JP2894687B2 - アポエクオリン均質ペプチド - Google Patents
アポエクオリン均質ペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子工学分野に係り、より特定的には、ア
ポエクオリンタンパク質遺伝子を組換えベクターDNA内
に挿入すること、及び微生物である受容菌株に於いてア
ポエクオリンを産生することに係る。 アポエクオリン（apoaequorin）は発光性クラゲであ
るエクオレア・ヴイクトリア（Aequorea victoria）か
ら単離されうる１本のポリペプチド鎖から成るタンパク
質である。このタンパク質が腔腸動物門のルシフェリン
１分子を非共有結合で結合し含有すると、それはエクオ
リンとして知られているものになる。エクオリンはカル
シウムイオンの存在下で酸化され、可視光を発する。一
度光が発せられると、使用されたタンパク質（アポエク
オリン）を酸化ルシフエリンから精製し得、その後適当
な条件下で天然又は合成ルシフエリンを用いて再び（電
子と）結合される。この再結合されたエクオリンにカル
シウムイオンを加えてやることで、再び光を発するよう
になる。従つて、アポエクオリンは様々な化学及び生物
アツセイに於けるマーカーとして使用することができる
ものである。 天然のアポエクオリンは単一化合物ではなくて、数種
の分子の混合物を表わしている。数千にも及び個々のエ
クオレア（Aequorea）のエクオリンを表わしているとこ
ろの純粋な天然エクオリンを電気泳動にかけると（0.1m
M EDTA）を全ての緩衝液に含有させて、非変性条件下の
アルカリ性緩衝液中、オー・ガブリエル（O.Gabrie
l），メソド・エンザイモロジイー（Methods Enzymo
l.）、22巻、565−578頁、1971年参照）、少なくとも６
つの明瞭な青色ルミネツセンスのバンドが、用いたゲル
（0.5cm×10cm）を0.1M CaCl2中に浸すと見えるように
なる。この観察は、同様な抽出物を等電点電気泳動にか
け12本ものルミネツセンスバンドを観察したジエイ・ア
ール・ブリンクス（Ｊ・Ｒ・Blinks）及びジー・シー・
ハーレス（Ｇ・Ｃ・Harres）、（フエド・プロス（Fed.
Proc）、34巻、474頁、1975年）の結果と一致してい
る。等電点電気泳動は電気泳動よりも分離能が高いので
ブリンクス及びハーレスはより多くの種類（バンド）を
観察したのである。しかしながら、これらのバンドのど
れも純粋なペプチドとして単離されなかつた。 更に、生物ルミネツセンスアツセイに使用する為に必
要とされる量を供給し得るだけ充分量のエクオリン又は
アポエクオリンをクラゲ又は他の天然資源から生産する
ことは困難である。従つて、産業上利用し得るだけの充
分な量のアポエクオリンを生産する改良方法が強く望ま
れている。 近年の発達した技術によつて、大量に早く増殖する微
生物を使用して、産業上有用なタンパク質及びペプチド
をその天然に於ける由来源にかかわらず合成することが
可能になつた。これらの技術は、或る適当な微生物に、
通常は別の生物で作られているタンパク質又はペプチド
を合成する能力を遺伝子的に付与することを可能にす
る。 上記の技術は、全ての生物に於いて、遺伝物質（普通
はDNA）とその生物によつて合成されるタンパク質との
間に存在する基本的な関係を利用するものである。この
関係とは、タンパク質のアミノ酸配列がDNAのヌクレオ
チド配列中に反映されているというようなことである。
タンパク質中で最も共通して見られる20種のアミノ酸の
各々に特異的に対応している３ヌクレオチド配列のグル
ープが１つ以上ある。各々の或る３マクレオチド配列と
それに対応するアミノ酸との間の特異的な関係は遺伝暗
号を構成する。この遺伝暗号は全ての生物にとつて同一
又は類似しているものと考えられている。その結果、全
てのタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列は、良く理
解されている関係に従つて、対応するヌクレオチド配列
に反映されている。更に、原則的には、このヌクレオチ
ド配列はどの生物によつても翻訳され得るものである。 暗号：各々の３文字連鎖（３−letter triplet）は左
側に５′末端及び右側に３′末端を持つDNAの３ヌクレ
オチドを表わしている。この文字はヌクレオチド配列を
形成するプリン又はピリミジン塩基を表わしている。 Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はＧ Ｍ＝A,C又はＴ Ｔ＝チミン Ｘ＝ＹがＡ又はＧの場合、Ｔ又はＣ Ｘ＝ＹがＣ又はＴの場合、Ｇ Ｙ＝ＸがＣの場合、A,G,C又はＴ Ｙ＝ＸがＴの場合、Ａ又はＧ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ又はＡ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ Ｚ＝ＷがＧの場合、A,G,C又はＴ Ｚ＝ＷがＡの場合、Ａ又はＧ QR＝ＳがA,G,C又はＴの場合、TC QR＝ＳがＴ又はＣの場合、AG Ｓ＝ORがTCの場合、A,G,C又はＴ Ｓ＝QRがAGの場合、Ｔ又はＣ 表１の３ヌクレオチドはコドンと呼称され、生物の遺
伝物質中に存在する時、DNA3ヌクレオチドとして表わさ
れる。これらコドンのタンパク合成に於ける発現には伝
令RNA（m RNA）の中間形成が必要とされ、これに関して
は以下により詳細に述べる。mRNAコドンはチミンの代り
にウラシルがあることを別にすると表１のDNAコドンと
同じ配列を持つたものである。当分野に於いては、反対
の鎖極性（opposite strand polarity）を持つた相補的
な３ヌクレオチドDNA配列は機能的には表１のコドンと
の同等のものと理解されよう。遺伝暗号に関して重要で
良く知られている特徴に、その遺伝暗号の持つ冗長性
（redundancy）があり、それによつて、タンパク質を構
成するアミノ酸の殆んどについて、１つ以上のヌクレオ
チド３連鎖コードが使用されている。 従つて、或るアミノ酸配列をコードしている幾つかの
異なるヌクレオチド配列があり得る。このようなヌクレ
オチド配列は、或る菌株がその中のある配列を他の配列
より効率良く翻訳することはあつても、それらが全ての
生物に於いて同じアミノ酸配列を産生し得るので機能的
に同等のものと考えられている。時には、或る一定のヌ
クレオチド配列中にプリン又はピリミジンのメチル化さ
れた変異体（variant）が見つかることがある。このよ
うなメチル化によつてもコードの関係は全く影響を受け
ることはない。 基本的な概略に於いて、微生物に新規なタンパク質を
合成する能力を付与する方法は次の３ステップを含むも
のである。（１）所望タンパク質のアミノ酸配列に関す
る遺伝的にコードされた情報を含む特定遺伝子またはヌ
クレオチド配列を単離及び精製（又は化学合成）し、
（２）この単離したヌクレオチド配列を適当なベクタ
ー、典型的にバクテリオフアージ又はプラスミドのDNA
と組換え、そして（３）このベクターを適当な微生物に
移し、該所望の遺伝情報を含む受容微生物の株を選択す
る。 上記のプロセスを産業上利用しようとする際に遭遇す
る基本的に困難な点は第一段階、つまり所望の特定遺伝
情報を単離し精製することである。全ての生物細胞に於
いて、DNAは非常に高分子量のヌクレオチド鎖の形態で
存在している。細胞中には、各々の遺伝子が数百のヌク
レオチド長を持ち、10,000以上の特定タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードしている10,000以上もの構造遺伝子が
含まれている。その殆んどの場合、４種類のヌクレオチ
ド塩基によつて全ての現存する配列が形成されている。
この４種類のヌクレオチド塩基とはアデニン（Ａ）、グ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）であ
る。その結果、特定タンパク質の構造遺伝子を含有する
長い配列は、全体として化学的組成及び物理特性に於い
て非常に良く似ている。このような配列の１つを単離し
たDNA中に存在する他の非常に多くの配列から分離する
ことは、従来の物理的、化学的調製方法では通常達成さ
れ得ないものである。 先行技術に於いて、上記の一般的な操作方法の第一段
階を達成する為に二つの一般的な方法が用いられてき
た。第一の方法はしばしばシヨツトガン法と呼ばれるも
のである。この方法では、或る生物のDNAは所望のヌク
レオチド配列よりも通常長い断片に分断される。上記
（１）の段階は本質的に迂回されている。該DNA断片
は、特定配列をあらかじめ精製することなく、直ちに所
望のベクターと組換えられる。粗分画段階は適宜その間
に行ない得る。全ての可能性を持つた菌株の中から、所
望の遺伝情報を含む微生物の株を選択するのに微生物遺
伝学の選択技術を用いて行なうことができる。このシヨ
ツトガン法には二つの重要な欠点がある。 このうち特に重要な点は、この操作によつて数百もの
未知の遺伝子が受容微生物中に取込まれることになり、
実験中に未知の遺伝素性を持つた新規な株が創り出され
ることである。従つて、この操作を用いると実験従事者
と環境に対して災害をもたらす恐れがある。 シヨツトガン法の第二の欠点というのは、所望株を産
生する点で非常に効率が悪く、第一段階に於ける分画の
欠如を補償するに充分な検出力のある選択技術を用い得
るかどうかにかかつていいることである。しかしなが
ら、本明細書の後段で明らかにされるように、前記欠点
を解消する方法が存在する。 第二の一般的方法は、細胞内の全遺伝情報がある特定
の時に発現されるということは、たとえあるとしても極
めてまれであるという事実を利用している。特に、高等
生物の分化した組織はある一時期に産生し得るタンパク
質のうちのほんの少しの部分しか合成していないことが
ある。極端な場合には、このような細胞は主に一種類の
タンパク質を合成していることがある。このような極端
な場合には、適当な細胞から対応する伝令RNAを単離す
ることによつて、問題の該タンパク質をコードしている
ヌクレオチド配列を単離することが可能であつた。 伝令RNAはDNAのヌクレオチド配列情報をタンパク質の
アミノ酸配列構造に変換する過程に於いて機能する。こ
の過程の第一段階（転写）に於いては、産生すべきタン
パク質を特定しているヌクレオチド配列を持つたDNAの
局部断片がRNA中に写し取られる。RNAは、デオキシリボ
ースの代りにリボースが用いられていること及びチミン
の代りにウラシルが使用されていること以外はDNAに類
似しているポリヌクレオチドである。RNA中のヌクレオ
チド塩基はDNAの相補的鎖間に存在するものとして良く
知られている塩基対合関係と同種の関係を形成すること
ができる。Ａ及びＵ（Ｔ）は相補的であり、Ｇ及びＣが
相補的である。DNAヌクレオチド配列のRNA転写体は写し
取られた配列に対して相補的になる。このようなRNA
は、細胞の遺伝装置（genetic apparatus）とタンパク
質合成装置との間の媒介手段としての役割から伝令RNA
（mRNA）と呼称される。一般的には、細胞中である特定
の時に存在しているmRNAのみがその時に活発に合成され
ているタンパク質に対応しているものである。従つて、
主にある一種のタンパク質を合成することにその機能が
従事しているような分化細胞はそのタンパク質に対応し
ているRNA種を主に含んでいるものである。これがうま
くいきそうな場合には、分化細胞に於けるこうしたタン
パク質の特別な合成を利用して或る所定のタンパク質を
コードしている適当なヌクレオチド配列を精製・単離す
ることができる。 上記操作の主要な欠点は、細胞が主に単一のタンパク
質を合成しているものと確認できるような比較的まれな
場合にのみしかこの操作を適用し得ないということであ
る。産業上関心が持たれているタンパク質の多くはこの
ような特別な方法では合成されていないものである。所
望のタンパク質は、或る一定の時期に或る組織又は器官
の細胞によつて産生される百いくつもの様々なタンパク
質のうちの一つかも知れない。それにもかかわらず、細
胞中に存在するRNA種の組は通常DNA中に存在している全
配列のうちの一部分にすぎないのであるから、mRNA単離
技術は有用であり、したがって、初期精製手段を提供し
ていることになるのである。 極く最近の発展によると、ある配列がmRNA配列の異種
集団うちの２％という低い頻度で存在するような場合に
於いても、該ヌクレオチド配列を単離・精製できる操作
が米国特許第4,363,877号に開示されている。更に、最
初に単離された全RNA集団中もつと低い頻度で存在する
配列を単離・精製する為に、この操作をmRNAを分画する
公知の方法と組み合せることも可能である。この方法は
一般に、実際上どんな生物から抽出したmRNA種に対して
も適用し得、それ故に産業上及び研究上興味のあるタン
パク質を最終的に役に立つだけの量生産する為の強力な
基本的な手段を提供するものである。 上記の方法はmRNA及びDNAの或る構造上の特徴を利用
し、或る種の酵素によつて触媒される反応を使用するも
のである。先行技術に於いて理解されているところの上
記反応の性質及び構造上の詳細な点については本明細書
中に記載し、上記米国特許に於いて更に詳細に述べられ
るものである。 本明細書中で用いられる符号及び略号を次表に示す。 天然の形態では、DNAは直鎖ポリヌクレオチド対の形
態で存在する。前述の相補的塩基対合関係というのは一
方のストランドの各ヌクレオチド塩基が他方のストラン
ド上にあるそれと相補的な塩基とを対峙して在るように
一対の鎖相互間に存在しているものである。一方のスト
ランドの全配列は他方のストランド上の相補的配列によ
つて鏡面反映させられている。一対の鎖（ストランド）
が分離した時に、適当な前駆体モノマーから新しいパー
トナーであるストランドを合成することが可能である。
一端から始まるモノマーの添加による配列は元の完全な
ままのポリヌクレオチド鎖配列に相補的になるようにそ
れによつて決定される。つまりこのポリヌクレオチド鎖
配列がその相補的パートナー合成に対する鋳型として働
くのである。DNAの特定ヌクレオチド配列に対応するmRN
Aの合成に関してもこれと同様な原理に従うものと理解
されている。従つて、転写された領域に於いて、ある特
定のmRNA分子はDNAの一本の鎖に相補的であり、他方のD
NA鎖と同一の配列を持つことになる。生細胞中には、あ
る特定のタンパク質に対するヌクレオチド配列を含む特
定のDNA断片を選択的に転写させるような酵素による機
構が存在する。従つて、ある特別なタンパク質のアミノ
酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含むmRNAを
単離することはDNAそれ自体から同じ配列、すなわち遺
伝子を単離することと等価なものである。もし、mRNAが
再転写されそれに相補的なDNA（cDNA）を形成すると、
それによつて正確なDNA配列が再構成されたことにな
り、適当な方法によつて他の生物の遺伝物質中にこのDN
A配列を挿入することができる。従つて、ある一定の配
列のこの二つの相補版は相互に変換し得、機能的に互い
に同等なものである。 DNA及びRNAのヌクレオチドサブユニツトは一つのヌク
レオチド糖の５′位とそれと隣接しているものの３′位
との間をリン酸ジエステル結合によつて互いに結び付け
られている。このような結合の繰り返しにより、一方の
末端が他方の末端と区別され得るような意味で極性を持
つた直鎖状ポリヌクレオチドが生じる。３′末端は遊離
３′−ヒドロキシであり得、又はこのヒドロキシはリン
酸塩（エステル）又はより複雑な構造で置換されている
場合もある。５′末端についても同様である。真核生
物、すなわち明確な核と有糸***装置をもつている生物
に於いては、機能mRNAの合成は通常そのmRNAの３′末端
にポリアデニル酸を付加することを含むものである。従
つて、伝令RNAは、ポリチミジル酸を付着させたセルロ
ースのカラムクロマトグラフイによつて、真核生物から
単離した他のクラスのRNAから分離することができる。
アビブ・エイチ（Aviv,H.）及びレーダー・ピー（Lede
r.P.），プロス・ナト・アカド・サイ（Proc.Nat.Acad.
Sci.,）,69巻、1408頁（1972年）を参照のこと。オリゴ
dT,ポリＵ、又はポリＴ及びポリＵの組合せを含むクロ
マトグラフイ充填用物質、例えばポリＵ−セフアロース
（poly U−Sepharose）に対するポリＡの塩基対合親和
性（base−pairing affinity）を利用した他のクロマト
グラフイ手段も同様に用いることができる。 逆転写酵素（reverse transcriptase）はRNA鋳型の存
在下でRNA鋳型鎖に相補的なDNAの合成を触媒するもの
で、この際にはプライマーである３′−ヒドロキシを持
っている相補的なオリゴ又はポリヌクレオチドと四種の
デオキシヌクレオシド３リン酸、つまりdATP、dGTP、dC
TP及びdTTPを存在させる。この反応はmRNAの３′末端近
傍にオリゴデオキシヌクレオチドプライマーが非共有結
合的に会合することにより開始され、続いてmRNAヌクレ
オチド配列との塩基対合関係で決められている如くに、
成長している鎖の３′末端への適当なデオキシヌクレオ
チドの付加が段階的に行なわれる。生成分子はヘアピン
構造として記述でき、元のRNAは、一部分が一端に於い
てそれ自身に対し折り畳まれているDNAの相補鎖と水素
結合によつて対になつている。DNAとRNAとの鎖は互いに
共有結合によつて結合しているものではない。逆転写酵
素は一本鎖DNA鋳型を用いた類似の反応を触媒すること
もでき、そのような場合、得られる生成物は一端が一本
鎖DNAのループによつて結びつけられている二本鎖DNAの
ヘアピンである。アビブ・エイチ（Aviv,H.）及びレー
ダー・ピー（Leder,P），プロス・ナト・アカド・サイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,69巻,1408頁（1972年）
及び、エフストラテイアデイス・エー（Efstratiadis.
A.）；カフアトス・エフ・シー（Kafatos,F.C.），マキ
シアム・エー・エム（Maxam,A.M.）及びマニアテイス・
テイー（Maniatis,T.）細胞（Cell）,7巻,279頁（1976
年）。 制限エンドヌクレアーゼはDNA中のリン酸ジエステル
結合を加水分解することのできる酵素であり、DNA鎖の
連がり（continuity）に切れ目を生起せしめる。もしも
DNAが閉じたループの形状である場合には、そのループ
は線状構造に変換させられる。制限酵素の主な特徴は、
その加水分解作用がある特定のヌクレオチド配列の箇所
だけで生起するということである。 このような配列箇所はその制限エンドヌクレアーゼに
対する制限部位と呼ばれる。様々な生物源から制限エン
ドヌクレアーゼが単離され、それらの制限部位のヌクレ
オチド配列によつて特徴づけられてきた。二本鎖DNAに
作用する時に、制限エンドヌクレアーゼの幾種類かは同
じ箇所で両鎖のリン酸ジエステル結合を加水分解し、平
滑末端を生じる。他のものは数ヌクレオチド分だけ離れ
て結合を加水分解し、切断分子の各末端に於ける遊離状
態の一本鎖領域を生じる。このような一本鎖末端は自己
相補的で接着性（cohesive）であるから、加水分解され
たDNAを再結合させるのに用いることができる。このよ
うな酵素の１種によつて切断されるDNAはどれでも同じ
認識部位を含んでいるにちがいないから、同じ接着末端
が生じることになり、制限エンドヌクレアーゼ処理した
DNAの異種配列を同様に処理した他の配列に結合させる
ことが可能でる。ロバート・アール・ジエイ（Roberts,
R.J.）、クリト・レブ・バイオケム（Crit.Rev.Bioche
m）,4巻、123頁（1976年）を参照のこと。 或る酵素に対する制限部位は比較的まれであり、不均
一に分布している。或る特定の制限部位が一定の断片内
に存在するかどうかということは実験的に決定すべきこ
とである。しかしながら、様々な生物源から多様な部位
特異性を持つた制限エンドヌクレアーゼが数多単離また
は単離されつつあるので、千個のヌクレオチドのある一
定の断片が１つ以上の制限部位を含有している可能性が
あると考えるのは道理にかなつたことである。 一般的な技術的背景に関しては、ワトソン・ジエイ・
デイー（Watson,J.D.），遺伝分子生物学（the Molecul
ar Biology of the Gene）,3版，ベンジヤミン（Benjam
in），メンロパーク（Menlo Park），カリフ（Calif）,
1976年；ダビツドソン・ジエイ・エヌ（Davidson,J.
N.），核酸の生化学（The Biochemistry of the Nuclei
c Acids）,8版，アダムス・アール・エル・ピー（Adam
s,R.L.P.），バードン・アール・エイチ（Burdon,R.
H.），キヤンベル・エー・エム（Campbell,A.M.），及
びスメリエ・アール・エム・エス（Smellie,R.M.S.）改
訂版，アカデミツク・プレス，ニユーヨーク,1976年；
及びヘイズ・ダヴリユー・（Hayes.W.），バクテリア及
びそのウイルスの遺伝学，基礎遺伝学及び分子生物学の
研究（The Genetics of Bacteria and their Viruses,S
tudies in Basic Genetics and Molecular Biology）,2
版，ブラツクウエル科学出版（Blackwell Scientific P
ub.），オクスフオード,1968年を参照のこと。 従つて、本発明の目的は有用量のアポエクオリンを供
給し得るだけの微生物を提供することに在る。 更に、本発明は微生物の中に挿入されてアポエクオリ
ンを発現し得るような組換えDNAベクターを提供するこ
とを目的とするものである。 また更に、所望の組換えDNAベクターを生産する際に
使用され得る、合成で製造されるか又は天然源から単離
し得るか特定構造を持つたDNA断片を提供することも本
発明のもう一つの目的である。 こうして更に、天然アポエクオリンの活性によく似た
ペプチドを実験室での合成により又は微生物により製造
できるようにすることも本発明のもう一つの目的であ
る。 以上の本発明の目的およびその他の目的は、本明細書
中以下で直により明確になるであろうが、以下の第１〜
４式の化合物（１）およびその塩（２）から選択される
均一なペプチドを提供することによつて達成し得たもの
である。（ｂ）第２式： 第１式のPRO5の代りにSER、ASN8の代りにASP、LYS11
の代りにARG、ASP78の代りにGLU、ALA81の代りにGLU、L
YS88の代りにARG、THR91の代りにSER、ASP92の代りにCY
S又はGLU、GLU95の代りにLYS、LYS96の代りにARG、ALA
98の代りにSER、GLN101の代りにGLU、ILE102の代りにPR
O、ILE107の代りにLEU、ILE116の代りにVAL、THR125の
代りにSER、SER127の代りにASP、THR141の代りにSER、G
LU144の代りにASPになったもの（ここで、下付き番号は
第１式のアミノ末端から数えたアミノ酸位置を表してい
る）、 （ｃ）第３式として、前記第１式又は第２式に於いて、
アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
の両末端の１から15個のアミノ酸が欠如したもの。 （ｄ）第４式として、前記第１式又は第２式に於いて、
アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
の両末端に１から10個の付加アミノ酸を連続的に結合し
たもの。 （ｅ）第５式として、前記第１式においてアミノ末端
に、−MET THR SER GLU GLN TYR SER−の配列を有する
付加アミノ酸を連続的に結合したもの。 （２）前記式を有する化合物の塩類。 以上のペプチドは腔腸動物門のルシフエリンを結合し
Ca2+の存在下で光を放出することができる。 GTL1 AAJ2 XTY3 ACL4 〔CCL又はQRS〕5 GAK6 TTK
7 〔AAK又はGAK〕8 AAK9 CCL10 〔AAJ又はWGZ〕11
TGG12 ATM13 GGL14 WGZ15 CAK16 AAJ17 CAK18
ATG19 TTK20 AAK21 TTK22 XTY23 GAK24 GTL25
AAK26 CAK27 AAK28 GGL29 AAJ30 ATM31 QRS32
XTY33 GAK34 GAJ35 ATG36 GTL37 TAK38 AAJ39
GCL40 QRS41 GAK42 ATM43 GTL44 ATM45 AAK46
AAK47 XTY48 GGL49 GCL50 ACL51 CCL52 GAJ53
CAJ54 GCL55 AAJ56 WGZ57 CAK58 AAJ59 GAK60
GCL61 GTL62 GAJ63 GCL64 TTK65 TTK66 GGL67
GGL68 GCL69 GGL70 ATG71 AAJ72 TAK73 GGL74
GTL75 GAJ76 〔GAK又はGAJ〕78 TGG79 CCL80
〔GCL又はGAJ〕81 TAK82 ATM83 GAJ84 GGL85 TGG
86 AAJ87 〔AAJ又はWGZ〕88 XTY89 GCL90 ACL91
〔GAK,GAJ,又はTGK〕92 GAJ93 XTY94 GAJ95 〔AAJ
又はWGZ〕96 TAK97 〔GCL又はQRS〕98 AAJ99 AAK
100 〔CAJ又はGAJ〕101 〔ATM又はCCL〕102 ACL103
XTY104 ATM105 WGZ106 〔ATM又はXTY〕107 TGG
108 GGL109 GAK110 GCL111 XTY112 TTK113 GAK
114 ATM115 〔ATM又はGTL〕116 GAK117 AAJ118 GA
K119 CAJ120 AAK121 GGL122 GCL123 ATM124 ACL
125 XTY126 〔QRS又はGAK〕127 GAJ128 TGG129 AA
J130 GCL131 TAK132 ACL133 AAJ134 QRS135 GCL
136 GGL137 ATM138 ATM139 CAJ140 〔ACL又はQR
S〕141 QRS142 GAJ143 〔GAJ又はGAK〕144 TGK145
GAJ146 GAJ147 ACL148 TTK149 WGZ150 GTL151
TGK152 GAK153 ATM154 GAK155 GAJ156 QRS157 GG
L158 CAJ159 XTY160 GAK161 GTL162 GAK163 GAJ
164 ATG165 ACL166 WGZ167 CAJ168 CAK169 XTY
170 GGL171 TTK172 TGG173 TAK174 ACL175 ATG
176 GAK177 CCL178 GCL179 TGK180 GAJ181 AAJ
182 XTY183 TAK184 GGL185 GGL186 GCL187 GTL
188 CCL189〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオ
キシグアニル、Ｃはデオキシシトシル、Ｔはデオキシチ
ミジル、ＪはＡ又はG;KはＴ又はC;LはA,T,C,又はG;Mは
A,C又はT;Xはそれに続くＹがＡ又はＧのときＴ又はC,そ
れに続くＹがＣ又はＴのときはC;Yはそれに先立つＸが
ＣのときA,G,C又はＴ、それに先立つＸがＴのときはＡ
又はG;Wはそれに続くＺがＧ又はＡのときはＣ又はA,そ
れに続くＺがＣ又はＴのときはC;Zはそれに先立つＷが
ＣのときはA,G,C又はＴ、それに先立つＷがＡのときは
Ａ又はG;QRはそれに続くＳがA,G,C又はＴのときはTC,そ
れに続くＳがＴ又はＣのときはAG;Sはそれに先立つQRが
TCのときはA,G,C又はT,それに先立つQRがAGのときはＴ
又はC;であり、下付き番号は遺伝暗号によつてこのヌク
レオチド配列が対応するアポエクオリンのアミノ酸位置
を示し、アミノ酸位置はアミノ末端から数えたものであ
る〕 のヌクレオチド配列又は前記のペプチドをコードしてい
るヌクレオチド配列を含むDNA分子、組換えDNAベクタ
ー、及び修飾微生物もまた、遺伝子工学技術による上述
のようなペプチドの製造に関係する本発明の好適な一面
の実施用として提供される。 図面の簡単な説明 添附図面により特定の実施例で得られた結果を示す。
前記実施例は本発明を示すものであつて、本発明を限定
するものではない。 第１図は、オワンクラゲ（Aequorea Jellyfish）から
単離されたポリ（A+）RNAを用いてイン・ビトロで翻訳
されたタンパクをオートラジオグラフイー分析した結果
を示す写真である。翻訳は、オワンクラゲ ポリ（A+）
RNAの非存在下（レーン１）、存在下（レーン３）で行
なつた。２種の反応からの抗エクオリン免疫沈降タンパ
クを夫々、レーン２および４に示した。図の右側に、タ
ンパク分子量標準のホスホリラーゼｂ、BSA、卵アルブ
ミン、炭酸脱水酵素、SBT1およびリソチームの位置を示
す。天然エクオリンの位置も図示している。 第２（ａ）図は、アポエクオリンをコードするDNA配
列を含むオワンクラゲ（Aequorea victoria Jellyfis
h）から単離した遺伝子の制限地図であり、第２（ｂ）
図は、lacプロモーターの下流でプラスミドに挿入され
た第２（ａ）図のセグメントの制限地図である。 第３図は、pAEQ1抽出物中のCa2+−依存性発光タンパ
ク活性の時間および酸素依存性を示すグラフである。使
用した条件は次の通りである。 （ａ）曲線１および２では、活性画分0.5mlをβ−メル
カプトエタノール2mMおよび腔腸動物のルシフエリン0.1
mMに調製し、４℃でインキユベートした。適当な時間間
隔で５μｌを抜き取り、発光タンパク活性を調べた。 （ｂ）曲線２では、Arガスを泡立てて溶解O2レベルを低
下させ、混合物を表示した時に酸素と接触させた。 （ｃ）曲線３では、pAEQ1抽出物の代りに培養混合物中
に天然アポエクオリンを用いた。 第４図は、pAEQ1抽出物から生ずるCa2+−依存性発光
タンパク活性のゲル過プロフイールのグラフである。
pAEQ1抽出物からの部分精製されたアポエクオリン活性
分を用いて、第３図に記載したようにCa2+−依存性発光
タンパク活性を発生させた。次いで、この発光タンパク
画分（50μｌ）を、10mMEDTA、15mM Tris pH7.5おび100
mMKClを用いて平衡化させたＧ−75−40スーパーフアイ
ン（superfine）カラム（ベツド容量30.7ml）に充填し
た。各種分子量標識物質の溶離位置を示す。 好ましい具体例の記載 本発明者は、微生物中でタンパクアポエクオリンを発
現しうる組換えDNAベクターを初めて得、次いでアポエ
クオリンのアミノ酸配列を初めて同定した。これによ
り、均質なアポエクオリンの入手が可能となる。この情
報を用いて、適量の均質アポエクオリンを入手すること
ができる各種組換えDNAベクターが得られる。一般的な
組換えDNA技法を用いて別の組換えDNAベクターを産生す
ることができる。アポエクオリンを発現する形質転換体
もこの技術の例として産生された。 アポエクオリンのアミノ酸配列を表３に示す。 各アミノ酸を１文字で表記してアポエクオリンのアミ
ノ酸配列を示す。配列中の微不均一性の位置を括弧内の
文字で示す。表示したアミノ酸置換全てで生物学的機能
性を有するエクオリンを表わす。上記配列中の文字に対
応するアミノ酸は次の通りであえる。 A:アラニン、C:システイン,D:アスパラギン酸,E:グルタ
ミン酸,F:フエニルアラニン,G:グリシン,H:ヒスチジン,
I:イソロイシン,K:リシン,L:ロイシン,M:メチオニン,N:
アスパラギン,P:プロリン,Q:グルタミン、R:アルギニ
ン,S:セリン,T:トレオニン,V:バリン,W:トリプトフア
ン,Y:チロシン ペプチドのアミノ酸とペプチドをコードするDNA配列
との間に明確な対応関係があることは知られているの
で、アポエクオリン（或いは後記する変性ペプチド）を
コードするRNA分子またはDNA分子のDNA配列はこのアミ
ノ酸配列から容易に誘導され得る。アポエクオリンDNA
の一本の鎖のヌクレオチド配列を表４に示す。表中、数
字はタンパクのアミノ末端で開始するアミノ酸配列およ
び対応するDNAコドン配列を示す。mRNAではＵがＴに代
わつている点を除いてDNA配列はmRNA配列に対応してい
る。 遺伝子のDNA配列は十分に同定されているので、DNA遺
伝子を全くの科学的合成によつて産生することができ
る。その後、遺伝子を公知の組換えDNA技法を用いて多
くの入手可能なDNAベクターに挿入することができる。
従つて、本発明は、本願出願当時一般に自由に入手でき
る試薬、プラスミドおよび微生物を用いて実施されう
る。 例えば、塩基長さが100以上のヌクレオチド配列は、
アプライドバイオシステムス（Applied Biosystems）モ
デル380 A DNA合成装置を用いて容易に合成されうる。 なお同装置については、例えばジエネテイツクエンジ
ニアリングニユース（Genetic Engineering News）、No
r/Dec.1984 p.3に広告されている如く周知のものであ
る。前記オリゴヌクレオチドを後記する技術を用いてス
プライスすると本明細書に記載されているヌクレオチド
配列が得られる。 更に、本明細書に記載されているペプチド類を容易に
直接合成しうる自動化装置も入手可能である。上記ジエ
ネテイツク エンジニアリング ニユースの同じ号に
は、99％を超える結合効率を有する市販の自動ペプチド
合成装置の広告が掲載されている（p.34）。前記装置を
用いると、直接合成により或いは他の公知の方法で結合
されうる一連の断片を合成することにより本発明のペプ
チドを簡単に得ることができる。 表３に示した特定のペプチド配列の他に、これらの配
列をベースとし僅かな変更を加えた他のペプチドもアポ
エクオリンの生物学的活性を有する。例えば、配列末端
の一方もしくは両方から最高15個のアミノ酸が欠けてい
ても、ルシフエリンおよびカルシウム結合能は失なわれ
ない。同様に、末端の一方もしくは両方に最高10個のア
ミノ酸が更に付加されていてもよい。こうした変更（修
正）は、ルシフエリンおよびカルシウム結合部位が上記
配列の中央のアミノ酸にあるから可能なのである。例え
ば、アミノ酸40−100にルシフエリン結合部位があるよ
うである。末端は生物学的活性に比較的重要な影響を及
ぼさないので、付加アミノ酸の本質は重要でなく、かつ
上記アミノ酸のいずれでもよい。 アミン末端の付加アミノ酸が生物発光に大した影響を
有しないことを立証する実験データもある。しかしなが
ら、上記した特定式により極めて近似したもの、特にい
ずれかの末端の10個あるいはそれ以下好ましくは５個あ
るいはそれ以下のアミノ酸を欠くか、もしくはいずれか
の末端に７個あるいはそれ以下、好ましくは４個あるい
はそれ以下のアミノ酸が付加されている化合物、もしく
は、アミノ末端に、−MET THR SER GLU GLN TYR SER−
の配列を有する付加アミノ酸が連続的に結合している化
合物が好ましい。 分子の中央部分のアミノ酸を置換することは、生物学
的活性を維持するためにより限定される。しかしなが
ら、表３または表４に示した微不均一性の全ゆる部分が
生物学的機能を有する置換を示し、指示した置換をいか
ように組合わせても機能性分子を表わすであろう。表３
および表４中、メインライン（表３中かっこでくくって
ない配列）または第１エントリー（表４のかっこ内の最
初のもの）はその位置でより広く用いられているアミノ
酸またはヌクレオチドを示しより好ましいものである。 更に前記ペプチドおよびDNA分子を僅かに変更させた
ものも、当業者には明らかなようにより詳細に述べるペ
プチドおよびDNA分子と同等のものとしてみなされる。
例えば、特に置換が結合部位のアミノ酸に関連していな
いならば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、ア
スパラギン酸をグルタミン酸で、トレオニンをセリンで
単離（isolated）置換しても、或いはアミノ酸を構造的
に関連するアミノ酸で同様に置換しても、得られた分子
の生物学的活性に重大な影響はないことは予想される。
機能性ペプチドに変化が生じるかどうかは得られたペプ
チドをルシフエリンとインキユベートし、次いでカルシ
ウムイオンと接触させることにより簡単に調べることが
できる。この方法についての詳細は後記する。光が発す
れば置換は実体的ではなく、被験分子は表３の分子と同
等である。１個あるいはそれ以上の置換が行なわれてい
るペプチドも同様にして容易に試験されうる。 前記ペプチドをコードするDNA分子は、表１に示した
コドンのリストから容易に決定され、これも同様に表４
のDNA配列と同等のものとみなされる。実際ペプチド内
のDNAコドンとアミノ酸とは1:1で対応しているので、ペ
プチドでの置換あるいは他の変化に関する本明細書中の
議論は対応するDNA配列や、その配列を含むDNA分子，組
換えベクターまたは形質転換微生物（およびその逆）に
も均等にあてはめることができる。 表４に示した特定のヌクレオチドに加えて、本発明の
DNA（或いは対応するRNA）分子は前記特定のヌクレオチ
ドの前後いずれに追加のヌクレオチドを有していてもよ
い。例えば、ポリＡを３′末端に付加することもでき
る。何れかの末端に短い（例えば20より少ないヌクレオ
チド）配列を付加して、制限酵素部位に対応する末端配
列としてもよい。停止コドンをペプチド配列に続けて、
転写を終止させてもよい。更に、遺伝子の上流にプロモ
ータ領域或いは他のコントロール領域を含むDNA分子を
達成することもできる。本発明の配列を含むDNA分子は
全て細かく断片化されて本明細書に後記する種類のオリ
ゴヌクレオチドプローブを産生することができるので、
前記DNA分子は全て少なくとも１つの目的に対して有用
である。 本発明のペプチドは、直接合成により或いは本明細書
に記載されているクローン化遺伝子を用いることにより
初めて均質物として作成されうる。ここで“均質（homo
geneous）”とは、ペプチド或いはDNA配列について言及
するときには、当該組成物中に存在する実質的に全ての
分子の一次分子構造（即ちアミノ酸もしくはヌクレオチ
ド配列）が同一であることを意味する。前記した“実質
的に”という用語は少なくとも95重量％、より好ましく
は少なくとも99重量％、最も好ましくは少なくとも99.8
重量％を意味する。均質ペプチドあるいはDNA配列の全
分子に由来する断片が存在する場合、そのような断片が
５重量％以下、好ましくは１重量％、より好ましくは0.
2重量％以下存在しているならば均質性（homogeity）を
調べるときに考慮しなくともよい。何故ならば、（天然
アポエクオリン中に存在する混合物のように）一次分子
構造が異なる分子量の類似した幾つかの分子が存在する
混合物とは対照的に、単一の一定した構造を有する全分
子（およびその断片）の存在を“均質”という用語が指
しているからである。本明細書で使用した“単離された
（isolated）”という用語は、夫々他のペプチド類,DNA
類またはRNA類から分離されかつこの生化学的溶液中に
通常存在する溶媒，緩衝液、イオン或いは他の成分のみ
の存在下でみとめられる純粋なペプチド、DNA或いはRNA
を指す。“単離された”の中に、天然の（native）状態
の天然物質、或いは（例えばアクリルアミドゲル中で）
成分に分離されているが純粋な物質または溶液として得
られていない天然物質は含まれない。本明細書中“純
粋”という用語は上記した“実質的”と同じ数値制限を
有するのが好ましい。本明細書中“……により置換され
る”或いは“置換”というフレーズは、指示した“置
換”アミノ酸が別の式中に存在することが指示されてい
るアミノ酸と同じ位置に存在する場合（例えばセリンが
プロリンの代りに５の位置に存在する場合）存在するペ
プチドを指すのであって行なわれる作用そのものを指す
とは限らない。 本明細書に記載のペプチドの塩類とは、該ペプチドが
各種pHの水溶液中に存在する（或いは前記水溶液から単
離された）ときに天然に存在するものである。上記した
生物学的活性を有するペプチドの塩類は全て本発明の範
囲内にあるとみなされる。カルボン酸残基のアルカリ，
アルカリ土類および他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩
（例えばHCl）および同一分子内のカルボン酸残基とア
ミノ残基との反応により形成される両性イオンが例示さ
れる。 本発明は特に、表３および表４にリストされているア
ミノ酸やコドンの可能な選択に基づく組合せを選択する
ことによってなされうる種々のヌクレオチドまたはペプ
チドの可能な変形の各々および全てを包含しており、こ
れら全ての変種も特に開示されたものとみなされる。 本発明の好ましい具体例では、mRNAとしてコードされ
る遺伝情報はオワンクラゲ（Aequorea jellyfish）から
得られ、DNA遺伝子の構成に使用される。続いて前記DNA
遺伝子を用いて本発明ペプチドが産生される。 オワンクラゲの光発光器官からの細胞抽出物を使用す
ることが好ましい。ただし、全体細胞抽出物を使用する
ことも可能である。典型的には、クラゲまたはその一部
を小片に切断し（切り刻み）、小片をすり砕して初期の
粗細胞懸濁液を形成する。細胞懸濁液に音波処理あるい
はその他の処理を加えて細胞膜を破壊し、粗な細胞抽出
物を得る。所望により、公知の生化学的手法（例えばタ
ンパクの選択的沈殿）を用いて初期精製することもでき
る。粗の細胞抽出物あるいはそれからの部分精製RNA部
分を処理して更にRNAを分離する。例えば粗な細胞抽出
物を、１インチ×3.5インチのニトロセルロースチユー
ブ中の5.7MCsCl,10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EDTAの5ml
クツシヨンの頂部に重層し、SW27ローター（ベツクマン
・インストルメント社，（Beckman Instruments Cor
p.），フラートン（Fullerton），カリホルニア）を用
いて15℃、27000rpmで16時間遠心分離することができ
る。遠心分離後、チユーブ内容物をデカントし、チユー
ブから水を流去させ、澄明なRNAペレツトを含む底1/2cm
をレーザー刃で切断する。ペレツトをフラスコに移し、
10mM Tris−HCl、pH7.5,1mM EDTA,5％サルコシル（sarc
osyl）および５％フエノール20ml中に溶解させる。次い
で溶液をNaCl0.1Mに調整し、フエノール−クロロホルム
混合物（1:1）40mlを加えて振盪させる。RNAが、0.2M酢
酸ナトリウムpH5.5の存在下でエタノールを用いて処理
すると水性相から沈殿し、これを遠心分離により回収す
る。この方法の代りに、細胞源からRNAを単離する別の
いずれの方法を使用することも可能である。 配列および分子サイズの点で不均質なポリアデニル化
された。粗なあるいは部分的に精製されたmRNAのような
各種形態のRNAも使用されうる。RNA単離方法の選択性
は、単離されたRNAの不均一分散相中に所望のmRNAを多
く含ませることになるあらゆる方法によつて影響され
る。上記のような使用した予備的精製方法によつてmRNA
のエンドヌクレアーゼ開裂（endonucleolytic cleavag
e）を招かなければ、本発明の遺伝子の作成にどんな精
製方法も使用しうる。 所望のmRNA配列を豊富にするための予精製は、RNAを
細胞から単離後RNAを分画化するための従来方法を用い
て行うこともできる。RNAを分解することのないあらゆ
る技術が使用できる。シヨ糖勾配での調製用沈降法およ
びゲル電気泳動法が特に適当である。 mRNAは、mRNAの分解を防ぐ条件下で源細胞から単離し
なければならない。R Nase酵素はRNAヌクレオチド配列
を加水分解する能力を有しているので、これら酵素の作
用は特に避けなければならない。細胞からの抽出中にR
Naseを阻害する適切な方法としては、細胞破壊段階で4M
グアニジニウムチオシアネートおよび1Mメルカプトエタ
ノールを使用することが適当である。加えて、単離され
たRNAのR Nase分解を抑えるには低温度および5.0に近い
pHが有用である。 一般に、mRNAは汚染タンパク,DNA,ポリサツカライド
および脂質を本質的に含まずに作成される。このように
精製するための標準的な方法は当業界で公知である。こ
うして単離されたRNAは非メツセンジヤーおよびメツセ
ンジヤーRNAを含む。真核生物のmRNAを分離するには、
真核生物mRNAの３′末端にポリアデニル酸が存在するた
めにもたらされる水素結合特異性を利用して、オリゴ−
dTセルロースあるいは他のオリゴヌクレオチド置換カラ
ム材料例えばポリＵ−セフアロースのカラムを用いるク
ロマトグラフイーにかけるのが一般的である。 通常の次の工程は、単離されたmRNAの不均質配列に相
補的なDNAを形成することにある。この反応のために原
則的にはmRNA鋳型の相補的DNAコピーを正確に形成しう
る酵素であれば使用しうるが、逆転写酵素が選択され
る。反応は先行技術に記載された条件下で、鋳型として
mRNAおよびDNA鎖の前駆物質として４種のデオキシヌク
レオシド トリフオスフエート、即ちdATP,dGTP,dCTPお
よびdTTPの混合物を用いて実施される。反応過程をモニ
ターし、クロマトグラフイーや電気泳動等で分離後生成
物を回収するための目的（tag）を与えるために、かつ
回収率を定量評価する目的で、ヂオキシヌクレオチド
トリフオスフエートの１種のアルフア位を放射性同位元
素例えば32Pで標識することが好都合である。上記した
エフストラテイアデイス、エー（Efstratiadis,A.）ら
の文献を参照されたい。 逆転写酵素反応により生成されるcDNA転写物は、mRNA
鋳型に対する各転写物の開始点および終結点が異つてい
るために５′末端並びに３′末端の配列が幾分異質であ
る。５′末端の変異性は、合成を開始するために使用さ
れるオリゴ−dTプライマーはmRNAのポリアデニル化領域
に沿つた各種地点で結合し得るためと考えられる。cDNA
転写物はポリ−Ａ領域の中間点で合成が開始され、各種
長さのポリ−Ａ領域がオリゴ−dTプライマーの初期結合
サイトに応じて転写される。この不確実性は、オリゴ−
dTトラクト（tract）に加えてRNA配列それ自体のヌクレ
オチド１個あるいは２個を含むプライマーを使用すれば
避けられ、転写反応を開始するのに好ましくかつ一定の
結合サイトを有するプライマーが生成される。 cDNA転写物（transcript）の３′末端の不確実性は、
逆転写酵素反応に影響を及ぼす各種因子およびRNA鋳型
の部分的分解の恐れによるものである。最大長さを有す
る特定のcDNA転写物は、逆転写酵素反応条件を十分な長
さ（full length）の合成に好都合でありDNA短鎖の合成
を抑制するように選択すれば極めて容易に単離される。
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素のための好ましい反
応条件は、米国特許第4,363,877号明細書の実施例に記
載されており、前記明細書は本明細書中に緩用される。
長鎖DNA転写物を高い確実度で最大に生成すべく変更さ
れうる特殊パラメーターは反応温度、塩濃度、酵素量、
鋳型に対するプライマー濃度および反応時間である。 温度および塩濃度条件は、オリゴ−dTプライマーとRN
A鋳型のポリアデニル化部分との間の特殊な塩基対合（b
ase−pairing）を最適にするように選択される。適切に
選択された条件下で、プライマーはRNA鋳型のポリアデ
ニル化領域で結合し、短かいＡ−リツチ配列のような鋳
型上の別の位置でのプライマー結合による非特異的開始
反応は実質的に避けられる。温度および塩濃度の影響は
相互依存性である。温度を高くし塩濃度を低くすると、
特異的な塩基対合相互作用の安定性が低下する。反応時
間は、非特異的開始反応を回避しかつ分解の機会を最小
限にするために出来る限り短く保たれる。反応時間は温
度と相関関係にあり、温度が低ければ反応時間は長時間
を要する。42℃では１〜10分の反応時間が適当である。
プライマーはRNA鋳型に対して50〜500倍モル過剰に存在
させなければならず、酵素もRNA鋳型に対して同様にモ
ル過剰で存在させなければならない。過剰の酵素および
プライマーを使用すると開始反応およびcDNA鎖の成長が
促進され、長鎖のcDNA転写物が限られた短いインキユベ
ーシヨン時間内に効率よく産生される。 多くの場合、mRNAから転写された一本鎖cDNAを使用し
て該cDNAをさらに精製することが可能であろう。しかし
下記に論ずるように、所望の制限酵素が２本鎖DNAに対
してしか作用しない場合がある。この場合、前記のよう
にして調製されたcDNAは、例えばリバーストランスクリ
プターゼのようなDNAポリメラーゼ及び１本鎖DNAを加水
分解できるヌクレアーゼを使用して、２本鎖DNA合成用
の鋳型として使用できる。この方法による２本鎖DNAの
調製方法は先行文献に記載されている。例えば、ウルリ
ツチ（Ullrich）.A.,シヤイン（Shine）.J.,チヤーグウ
イン（Chirgwin）,J.,ピクテツト（Pictet）,R.,テイシ
エー（Tischer）、E.,ルター（Rutter）、W.J.及びグツ
ドマン（Goodman）,H.M.,サイエンス（Science）196,13
13（1977）を参照されたい。必須ではないが所望により
米国特許第4,363,877号の方法によりcDNAを更に精製す
ることも可能である。この方法においては、不均一mRNA
配列の転写により調製された不均一cDNAを、１種あるい
は２種の制限エンドヌクレアーゼにより処理する。使用
するエンドヌクレアーゼの選択はまず第１に単離したい
cDNA配列中に存在する酵素認識部位の予備測定に依る。
この方法は２つのそのような部位の存在に左右される。
該部位が同一である場合、一つの酵素で十分である。所
望配列は両部位で開裂され、所望cDNA配列に関する限り
サイズの不均一性が取り除かれ、所望配列を含み長さが
均一なフラグメント（断片）と指称ある分子の数を増大
する。制限部位が異なる場合は、所望の長さの均一なフ
ラグメントを生成するために２つの酵素が必要である。 所望のタンパク質の全体あるいは一部をコードする最
適長さのヌクレオチド配列フラグメントを生成できる制
限酵素の選択は経験的に成されなければならない。所望
のタンパク質のアミノ酸配列が既知である場合は、制限
エンドヌクレアーゼ開裂により生成された統一された長
さのフラグメントのヌクレオチド配列を、それがコード
するアミノ酸配列と、全ての生物の形態に共通な遺伝子
コード（遺伝暗号）の公知の関係を使用して比較するこ
とができる。しかしながら、部分的な配列に基いて必要
程度に正確な同定ができるので、所望タンパク質の完全
なアミノ酸配列は必要ではない。所望タンパク質のアミ
ノ酸配列が既に判明していない場合、制限エンドヌクレ
アーゼ開裂によつて生成された統一長のポリヌクレオチ
ドは、適当なin vitroのタンパク質合成系において所望
タンパク質の合成を検知し得るプローブとして使用し得
る。あるいは、mRNAはアフイニテイークロマトグラフイ
ーにより精製し得る。当業者により考えられ得るその他
の技術も本目的に適当なものとなろう。 使用に適した制限酵素の数は、一本鎖cDNAを使用する
か２本鎖cDNAを使用するかに依る。好ましい酵素は一本
鎖DNAに対して作用できるものであり、一本鎖DNAはmRNA
逆転写の直接の反応生成物である。現在知られている一
本鎖DNAに作用し得る制限酵素の数は限られている。酵
素HaeIII,HhaI及びHin（ｆ）Ｉが現在知られている適し
たものである。さらに、酵素MboIIも一本鎖DNAに作用し
得る。さらに研究されて他の制限酵素が一本鎖DNAに作
用し得ることが判明した場合は、そのような酵素も好ま
しい酵素の一端に加えられるであろう。２本鎖cDNAに特
異的なものも適した酵素に加えられる。このような酵素
は、２本鎖cDNAを生成するために付加的な反応を必要と
し、長い配列のロス及び不完全な回収によるその他のロ
スの機会を増加させるので好ましくない。二本鎖cDNAを
使用すると更に、事後の配列分析がより複雑な労力を要
するという技術的不利を招く。これ等の理由から一本鎖
cDNAが好ましいが、２本鎖DNAの使用も可能である。実
際、本発明は当初２本鎖cDNAを用いて実施されたもので
ある。 制限エンドヌクレアーゼ処理のために調製されるcDNA
は、放射活性標識として後の分離段階で検知し得るよう
にしてもよい。好ましい方法は32Pのような放射活性標
識を４つのデオキシヌクレオシドトリフオスフエート前
駆体のうちの１つのα位置に結合するものである。最高
の活性は、放射活性前駆体の濃度が非放射活性形状のも
のの濃度に対して高い時に得られる。しかしどのような
デオキシヌクレオシドトリフオスフエートの全濃度も、
逆転写酵素反応において得られるcDNAの長さを最大にす
るために30μＭよりも大きくなければならない。エフス
トラテイアデイス（Efstratiadis）、A.,、アニアテイ
ス（Maniatis）、T.,カフアトス（Kafatos）、F.C.ジエ
フリー（Jeffrey）、A.及びボーナキス（Vournakis）、
J.N.,セル(Cell) 4,367（1975）を参照されたい。cDNAの
ヌクレオチド配列を決定する目的で、ポリヌクレオチド
キナーゼ酵素により触媒される反応において32Pで５′
末端を標識するのが便利である。マキザム（Maxam）、
A.M.及びギルバート（Gilbert）、W.,ブロク・ナトル・
アカド・スシ(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 74,560（1977）
を参照されたい。 一つの制限酵素あるいは２つの制限酵素の組合せの作
用により生成されたフラグメントは、異なる長さに基い
てポリヌクレオチドを分離できる何等かの方法により、
お互いに及び認識部位を欠く不均一分散配列（heterodi
sperse sequences）から分離し得る。そのような方法と
しては様々な電気泳動法及び超遠心を使用した沈降法が
含まれる。ゲル電気泳動は、ポリヌクレオチド長に基い
て最良の分解能が得られるので好ましい。さらに該方法
では分離物質の定量的回収が容易である。便利な電気泳
動法がデイングマン（Dingman）、C.W.及びピーコツク
（Peacock）、A.C.バイオケミストリー(Biochemistr
y)，7,659（1968）及びマニアテイス（Maniatis）、T.,
ジエフリー（Jeffrey）、A.及びバンドサンド（van de
Sande）、H.,バイオケミストリー、14、3787（1975）に
開示されている。 種々のソースから得られたcDNA転写物の殆んどは、制
限エンドヌクレーゼ処理に先立ち、長さにおいて不均一
分散であることが判明するであろう。適当に選択された
制限エンドヌクレアーゼあるいはエンドヌクレアーゼ対
の作用により、所望の配列を含むポリヌクレオチド鎖が
各制限部位で開裂され、統一長のポリヌクレオチドフラ
グメントを生成する。ゲル電気泳動においてこれ等は異
なるバンドを形成することが観察される。他の配列にお
ける制限部位の有無により、他の分離したバンドが同様
に形成され得るが、それは所望配列のものとは異なる長
さのものであろう。従つて制限エンドヌクレアーゼ作用
の結果により、ゲル電気泳動パターンは１つ以上の分離
したバンドを見せるが、残りのcDNAは不均一分散のまま
になるであろう。所望のcDNA配列が存在する主要なポリ
ヌクレオチドの種から成る場合は、電気泳動パターンは
このcDNAの殆んどが分離バンド中に存在するということ
を示すであろう。 ２つの異なる配列が制限酵素により開裂されて殆んど
同じ長さのフラグメントを生成するということはありそ
うにもないが、規定長のフラグメントの純度検定法は望
ましいものである。電気泳動バンドの配列分析は、バン
ド中の物質の10％以上の不純物の検出には使用できる。
最初の単離方法に適用したのと同じ一般的原理に基い
て、低レベルの不純物を検知する方法が研究されて来
た。該方法においては、所望ヌクレオチド配列フラグメ
ントが最初の単離においては使用されなかった制限エン
ドヌクレアーゼに対する認識部位を含んでいることが必
要である。ゲル電気泳動バンドから溶出されたポリヌク
レオチド材料を所望配列に内的に作用し得る制限エンド
ヌクレアーゼで処理すると、所望配列が殆んどは非等長
の２つのサブフラグメントに開裂される。これ等のサブ
フラグメントは電気泳動においてそれぞれの長さに対応
する位置に別々のバンドを形成し、それ等の合成は開裂
前のポリヌクレオチドの長さに等しいはずである。制限
酵素に対して敏感でない最初のバンド中の不純物は最初
の位置に移動するであろうと考えられる。前記酵素に対
する１つ以上の認識部位を含む不純物は２つ以上のサブ
フラグメントを生成すると考えられる。認識部位の分布
は本質的にランダムであると考えられるので、不純物が
所望配列のフラグメントと同じ大きさのサブフラグメン
トを生成する可能性は極めて低い。放射活性標識ポリヌ
クレオチドバンドに存在する材料の量は、各バンドに存
在する放射活性の量の定量測定、あるいはその他の適当
な方法により測定できる。所望配列のフラグメントの純
度の定量的測定は、所望配列のサブフラグメントを示す
バンド中に存在する材料の量を材料総量と比較して得る
ことができる。 前記の分離、あるいは所望の遺伝子を単離するその他
の方法の後、該配列を再結合し得る。DNAフラグメント
の末端と末端との結合を触媒する酵素DNAリガーゼをこ
の目的に使用し得る。所望配列のサブフラグメントを示
すゲル電気泳動バンドを別々に溶出し、適当な条件下で
のDNAリガーゼを存在させて一緒にする。スガラメラ（S
garamella）、V.,バンデサンデ（Van de Sande）、J.H.
及びコラナ（Khorana）、H.G.,ブロク・ナトル・アカド
・スシ(Proc.Natl,Acad.Sci)、USA 67、1468（1970）
を参照されたい。結合する配列が平滑末端でない場合
は、E.coliより得られたリガーゼが使用し得る（モドリ
ツチ（Modrich）、P.及びレーマン（Lehman）、I.R.,ジ
エイ・バイオル・ケム(J.Biol.Chem.)、245、3626（197
0））。 制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたサブフ
ラグメントからのオリジナル配列再結合の効率は、不適
当な配列の再結合を防ぐ方法を使用することにより非常
に増大する。この望ましくない結果は、制限エンドヌク
レアーゼによる均一（均質）cDNAの開裂の前にcDNA上の
５′−末端リン酸基を除去し得る試薬で所望配列の均一
長cDNAフラグメントを処理しておくことによつて防止で
きる。酵素アルカリフオスフアターゼが好ましい。５′
末端リン酸基は、後の開裂サグフラグメントの再結合に
使用されるDNAリガーゼの結合作用において構造的必要
条件である。従つて、５′−末端リン酸を欠く末端は共
有結合され得ない。DNAサブフラグメントは、単離DNAフ
ラグメントについて成される制限エンドヌクレアーゼに
よる開裂によつて生成される５′−リン酸を含む末端に
おいてのみ結合される。 上述の条件下では、cDNA転写体の大部分は、mRNA鋳型
の５′−末端を含むmRNA領域から同じ鋳型に対して制限
エンドヌクレアーゼ開裂により得られたフラグメントを
特異的なプライマーとすることによつて得られる。この
ようにして、前記の方法は、所望タンパク質に関連する
特異的ヌクレオチド配列のフラグメントだけでなく、当
該タンパク質をコードした全ヌクレオチド配列を得るの
にも使用し得る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチ
ドリンカーであつて、制限エンドヌクレアーゼの認識配
列を有する２本鎖リンカーを単離cDNAの末端に付けて、
後のベクターDNAからの遺伝子部分の酵素的除去を容易
化することができる。シエラー（Scheller）、R.H.等、
サイエンス(Science) 196、177（2977）を参照された
い。ベクターDNAは適当な制限エンドヌクレアーゼによ
る処理により、連続ループから直鎖形状に変換される。
それによつて形成された末端はアルカリフオスフアター
ゼで処理して５′−リン酸末端基を除去し、ベクターDN
AがDNAリガーゼ反応において第１にアポエクオリンDNA
セグメントを取り込むことなしに連続ループを形成しな
いようにする。リンカーオリゴヌクレオチドを伴なうcD
NAと処理済ベクターDNAをDNAリガーゼ酵素と混合し、cD
NAをベクターDNAに結合してcDNAを取り込んでその中に
有する組換ベクターDNAの連続ループを形成する。プラ
スミドベクターを使用する場合、通常該閉鎖ループがバ
クテリアの形質転換を行える唯一の形となる。形質転換
とは、当該分野で理解され本明細書でも使用されている
ように、微生物のそれ自身の遺伝子構造内に細胞外DNA
を取り込む工程を指すものである。閉鎖ループ形状のプ
ラスミドDNAは適当な環境条件下でそのように取り込ま
れる。取り込まれた閉鎖ループプラスミドは形質転換細
胞中で複製を受け、その複製コピーは細胞***が起きる
と子細胞にも伝えられる。その結果、プラスミドを含有
しその遺伝子デターミナントを持つた新規なセルライン
が樹立される。プラスミドの複製によりプラスミド遺伝
子がセルライン中に維持されるようなこの方法における
プラスミドによる形質転換は、形質転換プラスミドDNA
が閉鎖ループ形状であると高い確率で起り、直鎖状のプ
ラスミドDNAを使用すると全く起らないか、あるいはま
れにしか起らない。一担組換えベクターが形成される
と、適当な微生物の形質転換は単純な工程であり、当業
者に理解されるような適当な選択技術を使用してアポエ
クオリン遺伝子を含む新規な微生物株を容易に単離でき
る。 要約すると下記のようにして、Aequoreaクラゲから遺
伝子情報を得、cDNAに変換し、ベクターに挿入し、宿主
微生物の形質転換に使用し、アポエクオリンを発現でき
る。 1.Aequoreaクラゲからポリ（A+）RNAを単離する。 2.in vitroで１本鎖cDNAを合成し、その後逆転写酵素
を使用して２本鎖cDNAを合成する。 3.S1ヌクレアーゼにより１本鎖部分を消化する。 4.ゲル口過で２本鎖cDNAをサイズにより分画化する。 5.ターミナルトランスフエラーゼ及びdCTPを使用してcD
NAをテイリングする。 6.Pst１によりpBR322を消化して、ターミナルトランス
フエラーゼ及びdGTPにより直鎖状DNAをテイリングす
る。 7.dC−テイリングcDNAフラグメントとdG−テイリングpB
R322をアニーリングする。 8.E.coli SK1592を形質転換する。テトラサイクリン耐
性コロニーを選択する。 9.アンピシリン感受性に形質転換されたものをスクリー
ニングする。tetRampSコロニーは組換えプラスミドを含
有する。それ等を−80℃で保存する。 10.オリゴヌクレオチド混合プローブ（既知アミノ酸配
列より演繹した配列を使用）を放射活性で標識する。 11.ニトロセルロースフイルター上でAequorea cDNAバン
クの各構成員を培養する。コロニーを溶解し、DNAをフ
イルターに固定する。 12.32P標識オリゴヌクレオチド混合物をニトロセルロー
スフイルターにハイブリダイゼーシヨンさせる。この32
P−プローブは、エクオリンcDNA配列を含むE.coli組換
え体由来のプラスミドDNAとハイブリダイゼーシヨンす
る。 13.過剰の32P−プローブをフイルターから洗浄する。 14.X線フイルムをフイルターに露出する。 15.Aequorea cDNAバンク中で同定された組換体からプラ
スミドDNAを調製する。 16.32P−標識オリゴヌクレオチドをプラスミドDNA（サ
ザンプロツト）にハイブリダイゼーシヨンさせ、ハイブ
リダイゼーシヨンを確認する。 17.pH7.2のEDTA含有バツフアー中でこれ等の組換体の抽
出物を調製し、組換体にエクオリンDNA配列が含まれて
いることを示す。腔腸動物ルシフエリン及びβ−メルカ
プトエタノールを加え、一夜４℃にインキユベートして
発現アポタンパク質をチヤージする。エクオリンアポタ
ンパク質を発現する試料はCa+2の添加により青色光を発
する。 上記に一連の工程を記載したが、遺伝子工学分野の技
術者の知識と前述したガイドラインを合わせれば所望の
遺伝子の単離及び組換DNAベクターでその使用は容易に
可能であろうし、同じ結果が得られる他の方法も判り、
本発明の組換DNAベクターの調製に使用できるであろ
う。 宿主中で再生成することが判明しているベクターを選
択することによつて形質転換宿主中にアポエクオリン遺
伝子のコピーを多数存在させ、外因的な挿入DNA（例え
ばpUC8、ptac12あるいはpIN−III−ompA1,2又は３）か
ら多量のタンパク質を生成する方法、あるいは公知のそ
の他のペプチド発現増加手段を用いてアポエクオリンの
発現を増加させることができる。 全ての場合においてアポエクオリンは、DNA配列がベ
クターに機能的に挿入された時に発現される。「機能的
に挿入された」とは、当業者にはよく理解されるよう
に、適正な解読枠と配向にあるということを意味する。
典型的にはアポエクオリン遺伝子はブロモーターから下
流に挿入され、その後に停止コドンが位置する。所望に
より後に開裂を伴うハイブリツドタンパク質として生成
してもそうである。 上記したような、本発明の実施による組換DNA分子及
び形質転換単細胞生物の調製に使用できる一般的方法に
加えて、その他の公知の方法及びその変形も本発明を実
施するのに使用できる。特に、遺伝子工学に関する技術
は近年、研究開発が進んでいる。多くの最近の米国特許
に、本発明の実施に使用できるプラスミド、遺伝子操作
を受けた微生物及び遺伝子操作の方法が開示されてい
る。例えば米国特許第4,273,875号はプラスミドとその
単離方法を開示している。米国特許第4,304,863号は遺
伝子工学によるバクテリアの生産方法を開示しており、
それによるとハイブリツドプラスミドを構築し、バクテ
リア宿主の形質転換に使用している。米国特許第4,419,
450号は組換DNA研究においてクローン化担体として有用
なプラスミドを開示している。米国特許第4,362,867号
は、クローン化工程に有用な組換cDNA構築方法及びそれ
によつて生成されたハイブリツドヌクレオチドを開示し
ている。米国特許第4,403,036号は、多数のDNAセグメン
トコピーを含むプラスミドを生成するための遺伝子物質
を開示している。米国特許第4,363,877号は組換DNAトラ
ンスフアーベクターを開示している。米国特許第4,356,
270号は組換DNAクローン化担体を開示しており、また遺
伝子工学で使用される多くの用語及びそこで使用される
基本的方法を定義しているので、遺伝子工学分野におい
て限られた経験しか持たない者にとつて特に有用な文献
である。米国特許第4,336,336号は融合遺伝子及びその
製法を開示している。米国特許第4,349,629号はプラス
ミドベクター及びその製造と使用を開示している。米国
特許第4,332,901号は組換DNAに有用なクローン化ベクタ
ーを開示している。これ等の特許のうちいくつかのもの
は本発明の範囲外の特定の遺伝子産物についてのもので
あるが、そこに記載された方法は、遺伝子工学の技術者
であれば本明細書に記載された本発明を実施するのに容
易に改変し得るものである。 これ等の特許及び本明細書で引用したその他の全ての
特許及び刊行物は、本発明の属する分野の技術者の技術
レベルを示すものであり、全て本明細書中にリフアラン
スとして含める。 本発明の内容は、エクオリンを螢光免疫測定の研究あ
るいはその他のエクオリンを標識として使用するアツセ
イにおいて、アポエクオリンを制限を受けることなく使
用できるようになるという点において有意義なものであ
る。生物発光アツセイにおけるアポエクオリンの使用方
法は、同一出願人が1983年10月13日に出願した出願番号
541,405号に開示されており、本明細書にリフアレンス
として含める。単離されたアポエクオリンcDNAを他の発
現ベクターに移入することにより、E.coli中のアポエク
オリンポリペプチドの発現を改善し、あるいは他の宿主
中のアポエクオリンの発現を可能にする構築物が生成す
る。さらに、アポエクオリンcDNAあるいはそのフラグメ
ントをハイブリダイゼーシヨンプローブとして使用する
ことによつて、他の生物発光腔腸動物及び例えばイカ
（軟体動物門）、魚（魚上網）及び甲殻網のその他の生
物に見られる構造的に関連する遺伝子を容易にクローン
化できる。これ等の遺伝子の中には、ウミシイタケ（Re
nilla）、スチラチユーラ（Stylatula）、ブチロサルカ
ス（Ptilosarcus）、ウミサボテン（Cavernularia）及
びアカントプチラム（Acanthoptilum）のルシフエラー
ゼをコードするもの、更にヒドロ虫類のオベリア（Obel
ia）及び有櫛動物のムネミオプシス（Mnemiopsis）及び
ウリクラゲ（Beroe）に見られる発光タンパク質をコー
ドするものが含まれる。 本明細書に記載した原理に基いたオリゴヌクレオチド
プローブ及び変形ヌクレオチド配列を使用して、発光タ
ンパク質を発現する上記の動物及び関連する生物から遺
伝子を単離することが特に期待される。そのようなプロ
ーブは完全な配列よりもかなり短くてもよいが、全長に
おいて少くとも10のヌクレオチドが必要であり、少くと
も14のヌクレオチドを有することが好ましい。それより
長く、遺伝子の全長までのオリゴヌクレオチドもまた有
用なものである。RNAプローブ及びDNAプローブとも使用
できる。 使用においては、該プローブを検知可能なように標識
し（例えば32P、3H、ビオチンあるいはアピジンによ
る）、所望遺伝子を有する生物から得た一本鎖DNAある
いはRNAとインキユベートする。１本鎖及び２本鎖の
（ハイブリダイゼーシヨンした）DNA（あるいはDNA/RN
A）を分離（典型的にはニトロセルロースペーパーを使
用して）した後、標識によりハイブリダイゼーシヨンを
検知する。オリゴヌクレオチドと共に使用するのに適し
たハイブリダイゼーシヨン技術は公知のものである。 プローブは通常、容易に同定できるようにする検知可
能な標識とともに用いられるが、非標識のオリゴヌクレ
オチドも有用なものであり、標識プローブの前駆体とし
ても、２本鎖DNA（あるいはDNA/RNA）の直接検知を行な
う方法における使用にも有用である。従つて、「オリゴ
ヌクレオチドプローブ」という用語は、標識及び非標識
両方の形状のものを指すものである。本明細書に記載し
たペプチド配列の40から110のアミノ酸をコードする領
域から得られたオリゴヌクレオチドが特に好ましく、そ
れはそれ等がルシフエリンとの結合に関与するアミノ酸
であるからである。 腔腸動物ルシフエリンは、表５に挙げた全ての生物中
に見られ、これらから得た発光タンパク質に結合する。
本明細書中に記載したオリゴヌクレオチドはこれ等の種
から得た発光タンパク質遺伝子の単離におけるプローブ
として有用であると考えられるものである。 これまで総括的に記述してきた本発明は、以下の実施
例を参照しながらより容易に理解されるであろう。これ
らの実施例は単に詳細な説明を意図するのみであつて、
特に記載のない限り本発明を限定するものではない。 実施例1:天然エクオリンの精製 第２のゲル過段階にセフアデツクスＧ−75（スーパ
ーフアイン）を用いること以外はブリンクス（Blinks）
等の方法〔ブリンクス・ジエイ・アール（Blinks,J.
R.），ピー・エイチ・マツテイングリー（P.H.Mattingl
y），ビー・アール・ジエウエル（B.R.Jewell），エム
・フアン・ルーヴエン（M.van Leeuwen），ジー・シー
・ハーレア（G.C.Harrer）及びデー・ジー・アレン（D.
G.Allen），メツド・エンザイモロジー（Methods Enzym
ol.）,57巻,292−328頁（1978年）〕に従つてエクオリ
ンを精製した。エクオリンの精製は以下の手順で行つ
た。 1.フライデイ湾（Friday Harbor），ワシントンでエク
オレア（Aequorea）を収集し口周組織（光細胞;photocy
tes）を採取する。 2.EDTA中の低張溶解によつて光細胞からタンパク質を抽
出する。 3.光細胞抽出物を硫酸アンモニウム分画（０−75％）す
る。 4.(NH4)2SO4による沈殿物を遠心分離して−70℃に保存
したまま、フライデイ湾，ワシントンより船で運ぶ。 5.セフアデツクスＧ−50（フアイン）を使つてゲル過
を行なう。 6.QAEセフアデツクスを使つてpH−ステツプ及び塩勾配
溶出によるイオン交換を行なう。 7.セフアデツクスＧ−75（スーパーフアイン）を使つて
ゲル過を行なう。 8.DEAE−セフアデツクスを使つて、pH−ステツプ及び塩
勾配溶出によりイオン交換を行なう。 9.純粋なエクオリンを凍結乾燥（EDTA中）し−80℃で保
存する。 上記１−４段階ではフライデイ湾上にて行なつた。収
集と口周組織の採取以外の全ての段階は０°−４℃で行
なわれた。段階４からの最終生成物は遠心ボトル（250m
l）に入れてドライアイス中で保存した。該物質はこの
ような形で船で運ばれた。 エクオリン及び緑螢光タンパク質（green fluorescen
t protein,GFP）の精製（第５−９段階）はジヨージア
のアテンス（Athens）で行なつた。全段階は０−４℃で
実施された。エクオリン含有画分は各段階の間−80℃で
保存された。タンパク質濃度にかかわらず、エクオリン
は凍結融解に対して安定であるようである。 第５段階 セフアデツクスＧ−50（フアイン）によるゲ
ル過。 カラム寸法:5.8cm×97cm;2563ml。 このカラムに10mM EDTA,pH5.5（EDTA溶液を調製するの
に２ナトリウム塩を用いた）溶液を75ml/時の流速で流
した。GFP及びエクオリンはこのカラムで一緒に溶出さ
れた。次段階用にエクオリン活性の65−75％がプールさ
れた。この画分の前後の画分（side fractions）もプー
ルし後段の精製のために保存された。この段階でのエク
オリンの収率は50−80％の範囲に亘り、通常65−75％の
収率が得られた。このカラムの能力は約1000mg（ブラド
フオード:Brad ford）/75mlであり、可能である限り一
般にそれよりも少ない量をカラムにかけた。 第６段階 QAEセフアデツクスによるイオン交換。 カラム寸法：直径5cm。15gの乾燥セフアデツクスをこの
段階に用いた。カラムのベツド体積はイオン強度及び緩
衝液組成によつてクロマトグラフイの間で変化した。 一般に、Ｇ−50の最初の６−10ステツプからプールし
たものをこのカラムに流した。この操作によつて全収量
が増え、効率的であつた。この段階はブリンクス等の方
法（1978年）と全く同様に実施された。カラムにかけた
後、GFPはpH−ステツプ（5mM NaAc,5mM EDTA,pH4.75）
によつて選択的に溶出された。エクオリンは次に、10mM
EDTA,pH5.5でNaClの直線勾配によつて溶出された（全
量500ml）。GFPはTris中10mMにしpHを8.0まで上げて−8
0℃にて次の精製まで保存された。エクオリンプールは
限外過（アミコンYM−10膜）で濃縮して次段階に用い
る調製物とした。エクオリン収率は80％であつた。 第７段階 セフアデツクスＧ−75（super fine）による
ゲル過。 カラム寸法:2.8cm×150cm;924ml。 カラムに10mM EDTA,pH5.5の溶液を10ml/時で流した。エ
クオリン収率は60−80％であつた。 第８段階 DEAE−セフアデツクスによるイオン交換。 第７段階でのプールエクオリンをこのカラムに直接か
け、QAEセフアデツクスカラムと全く同様に溶出を行な
つた。エクオリン収率は一般に75−80％であつた。この
段階は殆んどのエクオリン調製の際には必要のないもの
である。第７段階からのエクオリンは通常純粋なもので
ある（12％アクリルアミドSDS−PAGEによる）。 第９段階 EDTA存在下でエクオリンを95％より大きい回
収率で凍結乾燥した。EDTAが存在しないと回収率は０か
ら95％まで様々であつた（プリンクス等、1978年参
照）。 実施例2:エクオリンの配列決定に用いられる配列決定方
法 アミノ酸配列分析は自動エドマン分解（エドマン（Ed
man）及びベツグ（Begg）,1967年）を用いて実施され
た。比較的多量のタンパク質又はペプチド（10nmol以
上）の配列分析はモデル890Bベツクマンシークエンサー
（デユーク大学、ボーン（Bhown）等の記載（1980年）
のように最新のもの）及びポリブレン（polybrene）を
用いた0.55Mクアドロール（Quadrol）プログラム（ター
ル（Tarr）等、1978年）を採用して実施した。M3及びM5
という２つのペプチドは小さいか又はクアドロール法で
はカツプから洗浄されてしまうので、クラパー（Klappe
r）等（1978年）によつて提案されたジメチルアリルア
ミン緩衝液及びポリブレン用に適合させたプログラムを
使つて配列決定を行つた。アミノ酸のフエニルチオヒダ
ントイン（PTH−）誘導体は、ハンカピラー（Hunkapill
er）及びフツド（Hood）によつて記載された方法（1978
年）に主に従つて、デユポン・ゾルベイ（DuPont Zorba
y）ODSカラムを用いて逆相HPLCクロマトグラフイにより
同定された。２−10nmol程度の量で利用できるペプチド
は、0.1Mクアドロール（ブラウアー（Brauer）等、1975
年）及びポリブレン用のプログラムを使つてモデル890C
ベツクマンシークエンサー（ワシントン大学）によつて
配列決定された。PTH−アミノ酸はエリクソン（Ericsso
n）等によつて記載された（1977年）逆相HPLCシステム
を用いて同定された。1.5nmolより少ない量のペプチド
を使う場合には、応用バイオシステムモデル470A気相シ
ークエンサー（ワシントン大学，ハンカピラー等,1983
年）を用いて配列分析を行つた。気相装置からのPTHア
ミノ酸はハンカピラー及びフツドの記載（1983年）に従
つてIBMシアノカラムを用いて同定された。 参考文献 エドマン・ピー及びベツグ・ジー ヨーロピアン・ジ
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・エム（Hewick,R.M.），ドレイヤー・ダヴリユー・ジ
エイ（Dreyer,W.J.）及びフツド・エル・イー，メソド
・エンザイモロジー（Methods Enzymol）,91巻,399−41
3頁（1983年）。 ハンカピラー・エム・ダヴリユー及びフツド・エル・イ
ー，メソド・エンザイモロジー,91巻,486−493頁（1983
年）。 実施例3:均一アポエクオリンをコードしているcDNAのク
ローニング及びその発現。 材料及び方法 制限酵素はベセスダ・リサーチ・研究所（Bethesda R
esearch Laboratories），ニユーイングランドバイオラ
が（New England Bio Labs）及びインターナシヨナル・
バイオテクノロジー会社（International Biotechnolog
ies,Inc.）から購入し、それぞれに記載された条件に従
つて使用した。RNアーゼ（RNasin）及び逆転写酵素はそ
れぞれバイオテク（Biotech）及びライフ・サイエンス
（Life Sciences）から得た。末端転移酵素（ターミナ
ルトランスフエラーゼ）はPLバイオケミカルから購入し
た。腔腸動物門のルシフエリンは従来技術の記載に従つ
て合成し、必要な時まで凍結乾燥粉末で保存した：ホリ
・ケー（Hori,K.），アンデルセン・ジエイ・エム（And
ersen,J.M.），ワード・ダヴリユー・ダヴリユー（War
d,W.W.）及びコルミアー・エム・ジエイ（Cormier,M.
J.），バイオケミストリー,14巻,2371−2376頁（1975
年）；ホリ・ケー（Hori,K.），カルボネアウ・エイチ
（Charbonneau,H.），ハート・アール・シー（Hart,R.
C.）及びコルミアー・エム・ジエイ，プロス・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Nat′l. Acad.Sci.），米国,74
巻,4285−4287頁（1977年）；イノウエ・エス（Inouye,
S.），スギウラ・エイチ（Sugiura,H.），カコイ・エイ
チ（Kakoi,H.），ハシズマ・ケー（Hasizuma,K.），ゴ
トウ・テー（Goto,T.）及びイイオ・エイチ（Iio,
H.），ケミ・レター（Chem.Lett.）,141−144頁（1975
年）。 RNA単離及びイン・ヴイトロに於ける翻訳 エクオレア・ヴイクトリア（Aequorea victoria）ク
ラゲがワシントン大学海洋生物研究所にて、ワシントン
のフライデイ湾に於いて収集された。クラゲの周囲から
口周リング（circumoral ring）を切り取り、直ちにド
ライアイス／メタノール浴中で凍結させた。この組織を
−70℃にて所望の時まで保存した。 キム（Kim）等の方法〔キム・ワイ・ジエイ・シユー
マン・ジエイ（Snuman,J.），セツテ・ケー（Sette,
K.）及びプルツイピラ・エー（Przybyla,A.），細胞生
物誌（J.Cell.Biol.）,96巻,393−400頁（1983年）〕に
従つてRNAを単離し、ポリ（Ａ）＋RNAを前記方法〔アビ
ブ・エイチ（Aviv,H.）及びレーダー・ピー（Leder,
P.），PNAS69,1408−1412頁（1972年）〕を用いて調製
した。 ポリ（Ａ＋）RNA（１μｇ）及びポリ（Ａ−）RNA（20
μｇ）はラビツト網状赤血球イン・ヴイトロ翻訳システ
ムを用いて翻訳された〔ペルハム・エイチ・アール・ビ
ー（Pelham,H.R.B）及びジヤクソン・アール・ジエ（Ja
ckson,R.J.），ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケミ
ストリー（Eur.J.Biochem．）,247巻（1976年）；メリ
ツク・ダヴリユー・シー（Merrick,W.C.），メソド・イ
ン・エンザイム（Methods in Enz.）,101（Ｃ）,606−6
15頁（1983年）参照〕。溶解物からミクロコツカスヌク
レアーゼを用いて内因性mRNAを除去した。各翻訳試料
（総量62μｌ）を35S−メチオニン（38μCi）存在下に9
0分間25℃に保持した。電気泳動分析用に各翻訳試料か
ら２μｌを取った。抗エクオリン（２μｌ）及びスタフ
アウレウス（Staphaureus）細胞を50μｌの各翻訳混合
物中に加えてアポエクオリンを免疫沈降させた。数回洗
浄後に抗体−アポエクオリン複合体をSDS存在下で加熱
して解離させた。この翻訳生成物をSDSポリアクリルア
ミド（13％）ゲルで分析した。電気泳動に次いで、ゲル
をクマシー（Coomassie）Ｒ−250で染色しタンパク質の
標準物を同定し、その後該ゲルにDMSO中のPPOを含浸さ
せた。−70℃でフルオログラフイを行なつた。 DNA組換え操作 二本鎖cDNAを全エクオレア（Aequorea）ポリ（Ａ＋）
RNAからウイケンス（Wickens）等の記載〔ウイケンス・
エム・ピー（Wickens,M.P.），ブエル・ジー・エヌ（Bu
ell,G.N.）及びシムケ・アール・テイー（Schimke,R.
T.），生物化学誌（J.Biel,Chem.）,253,2483−2495頁
（1978年）〕のように合成した。ホモポリマーのdCテー
ルを付加した後、二本鎖cDNAをdG−テールを付加された
Pst I切断pBR322〔ヴイラ・コマロフ・エル（Villa−Ko
maroff,L.），エフストラデイアデイス・エー（Efstrad
iadis,A.），ブルーム・エス（Broome,S.），ロメジコ
・ピー（Lomedico,P.），チザード・アール（Tizard,
R.），ナーベル・エス・ピー（Naber,S.P.），チツク・
ダヴリユー・エル（Chick,W.L.）及びギルバート（Gilb
ert），PNAS,75巻,3727−3731頁（1978年）〕とアニー
リングし，大腸菌（E.coli）SK1592株を形質転換するの
に用いた。テトラサイクリン耐性・アンピシリン感受性
コロニーを移し取りマイクロタイターデイシシユ内で−
70℃にて凍結させた。 エクオレア（Aequorea）cDNAライブラリーを合成オリ
ゴヌクレオチド混合物を使つてスクリーニングにかけエ
クオリンcDNAを捜した。このオリゴヌクレオチド混合物
はコロンビア大学のチヤールズ・カントー（Charles Ca
ntor）及びカルロス・アルガラナ（Carlos Argarana）
から提供された。ポリアクリルアミド電気泳動〔マニア
テイス・テイー（Maniatis,T.）及びエフストラテイデ
イス・エー（Efstratidis,A.），メソ・イン・エンザイ
ム（Meth.in Enz.）,65巻,299−305頁（1980年）〕によ
つてそれら精製した後、17コより成る前記オリゴヌクレ
オチド（17マー）をポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−
32P−ATPを用いて放射活性標識した〔マキシマム・エー
・エム（Maxam,A.M.）及びギルバート・ダヴリユー（Gi
lbert,W.），メソ・イン・エンザイム,65巻,499−559頁
（1980年）〕。取り込まれなかつた32PはDEAEセルロー
スイオン交換クロマトグラフイによつて除去された。 エクオレア（Aequorea）cDNAバンクは次下のようにス
クリーニングされた： 大腸菌（E.coli）組換え体を凍結培養物からルリア寒
天プレート上のニトロセルロースフイルター（７×11c
m）に移行した。これらのコロニーを37℃にて12時間培
養した後溶解し、そしてワツトマン541紙用の記載に従
ってそのDNAを固定した〔タウブ・エフ（Taub,F.）及び
トンプソン・イー・ビー（Thompson,E.B.），アナル・
バイオケミ（Anal,Biochem.）,126巻,222−230頁（1982
年）〕参照〕。このフイルターを空気乾燥後に真空下２
時間ベーキングした。 このフイルターをまず初めに１×SSC中で湿らせた
後、フイルター１枚当り3mlのプレハイブリダイゼーシ
ヨン溶液（10×NET,0.1％SDS,3×デンハルト（Denhard
t）中で55℃,12−20時間保持した。この溶液をハイブリ
ダイゼーシヨンバツグから注ぎ出し、フイルター１枚り
1mlのハイブリダイゼーシヨン溶液（10×NET,0.1％SDS,
3×デンハルト,1×106cpmの32P標識17マー／フイルタ
ー）を代りに注入した。37℃にて24時間ハイブリダイゼ
ーシヨンを行ない、その後４℃の10×SSC中で10分間か
けて４回洗浄した。フイルターを空気乾燥した後プラス
チツクラツプに包んだ。デユポン・クロネツクス増感板
を使いコダツクXAR−５フイルムを−70℃にてこのフイ
ルターに露出した。 大腸菌（E.coli）の増殖及び抽出操作 pAEQ1−pAEQ6を含む大腸菌SK1592をルリア流体培養基
25ml中で37℃にて一晩増殖させた。この細胞を遠心分離
した後、10％シヨ糖,50mMトリスpH8溶液5mlに再懸濁し
た。この溶液に、0.1Mフエニルメチルスルホニルフロラ
イドを7.2μl,0.2M EDTAを312μl,10mgのリゾチーム及
び10mg/mlのRNaseAを10μｌ加えて細胞を溶解した。氷
中で45分間保持した後、この混合物を43,500×ｇで１時
間遠心分離にかけ、この上清を貯えた。 エクオリンの精製及びアツセイ ブリンクス等の方法〔ブリンクス・ジエイ・アール
（Blinks,J.R.），ウイア・ダヴリユー・ジー（Wier,W.
G.），ヘス・ピー（Hess,P.）及びプレダーガスト・エ
フ・ジー（Predergast,F.G.），プログ・バイロフイズ
・モレキユラー・バイオロ（Prog・Biophys・Molec・Bio
l）,40巻,1−114頁（1982年）〕に従つて、エクオリン
を抽出・精製した。エクオリンすなわち光タンパク質
（photoprotein）活性は、５μｌの試料を0.1M CaCl2,
0.1Mトリス,pH8.0溶液0.5mlに注入すると同時にピーク
光強度（peak light intensity）及び全光子数を測定す
ることで求めた。この測定用の測光計の設計及び光子収
量の絶対量に対する装置の標準化については、以前に記
載されたものを参照されたい〔アンデルソン・ジエイ・
エム（Anderson,J.M.），フアイニ・ジー・ジエイ（Fai
ni,G.J.）及びワアンプラー・ジエイ・イー・（Wample
r,J.E.），メソド・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enz.）,57巻,529−559頁（1978年）；カルボネアウ
・エイチ（Charbonneau,H.）及びユルミエル・エム・ジ
エイ（Cormier,M.J.），ジエイ・バイオロ・ケム（J.Bi
ol.chem.）,254頁,769−780頁（1979年）〕。 pAEQ1抽出物からのアポエクオリン活性の部分精製 発現されたアポエクオリンは、pAEQ1抽出物23mlを1mM
EDTA,1.5mMトリス,pH7.5溶液で平衡化されたワツトマ
ンDE−22カラム（42mlベツト体積）に通すことによつて
部分精製された。800mlのNaCl勾配（０−1M）を通す
と、アポエクオリン活性は0.3M NaClのところに溶出し
てきた。ピークの分画を回収し、0.5M KCl,10mM EDTA
及び15mMトリス,pH7.5溶液に対して透析した。これを第
３図に記載の実験に供した。 結果及び考察 インヴイトロに於けるエクオレアポリ（Ａ＋）RNAの翻
訳 凍結したクラゲの組織1gから約1.6μｇのポリ（Ａ
＋）RNAを単離した。イン・ヴイトロに於けるエクオレ
アポリ（Ａ＋）RNAの翻訳に関する結果は第１図に示
す。抗エクオリンと反応した翻訳生成物はレーン４で示
されている。免疫沈降した35Sのカウントは翻訳された
ものの全酸沈殿物のカウントの0.3％であり、これはア
ポエクオリンmRNAが全ポリ（Ａ＋）mRNA集団の約0.3％
であることを示している。このようにアポエクオリンmR
NAが比較的多いということは、エクオレアの口周リング
粗抽出物中のエクオリンに相答する全タンパク質の割合
（0.5％）と良く一致するものである。エクオレアRNA
（レーン２）の非存在下、又はエクオレアポリ（Ａ−）
RNAの存在下（データは記載していない）でイン・ヴイ
トロの翻訳を行うと、免疫沈降するタンパク質はできな
かつた。 抗エクオリンで免疫沈降する翻訳一次産物（primary
translation product）はSDS−PAGEゲルに於いて明らか
に23,400ダルトンの分子量を示すように動き（レーン
４）、これはエクオレアから単離した天然エクオリンの
分子量（22,800ダルトン，第１図参照）よりも僅かに大
きいものである。このデータ及び第４図に示したデータ
は、初期翻訳生成物には約７つのアミノ酸のプレ配列
（prepresence）の存在があることと一致するものであ
る。 ポリ（Ａ＋）RNA翻訳からの免疫沈降タンパク質は、
元のオートラジオグラムを見てみると、二重線或いはさ
らに三重線（レーン4,第１図）で動いていたことが判
る。この結果は二通りに解釈し得るものである。第１番
目に、エクオレア、ヴイクトリアには多数のアポエクオ
リン遺伝子が存在し得、それぞれのプレタンパク質の分
子量が、それらのプレ配列の長さが多様であるが故に異
つているということである。エクオリンアイソザイム
〔ブリンクス・ジエイ・アール（Blinks,J.R.）及びハ
レア・ジー・シー（Harrer,G.C.），フエド・プロス（F
ed.Proc.）,34巻,474頁（1975年）〕の存在はこうした
多重遺伝子族（multi−gene family）を示しているかも
知れない。第二番目に、フライデイ湾のエクオレア・ヴ
イクトリア集団がエクオレアの複数種から成り立つてい
るかも知れないということである。 エクオリンcDNAs同定 使用されたエクオレアcDNAライブラリーは450bpより
大きい挿入部分を持つ6000の組換え体を含んでいた。ス
クリーニングに付された25の任意の該組換え体のうちの
どれも500bp以下の挿入部分は持つておらず、そのうち
の２つは3Kbpよりも大きかつた。 エクオレアcDNAバンクは次の混合合成オリゴヌクレオ
チドプローブを用いてスクリーニングにかけられた。 上記オリゴヌクレオチドのDNA配列はアポエクオリン
の全アミノ酸配列の研究によつて求められた。このオリ
ゴヌクレオチドはエクオリンポリペプチドのカルボキシ
末端領域に於いてTrp173・Tyr・Thr・Met・Asp・Pro178
のペプチドをコードしているmRNAと相補的なものであ
る。上記の17マー（17−mers）は、方法の欄で記述した
様に32Pで標識されエクオレアcDNAライブラリーからの
プラスミドDNAとハイブリツドを形成した。 ６つの形質転換体が上記合成オリゴヌクレオチドとハ
イブリツドを形成する挿入部分を持つたプラスミドを含
有しているものと同定された。最大のPst I挿入部を含
むプラスミド、pAEQ1の制限地図を第２図に示す。pAEQ1
をBamHIで消化すると該合成オリゴヌクレオチドとのハ
イブリツドは形成されないであろう。前記の17マーDNA
配列の研究によると、このハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブはBamHI認識配列（GGATCC）を含んでいるものであ
る。従つて、pAEQ1中のBamHI部位はアポエクオリンをコ
ードしている配列の３′領域を同定するのに用いること
が出来よう。以下に示すように、組換えプラスミドpAEQ
1は、大腸菌（E.coli）に於けるその発現から示される
ように、アポエクオリンcDNAを実際に含んでいるもので
ある。 大腸菌に於けるアポエクオリンの発現 前記の６つの形質転換体のうちのどれが生物学的に活
性なアポエクオリンを発現しているかどうかを見つけ出
す為に、それらの抽出物、及び同様に親株（host strai
n）の抽出物を方法のところで記述した様に調製した。
それぞれの抽出物0.5mlにβ−メルカプトエタノール（2
mM）及び腔腸動物門のルシフエリン（0.1mM）を添加
し、この混合物を４℃にて20時間保持した。その後、該
混合物のCa2+依存光タンパク質活性について方法に記載
したようにして測定した。組換え体pAEQ1から調製した
抽出物についてはCa2+依存ルミネツセンスが観察された
が、親株又は他のいずれの形質転換体からの抽出物につ
いてはこのようなルミネツセンスは観察されなかつた。
pAEQ1−６の挿入部分がクロスハイブリツドを形成する
ということは、それらが相同なDNA配列を含んでいると
いうことを示唆するものである。しかしながら、もしも
pAEQ2〜６のcDNA挿入部分の長さが充分でなかつたり、
プラスミド中で適切に配向していなかつたりすると、そ
れら抽出物中のアポエクオリン活性は期待出来ないもの
であろう。 pAEQ1抽出物の光タンパク質活性発現の速度論は天然
の混合アポエクオリンのそれと類似している（第３図参
照）。この抽出物に於いて光タンパク質活性が発現する
為に必要とされる条件も真正の（authentic）アポエク
オリンを用いた場合に観察されるものと同一である。第
３図に示すように、溶存O2が必要とされる。更に、β−
メルカプトエタノール又は腔腸動物門のルシフエリンの
いずれかが反応混合物中に存在しなくなると、Ca2+依存
光タンパク質活性が全く発現されなくなる。Ca2+を含ま
ない緩衝液中に活性成分を注入してもルミネツセンスは
発さられなかつた。Ca2+を後で添加するとルミネツセン
スの閃光（flash）が見られた。 pAEQ1含有形質転換体の抽出物中の活性成分を更に詳
しく調べる為に、この組換えプラスミドを含有する形質
転換体抽出物を、方法のところで記載したようにDE−22
を用いたクロマトグラフイにかけた。アポエクオリン活
性は約0.3M塩のところで溶出され、これは真正のアポエ
クオリンの場合に類似している。この活性画分を腔腸動
物門のルシフエリン，β−メルカプトエタノール及び酸
素の存在下でインキユベートし、光タンパク質活性を発
生させた（第３図参照）。次いで、この混合物をゲル
過にかけた。第４図に示すように、pAEQ1抽出物中の部
分精製成分から生じた光タンパク質活性はMr＝20,600の
ところに溶出し、一方天然エクオリンは19,600のところ
であつた。同様の結果はイン・ヴイトロの翻訳実験中に
も観察された（第１図）。第４図のデータから、使用し
た条件下に於いて、ルシフエリンはpAEQ1抽出物中の活
性成分と強固に会合するという結論が得られるであろ
う。 第４図からの回収（プール）光タンパク質画分はCa2+
の添加によつてルミネツセンスの閃光を発する。この閃
光の速度論はCa2+依存エクオリン反応のそれと区別がで
きないものであつた。他の組換えプラスミドは形質転換
体中で光放出タンパク質（light−emitting protein）
を発現しなかつた（第６表参照）。 上記のデータは、pAEQ1中に挿入されたcDNA部分はア
ポエクオリンをコードしている全長cDNAを表わしている
ことを示している。更にこのデータは、該cDNAがpAEQ1
中で発現されており、そのタンパク質生産物の生物学的
活性は天然の混合アポエクオリンのそれと区別され得な
いことを示している。発現レベルは全可溶性タンパク質
の約0.01％であると推定された。 各抽出物0.5mlにメルカプトエタノール（2mM）及び腔
腸動物門のルシフエリン（0.015mM）を加えた。この混
合物を４℃で20時間インキユベートした。試料５μｌを
取り出し0.1mM Ca2+0.5mlに注入して、ピーク光強度を
測定した。 実施例4:誘導lacプロモーターを用いた大腸菌（E.col
i）内でのアポエクオリン発現の増大 pAEQ1を含む大腸菌に於けるアポエクオリンの発現は
比較的低レベルである。この発現レベルを増大させる為
に、アポエクオリン遺伝子の転写が誘導性（inducibl
e）lacプロモーターに対する相対位置によつて増加する
ように、pAEQ1からのアポエクオリン遺伝子をもう１つ
のプラスミド（pUC9）内でサブクローン化させた。 pAEQ1からのPst I断片（0.75kb）を単離し、pUC9の単
一Pst I部位にクローン化させた。２つの異なるプラス
ミド,pAEQ7及びpAEQ8を得た。プラスミドpAEQ8は第２図
（ｂ）で示すように、所望の配向で挿入されたPst I断
片を含んでいた。プラスミドpAEQ7には反対方向の配向
で該断片が挿入されていた。 pAEQ7及びpAEQ8を含有している大腸菌株（親；ホス
ト;JM105）を各々37℃にてアンピシリン（50μg/ml）含
有のルリア流体培養基20ml中で増殖させた。OD550が0.6
に達した時に、培養物を100mM保存溶液中で1mMにした。
5mlの試料を取り出し、一方残りの培養物は振とうされ
続けた。１時間及び２時間後にも同様に試料の一部を取
り出した。それぞれ試料の一部を採取した直後に、細胞
を遠心分離し−20℃で必要になる時まで保存した。 ６つの採取試料抽出物のアポエクオリン活性を測定し
た。大腸菌細胞をまず最初に50mMトリス,pH8,10％シヨ
糖,25μg/mlリゾチーム及び20μg/ml RNaseA溶液1mlに
再懸濁して溶解した。氷中45分間保持後に、この混合物
を43,500×ｇで１時間遠心分離した。上清を採取保存し
た。上清（抽出物）を次いで腔腸動物門のルシフエリン
及びメルカプトエタノール（250μｌ抽出物,5％メルカ
プトエタノール水溶液３μｌ及び腔腸動物門ルシフエリ
ン３μｌ）の存在下で一晩インキユベートした。このイ
ンキユベーシヨン試料５μｌを0.1M CaCl2,0.1Mトリス,
pH8.0溶液0.5mlに注入し、同時に最高（ピーク）光強度
及び全光子数を測定して、混合物中のエクオリン活性を
求めた。タンパク質はブラツドフオード（Bradford）ア
ツセイ（Bio Rad）を用いて測定した。 第７表には、pAEQ7及びpAEQ8含有株の６つの抽出物，
コントロール大腸菌株（SK1592）及びpAEQ1含有株の抽
出物から得られた結果が記されている。 これら抽出物中のエクオリン活性レベルはルシフエリ
ンによる充電効率（charging efficiency）に依存して
いる。粗抽出物に於ける充電効率を定量化することは不
可能である。エクオレアから単離したアポエクオリンを
用いた場合に観察される充電効率は20％以下であり、大
腸菌抽出物中ではこの効率は多分幾らかそれより低いも
のであろう。従つて、充電効率１％及び20％を基に計算
した値を求めた。 pAEQ8からの発現は、pAEQ1のそれと較べて誘導後２時
間に於いて著しく高いものである（600倍）。エクオリ
ン遺伝子をpAEQ8と反対方向の配向で含んでいるpAEQ7か
らはエクオリン遺伝子の誘導が観察されなかつた。 このデータは、cDNAヌクレオチド配列が誘導プロモー
ターの３′に適切に位置していれば、アポエクオリンの
発現レベルは顕著に増大し得るということを示している
ものである。 実施例5:特定のアポエクオリン遺伝子の構造決定 第２図に示した、プラスミドpAEQ1,pAEQ7およびpAEQ8
の中に存在するPst I−Pst I断片の構造を標準的遺伝子
配列解析法によつて決定した。３′末端から69個のヌク
レオチドは翻訳されない。翻訳領域が発現されると、実
施例１に記載した方法で単離したタンパク質（アポエク
オリン）のＮ末端に７個のアミノ酸残基が付いたタンパ
ク質が発現される。この実施例１で得られたタンパク質
のＮ末端はVALで始まる。この余分の７個のアミノ酸残
基は実施例１の単離工程の間にプロテアーゼによつて切
りとられるのであろう。PROをコードしているＣ−末端
コドンの次には停止コドンがあり、その後12個のヌクレ
オチドが続いている。これは明らかに単離されたcDNAが
完全長（full−length）であることを示している。全二
本鎖DNAとアミノ酸配列は次のとおりである。 この同定された配列が示していることは、この配列の
中では微不均一性のいろいろな位置に主要アミノ酸（pr
incipal amino acid）と少数アミノ酸（minor amino ac
id）の双方が含まれているので、表３に示した変異形か
らどのアミノ酸配列を選択しても活性なアポエクオリン
が得られるということである。 したがつて、同じようにして様々なペプチドをコード
している種々の遺伝子が生物学的に活性な分子を表わす
ことが示される。 本明細書中に開示した一般的な配列が表わされ、多少
の変異を示す（したがつてアポエクオリンの生物活性を
有する）他のペプチド,DNA分子，ベクター等に関して前
述した議論は、本実施例に開示した特定の配列にも等し
く適用できる。本実施例では特に１つのペプチド、これ
をコードしているDNA配列、および２個の制限部位の間
の完全長DNA配列を開示した。コードDNA配列（任意に末
端停止コドンを含んでいてもよい）は、完全長のDNA配
列とは別の実体として明らかにされ、その変異形も含め
て全長DNA配列とは切り離して考えられる。二本鎖DNAと
して開示されたいずれのDNAも、この二本鎖DNAを形成す
る個個の１本鎖DNAおよび転写によつて得られるこれに
相当するRNAを開示しているものと考えられる。 上記実施例のベクターと宿主は本発明の好ましい態様
のいくつかで用いられるが本発明はこれらの実施例に開
示された特定のベクターや宿主細菌に限定されるわけで
はない。使用した細菌とプラスミドは全て、バイオテク
ノロジー分野の当業者が様々な起源から容易に入手でき
る。たとえば、大腸菌（E. coli）JM105とプラスミドp
UC9およびpBR322は米国08854ニユージヤージー（New Je
rsey），ピスカタウエイ（Piscataway）センテニアル
アベニユー（Centennial Avenue）800のピー．エル．バ
イオケミカルズ社（P.L.Biochemicals,Inc.）〔これは
フアルマシア社（Pharmacia,Inc.）の一部門である〕か
ら市販されており、そのカタログではそれぞれ第27−15
50−01,27−4918−01および27−1750−01とされてい
る。さらに、本発明の実施に使用することができる上記
やその他の微生物とプラスミドは、米国20852メリーラ
ンド（Maryland），ロツクビル（Rockville），パーク
ローン ドライブ（Parklawn Drive）12301のアメリカ
ン タイプ カルチヤー コレクシヨン（American Typ
e Culture Collection）からも入手できる。代表的なも
のとその寄託番号は大腸菌（E. coli）SK1592（ATCC N
o.35106）、大腸菌（E. coli）JM105（ATCC No.5302
9）、pUC9（ATCC No.37252）、pBR322（ATCC No.3134
4）である。 以上本発明を詳細に説明したが、本発明の思想と範囲
を逸脱することなく多くの変更や修正ができることは当
業者には明らかであろう。
ポエクオリンタンパク質遺伝子を組換えベクターDNA内
に挿入すること、及び微生物である受容菌株に於いてア
ポエクオリンを産生することに係る。 アポエクオリン（apoaequorin）は発光性クラゲであ
るエクオレア・ヴイクトリア（Aequorea victoria）か
ら単離されうる１本のポリペプチド鎖から成るタンパク
質である。このタンパク質が腔腸動物門のルシフェリン
１分子を非共有結合で結合し含有すると、それはエクオ
リンとして知られているものになる。エクオリンはカル
シウムイオンの存在下で酸化され、可視光を発する。一
度光が発せられると、使用されたタンパク質（アポエク
オリン）を酸化ルシフエリンから精製し得、その後適当
な条件下で天然又は合成ルシフエリンを用いて再び（電
子と）結合される。この再結合されたエクオリンにカル
シウムイオンを加えてやることで、再び光を発するよう
になる。従つて、アポエクオリンは様々な化学及び生物
アツセイに於けるマーカーとして使用することができる
ものである。 天然のアポエクオリンは単一化合物ではなくて、数種
の分子の混合物を表わしている。数千にも及び個々のエ
クオレア（Aequorea）のエクオリンを表わしているとこ
ろの純粋な天然エクオリンを電気泳動にかけると（0.1m
M EDTA）を全ての緩衝液に含有させて、非変性条件下の
アルカリ性緩衝液中、オー・ガブリエル（O.Gabrie
l），メソド・エンザイモロジイー（Methods Enzymo
l.）、22巻、565−578頁、1971年参照）、少なくとも６
つの明瞭な青色ルミネツセンスのバンドが、用いたゲル
（0.5cm×10cm）を0.1M CaCl2中に浸すと見えるように
なる。この観察は、同様な抽出物を等電点電気泳動にか
け12本ものルミネツセンスバンドを観察したジエイ・ア
ール・ブリンクス（Ｊ・Ｒ・Blinks）及びジー・シー・
ハーレス（Ｇ・Ｃ・Harres）、（フエド・プロス（Fed.
Proc）、34巻、474頁、1975年）の結果と一致してい
る。等電点電気泳動は電気泳動よりも分離能が高いので
ブリンクス及びハーレスはより多くの種類（バンド）を
観察したのである。しかしながら、これらのバンドのど
れも純粋なペプチドとして単離されなかつた。 更に、生物ルミネツセンスアツセイに使用する為に必
要とされる量を供給し得るだけ充分量のエクオリン又は
アポエクオリンをクラゲ又は他の天然資源から生産する
ことは困難である。従つて、産業上利用し得るだけの充
分な量のアポエクオリンを生産する改良方法が強く望ま
れている。 近年の発達した技術によつて、大量に早く増殖する微
生物を使用して、産業上有用なタンパク質及びペプチド
をその天然に於ける由来源にかかわらず合成することが
可能になつた。これらの技術は、或る適当な微生物に、
通常は別の生物で作られているタンパク質又はペプチド
を合成する能力を遺伝子的に付与することを可能にす
る。 上記の技術は、全ての生物に於いて、遺伝物質（普通
はDNA）とその生物によつて合成されるタンパク質との
間に存在する基本的な関係を利用するものである。この
関係とは、タンパク質のアミノ酸配列がDNAのヌクレオ
チド配列中に反映されているというようなことである。
タンパク質中で最も共通して見られる20種のアミノ酸の
各々に特異的に対応している３ヌクレオチド配列のグル
ープが１つ以上ある。各々の或る３マクレオチド配列と
それに対応するアミノ酸との間の特異的な関係は遺伝暗
号を構成する。この遺伝暗号は全ての生物にとつて同一
又は類似しているものと考えられている。その結果、全
てのタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列は、良く理
解されている関係に従つて、対応するヌクレオチド配列
に反映されている。更に、原則的には、このヌクレオチ
ド配列はどの生物によつても翻訳され得るものである。 暗号：各々の３文字連鎖（３−letter triplet）は左
側に５′末端及び右側に３′末端を持つDNAの３ヌクレ
オチドを表わしている。この文字はヌクレオチド配列を
形成するプリン又はピリミジン塩基を表わしている。 Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はＧ Ｍ＝A,C又はＴ Ｔ＝チミン Ｘ＝ＹがＡ又はＧの場合、Ｔ又はＣ Ｘ＝ＹがＣ又はＴの場合、Ｇ Ｙ＝ＸがＣの場合、A,G,C又はＴ Ｙ＝ＸがＴの場合、Ａ又はＧ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ又はＡ Ｗ＝ＺがＣ又はＴの場合、Ｃ Ｚ＝ＷがＧの場合、A,G,C又はＴ Ｚ＝ＷがＡの場合、Ａ又はＧ QR＝ＳがA,G,C又はＴの場合、TC QR＝ＳがＴ又はＣの場合、AG Ｓ＝ORがTCの場合、A,G,C又はＴ Ｓ＝QRがAGの場合、Ｔ又はＣ 表１の３ヌクレオチドはコドンと呼称され、生物の遺
伝物質中に存在する時、DNA3ヌクレオチドとして表わさ
れる。これらコドンのタンパク合成に於ける発現には伝
令RNA（m RNA）の中間形成が必要とされ、これに関して
は以下により詳細に述べる。mRNAコドンはチミンの代り
にウラシルがあることを別にすると表１のDNAコドンと
同じ配列を持つたものである。当分野に於いては、反対
の鎖極性（opposite strand polarity）を持つた相補的
な３ヌクレオチドDNA配列は機能的には表１のコドンと
の同等のものと理解されよう。遺伝暗号に関して重要で
良く知られている特徴に、その遺伝暗号の持つ冗長性
（redundancy）があり、それによつて、タンパク質を構
成するアミノ酸の殆んどについて、１つ以上のヌクレオ
チド３連鎖コードが使用されている。 従つて、或るアミノ酸配列をコードしている幾つかの
異なるヌクレオチド配列があり得る。このようなヌクレ
オチド配列は、或る菌株がその中のある配列を他の配列
より効率良く翻訳することはあつても、それらが全ての
生物に於いて同じアミノ酸配列を産生し得るので機能的
に同等のものと考えられている。時には、或る一定のヌ
クレオチド配列中にプリン又はピリミジンのメチル化さ
れた変異体（variant）が見つかることがある。このよ
うなメチル化によつてもコードの関係は全く影響を受け
ることはない。 基本的な概略に於いて、微生物に新規なタンパク質を
合成する能力を付与する方法は次の３ステップを含むも
のである。（１）所望タンパク質のアミノ酸配列に関す
る遺伝的にコードされた情報を含む特定遺伝子またはヌ
クレオチド配列を単離及び精製（又は化学合成）し、
（２）この単離したヌクレオチド配列を適当なベクタ
ー、典型的にバクテリオフアージ又はプラスミドのDNA
と組換え、そして（３）このベクターを適当な微生物に
移し、該所望の遺伝情報を含む受容微生物の株を選択す
る。 上記のプロセスを産業上利用しようとする際に遭遇す
る基本的に困難な点は第一段階、つまり所望の特定遺伝
情報を単離し精製することである。全ての生物細胞に於
いて、DNAは非常に高分子量のヌクレオチド鎖の形態で
存在している。細胞中には、各々の遺伝子が数百のヌク
レオチド長を持ち、10,000以上の特定タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードしている10,000以上もの構造遺伝子が
含まれている。その殆んどの場合、４種類のヌクレオチ
ド塩基によつて全ての現存する配列が形成されている。
この４種類のヌクレオチド塩基とはアデニン（Ａ）、グ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）であ
る。その結果、特定タンパク質の構造遺伝子を含有する
長い配列は、全体として化学的組成及び物理特性に於い
て非常に良く似ている。このような配列の１つを単離し
たDNA中に存在する他の非常に多くの配列から分離する
ことは、従来の物理的、化学的調製方法では通常達成さ
れ得ないものである。 先行技術に於いて、上記の一般的な操作方法の第一段
階を達成する為に二つの一般的な方法が用いられてき
た。第一の方法はしばしばシヨツトガン法と呼ばれるも
のである。この方法では、或る生物のDNAは所望のヌク
レオチド配列よりも通常長い断片に分断される。上記
（１）の段階は本質的に迂回されている。該DNA断片
は、特定配列をあらかじめ精製することなく、直ちに所
望のベクターと組換えられる。粗分画段階は適宜その間
に行ない得る。全ての可能性を持つた菌株の中から、所
望の遺伝情報を含む微生物の株を選択するのに微生物遺
伝学の選択技術を用いて行なうことができる。このシヨ
ツトガン法には二つの重要な欠点がある。 このうち特に重要な点は、この操作によつて数百もの
未知の遺伝子が受容微生物中に取込まれることになり、
実験中に未知の遺伝素性を持つた新規な株が創り出され
ることである。従つて、この操作を用いると実験従事者
と環境に対して災害をもたらす恐れがある。 シヨツトガン法の第二の欠点というのは、所望株を産
生する点で非常に効率が悪く、第一段階に於ける分画の
欠如を補償するに充分な検出力のある選択技術を用い得
るかどうかにかかつていいることである。しかしなが
ら、本明細書の後段で明らかにされるように、前記欠点
を解消する方法が存在する。 第二の一般的方法は、細胞内の全遺伝情報がある特定
の時に発現されるということは、たとえあるとしても極
めてまれであるという事実を利用している。特に、高等
生物の分化した組織はある一時期に産生し得るタンパク
質のうちのほんの少しの部分しか合成していないことが
ある。極端な場合には、このような細胞は主に一種類の
タンパク質を合成していることがある。このような極端
な場合には、適当な細胞から対応する伝令RNAを単離す
ることによつて、問題の該タンパク質をコードしている
ヌクレオチド配列を単離することが可能であつた。 伝令RNAはDNAのヌクレオチド配列情報をタンパク質の
アミノ酸配列構造に変換する過程に於いて機能する。こ
の過程の第一段階（転写）に於いては、産生すべきタン
パク質を特定しているヌクレオチド配列を持つたDNAの
局部断片がRNA中に写し取られる。RNAは、デオキシリボ
ースの代りにリボースが用いられていること及びチミン
の代りにウラシルが使用されていること以外はDNAに類
似しているポリヌクレオチドである。RNA中のヌクレオ
チド塩基はDNAの相補的鎖間に存在するものとして良く
知られている塩基対合関係と同種の関係を形成すること
ができる。Ａ及びＵ（Ｔ）は相補的であり、Ｇ及びＣが
相補的である。DNAヌクレオチド配列のRNA転写体は写し
取られた配列に対して相補的になる。このようなRNA
は、細胞の遺伝装置（genetic apparatus）とタンパク
質合成装置との間の媒介手段としての役割から伝令RNA
（mRNA）と呼称される。一般的には、細胞中である特定
の時に存在しているmRNAのみがその時に活発に合成され
ているタンパク質に対応しているものである。従つて、
主にある一種のタンパク質を合成することにその機能が
従事しているような分化細胞はそのタンパク質に対応し
ているRNA種を主に含んでいるものである。これがうま
くいきそうな場合には、分化細胞に於けるこうしたタン
パク質の特別な合成を利用して或る所定のタンパク質を
コードしている適当なヌクレオチド配列を精製・単離す
ることができる。 上記操作の主要な欠点は、細胞が主に単一のタンパク
質を合成しているものと確認できるような比較的まれな
場合にのみしかこの操作を適用し得ないということであ
る。産業上関心が持たれているタンパク質の多くはこの
ような特別な方法では合成されていないものである。所
望のタンパク質は、或る一定の時期に或る組織又は器官
の細胞によつて産生される百いくつもの様々なタンパク
質のうちの一つかも知れない。それにもかかわらず、細
胞中に存在するRNA種の組は通常DNA中に存在している全
配列のうちの一部分にすぎないのであるから、mRNA単離
技術は有用であり、したがって、初期精製手段を提供し
ていることになるのである。 極く最近の発展によると、ある配列がmRNA配列の異種
集団うちの２％という低い頻度で存在するような場合に
於いても、該ヌクレオチド配列を単離・精製できる操作
が米国特許第4,363,877号に開示されている。更に、最
初に単離された全RNA集団中もつと低い頻度で存在する
配列を単離・精製する為に、この操作をmRNAを分画する
公知の方法と組み合せることも可能である。この方法は
一般に、実際上どんな生物から抽出したmRNA種に対して
も適用し得、それ故に産業上及び研究上興味のあるタン
パク質を最終的に役に立つだけの量生産する為の強力な
基本的な手段を提供するものである。 上記の方法はmRNA及びDNAの或る構造上の特徴を利用
し、或る種の酵素によつて触媒される反応を使用するも
のである。先行技術に於いて理解されているところの上
記反応の性質及び構造上の詳細な点については本明細書
中に記載し、上記米国特許に於いて更に詳細に述べられ
るものである。 本明細書中で用いられる符号及び略号を次表に示す。 天然の形態では、DNAは直鎖ポリヌクレオチド対の形
態で存在する。前述の相補的塩基対合関係というのは一
方のストランドの各ヌクレオチド塩基が他方のストラン
ド上にあるそれと相補的な塩基とを対峙して在るように
一対の鎖相互間に存在しているものである。一方のスト
ランドの全配列は他方のストランド上の相補的配列によ
つて鏡面反映させられている。一対の鎖（ストランド）
が分離した時に、適当な前駆体モノマーから新しいパー
トナーであるストランドを合成することが可能である。
一端から始まるモノマーの添加による配列は元の完全な
ままのポリヌクレオチド鎖配列に相補的になるようにそ
れによつて決定される。つまりこのポリヌクレオチド鎖
配列がその相補的パートナー合成に対する鋳型として働
くのである。DNAの特定ヌクレオチド配列に対応するmRN
Aの合成に関してもこれと同様な原理に従うものと理解
されている。従つて、転写された領域に於いて、ある特
定のmRNA分子はDNAの一本の鎖に相補的であり、他方のD
NA鎖と同一の配列を持つことになる。生細胞中には、あ
る特定のタンパク質に対するヌクレオチド配列を含む特
定のDNA断片を選択的に転写させるような酵素による機
構が存在する。従つて、ある特別なタンパク質のアミノ
酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含むmRNAを
単離することはDNAそれ自体から同じ配列、すなわち遺
伝子を単離することと等価なものである。もし、mRNAが
再転写されそれに相補的なDNA（cDNA）を形成すると、
それによつて正確なDNA配列が再構成されたことにな
り、適当な方法によつて他の生物の遺伝物質中にこのDN
A配列を挿入することができる。従つて、ある一定の配
列のこの二つの相補版は相互に変換し得、機能的に互い
に同等なものである。 DNA及びRNAのヌクレオチドサブユニツトは一つのヌク
レオチド糖の５′位とそれと隣接しているものの３′位
との間をリン酸ジエステル結合によつて互いに結び付け
られている。このような結合の繰り返しにより、一方の
末端が他方の末端と区別され得るような意味で極性を持
つた直鎖状ポリヌクレオチドが生じる。３′末端は遊離
３′−ヒドロキシであり得、又はこのヒドロキシはリン
酸塩（エステル）又はより複雑な構造で置換されている
場合もある。５′末端についても同様である。真核生
物、すなわち明確な核と有糸***装置をもつている生物
に於いては、機能mRNAの合成は通常そのmRNAの３′末端
にポリアデニル酸を付加することを含むものである。従
つて、伝令RNAは、ポリチミジル酸を付着させたセルロ
ースのカラムクロマトグラフイによつて、真核生物から
単離した他のクラスのRNAから分離することができる。
アビブ・エイチ（Aviv,H.）及びレーダー・ピー（Lede
r.P.），プロス・ナト・アカド・サイ（Proc.Nat.Acad.
Sci.,）,69巻、1408頁（1972年）を参照のこと。オリゴ
dT,ポリＵ、又はポリＴ及びポリＵの組合せを含むクロ
マトグラフイ充填用物質、例えばポリＵ−セフアロース
（poly U−Sepharose）に対するポリＡの塩基対合親和
性（base−pairing affinity）を利用した他のクロマト
グラフイ手段も同様に用いることができる。 逆転写酵素（reverse transcriptase）はRNA鋳型の存
在下でRNA鋳型鎖に相補的なDNAの合成を触媒するもの
で、この際にはプライマーである３′−ヒドロキシを持
っている相補的なオリゴ又はポリヌクレオチドと四種の
デオキシヌクレオシド３リン酸、つまりdATP、dGTP、dC
TP及びdTTPを存在させる。この反応はmRNAの３′末端近
傍にオリゴデオキシヌクレオチドプライマーが非共有結
合的に会合することにより開始され、続いてmRNAヌクレ
オチド配列との塩基対合関係で決められている如くに、
成長している鎖の３′末端への適当なデオキシヌクレオ
チドの付加が段階的に行なわれる。生成分子はヘアピン
構造として記述でき、元のRNAは、一部分が一端に於い
てそれ自身に対し折り畳まれているDNAの相補鎖と水素
結合によつて対になつている。DNAとRNAとの鎖は互いに
共有結合によつて結合しているものではない。逆転写酵
素は一本鎖DNA鋳型を用いた類似の反応を触媒すること
もでき、そのような場合、得られる生成物は一端が一本
鎖DNAのループによつて結びつけられている二本鎖DNAの
ヘアピンである。アビブ・エイチ（Aviv,H.）及びレー
ダー・ピー（Leder,P），プロス・ナト・アカド・サイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,69巻,1408頁（1972年）
及び、エフストラテイアデイス・エー（Efstratiadis.
A.）；カフアトス・エフ・シー（Kafatos,F.C.），マキ
シアム・エー・エム（Maxam,A.M.）及びマニアテイス・
テイー（Maniatis,T.）細胞（Cell）,7巻,279頁（1976
年）。 制限エンドヌクレアーゼはDNA中のリン酸ジエステル
結合を加水分解することのできる酵素であり、DNA鎖の
連がり（continuity）に切れ目を生起せしめる。もしも
DNAが閉じたループの形状である場合には、そのループ
は線状構造に変換させられる。制限酵素の主な特徴は、
その加水分解作用がある特定のヌクレオチド配列の箇所
だけで生起するということである。 このような配列箇所はその制限エンドヌクレアーゼに
対する制限部位と呼ばれる。様々な生物源から制限エン
ドヌクレアーゼが単離され、それらの制限部位のヌクレ
オチド配列によつて特徴づけられてきた。二本鎖DNAに
作用する時に、制限エンドヌクレアーゼの幾種類かは同
じ箇所で両鎖のリン酸ジエステル結合を加水分解し、平
滑末端を生じる。他のものは数ヌクレオチド分だけ離れ
て結合を加水分解し、切断分子の各末端に於ける遊離状
態の一本鎖領域を生じる。このような一本鎖末端は自己
相補的で接着性（cohesive）であるから、加水分解され
たDNAを再結合させるのに用いることができる。このよ
うな酵素の１種によつて切断されるDNAはどれでも同じ
認識部位を含んでいるにちがいないから、同じ接着末端
が生じることになり、制限エンドヌクレアーゼ処理した
DNAの異種配列を同様に処理した他の配列に結合させる
ことが可能でる。ロバート・アール・ジエイ（Roberts,
R.J.）、クリト・レブ・バイオケム（Crit.Rev.Bioche
m）,4巻、123頁（1976年）を参照のこと。 或る酵素に対する制限部位は比較的まれであり、不均
一に分布している。或る特定の制限部位が一定の断片内
に存在するかどうかということは実験的に決定すべきこ
とである。しかしながら、様々な生物源から多様な部位
特異性を持つた制限エンドヌクレアーゼが数多単離また
は単離されつつあるので、千個のヌクレオチドのある一
定の断片が１つ以上の制限部位を含有している可能性が
あると考えるのは道理にかなつたことである。 一般的な技術的背景に関しては、ワトソン・ジエイ・
デイー（Watson,J.D.），遺伝分子生物学（the Molecul
ar Biology of the Gene）,3版，ベンジヤミン（Benjam
in），メンロパーク（Menlo Park），カリフ（Calif）,
1976年；ダビツドソン・ジエイ・エヌ（Davidson,J.
N.），核酸の生化学（The Biochemistry of the Nuclei
c Acids）,8版，アダムス・アール・エル・ピー（Adam
s,R.L.P.），バードン・アール・エイチ（Burdon,R.
H.），キヤンベル・エー・エム（Campbell,A.M.），及
びスメリエ・アール・エム・エス（Smellie,R.M.S.）改
訂版，アカデミツク・プレス，ニユーヨーク,1976年；
及びヘイズ・ダヴリユー・（Hayes.W.），バクテリア及
びそのウイルスの遺伝学，基礎遺伝学及び分子生物学の
研究（The Genetics of Bacteria and their Viruses,S
tudies in Basic Genetics and Molecular Biology）,2
版，ブラツクウエル科学出版（Blackwell Scientific P
ub.），オクスフオード,1968年を参照のこと。 従つて、本発明の目的は有用量のアポエクオリンを供
給し得るだけの微生物を提供することに在る。 更に、本発明は微生物の中に挿入されてアポエクオリ
ンを発現し得るような組換えDNAベクターを提供するこ
とを目的とするものである。 また更に、所望の組換えDNAベクターを生産する際に
使用され得る、合成で製造されるか又は天然源から単離
し得るか特定構造を持つたDNA断片を提供することも本
発明のもう一つの目的である。 こうして更に、天然アポエクオリンの活性によく似た
ペプチドを実験室での合成により又は微生物により製造
できるようにすることも本発明のもう一つの目的であ
る。 以上の本発明の目的およびその他の目的は、本明細書
中以下で直により明確になるであろうが、以下の第１〜
４式の化合物（１）およびその塩（２）から選択される
均一なペプチドを提供することによつて達成し得たもの
である。（ｂ）第２式： 第１式のPRO5の代りにSER、ASN8の代りにASP、LYS11
の代りにARG、ASP78の代りにGLU、ALA81の代りにGLU、L
YS88の代りにARG、THR91の代りにSER、ASP92の代りにCY
S又はGLU、GLU95の代りにLYS、LYS96の代りにARG、ALA
98の代りにSER、GLN101の代りにGLU、ILE102の代りにPR
O、ILE107の代りにLEU、ILE116の代りにVAL、THR125の
代りにSER、SER127の代りにASP、THR141の代りにSER、G
LU144の代りにASPになったもの（ここで、下付き番号は
第１式のアミノ末端から数えたアミノ酸位置を表してい
る）、 （ｃ）第３式として、前記第１式又は第２式に於いて、
アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
の両末端の１から15個のアミノ酸が欠如したもの。 （ｄ）第４式として、前記第１式又は第２式に於いて、
アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
の両末端に１から10個の付加アミノ酸を連続的に結合し
たもの。 （ｅ）第５式として、前記第１式においてアミノ末端
に、−MET THR SER GLU GLN TYR SER−の配列を有する
付加アミノ酸を連続的に結合したもの。 （２）前記式を有する化合物の塩類。 以上のペプチドは腔腸動物門のルシフエリンを結合し
Ca2+の存在下で光を放出することができる。 GTL1 AAJ2 XTY3 ACL4 〔CCL又はQRS〕5 GAK6 TTK
7 〔AAK又はGAK〕8 AAK9 CCL10 〔AAJ又はWGZ〕11
TGG12 ATM13 GGL14 WGZ15 CAK16 AAJ17 CAK18
ATG19 TTK20 AAK21 TTK22 XTY23 GAK24 GTL25
AAK26 CAK27 AAK28 GGL29 AAJ30 ATM31 QRS32
XTY33 GAK34 GAJ35 ATG36 GTL37 TAK38 AAJ39
GCL40 QRS41 GAK42 ATM43 GTL44 ATM45 AAK46
AAK47 XTY48 GGL49 GCL50 ACL51 CCL52 GAJ53
CAJ54 GCL55 AAJ56 WGZ57 CAK58 AAJ59 GAK60
GCL61 GTL62 GAJ63 GCL64 TTK65 TTK66 GGL67
GGL68 GCL69 GGL70 ATG71 AAJ72 TAK73 GGL74
GTL75 GAJ76 〔GAK又はGAJ〕78 TGG79 CCL80
〔GCL又はGAJ〕81 TAK82 ATM83 GAJ84 GGL85 TGG
86 AAJ87 〔AAJ又はWGZ〕88 XTY89 GCL90 ACL91
〔GAK,GAJ,又はTGK〕92 GAJ93 XTY94 GAJ95 〔AAJ
又はWGZ〕96 TAK97 〔GCL又はQRS〕98 AAJ99 AAK
100 〔CAJ又はGAJ〕101 〔ATM又はCCL〕102 ACL103
XTY104 ATM105 WGZ106 〔ATM又はXTY〕107 TGG
108 GGL109 GAK110 GCL111 XTY112 TTK113 GAK
114 ATM115 〔ATM又はGTL〕116 GAK117 AAJ118 GA
K119 CAJ120 AAK121 GGL122 GCL123 ATM124 ACL
125 XTY126 〔QRS又はGAK〕127 GAJ128 TGG129 AA
J130 GCL131 TAK132 ACL133 AAJ134 QRS135 GCL
136 GGL137 ATM138 ATM139 CAJ140 〔ACL又はQR
S〕141 QRS142 GAJ143 〔GAJ又はGAK〕144 TGK145
GAJ146 GAJ147 ACL148 TTK149 WGZ150 GTL151
TGK152 GAK153 ATM154 GAK155 GAJ156 QRS157 GG
L158 CAJ159 XTY160 GAK161 GTL162 GAK163 GAJ
164 ATG165 ACL166 WGZ167 CAJ168 CAK169 XTY
170 GGL171 TTK172 TGG173 TAK174 ACL175 ATG
176 GAK177 CCL178 GCL179 TGK180 GAJ181 AAJ
182 XTY183 TAK184 GGL185 GGL186 GCL187 GTL
188 CCL189〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオ
キシグアニル、Ｃはデオキシシトシル、Ｔはデオキシチ
ミジル、ＪはＡ又はG;KはＴ又はC;LはA,T,C,又はG;Mは
A,C又はT;Xはそれに続くＹがＡ又はＧのときＴ又はC,そ
れに続くＹがＣ又はＴのときはC;Yはそれに先立つＸが
ＣのときA,G,C又はＴ、それに先立つＸがＴのときはＡ
又はG;Wはそれに続くＺがＧ又はＡのときはＣ又はA,そ
れに続くＺがＣ又はＴのときはC;Zはそれに先立つＷが
ＣのときはA,G,C又はＴ、それに先立つＷがＡのときは
Ａ又はG;QRはそれに続くＳがA,G,C又はＴのときはTC,そ
れに続くＳがＴ又はＣのときはAG;Sはそれに先立つQRが
TCのときはA,G,C又はT,それに先立つQRがAGのときはＴ
又はC;であり、下付き番号は遺伝暗号によつてこのヌク
レオチド配列が対応するアポエクオリンのアミノ酸位置
を示し、アミノ酸位置はアミノ末端から数えたものであ
る〕 のヌクレオチド配列又は前記のペプチドをコードしてい
るヌクレオチド配列を含むDNA分子、組換えDNAベクタ
ー、及び修飾微生物もまた、遺伝子工学技術による上述
のようなペプチドの製造に関係する本発明の好適な一面
の実施用として提供される。 図面の簡単な説明 添附図面により特定の実施例で得られた結果を示す。
前記実施例は本発明を示すものであつて、本発明を限定
するものではない。 第１図は、オワンクラゲ（Aequorea Jellyfish）から
単離されたポリ（A+）RNAを用いてイン・ビトロで翻訳
されたタンパクをオートラジオグラフイー分析した結果
を示す写真である。翻訳は、オワンクラゲ ポリ（A+）
RNAの非存在下（レーン１）、存在下（レーン３）で行
なつた。２種の反応からの抗エクオリン免疫沈降タンパ
クを夫々、レーン２および４に示した。図の右側に、タ
ンパク分子量標準のホスホリラーゼｂ、BSA、卵アルブ
ミン、炭酸脱水酵素、SBT1およびリソチームの位置を示
す。天然エクオリンの位置も図示している。 第２（ａ）図は、アポエクオリンをコードするDNA配
列を含むオワンクラゲ（Aequorea victoria Jellyfis
h）から単離した遺伝子の制限地図であり、第２（ｂ）
図は、lacプロモーターの下流でプラスミドに挿入され
た第２（ａ）図のセグメントの制限地図である。 第３図は、pAEQ1抽出物中のCa2+−依存性発光タンパ
ク活性の時間および酸素依存性を示すグラフである。使
用した条件は次の通りである。 （ａ）曲線１および２では、活性画分0.5mlをβ−メル
カプトエタノール2mMおよび腔腸動物のルシフエリン0.1
mMに調製し、４℃でインキユベートした。適当な時間間
隔で５μｌを抜き取り、発光タンパク活性を調べた。 （ｂ）曲線２では、Arガスを泡立てて溶解O2レベルを低
下させ、混合物を表示した時に酸素と接触させた。 （ｃ）曲線３では、pAEQ1抽出物の代りに培養混合物中
に天然アポエクオリンを用いた。 第４図は、pAEQ1抽出物から生ずるCa2+−依存性発光
タンパク活性のゲル過プロフイールのグラフである。
pAEQ1抽出物からの部分精製されたアポエクオリン活性
分を用いて、第３図に記載したようにCa2+−依存性発光
タンパク活性を発生させた。次いで、この発光タンパク
画分（50μｌ）を、10mMEDTA、15mM Tris pH7.5おび100
mMKClを用いて平衡化させたＧ−75−40スーパーフアイ
ン（superfine）カラム（ベツド容量30.7ml）に充填し
た。各種分子量標識物質の溶離位置を示す。 好ましい具体例の記載 本発明者は、微生物中でタンパクアポエクオリンを発
現しうる組換えDNAベクターを初めて得、次いでアポエ
クオリンのアミノ酸配列を初めて同定した。これによ
り、均質なアポエクオリンの入手が可能となる。この情
報を用いて、適量の均質アポエクオリンを入手すること
ができる各種組換えDNAベクターが得られる。一般的な
組換えDNA技法を用いて別の組換えDNAベクターを産生す
ることができる。アポエクオリンを発現する形質転換体
もこの技術の例として産生された。 アポエクオリンのアミノ酸配列を表３に示す。 各アミノ酸を１文字で表記してアポエクオリンのアミ
ノ酸配列を示す。配列中の微不均一性の位置を括弧内の
文字で示す。表示したアミノ酸置換全てで生物学的機能
性を有するエクオリンを表わす。上記配列中の文字に対
応するアミノ酸は次の通りであえる。 A:アラニン、C:システイン,D:アスパラギン酸,E:グルタ
ミン酸,F:フエニルアラニン,G:グリシン,H:ヒスチジン,
I:イソロイシン,K:リシン,L:ロイシン,M:メチオニン,N:
アスパラギン,P:プロリン,Q:グルタミン、R:アルギニ
ン,S:セリン,T:トレオニン,V:バリン,W:トリプトフア
ン,Y:チロシン ペプチドのアミノ酸とペプチドをコードするDNA配列
との間に明確な対応関係があることは知られているの
で、アポエクオリン（或いは後記する変性ペプチド）を
コードするRNA分子またはDNA分子のDNA配列はこのアミ
ノ酸配列から容易に誘導され得る。アポエクオリンDNA
の一本の鎖のヌクレオチド配列を表４に示す。表中、数
字はタンパクのアミノ末端で開始するアミノ酸配列およ
び対応するDNAコドン配列を示す。mRNAではＵがＴに代
わつている点を除いてDNA配列はmRNA配列に対応してい
る。 遺伝子のDNA配列は十分に同定されているので、DNA遺
伝子を全くの科学的合成によつて産生することができ
る。その後、遺伝子を公知の組換えDNA技法を用いて多
くの入手可能なDNAベクターに挿入することができる。
従つて、本発明は、本願出願当時一般に自由に入手でき
る試薬、プラスミドおよび微生物を用いて実施されう
る。 例えば、塩基長さが100以上のヌクレオチド配列は、
アプライドバイオシステムス（Applied Biosystems）モ
デル380 A DNA合成装置を用いて容易に合成されうる。 なお同装置については、例えばジエネテイツクエンジ
ニアリングニユース（Genetic Engineering News）、No
r/Dec.1984 p.3に広告されている如く周知のものであ
る。前記オリゴヌクレオチドを後記する技術を用いてス
プライスすると本明細書に記載されているヌクレオチド
配列が得られる。 更に、本明細書に記載されているペプチド類を容易に
直接合成しうる自動化装置も入手可能である。上記ジエ
ネテイツク エンジニアリング ニユースの同じ号に
は、99％を超える結合効率を有する市販の自動ペプチド
合成装置の広告が掲載されている（p.34）。前記装置を
用いると、直接合成により或いは他の公知の方法で結合
されうる一連の断片を合成することにより本発明のペプ
チドを簡単に得ることができる。 表３に示した特定のペプチド配列の他に、これらの配
列をベースとし僅かな変更を加えた他のペプチドもアポ
エクオリンの生物学的活性を有する。例えば、配列末端
の一方もしくは両方から最高15個のアミノ酸が欠けてい
ても、ルシフエリンおよびカルシウム結合能は失なわれ
ない。同様に、末端の一方もしくは両方に最高10個のア
ミノ酸が更に付加されていてもよい。こうした変更（修
正）は、ルシフエリンおよびカルシウム結合部位が上記
配列の中央のアミノ酸にあるから可能なのである。例え
ば、アミノ酸40−100にルシフエリン結合部位があるよ
うである。末端は生物学的活性に比較的重要な影響を及
ぼさないので、付加アミノ酸の本質は重要でなく、かつ
上記アミノ酸のいずれでもよい。 アミン末端の付加アミノ酸が生物発光に大した影響を
有しないことを立証する実験データもある。しかしなが
ら、上記した特定式により極めて近似したもの、特にい
ずれかの末端の10個あるいはそれ以下好ましくは５個あ
るいはそれ以下のアミノ酸を欠くか、もしくはいずれか
の末端に７個あるいはそれ以下、好ましくは４個あるい
はそれ以下のアミノ酸が付加されている化合物、もしく
は、アミノ末端に、−MET THR SER GLU GLN TYR SER−
の配列を有する付加アミノ酸が連続的に結合している化
合物が好ましい。 分子の中央部分のアミノ酸を置換することは、生物学
的活性を維持するためにより限定される。しかしなが
ら、表３または表４に示した微不均一性の全ゆる部分が
生物学的機能を有する置換を示し、指示した置換をいか
ように組合わせても機能性分子を表わすであろう。表３
および表４中、メインライン（表３中かっこでくくって
ない配列）または第１エントリー（表４のかっこ内の最
初のもの）はその位置でより広く用いられているアミノ
酸またはヌクレオチドを示しより好ましいものである。 更に前記ペプチドおよびDNA分子を僅かに変更させた
ものも、当業者には明らかなようにより詳細に述べるペ
プチドおよびDNA分子と同等のものとしてみなされる。
例えば、特に置換が結合部位のアミノ酸に関連していな
いならば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、ア
スパラギン酸をグルタミン酸で、トレオニンをセリンで
単離（isolated）置換しても、或いはアミノ酸を構造的
に関連するアミノ酸で同様に置換しても、得られた分子
の生物学的活性に重大な影響はないことは予想される。
機能性ペプチドに変化が生じるかどうかは得られたペプ
チドをルシフエリンとインキユベートし、次いでカルシ
ウムイオンと接触させることにより簡単に調べることが
できる。この方法についての詳細は後記する。光が発す
れば置換は実体的ではなく、被験分子は表３の分子と同
等である。１個あるいはそれ以上の置換が行なわれてい
るペプチドも同様にして容易に試験されうる。 前記ペプチドをコードするDNA分子は、表１に示した
コドンのリストから容易に決定され、これも同様に表４
のDNA配列と同等のものとみなされる。実際ペプチド内
のDNAコドンとアミノ酸とは1:1で対応しているので、ペ
プチドでの置換あるいは他の変化に関する本明細書中の
議論は対応するDNA配列や、その配列を含むDNA分子，組
換えベクターまたは形質転換微生物（およびその逆）に
も均等にあてはめることができる。 表４に示した特定のヌクレオチドに加えて、本発明の
DNA（或いは対応するRNA）分子は前記特定のヌクレオチ
ドの前後いずれに追加のヌクレオチドを有していてもよ
い。例えば、ポリＡを３′末端に付加することもでき
る。何れかの末端に短い（例えば20より少ないヌクレオ
チド）配列を付加して、制限酵素部位に対応する末端配
列としてもよい。停止コドンをペプチド配列に続けて、
転写を終止させてもよい。更に、遺伝子の上流にプロモ
ータ領域或いは他のコントロール領域を含むDNA分子を
達成することもできる。本発明の配列を含むDNA分子は
全て細かく断片化されて本明細書に後記する種類のオリ
ゴヌクレオチドプローブを産生することができるので、
前記DNA分子は全て少なくとも１つの目的に対して有用
である。 本発明のペプチドは、直接合成により或いは本明細書
に記載されているクローン化遺伝子を用いることにより
初めて均質物として作成されうる。ここで“均質（homo
geneous）”とは、ペプチド或いはDNA配列について言及
するときには、当該組成物中に存在する実質的に全ての
分子の一次分子構造（即ちアミノ酸もしくはヌクレオチ
ド配列）が同一であることを意味する。前記した“実質
的に”という用語は少なくとも95重量％、より好ましく
は少なくとも99重量％、最も好ましくは少なくとも99.8
重量％を意味する。均質ペプチドあるいはDNA配列の全
分子に由来する断片が存在する場合、そのような断片が
５重量％以下、好ましくは１重量％、より好ましくは0.
2重量％以下存在しているならば均質性（homogeity）を
調べるときに考慮しなくともよい。何故ならば、（天然
アポエクオリン中に存在する混合物のように）一次分子
構造が異なる分子量の類似した幾つかの分子が存在する
混合物とは対照的に、単一の一定した構造を有する全分
子（およびその断片）の存在を“均質”という用語が指
しているからである。本明細書で使用した“単離された
（isolated）”という用語は、夫々他のペプチド類,DNA
類またはRNA類から分離されかつこの生化学的溶液中に
通常存在する溶媒，緩衝液、イオン或いは他の成分のみ
の存在下でみとめられる純粋なペプチド、DNA或いはRNA
を指す。“単離された”の中に、天然の（native）状態
の天然物質、或いは（例えばアクリルアミドゲル中で）
成分に分離されているが純粋な物質または溶液として得
られていない天然物質は含まれない。本明細書中“純
粋”という用語は上記した“実質的”と同じ数値制限を
有するのが好ましい。本明細書中“……により置換され
る”或いは“置換”というフレーズは、指示した“置
換”アミノ酸が別の式中に存在することが指示されてい
るアミノ酸と同じ位置に存在する場合（例えばセリンが
プロリンの代りに５の位置に存在する場合）存在するペ
プチドを指すのであって行なわれる作用そのものを指す
とは限らない。 本明細書に記載のペプチドの塩類とは、該ペプチドが
各種pHの水溶液中に存在する（或いは前記水溶液から単
離された）ときに天然に存在するものである。上記した
生物学的活性を有するペプチドの塩類は全て本発明の範
囲内にあるとみなされる。カルボン酸残基のアルカリ，
アルカリ土類および他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩
（例えばHCl）および同一分子内のカルボン酸残基とア
ミノ残基との反応により形成される両性イオンが例示さ
れる。 本発明は特に、表３および表４にリストされているア
ミノ酸やコドンの可能な選択に基づく組合せを選択する
ことによってなされうる種々のヌクレオチドまたはペプ
チドの可能な変形の各々および全てを包含しており、こ
れら全ての変種も特に開示されたものとみなされる。 本発明の好ましい具体例では、mRNAとしてコードされ
る遺伝情報はオワンクラゲ（Aequorea jellyfish）から
得られ、DNA遺伝子の構成に使用される。続いて前記DNA
遺伝子を用いて本発明ペプチドが産生される。 オワンクラゲの光発光器官からの細胞抽出物を使用す
ることが好ましい。ただし、全体細胞抽出物を使用する
ことも可能である。典型的には、クラゲまたはその一部
を小片に切断し（切り刻み）、小片をすり砕して初期の
粗細胞懸濁液を形成する。細胞懸濁液に音波処理あるい
はその他の処理を加えて細胞膜を破壊し、粗な細胞抽出
物を得る。所望により、公知の生化学的手法（例えばタ
ンパクの選択的沈殿）を用いて初期精製することもでき
る。粗の細胞抽出物あるいはそれからの部分精製RNA部
分を処理して更にRNAを分離する。例えば粗な細胞抽出
物を、１インチ×3.5インチのニトロセルロースチユー
ブ中の5.7MCsCl,10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EDTAの5ml
クツシヨンの頂部に重層し、SW27ローター（ベツクマン
・インストルメント社，（Beckman Instruments Cor
p.），フラートン（Fullerton），カリホルニア）を用
いて15℃、27000rpmで16時間遠心分離することができ
る。遠心分離後、チユーブ内容物をデカントし、チユー
ブから水を流去させ、澄明なRNAペレツトを含む底1/2cm
をレーザー刃で切断する。ペレツトをフラスコに移し、
10mM Tris−HCl、pH7.5,1mM EDTA,5％サルコシル（sarc
osyl）および５％フエノール20ml中に溶解させる。次い
で溶液をNaCl0.1Mに調整し、フエノール−クロロホルム
混合物（1:1）40mlを加えて振盪させる。RNAが、0.2M酢
酸ナトリウムpH5.5の存在下でエタノールを用いて処理
すると水性相から沈殿し、これを遠心分離により回収す
る。この方法の代りに、細胞源からRNAを単離する別の
いずれの方法を使用することも可能である。 配列および分子サイズの点で不均質なポリアデニル化
された。粗なあるいは部分的に精製されたmRNAのような
各種形態のRNAも使用されうる。RNA単離方法の選択性
は、単離されたRNAの不均一分散相中に所望のmRNAを多
く含ませることになるあらゆる方法によつて影響され
る。上記のような使用した予備的精製方法によつてmRNA
のエンドヌクレアーゼ開裂（endonucleolytic cleavag
e）を招かなければ、本発明の遺伝子の作成にどんな精
製方法も使用しうる。 所望のmRNA配列を豊富にするための予精製は、RNAを
細胞から単離後RNAを分画化するための従来方法を用い
て行うこともできる。RNAを分解することのないあらゆ
る技術が使用できる。シヨ糖勾配での調製用沈降法およ
びゲル電気泳動法が特に適当である。 mRNAは、mRNAの分解を防ぐ条件下で源細胞から単離し
なければならない。R Nase酵素はRNAヌクレオチド配列
を加水分解する能力を有しているので、これら酵素の作
用は特に避けなければならない。細胞からの抽出中にR
Naseを阻害する適切な方法としては、細胞破壊段階で4M
グアニジニウムチオシアネートおよび1Mメルカプトエタ
ノールを使用することが適当である。加えて、単離され
たRNAのR Nase分解を抑えるには低温度および5.0に近い
pHが有用である。 一般に、mRNAは汚染タンパク,DNA,ポリサツカライド
および脂質を本質的に含まずに作成される。このように
精製するための標準的な方法は当業界で公知である。こ
うして単離されたRNAは非メツセンジヤーおよびメツセ
ンジヤーRNAを含む。真核生物のmRNAを分離するには、
真核生物mRNAの３′末端にポリアデニル酸が存在するた
めにもたらされる水素結合特異性を利用して、オリゴ−
dTセルロースあるいは他のオリゴヌクレオチド置換カラ
ム材料例えばポリＵ−セフアロースのカラムを用いるク
ロマトグラフイーにかけるのが一般的である。 通常の次の工程は、単離されたmRNAの不均質配列に相
補的なDNAを形成することにある。この反応のために原
則的にはmRNA鋳型の相補的DNAコピーを正確に形成しう
る酵素であれば使用しうるが、逆転写酵素が選択され
る。反応は先行技術に記載された条件下で、鋳型として
mRNAおよびDNA鎖の前駆物質として４種のデオキシヌク
レオシド トリフオスフエート、即ちdATP,dGTP,dCTPお
よびdTTPの混合物を用いて実施される。反応過程をモニ
ターし、クロマトグラフイーや電気泳動等で分離後生成
物を回収するための目的（tag）を与えるために、かつ
回収率を定量評価する目的で、ヂオキシヌクレオチド
トリフオスフエートの１種のアルフア位を放射性同位元
素例えば32Pで標識することが好都合である。上記した
エフストラテイアデイス、エー（Efstratiadis,A.）ら
の文献を参照されたい。 逆転写酵素反応により生成されるcDNA転写物は、mRNA
鋳型に対する各転写物の開始点および終結点が異つてい
るために５′末端並びに３′末端の配列が幾分異質であ
る。５′末端の変異性は、合成を開始するために使用さ
れるオリゴ−dTプライマーはmRNAのポリアデニル化領域
に沿つた各種地点で結合し得るためと考えられる。cDNA
転写物はポリ−Ａ領域の中間点で合成が開始され、各種
長さのポリ−Ａ領域がオリゴ−dTプライマーの初期結合
サイトに応じて転写される。この不確実性は、オリゴ−
dTトラクト（tract）に加えてRNA配列それ自体のヌクレ
オチド１個あるいは２個を含むプライマーを使用すれば
避けられ、転写反応を開始するのに好ましくかつ一定の
結合サイトを有するプライマーが生成される。 cDNA転写物（transcript）の３′末端の不確実性は、
逆転写酵素反応に影響を及ぼす各種因子およびRNA鋳型
の部分的分解の恐れによるものである。最大長さを有す
る特定のcDNA転写物は、逆転写酵素反応条件を十分な長
さ（full length）の合成に好都合でありDNA短鎖の合成
を抑制するように選択すれば極めて容易に単離される。
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素のための好ましい反
応条件は、米国特許第4,363,877号明細書の実施例に記
載されており、前記明細書は本明細書中に緩用される。
長鎖DNA転写物を高い確実度で最大に生成すべく変更さ
れうる特殊パラメーターは反応温度、塩濃度、酵素量、
鋳型に対するプライマー濃度および反応時間である。 温度および塩濃度条件は、オリゴ−dTプライマーとRN
A鋳型のポリアデニル化部分との間の特殊な塩基対合（b
ase−pairing）を最適にするように選択される。適切に
選択された条件下で、プライマーはRNA鋳型のポリアデ
ニル化領域で結合し、短かいＡ−リツチ配列のような鋳
型上の別の位置でのプライマー結合による非特異的開始
反応は実質的に避けられる。温度および塩濃度の影響は
相互依存性である。温度を高くし塩濃度を低くすると、
特異的な塩基対合相互作用の安定性が低下する。反応時
間は、非特異的開始反応を回避しかつ分解の機会を最小
限にするために出来る限り短く保たれる。反応時間は温
度と相関関係にあり、温度が低ければ反応時間は長時間
を要する。42℃では１〜10分の反応時間が適当である。
プライマーはRNA鋳型に対して50〜500倍モル過剰に存在
させなければならず、酵素もRNA鋳型に対して同様にモ
ル過剰で存在させなければならない。過剰の酵素および
プライマーを使用すると開始反応およびcDNA鎖の成長が
促進され、長鎖のcDNA転写物が限られた短いインキユベ
ーシヨン時間内に効率よく産生される。 多くの場合、mRNAから転写された一本鎖cDNAを使用し
て該cDNAをさらに精製することが可能であろう。しかし
下記に論ずるように、所望の制限酵素が２本鎖DNAに対
してしか作用しない場合がある。この場合、前記のよう
にして調製されたcDNAは、例えばリバーストランスクリ
プターゼのようなDNAポリメラーゼ及び１本鎖DNAを加水
分解できるヌクレアーゼを使用して、２本鎖DNA合成用
の鋳型として使用できる。この方法による２本鎖DNAの
調製方法は先行文献に記載されている。例えば、ウルリ
ツチ（Ullrich）.A.,シヤイン（Shine）.J.,チヤーグウ
イン（Chirgwin）,J.,ピクテツト（Pictet）,R.,テイシ
エー（Tischer）、E.,ルター（Rutter）、W.J.及びグツ
ドマン（Goodman）,H.M.,サイエンス（Science）196,13
13（1977）を参照されたい。必須ではないが所望により
米国特許第4,363,877号の方法によりcDNAを更に精製す
ることも可能である。この方法においては、不均一mRNA
配列の転写により調製された不均一cDNAを、１種あるい
は２種の制限エンドヌクレアーゼにより処理する。使用
するエンドヌクレアーゼの選択はまず第１に単離したい
cDNA配列中に存在する酵素認識部位の予備測定に依る。
この方法は２つのそのような部位の存在に左右される。
該部位が同一である場合、一つの酵素で十分である。所
望配列は両部位で開裂され、所望cDNA配列に関する限り
サイズの不均一性が取り除かれ、所望配列を含み長さが
均一なフラグメント（断片）と指称ある分子の数を増大
する。制限部位が異なる場合は、所望の長さの均一なフ
ラグメントを生成するために２つの酵素が必要である。 所望のタンパク質の全体あるいは一部をコードする最
適長さのヌクレオチド配列フラグメントを生成できる制
限酵素の選択は経験的に成されなければならない。所望
のタンパク質のアミノ酸配列が既知である場合は、制限
エンドヌクレアーゼ開裂により生成された統一された長
さのフラグメントのヌクレオチド配列を、それがコード
するアミノ酸配列と、全ての生物の形態に共通な遺伝子
コード（遺伝暗号）の公知の関係を使用して比較するこ
とができる。しかしながら、部分的な配列に基いて必要
程度に正確な同定ができるので、所望タンパク質の完全
なアミノ酸配列は必要ではない。所望タンパク質のアミ
ノ酸配列が既に判明していない場合、制限エンドヌクレ
アーゼ開裂によつて生成された統一長のポリヌクレオチ
ドは、適当なin vitroのタンパク質合成系において所望
タンパク質の合成を検知し得るプローブとして使用し得
る。あるいは、mRNAはアフイニテイークロマトグラフイ
ーにより精製し得る。当業者により考えられ得るその他
の技術も本目的に適当なものとなろう。 使用に適した制限酵素の数は、一本鎖cDNAを使用する
か２本鎖cDNAを使用するかに依る。好ましい酵素は一本
鎖DNAに対して作用できるものであり、一本鎖DNAはmRNA
逆転写の直接の反応生成物である。現在知られている一
本鎖DNAに作用し得る制限酵素の数は限られている。酵
素HaeIII,HhaI及びHin（ｆ）Ｉが現在知られている適し
たものである。さらに、酵素MboIIも一本鎖DNAに作用し
得る。さらに研究されて他の制限酵素が一本鎖DNAに作
用し得ることが判明した場合は、そのような酵素も好ま
しい酵素の一端に加えられるであろう。２本鎖cDNAに特
異的なものも適した酵素に加えられる。このような酵素
は、２本鎖cDNAを生成するために付加的な反応を必要と
し、長い配列のロス及び不完全な回収によるその他のロ
スの機会を増加させるので好ましくない。二本鎖cDNAを
使用すると更に、事後の配列分析がより複雑な労力を要
するという技術的不利を招く。これ等の理由から一本鎖
cDNAが好ましいが、２本鎖DNAの使用も可能である。実
際、本発明は当初２本鎖cDNAを用いて実施されたもので
ある。 制限エンドヌクレアーゼ処理のために調製されるcDNA
は、放射活性標識として後の分離段階で検知し得るよう
にしてもよい。好ましい方法は32Pのような放射活性標
識を４つのデオキシヌクレオシドトリフオスフエート前
駆体のうちの１つのα位置に結合するものである。最高
の活性は、放射活性前駆体の濃度が非放射活性形状のも
のの濃度に対して高い時に得られる。しかしどのような
デオキシヌクレオシドトリフオスフエートの全濃度も、
逆転写酵素反応において得られるcDNAの長さを最大にす
るために30μＭよりも大きくなければならない。エフス
トラテイアデイス（Efstratiadis）、A.,、アニアテイ
ス（Maniatis）、T.,カフアトス（Kafatos）、F.C.ジエ
フリー（Jeffrey）、A.及びボーナキス（Vournakis）、
J.N.,セル(Cell) 4,367（1975）を参照されたい。cDNAの
ヌクレオチド配列を決定する目的で、ポリヌクレオチド
キナーゼ酵素により触媒される反応において32Pで５′
末端を標識するのが便利である。マキザム（Maxam）、
A.M.及びギルバート（Gilbert）、W.,ブロク・ナトル・
アカド・スシ(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 74,560（1977）
を参照されたい。 一つの制限酵素あるいは２つの制限酵素の組合せの作
用により生成されたフラグメントは、異なる長さに基い
てポリヌクレオチドを分離できる何等かの方法により、
お互いに及び認識部位を欠く不均一分散配列（heterodi
sperse sequences）から分離し得る。そのような方法と
しては様々な電気泳動法及び超遠心を使用した沈降法が
含まれる。ゲル電気泳動は、ポリヌクレオチド長に基い
て最良の分解能が得られるので好ましい。さらに該方法
では分離物質の定量的回収が容易である。便利な電気泳
動法がデイングマン（Dingman）、C.W.及びピーコツク
（Peacock）、A.C.バイオケミストリー(Biochemistr
y)，7,659（1968）及びマニアテイス（Maniatis）、T.,
ジエフリー（Jeffrey）、A.及びバンドサンド（van de
Sande）、H.,バイオケミストリー、14、3787（1975）に
開示されている。 種々のソースから得られたcDNA転写物の殆んどは、制
限エンドヌクレーゼ処理に先立ち、長さにおいて不均一
分散であることが判明するであろう。適当に選択された
制限エンドヌクレアーゼあるいはエンドヌクレアーゼ対
の作用により、所望の配列を含むポリヌクレオチド鎖が
各制限部位で開裂され、統一長のポリヌクレオチドフラ
グメントを生成する。ゲル電気泳動においてこれ等は異
なるバンドを形成することが観察される。他の配列にお
ける制限部位の有無により、他の分離したバンドが同様
に形成され得るが、それは所望配列のものとは異なる長
さのものであろう。従つて制限エンドヌクレアーゼ作用
の結果により、ゲル電気泳動パターンは１つ以上の分離
したバンドを見せるが、残りのcDNAは不均一分散のまま
になるであろう。所望のcDNA配列が存在する主要なポリ
ヌクレオチドの種から成る場合は、電気泳動パターンは
このcDNAの殆んどが分離バンド中に存在するということ
を示すであろう。 ２つの異なる配列が制限酵素により開裂されて殆んど
同じ長さのフラグメントを生成するということはありそ
うにもないが、規定長のフラグメントの純度検定法は望
ましいものである。電気泳動バンドの配列分析は、バン
ド中の物質の10％以上の不純物の検出には使用できる。
最初の単離方法に適用したのと同じ一般的原理に基い
て、低レベルの不純物を検知する方法が研究されて来
た。該方法においては、所望ヌクレオチド配列フラグメ
ントが最初の単離においては使用されなかった制限エン
ドヌクレアーゼに対する認識部位を含んでいることが必
要である。ゲル電気泳動バンドから溶出されたポリヌク
レオチド材料を所望配列に内的に作用し得る制限エンド
ヌクレアーゼで処理すると、所望配列が殆んどは非等長
の２つのサブフラグメントに開裂される。これ等のサブ
フラグメントは電気泳動においてそれぞれの長さに対応
する位置に別々のバンドを形成し、それ等の合成は開裂
前のポリヌクレオチドの長さに等しいはずである。制限
酵素に対して敏感でない最初のバンド中の不純物は最初
の位置に移動するであろうと考えられる。前記酵素に対
する１つ以上の認識部位を含む不純物は２つ以上のサブ
フラグメントを生成すると考えられる。認識部位の分布
は本質的にランダムであると考えられるので、不純物が
所望配列のフラグメントと同じ大きさのサブフラグメン
トを生成する可能性は極めて低い。放射活性標識ポリヌ
クレオチドバンドに存在する材料の量は、各バンドに存
在する放射活性の量の定量測定、あるいはその他の適当
な方法により測定できる。所望配列のフラグメントの純
度の定量的測定は、所望配列のサブフラグメントを示す
バンド中に存在する材料の量を材料総量と比較して得る
ことができる。 前記の分離、あるいは所望の遺伝子を単離するその他
の方法の後、該配列を再結合し得る。DNAフラグメント
の末端と末端との結合を触媒する酵素DNAリガーゼをこ
の目的に使用し得る。所望配列のサブフラグメントを示
すゲル電気泳動バンドを別々に溶出し、適当な条件下で
のDNAリガーゼを存在させて一緒にする。スガラメラ（S
garamella）、V.,バンデサンデ（Van de Sande）、J.H.
及びコラナ（Khorana）、H.G.,ブロク・ナトル・アカド
・スシ(Proc.Natl,Acad.Sci)、USA 67、1468（1970）
を参照されたい。結合する配列が平滑末端でない場合
は、E.coliより得られたリガーゼが使用し得る（モドリ
ツチ（Modrich）、P.及びレーマン（Lehman）、I.R.,ジ
エイ・バイオル・ケム(J.Biol.Chem.)、245、3626（197
0））。 制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたサブフ
ラグメントからのオリジナル配列再結合の効率は、不適
当な配列の再結合を防ぐ方法を使用することにより非常
に増大する。この望ましくない結果は、制限エンドヌク
レアーゼによる均一（均質）cDNAの開裂の前にcDNA上の
５′−末端リン酸基を除去し得る試薬で所望配列の均一
長cDNAフラグメントを処理しておくことによつて防止で
きる。酵素アルカリフオスフアターゼが好ましい。５′
末端リン酸基は、後の開裂サグフラグメントの再結合に
使用されるDNAリガーゼの結合作用において構造的必要
条件である。従つて、５′−末端リン酸を欠く末端は共
有結合され得ない。DNAサブフラグメントは、単離DNAフ
ラグメントについて成される制限エンドヌクレアーゼに
よる開裂によつて生成される５′−リン酸を含む末端に
おいてのみ結合される。 上述の条件下では、cDNA転写体の大部分は、mRNA鋳型
の５′−末端を含むmRNA領域から同じ鋳型に対して制限
エンドヌクレアーゼ開裂により得られたフラグメントを
特異的なプライマーとすることによつて得られる。この
ようにして、前記の方法は、所望タンパク質に関連する
特異的ヌクレオチド配列のフラグメントだけでなく、当
該タンパク質をコードした全ヌクレオチド配列を得るの
にも使用し得る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチ
ドリンカーであつて、制限エンドヌクレアーゼの認識配
列を有する２本鎖リンカーを単離cDNAの末端に付けて、
後のベクターDNAからの遺伝子部分の酵素的除去を容易
化することができる。シエラー（Scheller）、R.H.等、
サイエンス(Science) 196、177（2977）を参照された
い。ベクターDNAは適当な制限エンドヌクレアーゼによ
る処理により、連続ループから直鎖形状に変換される。
それによつて形成された末端はアルカリフオスフアター
ゼで処理して５′−リン酸末端基を除去し、ベクターDN
AがDNAリガーゼ反応において第１にアポエクオリンDNA
セグメントを取り込むことなしに連続ループを形成しな
いようにする。リンカーオリゴヌクレオチドを伴なうcD
NAと処理済ベクターDNAをDNAリガーゼ酵素と混合し、cD
NAをベクターDNAに結合してcDNAを取り込んでその中に
有する組換ベクターDNAの連続ループを形成する。プラ
スミドベクターを使用する場合、通常該閉鎖ループがバ
クテリアの形質転換を行える唯一の形となる。形質転換
とは、当該分野で理解され本明細書でも使用されている
ように、微生物のそれ自身の遺伝子構造内に細胞外DNA
を取り込む工程を指すものである。閉鎖ループ形状のプ
ラスミドDNAは適当な環境条件下でそのように取り込ま
れる。取り込まれた閉鎖ループプラスミドは形質転換細
胞中で複製を受け、その複製コピーは細胞***が起きる
と子細胞にも伝えられる。その結果、プラスミドを含有
しその遺伝子デターミナントを持つた新規なセルライン
が樹立される。プラスミドの複製によりプラスミド遺伝
子がセルライン中に維持されるようなこの方法における
プラスミドによる形質転換は、形質転換プラスミドDNA
が閉鎖ループ形状であると高い確率で起り、直鎖状のプ
ラスミドDNAを使用すると全く起らないか、あるいはま
れにしか起らない。一担組換えベクターが形成される
と、適当な微生物の形質転換は単純な工程であり、当業
者に理解されるような適当な選択技術を使用してアポエ
クオリン遺伝子を含む新規な微生物株を容易に単離でき
る。 要約すると下記のようにして、Aequoreaクラゲから遺
伝子情報を得、cDNAに変換し、ベクターに挿入し、宿主
微生物の形質転換に使用し、アポエクオリンを発現でき
る。 1.Aequoreaクラゲからポリ（A+）RNAを単離する。 2.in vitroで１本鎖cDNAを合成し、その後逆転写酵素
を使用して２本鎖cDNAを合成する。 3.S1ヌクレアーゼにより１本鎖部分を消化する。 4.ゲル口過で２本鎖cDNAをサイズにより分画化する。 5.ターミナルトランスフエラーゼ及びdCTPを使用してcD
NAをテイリングする。 6.Pst１によりpBR322を消化して、ターミナルトランス
フエラーゼ及びdGTPにより直鎖状DNAをテイリングす
る。 7.dC−テイリングcDNAフラグメントとdG−テイリングpB
R322をアニーリングする。 8.E.coli SK1592を形質転換する。テトラサイクリン耐
性コロニーを選択する。 9.アンピシリン感受性に形質転換されたものをスクリー
ニングする。tetRampSコロニーは組換えプラスミドを含
有する。それ等を−80℃で保存する。 10.オリゴヌクレオチド混合プローブ（既知アミノ酸配
列より演繹した配列を使用）を放射活性で標識する。 11.ニトロセルロースフイルター上でAequorea cDNAバン
クの各構成員を培養する。コロニーを溶解し、DNAをフ
イルターに固定する。 12.32P標識オリゴヌクレオチド混合物をニトロセルロー
スフイルターにハイブリダイゼーシヨンさせる。この32
P−プローブは、エクオリンcDNA配列を含むE.coli組換
え体由来のプラスミドDNAとハイブリダイゼーシヨンす
る。 13.過剰の32P−プローブをフイルターから洗浄する。 14.X線フイルムをフイルターに露出する。 15.Aequorea cDNAバンク中で同定された組換体からプラ
スミドDNAを調製する。 16.32P−標識オリゴヌクレオチドをプラスミドDNA（サ
ザンプロツト）にハイブリダイゼーシヨンさせ、ハイブ
リダイゼーシヨンを確認する。 17.pH7.2のEDTA含有バツフアー中でこれ等の組換体の抽
出物を調製し、組換体にエクオリンDNA配列が含まれて
いることを示す。腔腸動物ルシフエリン及びβ−メルカ
プトエタノールを加え、一夜４℃にインキユベートして
発現アポタンパク質をチヤージする。エクオリンアポタ
ンパク質を発現する試料はCa+2の添加により青色光を発
する。 上記に一連の工程を記載したが、遺伝子工学分野の技
術者の知識と前述したガイドラインを合わせれば所望の
遺伝子の単離及び組換DNAベクターでその使用は容易に
可能であろうし、同じ結果が得られる他の方法も判り、
本発明の組換DNAベクターの調製に使用できるであろ
う。 宿主中で再生成することが判明しているベクターを選
択することによつて形質転換宿主中にアポエクオリン遺
伝子のコピーを多数存在させ、外因的な挿入DNA（例え
ばpUC8、ptac12あるいはpIN−III−ompA1,2又は３）か
ら多量のタンパク質を生成する方法、あるいは公知のそ
の他のペプチド発現増加手段を用いてアポエクオリンの
発現を増加させることができる。 全ての場合においてアポエクオリンは、DNA配列がベ
クターに機能的に挿入された時に発現される。「機能的
に挿入された」とは、当業者にはよく理解されるよう
に、適正な解読枠と配向にあるということを意味する。
典型的にはアポエクオリン遺伝子はブロモーターから下
流に挿入され、その後に停止コドンが位置する。所望に
より後に開裂を伴うハイブリツドタンパク質として生成
してもそうである。 上記したような、本発明の実施による組換DNA分子及
び形質転換単細胞生物の調製に使用できる一般的方法に
加えて、その他の公知の方法及びその変形も本発明を実
施するのに使用できる。特に、遺伝子工学に関する技術
は近年、研究開発が進んでいる。多くの最近の米国特許
に、本発明の実施に使用できるプラスミド、遺伝子操作
を受けた微生物及び遺伝子操作の方法が開示されてい
る。例えば米国特許第4,273,875号はプラスミドとその
単離方法を開示している。米国特許第4,304,863号は遺
伝子工学によるバクテリアの生産方法を開示しており、
それによるとハイブリツドプラスミドを構築し、バクテ
リア宿主の形質転換に使用している。米国特許第4,419,
450号は組換DNA研究においてクローン化担体として有用
なプラスミドを開示している。米国特許第4,362,867号
は、クローン化工程に有用な組換cDNA構築方法及びそれ
によつて生成されたハイブリツドヌクレオチドを開示し
ている。米国特許第4,403,036号は、多数のDNAセグメン
トコピーを含むプラスミドを生成するための遺伝子物質
を開示している。米国特許第4,363,877号は組換DNAトラ
ンスフアーベクターを開示している。米国特許第4,356,
270号は組換DNAクローン化担体を開示しており、また遺
伝子工学で使用される多くの用語及びそこで使用される
基本的方法を定義しているので、遺伝子工学分野におい
て限られた経験しか持たない者にとつて特に有用な文献
である。米国特許第4,336,336号は融合遺伝子及びその
製法を開示している。米国特許第4,349,629号はプラス
ミドベクター及びその製造と使用を開示している。米国
特許第4,332,901号は組換DNAに有用なクローン化ベクタ
ーを開示している。これ等の特許のうちいくつかのもの
は本発明の範囲外の特定の遺伝子産物についてのもので
あるが、そこに記載された方法は、遺伝子工学の技術者
であれば本明細書に記載された本発明を実施するのに容
易に改変し得るものである。 これ等の特許及び本明細書で引用したその他の全ての
特許及び刊行物は、本発明の属する分野の技術者の技術
レベルを示すものであり、全て本明細書中にリフアラン
スとして含める。 本発明の内容は、エクオリンを螢光免疫測定の研究あ
るいはその他のエクオリンを標識として使用するアツセ
イにおいて、アポエクオリンを制限を受けることなく使
用できるようになるという点において有意義なものであ
る。生物発光アツセイにおけるアポエクオリンの使用方
法は、同一出願人が1983年10月13日に出願した出願番号
541,405号に開示されており、本明細書にリフアレンス
として含める。単離されたアポエクオリンcDNAを他の発
現ベクターに移入することにより、E.coli中のアポエク
オリンポリペプチドの発現を改善し、あるいは他の宿主
中のアポエクオリンの発現を可能にする構築物が生成す
る。さらに、アポエクオリンcDNAあるいはそのフラグメ
ントをハイブリダイゼーシヨンプローブとして使用する
ことによつて、他の生物発光腔腸動物及び例えばイカ
（軟体動物門）、魚（魚上網）及び甲殻網のその他の生
物に見られる構造的に関連する遺伝子を容易にクローン
化できる。これ等の遺伝子の中には、ウミシイタケ（Re
nilla）、スチラチユーラ（Stylatula）、ブチロサルカ
ス（Ptilosarcus）、ウミサボテン（Cavernularia）及
びアカントプチラム（Acanthoptilum）のルシフエラー
ゼをコードするもの、更にヒドロ虫類のオベリア（Obel
ia）及び有櫛動物のムネミオプシス（Mnemiopsis）及び
ウリクラゲ（Beroe）に見られる発光タンパク質をコー
ドするものが含まれる。 本明細書に記載した原理に基いたオリゴヌクレオチド
プローブ及び変形ヌクレオチド配列を使用して、発光タ
ンパク質を発現する上記の動物及び関連する生物から遺
伝子を単離することが特に期待される。そのようなプロ
ーブは完全な配列よりもかなり短くてもよいが、全長に
おいて少くとも10のヌクレオチドが必要であり、少くと
も14のヌクレオチドを有することが好ましい。それより
長く、遺伝子の全長までのオリゴヌクレオチドもまた有
用なものである。RNAプローブ及びDNAプローブとも使用
できる。 使用においては、該プローブを検知可能なように標識
し（例えば32P、3H、ビオチンあるいはアピジンによ
る）、所望遺伝子を有する生物から得た一本鎖DNAある
いはRNAとインキユベートする。１本鎖及び２本鎖の
（ハイブリダイゼーシヨンした）DNA（あるいはDNA/RN
A）を分離（典型的にはニトロセルロースペーパーを使
用して）した後、標識によりハイブリダイゼーシヨンを
検知する。オリゴヌクレオチドと共に使用するのに適し
たハイブリダイゼーシヨン技術は公知のものである。 プローブは通常、容易に同定できるようにする検知可
能な標識とともに用いられるが、非標識のオリゴヌクレ
オチドも有用なものであり、標識プローブの前駆体とし
ても、２本鎖DNA（あるいはDNA/RNA）の直接検知を行な
う方法における使用にも有用である。従つて、「オリゴ
ヌクレオチドプローブ」という用語は、標識及び非標識
両方の形状のものを指すものである。本明細書に記載し
たペプチド配列の40から110のアミノ酸をコードする領
域から得られたオリゴヌクレオチドが特に好ましく、そ
れはそれ等がルシフエリンとの結合に関与するアミノ酸
であるからである。 腔腸動物ルシフエリンは、表５に挙げた全ての生物中
に見られ、これらから得た発光タンパク質に結合する。
本明細書中に記載したオリゴヌクレオチドはこれ等の種
から得た発光タンパク質遺伝子の単離におけるプローブ
として有用であると考えられるものである。 これまで総括的に記述してきた本発明は、以下の実施
例を参照しながらより容易に理解されるであろう。これ
らの実施例は単に詳細な説明を意図するのみであつて、
特に記載のない限り本発明を限定するものではない。 実施例1:天然エクオリンの精製 第２のゲル過段階にセフアデツクスＧ−75（スーパ
ーフアイン）を用いること以外はブリンクス（Blinks）
等の方法〔ブリンクス・ジエイ・アール（Blinks,J.
R.），ピー・エイチ・マツテイングリー（P.H.Mattingl
y），ビー・アール・ジエウエル（B.R.Jewell），エム
・フアン・ルーヴエン（M.van Leeuwen），ジー・シー
・ハーレア（G.C.Harrer）及びデー・ジー・アレン（D.
G.Allen），メツド・エンザイモロジー（Methods Enzym
ol.）,57巻,292−328頁（1978年）〕に従つてエクオリ
ンを精製した。エクオリンの精製は以下の手順で行つ
た。 1.フライデイ湾（Friday Harbor），ワシントンでエク
オレア（Aequorea）を収集し口周組織（光細胞;photocy
tes）を採取する。 2.EDTA中の低張溶解によつて光細胞からタンパク質を抽
出する。 3.光細胞抽出物を硫酸アンモニウム分画（０−75％）す
る。 4.(NH4)2SO4による沈殿物を遠心分離して−70℃に保存
したまま、フライデイ湾，ワシントンより船で運ぶ。 5.セフアデツクスＧ−50（フアイン）を使つてゲル過
を行なう。 6.QAEセフアデツクスを使つてpH−ステツプ及び塩勾配
溶出によるイオン交換を行なう。 7.セフアデツクスＧ−75（スーパーフアイン）を使つて
ゲル過を行なう。 8.DEAE−セフアデツクスを使つて、pH−ステツプ及び塩
勾配溶出によりイオン交換を行なう。 9.純粋なエクオリンを凍結乾燥（EDTA中）し−80℃で保
存する。 上記１−４段階ではフライデイ湾上にて行なつた。収
集と口周組織の採取以外の全ての段階は０°−４℃で行
なわれた。段階４からの最終生成物は遠心ボトル（250m
l）に入れてドライアイス中で保存した。該物質はこの
ような形で船で運ばれた。 エクオリン及び緑螢光タンパク質（green fluorescen
t protein,GFP）の精製（第５−９段階）はジヨージア
のアテンス（Athens）で行なつた。全段階は０−４℃で
実施された。エクオリン含有画分は各段階の間−80℃で
保存された。タンパク質濃度にかかわらず、エクオリン
は凍結融解に対して安定であるようである。 第５段階 セフアデツクスＧ−50（フアイン）によるゲ
ル過。 カラム寸法:5.8cm×97cm;2563ml。 このカラムに10mM EDTA,pH5.5（EDTA溶液を調製するの
に２ナトリウム塩を用いた）溶液を75ml/時の流速で流
した。GFP及びエクオリンはこのカラムで一緒に溶出さ
れた。次段階用にエクオリン活性の65−75％がプールさ
れた。この画分の前後の画分（side fractions）もプー
ルし後段の精製のために保存された。この段階でのエク
オリンの収率は50−80％の範囲に亘り、通常65−75％の
収率が得られた。このカラムの能力は約1000mg（ブラド
フオード:Brad ford）/75mlであり、可能である限り一
般にそれよりも少ない量をカラムにかけた。 第６段階 QAEセフアデツクスによるイオン交換。 カラム寸法：直径5cm。15gの乾燥セフアデツクスをこの
段階に用いた。カラムのベツド体積はイオン強度及び緩
衝液組成によつてクロマトグラフイの間で変化した。 一般に、Ｇ−50の最初の６−10ステツプからプールし
たものをこのカラムに流した。この操作によつて全収量
が増え、効率的であつた。この段階はブリンクス等の方
法（1978年）と全く同様に実施された。カラムにかけた
後、GFPはpH−ステツプ（5mM NaAc,5mM EDTA,pH4.75）
によつて選択的に溶出された。エクオリンは次に、10mM
EDTA,pH5.5でNaClの直線勾配によつて溶出された（全
量500ml）。GFPはTris中10mMにしpHを8.0まで上げて−8
0℃にて次の精製まで保存された。エクオリンプールは
限外過（アミコンYM−10膜）で濃縮して次段階に用い
る調製物とした。エクオリン収率は80％であつた。 第７段階 セフアデツクスＧ−75（super fine）による
ゲル過。 カラム寸法:2.8cm×150cm;924ml。 カラムに10mM EDTA,pH5.5の溶液を10ml/時で流した。エ
クオリン収率は60−80％であつた。 第８段階 DEAE−セフアデツクスによるイオン交換。 第７段階でのプールエクオリンをこのカラムに直接か
け、QAEセフアデツクスカラムと全く同様に溶出を行な
つた。エクオリン収率は一般に75−80％であつた。この
段階は殆んどのエクオリン調製の際には必要のないもの
である。第７段階からのエクオリンは通常純粋なもので
ある（12％アクリルアミドSDS−PAGEによる）。 第９段階 EDTA存在下でエクオリンを95％より大きい回
収率で凍結乾燥した。EDTAが存在しないと回収率は０か
ら95％まで様々であつた（プリンクス等、1978年参
照）。 実施例2:エクオリンの配列決定に用いられる配列決定方
法 アミノ酸配列分析は自動エドマン分解（エドマン（Ed
man）及びベツグ（Begg）,1967年）を用いて実施され
た。比較的多量のタンパク質又はペプチド（10nmol以
上）の配列分析はモデル890Bベツクマンシークエンサー
（デユーク大学、ボーン（Bhown）等の記載（1980年）
のように最新のもの）及びポリブレン（polybrene）を
用いた0.55Mクアドロール（Quadrol）プログラム（ター
ル（Tarr）等、1978年）を採用して実施した。M3及びM5
という２つのペプチドは小さいか又はクアドロール法で
はカツプから洗浄されてしまうので、クラパー（Klappe
r）等（1978年）によつて提案されたジメチルアリルア
ミン緩衝液及びポリブレン用に適合させたプログラムを
使つて配列決定を行つた。アミノ酸のフエニルチオヒダ
ントイン（PTH−）誘導体は、ハンカピラー（Hunkapill
er）及びフツド（Hood）によつて記載された方法（1978
年）に主に従つて、デユポン・ゾルベイ（DuPont Zorba
y）ODSカラムを用いて逆相HPLCクロマトグラフイにより
同定された。２−10nmol程度の量で利用できるペプチド
は、0.1Mクアドロール（ブラウアー（Brauer）等、1975
年）及びポリブレン用のプログラムを使つてモデル890C
ベツクマンシークエンサー（ワシントン大学）によつて
配列決定された。PTH−アミノ酸はエリクソン（Ericsso
n）等によつて記載された（1977年）逆相HPLCシステム
を用いて同定された。1.5nmolより少ない量のペプチド
を使う場合には、応用バイオシステムモデル470A気相シ
ークエンサー（ワシントン大学，ハンカピラー等,1983
年）を用いて配列分析を行つた。気相装置からのPTHア
ミノ酸はハンカピラー及びフツドの記載（1983年）に従
つてIBMシアノカラムを用いて同定された。 参考文献 エドマン・ピー及びベツグ・ジー ヨーロピアン・ジ
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ローニング及びその発現。 材料及び方法 制限酵素はベセスダ・リサーチ・研究所（Bethesda R
esearch Laboratories），ニユーイングランドバイオラ
が（New England Bio Labs）及びインターナシヨナル・
バイオテクノロジー会社（International Biotechnolog
ies,Inc.）から購入し、それぞれに記載された条件に従
つて使用した。RNアーゼ（RNasin）及び逆転写酵素はそ
れぞれバイオテク（Biotech）及びライフ・サイエンス
（Life Sciences）から得た。末端転移酵素（ターミナ
ルトランスフエラーゼ）はPLバイオケミカルから購入し
た。腔腸動物門のルシフエリンは従来技術の記載に従つ
て合成し、必要な時まで凍結乾燥粉末で保存した：ホリ
・ケー（Hori,K.），アンデルセン・ジエイ・エム（And
ersen,J.M.），ワード・ダヴリユー・ダヴリユー（War
d,W.W.）及びコルミアー・エム・ジエイ（Cormier,M.
J.），バイオケミストリー,14巻,2371−2376頁（1975
年）；ホリ・ケー（Hori,K.），カルボネアウ・エイチ
（Charbonneau,H.），ハート・アール・シー（Hart,R.
C.）及びコルミアー・エム・ジエイ，プロス・ナトル・
アカド・サイ（Proc.Nat′l. Acad.Sci.），米国,74
巻,4285−4287頁（1977年）；イノウエ・エス（Inouye,
S.），スギウラ・エイチ（Sugiura,H.），カコイ・エイ
チ（Kakoi,H.），ハシズマ・ケー（Hasizuma,K.），ゴ
トウ・テー（Goto,T.）及びイイオ・エイチ（Iio,
H.），ケミ・レター（Chem.Lett.）,141−144頁（1975
年）。 RNA単離及びイン・ヴイトロに於ける翻訳 エクオレア・ヴイクトリア（Aequorea victoria）ク
ラゲがワシントン大学海洋生物研究所にて、ワシントン
のフライデイ湾に於いて収集された。クラゲの周囲から
口周リング（circumoral ring）を切り取り、直ちにド
ライアイス／メタノール浴中で凍結させた。この組織を
−70℃にて所望の時まで保存した。 キム（Kim）等の方法〔キム・ワイ・ジエイ・シユー
マン・ジエイ（Snuman,J.），セツテ・ケー（Sette,
K.）及びプルツイピラ・エー（Przybyla,A.），細胞生
物誌（J.Cell.Biol.）,96巻,393−400頁（1983年）〕に
従つてRNAを単離し、ポリ（Ａ）＋RNAを前記方法〔アビ
ブ・エイチ（Aviv,H.）及びレーダー・ピー（Leder,
P.），PNAS69,1408−1412頁（1972年）〕を用いて調製
した。 ポリ（Ａ＋）RNA（１μｇ）及びポリ（Ａ−）RNA（20
μｇ）はラビツト網状赤血球イン・ヴイトロ翻訳システ
ムを用いて翻訳された〔ペルハム・エイチ・アール・ビ
ー（Pelham,H.R.B）及びジヤクソン・アール・ジエ（Ja
ckson,R.J.），ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケミ
ストリー（Eur.J.Biochem．）,247巻（1976年）；メリ
ツク・ダヴリユー・シー（Merrick,W.C.），メソド・イ
ン・エンザイム（Methods in Enz.）,101（Ｃ）,606−6
15頁（1983年）参照〕。溶解物からミクロコツカスヌク
レアーゼを用いて内因性mRNAを除去した。各翻訳試料
（総量62μｌ）を35S−メチオニン（38μCi）存在下に9
0分間25℃に保持した。電気泳動分析用に各翻訳試料か
ら２μｌを取った。抗エクオリン（２μｌ）及びスタフ
アウレウス（Staphaureus）細胞を50μｌの各翻訳混合
物中に加えてアポエクオリンを免疫沈降させた。数回洗
浄後に抗体−アポエクオリン複合体をSDS存在下で加熱
して解離させた。この翻訳生成物をSDSポリアクリルア
ミド（13％）ゲルで分析した。電気泳動に次いで、ゲル
をクマシー（Coomassie）Ｒ−250で染色しタンパク質の
標準物を同定し、その後該ゲルにDMSO中のPPOを含浸さ
せた。−70℃でフルオログラフイを行なつた。 DNA組換え操作 二本鎖cDNAを全エクオレア（Aequorea）ポリ（Ａ＋）
RNAからウイケンス（Wickens）等の記載〔ウイケンス・
エム・ピー（Wickens,M.P.），ブエル・ジー・エヌ（Bu
ell,G.N.）及びシムケ・アール・テイー（Schimke,R.
T.），生物化学誌（J.Biel,Chem.）,253,2483−2495頁
（1978年）〕のように合成した。ホモポリマーのdCテー
ルを付加した後、二本鎖cDNAをdG−テールを付加された
Pst I切断pBR322〔ヴイラ・コマロフ・エル（Villa−Ko
maroff,L.），エフストラデイアデイス・エー（Efstrad
iadis,A.），ブルーム・エス（Broome,S.），ロメジコ
・ピー（Lomedico,P.），チザード・アール（Tizard,
R.），ナーベル・エス・ピー（Naber,S.P.），チツク・
ダヴリユー・エル（Chick,W.L.）及びギルバート（Gilb
ert），PNAS,75巻,3727−3731頁（1978年）〕とアニー
リングし，大腸菌（E.coli）SK1592株を形質転換するの
に用いた。テトラサイクリン耐性・アンピシリン感受性
コロニーを移し取りマイクロタイターデイシシユ内で−
70℃にて凍結させた。 エクオレア（Aequorea）cDNAライブラリーを合成オリ
ゴヌクレオチド混合物を使つてスクリーニングにかけエ
クオリンcDNAを捜した。このオリゴヌクレオチド混合物
はコロンビア大学のチヤールズ・カントー（Charles Ca
ntor）及びカルロス・アルガラナ（Carlos Argarana）
から提供された。ポリアクリルアミド電気泳動〔マニア
テイス・テイー（Maniatis,T.）及びエフストラテイデ
イス・エー（Efstratidis,A.），メソ・イン・エンザイ
ム（Meth.in Enz.）,65巻,299−305頁（1980年）〕によ
つてそれら精製した後、17コより成る前記オリゴヌクレ
オチド（17マー）をポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−
32P−ATPを用いて放射活性標識した〔マキシマム・エー
・エム（Maxam,A.M.）及びギルバート・ダヴリユー（Gi
lbert,W.），メソ・イン・エンザイム,65巻,499−559頁
（1980年）〕。取り込まれなかつた32PはDEAEセルロー
スイオン交換クロマトグラフイによつて除去された。 エクオレア（Aequorea）cDNAバンクは次下のようにス
クリーニングされた： 大腸菌（E.coli）組換え体を凍結培養物からルリア寒
天プレート上のニトロセルロースフイルター（７×11c
m）に移行した。これらのコロニーを37℃にて12時間培
養した後溶解し、そしてワツトマン541紙用の記載に従
ってそのDNAを固定した〔タウブ・エフ（Taub,F.）及び
トンプソン・イー・ビー（Thompson,E.B.），アナル・
バイオケミ（Anal,Biochem.）,126巻,222−230頁（1982
年）〕参照〕。このフイルターを空気乾燥後に真空下２
時間ベーキングした。 このフイルターをまず初めに１×SSC中で湿らせた
後、フイルター１枚当り3mlのプレハイブリダイゼーシ
ヨン溶液（10×NET,0.1％SDS,3×デンハルト（Denhard
t）中で55℃,12−20時間保持した。この溶液をハイブリ
ダイゼーシヨンバツグから注ぎ出し、フイルター１枚り
1mlのハイブリダイゼーシヨン溶液（10×NET,0.1％SDS,
3×デンハルト,1×106cpmの32P標識17マー／フイルタ
ー）を代りに注入した。37℃にて24時間ハイブリダイゼ
ーシヨンを行ない、その後４℃の10×SSC中で10分間か
けて４回洗浄した。フイルターを空気乾燥した後プラス
チツクラツプに包んだ。デユポン・クロネツクス増感板
を使いコダツクXAR−５フイルムを−70℃にてこのフイ
ルターに露出した。 大腸菌（E.coli）の増殖及び抽出操作 pAEQ1−pAEQ6を含む大腸菌SK1592をルリア流体培養基
25ml中で37℃にて一晩増殖させた。この細胞を遠心分離
した後、10％シヨ糖,50mMトリスpH8溶液5mlに再懸濁し
た。この溶液に、0.1Mフエニルメチルスルホニルフロラ
イドを7.2μl,0.2M EDTAを312μl,10mgのリゾチーム及
び10mg/mlのRNaseAを10μｌ加えて細胞を溶解した。氷
中で45分間保持した後、この混合物を43,500×ｇで１時
間遠心分離にかけ、この上清を貯えた。 エクオリンの精製及びアツセイ ブリンクス等の方法〔ブリンクス・ジエイ・アール
（Blinks,J.R.），ウイア・ダヴリユー・ジー（Wier,W.
G.），ヘス・ピー（Hess,P.）及びプレダーガスト・エ
フ・ジー（Predergast,F.G.），プログ・バイロフイズ
・モレキユラー・バイオロ（Prog・Biophys・Molec・Bio
l）,40巻,1−114頁（1982年）〕に従つて、エクオリン
を抽出・精製した。エクオリンすなわち光タンパク質
（photoprotein）活性は、５μｌの試料を0.1M CaCl2,
0.1Mトリス,pH8.0溶液0.5mlに注入すると同時にピーク
光強度（peak light intensity）及び全光子数を測定す
ることで求めた。この測定用の測光計の設計及び光子収
量の絶対量に対する装置の標準化については、以前に記
載されたものを参照されたい〔アンデルソン・ジエイ・
エム（Anderson,J.M.），フアイニ・ジー・ジエイ（Fai
ni,G.J.）及びワアンプラー・ジエイ・イー・（Wample
r,J.E.），メソド・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enz.）,57巻,529−559頁（1978年）；カルボネアウ
・エイチ（Charbonneau,H.）及びユルミエル・エム・ジ
エイ（Cormier,M.J.），ジエイ・バイオロ・ケム（J.Bi
ol.chem.）,254頁,769−780頁（1979年）〕。 pAEQ1抽出物からのアポエクオリン活性の部分精製 発現されたアポエクオリンは、pAEQ1抽出物23mlを1mM
EDTA,1.5mMトリス,pH7.5溶液で平衡化されたワツトマ
ンDE−22カラム（42mlベツト体積）に通すことによつて
部分精製された。800mlのNaCl勾配（０−1M）を通す
と、アポエクオリン活性は0.3M NaClのところに溶出し
てきた。ピークの分画を回収し、0.5M KCl,10mM EDTA
及び15mMトリス,pH7.5溶液に対して透析した。これを第
３図に記載の実験に供した。 結果及び考察 インヴイトロに於けるエクオレアポリ（Ａ＋）RNAの翻
訳 凍結したクラゲの組織1gから約1.6μｇのポリ（Ａ
＋）RNAを単離した。イン・ヴイトロに於けるエクオレ
アポリ（Ａ＋）RNAの翻訳に関する結果は第１図に示
す。抗エクオリンと反応した翻訳生成物はレーン４で示
されている。免疫沈降した35Sのカウントは翻訳された
ものの全酸沈殿物のカウントの0.3％であり、これはア
ポエクオリンmRNAが全ポリ（Ａ＋）mRNA集団の約0.3％
であることを示している。このようにアポエクオリンmR
NAが比較的多いということは、エクオレアの口周リング
粗抽出物中のエクオリンに相答する全タンパク質の割合
（0.5％）と良く一致するものである。エクオレアRNA
（レーン２）の非存在下、又はエクオレアポリ（Ａ−）
RNAの存在下（データは記載していない）でイン・ヴイ
トロの翻訳を行うと、免疫沈降するタンパク質はできな
かつた。 抗エクオリンで免疫沈降する翻訳一次産物（primary
translation product）はSDS−PAGEゲルに於いて明らか
に23,400ダルトンの分子量を示すように動き（レーン
４）、これはエクオレアから単離した天然エクオリンの
分子量（22,800ダルトン，第１図参照）よりも僅かに大
きいものである。このデータ及び第４図に示したデータ
は、初期翻訳生成物には約７つのアミノ酸のプレ配列
（prepresence）の存在があることと一致するものであ
る。 ポリ（Ａ＋）RNA翻訳からの免疫沈降タンパク質は、
元のオートラジオグラムを見てみると、二重線或いはさ
らに三重線（レーン4,第１図）で動いていたことが判
る。この結果は二通りに解釈し得るものである。第１番
目に、エクオレア、ヴイクトリアには多数のアポエクオ
リン遺伝子が存在し得、それぞれのプレタンパク質の分
子量が、それらのプレ配列の長さが多様であるが故に異
つているということである。エクオリンアイソザイム
〔ブリンクス・ジエイ・アール（Blinks,J.R.）及びハ
レア・ジー・シー（Harrer,G.C.），フエド・プロス（F
ed.Proc.）,34巻,474頁（1975年）〕の存在はこうした
多重遺伝子族（multi−gene family）を示しているかも
知れない。第二番目に、フライデイ湾のエクオレア・ヴ
イクトリア集団がエクオレアの複数種から成り立つてい
るかも知れないということである。 エクオリンcDNAs同定 使用されたエクオレアcDNAライブラリーは450bpより
大きい挿入部分を持つ6000の組換え体を含んでいた。ス
クリーニングに付された25の任意の該組換え体のうちの
どれも500bp以下の挿入部分は持つておらず、そのうち
の２つは3Kbpよりも大きかつた。 エクオレアcDNAバンクは次の混合合成オリゴヌクレオ
チドプローブを用いてスクリーニングにかけられた。 上記オリゴヌクレオチドのDNA配列はアポエクオリン
の全アミノ酸配列の研究によつて求められた。このオリ
ゴヌクレオチドはエクオリンポリペプチドのカルボキシ
末端領域に於いてTrp173・Tyr・Thr・Met・Asp・Pro178
のペプチドをコードしているmRNAと相補的なものであ
る。上記の17マー（17−mers）は、方法の欄で記述した
様に32Pで標識されエクオレアcDNAライブラリーからの
プラスミドDNAとハイブリツドを形成した。 ６つの形質転換体が上記合成オリゴヌクレオチドとハ
イブリツドを形成する挿入部分を持つたプラスミドを含
有しているものと同定された。最大のPst I挿入部を含
むプラスミド、pAEQ1の制限地図を第２図に示す。pAEQ1
をBamHIで消化すると該合成オリゴヌクレオチドとのハ
イブリツドは形成されないであろう。前記の17マーDNA
配列の研究によると、このハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブはBamHI認識配列（GGATCC）を含んでいるものであ
る。従つて、pAEQ1中のBamHI部位はアポエクオリンをコ
ードしている配列の３′領域を同定するのに用いること
が出来よう。以下に示すように、組換えプラスミドpAEQ
1は、大腸菌（E.coli）に於けるその発現から示される
ように、アポエクオリンcDNAを実際に含んでいるもので
ある。 大腸菌に於けるアポエクオリンの発現 前記の６つの形質転換体のうちのどれが生物学的に活
性なアポエクオリンを発現しているかどうかを見つけ出
す為に、それらの抽出物、及び同様に親株（host strai
n）の抽出物を方法のところで記述した様に調製した。
それぞれの抽出物0.5mlにβ−メルカプトエタノール（2
mM）及び腔腸動物門のルシフエリン（0.1mM）を添加
し、この混合物を４℃にて20時間保持した。その後、該
混合物のCa2+依存光タンパク質活性について方法に記載
したようにして測定した。組換え体pAEQ1から調製した
抽出物についてはCa2+依存ルミネツセンスが観察された
が、親株又は他のいずれの形質転換体からの抽出物につ
いてはこのようなルミネツセンスは観察されなかつた。
pAEQ1−６の挿入部分がクロスハイブリツドを形成する
ということは、それらが相同なDNA配列を含んでいると
いうことを示唆するものである。しかしながら、もしも
pAEQ2〜６のcDNA挿入部分の長さが充分でなかつたり、
プラスミド中で適切に配向していなかつたりすると、そ
れら抽出物中のアポエクオリン活性は期待出来ないもの
であろう。 pAEQ1抽出物の光タンパク質活性発現の速度論は天然
の混合アポエクオリンのそれと類似している（第３図参
照）。この抽出物に於いて光タンパク質活性が発現する
為に必要とされる条件も真正の（authentic）アポエク
オリンを用いた場合に観察されるものと同一である。第
３図に示すように、溶存O2が必要とされる。更に、β−
メルカプトエタノール又は腔腸動物門のルシフエリンの
いずれかが反応混合物中に存在しなくなると、Ca2+依存
光タンパク質活性が全く発現されなくなる。Ca2+を含ま
ない緩衝液中に活性成分を注入してもルミネツセンスは
発さられなかつた。Ca2+を後で添加するとルミネツセン
スの閃光（flash）が見られた。 pAEQ1含有形質転換体の抽出物中の活性成分を更に詳
しく調べる為に、この組換えプラスミドを含有する形質
転換体抽出物を、方法のところで記載したようにDE−22
を用いたクロマトグラフイにかけた。アポエクオリン活
性は約0.3M塩のところで溶出され、これは真正のアポエ
クオリンの場合に類似している。この活性画分を腔腸動
物門のルシフエリン，β−メルカプトエタノール及び酸
素の存在下でインキユベートし、光タンパク質活性を発
生させた（第３図参照）。次いで、この混合物をゲル
過にかけた。第４図に示すように、pAEQ1抽出物中の部
分精製成分から生じた光タンパク質活性はMr＝20,600の
ところに溶出し、一方天然エクオリンは19,600のところ
であつた。同様の結果はイン・ヴイトロの翻訳実験中に
も観察された（第１図）。第４図のデータから、使用し
た条件下に於いて、ルシフエリンはpAEQ1抽出物中の活
性成分と強固に会合するという結論が得られるであろ
う。 第４図からの回収（プール）光タンパク質画分はCa2+
の添加によつてルミネツセンスの閃光を発する。この閃
光の速度論はCa2+依存エクオリン反応のそれと区別がで
きないものであつた。他の組換えプラスミドは形質転換
体中で光放出タンパク質（light−emitting protein）
を発現しなかつた（第６表参照）。 上記のデータは、pAEQ1中に挿入されたcDNA部分はア
ポエクオリンをコードしている全長cDNAを表わしている
ことを示している。更にこのデータは、該cDNAがpAEQ1
中で発現されており、そのタンパク質生産物の生物学的
活性は天然の混合アポエクオリンのそれと区別され得な
いことを示している。発現レベルは全可溶性タンパク質
の約0.01％であると推定された。 各抽出物0.5mlにメルカプトエタノール（2mM）及び腔
腸動物門のルシフエリン（0.015mM）を加えた。この混
合物を４℃で20時間インキユベートした。試料５μｌを
取り出し0.1mM Ca2+0.5mlに注入して、ピーク光強度を
測定した。 実施例4:誘導lacプロモーターを用いた大腸菌（E.col
i）内でのアポエクオリン発現の増大 pAEQ1を含む大腸菌に於けるアポエクオリンの発現は
比較的低レベルである。この発現レベルを増大させる為
に、アポエクオリン遺伝子の転写が誘導性（inducibl
e）lacプロモーターに対する相対位置によつて増加する
ように、pAEQ1からのアポエクオリン遺伝子をもう１つ
のプラスミド（pUC9）内でサブクローン化させた。 pAEQ1からのPst I断片（0.75kb）を単離し、pUC9の単
一Pst I部位にクローン化させた。２つの異なるプラス
ミド,pAEQ7及びpAEQ8を得た。プラスミドpAEQ8は第２図
（ｂ）で示すように、所望の配向で挿入されたPst I断
片を含んでいた。プラスミドpAEQ7には反対方向の配向
で該断片が挿入されていた。 pAEQ7及びpAEQ8を含有している大腸菌株（親；ホス
ト;JM105）を各々37℃にてアンピシリン（50μg/ml）含
有のルリア流体培養基20ml中で増殖させた。OD550が0.6
に達した時に、培養物を100mM保存溶液中で1mMにした。
5mlの試料を取り出し、一方残りの培養物は振とうされ
続けた。１時間及び２時間後にも同様に試料の一部を取
り出した。それぞれ試料の一部を採取した直後に、細胞
を遠心分離し−20℃で必要になる時まで保存した。 ６つの採取試料抽出物のアポエクオリン活性を測定し
た。大腸菌細胞をまず最初に50mMトリス,pH8,10％シヨ
糖,25μg/mlリゾチーム及び20μg/ml RNaseA溶液1mlに
再懸濁して溶解した。氷中45分間保持後に、この混合物
を43,500×ｇで１時間遠心分離した。上清を採取保存し
た。上清（抽出物）を次いで腔腸動物門のルシフエリン
及びメルカプトエタノール（250μｌ抽出物,5％メルカ
プトエタノール水溶液３μｌ及び腔腸動物門ルシフエリ
ン３μｌ）の存在下で一晩インキユベートした。このイ
ンキユベーシヨン試料５μｌを0.1M CaCl2,0.1Mトリス,
pH8.0溶液0.5mlに注入し、同時に最高（ピーク）光強度
及び全光子数を測定して、混合物中のエクオリン活性を
求めた。タンパク質はブラツドフオード（Bradford）ア
ツセイ（Bio Rad）を用いて測定した。 第７表には、pAEQ7及びpAEQ8含有株の６つの抽出物，
コントロール大腸菌株（SK1592）及びpAEQ1含有株の抽
出物から得られた結果が記されている。 これら抽出物中のエクオリン活性レベルはルシフエリ
ンによる充電効率（charging efficiency）に依存して
いる。粗抽出物に於ける充電効率を定量化することは不
可能である。エクオレアから単離したアポエクオリンを
用いた場合に観察される充電効率は20％以下であり、大
腸菌抽出物中ではこの効率は多分幾らかそれより低いも
のであろう。従つて、充電効率１％及び20％を基に計算
した値を求めた。 pAEQ8からの発現は、pAEQ1のそれと較べて誘導後２時
間に於いて著しく高いものである（600倍）。エクオリ
ン遺伝子をpAEQ8と反対方向の配向で含んでいるpAEQ7か
らはエクオリン遺伝子の誘導が観察されなかつた。 このデータは、cDNAヌクレオチド配列が誘導プロモー
ターの３′に適切に位置していれば、アポエクオリンの
発現レベルは顕著に増大し得るということを示している
ものである。 実施例5:特定のアポエクオリン遺伝子の構造決定 第２図に示した、プラスミドpAEQ1,pAEQ7およびpAEQ8
の中に存在するPst I−Pst I断片の構造を標準的遺伝子
配列解析法によつて決定した。３′末端から69個のヌク
レオチドは翻訳されない。翻訳領域が発現されると、実
施例１に記載した方法で単離したタンパク質（アポエク
オリン）のＮ末端に７個のアミノ酸残基が付いたタンパ
ク質が発現される。この実施例１で得られたタンパク質
のＮ末端はVALで始まる。この余分の７個のアミノ酸残
基は実施例１の単離工程の間にプロテアーゼによつて切
りとられるのであろう。PROをコードしているＣ−末端
コドンの次には停止コドンがあり、その後12個のヌクレ
オチドが続いている。これは明らかに単離されたcDNAが
完全長（full−length）であることを示している。全二
本鎖DNAとアミノ酸配列は次のとおりである。 この同定された配列が示していることは、この配列の
中では微不均一性のいろいろな位置に主要アミノ酸（pr
incipal amino acid）と少数アミノ酸（minor amino ac
id）の双方が含まれているので、表３に示した変異形か
らどのアミノ酸配列を選択しても活性なアポエクオリン
が得られるということである。 したがつて、同じようにして様々なペプチドをコード
している種々の遺伝子が生物学的に活性な分子を表わす
ことが示される。 本明細書中に開示した一般的な配列が表わされ、多少
の変異を示す（したがつてアポエクオリンの生物活性を
有する）他のペプチド,DNA分子，ベクター等に関して前
述した議論は、本実施例に開示した特定の配列にも等し
く適用できる。本実施例では特に１つのペプチド、これ
をコードしているDNA配列、および２個の制限部位の間
の完全長DNA配列を開示した。コードDNA配列（任意に末
端停止コドンを含んでいてもよい）は、完全長のDNA配
列とは別の実体として明らかにされ、その変異形も含め
て全長DNA配列とは切り離して考えられる。二本鎖DNAと
して開示されたいずれのDNAも、この二本鎖DNAを形成す
る個個の１本鎖DNAおよび転写によつて得られるこれに
相当するRNAを開示しているものと考えられる。 上記実施例のベクターと宿主は本発明の好ましい態様
のいくつかで用いられるが本発明はこれらの実施例に開
示された特定のベクターや宿主細菌に限定されるわけで
はない。使用した細菌とプラスミドは全て、バイオテク
ノロジー分野の当業者が様々な起源から容易に入手でき
る。たとえば、大腸菌（E. coli）JM105とプラスミドp
UC9およびpBR322は米国08854ニユージヤージー（New Je
rsey），ピスカタウエイ（Piscataway）センテニアル
アベニユー（Centennial Avenue）800のピー．エル．バ
イオケミカルズ社（P.L.Biochemicals,Inc.）〔これは
フアルマシア社（Pharmacia,Inc.）の一部門である〕か
ら市販されており、そのカタログではそれぞれ第27−15
50−01,27−4918−01および27−1750−01とされてい
る。さらに、本発明の実施に使用することができる上記
やその他の微生物とプラスミドは、米国20852メリーラ
ンド（Maryland），ロツクビル（Rockville），パーク
ローン ドライブ（Parklawn Drive）12301のアメリカ
ン タイプ カルチヤー コレクシヨン（American Typ
e Culture Collection）からも入手できる。代表的なも
のとその寄託番号は大腸菌（E. coli）SK1592（ATCC N
o.35106）、大腸菌（E. coli）JM105（ATCC No.5302
9）、pUC9（ATCC No.37252）、pBR322（ATCC No.3134
4）である。 以上本発明を詳細に説明したが、本発明の思想と範囲
を逸脱することなく多くの変更や修正ができることは当
業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図はオワンクラゲから単離したポリ（A+）RNAを用
いてインビトロで翻訳したオートラジオグラフイー分析
結果を示す写真であり、 第２図（ａ）はエクオレア ビクトリア（Aequorea vi
ctoria）クラゲから単離したアポエクオリンをコードし
ているDNA配列を含有する遺伝子の制限地図であり、 第２図（ｂ）はプラスミドのlacプロモーターの下流に
挿入した第２図（ａ）のセグメントの制限地図であり、 第３図はpAEQ1抽出物中のCa2+−依存性発光タンパク質
活性の時間と酸素に対する依存性を示すグラフであり、 第４図はpAEQ1抽出物で現われるCa2+−依存性発光タン
パク質活性のゲル過の結果のグラフである。
いてインビトロで翻訳したオートラジオグラフイー分析
結果を示す写真であり、 第２図（ａ）はエクオレア ビクトリア（Aequorea vi
ctoria）クラゲから単離したアポエクオリンをコードし
ているDNA配列を含有する遺伝子の制限地図であり、 第２図（ｂ）はプラスミドのlacプロモーターの下流に
挿入した第２図（ａ）のセグメントの制限地図であり、 第３図はpAEQ1抽出物中のCa2+−依存性発光タンパク質
活性の時間と酸素に対する依存性を示すグラフであり、 第４図はpAEQ1抽出物で現われるCa2+−依存性発光タン
パク質活性のゲル過の結果のグラフである。
フロントページの続き
(72)発明者 ミルトン・ジエイ・コーマイヤー
アメリカ合衆国、ジヨージア・30622、
ボガート、ボツクス・34・エイ、ルー
ト・１
(72)発明者 ダグラス・プラツシヤー
アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・
02536、イースト・フアルマウス、ゴー
レツタ・ドライブ・72
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（１）化合物（ｂ）第２式： 第１式のPRO5の代りにSER、ASN8の代りにASP、LYS11の
代りにARG、ASP78の代りにGLU、ALA81の代りにGLU、LYS
88の代りにARG、THR91の代りにSER、ASR92の代りにCYS
又はGLU、GLU95の代りにLYS、LYS96の代りにARG、ALA98
の代りにSER、GLN101の代りにGLU、ILE102の代りにPR
O、ILE107の代りにLEU、ILE116の代りにVAL、THR125の
代りにSER、SER127の代りにASP、THR141の代りにSER、G
LU144の代りにASPになったもの（ここで、下付き番号は
第１式のアミノ末端から数えたアミノ酸位置を表してい
る）、 （ｃ）第３式として、前記第１式又は第２式に於いて、
アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
の両末端の１から15個のアミノ酸が欠如したもの、 （ｄ）第４式として、前記第１式又は第２式に於いて、
アミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか、又はそ
の両末端に１から10個の付加アミノ酸を連続的に結合し
たもの；及び （２）前記式を有する化合物の塩類； から選択される均質ペプチドであって、該ペプチドは腔
腸動物門のルシフェリンを結合しCa2+の存在下で光を放
つことができるペプチド。 ２．前記第１式又は第２式に於いてアミノ末端に、−ME
T THR SER GLU GLN TYR SER−の配列を有する付加アミ
ノ酸を連続的に結合した特許請求の範囲第１項記載のペ
プチド。 ３．第１式の化合物又はその塩類である特許請求の範囲
第１項又は第２項記載のペプチド。 ４．第２式の化合物又はその塩類である特許請求の範囲
第１項又は第２項記載のペプチド。 ５．第１式の１つ以上のアミノ酸が指定されたアミノ酸
で置換されており、その結果第２式の化合物である、特
許請求の範囲第４項記載のペプチド。 ６．第３式の化合物又はその塩類である特許請求の範囲
第１項記載のペプチド。 ７．アミノ末端から欠如アミノ酸が欠如した特許請求の
範囲第６項記載のペプチド。 ８．カルボキシ末端から欠如アミノ酸が欠如した特許請
求の範囲第６項記載のペプチド。 ９．少なくとも１つのアミノ酸が両末端から欠如した特
許請求の範囲第６項記載のペプチド。 １０．いずれかの末端から10以下のアミノ酸が欠如した
特許請求の範囲第６項記載のペプチド。 １１．第４式の化合物又はその塩類である特許請求の範
囲第１項記載のペプチド。 １２．アミノ末端に付加アミノ酸が結合した特許請求の
範囲第11項記載のペプチド。 １３．カルボキシ末端に付加アミノ酸が結合した特許請
求の範囲第11項記載のペプチド。 １４．少なくとも１つの付加アミノ酸が各末端に結合し
た特許請求の範囲第11項に記載のペプチド。
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