JP2696424B2 - Ｒ（‐）―マンデル酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＲ（−）−マンデル酸の製造法に関する。更
に詳しくは、R,S−マンデロニトリルに対して不斉加水
分解能を有する微生物を用いて、Ｒ（−）−マンデル酸
を製造する方法に関する。Ｒ（−）−マンデル酸は、セ
フェム系抗生物質の合成原料として、また、多種の医農
薬品の合成原料として工業的に重要である。

〔従来の技術とその問題点〕 Ｒ（−）−マンデル酸の製造法として公知のものに化
学的に合成したR,S−マンデル酸（ラセミ体）を（１）
分別結晶によるラセミ分割（特開昭58−177933号公報参
照）、（２）クロマトグラフィーによるラセミ分割（EP
98707号公報参照）、（３）ラセミ体エステルと成し酵
素的不斉加水分解によるラセミ分割〔K.Mori et al.,Te
trahedron 36,91（1980）参照〕するなどのラセミ分割
法、（４）キラル試薬を用いた化学的不斉合成法〔D.A.
Evans et al.,J.Am.Chem.Soc.107,4346（1985）参照〕
などが有る。また、生物学的方法としては、上記のエス
テル不斉加水分解法のほかに、（５）ベンゾイルギ酸の
微生物的不斉還元法（特開昭57−198096号公報参照）、
（６）Ｄ−オキシニトリラーゼにより不斉合成したＲ
（−）−マンデロニトリルの加水分解（特開昭63−2193
88号公報参照）、（７）アルカリゲネス属、シュウドモ
ナス属、ロドシュウドモナス属、コリネバクテリウム
属、アシネトバクター属、バチルス属、マイコバクテリ
ウム属、ロドコッカス属またはキャンディダ属の微生物
によるラセミ体のマンデロニトリルまたはマンデルアミ
ドの不斉加水分解によるＲ（−）−マンデル酸の製造法
（特開平２−84198号公報参照）などが知られている。

しかし、ラセミ分割による方法はいずれの方法におい
てもプロセスの複雑化と各段階での収率の低下を引き起
こすこと、キラル試薬を触媒とした不斉合成法ではキラ
ル試薬が高価である上に高い光学純度の生成物が得にく
いという問題がある。生物学的方法であるベンゾイルギ
酸の不斉還元法においては基質の合成とNADH再成系の維
持に難点が有り、またＤ−オキシニトリラーゼ法は未だ
充分な工業化研究が行なわれていない。ラセミ体のマン
デロニトリルまたはマンデルアミドからのＲ（−）−マ
ンデル酸の生産に関しては、ラセミ体の原料から直接優
位量の光学活性体を得るものではなく、残存する他方の
光学活性を有する未反応のニトリルもしくはアミドは回
収され酸を用いた加水分解により他方の光学活性な有機
酸に変換されるか、アルカリ処理によりラセミ体となし
再び原料として使用され、Ｒ（−）−マンデル酸の生産
に利用されている。この方法においても残存する他方の
光学活性なマンデロニトリルまたはマンデルアミドの分
離とアルカリ処理によるラセミ化反応のプロセスは複雑
となり、収率の低下も引き起こされることになる。

このように従来の方法は種々の問題点を含み、いずれ
も工業的に有利なＲ（−）−マンデル酸の製造法とはな
り難い。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはR,S−マンデロニトリルまたはベンズア
ルデヒドと青酸を原料とし、Ｒ（−）−マンデル酸を工
業的に有利に製造する方法の開発を目的として検討を進
めた結果、先に、シュードモナス（Pseudomonas）属、
アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アシネトバクター
（Acinetobacter）属またはカセオバクター（Caseobact
er）属等の微生物を用いて、中性付近ないし塩基性の水
性媒体中で、R,S−マンデロニトリルまたはベンズアル
デヒドと青酸からほぼ化学量論的にＲ（−）−マンデル
酸を生成し得ることを見出し特許出願した（特願平２−
80694号明細書参照）。その後、さらにマンデロニトリ
ルの不斉加水分解活性を有する優れた微生物の探索を進
めた結果、ノカルディア（Nocardia）属、ブレビバクテ
リウム（Brevibacterium）属またはオーレオバクテリウ
ム（Aureobacterium）属に属する微生物を用いても上記
同様な効果が得られることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ノカルディア（Nocardia）属、
バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevib
acterium）属またはオーレオバクテリウム（Aureobacte
rium）属に属し、R,S−マンデロニトリルのニトリル基
を立体選択的に加水分解する能力を有する微生物または
該処理物を、中性付近ないし塩基性の水性媒体中でR,S
−マンデロニトリルまたはベンズアルデヒドと青酸の混
合物に作用させることにより、原料のR,S−マンデロニ
トリルまたはベンズアルデヒドと青酸から直接優位量の
Ｒ（−）−マンデル酸を生成せしめることを特徴とする
Ｒ（−）−マンデル酸の製造法、である。

上記したところを要旨とする本発明は、R,S−マンデ
ロニトリルが、中性付近ないしは塩基性の水性媒体中
で、ベンズアルデヒドと青酸との間で解離平衡すること
によりマンデロニトリルが容易にラセミ化するという性
質を利用し、このラセミ化反応の系とマンデロニトリル
の不斉加水分解活性を有する微生物とを共役させること
により、R,S−マンデロニトリルを直接Ｒ−体優位にＲ
（−）−マンデル酸に変換し得るとの本発明者らにより
見出された知見に基づくものである。

本発明で使用する微生物は、例えば、ノカルディア
アステロイデス（Nocardia asteroides）IFO 3384、バ
チルス サブチリス（Bacillus subtilis）ATCC 2169
7、ブレビバクテリウム アセチリカム（Brevibacteriu
m acetylicum）IAM 1790およびオ−レオバクテリウム
テスタセウム（Aureobacterium testaceum）IAM 1561が
挙げられ、またこれらの変異株を用いることもできる。

これらの微生物はいずれも公知であり、財団法人 醗
酵研究所（IFO）、アメリカン タイプカルチャー コ
レクション（ATCC）または東京大学応用微生物研究所
（IAM）から容易に入手することができる。

次に本発明の実施態様について説明する。

本発明に使用される微生物の培養は資化し得るグリセ
ロール、グルコース、サッカロースなどの炭素源、尿
素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素
源、微生物の生育に必須の塩化マグネシウム、塩化カル
シウム、塩化鉄などの無機栄養素などを含有した通常の
培地を用いて行なわれる。またこれらの培地に酵母エキ
ス、肉エキス、糖蜜などの天然培地を添加したものも使
用することができる。

培養初期または中期に生育を大きく阻害しない濃度の
ケイ皮酸ニトリル、ベンジルシアニド、イソブチロニト
リル、ベンゾニトリル、１−シクロヘキセニルアセトニ
トリル、β−フェニルプロピオニトリル、４−シアノピ
リジン、フェニルスルフォニルアセトニトリル、γ−ブ
チロニトリルなどのニトリル類またはイソブチルアミ
ド、４−ピリジンカルボン酸アミド、フェニルアセトア
ミドなどのアミド類を酵素誘導物質として添加すること
により高い酵素活性が得られる。

使用する培地のpHは４〜10、培養温度は５〜50℃の範
囲で選べばよく、培養は１〜14日程度、好気的に行ない
活性が最大となるまで継続すればよい。

R,S−マンデル酸の不斉加水分解反応は、上記の方法
にて培養した微生物の菌体または菌体処理物（菌体の破
砕物、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等）を、水また
は緩衝液等の水性媒体中で、マンデロニトリルまたはベ
ンズアルデヒドと青酸の混合物に接触させることによっ
て行われる。

本発明においては、前述のようにマンデロニトリルを
ラセミ化するために、反応系を中性付近ないしは塩基性
に保つことが必須であり、pHを４〜11、好ましくは６〜
10に調整する。その他、本発明における反応条件は、ベ
ンズアルデヒドや青酸に対する酵素の感受性により一概
に特定し得ないが、通常反応液中のマンデロニトリル
は、0.1〜2.0重量％、好ましくは0.2〜1.0重量％、ベン
ズアルデヒドは0.1〜1.0重量％、好ましくは0.1〜0.5重
量％、青酸は0.1〜0.5重量％、好ましくは0.1〜0.2重量
％であり、マンデロニトリルに対する微生物等の使用量
は、乾燥菌体として0.01〜5.0重量％、反応温度は０〜5
0℃、好ましくは10〜30℃で0.1〜24時間反応させればよ
い。

かくして、R,S−マンデロニトリルまたはベンズアル
デヒドと青酸は水性媒体中で起こるラセミ化反応とニト
リルの不斉加水分解反応との共役により高収率で光学活
性なＲ（−）−マンデル酸に変換され蓄積される。生成
物の単離は、濃縮、イオン交換、電気透析、抽出、晶析
などの公知の方法を利用して行うことができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ラセミ体のR,S−マンデロニトリル
またはベンズアルデヒドと青酸から直接優位量（50〜10
0％）のＲ（−）−マンデル酸が製造でき、化学量論的
に全ての原料をＲ（−）−マンデル酸に変換することも
可能であり、極めて効率のよいＲ（−）−マンデル酸の
製造法を提供し得る。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１および比較例１ （１）培養 表１に示す微生物を下記の条件で培養した。

ｉ）培地 グリセロール 0.5 ％（w/v） 酵母エキス 0.02 ％（w/v） リン酸一カリウム 0.68 ％（w/v） リン酸二ナトリウム 0.71 ％（w/v） 硫酸ナトリウム 0.28 ％（w/v） 塩化マグネシウム 0.04 ％（w/v） 塩化カルシウム 0.004％（w/v） 硫酸マンガン ４×10^-4％（w/v） 塩化鉄 ６×10^-5％（w/v） 硫酸亜鉛 ３×10^-5％（w/v） 寒天 1.8 ％（w/v） ベンジルシアニド 0.05％（w/v） pH 7.5 ii）培養条件 斜面培地から１白金耳の菌体を採り、上記平板培地上
に塗布し、30℃で72時間好気条件下で培養した。

（２）R,S−マンデロニトリルからのＲ（−）−マンデ
ル酸の生産 平板培地から菌体を採取し遠心分離により各々の菌体
を50mMリン酸緩衝液（pH 7.5）で３回洗浄した。沈殿菌
体を1.5mlの同様の緩衝液に再懸濁し、終濃度14mMのラ
セミ体のマンデロニトリルを添加し30℃で24時間振盪し
ながら反応を行った。反応終了後、各々の反応液を遠心
分離し菌体を除去し遠心上清中のマンデル酸の含量を液
体クロマトグラフィー（カラム;SHODEX ODS F511A、キ
ャリア;0.2M H₃PO₄：アセトニトリル＝4:1、モニター;
208nm）で分析し、生産されたマンデル酸の光学純度を
液体クロマトグラフィー（カラム;CHIRALPAKWH、キャリ
ア;0.25mM硫酸銅水溶液、モニター;208nm）で分析し
た。

尚、比較の為、特開平２−84198号公報記載のアルカ
リゲネス フェカリス ATCC 8750株についても、上記
同様に培養し加水分解反応（比較例１）を試みた。

結果を表−１に示した。

実施例２ （１）培養 オーレオバクテリウム テスタセウム IAM 1561株を
実施例１と同様の培養条件で培養した。

（２）ベンズアルデヒドと青酸からのＲ（−）−マンデ
ル酸の生産 得られた培養液から実施例１と同様の方法で菌体を取
得し、50mMリン緩衝液（pH 7.5）1.5mlに懸濁し、休止
菌体懸濁液を調製した（OD₆₃₀＝40）。

この液にベンズアルデヒドと青酸を各々について終濃
度15mMとなる様な濃度に添加し、30℃で24時間振盪しな
がら反応を行った。反応終了後、遠心分離により菌体を
除去し、得られた遠心上清中のマンデン酸の含量と光学
純度を実施例１と同様の分析条件で分析したところ、光
学純度97.1％eeのＲ（−）−マンデル酸を13.5mM蓄積し
ており、変換収率は90.0％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ノカルディア（Nocardia）属、バチルス
   （Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacteriu
   m）属またはオーレオバクテリウム（Aureobacterium）
   属に属し、R,S−マンデロニトリルのニトリル基を立体
   選択的に加水分解する能力を有する微生物または該処理
   物を、中性付近ないし塩基性の水性媒体中で、R,S−マ
   ンデロニトリルに作用させることにより、原料のR,S−
   マンデロニトリルから直接優位量のＲ（−）−マンデル
   酸を生成せしめることを特徴とするＲ（−）−マンデル
   酸の製造法。
2. 【請求項２】ノカルディア（Nocardia）属、バチルス
   （Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacteriu
   m）属またはオーレオバクテリウム（Aureobacterium）
   属に属し、R,S−マンデロニトリルのニトリル基を立体
   選択的に加水分解する能力を有する微生物または該処理
   物を、中性付近ないし塩基性の水性媒体中で、ベンズア
   ルデヒドと青酸の混合物に作用させることにより、原料
   のベンズアルデヒドと青酸から直接優位量のＲ（−）−
   マンデル酸を生成せしめることを特徴とするＲ（−）−
   マンデル酸の製造法。