JP3009421B2 - 有機酸の生物学的製造法 - Google Patents
有機酸の生物学的製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 産業上の利用分野 本発明は、生物学的手法による有機酸の製造法に関す
る。更に詳しくは、本発明は、微生物の作用によりニト
リル化合物から対応する有機酸を生成する方法に関す
る。有機酸は各種化学合成原料等として利用されるが、
特にアクリル酸およびメタクリル酸はポリマー等の原料
として重要であり、またニコチン酸は医薬品等に用いら
れることが知られている。
る。更に詳しくは、本発明は、微生物の作用によりニト
リル化合物から対応する有機酸を生成する方法に関す
る。有機酸は各種化学合成原料等として利用されるが、
特にアクリル酸およびメタクリル酸はポリマー等の原料
として重要であり、またニコチン酸は医薬品等に用いら
れることが知られている。
従来の技術とその課題 ニトリル化合物から対応する有機酸を製造する方法と
しては、化学合成的手法と生物学的手法が知られてい
る。このうち化学合成的手法を用いる場合、強酸を用い
て加水分解を行うため、反応後の廃液の処理が大きな問
題となる。一方生物学的手法では、微生物あるいはその
微生物由来の酵素をニトリル化合物の加水分解触媒とす
るため、温和な条件で有機酸を生成させることができる
点、有利である。この生物学的手法の具体例としては、
例えば微生物としてバチルス（Bacillus）属、バクテリ
ジウム（Bacteridium）属、ミクロコッカス（Micrococc
us）属およびブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
（特公昭58−15120号公報参照）、アシネトバクター（A
cinetobacter）属（特公昭63−2596号公報参照）、コリ
ネバクテリウム（Corynebacterium）属（特公昭63−568
0号公報参照）およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属
（特開平１−132392号公報参照）を用いる方法が提案さ
れている。これらのうち特公昭58−15120号公報記載の
方法では、その活性が低く実用的ではない。そこで微生
物の触媒活性を高めるために、前記した特公昭63−2596
号等には、ニトリル化合物を加水分解酵素の誘導物質と
して添加して微生物の培養を行なう方法が提案されてい
る。しかしながらこのような方法では、微生物が培地中
に添加されたニトリル化合物を培養中に資化するため、
ニトリル化合物をその消費に応じて培地に追加する必要
があり、工業的に、常に安定して高活性の微生物を得る
ことは難しい。また、得られる活性も必ずしも満足し得
るものではない。
しては、化学合成的手法と生物学的手法が知られてい
る。このうち化学合成的手法を用いる場合、強酸を用い
て加水分解を行うため、反応後の廃液の処理が大きな問
題となる。一方生物学的手法では、微生物あるいはその
微生物由来の酵素をニトリル化合物の加水分解触媒とす
るため、温和な条件で有機酸を生成させることができる
点、有利である。この生物学的手法の具体例としては、
例えば微生物としてバチルス（Bacillus）属、バクテリ
ジウム（Bacteridium）属、ミクロコッカス（Micrococc
us）属およびブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
（特公昭58−15120号公報参照）、アシネトバクター（A
cinetobacter）属（特公昭63−2596号公報参照）、コリ
ネバクテリウム（Corynebacterium）属（特公昭63−568
0号公報参照）およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属
（特開平１−132392号公報参照）を用いる方法が提案さ
れている。これらのうち特公昭58−15120号公報記載の
方法では、その活性が低く実用的ではない。そこで微生
物の触媒活性を高めるために、前記した特公昭63−2596
号等には、ニトリル化合物を加水分解酵素の誘導物質と
して添加して微生物の培養を行なう方法が提案されてい
る。しかしながらこのような方法では、微生物が培地中
に添加されたニトリル化合物を培養中に資化するため、
ニトリル化合物をその消費に応じて培地に追加する必要
があり、工業的に、常に安定して高活性の微生物を得る
ことは難しい。また、得られる活性も必ずしも満足し得
るものではない。
そこで本発明者らは、生物学的手法を用いてニトリル
化合物から対応する有機酸を工業的に製造し得る方法に
ついて鋭意検討した結果、ラクタム化合物を添加した培
地で、ロドコッカス属に属する微生物を培養することに
よって、強力にニトリラーゼ酵素を生成する歯体を容易
に調製することができ、その酵素がニトリル化合物から
対応する有機酸を製造する触媒として工業的に適応し得
るものであることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
化合物から対応する有機酸を工業的に製造し得る方法に
ついて鋭意検討した結果、ラクタム化合物を添加した培
地で、ロドコッカス属に属する微生物を培養することに
よって、強力にニトリラーゼ酵素を生成する歯体を容易
に調製することができ、その酵素がニトリル化合物から
対応する有機酸を製造する触媒として工業的に適応し得
るものであることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
要 旨 すなわち、本発明による有機酸の製造法は、微生物由
来のニトリラーゼ酵素の作用により、ニトリル化合物か
ら対応する有機酸を生成させる方法において、ロドコッ
カス（Rhodococcus）属の微生物をγ−ブチロラクタ
ム、δ−バレロラクタムおよびε−カプロラクタムの中
から選ばれるラクタム化合物の存在下に培養してニトリ
ラーゼ酵素を産生させ、ニトリル化合物に当該ニトリラ
ーゼ酵素を作用させて対応する有機酸を生成させること
を特徴とするものである。
来のニトリラーゼ酵素の作用により、ニトリル化合物か
ら対応する有機酸を生成させる方法において、ロドコッ
カス（Rhodococcus）属の微生物をγ−ブチロラクタ
ム、δ−バレロラクタムおよびε−カプロラクタムの中
から選ばれるラクタム化合物の存在下に培養してニトリ
ラーゼ酵素を産生させ、ニトリル化合物に当該ニトリラ
ーゼ酵素を作用させて対応する有機酸を生成させること
を特徴とするものである。
効 果 本発明によれば、ラクタム化合物を添加した培地でロ
ドコッカス属に属する微生物を培養して、ニトリラーゼ
酵素を誘導する。その際、培養液中のラクタム化合物は
ほとんど資化されず一定濃度を保つため、ニトリラーゼ
酵素の誘導効果が安定しており、容易に高活性なニトリ
ラーゼ活性菌体を調製することができる。従って、本培
養法によって調製した菌体由来の酵素をニトリル化合物
加水分解触媒として用いることにより、工業的規模での
有機酸の製造が可能となる。
ドコッカス属に属する微生物を培養して、ニトリラーゼ
酵素を誘導する。その際、培養液中のラクタム化合物は
ほとんど資化されず一定濃度を保つため、ニトリラーゼ
酵素の誘導効果が安定しており、容易に高活性なニトリ
ラーゼ活性菌体を調製することができる。従って、本培
養法によって調製した菌体由来の酵素をニトリル化合物
加水分解触媒として用いることにより、工業的規模での
有機酸の製造が可能となる。
＜ニトリラーゼ酵素の誘導＞ 本発明でニトリラーゼ酵素源として使用する微生物は
ロドコッカス属に属するものであり、例えば、ロドコッ
カス・ロドクロウス（ATCC33278）、ロドコッカスsp.
（NCIB11215）、ロドコッカスsp.（NCIB11216）、ロド
コッカス・ロドクロウスＪ−１（微工研条寄第1478号）
を挙げることができる。
ロドコッカス属に属するものであり、例えば、ロドコッ
カス・ロドクロウス（ATCC33278）、ロドコッカスsp.
（NCIB11215）、ロドコッカスsp.（NCIB11216）、ロド
コッカス・ロドクロウスＪ−１（微工研条寄第1478号）
を挙げることができる。
本発明では、これらの微生物をラクタム化合物を添加
した培地で培養して使用する。これらの微生物を培養す
る培地としては、これらの微生物が生育し得る通常の培
地に、更にラクタム化合物を添加したものが使用され
る。例えば、炭素源としてグルコース、シュークロー
ス、グリセロール等を、窒素源としてペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、アミノ酸、あるいは各種無機又は有機
酸アンモニウム塩等を添加し、更に無機塩、微量金属
塩、ビタミン等を必要に応じて適宜添加した培地に、ラ
クタム化合物を添加したものが用いられる。培地に添加
するラクタム化合物とは、有機環式化合物で、環内に−
CONH−を含むものであれば制限されないが、炭素数４−
６程度のω−アミノ酸の分子内アミド、特にγ−ブチロ
ラクタム、δ−バレロラクタム、ε−カプロラクタムが
好ましく用いられる。このラクタム化合物を２種以上添
加することも可能である。
した培地で培養して使用する。これらの微生物を培養す
る培地としては、これらの微生物が生育し得る通常の培
地に、更にラクタム化合物を添加したものが使用され
る。例えば、炭素源としてグルコース、シュークロー
ス、グリセロール等を、窒素源としてペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、アミノ酸、あるいは各種無機又は有機
酸アンモニウム塩等を添加し、更に無機塩、微量金属
塩、ビタミン等を必要に応じて適宜添加した培地に、ラ
クタム化合物を添加したものが用いられる。培地に添加
するラクタム化合物とは、有機環式化合物で、環内に−
CONH−を含むものであれば制限されないが、炭素数４−
６程度のω−アミノ酸の分子内アミド、特にγ−ブチロ
ラクタム、δ−バレロラクタム、ε−カプロラクタムが
好ましく用いられる。このラクタム化合物を２種以上添
加することも可能である。
培地へのラクタム化合物の添加量は、0.05〜2.0（W/
V）％、好ましくは0.1〜1.0（W/V）％、である。
V）％、好ましくは0.1〜1.0（W/V）％、である。
培地のpHは、６〜10、好ましくは７〜９、温度は15〜
37℃、好ましくは25〜30℃、で好気的に１〜７日間培養
する。
37℃、好ましくは25〜30℃、で好気的に１〜７日間培養
する。
＜ニトリルの加水分解＞ 本発明による有機酸の生物学的製造法は、微生物由来
のニトリラーゼ酵素の作用により、ニトリル化合物から
対応する有機酸を生成させることからなるものである。
ここで「微生物由来のニトリラーゼ酵素の作用により」
ということは、酵素が微生物の産生したものであって、
該酵素によってその基質であるニトリルが対応する有機
酸に変換される限り、該酵素の形態ならびに基質への作
用のさせ方等に関して、各種の態様を包含するものであ
る。例えば、上記のようにして培養して得た微生物の培
養液あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基
質であるニトリル化合物を添加する方法、菌体処理物
（例えば菌体破砕物、粗酵素、精製酵素等）あるいは常
法により固定化した菌体または菌体処理物等の懸濁液に
基質であるニトリル化合物を添加する方法、微生物の培
養時に基質であるニトリル化合物を培養液に添加して培
養と同時に反応を行う方法等が含まれる。
のニトリラーゼ酵素の作用により、ニトリル化合物から
対応する有機酸を生成させることからなるものである。
ここで「微生物由来のニトリラーゼ酵素の作用により」
ということは、酵素が微生物の産生したものであって、
該酵素によってその基質であるニトリルが対応する有機
酸に変換される限り、該酵素の形態ならびに基質への作
用のさせ方等に関して、各種の態様を包含するものであ
る。例えば、上記のようにして培養して得た微生物の培
養液あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基
質であるニトリル化合物を添加する方法、菌体処理物
（例えば菌体破砕物、粗酵素、精製酵素等）あるいは常
法により固定化した菌体または菌体処理物等の懸濁液に
基質であるニトリル化合物を添加する方法、微生物の培
養時に基質であるニトリル化合物を培養液に添加して培
養と同時に反応を行う方法等が含まれる。
反応液中の基質濃度は特に限定されるものではない
が、0.1〜10（W/V）％の範囲が好ましく、基質は反応液
中に一括して加えるかあるいは分割添加することができ
る。
が、0.1〜10（W/V）％の範囲が好ましく、基質は反応液
中に一括して加えるかあるいは分割添加することができ
る。
反応温度およびpHは、５〜50℃、pH4〜10の範囲で行
うことが好ましい。
うことが好ましい。
反応時間は、基質濃度、菌体濃度、あるいはその他の
反応条件等によって変わるが、通常１分〜48時間で終了
させればよい。
反応条件等によって変わるが、通常１分〜48時間で終了
させればよい。
本発明で加水分解の対象となるニトリル化合物として
は、脂肪族および芳香族のモノニトリルまたはジニトリ
ルが挙げられる。脂肪族ニトリルとしては炭素数２〜６
のものが適当であり、具体的にはアクリロニトリル、メ
タクリロニトリル、クロトノニトリル等の不飽和ニトリ
ル、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリ
ル、バレロニトリル等の飽和ニトリル、サクシノニトリ
ル、アジポニトリル等のジニトリルを挙げることができ
る。
は、脂肪族および芳香族のモノニトリルまたはジニトリ
ルが挙げられる。脂肪族ニトリルとしては炭素数２〜６
のものが適当であり、具体的にはアクリロニトリル、メ
タクリロニトリル、クロトノニトリル等の不飽和ニトリ
ル、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリ
ル、バレロニトリル等の飽和ニトリル、サクシノニトリ
ル、アジポニトリル等のジニトリルを挙げることができ
る。
また、芳香族ニトリルとしては芳香環を形成する炭素
数が４〜10のものが適当であり、具体的には、下記の一
般式〔Ｉ〕〜〔VII〕で示される化合物が挙げられる。
数が４〜10のものが適当であり、具体的には、下記の一
般式〔Ｉ〕〜〔VII〕で示される化合物が挙げられる。
一般式〔Ｉ〕： 具体例としては、４−、３−、および２−シアノピリ
ジン、が挙げられる。
ジン、が挙げられる。
一般式〔II〕： （ここで、R1およびR2は、それぞれ、Ｈ、CH3、OH、OCH
3、OC2H5、Cl、Ｆ、CN、NH2またはNO2である） 具体例としては、ベンゾニトリル、２−、３−および
４−クロロベンゾニトリル、２−、３−および４−フル
オロベンゾニトリル、３−および４−ブロモベンゾニト
リル、３−および４−ニトロベンゾニトリル、３−およ
び４−アミノベンゾニトリル、３−および４−ヒドロキ
シベンゾニトリル、２−、３−および４−トリニトリ
ル、２−、３−および４−メトキシベンゾニトリル、３
−および４−エトキシベンゾニトリル、フタロニトリ
ル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、2,6−
ジクロロベンゾニトリル、2,4−ジクロロベンゾニトリ
ル、3,5−ジクロロベンゾニトリル、2,6−ジフルオロベ
ンゾニトリル、3,4−ジフルオロベンゾニトリルが挙げ
られる。
3、OC2H5、Cl、Ｆ、CN、NH2またはNO2である） 具体例としては、ベンゾニトリル、２−、３−および
４−クロロベンゾニトリル、２−、３−および４−フル
オロベンゾニトリル、３−および４−ブロモベンゾニト
リル、３−および４−ニトロベンゾニトリル、３−およ
び４−アミノベンゾニトリル、３−および４−ヒドロキ
シベンゾニトリル、２−、３−および４−トリニトリ
ル、２−、３−および４−メトキシベンゾニトリル、３
−および４−エトキシベンゾニトリル、フタロニトリ
ル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、2,6−
ジクロロベンゾニトリル、2,4−ジクロロベンゾニトリ
ル、3,5−ジクロロベンゾニトリル、2,6−ジフルオロベ
ンゾニトリル、3,4−ジフルオロベンゾニトリルが挙げ
られる。
一般式〔III〕： 具体例としては例えば、α−およびβ−ナフトニトリ
ル、が挙げらえる。
ル、が挙げらえる。
一般式〔IV〕： （ここで、ＸはＳまたはＯである） 具体例としては、２−チオフェンカルボニトリルおよ
び２−フロニトリル、が挙げられる。
び２−フロニトリル、が挙げられる。
一般式〔Ｖ〕： 具体例としては、５−シアノインドール、が挙げられ
る。
る。
一般式〔VI〕： すなわち、シアノピラジンである。
一般式〔VII〕： すなわち、ピペロニロニトリルである。
これらのニトリル化合物を基質として、前記したニト
リラーゼ酵素を作用させることにより、基質ニトリルの
加水分解中間体であるアミド化合物をほとんど副生する
ことなしに、ほぼ100％のモル収率で対応する有機酸を
得ることができる。有機酸は反応液中にアンモニウム塩
として蓄積するが、反応液からの有機酸の回収は公知の
方法で行うことができる。例えば、反応液から菌体を遠
心分離等によって除去し、酸処理等によってアンモニア
を除去した後、抽出、蒸留等により有機酸を回収、精製
することができる。
リラーゼ酵素を作用させることにより、基質ニトリルの
加水分解中間体であるアミド化合物をほとんど副生する
ことなしに、ほぼ100％のモル収率で対応する有機酸を
得ることができる。有機酸は反応液中にアンモニウム塩
として蓄積するが、反応液からの有機酸の回収は公知の
方法で行うことができる。例えば、反応液から菌体を遠
心分離等によって除去し、酸処理等によってアンモニア
を除去した後、抽出、蒸留等により有機酸を回収、精製
することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
実施例１〜４ グルコース1.5％、グルタミン酸ソーダ0.75％、リン
酸一カリウム0.05％、リン酸二カリウム0.05％、硫酸マ
グネシウム７水塩0.05％、酵母エキス0.1％及びε−カ
プロラクタム0.5％からなる培地（pH7.2）を作製し、50
0ml坂口フラスコに60mlずつ分注し、120℃で20分間オー
トクレーブ滅菌した。
酸一カリウム0.05％、リン酸二カリウム0.05％、硫酸マ
グネシウム７水塩0.05％、酵母エキス0.1％及びε−カ
プロラクタム0.5％からなる培地（pH7.2）を作製し、50
0ml坂口フラスコに60mlずつ分注し、120℃で20分間オー
トクレーブ滅菌した。
上記培地に第１表に示した菌株を各々接種し、28℃で
48時間振とう培養した。
48時間振とう培養した。
これら培養液から遠心分離して菌体を集め、0.85％塩
化ナトリウム水溶液で洗浄した後、この菌体を培養液と
同量の0.85％塩化ナトリウム水溶液に懸濁させた。
化ナトリウム水溶液で洗浄した後、この菌体を培養液と
同量の0.85％塩化ナトリウム水溶液に懸濁させた。
50mMアクリロニトリルあるいは３−シアノピリジン1.
0ml、100mMリン酸カリウム緩衝液0.5ml（pH7.8）及び蒸
留水0.4mlからなる反応液に、上記菌体懸濁液を各々0.1
ml添加して、20℃で20分間反応させた。1N塩酸0.2mlを
添加して反応を止めた後、生成したアクリル酸あるいは
ニコチン酸をHPLCによって定量した（エムエス機器製M
＆ S pack C18カラム使用）。その結果は第１表に示さ
れる通りである。
0ml、100mMリン酸カリウム緩衝液0.5ml（pH7.8）及び蒸
留水0.4mlからなる反応液に、上記菌体懸濁液を各々0.1
ml添加して、20℃で20分間反応させた。1N塩酸0.2mlを
添加して反応を止めた後、生成したアクリル酸あるいは
ニコチン酸をHPLCによって定量した（エムエス機器製M
＆ S pack C18カラム使用）。その結果は第１表に示さ
れる通りである。
なお、加水分解中間体であるアクリルアミドおよびニ
コチンアミドの副生は全く検出できなかった。
コチンアミドの副生は全く検出できなかった。
また、ε−カプロラクタムを含まない同様の培地で上
記菌株を各々培養した。これらの菌体では、第１表に示
されるようなニトリラーゼ活性は全く検出できなかっ
た。
記菌株を各々培養した。これらの菌体では、第１表に示
されるようなニトリラーゼ活性は全く検出できなかっ
た。
実施例５〜６ 実施例１〜４で使用した培地において、ε−カプロラ
クタムの代わりにγ−ブチロラクタム又はδ−バレロラ
クタムを各々用いてロドコッカス・ロドクロウス Ｊ−
１を28℃で96時間培養し、実施例１〜４と同様にしてニ
トリラーゼ活性を測定した。その結果は第２表に示され
る通りである。
クタムの代わりにγ−ブチロラクタム又はδ−バレロラ
クタムを各々用いてロドコッカス・ロドクロウス Ｊ−
１を28℃で96時間培養し、実施例１〜４と同様にしてニ
トリラーゼ活性を測定した。その結果は第２表に示され
る通りである。
実施例７〜13 ロドコッカス・ロドクロウス Ｊ−１を、実施例１と
同様の培地で、28℃で96時間培養した。その菌体を破砕
し、その遠心上清を、30（V/V）％のグリセロールを添
加した10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で透析し、
同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファセル（ファルマシ
ア社製）に吸着させた。その後、０〜0.6MのKCl直線濃
度勾配によってタンパク質を流出させることにより、ニ
トリラーゼの活性画分を集めた。そのニトリラーゼ粗酵
素液を使って第３表に示したニトリル化合物に対する活
性を測定した。
同様の培地で、28℃で96時間培養した。その菌体を破砕
し、その遠心上清を、30（V/V）％のグリセロールを添
加した10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で透析し、
同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファセル（ファルマシ
ア社製）に吸着させた。その後、０〜0.6MのKCl直線濃
度勾配によってタンパク質を流出させることにより、ニ
トリラーゼの活性画分を集めた。そのニトリラーゼ粗酵
素液を使って第３表に示したニトリル化合物に対する活
性を測定した。
活性の測定は、20mMのニトリル化合物1.0ml及び100mM
リン酸カリウム緩衝液（pH7.8）0.5mlからなる反応液
に、必要に応じて蒸留水で希釈した上記ニトリラーゼ粗
酵素液0.5mlを添加して、20℃で10分間反応させること
により行った。
リン酸カリウム緩衝液（pH7.8）0.5mlからなる反応液
に、必要に応じて蒸留水で希釈した上記ニトリラーゼ粗
酵素液0.5mlを添加して、20℃で10分間反応させること
により行った。
反応は、1N塩酸0.2mlを添加することで停止させた。
生成した有機酸の定量はすべてHPLC（エムエム機器社
製M ＆ S pack C18カラム使用）で行った。
製M ＆ S pack C18カラム使用）で行った。
その結果は第３表に示される通りである。
なお表中で、１ユニット（Ｕ）とは、各ニトリルから
対応する酸が生成する速度:1μモル／分と定義した。
対応する酸が生成する速度:1μモル／分と定義した。
実施例14 ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１を、実施例１と同
様の培地で、28℃で96時間培養した。培養液から遠心分
離によって菌体を集め、50mMのリン酸カリウム緩衝液
（pH7.8）で洗浄した後、この菌体を培養液と同量の前
記緩衝液に懸濁させた。
様の培地で、28℃で96時間培養した。培養液から遠心分
離によって菌体を集め、50mMのリン酸カリウム緩衝液
（pH7.8）で洗浄した後、この菌体を培養液と同量の前
記緩衝液に懸濁させた。
この菌体懸濁液50mlを20℃に保って攪拌しながら、ア
クリロニトリルを、その濃度が200mM以下になるように
分割添加したところ、24時間で392g/lのアクリル酸をほ
ぼ定量的に生成、蓄積した。また、アクリルアミドの副
生は0.5％以下であった（モル比率）。
クリロニトリルを、その濃度が200mM以下になるように
分割添加したところ、24時間で392g/lのアクリル酸をほ
ぼ定量的に生成、蓄積した。また、アクリルアミドの副
生は0.5％以下であった（モル比率）。
尚、上記培養終了時の培養液中のε−カプロラクタム
濃度をガスクロマトグラフィーで定量したところ、4.8g
/l（残存率96％）であった。
濃度をガスクロマトグラフィーで定量したところ、4.8g
/l（残存率96％）であった。
比較例１〜４ グリセロール1.0％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％及び麦芽エキス0.3％からなる培地（pH7.2）を作
製し、500ml坂口フラスコに100mlずつ分注した。120℃
で20分間オートクレーブ殺菌した後、これに各々100μ
ｌのイソバレロニトリルを無菌的に添加した。
0.3％及び麦芽エキス0.3％からなる培地（pH7.2）を作
製し、500ml坂口フラスコに100mlずつ分注した。120℃
で20分間オートクレーブ殺菌した後、これに各々100μ
ｌのイソバレロニトリルを無菌的に添加した。
上記培地に、第４表に示した菌株を各々接種し、28℃
にて48時間振とう培養した。
にて48時間振とう培養した。
培養後、実施例１〜４と同様に菌体懸濁液を調製し、
ニトリラーゼ活性を測定した。その結果は第４表に示さ
れる通りである。
ニトリラーゼ活性を測定した。その結果は第４表に示さ
れる通りである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 中村 哲二 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日東化学工業株式会社内 (56)参考文献 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．182，Ｎｏ．２，ｐ．349−356 （1989) Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ ｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．54，Ｎｏ．４，ｐ. 1030−1032（1988) Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．29，Ｎｏ．２−３, ｐ．231−233（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/40 - 7/52 C12P 17/00 - 17/12 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】微生物由来のニトリラーゼ酵素の作用によ
り、ニトリル化合物から対応する有機酸を生成させる方
法において、ロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物
をγ−ブチロラクタム、δ−バレロラクタムおよびε−
カプロラクタムの中から選ばれるラクタム化合物の存在
下に培養してニトリラーゼ酵素を産生させ、ニトリル化
合物に当該ニトリラーゼ酵素を作用させて対応する有機
酸を生成させることを特徴とする、有機酸の生物学的製
造法。
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| RU2182928C2 (ru) * | 1995-12-12 | 2002-05-27 | Циба Спешиалти Кемикалз Уотер Тритментс Лимитед | Способ получения водного раствора (мет)акриловой кислоты или ее соли |
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| WO2006018025A1 (en) * | 2004-08-20 | 2006-02-23 | Danmarks Og Grønlands Geologiske Undersøgelse | Bam mineralizing activity |
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| Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．２−３，ｐ．２３１−２３３（１９８８） |
| Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｎｏ．２，ｐ．３４９−３５６（１９８９） |
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