JP2868530B2 - プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの活性を
抑制する因子としてPlasminogen activator inhibitor
・１（PAI・１）,Urokinase inhibitor（PAI・２）及び
Urokinase like（PAI・３）が知られている。本発明はP
AI・１すなわちヒトプラスミノーゲンアクティベーター
インヒビター・１（Plasminogen activator inhibitor
・1;以後PAIと略す）を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体、それを産生するハイブリドーマ，その抗体の製
造方法に関する。
抑制する因子としてPlasminogen activator inhibitor
・１（PAI・１）,Urokinase inhibitor（PAI・２）及び
Urokinase like（PAI・３）が知られている。本発明はP
AI・１すなわちヒトプラスミノーゲンアクティベーター
インヒビター・１（Plasminogen activator inhibitor
・1;以後PAIと略す）を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体、それを産生するハイブリドーマ，その抗体の製
造方法に関する。
b.従来技術 Loskutoffらにより、ウシ大動脈血管壁内皮細胞の培
養上清より、分子量50,000のウシPAIが生成された［Mou
rik,J.A.at al J.Boil.Chem.,259,14914−14921（198
4）］。
養上清より、分子量50,000のウシPAIが生成された［Mou
rik,J.A.at al J.Boil.Chem.,259,14914−14921（198
4）］。
このウシPAIは、種々の蛋白変性剤,pH,加熱などに対
して極めて安定であり、activeなPAIとquiescentなPAI
の存在が示唆されている。このPAIは、セリンプロテア
ーゼインヒビターの一種であり、組織型プラスミノーゲ
ンアクティベーター（Tissue plasminogen activator;
以降tPAと略記する）と速やかに複合体を形成し、tPA活
性を抑制することが知られている。
して極めて安定であり、activeなPAIとquiescentなPAI
の存在が示唆されている。このPAIは、セリンプロテア
ーゼインヒビターの一種であり、組織型プラスミノーゲ
ンアクティベーター（Tissue plasminogen activator;
以降tPAと略記する）と速やかに複合体を形成し、tPA活
性を抑制することが知られている。
［Levin,E.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,80,6804−6808
（1986）,Philips M.et al.Biochem.Biophys.Acta.,80
2,99−110（1984）参照］また、同様のPAI−tPA複合体
は血漿中にも存在することが知られている［Booth,N.A.
et al Thromb.Res.,38,261−267（1985）参照］さら
に、血中PAI活性値と血栓症との相関が示唆されており
［Nilsson,et al Brit.Med.J.,290,1453−1456（198
5）,Paramo,J.A.et al Thromb.Haemost.,54,713−716
（1985）参照］PAIは血液凝固線溶系の開始機構の重要
な制御因子であることが明らかにされている。
（1986）,Philips M.et al.Biochem.Biophys.Acta.,80
2,99−110（1984）参照］また、同様のPAI−tPA複合体
は血漿中にも存在することが知られている［Booth,N.A.
et al Thromb.Res.,38,261−267（1985）参照］さら
に、血中PAI活性値と血栓症との相関が示唆されており
［Nilsson,et al Brit.Med.J.,290,1453−1456（198
5）,Paramo,J.A.et al Thromb.Haemost.,54,713−716
（1985）参照］PAIは血液凝固線溶系の開始機構の重要
な制御因子であることが明らかにされている。
したがってPAIの作用機構を明らかにすることと、ま
た、PAIの血中における抗原量，活性量を測定し、その
動向を把握することができれば、それは基礎医学，臨床
医学の領域において非常に重要な意味を持つと考えられ
る。
た、PAIの血中における抗原量，活性量を測定し、その
動向を把握することができれば、それは基礎医学，臨床
医学の領域において非常に重要な意味を持つと考えられ
る。
一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定基に対して
特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的
に産生できるという利点から抗原蛋白質の機能及び構造
の解析、或いは免疫測定（EIA,RIA）に近時一般的に広
く利用されるようになってきた。特に抗原蛋白質の機能
解析，分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、又
は特殊の構造部位を認識する抗体を見出すことが有力な
手段となり得る。
特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的
に産生できるという利点から抗原蛋白質の機能及び構造
の解析、或いは免疫測定（EIA,RIA）に近時一般的に広
く利用されるようになってきた。特に抗原蛋白質の機能
解析，分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、又
は特殊の構造部位を認識する抗体を見出すことが有力な
手段となり得る。
従来、PAIのモノクローナル抗体は、ヒト血漿由来PAI
を抗原としたもの［Urden,G.et al.Thromb.Haemost.,5
5,383−387（1986）］，ヒト胎盤由来PAIを抗原とした
もの［Philips,M.et al.Thromb.Haemost.,55,213−217
（1986）参照］，ヒトFibrosarcoma cell line由来PAI
を抗原したもの［Nielsen,L.S.et al.Thromb.Haemost.,
55,206−212（1986）参照］が報告されている。
を抗原としたもの［Urden,G.et al.Thromb.Haemost.,5
5,383−387（1986）］，ヒト胎盤由来PAIを抗原とした
もの［Philips,M.et al.Thromb.Haemost.,55,213−217
（1986）参照］，ヒトFibrosarcoma cell line由来PAI
を抗原したもの［Nielsen,L.S.et al.Thromb.Haemost.,
55,206−212（1986）参照］が報告されている。
そこで本発明者は、ヒト血管壁内皮細胞由来PAIを抗
原としたモノクローナル抗体を作製し、あわせてウシ血
清含有ヒト血管壁内皮細胞培養上清よりのPAI精製法を
確立した。
原としたモノクローナル抗体を作製し、あわせてウシ血
清含有ヒト血管壁内皮細胞培養上清よりのPAI精製法を
確立した。
c.発明の構成 本発明者はヒト血管壁内皮細胞由来のPAIを特異的に
認識するモノクローナル抗体，ヒト血管壁内皮細胞由来
のPAIを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ，このモノクローナル抗体を用いてヒ
ト血管壁内皮細胞由来PAIを免疫吸着し精製する方法,PA
I及びPAI−tPA複合体を測定する方法を見出し、本発明
に到達した。すなわち、本発明者は、血管壁内皮細胞由
来のPAIを精製し、ケーラーとミルシュタインの方法［K
ohler ＆ Milstein,Nature;256,495−497（1975）参
照］として知られた方法によって血管壁内皮細胞由来PA
Iを特異的に認識するモノクローナル抗体を得た。ヒト
血管壁内皮細胞由来PAIでマウスを免疫した後このマウ
スの脾臓細胞をマウス・ミエローマ細胞と融合させ、得
られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイタープレート
に固定されたPAIと反応する抗体に対し、系統的に検査
し、選択される。
認識するモノクローナル抗体，ヒト血管壁内皮細胞由来
のPAIを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ，このモノクローナル抗体を用いてヒ
ト血管壁内皮細胞由来PAIを免疫吸着し精製する方法,PA
I及びPAI−tPA複合体を測定する方法を見出し、本発明
に到達した。すなわち、本発明者は、血管壁内皮細胞由
来のPAIを精製し、ケーラーとミルシュタインの方法［K
ohler ＆ Milstein,Nature;256,495−497（1975）参
照］として知られた方法によって血管壁内皮細胞由来PA
Iを特異的に認識するモノクローナル抗体を得た。ヒト
血管壁内皮細胞由来PAIでマウスを免疫した後このマウ
スの脾臓細胞をマウス・ミエローマ細胞と融合させ、得
られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイタープレート
に固定されたPAIと反応する抗体に対し、系統的に検査
し、選択される。
PAIに陽性を示すハイブリドーマを選別することによ
り、目的とする抗体を合成し分泌するハイブリドーマを
単離することができる。
り、目的とする抗体を合成し分泌するハイブリドーマを
単離することができる。
本発明のモノクローナル抗体は抗体はかかる新規なハ
イブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、PAI分
子上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用す
る。
イブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、PAI分
子上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用す
る。
本発明のモノクローナル抗体はその特性からPAIの精
製に利用する場合非常に有利である。すなわち、不溶性
担体に本発明におけるモノクローナル抗体を固定化し、
ウシ胎児血清を含むヒト血管内皮細胞培養上清、または
他のPAIを含む試料、あるいはそれらの粗抽出物，粗精
製物及び遺伝子発現によるrecombinant−PAIを含む溶液
からPAIを吸着，分離し、吸着対を洗浄後quiescent PAI
をactivePAIに活性化することがない様な条件下（例え
ば0.2Mグリシン／塩酸溶液）でPAIを溶出することがで
きる。また本発明のモノクローナル抗体を用いればPAI
−tPA複合体の精製にとっても有利である。すなわち不
溶性担体に本発明におけるモノクローナル抗体を固定化
し、PAI−tPA複合体を含む溶液からPAI−tPA複合体を吸
着分離し、吸着体を洗浄後適当な条件下（例えば0.2Mグ
リシン／塩酸溶液）でPAI−tPA複合体を溶出することが
できる。またこのPAIを認識するモノクローナル抗体を
用いて免疫学的手段、例えばEIA（Enzyme immuno assa
y）やRIA（Radio immuno assay）により血漿中あるいは
その他試料中のPAI抗原量を測定することができる。ま
た、tPAを認識する抗体と組合せることにより、血漿中
あるいはその他試料中のPAI−tPA複合体の抗原量を測定
することができる。
製に利用する場合非常に有利である。すなわち、不溶性
担体に本発明におけるモノクローナル抗体を固定化し、
ウシ胎児血清を含むヒト血管内皮細胞培養上清、または
他のPAIを含む試料、あるいはそれらの粗抽出物，粗精
製物及び遺伝子発現によるrecombinant−PAIを含む溶液
からPAIを吸着，分離し、吸着対を洗浄後quiescent PAI
をactivePAIに活性化することがない様な条件下（例え
ば0.2Mグリシン／塩酸溶液）でPAIを溶出することがで
きる。また本発明のモノクローナル抗体を用いればPAI
−tPA複合体の精製にとっても有利である。すなわち不
溶性担体に本発明におけるモノクローナル抗体を固定化
し、PAI−tPA複合体を含む溶液からPAI−tPA複合体を吸
着分離し、吸着体を洗浄後適当な条件下（例えば0.2Mグ
リシン／塩酸溶液）でPAI−tPA複合体を溶出することが
できる。またこのPAIを認識するモノクローナル抗体を
用いて免疫学的手段、例えばEIA（Enzyme immuno assa
y）やRIA（Radio immuno assay）により血漿中あるいは
その他試料中のPAI抗原量を測定することができる。ま
た、tPAを認識する抗体と組合せることにより、血漿中
あるいはその他試料中のPAI−tPA複合体の抗原量を測定
することができる。
すなわち本発明は下記の発明を包含する。
（１）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの結
合によっては結合を阻害されないヒトプラスミノーゲン
アクティベーターインヒビター・１の抗原決定部位を認
識するヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
ター・１に対するモノクローナル抗体。
合によっては結合を阻害されないヒトプラスミノーゲン
アクティベーターインヒビター・１の抗原決定部位を認
識するヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
ター・１に対するモノクローナル抗体。
（２）上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。
マ。
（３）上記ハイブリドーマを選択し、そのハイブリドー
マの産生するモノクローナル抗体を他の産生物と分離
し、精製し取得することを特徴とするモノクローナル抗
体の製造方法。
マの産生するモノクローナル抗体を他の産生物と分離
し、精製し取得することを特徴とするモノクローナル抗
体の製造方法。
次に本発明におけるモノクローナル抗体に作製する方
法について詳細に説明する。
法について詳細に説明する。
A.抗原の単離・精製 抗原に用いるPAIはvan Mourik J.A.らの方法［van Mo
urik J.A.et al.,J.Biol.Chem.,259,14914−14921（198
4）参照］を応用しヒト血管壁内皮細胞の培養上清から
単離・精製した。
urik J.A.et al.,J.Biol.Chem.,259,14914−14921（198
4）参照］を応用しヒト血管壁内皮細胞の培養上清から
単離・精製した。
B.PAIによるマウスの免疫 雌Balb/Cマウスを用いることができるが他の系（Stra
in）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、及
びPAIの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた、リンパ球
が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウスに
50μｇのPAIを２週間間隔で腹腔に３回免疫の後、さら
に30μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融合の
為に脾臓細胞をとり出す。
in）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、及
びPAIの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた、リンパ球
が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウスに
50μｇのPAIを２週間間隔で腹腔に３回免疫の後、さら
に30μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融合の
為に脾臓細胞をとり出す。
C.細胞融合 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出
し、そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細
胞を適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合
促進剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲であ
る。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体
の使用が適当である。
し、そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細
胞を適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合
促進剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲であ
る。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体
の使用が適当である。
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、よく知られて
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細胞（P3−U1）
［Yelton,D.T.at al.Current.Topics in Microbiology
and Immunology,81,1（1978）参照］を用いた。
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細胞（P3−U1）
［Yelton,D.T.at al.Current.Topics in Microbiology
and Immunology,81,1（1978）参照］を用いた。
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量10
00〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量4000のポ
リエチレングリコールを用いた。
00〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量4000のポ
リエチレングリコールを用いた。
D.融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未
融合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合
したハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を
死滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばHA
T培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後（約１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫
瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中
で生存できる。
融合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合
したハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を
死滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばHA
T培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後（約１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫
瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中
で生存できる。
E.各容器中のPAIに対する抗体の確認 かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、PAIに対する抗体について酸素免疫定
量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）によりス
クリーニングする。
養上清を採取し、PAIに対する抗体について酸素免疫定
量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）によりス
クリーニングする。
F.PAIに対する活性を持つ抗体を産出するハイブリドー
マ細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ばハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。
第２の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子、
又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することが
できる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中よ
り、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
マ細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ばハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。
第２の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子、
又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することが
できる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中よ
り、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
G.PAI含有液からのPAIの分離 まず前記PAIに対するモノクローナル抗体を不溶性担
体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その際使用さ
れる不溶性担体としては、モノクローナル抗体を用いた
測定試薬又は測定用キットの基材として一般的使用され
るものであればよい。例えば材質としてセファロース，
ポリアクリルアミド，セルロース，デキストラン，又は
マレイン酸ポリマーあるいはこれらの混合物が好ましく
用いられる。これら不活性担体の形態としては、粉末
状，粒状，ペレット状，ビーズ状，フイルム状，繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
又はその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状
のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが有
利である。
体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その際使用さ
れる不溶性担体としては、モノクローナル抗体を用いた
測定試薬又は測定用キットの基材として一般的使用され
るものであればよい。例えば材質としてセファロース，
ポリアクリルアミド，セルロース，デキストラン，又は
マレイン酸ポリマーあるいはこれらの混合物が好ましく
用いられる。これら不活性担体の形態としては、粉末
状，粒状，ペレット状，ビーズ状，フイルム状，繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
又はその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状
のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが有
利である。
前記吸着体を用い、これにPAI含有混合物を接触せし
めると、該吸着体に固定化したモノクローナル抗体とPA
Iとが結合して、結果的にPAIが該吸着体に結合する。か
くすることによりPAIを分離，除去することが可能であ
る。
めると、該吸着体に固定化したモノクローナル抗体とPA
Iとが結合して、結果的にPAIが該吸着体に結合する。か
くすることによりPAIを分離，除去することが可能であ
る。
また前記の如くしてPAIを吸着体に結合させ、できれ
ば残余の混合物を洗浄して除去する。次いで吸着体に結
合したPAIを酸性条件（0.2Mグリシン塩酸）で離脱し、
これを取得することによってPAI単離することができ
る。
ば残余の混合物を洗浄して除去する。次いで吸着体に結
合したPAIを酸性条件（0.2Mグリシン塩酸）で離脱し、
これを取得することによってPAI単離することができ
る。
かくして前記分離法によれば、PAIを含有する混合物
からのPAIの除去、該混合物からのPAIの分離および精
製、該混合物中のPAIの含有量の測定などが極めて簡単
な操作で達成される。
からのPAIの除去、該混合物からのPAIの分離および精
製、該混合物中のPAIの含有量の測定などが極めて簡単
な操作で達成される。
H.PAI−tPA複合体含有液からのヒトPAIの分離 まず前記PAIに対するモノクローナル抗体を不溶性担
体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その際使用さ
れる不溶性担体としては、モノクローナル抗体を用いた
測定試薬又は測定溶キットの基材として一般的使用され
るものであればよい。例えば材質としてセファロース，
ポリアクリルアミド，セルロース，デキストラン，又は
マレイン酸ポリマーあるいはこれらの混合物が好ましく
用いられる。これら不活性担体の形態としては、粉末
状，粒状，ペレット状，ビーズ状，フイルム状，繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿，
又はその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状
のくぼみのプレート（ウエル）を用いることが有利であ
る。
体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その際使用さ
れる不溶性担体としては、モノクローナル抗体を用いた
測定試薬又は測定溶キットの基材として一般的使用され
るものであればよい。例えば材質としてセファロース，
ポリアクリルアミド，セルロース，デキストラン，又は
マレイン酸ポリマーあるいはこれらの混合物が好ましく
用いられる。これら不活性担体の形態としては、粉末
状，粒状，ペレット状，ビーズ状，フイルム状，繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿，
又はその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状
のくぼみのプレート（ウエル）を用いることが有利であ
る。
前記吸着体を用い、これにPAI−tPA複合体含有混合物
を、接触せしめると、該吸着体に固定化したモノクロー
ナル抗体とPAI−tPA複合体とが結合して、結果的にPAI
−tPA複合体が該吸着体に結合する。かくすることによ
りPAI−tPA複合体を分離・除去することが可能である。
また前記の如くしてPAI−tPA複合体を吸着体に結合さ
せ、できれば残余の混合物を洗浄して除去する。次いで
吸着体に結合したPAI−tPA複合体を酸性条件（0.2Mグリ
シン塩酸）で離脱し、これを取得することによってPAI
−tPA複合体を単離することができる。
を、接触せしめると、該吸着体に固定化したモノクロー
ナル抗体とPAI−tPA複合体とが結合して、結果的にPAI
−tPA複合体が該吸着体に結合する。かくすることによ
りPAI−tPA複合体を分離・除去することが可能である。
また前記の如くしてPAI−tPA複合体を吸着体に結合さ
せ、できれば残余の混合物を洗浄して除去する。次いで
吸着体に結合したPAI−tPA複合体を酸性条件（0.2Mグリ
シン塩酸）で離脱し、これを取得することによってPAI
−tPA複合体を単離することができる。
かくして前記分離法によれば、PAI−tPA複合体を含有
する混合物からのPAI−tPA複合体の除去、該混合物から
のPAI−tPA複合体の分離および精製、該混合物中のPAI
−tPA複合体量の含有量の測定などが極めて簡単な操作
で達成される。
する混合物からのPAI−tPA複合体の除去、該混合物から
のPAI−tPA複合体の分離および精製、該混合物中のPAI
−tPA複合体量の含有量の測定などが極めて簡単な操作
で達成される。
d.発明の効果 PAIは系液凝固線溶系の開始機構の重要な制御因子で
あり、PAIの作用機構を明らかにすること、またPAIの血
中における抗原量，活性量を測定し、その動向を把握す
ることは基礎医学，臨床医学の領域において非常に重要
な意味を持つ。本発明のPAIを認識するモノクローナル
抗体によれば血漿中あるいはその他の試料中のPAI抗原
量を測定することができ、またtPAを認識する抗体と組
合せることにより、血漿中あるいはその他試料中のPAI
−tPA複合体の抗原量を測定することができる。また本
発明のモノクローナル抗体を用いればPAIあるいはPAI−
tPA複合体の精製も容易に行なうことができる。
あり、PAIの作用機構を明らかにすること、またPAIの血
中における抗原量，活性量を測定し、その動向を把握す
ることは基礎医学，臨床医学の領域において非常に重要
な意味を持つ。本発明のPAIを認識するモノクローナル
抗体によれば血漿中あるいはその他の試料中のPAI抗原
量を測定することができ、またtPAを認識する抗体と組
合せることにより、血漿中あるいはその他試料中のPAI
−tPA複合体の抗原量を測定することができる。また本
発明のモノクローナル抗体を用いればPAIあるいはPAI−
tPA複合体の精製も容易に行なうことができる。
e.実施例 以下実施例を掲げ本発明を詳細に説明する。
実施例１（モノクローナル抗体の取得） 精製したPAIを雌のBalb/Cマウス（４周齢）２匹に対
して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫はPBSに溶解
した。50μｇのPAIを等量のフロイントの完全アジュバ
ント（Complete Freund′s adjuvant）と混合し、その
エマルジョンを、腹腔内に投与した（0.5mg/head）、２
回目,3回目は、同じく50μｇのPAIをフロイントの不完
全アジュバント（Freund′s imcomplete adjuvant）と
混合し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は10μｇの
PAIをPBS溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。
最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融
合に用いた。
して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫はPBSに溶解
した。50μｇのPAIを等量のフロイントの完全アジュバ
ント（Complete Freund′s adjuvant）と混合し、その
エマルジョンを、腹腔内に投与した（0.5mg/head）、２
回目,3回目は、同じく50μｇのPAIをフロイントの不完
全アジュバント（Freund′s imcomplete adjuvant）と
混合し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は10μｇの
PAIをPBS溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。
最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融
合に用いた。
免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細
胞（P3U1）を約2:1〜約15:1の割り合いで混合し、50％
ポリエステルグリコール4000（Merck）を融合促進剤と
してKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行なっ
た。融合後の細胞は、１×106cell/mlの細胞濃度となる
ように10％FCS・−RPMI−1640培地の懸濁し、96wellsマ
イクロプレート（Coster）に１ウエル当り100μずつ
分注した。
胞（P3U1）を約2:1〜約15:1の割り合いで混合し、50％
ポリエステルグリコール4000（Merck）を融合促進剤と
してKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行なっ
た。融合後の細胞は、１×106cell/mlの細胞濃度となる
ように10％FCS・−RPMI−1640培地の懸濁し、96wellsマ
イクロプレート（Coster）に１ウエル当り100μずつ
分注した。
融合細胞は、CO2インキュベーター（５％CO2,37℃）
中で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジ
ンを含む培地（HAT培地）で培地交換を行ない、HAT培地
中で増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞からなるハイ
ブリドーマのスクリーニングを行なった。
中で培養し、ヒポキサンチン，アミノプテリン；チミジ
ンを含む培地（HAT培地）で培地交換を行ない、HAT培地
中で増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞からなるハイ
ブリドーマのスクリーニングを行なった。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原PAIをコー
ティングしたマイクロタイタープレートを用いELISA法
により検出した。第２抗体には、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（以降HRPと略す）標識ウサギ抗マウスIgG抗体を
用いた。
ティングしたマイクロタイタープレートを用いELISA法
により検出した。第２抗体には、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（以降HRPと略す）標識ウサギ抗マウスIgG抗体を
用いた。
融合細胞をまいた合計570のウエルのうち511のウエル
にコロニーの形成が認められる。このうち抗体産生陽性
ウエルは下記表１に示すように８ウエルであった。これ
らの抗体産生陽性ウエルについて限界希釈法によるクロ
ーニングを２回繰り返して行ない４個のクローンを得
た。このクローンから産生されるモノクローナル抗体を
それぞれJTI−1,JTI−2,JTI−3,JTI−４とする。得られ
たクローンは90％FCS−10％DMSO中に懸濁され液体窒素
中保存した。各クローンの産生するモノクローナル抗体
は、クローンをBalb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹
水からプロティンＡ−Sepharose4Bカラムを用いて精製
した。
にコロニーの形成が認められる。このうち抗体産生陽性
ウエルは下記表１に示すように８ウエルであった。これ
らの抗体産生陽性ウエルについて限界希釈法によるクロ
ーニングを２回繰り返して行ない４個のクローンを得
た。このクローンから産生されるモノクローナル抗体を
それぞれJTI−1,JTI−2,JTI−3,JTI−４とする。得られ
たクローンは90％FCS−10％DMSO中に懸濁され液体窒素
中保存した。各クローンの産生するモノクローナル抗体
は、クローンをBalb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹
水からプロティンＡ−Sepharose4Bカラムを用いて精製
した。
実施例２ （ドデシル硫酸ナトリウム活性化PAIとモノクローナル
抗体とのエンザイムイムノアッセイ法での結合能） ドデシル硫酸ナトリウム（以後SDSと略す）で活性化
したPAIへのモノクローナル抗体結合能を、抗原固定化
エンザイムイムノアッセイ法を用いて検定した。quiesc
ent PAI溶液に、終濃度0.1％となるようにSDSを加え、3
7℃で１時間静置した。その後終濃度１％となるように
トライトンＸ−100を加え、氷冷上で１時間静置した。
この操作でSDS活性化PAIが得られた。
抗体とのエンザイムイムノアッセイ法での結合能） ドデシル硫酸ナトリウム（以後SDSと略す）で活性化
したPAIへのモノクローナル抗体結合能を、抗原固定化
エンザイムイムノアッセイ法を用いて検定した。quiesc
ent PAI溶液に、終濃度0.1％となるようにSDSを加え、3
7℃で１時間静置した。その後終濃度１％となるように
トライトンＸ−100を加え、氷冷上で１時間静置した。
この操作でSDS活性化PAIが得られた。
このSDS活性化PAIを抗原とし、また比較のためにPAI
−tPA複合体,quiescent PAIも抗原とし、エンザイムイ
ムノアッセイを行なった。
−tPA複合体,quiescent PAIも抗原とし、エンザイムイ
ムノアッセイを行なった。
ポリスチレンプラスチックウエルを１夜４℃で、各々
の抗原を１μg/mlのタンパク濃度に調製し、これをコー
ティングした。表２に示すように抗原との結合能を検定
した。ウエルを洗浄し、BSAでブロックし、37℃で２時
間,5μg/mlのタンパク濃度に調製した４種のモノクロー
ナル抗体とともに保温した。洗浄後、HRP標識ウサギ抗
マウス抗体とともに保温した。洗浄後、ウエルに残存し
ているペルオキシダーゼ活性を定量し、結合能を検定し
た。４種のモノクローナル抗体とともにPAI−tPA複合
体,quiescent PAI,SDS活性化PAIに結合能を示したが、J
TI−１はquiescent PAIへの結合がより強く、JTI−２は
SDS活性化PAIへの結合がより強かった。JTI−3,−４は
ともに３種の抗原に強く結合した。
の抗原を１μg/mlのタンパク濃度に調製し、これをコー
ティングした。表２に示すように抗原との結合能を検定
した。ウエルを洗浄し、BSAでブロックし、37℃で２時
間,5μg/mlのタンパク濃度に調製した４種のモノクロー
ナル抗体とともに保温した。洗浄後、HRP標識ウサギ抗
マウス抗体とともに保温した。洗浄後、ウエルに残存し
ているペルオキシダーゼ活性を定量し、結合能を検定し
た。４種のモノクローナル抗体とともにPAI−tPA複合
体,quiescent PAI,SDS活性化PAIに結合能を示したが、J
TI−１はquiescent PAIへの結合がより強く、JTI−２は
SDS活性化PAIへの結合がより強かった。JTI−3,−４は
ともに３種の抗原に強く結合した。
また、抗原固定化法で、モノクローナル抗体の抗原へ
の結合能を分析した結果、表３に示した解離定数（Diss
ociation Constant,以後Kdと略す）を得た。
の結合能を分析した結果、表３に示した解離定数（Diss
ociation Constant,以後Kdと略す）を得た。
実施例３ （JTI−２のイムノブロッティングでの結合能） PAI又はPAI−tPA複合体の各々300ngを、SDSスラブゲ
ル電気泳動し、この後電気的にニトロセルロースメンブ
レン上にタンパクを転移した。このニトロセルロースメ
ンブレンをBSAでブロックし、洗浄後、室温で２時間10
μg/mlのタンパク濃度になるよう調製したJTI−２溶液
中で保温した。洗浄後HRP標識ウサギ抗マウス抗体とと
もに保温した。洗浄後、ニトロセルロース上に、抗原と
結合して残存しているHRP標識抗体のペルオキシダーゼ
活性を検出した。結果を図１に示した。JTI−２は、PAI
単独,PAI−tPA複合体ともに結合能を示した。
ル電気泳動し、この後電気的にニトロセルロースメンブ
レン上にタンパクを転移した。このニトロセルロースメ
ンブレンをBSAでブロックし、洗浄後、室温で２時間10
μg/mlのタンパク濃度になるよう調製したJTI−２溶液
中で保温した。洗浄後HRP標識ウサギ抗マウス抗体とと
もに保温した。洗浄後、ニトロセルロース上に、抗原と
結合して残存しているHRP標識抗体のペルオキシダーゼ
活性を検出した。結果を図１に示した。JTI−２は、PAI
単独,PAI−tPA複合体ともに結合能を示した。
実施例４ （PAI単独とPAI−tPA複合体との全PAI抗原量の測定） JTI−３をタンパク濃度50μg/mlでポリスチレンプラ
スチックウエル上に４℃で一夜静置し、コーティングし
た。次に１％BSAを含むトリス塩酸緩衝液（以後TBSと略
す）を加え、37℃で２時間静置した後0.5％Tween 20を
含むトリス塩酸緩衝液（以後TBS−Twと略す）で４回洗
浄した。次にPAIあるいはPAI−tPA複合体を、タンパク
濃度10,20あるいは40ng/mlになるようにTBS−Twで希釈
した溶液を加え37℃で２時間静置した。TBS−Twで４回
洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したJTI−４を、TBS−
Twで２μg/mlになるように希釈した溶液を加え、37℃で
２時間静置した。TBS−Twで４回洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ基質溶液を加え室温で反応後、波長495nmで吸光度
を測定した。結果を図２に示す。この図より、PAI単独
でのタンパク濃度あるいはPAI−tPA複合体のタンパク濃
度と吸光度の関係は、同様の直線関係になることが示さ
れた。以上のことから、この測定系では、PAI単独とPAI
−tPA複合体をあわせた全PAI抗原量を測定しうることが
示された。
スチックウエル上に４℃で一夜静置し、コーティングし
た。次に１％BSAを含むトリス塩酸緩衝液（以後TBSと略
す）を加え、37℃で２時間静置した後0.5％Tween 20を
含むトリス塩酸緩衝液（以後TBS−Twと略す）で４回洗
浄した。次にPAIあるいはPAI−tPA複合体を、タンパク
濃度10,20あるいは40ng/mlになるようにTBS−Twで希釈
した溶液を加え37℃で２時間静置した。TBS−Twで４回
洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したJTI−４を、TBS−
Twで２μg/mlになるように希釈した溶液を加え、37℃で
２時間静置した。TBS−Twで４回洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ基質溶液を加え室温で反応後、波長495nmで吸光度
を測定した。結果を図２に示す。この図より、PAI単独
でのタンパク濃度あるいはPAI−tPA複合体のタンパク濃
度と吸光度の関係は、同様の直線関係になることが示さ
れた。以上のことから、この測定系では、PAI単独とPAI
−tPA複合体をあわせた全PAI抗原量を測定しうることが
示された。
実施例５ （PAI単独の抗原量の測定） JTI−２をタンパク濃度50μg/mlでポリスチレンプラ
スチックウエル上に４℃で一夜静置しコーティングし
た。次に１％BSAを含むTBSを加え、37℃で２時間静置し
た後、TBS−Twで４回洗浄した。次にPAIあるいはPAI−t
PA複合体をタンパク濃度10,20あるいは40ng/mlになるよ
うにTBS−Twで希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置
した。TBS−Twで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼで
標識したJTI−１を、TBS−Twで２μg/mlになるように希
釈した溶液を加え、37℃で２時間静置した。TBS−Twで
４回潜像後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加え室温で反
応後、波長495nmで吸光度を測定した。結果を図３に示
す。この図よりPAI単独ではタンパク濃度と吸光度は直
線関係になることが示されたが、PAI−tPA複合体につい
ては、タンパク量の増加に伴う吸光度の増加はみられな
かった。以上のことから、この測定系では、PAI単独で
の抗原量は測定しうるが、PAI−tPA複合体の抗原量は測
定しないことが示された。
スチックウエル上に４℃で一夜静置しコーティングし
た。次に１％BSAを含むTBSを加え、37℃で２時間静置し
た後、TBS−Twで４回洗浄した。次にPAIあるいはPAI−t
PA複合体をタンパク濃度10,20あるいは40ng/mlになるよ
うにTBS−Twで希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置
した。TBS−Twで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼで
標識したJTI−１を、TBS−Twで２μg/mlになるように希
釈した溶液を加え、37℃で２時間静置した。TBS−Twで
４回潜像後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加え室温で反
応後、波長495nmで吸光度を測定した。結果を図３に示
す。この図よりPAI単独ではタンパク濃度と吸光度は直
線関係になることが示されたが、PAI−tPA複合体につい
ては、タンパク量の増加に伴う吸光度の増加はみられな
かった。以上のことから、この測定系では、PAI単独で
の抗原量は測定しうるが、PAI−tPA複合体の抗原量は測
定しないことが示された。
実施例６ （PAI−tPA複合体の抗原量の測定） 測定系Ｉ tPA単独およびPAI−tPA複合体ともに結合しうる抗tPA
モノクローナル抗体を、タンパク濃度50μg/mlでポリス
チレンプラスチックウエル上に４℃で一夜静置し、コー
ティングした。次に１％BSAを含むTBSを加え、７℃で２
時間静置した後、TBS−Twで４回洗浄した。次にPAI−tP
A複合体をタンパク濃度10,20あるいは40ng/mlになるよ
うにTBS−Twで希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置
した。TBSで４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したJ
TI−1,−３あるいは−４をTBS−Twで２μg/mlになるよ
うに希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置した。TBS
−Twで４回洗浄ペルオキシダーゼ基質溶液を加え、室温
で反応後、波長495nmで吸光度を測定した。結果を図４
に示す。この図により、いずれのペルオキシダーゼ標識
化抗体でも、PAI−tPA複合体量と吸光度の関係は、直線
関係になることが示された。以上のことからこの測定系
では、PAI−tPA複合体の抗原量を測定しうることが示さ
れた。
モノクローナル抗体を、タンパク濃度50μg/mlでポリス
チレンプラスチックウエル上に４℃で一夜静置し、コー
ティングした。次に１％BSAを含むTBSを加え、７℃で２
時間静置した後、TBS−Twで４回洗浄した。次にPAI−tP
A複合体をタンパク濃度10,20あるいは40ng/mlになるよ
うにTBS−Twで希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置
した。TBSで４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したJ
TI−1,−３あるいは−４をTBS−Twで２μg/mlになるよ
うに希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置した。TBS
−Twで４回洗浄ペルオキシダーゼ基質溶液を加え、室温
で反応後、波長495nmで吸光度を測定した。結果を図４
に示す。この図により、いずれのペルオキシダーゼ標識
化抗体でも、PAI−tPA複合体量と吸光度の関係は、直線
関係になることが示された。以上のことからこの測定系
では、PAI−tPA複合体の抗原量を測定しうることが示さ
れた。
測定系II JTI−1,−３あるいは−４を、タンパク濃度50μg/ml
でポリスチレンプラスチックウエル上に４℃で一夜静置
し、コーティングした。次に１％BSAを含むTBSを加え、
37℃で２時間静置した後、TBS−Twで４回洗浄した。次
にPAI−tPA複合体をタンパク濃度10,20あるいは40ng/ml
になるようにTBS−Twで希釈した溶液を加え、７℃で２
時間静置した。TBS−Twで４回洗浄後、ペルオキシダー
ゼで標識したtPA単独およびPAI−tPA複合体に結合しう
る抗tPAモノクローナル抗体をTBS−Twで２μg/mlになる
ように希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置した。TB
S−Twで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加
え、室温で反応後波長495nmで吸光度を測定した。結果
を図５に示す。この図より、いずれの抗PAIモノクロー
ナル抗体を用いてコーティングした場合でも、PAI−tPA
複合体量と吸光度の関係は直線関係になることが示され
た。以上のことからこの測定系では、PIA−tPA複合体の
抗原量を測定しうることが示された。
でポリスチレンプラスチックウエル上に４℃で一夜静置
し、コーティングした。次に１％BSAを含むTBSを加え、
37℃で２時間静置した後、TBS−Twで４回洗浄した。次
にPAI−tPA複合体をタンパク濃度10,20あるいは40ng/ml
になるようにTBS−Twで希釈した溶液を加え、７℃で２
時間静置した。TBS−Twで４回洗浄後、ペルオキシダー
ゼで標識したtPA単独およびPAI−tPA複合体に結合しう
る抗tPAモノクローナル抗体をTBS−Twで２μg/mlになる
ように希釈した溶液を加え、37℃で２時間静置した。TB
S−Twで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加
え、室温で反応後波長495nmで吸光度を測定した。結果
を図５に示す。この図より、いずれの抗PAIモノクロー
ナル抗体を用いてコーティングした場合でも、PAI−tPA
複合体量と吸光度の関係は直線関係になることが示され
た。以上のことからこの測定系では、PIA−tPA複合体の
抗原量を測定しうることが示された。
実施例７ （抗PAIモノクローナル抗体による、試験管内でのPAI−
tPA複合体形成抑制） QuiscentPAIを、SDSを用いて活性化し、SDS活性化PAI
を得た。このSDS活性化PAI100ngにJTI−1,−2,−3,−4,
マウスIgGあるいはウサギ抗PAIポリクローナル抗体をモ
ル比にして10倍又は100倍加え37℃で１時間静置した。
次に125I標識化tPAを0.1ng（１×104cpm）加え、37℃で
30分間静置した。このものをSDSスラブゲル電気泳動
し、ゲルを乾燥後オートラジオグラフィーを行なった。
ここで検出されたtPA単独あるいはPAI−tPA複合体に相
当する一にある放射活性を測定し、tPA単独とPAI−tPA
複合体の放射活性の比を百分率表示で表４に示した。表
に示されたように、抗体PAIポリクローナル抗体をPAIの
100倍モル量加えた場合、ほぼ完全に複合体形成が抑制
された。またJTI−３を10倍量あるいは100倍量加えた場
合も、強く複合体形成が抑制された。またJTI−２も複
合体形成を抑制する傾向を示した。以上のことより少く
ともJTI−３は試験管内でのPAI−tPA複合体形成を抑制
することが示された。
tPA複合体形成抑制） QuiscentPAIを、SDSを用いて活性化し、SDS活性化PAI
を得た。このSDS活性化PAI100ngにJTI−1,−2,−3,−4,
マウスIgGあるいはウサギ抗PAIポリクローナル抗体をモ
ル比にして10倍又は100倍加え37℃で１時間静置した。
次に125I標識化tPAを0.1ng（１×104cpm）加え、37℃で
30分間静置した。このものをSDSスラブゲル電気泳動
し、ゲルを乾燥後オートラジオグラフィーを行なった。
ここで検出されたtPA単独あるいはPAI−tPA複合体に相
当する一にある放射活性を測定し、tPA単独とPAI−tPA
複合体の放射活性の比を百分率表示で表４に示した。表
に示されたように、抗体PAIポリクローナル抗体をPAIの
100倍モル量加えた場合、ほぼ完全に複合体形成が抑制
された。またJTI−３を10倍量あるいは100倍量加えた場
合も、強く複合体形成が抑制された。またJTI−２も複
合体形成を抑制する傾向を示した。以上のことより少く
ともJTI−３は試験管内でのPAI−tPA複合体形成を抑制
することが示された。
実施例８ （抗PAIモノクローナル抗体による、PAIのtPA依存生プ
ラスミノーゲル活性化阻害の抑制） QuiscentPAIを、SDSを用いて活性化し、SDS活性化PAI
を得た。このSDS活性化PAI20ngに、JTI−1,−2,−3,−
４あるいはウサギ抗PAIポリクローナル抗体をモル比に
して10倍又は100倍加え、37℃で１時間静置した。次にt
PAを0.25ng加え、37℃で30分間静置した。次にプラスミ
ノーゲン22μg,プラスミンの合成発色基質であるＳ−22
51を0.15mMになるように加え、37℃で３時間静置した
後、波長405nmで吸光度を測定した。なお、ここで用い
たSDS活性化PAIの量は、tPA活性の90％を阻害する量だ
った。結果を表５に示した。表５は残存するtPA活性
が、SDS活性化PAIを含まない場合の何％に当るかを表示
した。表に示されたように抗PAIポリクローナル抗体をP
AIの100倍モル量加えた場合、tPA活性はほぼ完全に回復
した。またJTI−３を100倍モル量加えた場合も約50％tP
A活性が回復した。以上のことよりJTI−３はSDS活性化P
AIによるtPA依存生プラスミノーゲル活性化阻害を抑制
することが示された。
ラスミノーゲル活性化阻害の抑制） QuiscentPAIを、SDSを用いて活性化し、SDS活性化PAI
を得た。このSDS活性化PAI20ngに、JTI−1,−2,−3,−
４あるいはウサギ抗PAIポリクローナル抗体をモル比に
して10倍又は100倍加え、37℃で１時間静置した。次にt
PAを0.25ng加え、37℃で30分間静置した。次にプラスミ
ノーゲン22μg,プラスミンの合成発色基質であるＳ−22
51を0.15mMになるように加え、37℃で３時間静置した
後、波長405nmで吸光度を測定した。なお、ここで用い
たSDS活性化PAIの量は、tPA活性の90％を阻害する量だ
った。結果を表５に示した。表５は残存するtPA活性
が、SDS活性化PAIを含まない場合の何％に当るかを表示
した。表に示されたように抗PAIポリクローナル抗体をP
AIの100倍モル量加えた場合、tPA活性はほぼ完全に回復
した。またJTI−３を100倍モル量加えた場合も約50％tP
A活性が回復した。以上のことよりJTI−３はSDS活性化P
AIによるtPA依存生プラスミノーゲル活性化阻害を抑制
することが示された。
実施例９ （抗PAIモノクローナル抗体による、血管壁内皮細胞上
でのPAI−tPA複合体形成の抑制） 血管壁内皮細胞を、直径35mmの細胞培養皿上にコンフ
ルエントになるよう培養した。細胞を無血清199培地で
洗浄後2mlの無血清199培地，終濃度100ng/mlのtPAおよ
び終濃度10μg/mlのLTI−1,−2,−3,−4,マウスIgGある
いはウサギ抗PAIポリクローナル抗体を加え37℃で３時
間静置し、上清を回収した。この上清をSDSスラブゲル
電気泳動を行なった後フィブリンオートグラフィーで分
析した。結果を図６に示した。図６において記号１〜５
はそれぞれ以下の場合を示す。
でのPAI−tPA複合体形成の抑制） 血管壁内皮細胞を、直径35mmの細胞培養皿上にコンフ
ルエントになるよう培養した。細胞を無血清199培地で
洗浄後2mlの無血清199培地，終濃度100ng/mlのtPAおよ
び終濃度10μg/mlのLTI−1,−2,−3,−4,マウスIgGある
いはウサギ抗PAIポリクローナル抗体を加え37℃で３時
間静置し、上清を回収した。この上清をSDSスラブゲル
電気泳動を行なった後フィブリンオートグラフィーで分
析した。結果を図６に示した。図６において記号１〜５
はそれぞれ以下の場合を示す。
1;JTI−１を加えた場合,2;JTI−３を加えた場合,3;ポ
リクローナル抗体を加えた場合,4;JTI−４を加えた場
合,5;実験に用いたtPA。
リクローナル抗体を加えた場合,4;JTI−４を加えた場
合,5;実験に用いたtPA。
図６より、ウサギ抗PAIポリクローナル抗体を加てた
場合、PAI−tPA複合体形成は完全に抑制されたことがわ
かる。またJTI−1,JTI−３を加えた場合もPAI−tPA複合
体形成の抑制がみられた。以上のことから、JTI−1,JTI
−３は血管壁内皮細胞が作る活性形PAIによるPAI−tPA
複合体形成を抑制することがわかった。
場合、PAI−tPA複合体形成は完全に抑制されたことがわ
かる。またJTI−1,JTI−３を加えた場合もPAI−tPA複合
体形成の抑制がみられた。以上のことから、JTI−1,JTI
−３は血管壁内皮細胞が作る活性形PAIによるPAI−tPA
複合体形成を抑制することがわかった。
実施例10 （ヒト血管壁内皮細胞PAIの精製） ヒト血管壁内皮細胞培養上清１に、pH7.0に調製し
た飽和硫安１を、１時間かけ氷冷撹拌しながら加え
た。すべての硫安溶液を加えおえたのち、２時間撹拌を
する。この溶液を10,000×G,30分間４℃で遠心分離し、
沈澱を分離した。
た飽和硫安１を、１時間かけ氷冷撹拌しながら加え
た。すべての硫安溶液を加えおえたのち、２時間撹拌を
する。この溶液を10,000×G,30分間４℃で遠心分離し、
沈澱を分離した。
この沈澱を20mM Tris・HClpH7.4−0.15M NaCl−0.01
％Tween 80（以後Tw80と略す）に1mM Benzamidine緩衝
液100mlに溶解し同緩衝液対にして４℃で透析した。
％Tween 80（以後Tw80と略す）に1mM Benzamidine緩衝
液100mlに溶解し同緩衝液対にして４℃で透析した。
透析を終えた試料を、前記抗PAIモノクローナル抗体J
TI−１を、1mg/ml・抗体の濃度で結合させた抗体−担体
結合体10mlと混合，撹拌し４℃,18時間の反応をおえた
抗体−担体結合体を集め，これを100mlの20mM Tris・HC
l−1.0M NaCl−0.01％Tw 80−1mM Benzamidin緩衝液で
洗浄し、さらに20mM Tris・HCl−0.15M NaCl−0.01％Tw
80−1mM Benzamidin 100mlで洗浄する。PAIを吸着して
いる抗体・担体結合体から0.2Mグリシン・塩酸pH2.5−
0.01％Tw 80緩衝液を用いてPAIを溶出した。
TI−１を、1mg/ml・抗体の濃度で結合させた抗体−担体
結合体10mlと混合，撹拌し４℃,18時間の反応をおえた
抗体−担体結合体を集め，これを100mlの20mM Tris・HC
l−1.0M NaCl−0.01％Tw 80−1mM Benzamidin緩衝液で
洗浄し、さらに20mM Tris・HCl−0.15M NaCl−0.01％Tw
80−1mM Benzamidin 100mlで洗浄する。PAIを吸着して
いる抗体・担体結合体から0.2Mグリシン・塩酸pH2.5−
0.01％Tw 80緩衝液を用いてPAIを溶出した。
カラムからの溶出液は3mlずつ分画した。また溶出後
各分画は1M Tris pH9.0を加えてpH7.4に調製した。
各分画は1M Tris pH9.0を加えてpH7.4に調製した。
得られた試料に存在するPAI−tPA複合体を除くために
抗tPAポリクローナル抗体を不溶化した担体と４℃,18時
間撹拌したその上清を得た。
抗tPAポリクローナル抗体を不溶化した担体と４℃,18時
間撹拌したその上清を得た。
上記の実施例において、PAIの精製を確認のためのSDS
電気泳動を行ない、タンパク染色と抗PAIモノクローナ
ル抗体JTI−２およびHRP標識化ウサギ抗マウスIgGを用
いたイムノブロッティングの結果を図７に示した。
電気泳動を行ない、タンパク染色と抗PAIモノクローナ
ル抗体JTI−２およびHRP標識化ウサギ抗マウスIgGを用
いたイムノブロッティングの結果を図７に示した。
図７において記号Ａ〜Ｆはそれぞれ以下の銀染色を示
す。
す。
A;培養上清,B;抗体カラム素通り,C;分画1,D;分画2,E;
分画3,F;分画４。またＧはイムノブロッティング発色を
示す。
分画3,F;分画４。またＧはイムノブロッティング発色を
示す。
図１は実施例３におけるゲル電気泳動結果を示す。図２
は実施例４における全PAI抗原量の測定結果を示す。図
３は実施例５におけるPAI単独の抗原量の測定結果を示
す。図４は実施例６における測定系ＩのPAI−tPA複合体
抗原量の測定結果を示す。図５は実施例６における測定
系IIのPAI−tPA複合体の測定結果を示す。図６は実施例
９におけるゲル電気泳動結果を示す。図７は実施例10に
おけるゲル電気泳動結果を示す。
は実施例４における全PAI抗原量の測定結果を示す。図
３は実施例５におけるPAI単独の抗原量の測定結果を示
す。図４は実施例６における測定系ＩのPAI−tPA複合体
抗原量の測定結果を示す。図５は実施例６における測定
系IIのPAI−tPA複合体の測定結果を示す。図６は実施例
９におけるゲル電気泳動結果を示す。図７は実施例10に
おけるゲル電気泳動結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (56)参考文献 特開 昭63−500564（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｒｏｍｂｏｓｔｓ ａｎｄ Ｈａ ｅｎｏｓｔａｓｉｓ 55［２］（1986) ｐ．213−217 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｔｓ ａｎｄ Ｈａ ｅｎｏｓｔａｓｉｓ 55［２］（1986) ｐ．206−213 Ｂｌｏｏｄ 71［１］（1988，Ｊａ ｎ）ｐ．220−225 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】A.活性化されていないヒトプラスミノーゲ
ンアクティベーターインヒビター・１ B.活性化されたヒトプラスミノーゲンアクティベーター
インヒビター・１ C.ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
・１と、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターと
の複合体 のいずれにも結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ。 - 【請求項３】請求項２記載のハイブリドーマを選択し、
そのハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を他
の産生物と分離し、精製し取得することを特徴とするモ
ノクローナル抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1081544A JP2868530B2 (ja) | 1989-04-03 | 1989-04-03 | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1081544A JP2868530B2 (ja) | 1989-04-03 | 1989-04-03 | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63081366 Division | 1988-04-04 | 1988-04-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0235099A JPH0235099A (ja) | 1990-02-05 |
| JP2868530B2 true JP2868530B2 (ja) | 1999-03-10 |
Family
ID=13749236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1081544A Expired - Lifetime JP2868530B2 (ja) | 1989-04-03 | 1989-04-03 | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2868530B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114686441B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-11-03 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 一种能分泌tPAI-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK319685A (da) * | 1985-07-12 | 1987-01-13 | Fonden Til Fremme Af Eksperime | Monoklonale antistoffer, fremgangsmaade til frembringelse af antistofferne, hybridomaceller, der producerer antistofferne, og anvendelse af antistofferne |
-
1989
- 1989-04-03 JP JP1081544A patent/JP2868530B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ ７１［１］（１９８８，Ｊａｎ）ｐ．２２０−２２５ |
| Ｔｈｒｏｍｂｏｓｔｓ ａｎｄ Ｈａｅｎｏｓｔａｓｉｓ ５５［２］（１９８６）ｐ．２０６−２１３ |
| Ｔｈｒｏｍｂｏｓｔｓ ａｎｄ Ｈａｅｎｏｓｔａｓｉｓ ５５［２］（１９８６）ｐ．２１３−２１７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0235099A (ja) | 1990-02-05 |
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