JPH0616717B2 - モノクロナ−ル抗体 - Google Patents
モノクロナ−ル抗体Info
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- JPH0616717B2 JPH0616717B2 JP59237691A JP23769184A JPH0616717B2 JP H0616717 B2 JPH0616717 B2 JP H0616717B2 JP 59237691 A JP59237691 A JP 59237691A JP 23769184 A JP23769184 A JP 23769184A JP H0616717 B2 JPH0616717 B2 JP H0616717B2
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- antibody
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- A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、新規なハイブリドーマ（ハイブリッド細胞
系）、すなわち各々１９８３年１１月９日および１９８
３年１１月１６日提出された ＡＴＣＣＨＢ８４１８およびＡＴＣＣＨＢ８４２６に関
する。さらに詳細には、本発明は、そのような新規なハ
イブリドーマの各々からモノクロナール抗体たとえばフ
ィブリノーゲンから誘導される生体内フラグメントに対
して特異性のある抗体の製造、およびこれらの抗体を用
いる診断および治療方法および組成物に関する。
系）、すなわち各々１９８３年１１月９日および１９８
３年１１月１６日提出された ＡＴＣＣＨＢ８４１８およびＡＴＣＣＨＢ８４２６に関
する。さらに詳細には、本発明は、そのような新規なハ
イブリドーマの各々からモノクロナール抗体たとえばフ
ィブリノーゲンから誘導される生体内フラグメントに対
して特異性のある抗体の製造、およびこれらの抗体を用
いる診断および治療方法および組成物に関する。
フィブリノーゲンは、３つの異なるポリペプチド鎖から
なる大きな（Ｍｒ３４０，０００）二量体分子である。
フィブリノーゲン−フィブリン遷移はフィブリノペプチ
ドの継続的放出を伴う。この二段トロンビン媒介プロセ
スでは、フィブリンＩは初期生成物であり、ＦＰＡ〔フ
ィブリノペプチドＡ（Ａα１−１６）〕の放出に続いて
形成される。よりコンパクトな構造体であるフィブリン
ＩＩはＦＰＢ〔フィブリノペプチドＢ（Ｂβ１−１
４）〕が放出された際に生成する（Ｂｌｏｍｂｃｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄ．，２５７，５
０１−５０５，１９７８）。血管統合性を回復するに
は、フィブリン（フィブリンＩであれまたはＩＩであ
れ）沈着物の溶解が必要である。これは主としてプラス
ミン経路を介して達成される（Ｋｅｒｎｏｆｆ ａｎｄ
ＭｃＮｉｃｏｌ，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．，３３，
２３９−２４４，１９７７およびＣｏｌｌｅｎ，Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．，４３，７７−８９．１
９８０）。フィブリノーゲンまたはフィブリンの初期プ
ラスミン分解産物の１つは、Ｂβ鎖のＮＨ２−末端部分
から誘導される。結合Ｂβ４２Ａｒｇ−４３Ａｌａはプ
ラスミンに特に敏感である（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，５２１０
−５２１９，１９７２；Ｔａｋａｇｉ ａｎｄ Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，９４
０−９４６，１９７５）。プラスミンにより放出される
Ｂβ鎖ペプチドの性状は利用出来る基質に依存する。フ
ィブリノーゲンまたはフィブリンＩの分解により、ペプ
チドＢβ１−４２を含有するＦＰＢが生じる。もちろ
ん、後者は、ペプチドＢβ１５−４２の放出を生じるフ
ィブリンＩＩのプラスミンタンパク質加水分解において
生じ得ない。
なる大きな（Ｍｒ３４０，０００）二量体分子である。
フィブリノーゲン−フィブリン遷移はフィブリノペプチ
ドの継続的放出を伴う。この二段トロンビン媒介プロセ
スでは、フィブリンＩは初期生成物であり、ＦＰＡ〔フ
ィブリノペプチドＡ（Ａα１−１６）〕の放出に続いて
形成される。よりコンパクトな構造体であるフィブリン
ＩＩはＦＰＢ〔フィブリノペプチドＢ（Ｂβ１−１
４）〕が放出された際に生成する（Ｂｌｏｍｂｃｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄ．，２５７，５
０１−５０５，１９７８）。血管統合性を回復するに
は、フィブリン（フィブリンＩであれまたはＩＩであ
れ）沈着物の溶解が必要である。これは主としてプラス
ミン経路を介して達成される（Ｋｅｒｎｏｆｆ ａｎｄ
ＭｃＮｉｃｏｌ，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．，３３，
２３９−２４４，１９７７およびＣｏｌｌｅｎ，Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．，４３，７７−８９．１
９８０）。フィブリノーゲンまたはフィブリンの初期プ
ラスミン分解産物の１つは、Ｂβ鎖のＮＨ２−末端部分
から誘導される。結合Ｂβ４２Ａｒｇ−４３Ａｌａはプ
ラスミンに特に敏感である（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，５２１０
−５２１９，１９７２；Ｔａｋａｇｉ ａｎｄ Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，９４
０−９４６，１９７５）。プラスミンにより放出される
Ｂβ鎖ペプチドの性状は利用出来る基質に依存する。フ
ィブリノーゲンまたはフィブリンＩの分解により、ペプ
チドＢβ１−４２を含有するＦＰＢが生じる。もちろ
ん、後者は、ペプチドＢβ１５−４２の放出を生じるフ
ィブリンＩＩのプラスミンタンパク質加水分解において
生じ得ない。
フィブリノーゲンおよびフィブリンのトロンビンおよび
プラスミン分解産物の同定および定量は貴重な診断テス
トとして役立ち得る。過去１０年間の間、この目的のた
めに多数の免疫検定法が開発された。これらの免疫検定
法のほとんどで通常の免疫感作により調製される抗血清
が使用されている。そのような抗血清は種々の力価、親
和性および特異性の抗体を含有しているので、多数の問
題に遭遇する。たとえば、フィブリノーゲンおよびフィ
ブリンのあるフラグメントに見い出される分解−会合し
たネオ抗原に対する抗体は一般に著しく低い力価で存在
する（Ｐｌｏｗ ａｎｄ Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５２，２７３−２８２，１９
７３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，３３８６−
３３９２，１９７５）。交差反応性に関しては、大低の
抗血清は無瘍のフィブリノーゲンと反応し、したがっ
て、血漿サンプルは無傷フィブリノーゲンを選択的に除
去するために処理工程を必要とする。調製された抗血清
では、ＦＰＡおよびＦＰＢの両方に対する免疫反応性に
著しい差が見られる （Ｃｏｎｆｉｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１５，１２０３−１２０８，１９７６；Ｗｉ
ｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１５，１２０９−１２１３，１９７６；Ｂｉｌｅｚｉｋ
ｉａｎ ａｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，５６，４３８−４４５，１９７５）。これらの抗
血清のあるものは、遊離ＦＰＡまたはＦＰＢより長いご
く少数のアミノ酸残基であるペプチドとの交差反応性に
限界がある。
プラスミン分解産物の同定および定量は貴重な診断テス
トとして役立ち得る。過去１０年間の間、この目的のた
めに多数の免疫検定法が開発された。これらの免疫検定
法のほとんどで通常の免疫感作により調製される抗血清
が使用されている。そのような抗血清は種々の力価、親
和性および特異性の抗体を含有しているので、多数の問
題に遭遇する。たとえば、フィブリノーゲンおよびフィ
ブリンのあるフラグメントに見い出される分解−会合し
たネオ抗原に対する抗体は一般に著しく低い力価で存在
する（Ｐｌｏｗ ａｎｄ Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５２，２７３−２８２，１９
７３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，３３８６−
３３９２，１９７５）。交差反応性に関しては、大低の
抗血清は無瘍のフィブリノーゲンと反応し、したがっ
て、血漿サンプルは無傷フィブリノーゲンを選択的に除
去するために処理工程を必要とする。調製された抗血清
では、ＦＰＡおよびＦＰＢの両方に対する免疫反応性に
著しい差が見られる （Ｃｏｎｆｉｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１５，１２０３−１２０８，１９７６；Ｗｉ
ｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１５，１２０９−１２１３，１９７６；Ｂｉｌｅｚｉｋ
ｉａｎ ａｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，５６，４３８−４４５，１９７５）。これらの抗
血清のあるものは、遊離ＦＰＡまたはＦＰＢより長いご
く少数のアミノ酸残基であるペプチドとの交差反応性に
限界がある。
Ｋｂｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５，によるハイブ
リドーマ技術の開発により、フィブリノーゲンまたはフ
ィブリン分解産物を取り扱うほとんどの免疫検定法の改
善が可能になるかも知れない。
ｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５，によるハイブ
リドーマ技術の開発により、フィブリノーゲンまたはフ
ィブリン分解産物を取り扱うほとんどの免疫検定法の改
善が可能になるかも知れない。
Ｋｂｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによる免疫さ
れたマウスからの脾細胞へのマウス骨髄腫細胞の融合に
より、モノクロナール抗体を産生する無限増殖性細胞系
を得ることが出来ることが始めて証明された。その後、
種々のハイブリッド細胞系（ハイブリドーマ）の形成お
よびこれらのハイブリドーマにより産生される抗体の使
用に多くの努力が向けられた（たとえば、Ｆ．Ｍｅｌｃ
ｈｅｒｓ，Ｍ．Ｐｏｔｌｅｒ，ａｎｄ Ｎ．Ｗａｒｎｅ
ｒ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，８１−“Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９７８
およびそこに引用されている文献；Ｃ．Ｊ．Ｂａｒｎｓ
ｔａｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４，９−２
０，Ｍａｙ，１９７８；Ｐ．Ｐａｒｈａｍ ａｎｄ
Ｗ．Ｆ．Ｂｏｄｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，３９７
−３９９Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，１９７８；Ｄ．Ｍ．Ｗｉｅ
ｒ，ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，２，Ｂｌ
ａｃｋｗｅｌｌ，１９７８，Ｃｈａｐｔｅｒ２５；およ
びＣｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｎｅｗｓ．，Ｊａｎ．１，１９７９，１５−１７）。
これらの文献には、ハイブリド−マからモノクロナール
抗体を産生しようとする際に固有に存在する問題が指摘
されている。一般的な技術は良く理解されているけれど
も、各特定の場合には多くの困難と変更が存在する。
れたマウスからの脾細胞へのマウス骨髄腫細胞の融合に
より、モノクロナール抗体を産生する無限増殖性細胞系
を得ることが出来ることが始めて証明された。その後、
種々のハイブリッド細胞系（ハイブリドーマ）の形成お
よびこれらのハイブリドーマにより産生される抗体の使
用に多くの努力が向けられた（たとえば、Ｆ．Ｍｅｌｃ
ｈｅｒｓ，Ｍ．Ｐｏｔｌｅｒ，ａｎｄ Ｎ．Ｗａｒｎｅ
ｒ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，８１−“Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９７８
およびそこに引用されている文献；Ｃ．Ｊ．Ｂａｒｎｓ
ｔａｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４，９−２
０，Ｍａｙ，１９７８；Ｐ．Ｐａｒｈａｍ ａｎｄ
Ｗ．Ｆ．Ｂｏｄｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，３９７
−３９９Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，１９７８；Ｄ．Ｍ．Ｗｉｅ
ｒ，ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，２，Ｂｌ
ａｃｋｗｅｌｌ，１９７８，Ｃｈａｐｔｅｒ２５；およ
びＣｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｎｅｗｓ．，Ｊａｎ．１，１９７９，１５−１７）。
これらの文献には、ハイブリド−マからモノクロナール
抗体を産生しようとする際に固有に存在する問題が指摘
されている。一般的な技術は良く理解されているけれど
も、各特定の場合には多くの困難と変更が存在する。
実際の所、ある一定のハイブリドーマを調製しようとす
る前に、所望のハイブリドーマが得られること、得られ
た場合にそのハイブリドーマが抗体を産生すること、ま
たはそのようにして得られる抗体が所望の特異性を有す
ること、の保証はない。成功の度合は、主として使用す
る抗原の種類および所望のハイブリドーマの単離に使用
される選択技術によって左右される。
る前に、所望のハイブリドーマが得られること、得られ
た場合にそのハイブリドーマが抗体を産生すること、ま
たはそのようにして得られる抗体が所望の特異性を有す
ること、の保証はない。成功の度合は、主として使用す
る抗原の種類および所望のハイブリドーマの単離に使用
される選択技術によって左右される。
従来の研究によれば、ＣＮＢｒによるフリブリノーゲン
の生体内分解により主要ＮＨ２末端フラグメント、いわ
ゆるＮ−ＤＳＫが放出されることが判明している（Ｂｌ
ｏｍｂｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２１８，
１３０−１３４，１９６８）。フリブリノーゲンのＮ−
ＤＳＫ部分は酵素活性化の結果として現われかつフィブ
リノーゲンのフィブリンへの遷移において作用する結合
または重合ドメインを含有する（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，３３２２
−３３２５，１９７４）。酵素トロンビンは、フィブリ
ノーゲンからＦＰＡおよびＦＰＢを開裂させることが出
来、両ペプチドの放出はフィブリンＩＩの生成をもたら
す。トロンビンとは異なって、ヘビ毒酵素バトロキソビ
ンはフィブリノーゲンからＦＰＡしか放出させることが
出来ず（Ｌａｕｒｅｎｔ ＆ Ｂｌｏｍｂｃｋ，Ａｃ
ｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，１２，１８７５−１８
７７，１９５８）、これはフィブリンＩと呼ばれる種類
のフィブリンの生成を与える方法である。フィブリノー
ゲンおよびＮ−ＤＳＫのＮＨ２末端は同一であるから、
トロンビンおよびバイロキソビン誘導フィブリンゲンか
ら異なるＮ−ＤＳＫ種を得ることが出来る。
の生体内分解により主要ＮＨ２末端フラグメント、いわ
ゆるＮ−ＤＳＫが放出されることが判明している（Ｂｌ
ｏｍｂｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２１８，
１３０−１３４，１９６８）。フリブリノーゲンのＮ−
ＤＳＫ部分は酵素活性化の結果として現われかつフィブ
リノーゲンのフィブリンへの遷移において作用する結合
または重合ドメインを含有する（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，３３２２
−３３２５，１９７４）。酵素トロンビンは、フィブリ
ノーゲンからＦＰＡおよびＦＰＢを開裂させることが出
来、両ペプチドの放出はフィブリンＩＩの生成をもたら
す。トロンビンとは異なって、ヘビ毒酵素バトロキソビ
ンはフィブリノーゲンからＦＰＡしか放出させることが
出来ず（Ｌａｕｒｅｎｔ ＆ Ｂｌｏｍｂｃｋ，Ａｃ
ｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，１２，１８７５−１８
７７，１９５８）、これはフィブリンＩと呼ばれる種類
のフィブリンの生成を与える方法である。フィブリノー
ゲンおよびＮ−ＤＳＫのＮＨ２末端は同一であるから、
トロンビンおよびバイロキソビン誘導フィブリンゲンか
ら異なるＮ−ＤＳＫ種を得ることが出来る。
ネオペプチドを同定しようとして、Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６，３５７−３７
４，１９７５，において、人（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫに対する
ラビット抗血清が調製された。高力価血清が得られたに
もかかわらず、これらの研究者等はＮ−ＤＳＫと（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫの免波化学的差を何ら証明することが出来な
かった。
ｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６，３５７−３７
４，１９７５，において、人（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫに対する
ラビット抗血清が調製された。高力価血清が得られたに
もかかわらず、これらの研究者等はＮ−ＤＳＫと（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫの免波化学的差を何ら証明することが出来な
かった。
１９８２年、Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．は、フィブリ
ノーゲンまたはフィブリンから誘導されたＢβ１５−４
２配列を含むペプチドの血漿水準の測定に使用出来るラ
ジオイムノアッセイを開発した（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２５，２７７−２９
１，１９８２）。これらのペプチドは生体内プラスミン
分解の結果として生じるので、ラジオイムノアッセイは
血栓症が起りそうなまたははっきりしいいる疾病状態に
関する臨床研究において重要な情報を与え得ることが提
案された。しかしながら、ラジオイムノアッセイはＢβ
１５−４２のＮＨ２−またはＣＯＯＨ−末端に延長部を
含有するペプチド間の識別を行うことが出来ず、したが
って、全Ｂβ１５−４２免疫反応性しか測定出来なかっ
た。
ノーゲンまたはフィブリンから誘導されたＢβ１５−４
２配列を含むペプチドの血漿水準の測定に使用出来るラ
ジオイムノアッセイを開発した（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２５，２７７−２９
１，１９８２）。これらのペプチドは生体内プラスミン
分解の結果として生じるので、ラジオイムノアッセイは
血栓症が起りそうなまたははっきりしいいる疾病状態に
関する臨床研究において重要な情報を与え得ることが提
案された。しかしながら、ラジオイムノアッセイはＢβ
１５−４２のＮＨ２−またはＣＯＯＨ−末端に延長部を
含有するペプチド間の識別を行うことが出来ず、したが
って、全Ｂβ１５−４２免疫反応性しか測定出来なかっ
た。
Ｎｏｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．，６４，１３７１−１３７８，１９７９，におい
て、臨床血液サンプル中でもＢβ１−４２が同定され、
したがって、それはいわゆるフィブリンＩのプラスミン
タンパク質加水分解から生じることが示唆された。第２
の種類のフィブリンも生体内で形成される。定義によれ
ば、フィブリンＩＩはＦＰＡもまたＦＰＢも含んでおら
ず、したがって、プラスミンでそれを溶解してもＢβ−
１−４２は生成し得ない（第８図）。Ｎｏｓｓｅｌ（Ｎ
ａｕｒｅ．，Ｌｏｎｄ．，２９１，１６５−１６７，１
９８１）は、フィブリンＩは生体内フィブリノーゲンタ
ンパク質加水分解における重要な基質であり、そしてフ
ィブリンＩＩは閉塞性血栓症をより生じやすいと示唆し
ている（第８図）。閉塞性血栓症は患者の生命を危険に
さらすので、血栓症の初期を検出しなければならない。
生体内でのフィブリノーゲン分解は、フィブリノーゲン
タンパク質加水分解時に起る一般的な酵素反応に依存し
て血栓症を引き起す生成物を生じる。フィブリノーゲン
のナロンビン活性化から生じるフィブリンＩポリマーが
次いでトロンビンまたはプラスミンにより活性化される
かどうかを信頼出来る方法で調べることは困難であると
いう問題が存在する。主としてプラスミンにより活然化
されると、フィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４
２を含有するフラグメントを含む分解産物が産生され
る。後者が主な経路であれば、閉塞性血詮症は起らな
い。その代り、フィブリンＩポリマーがトロンビンによ
りさらに活性化されると、フィブリンＩＩが生成し、こ
れはしばしば血栓症を伴う。
ｓｔ．，６４，１３７１−１３７８，１９７９，におい
て、臨床血液サンプル中でもＢβ１−４２が同定され、
したがって、それはいわゆるフィブリンＩのプラスミン
タンパク質加水分解から生じることが示唆された。第２
の種類のフィブリンも生体内で形成される。定義によれ
ば、フィブリンＩＩはＦＰＡもまたＦＰＢも含んでおら
ず、したがって、プラスミンでそれを溶解してもＢβ−
１−４２は生成し得ない（第８図）。Ｎｏｓｓｅｌ（Ｎ
ａｕｒｅ．，Ｌｏｎｄ．，２９１，１６５−１６７，１
９８１）は、フィブリンＩは生体内フィブリノーゲンタ
ンパク質加水分解における重要な基質であり、そしてフ
ィブリンＩＩは閉塞性血栓症をより生じやすいと示唆し
ている（第８図）。閉塞性血栓症は患者の生命を危険に
さらすので、血栓症の初期を検出しなければならない。
生体内でのフィブリノーゲン分解は、フィブリノーゲン
タンパク質加水分解時に起る一般的な酵素反応に依存し
て血栓症を引き起す生成物を生じる。フィブリノーゲン
のナロンビン活性化から生じるフィブリンＩポリマーが
次いでトロンビンまたはプラスミンにより活性化される
かどうかを信頼出来る方法で調べることは困難であると
いう問題が存在する。主としてプラスミンにより活然化
されると、フィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４
２を含有するフラグメントを含む分解産物が産生され
る。後者が主な経路であれば、閉塞性血詮症は起らな
い。その代り、フィブリンＩポリマーがトロンビンによ
りさらに活性化されると、フィブリンＩＩが生成し、こ
れはしばしば血栓症を伴う。
上記に照らして、フィブリンＩ分子がどのような生化学
的ルートを取るのかを決定することは非常に望ましいこ
とである。これを行う１つのアプローチは、臨床サンプ
ル中のＢβ鎖ペプチドの分子性状を同定することであ
る。たとえば、Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４および１
５−４２を含有するペプチドフラグメントの一指標と合
わせ、患者の血漿中で無傷Ｂβ１−４２が支配的である
ことが確認されれば、フィブリンＩのプラスミンタンパ
ク質加水分解が強く示唆されるであろう。他方、逆の発
見であれば、フィブリンＩがさらに分解されてフィブリ
ンＩＩが生じることが指摘されるであろう。前述したよ
うに、フィブリンＩＩのプラスミン分解はＢβ１−４２
を決して生じることがない。
的ルートを取るのかを決定することは非常に望ましいこ
とである。これを行う１つのアプローチは、臨床サンプ
ル中のＢβ鎖ペプチドの分子性状を同定することであ
る。たとえば、Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４および１
５−４２を含有するペプチドフラグメントの一指標と合
わせ、患者の血漿中で無傷Ｂβ１−４２が支配的である
ことが確認されれば、フィブリンＩのプラスミンタンパ
ク質加水分解が強く示唆されるであろう。他方、逆の発
見であれば、フィブリンＩがさらに分解されてフィブリ
ンＩＩが生じることが指摘されるであろう。前述したよ
うに、フィブリンＩＩのプラスミン分解はＢβ１−４２
を決して生じることがない。
Ｍａｔｓｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｉｅｎｃｅ，２
２２，１１２９−１１３２，１９８３，においてＳＰ２
／０骨髄腫細胞系の細胞と、人フィブリンのＢβ鎖のア
ミノ末端の合成ヘプタペプチド、ヘプタペプチドのカル
ボキシ末端に位置するシスティン残基およびＭＢ−ＫＬ
Ｈ（マレイミドベンゾイル化キーホールリンペットヘモ
シアニンン）からなる複合体で免疫にされた雌ＢＡＬＢ
／Ｃマウスからの脾臓細胞との融合から調製されるハイ
ブリドーマから人フィブリンに結合する３つのモノクロ
ナール抗体を開発したことが述べられている。モノクロ
ナール抗体の１つは、人以外の種からのフィブリンたと
えばラビットフィブリンと交差反応した。
２２，１１２９−１１３２，１９８３，においてＳＰ２
／０骨髄腫細胞系の細胞と、人フィブリンのＢβ鎖のア
ミノ末端の合成ヘプタペプチド、ヘプタペプチドのカル
ボキシ末端に位置するシスティン残基およびＭＢ−ＫＬ
Ｈ（マレイミドベンゾイル化キーホールリンペットヘモ
シアニンン）からなる複合体で免疫にされた雌ＢＡＬＢ
／Ｃマウスからの脾臓細胞との融合から調製されるハイ
ブリドーマから人フィブリンに結合する３つのモノクロ
ナール抗体を開発したことが述べられている。モノクロ
ナール抗体の１つは、人以外の種からのフィブリンたと
えばラビットフィブリンと交差反応した。
定義 ＦＰＡ：フィブリノペプチドＡ（Ａα１−１６）。
ＦＰＢ：フィブリノペプチドＢ（Ａβ１−１４）。
フィブリンＩ：フィブリノーゲンをヘビ毒酵素バトロキ
ソビンで凝固させることにより調製されるＦＰＡを欠除
しているフィビリン。
ソビンで凝固させることにより調製されるＦＰＡを欠除
しているフィビリン。
フィブリンＩＩ：フィブリノーゲンのトロンビン分解か
ら得られる完全形成フィビリン（ＦＰＡおよびＦＰＢを
含まない）。
ら得られる完全形成フィビリン（ＦＰＡおよびＦＰＢを
含まない）。
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー。
ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４１８ ：１９８３年１１月９日に寄託されたＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２（以下「ＡＴＣ
Ｃ」）によるＨＢ８４１８の名称が与えられたマウスリ
ンパ球ハブリドーマ（寄託者記号：１−８ｃ６）。
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２（以下「ＡＴＣ
Ｃ」）によるＨＢ８４１８の名称が与えられたマウスリ
ンパ球ハブリドーマ（寄託者記号：１−８ｃ６）。
ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４２６ ：１９８３年１１月１６日に寄託されたＡＴＴＣにより
ＨＢ８４２６の名称が与えられたマウスリンパ球ハイブ
リドーマ（寄託者記号：Ｔ２Ｇｌｓ）。
ＨＢ８４２６の名称が与えられたマウスリンパ球ハイブ
リドーマ（寄託者記号：Ｔ２Ｇｌｓ）。
単一特異性抗体：単一の抗原と結合する抗体。単一の抗
原決定基に対して単一特異性である単一特異性抗体は前
記抗原決定基（エピトープ）とのみ結合する。
原決定基に対して単一特異性である単一特異性抗体は前
記抗原決定基（エピトープ）とのみ結合する。
ヘテロ分子抗体：同一抗体の多数の異なる分子形態を含
有する抗体。
有する抗体。
ホモ分子抗体：単一分子形態のみを含有する抗体、すな
わち、各抗体分子は各他の抗体分子と同じである。
わち、各抗体分子は各他の抗体分子と同じである。
モノクロナール抗体 ：発生的には同一でホモ分子抗体を産生する単一細胞系
から誘導される抗体。
から誘導される抗体。
ＭＡｂ／１−８ｃ６：モノクロナール抗体１−８ｃ６、
ＡＴＣＣＨＢ８４１８と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。
ＡＴＣＣＨＢ８４１８と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。
ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ：モノクロナール抗体Ｔ２Ｇｌｓ、
ＡＴＣＣＨＢ８４２６と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。
ＡＴＣＣＨＢ８４２６と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。
Ｎ−ＤＳＫ：ＣＮＢｒ分解により得られる人フィブリノ
ーゲンのＮＨ２末端部分、分子式（Ａα１−５１、Ｂβ
１−１１８、γ１−７８）２、分子量５８．０００（分
子量はゲル電気泳動により測定）。
ーゲンのＮＨ２末端部分、分子式（Ａα１−５１、Ｂβ
１−１１８、γ１−７８）２、分子量５８．０００（分
子量はゲル電気泳動により測定）。
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ：フィブリノーゲンをヘビ毒酵素バト
ロキソビンで凝固させることにより調製された人フィブ
リンから得られるＣＮＢｒプラグメント。（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫは、ＦＰＡを欠除し、したがって、その分子式は
（Ａα１７−５１、Ｂβ１−１１８、γ１−７８）２で
分子量５５．０００（分子量はゲル電気泳動により測
定）である点においてＮ−ＤＳＫと異なる。
ロキソビンで凝固させることにより調製された人フィブ
リンから得られるＣＮＢｒプラグメント。（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫは、ＦＰＡを欠除し、したがって、その分子式は
（Ａα１７−５１、Ｂβ１−１１８、γ１−７８）２で
分子量５５．０００（分子量はゲル電気泳動により測
定）である点においてＮ−ＤＳＫと異なる。
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ：フィブリノーゲンを人トロンビンで
凝固させるかまたはＮ−ＤＳＫを同じ酵素で活性化する
ことにより調製された人フィブリンから得られるＣＮＢ
ｒフラグメント。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＦＰＡもまたＦＰ
Ｂも欠除しており、分子式（Ａα１７−５１、Ｂβ１５
−１８、γ１−７８）２および分子量５２．０００（分
子量はゲル電気泳動により測定）を有する。
凝固させるかまたはＮ−ＤＳＫを同じ酵素で活性化する
ことにより調製された人フィブリンから得られるＣＮＢ
ｒフラグメント。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＦＰＡもまたＦＰ
Ｂも欠除しており、分子式（Ａα１７−５１、Ｂβ１５
−１８、γ１−７８）２および分子量５２．０００（分
子量はゲル電気泳動により測定）を有する。
ＣＮＢｒ：臭化シアン。
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム。
ＴＰＢＳ：０．０５％トゥイーン２０をさらに含有する
燐酸塩−生理的食塩水緩衝液。
燐酸塩−生理的食塩水緩衝液。
ＥＬＩＳＡ：エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
セイ。
セイ。
ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ。
Ａ４９０：波長４９０ｎｍにおける吸光度。
Ｓａｃ−Ｃｅｌ：ロバ抗マウスセルロース懸濁液。
動物：ことわりがない限り、本発明で使用する「動物」
は、人間以外の温血動物を意味する。
は、人間以外の温血動物を意味する。
発明の概要 モノクロナール抗体の製造方法が新たに見い出された。
そのようなモノクロナール抗体は単一特異性でもある。
そのようにして産生される新規なモノクロナール抗体
は、ＭＡｂ／１−８ｃ６およびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと称
される。これらのモノクロナール抗体を産生するハイブ
リドーマは各々１−８ｃ６（ＡＴＣＣＨＢ８４１８）お
よびＴ２Ｇｌｓ（ＡＴＣＣＨＢ８４２６）と称される。
そのようなモノクロナール抗体は単一特異性でもある。
そのようにして産生される新規なモノクロナール抗体
は、ＭＡｂ／１−８ｃ６およびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと称
される。これらのモノクロナール抗体を産生するハイブ
リドーマは各々１−８ｃ６（ＡＴＣＣＨＢ８４１８）お
よびＴ２Ｇｌｓ（ＡＴＣＣＨＢ８４２６）と称される。
ハイブリドーマ、したがってモノクロナール抗体の産生
方法は、動物細胞たとえばマウス骨髄腫細胞たとえばマ
ウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を、動物たとえばマウス
たとえばＢＡＬＢ／ｃｊマウスからの脾臓細胞と融合さ
せることを含んでなる。
方法は、動物細胞たとえばマウス骨髄腫細胞たとえばマ
ウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を、動物たとえばマウス
たとえばＢＡＬＢ／ｃｊマウスからの脾臓細胞と融合さ
せることを含んでなる。
ＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、マウスは人フィブリノーゲ
ンまたはフィブリンＩのＮＨ２末端プラグメントにより
免疫され、新規なハイブリドーマすなわち１−８ｃ６が
形成される。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、マウスは人フ
ィブリンＩＩのＮＨ２末端フラグメントにより免疫さ
れ、新規なハイブリドーマすなわちＴ２Ｇｌｓが形成さ
れる。得られるハイブリドーマは分離され、ＨＡｂ／８
ｃ６の場合には人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＮＨ２末端フラグメントに対して、またＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓの場合、人フィブリンＩＩのＮＨ２末端フラグメ
ントに対して単一特異性抗体を産生するハイブリドーマ
が選ばれる。
ンまたはフィブリンＩのＮＨ２末端プラグメントにより
免疫され、新規なハイブリドーマすなわち１−８ｃ６が
形成される。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、マウスは人フ
ィブリンＩＩのＮＨ２末端フラグメントにより免疫さ
れ、新規なハイブリドーマすなわちＴ２Ｇｌｓが形成さ
れる。得られるハイブリドーマは分離され、ＨＡｂ／８
ｃ６の場合には人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＮＨ２末端フラグメントに対して、またＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓの場合、人フィブリンＩＩのＮＨ２末端フラグメ
ントに対して単一特異性抗体を産生するハイブリドーマ
が選ばれる。
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのフラグメント
は、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＣＮＢｒ
による分解により形成することが出来る。そのようなＣ
ＮＢｒ分解の人フィブリノーゲンのフラグメントはＮ−
ＤＳＫである。使用出来る人フィブリノーゲンまたはフ
ィブリンＩの他のフラグメントはＢβ１−１１８および
Ｂβ１−４２である。本発明において使用出来るフィブ
リンＩのフラグメントは（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫである。
は、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＣＮＢｒ
による分解により形成することが出来る。そのようなＣ
ＮＢｒ分解の人フィブリノーゲンのフラグメントはＮ−
ＤＳＫである。使用出来る人フィブリノーゲンまたはフ
ィブリンＩの他のフラグメントはＢβ１−１１８および
Ｂβ１−４２である。本発明において使用出来るフィブ
リンＩのフラグメントは（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫである。
人フィブリンＩＩのフラグメントは、フィブリンＩＩの
ＣＮＢｒによる分解により形成することが出来る。人フ
ィブリンＩＩのフラグメントは（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫであ
る。使用出来る人フィブリンＩＩの他のフラグメントは
Ｂβ１５−１１８おおよびＢβ１５−４２である。
ＣＮＢｒによる分解により形成することが出来る。人フ
ィブリンＩＩのフラグメントは（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫであ
る。使用出来る人フィブリンＩＩの他のフラグメントは
Ｂβ１５−１１８おおよびＢβ１５−４２である。
ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８４１８は、単一特
異性抗体ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生する。このＭＡｂ／
１−８ｃ６は、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフ
ラグメントと反応するが、しかし人フィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−１４また
は１５−４２を含有するペプチドフラグメントとは反応
しない。したがって、ＭＡｂ／１−８ｃ６はＢβ１４Ａ
ｒｇ−１５Ｇｌｙ結合内のまたはその周りのエピトープ
（抗原決定基）と認められ、したがって人フィブリノー
ゲン、またはフィブリンＩおよびフィブリンＩＩのＢβ
鎖から誘導されるＮＨ２末端ペプチド間の識別を行う。
異性抗体ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生する。このＭＡｂ／
１−８ｃ６は、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフ
ラグメントと反応するが、しかし人フィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−１４また
は１５−４２を含有するペプチドフラグメントとは反応
しない。したがって、ＭＡｂ／１−８ｃ６はＢβ１４Ａ
ｒｇ−１５Ｇｌｙ結合内のまたはその周りのエピトープ
（抗原決定基）と認められ、したがって人フィブリノー
ゲン、またはフィブリンＩおよびフィブリンＩＩのＢβ
鎖から誘導されるＮＨ２末端ペプチド間の識別を行う。
ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８４２６は、単一特
異性抗体ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生する。この ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメントと
反応するが、しかし人フィブリノーゲンまたはフィブリ
ンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２または１−１４を
含有するペプチドフラグメントと反応しない。したがっ
て、ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはフィブリンＩＩのＢβ鎖上の
エピトープと認められるが、しかしフィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖上のエピナープでない。
異性抗体ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生する。この ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメントと
反応するが、しかし人フィブリノーゲンまたはフィブリ
ンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２または１−１４を
含有するペプチドフラグメントと反応しない。したがっ
て、ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはフィブリンＩＩのＢβ鎖上の
エピトープと認められるが、しかしフィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖上のエピナープでない。
ＭＡｂ／１−８ｃ６は、人フィブリノーゲン、フィブリ
ンＩまたはこのいずれかから誘導されたペプチド（アミ
ノ酸残基１−４２を含有する）のＢβ鎖上の単一決定基
に対して単一特異性である。
ンＩまたはこのいずれかから誘導されたペプチド（アミ
ノ酸残基１−４２を含有する）のＢβ鎖上の単一決定基
に対して単一特異性である。
ＭＡｂ／１−８ｃ６は他の抗人フィブリノーゲン抗体を
含有しない。このことは、本来的に汚染されている従来
技術の抗血清およびＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合中
またはその周囲のエピトープに対して特異性でない従来
技術のモノクロナール抗体と対照をなす。
含有しない。このことは、本来的に汚染されている従来
技術の抗血清およびＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合中
またはその周囲のエピトープに対して特異性でない従来
技術のモノクロナール抗体と対照をなす。
ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、人フィブリンＩＩのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメント
上の単一決定基に対して単一特異性である。ＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓは、本来的に汚染される従来技術の抗血清とは
違ってまたフィブリンＩＩのＢβ鎖上のエピトープに対
して特異性でない従来技術のモノクロナール抗体とは違
って、他の抗人免疫グロブリンを実質的に含有しない。
ミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメント
上の単一決定基に対して単一特異性である。ＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓは、本来的に汚染される従来技術の抗血清とは
違ってまたフィブリンＩＩのＢβ鎖上のエピトープに対
して特異性でない従来技術のモノクロナール抗体とは違
って、他の抗人免疫グロブリンを実質的に含有しない。
ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、フィブリンＩＩのアミノ酸残基
１５−４２を含有する人ペプチドフラグメントに対して
も特異性である。すなわち、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは人フ
ィブリノーゲンのトロンビン分解により生じる産物と反
応するが、しかしある動物フィブリノーゲンたとえばラ
ビットフィブリノーゲンのトロンビン分解から得られる
産物とは反応しない。
１５−４２を含有する人ペプチドフラグメントに対して
も特異性である。すなわち、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは人フ
ィブリノーゲンのトロンビン分解により生じる産物と反
応するが、しかしある動物フィブリノーゲンたとえばラ
ビットフィブリノーゲンのトロンビン分解から得られる
産物とは反応しない。
本発明の新規なハイブリドーマは、培養して抗体を産生
させることが出来るが、この際動物に免疫し、殺すこ
と、およびついで従来技術の不純な抗血清を得るために
さえ必要な冗長な吸着・精製工程を必要としない。
させることが出来るが、この際動物に免疫し、殺すこ
と、およびついで従来技術の不純な抗血清を得るために
さえ必要な冗長な吸着・精製工程を必要としない。
免疫グロブリン分子はすべて２つの同じＬ鎖（ＭＷ２
５，０００）と２つの同じＨ鎖（ＭＷ５０，０００）が
ジスルフィド結合により四量体として結合されたものか
らなる。各鎖は概念上構造的および機能的意味を有する
特異性ドメインまたは領域に分けることが出来る。カル
ボキシ末端側のＬ鎖の半分は不変部と呼ばれ、アミノ末
端の半分はＬ鎖の可変部である。アミノ末端に位置する
Ｈ鎖のほぼ１／４は可変部と呼ばれ、Ｈ鎖の他の３／４
はＨ鎖の不変部と呼ばれる。
５，０００）と２つの同じＨ鎖（ＭＷ５０，０００）が
ジスルフィド結合により四量体として結合されたものか
らなる。各鎖は概念上構造的および機能的意味を有する
特異性ドメインまたは領域に分けることが出来る。カル
ボキシ末端側のＬ鎖の半分は不変部と呼ばれ、アミノ末
端の半分はＬ鎖の可変部である。アミノ末端に位置する
Ｈ鎖のほぼ１／４は可変部と呼ばれ、Ｈ鎖の他の３／４
はＨ鎖の不変部と呼ばれる。
４クラスのＨ鎖がマウスに見い出されており、これらの
クラスは化学的差異により識別することが出来る。Ｈ鎖
の種類は免疫グロブリンのクラスを、したがって、その
エフェクター作用を決定する。５つの免疫グロブリンク
ラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存
在する。マウスＩｇＧの４クラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３と呼ばれる。
クラスは化学的差異により識別することが出来る。Ｈ鎖
の種類は免疫グロブリンのクラスを、したがって、その
エフェクター作用を決定する。５つの免疫グロブリンク
ラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存
在する。マウスＩｇＧの４クラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３と呼ばれる。
ＭＡｂ／１−８ｃ６はクラスＩｇＧおよびサブクラスＩ
ｇＧ２ａに属している。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはクラスＩ
ｇＧおよびサブグラスＩｇＧ１に属している。
ｇＧ２ａに属している。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはクラスＩ
ｇＧおよびサブグラスＩｇＧ１に属している。
したがって、前述の利点を達成するに当って、本発明は
２つのハイブリドーマ、すなわち人フィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含
有するペプチドフラグメントに対して抗体を産生するハ
イブリドーマおよび人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ
酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメントに対
して抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
２つのハイブリドーマ、すなわち人フィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含
有するペプチドフラグメントに対して抗体を産生するハ
イブリドーマおよび人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ
酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメントに対
して抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
さらに、本発明は、生体内でのフィブリノーゲンタンパ
ク質加水分解経路の性質を決定する方法を提供する。
ク質加水分解経路の性質を決定する方法を提供する。
また、本発明は、本発明のモノクロナール抗体を用いる
疾病の診断方法を提供する。
疾病の診断方法を提供する。
また、本発明は、閉塞性血栓症になる恐れのあるまたは
現にかかっている患者の血流からフィブリンＩＩを治療
により除去する方法を提供する。
現にかかっている患者の血流からフィブリンＩＩを治療
により除去する方法を提供する。
一般に、本発明によるモノクロナール抗体を産生するハ
イブリドーマは、Ｋｈｌｏｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎの方法により調製される。ＭＡｂ／１−８ｃ６の産
生の場合はＮ−ＤＳＫの溶液をまたはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ
ａの産生の場合は（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫの溶液によりマウス
を免疫した後、免疫したマウスの脾臓細胞を、マウス骨
髄腫系からの細胞と融合させる。得られたハイブリドー
マからのクローン培養液をスクリーニングし、人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−４２を含有するペプチドフラグメントに（ＭＡｂ／
１−８ｃ６の産生の場合）、または人フィブリンＩＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフ
ラグメントに（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産生の場合）選択
的に結合する抗体を含有する上澄液を含む培養液を得
る。
イブリドーマは、Ｋｈｌｏｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎの方法により調製される。ＭＡｂ／１−８ｃ６の産
生の場合はＮ−ＤＳＫの溶液をまたはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ
ａの産生の場合は（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫの溶液によりマウス
を免疫した後、免疫したマウスの脾臓細胞を、マウス骨
髄腫系からの細胞と融合させる。得られたハイブリドー
マからのクローン培養液をスクリーニングし、人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−４２を含有するペプチドフラグメントに（ＭＡｂ／
１−８ｃ６の産生の場合）、または人フィブリンＩＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフ
ラグメントに（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産生の場合）選択
的に結合する抗体を含有する上澄液を含む培養液を得
る。
強調すべきことは、ハイブリッド調製物の性状は予知出
来ないために、１つの抗原または細胞系からの他の抗原
または細胞系への外挿が不可能なことである。
来ないために、１つの抗原または細胞系からの他の抗原
または細胞系への外挿が不可能なことである。
本発明の方法により製造されるハイブリドーマから誘導
されるモノクロナール抗体は、血栓症にかかる恐れのあ
るまたはかかっている患者の血液に発生するフィブリン
分子の性状を決定するために臨床研究において診断薬と
して有用である。血栓症は多数の病状と関連があるが、
また手術前、中または後ならびに他の外傷状態でも起り
得る。血液透析患者に対するヘパリン治療の効果を、本
発明の診断薬を介してフィブリノーゲンまたはフィブリ
ン分解産物の血漿濃度を測定することにより検査するこ
とも出来る。ストレプトキナーゼまたは組織型プラスミ
ノーゲンアクチベータを用いる血栓症治療の効果を、本
発明の抗体を用いて検査することも出来る。
されるモノクロナール抗体は、血栓症にかかる恐れのあ
るまたはかかっている患者の血液に発生するフィブリン
分子の性状を決定するために臨床研究において診断薬と
して有用である。血栓症は多数の病状と関連があるが、
また手術前、中または後ならびに他の外傷状態でも起り
得る。血液透析患者に対するヘパリン治療の効果を、本
発明の診断薬を介してフィブリノーゲンまたはフィブリ
ン分解産物の血漿濃度を測定することにより検査するこ
とも出来る。ストレプトキナーゼまたは組織型プラスミ
ノーゲンアクチベータを用いる血栓症治療の効果を、本
発明の抗体を用いて検査することも出来る。
本発明の具体的説明 本発明による、ハイブリドーマおよびそのハイブリドー
マによって産生される抗体の製造方法は、形質転換され
た動物細胞たとえば骨髄腫細胞を動物の脾臓細胞と融合
させることにより行うことが出来る。しかしながら、マ
ウス骨髄腫細胞およびマウス脾臓細胞を使用することが
好ましく、したがって、以下、本発明はマウス骨髄腫細
胞およびマウス脾臓細胞を用いて記載される。
マによって産生される抗体の製造方法は、形質転換され
た動物細胞たとえば骨髄腫細胞を動物の脾臓細胞と融合
させることにより行うことが出来る。しかしながら、マ
ウス骨髄腫細胞およびマウス脾臓細胞を使用することが
好ましく、したがって、以下、本発明はマウス骨髄腫細
胞およびマウス脾臓細胞を用いて記載される。
本発明によれば、ＭＡｂ／１−８ｃ６（人フィブリノー
ゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４
２を含有するペプチドフラグメントと反応するがしかし
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−１４または１５−４２を含有するペプチド
フラグメントと反応しない）またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ
（人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
を含有するペプチドフラグメントと反応するがしかし人
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ
酸残基１−１４または１−４２を含有するペプチドフラ
グメントと反応しない）を産生するハイブリドーマの調
製方法は、一般に下記工程からなる： Ａ．ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の場合にはＮ−ＤＳＫ、
Ｂβ１−１１８、Ｂβ１−４２または（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
を、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産生の場合には（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１５−１１８またはＢβ１５−４２に
よりマウスを免疫する工程。Ｎ−ＤＳＫはフィブリノー
ゲンから調製され、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫのト
ロンビン分解により調製される。ＢＡＬＢ／ｃＪマウス
が好ましいが、他のマウス系統が使用出来る。免疫感作
スケジュールおよび免疫原濃度は、適当に感作された脾
細胞の有効量を生じるものとする。ＭＡｂ／１−８ｃ６
を産生するためには、Ｎ−ＤＳＫ溶液（４ｍｇ／ｍｌの
エマルジョン０．１ｍｌおよび等容量の完全フロイント
アジュバンドを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、次いで一
週間おきに不完全フロイントアジュバントを用いて同じ
投与量の二次免疫注射を４回行い、次いで１０週間後に
０．１ｍｇＮ−ＤＳＷをトリス−生理的食塩水に溶解し
たものを静脈（ｉ．ｖ．）注射してマウスを免疫する。
ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生するには、１００ｕｇの
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバントと混合
したものを腹腔内に注射し、次いで不完全フロイントア
ジュバントを用いて同じ投与量の二次免疫静脈注射を４
回行い、次いで１００μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫをトリス
−生理的食塩水に溶解したものを静脈注射して、マウス
を免疫する。
ゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４
２を含有するペプチドフラグメントと反応するがしかし
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−１４または１５−４２を含有するペプチド
フラグメントと反応しない）またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ
（人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
を含有するペプチドフラグメントと反応するがしかし人
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ
酸残基１−１４または１−４２を含有するペプチドフラ
グメントと反応しない）を産生するハイブリドーマの調
製方法は、一般に下記工程からなる： Ａ．ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の場合にはＮ−ＤＳＫ、
Ｂβ１−１１８、Ｂβ１−４２または（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
を、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産生の場合には（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１５−１１８またはＢβ１５−４２に
よりマウスを免疫する工程。Ｎ−ＤＳＫはフィブリノー
ゲンから調製され、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫのト
ロンビン分解により調製される。ＢＡＬＢ／ｃＪマウス
が好ましいが、他のマウス系統が使用出来る。免疫感作
スケジュールおよび免疫原濃度は、適当に感作された脾
細胞の有効量を生じるものとする。ＭＡｂ／１−８ｃ６
を産生するためには、Ｎ−ＤＳＫ溶液（４ｍｇ／ｍｌの
エマルジョン０．１ｍｌおよび等容量の完全フロイント
アジュバンドを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、次いで一
週間おきに不完全フロイントアジュバントを用いて同じ
投与量の二次免疫注射を４回行い、次いで１０週間後に
０．１ｍｇＮ−ＤＳＷをトリス−生理的食塩水に溶解し
たものを静脈（ｉ．ｖ．）注射してマウスを免疫する。
ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生するには、１００ｕｇの
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバントと混合
したものを腹腔内に注射し、次いで不完全フロイントア
ジュバントを用いて同じ投与量の二次免疫静脈注射を４
回行い、次いで１００μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫをトリス
−生理的食塩水に溶解したものを静脈注射して、マウス
を免疫する。
Ｂ．各免疫されたマウスから脾臓を摘出し、各脾臓から
の細胞を適当な媒体たとえばＲＰＭＩ１６４０に分散さ
せた懸濁液を調製する。。
の細胞を適当な媒体たとえばＲＰＭＩ１６４０に分散さ
せた懸濁液を調製する。。
Ｃ．懸濁脾臓細胞を適当な細胞系からのマウス骨髄腫細
胞とたとえば適当な融合促進剤たとえばＰＥＧ１０００
を用いて融合させる工程。好ましい割合は、ＭＡｂ／１
−８ｃ６産生の場合、骨髄腫細胞当り１ｇで４個の脾臓
細胞であり、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、骨髄腫細胞当
り７個の脾臓細胞である。約１０８個の脾細胞に対して
全量で約０．５−１．０ｍｌの融合媒体が適当である。
多くのマウス骨髄腫細胞系は公知であり、一般に学界の
メンバーまたは種々の寄託バンクたとえばＳａｌｋ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ
ｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手出
来る。使用する細胞系は、融合しない骨髄腫細胞が選択
培地で生き残らず、ハイブリッドが生き残るように、い
わゆる「薬物耐性」型であるのが好ましい。最も普通の
クラスは８−アザグアニン耐性細胞系であるが、このも
のは酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼを欠除しており、したがって、ＨＡＴ（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地に
よって育成されない。また、使用する骨髄腫細胞系は、
それ自身では抗体を全く産生しないのでいわゆる「非分
泌」型であるのが好ましい（分泌型も使用出来るけれど
も）。しかしながら、ある場合には、分泌型骨髄腫系が
好ましい。
胞とたとえば適当な融合促進剤たとえばＰＥＧ１０００
を用いて融合させる工程。好ましい割合は、ＭＡｂ／１
−８ｃ６産生の場合、骨髄腫細胞当り１ｇで４個の脾臓
細胞であり、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、骨髄腫細胞当
り７個の脾臓細胞である。約１０８個の脾細胞に対して
全量で約０．５−１．０ｍｌの融合媒体が適当である。
多くのマウス骨髄腫細胞系は公知であり、一般に学界の
メンバーまたは種々の寄託バンクたとえばＳａｌｋ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏ
ｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手出
来る。使用する細胞系は、融合しない骨髄腫細胞が選択
培地で生き残らず、ハイブリッドが生き残るように、い
わゆる「薬物耐性」型であるのが好ましい。最も普通の
クラスは８−アザグアニン耐性細胞系であるが、このも
のは酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼを欠除しており、したがって、ＨＡＴ（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地に
よって育成されない。また、使用する骨髄腫細胞系は、
それ自身では抗体を全く産生しないのでいわゆる「非分
泌」型であるのが好ましい（分泌型も使用出来るけれど
も）。しかしながら、ある場合には、分泌型骨髄腫系が
好ましい。
好ましい融合促進剤は平均分子量が約１０００〜約４０
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０００等とし
て市販されている）であるが、当業者で公知の他の融合
促進剤も使用することが出来る。
００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０００等とし
て市販されている）であるが、当業者で公知の他の融合
促進剤も使用することが出来る。
Ｄ．別個の容器、たとえばミクロタイタープレートの別
個のウエルで、未融合脾細胞、末融合骨髄腫細胞および
融合細胞の混合物を、未融合骨髄腫細胞が生育しない選
択培地で未融合細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
４−１６日）の間希釈して培養する工程。希釈は、希釈
剤の容量が各別々の容器（たとえばミクロタイタープレ
ートの各ウエル）である数の細胞（たとえば１−４）を
単離させるように統計的に計算された限界希釈でよい。
培地は薬物耐性（たとえば８−アザグアニン耐性）未融
合骨髄腫細胞系が生育しないもの（たとえばＨＡＴ培
地）である。したがって、これらの骨髄腫細胞は死滅す
る。未融合脾臓細胞は悪性でないから、有限の世代数し
か有しない。したがって、ある時間（約１４−１６日）
後、これらの未融合脾細胞は生殖することが出来ない。
他方、融合細胞は骨髄腫親の悪性特性および選択培地で
生き残る能力を有しているので生殖し続ける。
個のウエルで、未融合脾細胞、末融合骨髄腫細胞および
融合細胞の混合物を、未融合骨髄腫細胞が生育しない選
択培地で未融合細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
４−１６日）の間希釈して培養する工程。希釈は、希釈
剤の容量が各別々の容器（たとえばミクロタイタープレ
ートの各ウエル）である数の細胞（たとえば１−４）を
単離させるように統計的に計算された限界希釈でよい。
培地は薬物耐性（たとえば８−アザグアニン耐性）未融
合骨髄腫細胞系が生育しないもの（たとえばＨＡＴ培
地）である。したがって、これらの骨髄腫細胞は死滅す
る。未融合脾臓細胞は悪性でないから、有限の世代数し
か有しない。したがって、ある時間（約１４−１６日）
後、これらの未融合脾細胞は生殖することが出来ない。
他方、融合細胞は骨髄腫親の悪性特性および選択培地で
生き残る能力を有しているので生殖し続ける。
Ｅ．ハイブリドーマを含有する各容器（ウエル）の上澄
み液について、（１）ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合
は、Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体〔フィブリノーゲン、
Ｎ−ＤＳＫ、またはそれらのフラグメント、たとえば
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（Ｎ−ＤＳＫのバトロキソビン分解産
物）およびＢβ１−１１８〕に対する抗体の存在および
Ｎ−ＤＳＫのＡα１−５１またはα１−７８鎖、トロン
ビン分解Ｂβ１−１１８、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、遊離Ｂβ
１−１４（ＦＰＢ）またはＢβ１５−４２に対する抗体
の不存在についておよび（２）ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ産生
の場合は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体（フィブ
リンＩＩ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、トロンビン分解Ｂβ１−
４２およびＢβ１５−４２）に対する抗体の存在および
無傷フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫまたは（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫまたはＢβ１−４２に対する抗体の不存在について
評価する工程。
み液について、（１）ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合
は、Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体〔フィブリノーゲン、
Ｎ−ＤＳＫ、またはそれらのフラグメント、たとえば
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（Ｎ−ＤＳＫのバトロキソビン分解産
物）およびＢβ１−１１８〕に対する抗体の存在および
Ｎ−ＤＳＫのＡα１−５１またはα１−７８鎖、トロン
ビン分解Ｂβ１−１１８、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、遊離Ｂβ
１−１４（ＦＰＢ）またはＢβ１５−４２に対する抗体
の不存在についておよび（２）ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ産生
の場合は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体（フィブ
リンＩＩ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、トロンビン分解Ｂβ１−
４２およびＢβ１５−４２）に対する抗体の存在および
無傷フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫまたは（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫまたはＢβ１−４２に対する抗体の不存在について
評価する工程。
Ｆ．所望の抗体、たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントと反
応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４ま
たは１５−４２のみしか含有しないペプチドフラグメン
トと反応しない抗体を、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場
合、人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４
２を含有するペプチドフラグメントと反応するが、しか
し人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１−１４または１−４２を含有するペプチド
フラグメントと反応しない抗体を産生するハイブリドー
マを選択（たとえば限界希釈により）・クローン化する
工程。
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントと反
応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４ま
たは１５−４２のみしか含有しないペプチドフラグメン
トと反応しない抗体を、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場
合、人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４
２を含有するペプチドフラグメントと反応するが、しか
し人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１−１４または１−４２を含有するペプチド
フラグメントと反応しない抗体を産生するハイブリドー
マを選択（たとえば限界希釈により）・クローン化する
工程。
所望のハイブリドーマを選択し、クローン化したら、生
成抗体を２つの方法のうち１つの方法で産生することが
出来る。最も純粋なモノクロナール抗体は、所望のハイ
ブリドーマを適当な培地で適当な時間の間生体外培養
し、次いでクローンの上澄み液から所望の抗体を取得す
ることにより産生される。適当な培地および適当な培養
時間は公知でありまた容易に決定される。この生体外技
術により他の抗人免疫グロブリンを含まないモノクロナ
ール抗体が産生される。培地は異種血清（たとえば、ウ
シ胎児血清）を含有するので少量の他の免疫グロブリン
が存在する。しかしながら、この生体外方法では、ある
目的に対して十分な量または濃度の抗体を産生すること
が出来ない。これは、モノクロナール抗体の濃度が約５
０μｇ／ｍｌに過ぎないからである。
成抗体を２つの方法のうち１つの方法で産生することが
出来る。最も純粋なモノクロナール抗体は、所望のハイ
ブリドーマを適当な培地で適当な時間の間生体外培養
し、次いでクローンの上澄み液から所望の抗体を取得す
ることにより産生される。適当な培地および適当な培養
時間は公知でありまた容易に決定される。この生体外技
術により他の抗人免疫グロブリンを含まないモノクロナ
ール抗体が産生される。培地は異種血清（たとえば、ウ
シ胎児血清）を含有するので少量の他の免疫グロブリン
が存在する。しかしながら、この生体外方法では、ある
目的に対して十分な量または濃度の抗体を産生すること
が出来ない。これは、モノクロナール抗体の濃度が約５
０μｇ／ｍｌに過ぎないからである。
さらに高濃度の純度がわずかに劣るモノクロナール抗体
を産生するには、所望のハイブリドーマクローンをマウ
ス、好ましくは同系または半同系マウスに転移、すなわ
ち腹腔内注射することが出来る。ハイブリドーマは適当
な培養時間後、抗体産生腫瘍を形成し、この腫瘍は、宿
主マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）中に高濃度
（約５−２０ｍｇ／）の所望の抗体を生じる。これら
の宿主マウスも血液および腹水中に正常抗体を有するけ
れども、これらの正常抗体の濃度はモノクロナール抗体
の濃度の約５％に過ぎない。さらに、これらの正常抗体
は特異性が抗人性でないので、産生された悪性腹水から
または血清から得られたモノクロナール抗体は汚染性抗
人免疫グロブリンを実質的に含んでいない。このモノク
ロナール抗体は高力価を有し、非特異性免疫グロブリン
に対する特異性の割合が大きい。
を産生するには、所望のハイブリドーマクローンをマウ
ス、好ましくは同系または半同系マウスに転移、すなわ
ち腹腔内注射することが出来る。ハイブリドーマは適当
な培養時間後、抗体産生腫瘍を形成し、この腫瘍は、宿
主マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）中に高濃度
（約５−２０ｍｇ／）の所望の抗体を生じる。これら
の宿主マウスも血液および腹水中に正常抗体を有するけ
れども、これらの正常抗体の濃度はモノクロナール抗体
の濃度の約５％に過ぎない。さらに、これらの正常抗体
は特異性が抗人性でないので、産生された悪性腹水から
または血清から得られたモノクロナール抗体は汚染性抗
人免疫グロブリンを実質的に含んでいない。このモノク
ロナール抗体は高力価を有し、非特異性免疫グロブリン
に対する特異性の割合が大きい。
専門技術者が血漿サンプルをテストして本発明のモノク
ロナール抗体が単一特異性を示す対象である孔原の存在
量（たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、人ブィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有するペプチドフラグメントの量、またはＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、人フィブリンＩＩのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメント
の量）を測定出来る方法は次のようである。
ロナール抗体が単一特異性を示す対象である孔原の存在
量（たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、人ブィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有するペプチドフラグメントの量、またはＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、人フィブリンＩＩのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメント
の量）を測定出来る方法は次のようである。
患者からある間隔で血液を集め、その血液から血漿を取
り出す。血漿サンプルを迅速に「処理」（ｐｒｏｃｅｓ
ｓｅｄ）」し、すなわち氷冷エタノールで処理し〔５０
％最終濃度〕、Ｂβ鎖から誘導されるフィブリノーゲン
／フィブリンペプチドを単離する。エタノール上澄液は
一般に凍結乾燥して溶剤を除去すると共に抽出液を濃縮
する。「処理」血漿サンプルを２つの部分すなわち、Ｂ
β１−４２の存在を検出するために使用される部分と、 Ｂβ１５−４２の存在を検出するために使用される部分
に分割することが出来る。エタノール抽出液中に存在す
るペプチド水準は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）か
またはエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により測定することが出来る。たとえ
ば、エタノール抽出液の種種の希釈液を、一定量の動物
モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６および
たとえば人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ
鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する放射能標識ペプチ
ドフラグメントからなる競合的放射能標識抗原、たとえ
ば動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６
と結合することが出来る１２５ＩＢβ１−４２リガンド
と混合する。また、エタノール抽出液の種々の希釈液
を、一定量の動物モノクロナール抗体たとえばＭＡＤ／
Ｔ２Ｇｌｓおよび人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸
残基１５−４２を含有する放射能標識ペプチドフラグメ
ントからなる競合的放射能標識抗原と混合する（この競
合的放射能標識抗原たとえば１２５ＩＢβ１５−４２リ
ガンドは動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓと結合することが出来る。両方の場合共、適当な
インキュベーション期間後、場合により、動物モノクロ
ナール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６またはＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓに特異的である第二の抗体（たとえばラビッ
ト抗マウス全抗体またはＳａｃ−Ｃｅｌ）を添加する。
第二のインキュベーション期間後、抗体が結合した放射
能標識抗原（リガンド）を分離して定量する、すなわち
結合放射能標識抗原の放射能を計数する。サンプル中に
存在するＢβ１−４２（または１５−４２）が「コール
ド」であるほど、そのサンプルでは結合リガンドが少な
い。未知サンプル中の正確な量（すなわちＢβ１−４２
または１５−４２ペプチドの濃度）は、未知サンプルの
阻止値を各々Ｂβ１−４２または１５−４２標準を用い
て得られる阻止値と比較することにより、すなわち、血
漿サンプルを用いるＲＩＡテストの結果を、標準量の既
知抗原たとえば人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＢβ鎖の酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメ
ントまたはフィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５
−４２を含有するペプチドフラグメントを用いて得られ
るＲＩＡテスト結果と比較することにより、測定するこ
とが出来る。
り出す。血漿サンプルを迅速に「処理」（ｐｒｏｃｅｓ
ｓｅｄ）」し、すなわち氷冷エタノールで処理し〔５０
％最終濃度〕、Ｂβ鎖から誘導されるフィブリノーゲン
／フィブリンペプチドを単離する。エタノール上澄液は
一般に凍結乾燥して溶剤を除去すると共に抽出液を濃縮
する。「処理」血漿サンプルを２つの部分すなわち、Ｂ
β１−４２の存在を検出するために使用される部分と、 Ｂβ１５−４２の存在を検出するために使用される部分
に分割することが出来る。エタノール抽出液中に存在す
るペプチド水準は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）か
またはエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により測定することが出来る。たとえ
ば、エタノール抽出液の種種の希釈液を、一定量の動物
モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６および
たとえば人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ
鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する放射能標識ペプチ
ドフラグメントからなる競合的放射能標識抗原、たとえ
ば動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６
と結合することが出来る１２５ＩＢβ１−４２リガンド
と混合する。また、エタノール抽出液の種々の希釈液
を、一定量の動物モノクロナール抗体たとえばＭＡＤ／
Ｔ２Ｇｌｓおよび人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸
残基１５−４２を含有する放射能標識ペプチドフラグメ
ントからなる競合的放射能標識抗原と混合する（この競
合的放射能標識抗原たとえば１２５ＩＢβ１５−４２リ
ガンドは動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓと結合することが出来る。両方の場合共、適当な
インキュベーション期間後、場合により、動物モノクロ
ナール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６またはＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓに特異的である第二の抗体（たとえばラビッ
ト抗マウス全抗体またはＳａｃ−Ｃｅｌ）を添加する。
第二のインキュベーション期間後、抗体が結合した放射
能標識抗原（リガンド）を分離して定量する、すなわち
結合放射能標識抗原の放射能を計数する。サンプル中に
存在するＢβ１−４２（または１５−４２）が「コール
ド」であるほど、そのサンプルでは結合リガンドが少な
い。未知サンプル中の正確な量（すなわちＢβ１−４２
または１５−４２ペプチドの濃度）は、未知サンプルの
阻止値を各々Ｂβ１−４２または１５−４２標準を用い
て得られる阻止値と比較することにより、すなわち、血
漿サンプルを用いるＲＩＡテストの結果を、標準量の既
知抗原たとえば人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩ
のＢβ鎖の酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメ
ントまたはフィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５
−４２を含有するペプチドフラグメントを用いて得られ
るＲＩＡテスト結果と比較することにより、測定するこ
とが出来る。
別法として、前記抗体（すなわち、Ｂβ１−４２または
１５−４２）の存在はＥＬＩＳＡにより検出することが
出来る。この方法では、固体担体たとえばミクロタイタ
ープレートに、たとえばＢβ１−４２、Ｎ−ＤＳＫまた
は無傷フィブリノーゲンを含有する人フィブリノーゲン
またはフィブリンＩのＢβ鎖のペプチドフラグメントか
らなる競合的抗原を一晩被覆する。洗浄「遮断」（非特
異性結合を最小限にする）工程後、ＭＡｂ／１−８ｃ６
および血漿サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢ
β１−４２標準）を適当に希釈したものをミクロタイタ
ープレートの適当なウエルに添加する。そのようなサン
プル中に大過剰のＢβ１−４２ペプチドが存在する場
合、ＭＡｂ／１−８ｃ６はペプチドと反応し、ミクロタ
イタープレートの表面に最初に被覆された前記抗原また
は関連抗原との結合にこの抗体のほとんどは利用出来な
い（前記参照）。抗原被覆プレートに結合することがあ
る場合この抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の量は、プ
レートに結合した酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫
グロブリンたとえばＭＡｂ／１−８ｃ６に結合する、す
なわち特異的である）の量をすでに述べた方法（Ｅｎｇ
ａｌｌ，Ｅ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，７０，Ｐａｒｔ Ａ，４４１９−４３
９，１９８０）により測定することによって検出する。
未知サンプル中のたとえばＢβ１−４２の量は、未知サ
ンプルの阻止値をたとえばＢβ１−４２標準を用いて得
られる阻止値と比較することにより（すなわち血漿サン
プルを用いるＥＬＩＳＡテストの結果を既知抗原すなわ
ち、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
の標準量をを用いて得られるＥＬＩＳＡテスト結果と比
較することにより）測定する。前記ＥＬＩＳＡ法は血漿
サンプル中のＢβ１５−４２の存在の検出に使用され
る。たとえば、ミクロタイタープレートに、人フィブリ
ンＩＩのＢβ鎖ののアミノ酸残基１５−４２を含有する
ペプチドフラグメントからなる競合的抗原たとえばＢβ
１５−４２を被覆する。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓおよび血漿
サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢβ１５−４
２標準）をプレートのウエルに添加する。抗原被覆プレ
ートに結合したＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの量は、プレートに
結合した酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫グロブリ
ンたとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓに結合する、すなわち特
異的である）の量を測定することにより検出する。未知
サンプル中のＢβ１５−４２の量は、未知サンプルの阻
止値をＢβ１５−４２標準を用いて得られる阻止値と比
較することにより（すなわち、血漿サンプルを用いるＥ
ＬＩＳＡテストの結果を、人フィブリンＩＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２を含有する標準ペプチドフラグ
メントを用いて得られるＥＬＩＳＡテスト結果と比較す
ることにより）測定する。
１５−４２）の存在はＥＬＩＳＡにより検出することが
出来る。この方法では、固体担体たとえばミクロタイタ
ープレートに、たとえばＢβ１−４２、Ｎ−ＤＳＫまた
は無傷フィブリノーゲンを含有する人フィブリノーゲン
またはフィブリンＩのＢβ鎖のペプチドフラグメントか
らなる競合的抗原を一晩被覆する。洗浄「遮断」（非特
異性結合を最小限にする）工程後、ＭＡｂ／１−８ｃ６
および血漿サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢ
β１−４２標準）を適当に希釈したものをミクロタイタ
ープレートの適当なウエルに添加する。そのようなサン
プル中に大過剰のＢβ１−４２ペプチドが存在する場
合、ＭＡｂ／１−８ｃ６はペプチドと反応し、ミクロタ
イタープレートの表面に最初に被覆された前記抗原また
は関連抗原との結合にこの抗体のほとんどは利用出来な
い（前記参照）。抗原被覆プレートに結合することがあ
る場合この抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の量は、プ
レートに結合した酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫
グロブリンたとえばＭＡｂ／１−８ｃ６に結合する、す
なわち特異的である）の量をすでに述べた方法（Ｅｎｇ
ａｌｌ，Ｅ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，７０，Ｐａｒｔ Ａ，４４１９−４３
９，１９８０）により測定することによって検出する。
未知サンプル中のたとえばＢβ１−４２の量は、未知サ
ンプルの阻止値をたとえばＢβ１−４２標準を用いて得
られる阻止値と比較することにより（すなわち血漿サン
プルを用いるＥＬＩＳＡテストの結果を既知抗原すなわ
ち、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
の標準量をを用いて得られるＥＬＩＳＡテスト結果と比
較することにより）測定する。前記ＥＬＩＳＡ法は血漿
サンプル中のＢβ１５−４２の存在の検出に使用され
る。たとえば、ミクロタイタープレートに、人フィブリ
ンＩＩのＢβ鎖ののアミノ酸残基１５−４２を含有する
ペプチドフラグメントからなる競合的抗原たとえばＢβ
１５−４２を被覆する。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓおよび血漿
サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢβ１５−４
２標準）をプレートのウエルに添加する。抗原被覆プレ
ートに結合したＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの量は、プレートに
結合した酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫グロブリ
ンたとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓに結合する、すなわち特
異的である）の量を測定することにより検出する。未知
サンプル中のＢβ１５−４２の量は、未知サンプルの阻
止値をＢβ１５−４２標準を用いて得られる阻止値と比
較することにより（すなわち、血漿サンプルを用いるＥ
ＬＩＳＡテストの結果を、人フィブリンＩＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２を含有する標準ペプチドフラグ
メントを用いて得られるＥＬＩＳＡテスト結果と比較す
ることにより）測定する。
専門技術者が患者に閉塞性血栓症が発病する可能性を検
出出来る方法は、血漿サンプルを２つの部分に分割し、
そして（１）１つの部分で人フィブリノーゲンまたはフ
ィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有す
るペプチドフラグメントの量を、および（２）もう１つ
の部分で人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５
−４２を含有するペプチドフラグメントの量を測定する
ことからなる。技術者は、前述したようにＥＬＩＳＡま
たはＲＩＡテストのいずれかを用いることが出来る。次
に、患者の血漿中のペプチドフラグメントの相対量を比
較することが出来る。Ｂβ１−４２がＢβ１５−４２よ
り優勢である場合、フィブリノーゲンまたはフィブリン
Ｉポリマーのプラスミンタンパク質加水分解が行われて
いることが指摘される。Ｂβ１５−４２がＢβ１−４２
より優勢である場合、フィブリンＩＩが形成されてい
る。すなわち、患者に閉塞性血栓症の発病の可能性があ
ることが指摘される。
出出来る方法は、血漿サンプルを２つの部分に分割し、
そして（１）１つの部分で人フィブリノーゲンまたはフ
ィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有す
るペプチドフラグメントの量を、および（２）もう１つ
の部分で人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１５
−４２を含有するペプチドフラグメントの量を測定する
ことからなる。技術者は、前述したようにＥＬＩＳＡま
たはＲＩＡテストのいずれかを用いることが出来る。次
に、患者の血漿中のペプチドフラグメントの相対量を比
較することが出来る。Ｂβ１−４２がＢβ１５−４２よ
り優勢である場合、フィブリノーゲンまたはフィブリン
Ｉポリマーのプラスミンタンパク質加水分解が行われて
いることが指摘される。Ｂβ１５−４２がＢβ１−４２
より優勢である場合、フィブリンＩＩが形成されてい
る。すなわち、患者に閉塞性血栓症の発病の可能性があ
ることが指摘される。
また、本発明は、フィブリノーゲンおよび（または）フ
ィブリンの生体内発生ペプチドの性状を調らべるための
テストキットに関する。１つのそのようなテストキッ
ト、すなわち単一ペプチドキットでは、たとえば人フィ
ブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残
基１−４２を含有するペプチドフラグメントの存在が検
出される。凍結乾燥した動物モノクロナール抗体たとえ
ばＭＡｂ／１−８ｃ６のアリコート（たとえば０．５ｍ
ｇ）を用意する。また、フィブリノーゲンのアリコート
（たとえば２−４ｍｇ）も用意する。技術者はこのアリ
コートをを用いてＥＬＩＳＡテストで使用するミクロリ
ットルプレートを被覆する。さらに、人フィブリノーゲ
ンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２
を含有するペプチドフラグメントのアリコート（たとえ
ば２０μｇ）を用意する。これは、技術者により、フィ
ブリノーゲン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合するＭＡｂ
／１−８ｃ６の量が色強度（下記で説明）により示され
るように、テストサンプル溶液中の競合性抗原（Ｂβ１
−４２）の量が増加するにつれて減少する標準曲線をつ
くるために使用される。技術者は、競合性ＥＬＩＳＡテ
ストで溶液として使用する既知量の抗原を得るために用
意されたＢβ１−４２の希釈液を調製する。この技術は
良く知られている。また、動物たとえばマウス免疫グロ
ブリンにに対する酵素結合（たとえばペルオキシダーゼ
結合）免疫グロブリン（たとえばラビット）を用意し
て、動物免疫グロブリンたとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の
フィブリノーゲン被覆プレートへの結合を検出する。酵
素結合ＩｇＧ結合はＨ２Ｏ２−ｏ−ジアニシジン溶液を
用いて検出する。色強度はたとえばＭＲ５８０・マイク
ロエリサオートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｌｅｘ
ａｎｄｒｉａ，ＶＡ）を用いて自動的に測定することが
出来る。
ィブリンの生体内発生ペプチドの性状を調らべるための
テストキットに関する。１つのそのようなテストキッ
ト、すなわち単一ペプチドキットでは、たとえば人フィ
ブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残
基１−４２を含有するペプチドフラグメントの存在が検
出される。凍結乾燥した動物モノクロナール抗体たとえ
ばＭＡｂ／１−８ｃ６のアリコート（たとえば０．５ｍ
ｇ）を用意する。また、フィブリノーゲンのアリコート
（たとえば２−４ｍｇ）も用意する。技術者はこのアリ
コートをを用いてＥＬＩＳＡテストで使用するミクロリ
ットルプレートを被覆する。さらに、人フィブリノーゲ
ンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２
を含有するペプチドフラグメントのアリコート（たとえ
ば２０μｇ）を用意する。これは、技術者により、フィ
ブリノーゲン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合するＭＡｂ
／１−８ｃ６の量が色強度（下記で説明）により示され
るように、テストサンプル溶液中の競合性抗原（Ｂβ１
−４２）の量が増加するにつれて減少する標準曲線をつ
くるために使用される。技術者は、競合性ＥＬＩＳＡテ
ストで溶液として使用する既知量の抗原を得るために用
意されたＢβ１−４２の希釈液を調製する。この技術は
良く知られている。また、動物たとえばマウス免疫グロ
ブリンにに対する酵素結合（たとえばペルオキシダーゼ
結合）免疫グロブリン（たとえばラビット）を用意し
て、動物免疫グロブリンたとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の
フィブリノーゲン被覆プレートへの結合を検出する。酵
素結合ＩｇＧ結合はＨ２Ｏ２−ｏ−ジアニシジン溶液を
用いて検出する。色強度はたとえばＭＲ５８０・マイク
ロエリサオートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｌｅｘ
ａｎｄｒｉａ，ＶＡ）を用いて自動的に測定することが
出来る。
標準曲線をつくったら、フィブリノーゲンを除去すべく
処理された血漿サンプル（たとえば例７に記載）（この
血漿サンプルは未知量のＢβ１−４２を含有し得る）を
用いてＥＬＩＳＡテストを行うことが出来る。色強度を
測定し、血漿サンプル中のＢβ１−４２量を標準曲線か
ら読み取ることが出来る。
処理された血漿サンプル（たとえば例７に記載）（この
血漿サンプルは未知量のＢβ１−４２を含有し得る）を
用いてＥＬＩＳＡテストを行うことが出来る。色強度を
測定し、血漿サンプル中のＢβ１−４２量を標準曲線か
ら読み取ることが出来る。
本発明による他のテストキットすなわち単一ペプチド検
出キットは、前述の如く操作されるが、しかし血漿サン
プル中に存在するＢβ１５−４２の量を測定する。凍結
乾燥した動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓのアリコート（たとえば０．５ｍｇ）を用意す
る。また、ミクロタイタープレートの被覆に用いるフィ
ブリンのアリコート（たとえば２−４ｍｇ）を用意す
る。また、動物たとえばマウス免疫グロブリンに対する
酵素結合免疫グロブリン（たとえばラビット）と同様に
人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基を含有するペ
プチドフラグメントのアリコート（たとえば２０（μ
ｇ）を用意する。
出キットは、前述の如く操作されるが、しかし血漿サン
プル中に存在するＢβ１５−４２の量を測定する。凍結
乾燥した動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓのアリコート（たとえば０．５ｍｇ）を用意す
る。また、ミクロタイタープレートの被覆に用いるフィ
ブリンのアリコート（たとえば２−４ｍｇ）を用意す
る。また、動物たとえばマウス免疫グロブリンに対する
酵素結合免疫グロブリン（たとえばラビット）と同様に
人フィブリンＩＩのＢβ鎖のアミノ酸残基を含有するペ
プチドフラグメントのアリコート（たとえば２０（μ
ｇ）を用意する。
本発明による本発明の好ましいテストキットである。第
三のテストキットすなわち２つの異なるペプチド検出用
のペプチド検出キットを用いて血漿サンプル中のＢβ１
−４２およびＢβ１５−４２の両方を測定することが出
来る。血漿サンプルを２つの部分すなわちＢβ１−４２
の存在のテストに用いる部分と、Ｂβ１５−４２の存在
のテストに用いる部分に分割する。動物モノクロナール
抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ
ｓ、フィブリノーゲンおよびフィブリン（プレート被覆
用）、Ｂβ１−４２およびＢβ１５−４２（標準曲線作
製用）および動物たとえばマウス免疫グロブリンに対す
る酵素結合免疫グロブリン（たとえばラビット）をすべ
て用意する。技術者は、各単一ペプチド検出キットにつ
いて前述した手順に従う。このようにして、各血漿サン
プルにおいてＢβ１−４２およびＢβ１５−４２の量を
測定し、比較することが出来る。
三のテストキットすなわち２つの異なるペプチド検出用
のペプチド検出キットを用いて血漿サンプル中のＢβ１
−４２およびＢβ１５−４２の両方を測定することが出
来る。血漿サンプルを２つの部分すなわちＢβ１−４２
の存在のテストに用いる部分と、Ｂβ１５−４２の存在
のテストに用いる部分に分割する。動物モノクロナール
抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ
ｓ、フィブリノーゲンおよびフィブリン（プレート被覆
用）、Ｂβ１−４２およびＢβ１５−４２（標準曲線作
製用）および動物たとえばマウス免疫グロブリンに対す
る酵素結合免疫グロブリン（たとえばラビット）をすべ
て用意する。技術者は、各単一ペプチド検出キットにつ
いて前述した手順に従う。このようにして、各血漿サン
プルにおいてＢβ１−４２およびＢβ１５−４２の量を
測定し、比較することが出来る。
前述したように、ＥＬＩＳＡの使用が好ましい。しかし
ながら、技術者は、キットの構成部分を用いてＥＬＩＳ
Ａの代りにＲＩＡを行ってペプチドフラグメントの量を
測定することが出来る。
ながら、技術者は、キットの構成部分を用いてＥＬＩＳ
Ａの代りにＲＩＡを行ってペプチドフラグメントの量を
測定することが出来る。
前述したように、本発明は、生体内で産生されつつある
フィブリン分子の性状の迅速な分析手段を提供する。血
漿テストサンプル中でＢβ１−４２抗原がＢβ１５−４
２の抗原より優勢である場合、フィブリノーゲンまたは
フィブリンＩポリマーのプラスミンタンパク質加水分解
が起りつつあることが指摘される。他方、Ｂβ１５−４
２抗原がＢβ１−４２抗原より優勢である場合、フィブ
リンＩＩが循環しているかまたは血管壁に付着しつつあ
る可能性がある（この過程は閉塞性血栓症に至る）こと
が臨床医に指摘される。
フィブリン分子の性状の迅速な分析手段を提供する。血
漿テストサンプル中でＢβ１−４２抗原がＢβ１５−４
２の抗原より優勢である場合、フィブリノーゲンまたは
フィブリンＩポリマーのプラスミンタンパク質加水分解
が起りつつあることが指摘される。他方、Ｂβ１５−４
２抗原がＢβ１−４２抗原より優勢である場合、フィブ
リンＩＩが循環しているかまたは血管壁に付着しつつあ
る可能性がある（この過程は閉塞性血栓症に至る）こと
が臨床医に指摘される。
本発明では、免疫マウスからの脾細胞および骨髄腫細胞
を使用することが好ましいけれども、他の動物たとえば
ラット、モルモットおよびラビットからの細胞を使用す
ることも出来る。
を使用することが好ましいけれども、他の動物たとえば
ラット、モルモットおよびラビットからの細胞を使用す
ることも出来る。
本発明の方法を用いて人間以外の種からのフィブリノー
ゲンまたはフィブリンＩフラグメントに対して抗体を生
じさせることも出来る。たとえばラビットまたはドッグ
フィブリノーゲン、フィブリンＩまたはフィブリンＩＩ
からのフラグメントを用いて、獣医学用に、フィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩに対して抗体を生じさせるこ
とが出来る。このような抗体は、実験的血栓症または血
栓崩壊治療を取り扱う研究で使用することも出来る。し
かしながら、注目すべきことは、特定の種の動物を治療
する場合、抗体は異なる種の動物から誘導しなければな
らないことである。
ゲンまたはフィブリンＩフラグメントに対して抗体を生
じさせることも出来る。たとえばラビットまたはドッグ
フィブリノーゲン、フィブリンＩまたはフィブリンＩＩ
からのフラグメントを用いて、獣医学用に、フィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩに対して抗体を生じさせるこ
とが出来る。このような抗体は、実験的血栓症または血
栓崩壊治療を取り扱う研究で使用することも出来る。し
かしながら、注目すべきことは、特定の種の動物を治療
する場合、抗体は異なる種の動物から誘導しなければな
らないことである。
本発明の検定法を用いて、多数の外傷患者群たとえば火
傷患者、頭部および他の身体部位の損傷を受けている患
者、開心および冠状バイパス手術を含む手術中の患者
（検定法は手術前、中および後に行うことが出来る）、
血液透析患者、癌患者および深部静脈血栓症患者おいて
フィブリノーゲンまたはフィブリン分解産物を測定する
ことが出来る。たとえば、股の手術を受けている初老の
患者は、急性深部静脈血栓症を引き起すことがある。こ
の状態を軽減するために、２つの治療方法すなわちトロ
ンビン（凝固）を除去する手術かまたはフィブリン溶解
剤たとえばストレプトキナーゼまたは組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）によるトロンビンの
溶解を使用することが出来る。本発明の方法を用いて前
述した血栓崩壊剤により指摘されるように、血餅溶解の
ごく初期の段階を検出することが出来る。本発明の方法
を用いて閉塞性血栓症にかかり得るまたは潜在的にかか
り得る患者においてフィブリノーゲンまたはフィブリン
分解産物を検出することが出来る。
傷患者、頭部および他の身体部位の損傷を受けている患
者、開心および冠状バイパス手術を含む手術中の患者
（検定法は手術前、中および後に行うことが出来る）、
血液透析患者、癌患者および深部静脈血栓症患者おいて
フィブリノーゲンまたはフィブリン分解産物を測定する
ことが出来る。たとえば、股の手術を受けている初老の
患者は、急性深部静脈血栓症を引き起すことがある。こ
の状態を軽減するために、２つの治療方法すなわちトロ
ンビン（凝固）を除去する手術かまたはフィブリン溶解
剤たとえばストレプトキナーゼまたは組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）によるトロンビンの
溶解を使用することが出来る。本発明の方法を用いて前
述した血栓崩壊剤により指摘されるように、血餅溶解の
ごく初期の段階を検出することが出来る。本発明の方法
を用いて閉塞性血栓症にかかり得るまたは潜在的にかか
り得る患者においてフィブリノーゲンまたはフィブリン
分解産物を検出することが出来る。
本発明のＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを治療に用いて、閉塞性血
栓にかかりつつあるかも知れない患者の血流からフィブ
リンＩＩを除去することが出来る。たとえば、血液透析
を用いてそのような除去を行うことが出来る。血液透析
を用いる場合、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは固体担体たとえば
ガラスビーズ上で固定される。次いで、固定化ＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓ−固体担体複合体は、血液透析室のある位置
に置かれ、次いで血液が患者に戻される。したがって、
血液透析中、血液は血液透析室を血液が固定化モノクロ
ナール抗体と接触するように流れてフィブリンＩＩが血
液から実質的に除去され、その後血液は患者の循環系に
戻される。
栓にかかりつつあるかも知れない患者の血流からフィブ
リンＩＩを除去することが出来る。たとえば、血液透析
を用いてそのような除去を行うことが出来る。血液透析
を用いる場合、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは固体担体たとえば
ガラスビーズ上で固定される。次いで、固定化ＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓ−固体担体複合体は、血液透析室のある位置
に置かれ、次いで血液が患者に戻される。したがって、
血液透析中、血液は血液透析室を血液が固定化モノクロ
ナール抗体と接触するように流れてフィブリンＩＩが血
液から実質的に除去され、その後血液は患者の循環系に
戻される。
本発明をさらに下記の非限定的例により説明する。
例 例１：Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび関連フラグ
メントの調製 ＩＭＣＯ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．（ストッ
クホルム．スェーデン）から人フィブリノーゲンを得
た。このフィブリノーゲンから、実質的にＢｌｏｍａｃ
ｋ ｅｔａｌ．，Ｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８，
５８０６−５８２０，１９７３，の技術に従ってＮ−Ｄ
ＳＫを調製した。しかしながら、向流分配を用いる代り
に、セファデックスＤＥＡＥ Ａ ５０（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ）によるイオン交換クロマトグラフィーを使用した。
メントの調製 ＩＭＣＯ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．（ストッ
クホルム．スェーデン）から人フィブリノーゲンを得
た。このフィブリノーゲンから、実質的にＢｌｏｍａｃ
ｋ ｅｔａｌ．，Ｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８，
５８０６−５８２０，１９７３，の技術に従ってＮ−Ｄ
ＳＫを調製した。しかしながら、向流分配を用いる代り
に、セファデックスＤＥＡＥ Ａ ５０（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ）によるイオン交換クロマトグラフィーを使用した。
部分的に純粋なＮ−ＤＳＫを０．１Ｍトリス中ｐＨ７．
５でイオン交換樹脂に適用した。Ｎ−ＤＳＫを、０．１
Ｍトリス、ｐＨ７．５（出発緩衝液）および０．１Ｍト
リス、ｐＨ７．５でつくりかつさらに０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ（限界緩衝液）を含有する線状塩勾配でカラムから溶
離した。精製工程の任意の段階からのＮ−ＤＳＫまたは
Ｎ−ＤＳＫ含有画分は、凍結乾燥により決して濃縮しな
かった。
５でイオン交換樹脂に適用した。Ｎ−ＤＳＫを、０．１
Ｍトリス、ｐＨ７．５（出発緩衝液）および０．１Ｍト
リス、ｐＨ７．５でつくりかつさらに０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ（限界緩衝液）を含有する線状塩勾配でカラムから溶
離した。精製工程の任意の段階からのＮ−ＤＳＫまたは
Ｎ−ＤＳＫ含有画分は、凍結乾燥により決して濃縮しな
かった。
フィブリンゲルのトロンビン〔人トロンビン、３０００
ＮＩＨ単位／タンパク質１ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）〕およびバトロキソビン〔バスロップ
スアトロックスマラジョエンシス（Ｂａｔｈｒｏｐｓａ
ｔｒｏｘ ｍａｒａｊｏｅｎｓｉｓ）の毒液からの不溶
化酵素、２０バトロキソビン単位／懸濁液１ｍｌ（Ｐｅ
ｎｔａｐｈａｒｍ Ｌｔｄ．，Ｂａｌｓｅ，Ｓｗｉｔｚ
ｅｒｌａｎｄ）〕分解から（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを各々調製した。フィブリノーゲン溶
液を、Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，３４９−３５６，
１９８１，に記載の如くしてつった。５単位／ｍｌ（ト
ロンビンまたはバトロキソビン）を添加して凝固を開始
し、３７℃で約６時間分解を続けた。ＣＮＢｒ分解およ
び続くすべての単離手順は、Ｎ−ＤＳＫの場合と同じで
あった。また、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから直接
調製した。Ｎ−ＤＳＫの溶液（０．５−１．０ｍｇ／ｍ
ｌ）を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス
（ｐＨ７．５）でつくり、これらの溶液を２つの等しい
部分に分割した。トロンビン（１０ＮＩＨ単位１ｍｌ）
を１つのアリコートに添加し、等容量の生理的食塩水を
もう一方のアリコートに添加した。両サンプル共３７℃
で４時間培養し、その後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ
−Ｐｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ
ｉｆｏｎｉａ）のアリコート（１０μｌの０．９×１０
−４Ｍ原液／分解液１ｍｌ）を両サンプルに添加した。
フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）およびフィブリノペプ
チドＢ（ＦＰＢ）ラジオイムノアッセイを用いてトロン
ビン分解産物を測定する。
ＮＩＨ単位／タンパク質１ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）〕およびバトロキソビン〔バスロップ
スアトロックスマラジョエンシス（Ｂａｔｈｒｏｐｓａ
ｔｒｏｘ ｍａｒａｊｏｅｎｓｉｓ）の毒液からの不溶
化酵素、２０バトロキソビン単位／懸濁液１ｍｌ（Ｐｅ
ｎｔａｐｈａｒｍ Ｌｔｄ．，Ｂａｌｓｅ，Ｓｗｉｔｚ
ｅｒｌａｎｄ）〕分解から（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを各々調製した。フィブリノーゲン溶
液を、Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，３４９−３５６，
１９８１，に記載の如くしてつった。５単位／ｍｌ（ト
ロンビンまたはバトロキソビン）を添加して凝固を開始
し、３７℃で約６時間分解を続けた。ＣＮＢｒ分解およ
び続くすべての単離手順は、Ｎ−ＤＳＫの場合と同じで
あった。また、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから直接
調製した。Ｎ−ＤＳＫの溶液（０．５−１．０ｍｇ／ｍ
ｌ）を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス
（ｐＨ７．５）でつくり、これらの溶液を２つの等しい
部分に分割した。トロンビン（１０ＮＩＨ単位１ｍｌ）
を１つのアリコートに添加し、等容量の生理的食塩水を
もう一方のアリコートに添加した。両サンプル共３７℃
で４時間培養し、その後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ
−Ｐｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ
ｉｆｏｎｉａ）のアリコート（１０μｌの０．９×１０
−４Ｍ原液／分解液１ｍｌ）を両サンプルに添加した。
フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）およびフィブリノペプ
チドＢ（ＦＰＢ）ラジオイムノアッセイを用いてトロン
ビン分解産物を測定する。
ＩＭＣＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．（ストッ
クホルム、スエーデン）から供給されるキットおよび方
法を用いてＦＰＡ検定を行った。ＦＰＢ検定は、Ｂｉｌ
ｅｚｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｂ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ，５６，４３８−４４５，１９７５，の方法によ
り行つた。Ｎ−ＤＳＫの鎖およびフィブリノーゲンのプ
ラスミン分解産物を前述の如くして調製した（Ｂｌｏｍ
ｂｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４１，１４９６−１５１２，１９７２およびＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８，５８０６−５８２０，１９
７３；Ｇａｒｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ．，１，３７１−３８８，１９７２）。
クホルム、スエーデン）から供給されるキットおよび方
法を用いてＦＰＡ検定を行った。ＦＰＢ検定は、Ｂｉｌ
ｅｚｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｂ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ，５６，４３８−４４５，１９７５，の方法によ
り行つた。Ｎ−ＤＳＫの鎖およびフィブリノーゲンのプ
ラスミン分解産物を前述の如くして調製した（Ｂｌｏｍ
ｂｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４１，１４９６−１５１２，１９７２およびＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８，５８０６−５８２０，１９
７３；Ｇａｒｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ．，１，３７１−３８８，１９７２）。
種々の技術を用いてＮ−ＤＳＫおよびその関連フラグメ
ントの純度を測定した。１０８４Ｂヒューレット−パッ
カード液体クロマトグラフィーを用いて分析および分取
クロマトグラフィーを行った。カラムおよびクロマトグ
ラフィー条件は、Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌ
ｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，３４９−
３５６，１９８１，に記載されているものと同じであっ
た。Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体のエレクトロイムアッ
セイは前述と同様であった（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａ
ｌ．，前出、１９８２）。Ｎ−ＤＳＫ抗血清（２４１
６）を熱ゲル溶液と混合して約０．４％の抗血清濃度と
することによりゲルをつくった。ゲル電気永動およびア
ミノ酸分析は、記載された通りであった（Ｂｌｏｍｂ
ｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４
８，５８０６−５８２０，１９７３；Ｈｅｓｓｅｌ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９８，５
２１−５３４，１９７９）。
ントの純度を測定した。１０８４Ｂヒューレット−パッ
カード液体クロマトグラフィーを用いて分析および分取
クロマトグラフィーを行った。カラムおよびクロマトグ
ラフィー条件は、Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌ
ｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，３４９−
３５６，１９８１，に記載されているものと同じであっ
た。Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体のエレクトロイムアッ
セイは前述と同様であった（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａ
ｌ．，前出、１９８２）。Ｎ−ＤＳＫ抗血清（２４１
６）を熱ゲル溶液と混合して約０．４％の抗血清濃度と
することによりゲルをつくった。ゲル電気永動およびア
ミノ酸分析は、記載された通りであった（Ｂｌｏｍｂ
ｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４
８，５８０６−５８２０，１９７３；Ｈｅｓｓｅｌ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９８，５
２１−５３４，１９７９）。
ジスルフィド結合Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、第１図に示すように、ＳＤＳの存
在下７％アクリルアミドゲル中でわずかであるが検出可
能な移動度差を示した。還元後、ＳＤＳの存在下１０％
アクリルアミドゲル中で各フラグメントの鎖について特
性帯パターンを得た（図示せず）。すなわち、Ｎ−ＤＳ
Ｋおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはＡα鎖の移動度のみが異な
っていた。Ｎ−ＤＳＫと比較すると、還元（Ｔ）Ｎ−Ｄ
ＳＫはＡαおよびＢβ鎖の両方について異なる移動度を
示した。これらの観察は他の人々によって報告されてい
るものと一致した（Ｈｅｓｓｅｌ，Ｄｏｃｔｏｒａｌ
ｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈｅｍ．Ｄｅｐｔ．Ｋａｒｏｌｉｎｓ
ｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗ
ｅｄｅｎ，１９７５；Ｈｅｓｓｅｌ ｅｌ ａｌ．，Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９８，５２１−５３４，
１９７９）。各々の成分フィブリノペプチド含量を測定
するために、３つのＮ−ＤＳＫ種をトロンビンで処理し
た。この後、各分解液を９％トリクロル酢酸にに調節
し、もしあればトロンビン分解ペプチドを、前述したよ
うにＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジに吸着させて
上澄み液から単離した（Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆ
ｉｅｌｄ，前出，１９８１）。その後、第２図に示すよ
うに、ペプチドを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）により同定した。ＦＰＡおよびＦＰＢ共Ｎ−ＤＳ
Ｋから放出された（第２ａ図）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫのト
ロンビン分解物から取得された主要ペプチドはＦＰＢで
あった（第２ｂ図）。ゲル過（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫをトロ
ンビンで２回分解した場合、ペプチドは放出されなかっ
た。
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、第１図に示すように、ＳＤＳの存
在下７％アクリルアミドゲル中でわずかであるが検出可
能な移動度差を示した。還元後、ＳＤＳの存在下１０％
アクリルアミドゲル中で各フラグメントの鎖について特
性帯パターンを得た（図示せず）。すなわち、Ｎ−ＤＳ
Ｋおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはＡα鎖の移動度のみが異な
っていた。Ｎ−ＤＳＫと比較すると、還元（Ｔ）Ｎ−Ｄ
ＳＫはＡαおよびＢβ鎖の両方について異なる移動度を
示した。これらの観察は他の人々によって報告されてい
るものと一致した（Ｈｅｓｓｅｌ，Ｄｏｃｔｏｒａｌ
ｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈｅｍ．Ｄｅｐｔ．Ｋａｒｏｌｉｎｓ
ｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗ
ｅｄｅｎ，１９７５；Ｈｅｓｓｅｌ ｅｌ ａｌ．，Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９８，５２１−５３４，
１９７９）。各々の成分フィブリノペプチド含量を測定
するために、３つのＮ−ＤＳＫ種をトロンビンで処理し
た。この後、各分解液を９％トリクロル酢酸にに調節
し、もしあればトロンビン分解ペプチドを、前述したよ
うにＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジに吸着させて
上澄み液から単離した（Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆ
ｉｅｌｄ，前出，１９８１）。その後、第２図に示すよ
うに、ペプチドを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）により同定した。ＦＰＡおよびＦＰＢ共Ｎ−ＤＳ
Ｋから放出された（第２ａ図）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫのト
ロンビン分解物から取得された主要ペプチドはＦＰＢで
あった（第２ｂ図）。ゲル過（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫをトロ
ンビンで２回分解した場合、ペプチドは放出されなかっ
た。
Ｎ−ＤＳＫの成分鎖は１０％アクリルアミドゲルで単一
帯を示し、すでに記載されたものと一致するアミノ酸組
成を示した（Ｂｌｏｍｂｃｋ ｅｔ ａｌ．，前記，
１９７２，１９７３；Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，前
記１９７９）。
帯を示し、すでに記載されたものと一致するアミノ酸組
成を示した（Ｂｌｏｍｂｃｋ ｅｔ ａｌ．，前記，
１９７２，１９７３；Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，前
記１９７９）。
次のようにしてプラスミノーゲン含有フィブリノーゲン
溶液を活性化することによりペプチドＢβ１−４２を調
節した。ＩＭＣＯフィブリノーゲン（ＬｏｔＦ−１７
１）を０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．４）中で約４．０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度に希釈した。１００Ｕ／ｍｌのストレプト
キナーゼ〔Ｌｏｔ１１２Ｆ−０３７３）、４５００Ｕ／
固体１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ〕を
添加後、３７℃／６０分で分解を進行させた。この後、
６０℃／３０分で加熱することにより非分解フィブリノ
ーゲンのほとんどを沈殿させた。遠心分離後、上澄み液
をＳｃｐ−Ｐａｃ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に通
した。Ｂβ１−４２を含む吸着ペプチドを５０％アセト
ニトリルを用いて溶離した。その後、高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＢβ１−４２ペプチ
ドを精製した。カラムおよび手順は、Ｋｏｅｈｍ ＆
Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
１６，３４９−３５６，１９８１，に記載のものと実質
的に同じであった。
溶液を活性化することによりペプチドＢβ１−４２を調
節した。ＩＭＣＯフィブリノーゲン（ＬｏｔＦ−１７
１）を０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．４）中で約４．０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度に希釈した。１００Ｕ／ｍｌのストレプト
キナーゼ〔Ｌｏｔ１１２Ｆ−０３７３）、４５００Ｕ／
固体１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ〕を
添加後、３７℃／６０分で分解を進行させた。この後、
６０℃／３０分で加熱することにより非分解フィブリノ
ーゲンのほとんどを沈殿させた。遠心分離後、上澄み液
をＳｃｐ−Ｐａｃ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に通
した。Ｂβ１−４２を含む吸着ペプチドを５０％アセト
ニトリルを用いて溶離した。その後、高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＢβ１−４２ペプチ
ドを精製した。カラムおよび手順は、Ｋｏｅｈｍ ＆
Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
１６，３４９−３５６，１９８１，に記載のものと実質
的に同じであった。
ストレプトキナーゼ活性化の結果としてフィブリノーゲ
ンから放出されたペプチドは、非常に複雑なＨＰＬＣパ
ターン（図示せず）を示した。ＨＰＬＣ画分の免疫反応
性を前述のように（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ Ａｌ．，前
出，１９８２）Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッセイで
追跡することにより、幾つかの反応性ピークを得た。こ
れらの画分の１つを分取ＨＰＬＣ操作で単離した。第９
ａ図に示すように、画分１６またはその近くで溶離する
ピークはＢβ１５−４２に対するラビット抗血清と反応
した。この抗血清はＢβ１５−４２とＢβ１−４２を区
別しないのでこれらの結果は予期された（Ｋｕｄｒｙｋ
ｅｔ ａｌ．，前出，１９８２）。この同じ物質Ｂβ
１−４２のアリコートを人トロンビンで分解し、同じ条
件下で再びクロマトグラフィーにかけると、第９ｂ図に
示すパターンが観察された。トロンビン分解の結果とし
て、第９ａ図に示すピークは消失し、２つの新しいピー
クが現われた。これらのピークの１つは画分６−８また
はその近くで溶離し、Ｂβ−１５−４２イムノアッセイ
で反応した。この物質はＢβ１５−４２として同定さ
れ、１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合でＢβ１−４２のトロ
ンビン分解から生じた。ＨＰＬＣにより同じ条件下で分
離した場合、ＩＭＣＯ標準Ｂβ１５−４２もこの位置で
溶離した（図示せず）。画分２１またはその付近で溶離
する第２のピークはＦＰＢと同定された。これは、ＨＬ
ＰＣ系におけるＦＰＢ標準の公知溶離位置から確認され
た。さらに、画分２１ピークはＦＰＢラジオイムノアッ
セイで反応した（図示せず）。
ンから放出されたペプチドは、非常に複雑なＨＰＬＣパ
ターン（図示せず）を示した。ＨＰＬＣ画分の免疫反応
性を前述のように（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ Ａｌ．，前
出，１９８２）Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッセイで
追跡することにより、幾つかの反応性ピークを得た。こ
れらの画分の１つを分取ＨＰＬＣ操作で単離した。第９
ａ図に示すように、画分１６またはその近くで溶離する
ピークはＢβ１５−４２に対するラビット抗血清と反応
した。この抗血清はＢβ１５−４２とＢβ１−４２を区
別しないのでこれらの結果は予期された（Ｋｕｄｒｙｋ
ｅｔ ａｌ．，前出，１９８２）。この同じ物質Ｂβ
１−４２のアリコートを人トロンビンで分解し、同じ条
件下で再びクロマトグラフィーにかけると、第９ｂ図に
示すパターンが観察された。トロンビン分解の結果とし
て、第９ａ図に示すピークは消失し、２つの新しいピー
クが現われた。これらのピークの１つは画分６−８また
はその近くで溶離し、Ｂβ−１５−４２イムノアッセイ
で反応した。この物質はＢβ１５−４２として同定さ
れ、１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合でＢβ１−４２のトロ
ンビン分解から生じた。ＨＰＬＣにより同じ条件下で分
離した場合、ＩＭＣＯ標準Ｂβ１５−４２もこの位置で
溶離した（図示せず）。画分２１またはその付近で溶離
する第２のピークはＦＰＢと同定された。これは、ＨＬ
ＰＣ系におけるＦＰＢ標準の公知溶離位置から確認され
た。さらに、画分２１ピークはＦＰＢラジオイムノアッ
セイで反応した（図示せず）。
ペプチドＢβ１５−４２はＩＭＣＯから得または前述し
たように人トロンビン〔３０００ＮＩＨ単位／タンパク
質１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ〕で分
解することによりＢβ１−４２から直接調製した。後者
の方法では、Ｂβ１−４２を０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３
ＣＰＨ ８．０）に溶解し、３７℃／９０分で分解を行
った。この後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−
Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のアリコ
ート（１０μｌの０．９×１０４Ｍ原液／分解液１ｍ
ｌ）を添加して分解を停止した。
たように人トロンビン〔３０００ＮＩＨ単位／タンパク
質１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ〕で分
解することによりＢβ１−４２から直接調製した。後者
の方法では、Ｂβ１−４２を０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３
ＣＰＨ ８．０）に溶解し、３７℃／９０分で分解を行
った。この後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−
Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のアリコ
ート（１０μｌの０．９×１０４Ｍ原液／分解液１ｍ
ｌ）を添加して分解を停止した。
例２：モノクロナール抗体の産生 ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生するために、ＢＡＬＢ／ｃＪ
マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ．）の各々に、Ｎ−ＤＳＫ
溶液（４ｍｇ／ｍｌ）のエマルジョン０．１ｍｌおよび
等容量の完全フロイントアジュバントを腹腔内（ｉ．
ｐ．）注射して免疫した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１を産生する
ために、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの各々に、１００μｇ
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバントと混合
したものをｉ．ｐ．注射して免疫した。両方の場合共、
マウスに１週間おきに同じ投与量（不完全フロイントア
ジュバントを用いて）を４回追加注射した。ＭＡｂ／１
−８ｃ６産生の場合、１０週間休止後、トリス−生理的
食塩水中１００μｇのＮ−ＤＳＫを用いて動物の腹腔内
（ｉ．ｖ．）に追加注射した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１産生の
場合、最初の注射ｉ．ｖ．後５週間してトリス−生理的
食塩水中１００μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを追加注射し
た。両方の場合共、３日後にマウスから脾臓を摘出し、
組織をステンレス鋼金網から押し出して単一細胞懸濁液
をつくった。
マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ．）の各々に、Ｎ−ＤＳＫ
溶液（４ｍｇ／ｍｌ）のエマルジョン０．１ｍｌおよび
等容量の完全フロイントアジュバントを腹腔内（ｉ．
ｐ．）注射して免疫した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１を産生する
ために、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの各々に、１００μｇ
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバントと混合
したものをｉ．ｐ．注射して免疫した。両方の場合共、
マウスに１週間おきに同じ投与量（不完全フロイントア
ジュバントを用いて）を４回追加注射した。ＭＡｂ／１
−８ｃ６産生の場合、１０週間休止後、トリス−生理的
食塩水中１００μｇのＮ−ＤＳＫを用いて動物の腹腔内
（ｉ．ｖ．）に追加注射した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ１産生の
場合、最初の注射ｉ．ｖ．後５週間してトリス−生理的
食塩水中１００μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを追加注射し
た。両方の場合共、３日後にマウスから脾臓を摘出し、
組織をステンレス鋼金網から押し出して単一細胞懸濁液
をつくった。
両方の場合共、細胞融合は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，６，５１
１−５１９，１９７６，に記載の方法により行った。脾
細胞を、ＰＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂ
ｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ Ｎ．Ｙ．）で３５％ポ
リエチレグリコール１０００（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ
Ｌａｂｓ，Ｃｏｌｍｂｒｏｏｋ，Ｕ．Ｋ．）中で骨髄腫
細胞〔Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３〕と４：１（ＭＡｂ／
１−８ｃ６）または７：１（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ）の割
合で室温で１分間融合させた。細胞を小球形にし、洗浄
し、そして１０％ＮＣＴＣ１０９（ＭＡバイオプロダク
ツ、Ｎａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）および２０％ウ
シ胎児血清（ステリルシステムズ、Ｌｏｇａｎ，ＶＴ）
を含有する２１５ｍｌＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させ
た。正常脾細胞（１０８）を支持細胞層として添加し
た。湿潤した５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で一晩培養
後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡ
Ｔ）培地（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
１４５，７０９−７１０，１９６４）を添加してＨＡＴ
選択を開始した。５％ＣＯ２中、３７℃で一晩培養後、
９６−ウエル培地プレート〔コースター３５９６（Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）〕で限界希釈を行って前記ＨＡ
Ｔ培地中の細胞をクローン化した。ハイブリドーマイク
ローンを１６日間培養し、次いで培地の抗体を検定し
た。
ｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，６，５１
１−５１９，１９７６，に記載の方法により行った。脾
細胞を、ＰＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂ
ｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ Ｎ．Ｙ．）で３５％ポ
リエチレグリコール１０００（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ
Ｌａｂｓ，Ｃｏｌｍｂｒｏｏｋ，Ｕ．Ｋ．）中で骨髄腫
細胞〔Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３〕と４：１（ＭＡｂ／
１−８ｃ６）または７：１（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ）の割
合で室温で１分間融合させた。細胞を小球形にし、洗浄
し、そして１０％ＮＣＴＣ１０９（ＭＡバイオプロダク
ツ、Ｎａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）および２０％ウ
シ胎児血清（ステリルシステムズ、Ｌｏｇａｎ，ＶＴ）
を含有する２１５ｍｌＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させ
た。正常脾細胞（１０８）を支持細胞層として添加し
た。湿潤した５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で一晩培養
後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡ
Ｔ）培地（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
１４５，７０９−７１０，１９６４）を添加してＨＡＴ
選択を開始した。５％ＣＯ２中、３７℃で一晩培養後、
９６−ウエル培地プレート〔コースター３５９６（Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）〕で限界希釈を行って前記ＨＡ
Ｔ培地中の細胞をクローン化した。ハイブリドーマイク
ローンを１６日間培養し、次いで培地の抗体を検定し
た。
例３：ハイブリドーマにより産生される抗Ｎ−ＤＳＫお
よび抗（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ抗体の検出 ハイブリドーマ培地の最初のテストは、Ｅｎｇａｖａｌ
ｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７
０ （ＰａｒｔＡ），４１９−４３９，１９８０，Ａｃ
ａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．のＥＬＩＳＡ法により行っ
た。クローン培地液をポリビニルミクロタイタープレー
ト（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ．）上で
スクリーニングした。各ウエルは６個の抗体：フィブリ
ノーゲン、Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ，Ｎ−ＤＳＫ
のＡα１−５１、Ｂβ１−１１８またはγ１−７８鎖の
１つを、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中
約５−１５μｇ／ｍｌの濃度で含有した。未希釈クロー
ン培地液のアリコートを６個の「抗原」ウエルの各々に
添加した。培養・洗浄サイクル後、マウス免疫グロブリ
ン〔Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｗｅｓｔ
ｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．〕試薬に対するペルオキシダーゼ結
合ラビット免疫グロブリンを適当に希釈したものを添加
した。Ｈ２Ｏ２−ｏ−ジアニシジン溶液を用いて酵素結
合ＩｇＧ結合を検出した。ＭＲ５８０マイクロエリサオ
ートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｌｅｘａｎｄｒｉ
ａ，ＶＡ．）を用いて色強度を自動的に測定した。
よび抗（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ抗体の検出 ハイブリドーマ培地の最初のテストは、Ｅｎｇａｖａｌ
ｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７
０ （ＰａｒｔＡ），４１９−４３９，１９８０，Ａｃ
ａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．のＥＬＩＳＡ法により行っ
た。クローン培地液をポリビニルミクロタイタープレー
ト（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ．）上で
スクリーニングした。各ウエルは６個の抗体：フィブリ
ノーゲン、Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ，Ｎ−ＤＳＫ
のＡα１−５１、Ｂβ１−１１８またはγ１−７８鎖の
１つを、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中
約５−１５μｇ／ｍｌの濃度で含有した。未希釈クロー
ン培地液のアリコートを６個の「抗原」ウエルの各々に
添加した。培養・洗浄サイクル後、マウス免疫グロブリ
ン〔Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｗｅｓｔ
ｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．〕試薬に対するペルオキシダーゼ結
合ラビット免疫グロブリンを適当に希釈したものを添加
した。Ｈ２Ｏ２−ｏ−ジアニシジン溶液を用いて酵素結
合ＩｇＧ結合を検出した。ＭＲ５８０マイクロエリサオ
ートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｌｅｘａｎｄｒｉ
ａ，ＶＡ．）を用いて色強度を自動的に測定した。
検定可能な抗Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストした１８２
のハイブリドーマクローンの中で、１つ（ＡＴＣＣＨＢ
４１８）は、抗原（Ｎ−ＤＳＫ）とばかりでなく、無傷
フィブリノーゲン、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１−１１８
およびＢβ１−４２とも反応する抗体をきわめて高濃度
で産生した。１０％ＮＣＴＣ１０９および２０％ウシ胎
児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０でハイブリドーマを
培養することにより、多量のＭＡｂ／１−８ｃ６を得
た。
のハイブリドーマクローンの中で、１つ（ＡＴＣＣＨＢ
４１８）は、抗原（Ｎ−ＤＳＫ）とばかりでなく、無傷
フィブリノーゲン、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１−１１８
およびＢβ１−４２とも反応する抗体をきわめて高濃度
で産生した。１０％ＮＣＴＣ１０９および２０％ウシ胎
児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０でハイブリドーマを
培養することにより、多量のＭＡｂ／１−８ｃ６を得
た。
その後、半飽和硫酸アンモニウムで沈殿させてＭＡｂ／
１−８ｃ６を精製し、第２沈殿から得られたＩｇＧを
０．０２％ＮａＮ３を含有する０．１Ｍトリス（ｐＨ
７．５）に溶解した。最終溶液は培地の最初の容量の１
／１０であった。ＩｇＧクラスの測定を、ラビット抗マ
ウス免疫グロブリンクラス−特異性抗血清（Ｌｉｔｔｏ
ｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｅｓｔ
ｏｎ，ＳＣ）を用いてオクテルロニー法によりテストし
た。第３図に示すように、ＭＡｂ／１−８ｃ６はＩｇＧ
２ａ抗血清とのみ反応した。抗体のＬ鎖クラスは測定さ
れなかった。
１−８ｃ６を精製し、第２沈殿から得られたＩｇＧを
０．０２％ＮａＮ３を含有する０．１Ｍトリス（ｐＨ
７．５）に溶解した。最終溶液は培地の最初の容量の１
／１０であった。ＩｇＧクラスの測定を、ラビット抗マ
ウス免疫グロブリンクラス−特異性抗血清（Ｌｉｔｔｏ
ｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｅｓｔ
ｏｎ，ＳＣ）を用いてオクテルロニー法によりテストし
た。第３図に示すように、ＭＡｂ／１−８ｃ６はＩｇＧ
２ａ抗血清とのみ反応した。抗体のＬ鎖クラスは測定さ
れなかった。
抗（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストした１６３２の
ハイブリドーマクローンの中で、２４７のクローンはそ
のような抗体を非常に高濃度産生した。また、これらの
クローン培地液のほとんどはＮ−ＤＳＫおよびフィブリ
ノーゲン被覆プレートと反応した。しかしながら、クロ
ーンＴ２Ｇｌは、前述の３種類のものを被覆したプレー
トすべてと結合する他に、溶解した１２５ＩＢβ１５−
４２リガンドとも結合する抗体を産生した。種々の交差
反応性を有するために、Ｔ２Ｇｌは混合クローンと見な
され、したがって、サブクローン化した。クローン化工
程後、テストした９６の中で単一個クローン（Ｔ２Ｇｌ
ｓ）は、ＥＬＩＳＡにより、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレ
ートと反応するばかりでなく、溶解した１２５ＩＢβ１
５−４２と結合することも出来る抗体を分泌することが
判明した。
ハイブリドーマクローンの中で、２４７のクローンはそ
のような抗体を非常に高濃度産生した。また、これらの
クローン培地液のほとんどはＮ−ＤＳＫおよびフィブリ
ノーゲン被覆プレートと反応した。しかしながら、クロ
ーンＴ２Ｇｌは、前述の３種類のものを被覆したプレー
トすべてと結合する他に、溶解した１２５ＩＢβ１５−
４２リガンドとも結合する抗体を産生した。種々の交差
反応性を有するために、Ｔ２Ｇｌは混合クローンと見な
され、したがって、サブクローン化した。クローン化工
程後、テストした９６の中で単一個クローン（Ｔ２Ｇｌ
ｓ）は、ＥＬＩＳＡにより、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレ
ートと反応するばかりでなく、溶解した１２５ＩＢβ１
５−４２と結合することも出来る抗体を分泌することが
判明した。
サブクローン化後、１０％ＮＣＴＣ１０９および２０％
ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中でクローン
Ｔ２Ｇｌｓの大量培養物を調製した。このハイブリドー
マの廃培地に蓄積した抗体〔ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ〕を半
飽和硫酸アンモニウムで沈殿させることにより精製し、
第二沈殿から得られたＩｇＧを０．０２％ＮａＨ３を含
有する０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）に溶解した。最終
溶液は培地の最初の容量の１／１０であった。前述した
ようにオクテルロニーテストにより測定した際、ＭＡｂ
／Ｔ２ＧｌｓはＩｇＧｌ抗血清とのみ反応した。ＭＡｂ
／Ｔ２ＧｌｓのＬ鎖クラスは測定されなかった。
ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中でクローン
Ｔ２Ｇｌｓの大量培養物を調製した。このハイブリドー
マの廃培地に蓄積した抗体〔ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ〕を半
飽和硫酸アンモニウムで沈殿させることにより精製し、
第二沈殿から得られたＩｇＧを０．０２％ＮａＨ３を含
有する０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）に溶解した。最終
溶液は培地の最初の容量の１／１０であった。前述した
ようにオクテルロニーテストにより測定した際、ＭＡｂ
／Ｔ２ＧｌｓはＩｇＧｌ抗血清とのみ反応した。ＭＡｂ
／Ｔ２ＧｌｓのＬ鎖クラスは測定されなかった。
例４：ＭＡｂ／１−８ｃ６のＮ−ＤＳＫおよび関連構造
体に対する特異性 前述したようにハイブリドーマクローン１−８ｃ６（Ａ
ＴＣＣＨＢ８４１８）からの最初の培養液を、Ｎ−ＤＳ
Ｋまたは前述した関連構造体のいずれかを被覆したプレ
ート上でＥＬＩＳＡによりテストした。Ｎ−ＤＳＫ、フ
ィブリノーゲンまたはＢβ１−１１８を有するプレート
で強いプラス反応が得られた。ＥＬＩＳＡおよびラジオ
イムノアッセイの両方を用いて競合免疫検定法によりＭ
Ａｂ／１−８ｃ６の特異性をさらに検討した。ＥＬＩＳ
Ａは二段法であった。ミクロタイタープレートに、Ｂβ
１−１１８（５μｇ／ｍｌ）を＋４℃／１６ｈｒで被覆
した。ＭＡｂ／１−８ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤トウイーン
を含有する燐酸塩緩衝生理的食塩水）中で希釈し、Ａ
４９０／１０分値を１．５−２．０とした。この抗体希
釈液を標準（Ｂβ１−１１８）または他の所望の競合抗
原と混合し、プレートに添加した。洗浄後、固相に結合
したＭＡｂ／１−８ｃ６の量を、前述した酵素抗免疫グ
ロブリン結合基質おび色原体溶液（例３）を用いて検出
した。これらの検定法で、Ｂβ１−１１８、Ｎ−ＤＳＫ
および無傷フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ６と反
応することが判明した。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ａα１−５
１およびγ１−７８は、検出に用いた各々の溶液がＢβ
１−１１８、Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノーゲンと
比較して約１００Ｘモル過剰であったにもかかわらず反
応しなかった。Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノーゲン
を被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡで同じ結果が得
られた。
体に対する特異性 前述したようにハイブリドーマクローン１−８ｃ６（Ａ
ＴＣＣＨＢ８４１８）からの最初の培養液を、Ｎ−ＤＳ
Ｋまたは前述した関連構造体のいずれかを被覆したプレ
ート上でＥＬＩＳＡによりテストした。Ｎ−ＤＳＫ、フ
ィブリノーゲンまたはＢβ１−１１８を有するプレート
で強いプラス反応が得られた。ＥＬＩＳＡおよびラジオ
イムノアッセイの両方を用いて競合免疫検定法によりＭ
Ａｂ／１−８ｃ６の特異性をさらに検討した。ＥＬＩＳ
Ａは二段法であった。ミクロタイタープレートに、Ｂβ
１−１１８（５μｇ／ｍｌ）を＋４℃／１６ｈｒで被覆
した。ＭＡｂ／１−８ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤トウイーン
を含有する燐酸塩緩衝生理的食塩水）中で希釈し、Ａ
４９０／１０分値を１．５−２．０とした。この抗体希
釈液を標準（Ｂβ１−１１８）または他の所望の競合抗
原と混合し、プレートに添加した。洗浄後、固相に結合
したＭＡｂ／１−８ｃ６の量を、前述した酵素抗免疫グ
ロブリン結合基質おび色原体溶液（例３）を用いて検出
した。これらの検定法で、Ｂβ１−１１８、Ｎ−ＤＳＫ
および無傷フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ６と反
応することが判明した。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ａα１−５
１およびγ１−７８は、検出に用いた各々の溶液がＢβ
１−１１８、Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノーゲンと
比較して約１００Ｘモル過剰であったにもかかわらず反
応しなかった。Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノーゲン
を被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡで同じ結果が得
られた。
ラジオイムノアッセイでは、リガンドは１２５Ｉ−Ｂβ
１−１１８であった。１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８は人フ
ィブリノーゲンからのＢβ１５−４２の沃素化について
述べた方法を用て調製した（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａ
ｌ．，前出、１９８２）。製造業者（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉ
ａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）により略述された示唆に
従ってＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバ抗マウスセルロース懸濁
液）を用いて結合リガンドを分離した。ラジオイムノア
ッセイは、４つの区分からなり、２つの別々の培養時間
を含むものであった。検定手順は、前述したリガンドお
よび第二抗体を除いて、最近記載（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ
ａｌ．，前出、１９８２）のものとほぼ同じであっ
た。
１−１１８であった。１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８は人フ
ィブリノーゲンからのＢβ１５−４２の沃素化について
述べた方法を用て調製した（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａ
ｌ．，前出、１９８２）。製造業者（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉ
ａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）により略述された示唆に
従ってＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバ抗マウスセルロース懸濁
液）を用いて結合リガンドを分離した。ラジオイムノア
ッセイは、４つの区分からなり、２つの別々の培養時間
を含むものであった。検定手順は、前述したリガンドお
よび第二抗体を除いて、最近記載（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ
ａｌ．，前出、１９８２）のものとほぼ同じであっ
た。
ＭＡｂ／１−８ｃ６およびSac-Celの適当な希釈液は
１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８リガンドのほぼ９０％結合す
ることが出来た。ラジオイムノアッセイでは、これらの
試薬の希釈液はコールド競合抗原の不在下でリガンドの
約４０％結合をもたらすように選ばれた。これらの実験
で、ＭＡｂ／１−８ｃ６の代りに緩衝液または対照クロ
ーン培養液から単離したＩｇＧを用いた場合、リガンド
の非特異性結合は５％を超えなかった。リガンドの特異
性結合は、寒冷Ｂβ１−１１８の量を増大させることに
より徐々に阻止された。第４図に示すように、約５×１
０−９Ｍ濃度でリガンド結合の５０％阻止率が得られ
た。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫはすべて強い競合を示した。第４図において、Ｎ−
ＤＳＫは無傷フィブリノーゲンおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
に比較して幾らか弱い競合抗原と思われる。しかしなが
ら、その後の実験で、異なるロットのＮ−ＤＳＫを用い
た場合、フィブリノーゲンおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫと一
致する阻止曲線が得られた（図示せず）。比較すると、
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫは第４図に示す濃度範囲では競合せ
ず、したがってＭＡｂ／１−８ｃ６により結合されなか
った。このことは、テストしたあらゆるロットの（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫで見られた。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫとのわずかの
競合が検出されたが、しかし１０−６Ｍより大きい濃度
においてのみであった。
１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８リガンドのほぼ９０％結合す
ることが出来た。ラジオイムノアッセイでは、これらの
試薬の希釈液はコールド競合抗原の不在下でリガンドの
約４０％結合をもたらすように選ばれた。これらの実験
で、ＭＡｂ／１−８ｃ６の代りに緩衝液または対照クロ
ーン培養液から単離したＩｇＧを用いた場合、リガンド
の非特異性結合は５％を超えなかった。リガンドの特異
性結合は、寒冷Ｂβ１−１１８の量を増大させることに
より徐々に阻止された。第４図に示すように、約５×１
０−９Ｍ濃度でリガンド結合の５０％阻止率が得られ
た。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫはすべて強い競合を示した。第４図において、Ｎ−
ＤＳＫは無傷フィブリノーゲンおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
に比較して幾らか弱い競合抗原と思われる。しかしなが
ら、その後の実験で、異なるロットのＮ−ＤＳＫを用い
た場合、フィブリノーゲンおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫと一
致する阻止曲線が得られた（図示せず）。比較すると、
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫは第４図に示す濃度範囲では競合せ
ず、したがってＭＡｂ／１−８ｃ６により結合されなか
った。このことは、テストしたあらゆるロットの（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫで見られた。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫとのわずかの
競合が検出されたが、しかし１０−６Ｍより大きい濃度
においてのみであった。
トロンビンの公知の特異性およびＢβ１−１１８と
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ間のＭＡｂ／１−８ｃ６との反応性の
差から、Ｂβ１−１１８をラジオイムノアッセイで競合
抗原として使用するためにトロンビンで分解した。第５
図に示すように、トロンビン分解後Ｂβ１−１１８では
移動度に明確な変化が認められた。これは、ＳＤＳの存
在下７％および１０％アクリルアミドゲルの両方で認め
られた。この移動度変化は、Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，前出，１９７９，より報告されている発見と一致
し、したがってＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合のトロ
ンビンによる分解を反映している。第６図は、トロンビ
ン分解前後にＢβ１−１１８で得られた競合曲線を示
す。明らかなように、非分解Ｂβ１−１１８で得られる
同じ阻止率を達成するに、約２０００モル過剰の分解鎖
が必要であった。純ＦＰＢ，Ｂβ１５−４２またはこれ
らの２つのペプチドの混合物は、ラジオイムノアッセイ
において第６図に示す濃度範囲では競合しなかった。
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ間のＭＡｂ／１−８ｃ６との反応性の
差から、Ｂβ１−１１８をラジオイムノアッセイで競合
抗原として使用するためにトロンビンで分解した。第５
図に示すように、トロンビン分解後Ｂβ１−１１８では
移動度に明確な変化が認められた。これは、ＳＤＳの存
在下７％および１０％アクリルアミドゲルの両方で認め
られた。この移動度変化は、Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，前出，１９７９，より報告されている発見と一致
し、したがってＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合のトロ
ンビンによる分解を反映している。第６図は、トロンビ
ン分解前後にＢβ１−１１８で得られた競合曲線を示
す。明らかなように、非分解Ｂβ１−１１８で得られる
同じ阻止率を達成するに、約２０００モル過剰の分解鎖
が必要であった。純ＦＰＢ，Ｂβ１５−４２またはこれ
らの２つのペプチドの混合物は、ラジオイムノアッセイ
において第６図に示す濃度範囲では競合しなかった。
Ｂβ１−１１８に対する反応性の差およびＢβ１−１１
８が多重鎖構造の一部である場合の前記差は、ＭＡｂ／
１−８ｃ６が対象とするエピトープがフィブリノーゲン
および関連ジスルフィド結合フラグメント上で表面配向
されている場合のみ十分反応性であるという事によると
思われる。
８が多重鎖構造の一部である場合の前記差は、ＭＡｂ／
１−８ｃ６が対象とするエピトープがフィブリノーゲン
および関連ジスルフィド結合フラグメント上で表面配向
されている場合のみ十分反応性であるという事によると
思われる。
第６図に示すように、Ｂβ１−１１８鎖がトロンビンで
分解された場合、Ｂβ１−１１８反応性のほとんどは失
われた。この結果は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、遊離Ｂβ１−
１４（ＦＰＢ）ならびにＢβ１５−４２がＭＡｂ／−８
ｃ６と反応することが出来なかったという事実と相俟っ
て、この抗体がトロンビン感受性Ｂβ１４Ａｒｇ−１５
Ｇｌｙ結合中またはその周囲のエピトープに向うという
ことを明示するものである。Ｂβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌ
ｙ結合がトロンビンにより完全に分解された場合、Ｂβ
１−１１８および関連構造体によるすべての免疫反応性
は完全に失われる。
分解された場合、Ｂβ１−１１８反応性のほとんどは失
われた。この結果は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、遊離Ｂβ１−
１４（ＦＰＢ）ならびにＢβ１５−４２がＭＡｂ／−８
ｃ６と反応することが出来なかったという事実と相俟っ
て、この抗体がトロンビン感受性Ｂβ１４Ａｒｇ−１５
Ｇｌｙ結合中またはその周囲のエピトープに向うという
ことを明示するものである。Ｂβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌ
ｙ結合がトロンビンにより完全に分解された場合、Ｂβ
１−１１８および関連構造体によるすべての免疫反応性
は完全に失われる。
例５：ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの特異性 ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの特異性をＥＬＩＳＡ法によりテス
トした。ミクロタイタープロレートに、（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋ（０．８μｇ／ｍｌ）を＋４℃／１６時間で被覆し
た。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓをＴＰＢＳ中で希釈してＡ
４９０／５分値を約１．６とした。この抗体希釈液を所
望の競合抗原の希釈液と混合し、プレートに添加した。
洗浄後、固相に結合した抗体を前記と同様にして（例
３）検定した。
トした。ミクロタイタープロレートに、（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋ（０．８μｇ／ｍｌ）を＋４℃／１６時間で被覆し
た。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓをＴＰＢＳ中で希釈してＡ
４９０／５分値を約１．６とした。この抗体希釈液を所
望の競合抗原の希釈液と混合し、プレートに添加した。
洗浄後、固相に結合した抗体を前記と同様にして（例
３）検定した。
ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは（Ｔ）Ｎ−
ＤＳＫ被覆プレートと強く反応した。この抗体は溶解し
た１２５ＩＢβ１５−４２リガンドとも結合するので、
プレート上にペプチドを被覆し、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓが
そのようなプレートに結合することを証明する試みを行
った。これらの実験で、前述のカップリング緩衝液でＢ
β１５−４２ペプチドの原液〔０．０５−０．１μｇ／
ｍｌ〕をつくった。これらの溶液を被覆したプレート
は、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと特異的に結合することが分っ
た。トロンビン分解Ｂβ１−４２を被覆したプレートで
同様の結果が得られた。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、Ｂβ１
−４２を被覆したプレートと結合しなかった。第１０図
は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレートおよびＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓを用いた競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。用
いた競合抗原はトロンビン分解前後のＢβ１−４であっ
た。Ｂβ１５−４２ペプチドはトロンビン分解Ｂβ１−
４２で見られるものと同じ競合曲線を与えた。
ＤＳＫ被覆プレートと強く反応した。この抗体は溶解し
た１２５ＩＢβ１５−４２リガンドとも結合するので、
プレート上にペプチドを被覆し、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓが
そのようなプレートに結合することを証明する試みを行
った。これらの実験で、前述のカップリング緩衝液でＢ
β１５−４２ペプチドの原液〔０．０５−０．１μｇ／
ｍｌ〕をつくった。これらの溶液を被覆したプレート
は、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと特異的に結合することが分っ
た。トロンビン分解Ｂβ１−４２を被覆したプレートで
同様の結果が得られた。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、Ｂβ１
−４２を被覆したプレートと結合しなかった。第１０図
は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレートおよびＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓを用いた競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。用
いた競合抗原はトロンビン分解前後のＢβ１−４であっ
た。Ｂβ１５−４２ペプチドはトロンビン分解Ｂβ１−
４２で見られるものと同じ競合曲線を与えた。
また、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの特異性を検討するためにラ
ジオイムノアッセイを用いた。用いたリガンドは１２５
１Ｂβ１５−４２であった。１２５ＩＢβ１５−４２は
すでに述べた方法（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前
出，１９８２）を用いて調製した。製造業者（Ｗｅｌｌ
ｃｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）により略述され
ている示唆に従いＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバー抗マウス免疫
グロブリンセルロース懸濁液）を用いて結合リガンドを
分離した。ラジオイムノアッセイは４つの区分からな
り、２つの別々のインキュベーション時間を含み、前述
した特異性〔ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ〕およよび第二抗体を
除いて最近の記載（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前
出，１９８２）のものとほとんど同じであった。
ジオイムノアッセイを用いた。用いたリガンドは１２５
１Ｂβ１５−４２であった。１２５ＩＢβ１５−４２は
すでに述べた方法（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前
出，１９８２）を用いて調製した。製造業者（Ｗｅｌｌ
ｃｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）により略述され
ている示唆に従いＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバー抗マウス免疫
グロブリンセルロース懸濁液）を用いて結合リガンドを
分離した。ラジオイムノアッセイは４つの区分からな
り、２つの別々のインキュベーション時間を含み、前述
した特異性〔ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ〕およよび第二抗体を
除いて最近の記載（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前
出，１９８２）のものとほとんど同じであった。
抗体および第二抗体（Ｓａｃ−Ｃｅｌ）の適当な希釈液
は、競合抗原の不在下で１２５１Ｂβ１５−４２リガン
ドの約４０％結合を与えるように選んだ。第１１図に示
すように、このリガンドの結合は「コールド」Ｂβ１５
−４２標準の量を増大させることにより阻害された。約
２×１０−８Ｍ濃度で５０％置換水準が得られた。トロ
ンビン分解Ｂβ１−４２および（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫで同じ
阻止率が見られた（図示せず）。無傷Ｂβ１−４２、Ｎ
−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはもしあってもほとん
ど阻止率を示さなかった。異なるロットのＩＭＣＯフィ
ブリノーゲンはわずかの阻止率を示した。しかしなが
ら、Ｂβ１５−４２のリガンド最大置換対無傷フィブリ
ノーゲンのそれとを比較するモル比は１：２５０程度で
あった。
は、競合抗原の不在下で１２５１Ｂβ１５−４２リガン
ドの約４０％結合を与えるように選んだ。第１１図に示
すように、このリガンドの結合は「コールド」Ｂβ１５
−４２標準の量を増大させることにより阻害された。約
２×１０−８Ｍ濃度で５０％置換水準が得られた。トロ
ンビン分解Ｂβ１−４２および（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫで同じ
阻止率が見られた（図示せず）。無傷Ｂβ１−４２、Ｎ
−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはもしあってもほとん
ど阻止率を示さなかった。異なるロットのＩＭＣＯフィ
ブリノーゲンはわずかの阻止率を示した。しかしなが
ら、Ｂβ１５−４２のリガンド最大置換対無傷フィブリ
ノーゲンのそれとを比較するモル比は１：２５０程度で
あった。
第１０図および第１１図に示すデータに基いて、前記結
果を以下に説明する。ＦＰＢはＢβ１−４２の一部であ
りかつ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよびＢβ１５−４２の両方か
ら欠除しているので、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓとフィブリノ
ーゲンまたはそのフラグメント間の免疫反応性には、す
べての抗原において結合Ｂβ１４−Ａｒｇ１５Ｇｌｙの
前分解が必要であると思われる。
果を以下に説明する。ＦＰＢはＢβ１−４２の一部であ
りかつ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよびＢβ１５−４２の両方か
ら欠除しているので、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓとフィブリノ
ーゲンまたはそのフラグメント間の免疫反応性には、す
べての抗原において結合Ｂβ１４−Ａｒｇ１５Ｇｌｙの
前分解が必要であると思われる。
第１１図に示すように、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと無傷フィ
ブリノーゲンでわるかであるが測定可能な交差反応が検
出された。すでに述べたように、これは幾つかの異なる
ロットのＩＭＣＯフィブリノーゲンの場合に観察され
た。これに対する１つの説明は、そのようなフィブリノ
ーゲン調製物が溶解して残である少量のフィブリノーゲ
ン−フィブリン複合体として含有しているということで
ある。
ブリノーゲンでわるかであるが測定可能な交差反応が検
出された。すでに述べたように、これは幾つかの異なる
ロットのＩＭＣＯフィブリノーゲンの場合に観察され
た。これに対する１つの説明は、そのようなフィブリノ
ーゲン調製物が溶解して残である少量のフィブリノーゲ
ン−フィブリン複合体として含有しているということで
ある。
〔Ｓｈａｉｎｏｆｆ ＆ Ｐａｇｅ，１９６２〕。その
ような調製物のＮＨ２末端分析で少量のグリシンがほと
んど常に検出されるという事実がこれを支持している。
このアミノ酸は、トロンビン作用の結果としてＦＰＡも
またＦＰＢも放出された場合、新規なＮＨ２末端残基で
ある〔Ｂｌｏｍｂｃｋ ＆ Ｙａｍａｒｈｉｎａ，１
９５８〕。
ような調製物のＮＨ２末端分析で少量のグリシンがほと
んど常に検出されるという事実がこれを支持している。
このアミノ酸は、トロンビン作用の結果としてＦＰＡも
またＦＰＢも放出された場合、新規なＮＨ２末端残基で
ある〔Ｂｌｏｍｂｃｋ ＆ Ｙａｍａｒｈｉｎａ，１
９５８〕。
例４で述べたように、ＭＡｂ／１−８ｃ６は無傷フィブ
リノーゲンと完全に交差反応した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ
は種々のフィブリノーゲン調製物とごくわずしか反応し
なかったので、そのような反応は恐らくフィブリンの微
量汚染によるものと思われた。これらの２つの抗体のフ
ィブリノーゲンに対する反応性の差を比較するために、
フィブリノーゲン被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて非常
に簡単な実験を試みた。フィブリノーゲンおよびフィブ
リン−被覆ＥＬＩＳＡプレートの調製に際して、ＩＭＣ
Ｏフィブリノーゲン（ＬｏｔＦ−１５５，４．３ｍｇ／
ｍｌ）をＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中
で１／５００に希釈し、ポリビニルミクロタイタープレ
ート上に＋４℃／１６時間で被覆した。洗浄、５％ＢＳ
Ａ〔ＲＩＡ級ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ〕による阻止および続く洗浄後、人トロンビン〔Ｓ
ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ〕原液（１ ＮＩＨ
単位／ｎ−生理的食塩水１ｍｌ）１００μｌを各ウエル
に添加した。選定した間隔で、前述のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ原液を等容量添加してトロンビ
ン阻止した。その後の洗浄、反応および結合抗体の検出
は、すでに述べたものと同じであった。
リノーゲンと完全に交差反応した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ
は種々のフィブリノーゲン調製物とごくわずしか反応し
なかったので、そのような反応は恐らくフィブリンの微
量汚染によるものと思われた。これらの２つの抗体のフ
ィブリノーゲンに対する反応性の差を比較するために、
フィブリノーゲン被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて非常
に簡単な実験を試みた。フィブリノーゲンおよびフィブ
リン−被覆ＥＬＩＳＡプレートの調製に際して、ＩＭＣ
Ｏフィブリノーゲン（ＬｏｔＦ−１５５，４．３ｍｇ／
ｍｌ）をＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中
で１／５００に希釈し、ポリビニルミクロタイタープレ
ート上に＋４℃／１６時間で被覆した。洗浄、５％ＢＳ
Ａ〔ＲＩＡ級ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ〕による阻止および続く洗浄後、人トロンビン〔Ｓ
ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ〕原液（１ ＮＩＨ
単位／ｎ−生理的食塩水１ｍｌ）１００μｌを各ウエル
に添加した。選定した間隔で、前述のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ原液を等容量添加してトロンビ
ン阻止した。その後の洗浄、反応および結合抗体の検出
は、すでに述べたものと同じであった。
第１２図に示すように、トロンビン溶液で９０秒以下処
理したフィブリノーゲン被覆ウエルにＭＡｂ／１−８ｃ
６を添加した場合、かなりのＡ４９０／５分値が得られ
た。この抗体をトロンビンで９０秒より長い時間処理さ
れたウエルに添加加した場合、色の急激な減少が見られ
たが、これは抗体結合の低下を意味した。ＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓで、完全に予知出来る逆の結果が得られた。この
抗体を非処理ウエルに添加した場合、バックグランドの
色のみが観察された。しかしながら、トロンビンに対す
る暴露時間が増大すると、非常に有意のＡ４９０／５分
値が記録された。これらの結果は、トロンビン分解によ
りＥＬＩＳＡプレートの表面にネオエピトープが漸次現
われることおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓがこのネオエピト
ープと反応・結合することが出来ることを示唆してい
る。
理したフィブリノーゲン被覆ウエルにＭＡｂ／１−８ｃ
６を添加した場合、かなりのＡ４９０／５分値が得られ
た。この抗体をトロンビンで９０秒より長い時間処理さ
れたウエルに添加加した場合、色の急激な減少が見られ
たが、これは抗体結合の低下を意味した。ＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓで、完全に予知出来る逆の結果が得られた。この
抗体を非処理ウエルに添加した場合、バックグランドの
色のみが観察された。しかしながら、トロンビンに対す
る暴露時間が増大すると、非常に有意のＡ４９０／５分
値が記録された。これらの結果は、トロンビン分解によ
りＥＬＩＳＡプレートの表面にネオエピトープが漸次現
われることおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓがこのネオエピト
ープと反応・結合することが出来ることを示唆してい
る。
例６：ＭＡｂ／１−８ｃ６の臨床的応用 ＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性が確認されたら、臨床研に
おけるその有用性を研究することが興味あることであっ
た。この目的のために、***患者から血液透析中選定
された間隔で血液を集めた。捕集および処理すでに述べ
たものと同じであった（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２５，２７７−２９１，１９
８２）。フィブリノーゲンを最後の微量まで除去するた
めに、患者血漿の凍結乾燥したエタノール出液を使い捨
てＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）でＫ
ｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１６，３４９−４５６，１９８１，
の方法によりさらに精製した。
おけるその有用性を研究することが興味あることであっ
た。この目的のために、***患者から血液透析中選定
された間隔で血液を集めた。捕集および処理すでに述べ
たものと同じであった（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２５，２７７−２９１，１９
８２）。フィブリノーゲンを最後の微量まで除去するた
めに、患者血漿の凍結乾燥したエタノール出液を使い捨
てＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）でＫ
ｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１６，３４９−４５６，１９８１，
の方法によりさらに精製した。
従来の実験で、そのような患者は、正常の被検者に見い
出される０．４１ｐｍｏｌｅｓ／ｍｌの４０倍以上の非
常に高い水準のＢβ１５−４２免疫反応性物質を有する
ことが確定された（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前
出、１９８２）。本発明の研究では、この患者群に普通
見い出されるＢβ１５−４２免疫反応性物質の何％がＭ
Ａｂ／１−８ｃ６と交差反応するかを測定することが興
味あることであった。
出される０．４１ｐｍｏｌｅｓ／ｍｌの４０倍以上の非
常に高い水準のＢβ１５−４２免疫反応性物質を有する
ことが確定された（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前
出、１９８２）。本発明の研究では、この患者群に普通
見い出されるＢβ１５−４２免疫反応性物質の何％がＭ
Ａｂ／１−８ｃ６と交差反応するかを測定することが興
味あることであった。
フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ６と反応するので
（第４図）、前述した方法（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａ
ｌ．，前出，１９９２）により調製した患者の血漿抽出
液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジでさらに精製
した。その後、サンプルを２つの部分に分割し、その１
つの部分をトロンビンで分解した（９０ＮＩＨ単位／ｍ
ｌ、３７℃／６０分）。最後に、各サンプルの適当な希
釈液をつくり、例４と同じラジオイムノアッセイで用い
た。
（第４図）、前述した方法（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａ
ｌ．，前出，１９９２）により調製した患者の血漿抽出
液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジでさらに精製
した。その後、サンプルを２つの部分に分割し、その１
つの部分をトロンビンで分解した（９０ＮＩＨ単位／ｍ
ｌ、３７℃／６０分）。最後に、各サンプルの適当な希
釈液をつくり、例４と同じラジオイムノアッセイで用い
た。
表１は、３人の患者のフィブリノーゲン、ＦＰＡおよび
Ｂβ１５−４２免疫反応物質の血漿濃度を示す。サンプ
ルは、透析前および透析プログラム中の２つの異なる時
点で取った。後者の２つのサンプルは静脈（出口側）血
管からものであった。各患者からの透析前サンプル中の
ＦＰＡ濃度は、ＩＭＣＯ検定キット（Ｗｉｌｈｅｌｍｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，
１５，２５２−２５８，１９８１）を用いた場合、正常
の被検者に見い出される１．４±０．６ｐｍｏｌｅｓ／
ｍｌ水準よりわずかに大きい値であった。３人の患者の
うち２人にサンプル２においてＦＰＡの低下が見られ
た。３人の患者全部からの最後サンプルはサンプル２に
比較して大きい値を示した。
Ｂβ１５−４２免疫反応物質の血漿濃度を示す。サンプ
ルは、透析前および透析プログラム中の２つの異なる時
点で取った。後者の２つのサンプルは静脈（出口側）血
管からものであった。各患者からの透析前サンプル中の
ＦＰＡ濃度は、ＩＭＣＯ検定キット（Ｗｉｌｈｅｌｍｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，
１５，２５２−２５８，１９８１）を用いた場合、正常
の被検者に見い出される１．４±０．６ｐｍｏｌｅｓ／
ｍｌ水準よりわずかに大きい値であった。３人の患者の
うち２人にサンプル２においてＦＰＡの低下が見られ
た。３人の患者全部からの最後サンプルはサンプル２に
比較して大きい値を示した。
これらの結果は、ヘパリン水準が０．５ ＩＵ／ｍｌよ
り大きい場合透析の初期段階時ではＦＰＡは正常かまた
は正常に近いことを示す従来の発見と一致する。ヘパリ
ンがこの値以下になると、一般にＦＰＡ濃度の増大が見
られた（Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前
出、１９８１）。ヘパリン治療の効果はこの様にして検
査することが出来る。たとえば、ＦＰＡの血漿水準の増
大は、脈管内のフィブリン沈着をもたらし得る高トロン
ビン活性の指標として考えることが出来る。
り大きい場合透析の初期段階時ではＦＰＡは正常かまた
は正常に近いことを示す従来の発見と一致する。ヘパリ
ンがこの値以下になると、一般にＦＰＡ濃度の増大が見
られた（Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前
出、１９８１）。ヘパリン治療の効果はこの様にして検
査することが出来る。たとえば、ＦＰＡの血漿水準の増
大は、脈管内のフィブリン沈着をもたらし得る高トロン
ビン活性の指標として考えることが出来る。
Ｂβ１５−４２免疫反応性に関しては、ラビット抗血清
で検出された水準は、正常の血漿で見い出される０．４
１ｐｍｏｌｅｓ／ｍｌよりかなり大きかった（Ｋｕｄｒ
ｙｋ ｅｔ ａｌ．，前出，１９８２）。患者１７２は
３つのサンプルすべてにおいてきわめて似た濃度を示し
た。これは、特に透析前の水準およびサンプル３の水準
を比較した場合、他の２人の患者ではそうでなかった。
ＭＡｂ／１−８ｃ６で検出されたＢβ１５−４２免疫反
応物質の濃度は、ラビット抗血清を用いた場合に見い出
されるものと類似していたが、しかし同じではなかっ
た。前述したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性から、これら
の結果は、全部ではないがほとんどのＢβ１５−４２免
疫物質は無傷Ｂβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合を含有す
るペプチド上に存在することを示唆した。これは、各サ
ンプルをトロンビンで分解し、２つの系を用いて再検定
した場合、部分的に立証された。ラビット抗血清の場合
に検出されるＢβ１５−４２免疫反応性物質の濃度はト
ロンビン分解前後において同じであった。他方、トロン
ビン分解サンプルにおいてＭＡｂ／１−８ｃ６で非常の
少しの免疫反応性物質を測定することが出来た（データ
は示されていない）。
で検出された水準は、正常の血漿で見い出される０．４
１ｐｍｏｌｅｓ／ｍｌよりかなり大きかった（Ｋｕｄｒ
ｙｋ ｅｔ ａｌ．，前出，１９８２）。患者１７２は
３つのサンプルすべてにおいてきわめて似た濃度を示し
た。これは、特に透析前の水準およびサンプル３の水準
を比較した場合、他の２人の患者ではそうでなかった。
ＭＡｂ／１−８ｃ６で検出されたＢβ１５−４２免疫反
応物質の濃度は、ラビット抗血清を用いた場合に見い出
されるものと類似していたが、しかし同じではなかっ
た。前述したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性から、これら
の結果は、全部ではないがほとんどのＢβ１５−４２免
疫物質は無傷Ｂβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合を含有す
るペプチド上に存在することを示唆した。これは、各サ
ンプルをトロンビンで分解し、２つの系を用いて再検定
した場合、部分的に立証された。ラビット抗血清の場合
に検出されるＢβ１５−４２免疫反応性物質の濃度はト
ロンビン分解前後において同じであった。他方、トロン
ビン分解サンプルにおいてＭＡｂ／１−８ｃ６で非常の
少しの免疫反応性物質を測定することが出来た（データ
は示されていない）。
生体内分解産物の性状をさらに特徴づけるため、プール
された患者の血漿から抽出液を調製した。用いた血漿は
表１に示す患者を除く数人の患者からのものであり、透
析や種々の時点で集めた。抽出液を、Ｋｏｅｈｎ ａｎ
ｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１１６，３４９−３５６，１９８１，に記載されて
いるような高性能液体クロマトグラフィーで分別した。
その後、画分のＦＰＡおよびＢβ１５−４２免疫反応性
について検定した。高Ｂβ１５−４２活性を示す画分を
トロンビンで分解し、その後Ｂβ１５−４２検定法なら
びにＦＰＢ免疫検定法を用いて再分析した。第７図に示
すように、ＦＰＡは画分１１−１４において取得され
た。画分５−８ではラビット抗血清およびＭＡｂ／１−
８ｃ６の両方を用いてＢβ１５−４２免疫反応性を検出
した。各画分をトロンビンで分解し、再検定した場合、
ラビット抗体では免疫反応性の変化はもしあっても非常
に小さかった。これに対し、他の２つの検定法を用いた
場合、トロンビン分解画分で大きな差が得られた。ＭＡ
ｂ／１−８ｃ６との免疫反応性が実質的にすべて失われ
た。画分５−８ではトロンビン分解後だけかなりの水準
のＦＰＢ免疫反応性が得られた。画分５−８および１７
−１９ではトロンビン分解前に若干のＦＰＢ免疫反応性
が検出されたことも指摘すべきことである。
された患者の血漿から抽出液を調製した。用いた血漿は
表１に示す患者を除く数人の患者からのものであり、透
析や種々の時点で集めた。抽出液を、Ｋｏｅｈｎ ａｎ
ｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１１６，３４９−３５６，１９８１，に記載されて
いるような高性能液体クロマトグラフィーで分別した。
その後、画分のＦＰＡおよびＢβ１５−４２免疫反応性
について検定した。高Ｂβ１５−４２活性を示す画分を
トロンビンで分解し、その後Ｂβ１５−４２検定法なら
びにＦＰＢ免疫検定法を用いて再分析した。第７図に示
すように、ＦＰＡは画分１１−１４において取得され
た。画分５−８ではラビット抗血清およびＭＡｂ／１−
８ｃ６の両方を用いてＢβ１５−４２免疫反応性を検出
した。各画分をトロンビンで分解し、再検定した場合、
ラビット抗体では免疫反応性の変化はもしあっても非常
に小さかった。これに対し、他の２つの検定法を用いた
場合、トロンビン分解画分で大きな差が得られた。ＭＡ
ｂ／１−８ｃ６との免疫反応性が実質的にすべて失われ
た。画分５−８ではトロンビン分解後だけかなりの水準
のＦＰＢ免疫反応性が得られた。画分５−８および１７
−１９ではトロンビン分解前に若干のＦＰＢ免疫反応性
が検出されたことも指摘すべきことである。
すでに説明したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性から、これ
らの結果は、Ｂβ１５−４２免疫反応性物質のほとんど
がＦＰＢを含有するペプチド上に存在することを示唆し
ている。第７図に示すデータもこの結論を支持してい
る。すなわち、遊離ＦＰＢより非常に早く溶離するペプ
チドはＦＰＢ抗血清と特異的に反応した。したがって、
そのようなペプチドはフィブリノーゲンまたはフィブリ
ンＩからのみ生じることが出来、フィブリンＩＩから生
じ得なかった。表１および第７図に示すデータに関して
はさらに幾つかの意見を加える必要がある。ラビット抗
血清およびＭＡｂ／１−８ｃ６で検出される免疫反応性
物質の水準に関しては、患者５８９からのサンプル２
が、モノクロナール抗体でかなり大きい量が測定された
ことを示す。この１つの説明として、ラビット抗血清に
より普通検出出来るあるＢβ１５−４２免疫反応性物質
はサンプル調製時に失われたということが挙げられる。
Ｂβ１５−４２標準は正常または患者の血清に添加した
場合急速な崩壊を受けることはすでに示されている（Ｋ
ｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前出，１９８２）。この研
究で述べた３つのＢβ鎖関連検定法の場合、高性能液体
クロマトグラフィー画分について多数の免疫反応性論郭
が得られた。第７図に示すものは、プールされた患者血
漿からの抽出液を用いた実験結果であった。他のサンプ
ルのクロマトグラフィーでは全く異なる結果が得られ
た。あるサンプルでは、Ｂβ鎖免疫反応性は、遊離ＦＰ
Ａの近くで溶離する画分にも見られた。これらの結果か
ら、そのような患者はこの報告に記載の抗体と交差反応
し得る多数のペプチドを有することが明らかである。こ
れら生体内ペプチドの正確な分子性状の同定は現在研究
されている。最後に、これら患者の高水準のＢβ１５−
４２免疫反応性物質に関してある論評を行わなければな
らない。サンプル１および２ではＦＰＡ濃度は正常また
は正常に近かったので、用いたヘパリン法により３人の
患者すべてにおいてフィブリン形成が効果的にに抑制さ
れたことは明らかであると思われる。このことならびに
Ｂβ１５−４２免疫反応物質の透析前水準さえ著しく向
上したという事実を念頭に入れて、これら分解産物の損
われた異化作用の問題を考慮しなければならない。この
点において、シャーマンおよび共同者は、幾つかの動物
モデルにおいて非常に多くのフィブリノーゲン分解産物
の回転について研究した。彼等の結果は、***それ自
体よりは機能性腎組織の不全はフィブリノーゲン分解産
物のクリアランスの低下に原因があることを示唆した
（Ｈａｙｎｅ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐ
ａｔｈ．，７１，２１９−２３６，１９７３；Ｉｉｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８７，
９３４−９４６，１９７６）。表１から分るように、あ
る患者は透析時これらのペプチドが一様に増加する。こ
れは、初期段階ではＦＰＡ濃度の増加を伴わないフィブ
リン溶解（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ）から生
じ得る（Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５６，４３８−４４５，１９
７５）。
らの結果は、Ｂβ１５−４２免疫反応性物質のほとんど
がＦＰＢを含有するペプチド上に存在することを示唆し
ている。第７図に示すデータもこの結論を支持してい
る。すなわち、遊離ＦＰＢより非常に早く溶離するペプ
チドはＦＰＢ抗血清と特異的に反応した。したがって、
そのようなペプチドはフィブリノーゲンまたはフィブリ
ンＩからのみ生じることが出来、フィブリンＩＩから生
じ得なかった。表１および第７図に示すデータに関して
はさらに幾つかの意見を加える必要がある。ラビット抗
血清およびＭＡｂ／１−８ｃ６で検出される免疫反応性
物質の水準に関しては、患者５８９からのサンプル２
が、モノクロナール抗体でかなり大きい量が測定された
ことを示す。この１つの説明として、ラビット抗血清に
より普通検出出来るあるＢβ１５−４２免疫反応性物質
はサンプル調製時に失われたということが挙げられる。
Ｂβ１５−４２標準は正常または患者の血清に添加した
場合急速な崩壊を受けることはすでに示されている（Ｋ
ｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，前出，１９８２）。この研
究で述べた３つのＢβ鎖関連検定法の場合、高性能液体
クロマトグラフィー画分について多数の免疫反応性論郭
が得られた。第７図に示すものは、プールされた患者血
漿からの抽出液を用いた実験結果であった。他のサンプ
ルのクロマトグラフィーでは全く異なる結果が得られ
た。あるサンプルでは、Ｂβ鎖免疫反応性は、遊離ＦＰ
Ａの近くで溶離する画分にも見られた。これらの結果か
ら、そのような患者はこの報告に記載の抗体と交差反応
し得る多数のペプチドを有することが明らかである。こ
れら生体内ペプチドの正確な分子性状の同定は現在研究
されている。最後に、これら患者の高水準のＢβ１５−
４２免疫反応性物質に関してある論評を行わなければな
らない。サンプル１および２ではＦＰＡ濃度は正常また
は正常に近かったので、用いたヘパリン法により３人の
患者すべてにおいてフィブリン形成が効果的にに抑制さ
れたことは明らかであると思われる。このことならびに
Ｂβ１５−４２免疫反応物質の透析前水準さえ著しく向
上したという事実を念頭に入れて、これら分解産物の損
われた異化作用の問題を考慮しなければならない。この
点において、シャーマンおよび共同者は、幾つかの動物
モデルにおいて非常に多くのフィブリノーゲン分解産物
の回転について研究した。彼等の結果は、***それ自
体よりは機能性腎組織の不全はフィブリノーゲン分解産
物のクリアランスの低下に原因があることを示唆した
（Ｈａｙｎｅ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐ
ａｔｈ．，７１，２１９−２３６，１９７３；Ｉｉｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８７，
９３４−９４６，１９７６）。表１から分るように、あ
る患者は透析時これらのペプチドが一様に増加する。こ
れは、初期段階ではＦＰＡ濃度の増加を伴わないフィブ
リン溶解（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ）から生
じ得る（Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５６，４３８−４４５，１９
７５）。
１）血液サンプルは透析前（Ｉ）、透析に入って２時間
目（ＩＩ）および各患者を透析器から外す直前、約３時
間後（ＩＩＩ）に採集した。サンプルＩは動脈瘻針によ
り取り出した。他の２つのサンプルは静脈（出口側）血
管の穿刺により採集した。
目（ＩＩ）および各患者を透析器から外す直前、約３時
間後（ＩＩＩ）に採集した。サンプルＩは動脈瘻針によ
り取り出した。他の２つのサンプルは静脈（出口側）血
管の穿刺により採集した。
２）前述した（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ，１９８２）
エレクトロイムノアッセイにより測定した。
エレクトロイムノアッセイにより測定した。
３），４） ＩＭＣＯ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｌｔ
ｄ．， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから購入されるＦＰ
ＡおよびＢβ１５−４２ラジオイムノアッセイキットに
より測定した。各アッセイの方法は製造業者により推奨
されたものであった。
ｄ．， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから購入されるＦＰ
ＡおよびＢβ１５−４２ラジオイムノアッセイキットに
より測定した。各アッセイの方法は製造業者により推奨
されたものであった。
５）ラジオイムノアッセイは、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａ
ｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓに記載されたものであった。人Ｂ
β１−１１８をリガンドとしてもまた標準としても用
い、抗体はＭＡｂ／１−８ｃ６であった。
ｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓに記載されたものであった。人Ｂ
β１−１１８をリガンドとしてもまた標準としても用
い、抗体はＭＡｂ／１−８ｃ６であった。
前記データに基づいて、ＭＡｂ／１−８Ｃ６は、フィブ
リン溶解（ｆｉｂｒｉｎｏ（ｇｅｎｏ）ｌｙｓｉｓ）に
関連する疾病状態の臨床研究において有用な試薬として
役立つと結論される。生体内発生フィブリンの性状およ
びその溶解動力学に関する重要な情報は、Ｂβ鎖標識を
測定する免疫検定法を用いることにより得ることが出来
る。
リン溶解（ｆｉｂｒｉｎｏ（ｇｅｎｏ）ｌｙｓｉｓ）に
関連する疾病状態の臨床研究において有用な試薬として
役立つと結論される。生体内発生フィブリンの性状およ
びその溶解動力学に関する重要な情報は、Ｂβ鎖標識を
測定する免疫検定法を用いることにより得ることが出来
る。
例７：臨床テストサンプル中のＢβ１−４２およびＢβ
１５−４２の存在の測定 １．４ｍｍ針をつけたきずのない静脈穿刺により患者か
ら血液を集めた。最初の２−３ｍｌを捨てた後、続いて
９ｍｌの血液を、１０００ＩＵヘパリンおよび１０００
ＫＩＵトラシロールを含有する１ｍｌの０．１５ＭＮａ
Ｃｌを含む１２ｍｌポリスチレン管に直接流し込んだ。
管をただちにプラスチックフィルムに対して３回逆さに
し、３０００−３５００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
た。各血漿サンプルを直接処理するかまたは−７０℃で
保存した。凍結血漿サンプルを３７℃で迅速に溶かし、
次いで直ちに前述の如くして処理した。血漿処理は次の
ようにして行った。３ｍｌプラスチック管中の１．０ｍ
ｌの血漿に、１．０ｍｌの冷却（氷浴）エタノールを添
加した。氷浴で３０分間混合・培養した後、サンプルを
前記と同様にして遠心分離した。上澄み液を新しい遠心
分離管に移し、氷浴でさらに３０分間保持し、そして再
び遠心分離した。第二の上澄み液を「処理血漿サンプ
ル」とする。
１５−４２の存在の測定 １．４ｍｍ針をつけたきずのない静脈穿刺により患者か
ら血液を集めた。最初の２−３ｍｌを捨てた後、続いて
９ｍｌの血液を、１０００ＩＵヘパリンおよび１０００
ＫＩＵトラシロールを含有する１ｍｌの０．１５ＭＮａ
Ｃｌを含む１２ｍｌポリスチレン管に直接流し込んだ。
管をただちにプラスチックフィルムに対して３回逆さに
し、３０００−３５００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
た。各血漿サンプルを直接処理するかまたは−７０℃で
保存した。凍結血漿サンプルを３７℃で迅速に溶かし、
次いで直ちに前述の如くして処理した。血漿処理は次の
ようにして行った。３ｍｌプラスチック管中の１．０ｍ
ｌの血漿に、１．０ｍｌの冷却（氷浴）エタノールを添
加した。氷浴で３０分間混合・培養した後、サンプルを
前記と同様にして遠心分離した。上澄み液を新しい遠心
分離管に移し、氷浴でさらに３０分間保持し、そして再
び遠心分離した。第二の上澄み液を「処理血漿サンプ
ル」とする。
「処理血漿サンプル」からフィブリノーゲンを最後の微
量まで除去するために、サンプルを、使い捨てＳｅｐ−
ＰａｋＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）でＫｏｅｈｎ ａ
ｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１１６，３４９−３５６（１９８１）、の方法に
よりさらに精製した。
量まで除去するために、サンプルを、使い捨てＳｅｐ−
ＰａｋＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）でＫｏｅｈｎ ａ
ｎｄ Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１１６，３４９−３５６（１９８１）、の方法に
よりさらに精製した。
各「処理血漿サンプル」を、競合的免疫検定法：エンザ
イムリンクドイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジ
オイムノアッセイによりテストした。「処理血漿サンプ
ル」は、２つの部分すなわち、Ｂβ１−４２の存在の検
出に使用する部分およびＢβ１５−４２の存在の検出に
使用する部分に分割することが出来る。ＥＬＩＳＡを用
いてＢβ１−４２抗原の存在についてテストするため
に、ミクロリットルプレートにたとえばＢβ１−４２ま
たはＢβ１−１１８（５μｇ／ｍｌ）を＋４℃／１６時
間で被覆した。ＭＡｂ／１−８Ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤ト
ウイーン−２０を含有する燐酸塩緩衝生理的食塩水）で
希釈して１．５−２．０のＡ４９０／１０分値とした。
この希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合し、
プレートに添加した。培養・洗浄後、固相にに結合した
抗体を前述（例３）と同様にして検出した。
イムリンクドイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジ
オイムノアッセイによりテストした。「処理血漿サンプ
ル」は、２つの部分すなわち、Ｂβ１−４２の存在の検
出に使用する部分およびＢβ１５−４２の存在の検出に
使用する部分に分割することが出来る。ＥＬＩＳＡを用
いてＢβ１−４２抗原の存在についてテストするため
に、ミクロリットルプレートにたとえばＢβ１−４２ま
たはＢβ１−１１８（５μｇ／ｍｌ）を＋４℃／１６時
間で被覆した。ＭＡｂ／１−８Ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤ト
ウイーン−２０を含有する燐酸塩緩衝生理的食塩水）で
希釈して１．５−２．０のＡ４９０／１０分値とした。
この希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合し、
プレートに添加した。培養・洗浄後、固相にに結合した
抗体を前述（例３）と同様にして検出した。
ＥＬＩＳＡを用いてＢβ１５−４２抗原の存在について
テストするために、ミクロリットルプレートにＢβ１５
−４２を４℃／１６ｈｒで被覆した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｃｌ
ｓをＴＰＢＳで希釈して約１．６のＡ４９０／５分値と
した。この抗体希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液
と混合し、プレートに添加した。培養・洗浄後、固相に
結合した抗体を前述（例３）と同様にして検出した。
テストするために、ミクロリットルプレートにＢβ１５
−４２を４℃／１６ｈｒで被覆した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｃｌ
ｓをＴＰＢＳで希釈して約１．６のＡ４９０／５分値と
した。この抗体希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液
と混合し、プレートに添加した。培養・洗浄後、固相に
結合した抗体を前述（例３）と同様にして検出した。
ＲＩＡを用いてＢβ１−４２抗原の存在について「処理
血漿サンプル」をテストするために、前述した方法（例
４）を行った。リガンドは１２５Ｉ−Ｂβ１−４２また
は１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８であり、抗体はＭＡｂ／１
−８Ｃ６であり、第二抗体はロバの抗マウス抗体をセル
ロースに懸濁させたもの、すなわちＳａｃ−Ｃｅｌであ
った。（例４）。
血漿サンプル」をテストするために、前述した方法（例
４）を行った。リガンドは１２５Ｉ−Ｂβ１−４２また
は１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８であり、抗体はＭＡｂ／１
−８Ｃ６であり、第二抗体はロバの抗マウス抗体をセル
ロースに懸濁させたもの、すなわちＳａｃ−Ｃｅｌであ
った。（例４）。
ＲＩＡを用いてＢβ１５−４２抗原の存在についてテス
トするために、前記と同じ手順に従った。リガンドは
１２５Ｉ−Ｂβ１５−４２であり、抗体はＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓであり、第二抗体はＳａｃ Ｃｅｌであった。
トするために、前記と同じ手順に従った。リガンドは
１２５Ｉ−Ｂβ１５−４２であり、抗体はＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓであり、第二抗体はＳａｃ Ｃｅｌであった。
本発明は、その精神または本質的な属性から逸脱するこ
となく他の特定の形態で具体化することが出来、したが
って、本発明の範囲を指摘するものとして前記明細書の
記載でなく、添付の特許請求の範囲を参照することが必
要である。
となく他の特定の形態で具体化することが出来、したが
って、本発明の範囲を指摘するものとして前記明細書の
記載でなく、添付の特許請求の範囲を参照することが必
要である。
第１図は、ＳＤＳの存在下７％ポリアクリルアミドゲル
中のＮ−ＤＳＫ（１）、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（２）、およ
び（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ（３）の電気泳動パターンを示す図
面に代る写真である。各Ｎ−ＤＳＫ種の移動度が示され
る。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはバトロキソビン誘導フィブリン
から単離し、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから人トロ
ンビン分解により調製した。 第２ａ図、および第２ｂ図は、Ｎ−ＤＳＫ（第２ａ図）
および（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（第２ｂ図）からのトロンビン
分解ペプチドの高性能液体クロマトグラフィーによる分
別を示すグラフである。溶離パターンは２０６ｎｍでの
吸光度を測定することにより得た。カラムおよびクロマ
トグラフィー条件、Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅ
ｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，３４
９−３５６，１９８１、に記載のものと同じであった。 第３図は、クラス特異性抗血清を用いるＭＡｂ／１−８
Ｃ６のオクテルロニー分析を示す図面に代る写真であ
る。抗原は正常マウス血漿（Ａ）およびＭＡｂ／１−８
Ｃ６（Ｂ）であり、クラス特異性抗血清は：抗ＩｇＧ１
（１）：抗ＩｇＧ２ａ（２）：抗ＩｇＧ２ｂ（３）：抗
ＩｇＧ３（４）であった。 第４図は、種々の「コールド」競合抗原による１２５Ｉ
−Ｂβ１−１１８リガンドの結合阻止を示すグラフであ
る。ＭＡｂ／１−８Ｃ６の１／４０希釈液を使用した。
ＭＡｂ／１−８Ｃ６は競合抗原の不在下でリガンドの約
４０％と結合した。非特異性結合は５％未満であった。
少なくとも５つの異なる実験の平均値を示す。Ｎ−ＤＳ
Ｋの他の２つの鎖（すなわち、Ａα−１−５１およびγ
１−７８）でここに示す濃度範囲では阻止が見られなか
った。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−
ＤＳＫは、２モルのＢβ鎖（フィブリノーゲンの場合）
またはＢβ１−１１８（両Ｎ−ＤＳＫ種の場合）を有す
る二量体である。したがって、計算に用いた演算分子量
（ｍｏｌ．ｗｔ．）は各々の実際の分子量の１／２であ
った。 第５図は、トロンビン分解前（ゲル１および３）および
後（ゲル２および４）のＢβ１−１１８の電気泳動パタ
ーンを示す。ゲル１および２はＳＤＳ中１０％アクリル
アミドであり、ゲル３および４はＳＤＳ中７％アクリル
アミドであった。各ゲルのＢβ鎖の移動度を図面に代る
写真である。 第６図は、トロンビン分解前後における標準量の「コー
ルド」Ｂβ１−１１８による１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８
の結合阻止を示すグラフである。抗体希釈、特異的およ
び非特異的結合は第４図に示す通りであった。８つの連
続実験の平均を示し、標準偏差を垂直バーで示す。 第７ａ図、第７ｂ図および第７ｃ図は、プールされた
（５．７ｍｌ）患者血漿からつくった抽出液を用いて高
性能クロマトグラフィー操作から得られた画分について
の免疫反応性論郭を示すグラフである。カラムおよび条
件は第２図に示すものと同じであった。クロマトグラフ
ィー後、アセトニトリルを留去し、各画分を１．０ｍｌ
の０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解し、免疫検定法で用
いた。トロンビン分解前後に画分５−８のみを分析し
た。サンプルのＦＰＡをトロンビン分解前のみ測定し
た。トップパネル：商用Ｂβ１５−４２ラジオイムノア
ッセイキット〔ＩＭＣＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌ
ｔｄ．，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ〕を用いる
免疫反応性；中間パネル：ＭＡｂ／１−８Ｃ６で測定し
た免疫反応性；底部パネル：トロンビン後のみの画分５
−８のＦＰＢ免疫反応性。画分５−８および１７−１９
にＦＰＢが見い出された。 第８図は、Ｎｏｓｓｅｌおよび共同者により仮定された
トロンビンおよびプラスミンによる生体内フィブリノー
ゲンタンパク質加水分解の図解を示す（Ｎｏｓｓｅｌ
ａｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６４，
１３７１−１３７８，１９７９、からの修正図）。 第９図は、人トロンビンによる分解前（ａ）および後
（ｂ）のＢβ１−４２ペプチドのＨＰＬＣ溶離パターン
を示すグラフである。画分の免疫反応性輪郭（陰影領
域）は、１２５Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンドおよびＢβ
１５−４２に対するラビット抗血清を用いてラジオイム
ノアッセイにより得た（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，
前出、１９８２）。（ｂ）でカラムに適用されたトロン
ビン分解ペプチドの量は（ａ）の場合の約３倍であっ
た。研究によれば、指摘された画分で抗原の７０％超を
取得出来ることが分った。 第１０図は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレート（０．８μ
ｇ／ｍｌおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを用いる競合ＥＬＩ
ＳＡを示すグラフである。阻害剤はトロンビンによる分
解前後のＢβ１−４２であった。緩衝液対照ウェル（阻
害剤添加せず）のＡ４９０／５分値は約０．８であっ
た。 第１１図は、１２５Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンドのＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓへの結合の指摘された「コールド」競合
抗原による阻止を示すグラフである。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
はＢβ１５−４２またはトロンビン分解Ｂβ１−４２で
示されるものと同じ阻止曲線を与えた。無傷Ｂβ１−４
２，Ｂβ１−１１８，Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳ
Ｋは、図示の濃度範囲で交差反応しなかった。正常の人
血漿を用いた場合わずかの競合が見られたが、非常に低
い希釈率で添加した場合だけであった。 第１２図は、トロンビン分解後のフィブリノーゲン被覆
ＥＬＩＳＡプレート上ににおける２つの異なるモノクロ
ナール抗体の反応性を示すグラフである。実験は、トロ
ンビンを添加した単一プレート（９６ウェル）上で行っ
た。指摘された時点における分解は、トロンビン阻害剤
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｎｇ−ＣＨ２Ｃｌを添加して停
止させた。対照（非分解）フィブリノーゲン被覆プレー
ト上のＭＡｂ／１−８ｃ６に対するＡ４９０／５分値は
約１．７であった。同じプレート上で、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ
ｌｓのみがバックグラウンドの色を与えた。
中のＮ−ＤＳＫ（１）、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（２）、およ
び（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ（３）の電気泳動パターンを示す図
面に代る写真である。各Ｎ−ＤＳＫ種の移動度が示され
る。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはバトロキソビン誘導フィブリン
から単離し、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから人トロ
ンビン分解により調製した。 第２ａ図、および第２ｂ図は、Ｎ−ＤＳＫ（第２ａ図）
および（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（第２ｂ図）からのトロンビン
分解ペプチドの高性能液体クロマトグラフィーによる分
別を示すグラフである。溶離パターンは２０６ｎｍでの
吸光度を測定することにより得た。カラムおよびクロマ
トグラフィー条件、Ｋｏｅｈｎ ａｎｄ Ｃａｎｆｉｅ
ｌｄ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，３４
９−３５６，１９８１、に記載のものと同じであった。 第３図は、クラス特異性抗血清を用いるＭＡｂ／１−８
Ｃ６のオクテルロニー分析を示す図面に代る写真であ
る。抗原は正常マウス血漿（Ａ）およびＭＡｂ／１−８
Ｃ６（Ｂ）であり、クラス特異性抗血清は：抗ＩｇＧ１
（１）：抗ＩｇＧ２ａ（２）：抗ＩｇＧ２ｂ（３）：抗
ＩｇＧ３（４）であった。 第４図は、種々の「コールド」競合抗原による１２５Ｉ
−Ｂβ１−１１８リガンドの結合阻止を示すグラフであ
る。ＭＡｂ／１−８Ｃ６の１／４０希釈液を使用した。
ＭＡｂ／１−８Ｃ６は競合抗原の不在下でリガンドの約
４０％と結合した。非特異性結合は５％未満であった。
少なくとも５つの異なる実験の平均値を示す。Ｎ−ＤＳ
Ｋの他の２つの鎖（すなわち、Ａα−１−５１およびγ
１−７８）でここに示す濃度範囲では阻止が見られなか
った。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−
ＤＳＫは、２モルのＢβ鎖（フィブリノーゲンの場合）
またはＢβ１−１１８（両Ｎ−ＤＳＫ種の場合）を有す
る二量体である。したがって、計算に用いた演算分子量
（ｍｏｌ．ｗｔ．）は各々の実際の分子量の１／２であ
った。 第５図は、トロンビン分解前（ゲル１および３）および
後（ゲル２および４）のＢβ１−１１８の電気泳動パタ
ーンを示す。ゲル１および２はＳＤＳ中１０％アクリル
アミドであり、ゲル３および４はＳＤＳ中７％アクリル
アミドであった。各ゲルのＢβ鎖の移動度を図面に代る
写真である。 第６図は、トロンビン分解前後における標準量の「コー
ルド」Ｂβ１−１１８による１２５Ｉ−Ｂβ１−１１８
の結合阻止を示すグラフである。抗体希釈、特異的およ
び非特異的結合は第４図に示す通りであった。８つの連
続実験の平均を示し、標準偏差を垂直バーで示す。 第７ａ図、第７ｂ図および第７ｃ図は、プールされた
（５．７ｍｌ）患者血漿からつくった抽出液を用いて高
性能クロマトグラフィー操作から得られた画分について
の免疫反応性論郭を示すグラフである。カラムおよび条
件は第２図に示すものと同じであった。クロマトグラフ
ィー後、アセトニトリルを留去し、各画分を１．０ｍｌ
の０．２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解し、免疫検定法で用
いた。トロンビン分解前後に画分５−８のみを分析し
た。サンプルのＦＰＡをトロンビン分解前のみ測定し
た。トップパネル：商用Ｂβ１５−４２ラジオイムノア
ッセイキット〔ＩＭＣＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌ
ｔｄ．，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ〕を用いる
免疫反応性；中間パネル：ＭＡｂ／１−８Ｃ６で測定し
た免疫反応性；底部パネル：トロンビン後のみの画分５
−８のＦＰＢ免疫反応性。画分５−８および１７−１９
にＦＰＢが見い出された。 第８図は、Ｎｏｓｓｅｌおよび共同者により仮定された
トロンビンおよびプラスミンによる生体内フィブリノー
ゲンタンパク質加水分解の図解を示す（Ｎｏｓｓｅｌ
ａｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６４，
１３７１−１３７８，１９７９、からの修正図）。 第９図は、人トロンビンによる分解前（ａ）および後
（ｂ）のＢβ１−４２ペプチドのＨＰＬＣ溶離パターン
を示すグラフである。画分の免疫反応性輪郭（陰影領
域）は、１２５Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンドおよびＢβ
１５−４２に対するラビット抗血清を用いてラジオイム
ノアッセイにより得た（Ｋｕｄｒｙｋ ｅｔ ａｌ．，
前出、１９８２）。（ｂ）でカラムに適用されたトロン
ビン分解ペプチドの量は（ａ）の場合の約３倍であっ
た。研究によれば、指摘された画分で抗原の７０％超を
取得出来ることが分った。 第１０図は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレート（０．８μ
ｇ／ｍｌおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを用いる競合ＥＬＩ
ＳＡを示すグラフである。阻害剤はトロンビンによる分
解前後のＢβ１−４２であった。緩衝液対照ウェル（阻
害剤添加せず）のＡ４９０／５分値は約０．８であっ
た。 第１１図は、１２５Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンドのＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓへの結合の指摘された「コールド」競合
抗原による阻止を示すグラフである。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
はＢβ１５−４２またはトロンビン分解Ｂβ１−４２で
示されるものと同じ阻止曲線を与えた。無傷Ｂβ１−４
２，Ｂβ１−１１８，Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳ
Ｋは、図示の濃度範囲で交差反応しなかった。正常の人
血漿を用いた場合わずかの競合が見られたが、非常に低
い希釈率で添加した場合だけであった。 第１２図は、トロンビン分解後のフィブリノーゲン被覆
ＥＬＩＳＡプレート上ににおける２つの異なるモノクロ
ナール抗体の反応性を示すグラフである。実験は、トロ
ンビンを添加した単一プレート（９６ウェル）上で行っ
た。指摘された時点における分解は、トロンビン阻害剤
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｎｇ−ＣＨ２Ｃｌを添加して停
止させた。対照（非分解）フィブリノーゲン被覆プレー
ト上のＭＡｂ／１−８ｃ６に対するＡ４９０／５分値は
約１．７であった。同じプレート上で、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ
ｌｓのみがバックグラウンドの色を与えた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マイケル イー．ウイーブ アメリカ合衆国，コネチカツト 06903, スタンフオード，ハービランド コート 83 (56)参考文献 特開 昭53−52621（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−24862（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，59（５），1006−1012 （1982) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，15（６）, 1203−1209（1976) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，254（11）, 4925−4932（1979) Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，６（４）, 357−374（1975) Ｎａｔｕｒｅ．256，495−497（1975)
Claims (12)
- 【請求項１】次の性質： ａ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２のペプチドフラグメントと反応
しない； を有するモノクロナール抗体。 - 【請求項２】ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４１８によ
り産生される特許請求の範囲第１項に記載のモノクロナ
ール抗体。 - 【請求項３】次の性質： ａ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２のペプチドフラグメントと反応
しない； を有するモノクロナール抗体と血漿サンプルとを接触さ
せることにより、エンザイムリンクドイムノアッセイま
たはラジオイムノアッセイによって前記血漿サンプル中
の人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１−４２を含有するフラグメントの存在を検
出する方法。 - 【請求項４】前記抗体を前記サンプルと、人フィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有する放射能標識フラグメントの存在下で混合
し、前記抗体に結合した放射能標識フラグメントを前記
抗体に特異性のある抗体を用いて分離する特許請求の範
囲第３項に記載の方法。 - 【請求項５】前記抗体を前記サンプルと混合し、この混
合物を人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖
のアミノ酸残基１−４２を含有するポリペプチドフラグ
メントと接触せしめ、そして前記抗体に特異性のある抗
体が酵素結合されている特許請求の範囲第３項に記載の
方法。 - 【請求項６】エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
セイである特許請求の範囲第３項に記載の方法。 - 【請求項７】ラジオイムノアッセイである特許請求の範
囲第４項に記載の方法。 - 【請求項８】前記エンザイムリンクドイムノソルベント
アッセイまたは前記ラジオイムノアッセイの結果を、既
知標準と比較することにより正常サンプルに対するテス
トサンプル中の相対抗原濃度を測定する特許請求の範囲
第３項に記載の方法。 - 【請求項９】血漿サンプル中に存在する、人フィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有するペプチドフラグメントの量を測定する方
法であって、 （１）前記サンプルを、 次の性質： ａ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２のペプチドフラグメントと反応
しない； を有するマウスモノクロナール抗体、 人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントを含
んでなる固体担体上の競合抗原、およびマウス免疫グロ
ブリンと結合する酵素結合抗体の既知量と接触させ； （２）結合した酸素結合抗体の量を測定することにより
固体担体上の競合抗原に結合したモノクロナール抗体の
量を検出し；そして （３）工程（１）および（２）の結果を、人フィブリノ
ーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−
４２を含有するペプチドフラグメントからなる既知抗原
の標準量を用いて得られた結果と比較する； ことを特徴とする方法。 - 【請求項１０】血漿サンプル中に存在する、人フィブリ
ノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１
−４２を含有するペプチドフラグメントの量を測定する
方法であって、 （１）前記サンプルを、 次の性質： ａ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２のペプチドフラグメントと反応
しない； を有するマウスモノクロナール抗体、および 人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントを含
んでなる競合放射能標識抗原各々の既知量と、該競合放
射能標識抗原が前記モノクロナール抗体と結合出来るよ
うに接触させ； （２）工程（１）の前記サンプル、前記モノクロナール
抗体および競合放射能標識抗原をマウス免疫グロブリン
に対して特異性のある抗体と接触させ； （３）工程（２）の抗体を用いて工程（２）の抗体と結
合した放射能標識抗原を分離し； （４）工程（３）の結合した放射能標識抗原の放射能を
計数し；そして （５）工程（１），（２），（３）および（４）の結果
を、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
を含んでなる既知抗原の標準量を用いて得られた結果と
比較する； ことを特徴とする方法。 - 【請求項１１】テストサンプルに含まれる血漿が特定の
アミノ酸配列のペプチドを含有するか否かを決定するた
めのキットであって、 （ｉ）次の性質： ａ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２のペプチドフラグメントと反応
しない； を有するモノクロナール抗体、 （ｉｉ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ
鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメ
ント、 （ｉｉｉ）人フィブリノーゲン、および （ｉｖ）特物免疫グロブリンに対して特異性のある酵素
結合免疫グロブリン、 を含んで成るキット。 - 【請求項１２】前記モノクロナール抗体がマウスモノク
ロナール抗体であり、そして動物の免疫グロブリンがマ
ウス免疫グロブリンである特許請求の範囲第１１項に記
載のキット。
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| US5357042A (en) * | 1984-04-23 | 1994-10-18 | The General Hospital Corporation | Synthetic peptides capable of eliciting fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity |
| US4927916A (en) * | 1984-04-23 | 1990-05-22 | The General Hospital Corporation | Method of producing fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity using fibrin-specific peptides |
| JPS60233553A (ja) * | 1984-05-04 | 1985-11-20 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | フイブリノゲン・フイブリン分解産物の測定方法 |
| JPS60257363A (ja) * | 1984-06-05 | 1985-12-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Ｆｄｐの測定法 |
| JPS60257364A (ja) * | 1984-06-05 | 1985-12-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | フイブリノゲン・フイブリン分解産物の測定法 |
| US5116613A (en) * | 1985-01-08 | 1992-05-26 | The General Hospital Corporation | Antibody-thrombolytic agent product and method of use |
| US5256413A (en) * | 1985-01-08 | 1993-10-26 | The General Hospital Corporation | Method and use for site-specific activation of substances |
| CA1302919C (en) * | 1985-07-03 | 1992-06-09 | Robert T. Buckler | Histamine derivatives, immunogen conjugates and antibodies raised thereto |
| JPS6393800A (ja) * | 1986-10-08 | 1988-04-25 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 抗人フイブリンモノクロ−ナル抗体ならびにその使用法 |
| SE8701437L (sv) * | 1987-04-06 | 1988-10-07 | Rolf Kenth Sigvard Wallin | Diagnostiskt foerfarande in vitro samt medel som kan utnyttjas vid foerfarandet |
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| US5382522A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Immunoassay for creatine kinase-MB and creatine kinase-BB isoforms and reagents |
| US4900662A (en) * | 1987-07-21 | 1990-02-13 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | CK-MM myocardial infarction immunoassay |
| US5382515A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Creative kinase-MB immunoassay for myocardial infarction and reagents |
| DE3727610A1 (de) | 1987-08-19 | 1989-03-02 | Behringwerke Ag | Synthetische peptide, gegen diese gerichtete antikoerper und deren verwendung |
| DE3730059A1 (de) * | 1987-09-08 | 1989-03-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
| US6541275B1 (en) | 1988-02-03 | 2003-04-01 | Dade Behring Inc. | Immunoassay for F1.2 prothrombin fragment |
| US5582862A (en) * | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
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| US5120834A (en) * | 1988-06-13 | 1992-06-09 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Fibrin-specific monoclonal antibody |
| US5453359A (en) * | 1988-06-13 | 1995-09-26 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers |
| US5609869A (en) * | 1988-08-19 | 1997-03-11 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| US5811265A (en) * | 1988-08-19 | 1998-09-22 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| DE68929127T2 (de) * | 1988-10-03 | 2000-05-31 | Scripps Research Inst La Jolla | Monoklonale antikörper gegen rezeptor-induzierte bindungsstellen auf liganden, die an proteine der cytoadhesin-superfamilie binden |
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| US5817768A (en) * | 1995-06-07 | 1998-10-06 | The New York Blood Center, Inc. | Monospecific antibodies against a subunit of fibrinogen |
| CA2266339A1 (en) * | 1996-09-20 | 1998-03-26 | The General Hospital Corporation | Chimeric, humanized and single chain antibodies to alpha-2-antiplasmin |
| AU2002220255A1 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-18 | The Penn State Research Foundation | A monoclonal antibody-based diagnostic assay for gamma fibrinogen |
| WO2012014997A1 (ja) * | 2010-07-30 | 2012-02-02 | シスメックス株式会社 | 抗ｆｄｐモノクローナル抗体、それを用いたｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びにｆｄｐ測定方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US4090846A (en) * | 1976-10-20 | 1978-05-23 | Fisher Scientific Company | Indirect latex test for determination of fibrinogen degradation products |
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| Ｂｌｏｏｄ，５９（５），１００６−１０１２（１９８２） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４（１１），４９２５−４９３２（１９７９） |
| Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５−４９７（１９７５） |
| Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，６（４），３５７−３７４（１９７５） |
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