JPS6197230A - ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 - Google Patents
ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体Info
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- JPS6197230A JPS6197230A JP59217312A JP21731284A JPS6197230A JP S6197230 A JPS6197230 A JP S6197230A JP 59217312 A JP59217312 A JP 59217312A JP 21731284 A JP21731284 A JP 21731284A JP S6197230 A JPS6197230 A JP S6197230A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対する
選択的吸着体及びそれを用いてヒト血漿中よりヒトα２
−プラスミンインヒビターを分離する方法に関するもの
である。
選択的吸着体及びそれを用いてヒト血漿中よりヒトα２
−プラスミンインヒビターを分離する方法に関するもの
である。
ｂ、従来技術
しトのα、−プラスミンインヒビタ−は、青水と諸井に
よって最初に単離・精製され、＠雑木溶解酵素のプラス
ミン（ｐｌａｓｍｉｎ ）のエステラーゼ活性を瞬間的
に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１
．７９６の糖を含む分子量約６７．０００の１本鎖の糖
蛋白質であることが知られている（ Ｍｏｒａｌ ａｎ
ｄ ＡｏｋｉｙＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋２５１．５９５
６−５９６５（１９７６）参照〕。
よって最初に単離・精製され、＠雑木溶解酵素のプラス
ミン（ｐｌａｓｍｉｎ ）のエステラーゼ活性を瞬間的
に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１
．７９６の糖を含む分子量約６７．０００の１本鎖の糖
蛋白質であることが知られている（ Ｍｏｒａｌ ａｎ
ｄ ＡｏｋｉｙＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋２５１．５９５
６−５９６５（１９７６）参照〕。
またその血漿中の濃度は、健常人で６．１３ｆ０．８８
ＩＩ９／１０ ｏｕであることも知られている（Ｎ、Ａ
ｏｋｉ ａｎｄ Ｔ、Ｙａｍａｎａｋａ＋Ｃ１ｉｎＣ１
１ｎｉｃａＣｈｉ Ａｃｔａ ８４．９９−１０５ （
１９７８）参照〕。
ＩＩ９／１０ ｏｕであることも知られている（Ｎ、Ａ
ｏｋｉ ａｎｄ Ｔ、Ｙａｍａｎａｋａ＋Ｃ１ｉｎＣ１
１ｎｉｃａＣｈｉ Ａｃｔａ ８４．９９−１０５ （
１９７８）参照〕。
一方ヒトのα！−プラスミンインヒビターには３種類の
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線雑木溶解作用阻害部位（以下これを１リアクテイブ
サイト′ということがある） ＣＢ 、 Ｗ’ｉｍａｎ
ａｎｄ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋２５４．９２９１−９２９７（１９７９）参照〕 で
あり、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合部
位ＣＢ 、Ｗｉｍａｎ ａｎｄ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ；
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ＋ ８４ ＋５７３−５７８（１９７８
）参照〕であり、第３はアミ７基末端のフィブリン結合
部位である（ Ｙ 、 ５ａｋａｔａ 、 ｅｔ ａｌ
、 、 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋
１６ 、２７９−２８２ （１９７９）＃照〕、最近、
ヒトα２−プラスミンインヒビターの理学的、生物学的
性質の解明が進み、ヒトα。
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線雑木溶解作用阻害部位（以下これを１リアクテイブ
サイト′ということがある） ＣＢ 、 Ｗ’ｉｍａｎ
ａｎｄ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋２５４．９２９１−９２９７（１９７９）参照〕 で
あり、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合部
位ＣＢ 、Ｗｉｍａｎ ａｎｄ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ；
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ＋ ８４ ＋５７３−５７８（１９７８
）参照〕であり、第３はアミ７基末端のフィブリン結合
部位である（ Ｙ 、 ５ａｋａｔａ 、 ｅｔ ａｌ
、 、 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋
１６ 、２７９−２８２ （１９７９）＃照〕、最近、
ヒトα２−プラスミンインヒビターの理学的、生物学的
性質の解明が進み、ヒトα。
−グラスミ／インヒビターはｌＮ！！維素溶雑木構に対
して、ｍｙな作用をしていることが知られている〔例え
ば青水延雄１医学のあゆみ′１２６．１４７−１５５（
１９８３）参照〕。
して、ｍｙな作用をしていることが知られている〔例え
ば青水延雄１医学のあゆみ′１２６．１４７−１５５（
１９８３）参照〕。
また、Ｃ２−プラスミンインヒビタ−先天的欠損症患者
の血液を試験管に入れ３７℃に放置すると、凝固はまっ
たく正常におこるが４〜８時間で＃血は完全に自然溶解
する （ Ｎ 、 Ａｏｋｉ ＋ ｅｔａｌ、 ＋ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＩｎｖｅ
ｓｔｉ＋ ６３ ＋８７７−８８４（１９７９，）参照
〕。
の血液を試験管に入れ３７℃に放置すると、凝固はまっ
たく正常におこるが４〜８時間で＃血は完全に自然溶解
する （ Ｎ 、 Ａｏｋｉ ＋ ｅｔａｌ、 ＋ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＩｎｖｅ
ｓｔｉ＋ ６３ ＋８７７−８８４（１９７９，）参照
〕。
実際−−プラスミンインヒビタ−欠損症に於ては、止血
栓の早期崩簸によるきわめて重篤な出血傾向がみられる
。
栓の早期崩簸によるきわめて重篤な出血傾向がみられる
。
この事実は、逆に１重篤な血栓症に於て血液中のＣ８−
プラスミンインヒビタ−の量を減少させることにより病
因となっている血栓を速やかに溶解し得ることを示唆し
ているものと考えられる。
プラスミンインヒビタ−の量を減少させることにより病
因となっている血栓を速やかに溶解し得ることを示唆し
ているものと考えられる。
Ｃ０発明の構成
そこで、本発明者らは、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体について研究を重ねた
ところ、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線雑木溶解作用阻止部位を特異的に認識し、
ヒトα２−プラスミンインヒビターの線雑木溶解阻止作
用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し
、またこのモノクローナル抗体を産生ずるバイプリドー
マ細胞を創作し得、既に提案した。
ターに対するモノクローナル抗体について研究を重ねた
ところ、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線雑木溶解作用阻止部位を特異的に認識し、
ヒトα２−プラスミンインヒビターの線雑木溶解阻止作
用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し
、またこのモノクローナル抗体を産生ずるバイプリドー
マ細胞を創作し得、既に提案した。
本発明者らは、かくして得られたモノクー−ナル抗体の
特異的な作用の利用について更に研究を進めた結果、ヒ
トａ、−プラスミンインヒビタ−を特異的に吸着し得る
吸着体及びそれを用いてヒト血漿中のヒトα、−プラス
ミ。
特異的な作用の利用について更に研究を進めた結果、ヒ
トａ、−プラスミンインヒビタ−を特異的に吸着し得る
吸着体及びそれを用いてヒト血漿中のヒトα、−プラス
ミ。
ンインヒビターを選択的に分離し得ることを見出し本発
明Ｋ ｊ！Ｉ達したものである〇すなわち、本発明はヒ
トα２−プラスミンインヒビターにおけるプラスミンの
線雑木溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結合し得
るモノクローナル抗体をリガンドとして不溶性担体に結
合させたヒト偽−プラスミンインヒピターに対する選択
的吸着体であり、またその吸着体を用いてヒト血漿中よ
りヒトα２−プラスミンインヒビターを選択的に分離す
る方法である。
明Ｋ ｊ！Ｉ達したものである〇すなわち、本発明はヒ
トα２−プラスミンインヒビターにおけるプラスミンの
線雑木溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結合し得
るモノクローナル抗体をリガンドとして不溶性担体に結
合させたヒト偽−プラスミンインヒピターに対する選択
的吸着体であり、またその吸着体を用いてヒト血漿中よ
りヒトα２−プラスミンインヒビターを選択的に分離す
る方法である。
一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の分離・精
製に利用するりｐマドグラフィーは、７フイニテイーク
ロマトグラフイーと呼ばれている〔例えば、千畑一部、
土佐哲也。
製に利用するりｐマドグラフィーは、７フイニテイーク
ロマトグラフイーと呼ばれている〔例えば、千畑一部、
土佐哲也。
松尾雄志著「実験と応用アフィニティークロマトグラフ
ィー」講映社すイコンティフィックε照〕。
ィー」講映社すイコンティフィックε照〕。
本発明におけるアフィニティー、リガンド。
不溶性担体、吸着体なる語は、それぞれ下記に意味に解
するものとする。
するものとする。
７フイニテイー；２ｍ物質問に存在する特異的親和力
リガント；吸着あるいはａ表を目的とする物質と７フイ
ニテイーを有する 物質 不溶性担体；水に不溶性の支持体（これにはリガンドは
含まれない） 吸 着 体；リガンドを不溶性担体に固定化したもの 次に本発明におけるヒトαオープラスミンインヒビタ−
に対する選択的吸着体及びヒト血漿中よりヒトαオープ
ラスミンインヒビタ−を分離する方法について詳細に説
明する。
ニテイーを有する 物質 不溶性担体；水に不溶性の支持体（これにはリガンドは
含まれない） 吸 着 体；リガンドを不溶性担体に固定化したもの 次に本発明におけるヒトαオープラスミンインヒビタ−
に対する選択的吸着体及びヒト血漿中よりヒトαオープ
ラスミンインヒビタ−を分離する方法について詳細に説
明する。
後述するヒトσ、−プラスミンインヒビタ−に対するモ
ノクローナル抗体を適当な不溶性担体（例えばセファロ
ース）Ｋ化学的にリガンドとして結合させ、これをカラ
ムに詰め適当な緩衝溶液（例えば５（ｌｔＭ）！ｊス緩
衝液ＰＨ７，４＋ ０．１５ Ｍ ＮａＣ／ ） Ｋよ
って平衝化する。
ノクローナル抗体を適当な不溶性担体（例えばセファロ
ース）Ｋ化学的にリガンドとして結合させ、これをカラ
ムに詰め適当な緩衝溶液（例えば５（ｌｔＭ）！ｊス緩
衝液ＰＨ７，４＋ ０．１５ Ｍ ＮａＣ／ ） Ｋよ
って平衝化する。
この吸着体に横付試料（ヒト血漿）を添加して検体試料
中のヒトαツープラスミンインヒビｊ′ ターを
吸着させる。次に適当な洗浄溶液（例えば、５０ｍＭ）
リス緩衝液、 ｐＨ７，４。
中のヒトαツープラスミンインヒビｊ′ ターを
吸着させる。次に適当な洗浄溶液（例えば、５０ｍＭ）
リス緩衝液、 ｐＨ７，４。
０．１５ ＭＮａＣ／ ）によって、不純物を吸着体か
ら除去する。次い宅血漿の１素通り画分′及び洗浄画分
′中のヒトαオープラスミンインヒビタ−量を測定する
。かくしてその値からヒト血漿中からのヒトαオープラ
スミンインヒビタ−の分離の程度を算出することができ
る。
ら除去する。次い宅血漿の１素通り画分′及び洗浄画分
′中のヒトαオープラスミンインヒビタ−量を測定する
。かくしてその値からヒト血漿中からのヒトαオープラ
スミンインヒビタ−の分離の程度を算出することができ
る。
本発明における選択的吸着体に用いられる不溶性担体と
しては、種々のものが使用できるが１例えば材質として
セファロース、ポリアクリル７ミド９セルロース！テキ
ストラン！またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不活性担体の形状と
しては、粉末状９粒状、ペレット状！ビーズ状！フィル
ム状、繊維状など径々の形態であることができる、 前記したように、本発明の吸着体に使用される抗体であ
る１ヒトα、−プラスミンインヒビタ−におけるプラス
ミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結
合し得るモノクローナル抗体′は、本発明者らＫよって
初めて見出され先に特許出願された（昭和５９年４月１
７日出願；発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ノーイブ
リドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方法“）。
しては、種々のものが使用できるが１例えば材質として
セファロース、ポリアクリル７ミド９セルロース！テキ
ストラン！またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不活性担体の形状と
しては、粉末状９粒状、ペレット状！ビーズ状！フィル
ム状、繊維状など径々の形態であることができる、 前記したように、本発明の吸着体に使用される抗体であ
る１ヒトα、−プラスミンインヒビタ−におけるプラス
ミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結
合し得るモノクローナル抗体′は、本発明者らＫよって
初めて見出され先に特許出願された（昭和５９年４月１
７日出願；発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ノーイブ
リドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方法“）。
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては前記特許出願明細書に詳細に説明されているが、
以下にその内容を簡単に説明する。
いては前記特許出願明細書に詳細に説明されているが、
以下にその内容を簡単に説明する。
抗原に用いるヒトα！−プラスミンインヒビタ−は前記
青水と諸井の方法によりヒト血漿中より単＃、精製され
た。
青水と諸井の方法によりヒト血漿中より単＃、精製され
た。
雄Ｂａ１ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（５ｔｒａｉ
ｎｓ ）の１ウスを使用することもできる。その際、免
疫計画及びヒトσ鵞−プラスミンインヒビターの製産は
十分な九の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう
選ばれるべきである。例えばマウスに少量のα、−プラ
スミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔に数回免疫の後、
さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の
為に肺臓細胞を取り出す。
ｎｓ ）の１ウスを使用することもできる。その際、免
疫計画及びヒトσ鵞−プラスミンインヒビターの製産は
十分な九の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう
選ばれるべきである。例えばマウスに少量のα、−プラ
スミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔に数回免疫の後、
さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の
為に肺臓細胞を取り出す。
肺臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
する。それらの肺臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。牌屍細胞対骨髄Ｍｍ胞の好ましい比率は約２０＝１
〜約２＝１の範囲である。朽ｔ ｏ’個の牌１臓細胞に
ついて０．５〜１．５１１７ｔノ融合媒体の使用が適当
である。
する。それらの肺臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。牌屍細胞対骨髄Ｍｍ胞の好ましい比率は約２０＝１
〜約２＝１の範囲である。朽ｔ ｏ’個の牌１臓細胞に
ついて０．５〜１．５１１７ｔノ融合媒体の使用が適当
である。
細胞融合に用いる骨髄島細胞は多く知られているが、本
発明ではＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ細胞（以下Ｐ ３
−Ｕ １と略記する）Ｃ−ｆａｌｔｏｎ＋ Ｄ、Ｅ、ｅ
ｔ ａｌ 、ｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ ＴｏｐｌｃａｉｎＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ＋ ８１ ＋ １（１９７８）＃照〕を用いた。これ
は、８−アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒ
ボキサンチンーグアニンホスボリボシルトランスフエラ
ーゼ（’ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｇｕ −ａｎｉｎｅ
ｐｈｏｓｐｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ）が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生存し
ない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分路し
ない、いわゆる非分泌屋である。
発明ではＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ細胞（以下Ｐ ３
−Ｕ １と略記する）Ｃ−ｆａｌｔｏｎ＋ Ｄ、Ｅ、ｅ
ｔ ａｌ 、ｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ ＴｏｐｌｃａｉｎＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ＋ ８１ ＋ １（１９７８）＃照〕を用いた。これ
は、８−アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒ
ボキサンチンーグアニンホスボリボシルトランスフエラ
ーゼ（’ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｇｕ −ａｎｉｎｅ
ｐｈｏｓｐｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ ）が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生存し
ない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分路し
ない、いわゆる非分泌屋である。
好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量がｉ、ｏ
ｏｏ〜４，０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。
ｏｏ〜４，０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。
別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の膵臓細胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（
約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−７
ザグ７ニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しない
もの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。
合の膵臓細胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（
約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−７
ザグ７ニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しない
もの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。
この選択培地中では未融合の骨髄Ｉｌ細胞は死滅する。
この未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期
間後（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した
細胞は骨髄腫の観細胞のＰＩｋ瘍性と親膵臓細胞の性質
をあわせ持つために選択培地中で生存できる。
間後（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した
細胞は骨髄腫の観細胞のＰＩｋ瘍性と親膵臓細胞の性質
をあわせ持つために選択培地中で生存できる。
かくしてハイプリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に対
する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉ
ｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎ。
上清を採取し、ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に対
する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉ
ｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎ。
５ｏｒｂｅｎｔ Ａ＋！ｓａｙ ） Ｋよりスクリーニ
ングする。
ングする。
ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に対する抗体を産生
じているノーイプリドーマ細胞を、無血清培地で培養し
て得られた、抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα
！−プラスミンインヒビタ−と共に一定時間インキユベ
ートした。さらＫこのヒトαヨープラスミンインヒビタ
−混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶鱗面積を測定した。このようにして
、ヒトα宜−プラスミンインヒビターに対する活性を持
つ抗体を産生ずるハイグリドーマ細胞を選択する。
じているノーイプリドーマ細胞を、無血清培地で培養し
て得られた、抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα
！−プラスミンインヒビタ−と共に一定時間インキユベ
ートした。さらＫこのヒトαヨープラスミンインヒビタ
−混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶鱗面積を測定した。このようにして
、ヒトα宜−プラスミンインヒビターに対する活性を持
つ抗体を産生ずるハイグリドーマ細胞を選択する。
目的の抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイプリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とＫより、その培養上清からそのハイプリドーマ細胞の
産生する七ツクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればノ・イブリドーマ細胞は同質遺伝子又は
半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射す°ることがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
そのハイプリドーマ細胞の産生ずるモノクー−ナル抗体
を得ることができる。
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイプリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とＫより、その培養上清からそのハイプリドーマ細胞の
産生する七ツクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればノ・イブリドーマ細胞は同質遺伝子又は
半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射す°ることがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
そのハイプリドーマ細胞の産生ずるモノクー−ナル抗体
を得ることができる。
上記の如くして得られたモノクローナル抗体は、ヒトα
ヨープラスミンインヒビタ−におけるプラスミンの線雑
木溶解作用の阻止部位を特異的に認識し、その部位に選
択的に結合する。
ヨープラスミンインヒビタ−におけるプラスミンの線雑
木溶解作用の阻止部位を特異的に認識し、その部位に選
択的に結合する。
本発明のヒト血漿中のα、−プラスミンインヒビタ−の
分離に用いる吸着体においては。
分離に用いる吸着体においては。
かかるモノクローナル抗体をリガンドとして不溶性担体
に化学的に結合させて使用する。
に化学的に結合させて使用する。
かへる結合方法とし【は一般にモノクローナル抗体を不
活性担体に化学的に結合する方法であればよい。
活性担体に化学的に結合する方法であればよい。
以上、本発明によれば、ヒト血漿中よりα。
−プラスミンインヒビタ−を容易に且つ選択的に分離す
ることが可能である。
ることが可能である。
以上実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例
α、−プラスミンインヒビタ−に対するモノクー−ナル
抗体ＩＤｌ０ＣＩ をリガンドとして化学的に結合させ
た吸着体（０，５１１１１）をカラムに詰め、洗浄液（
５０ｍ Ｍ４１＠液ｐＨ７，４、０，１５ＭＮａＣｌ
）で十分に洗浄後、ヒト血漿１．０１１７を添加した。
抗体ＩＤｌ０ＣＩ をリガンドとして化学的に結合させ
た吸着体（０，５１１１１）をカラムに詰め、洗浄液（
５０ｍ Ｍ４１＠液ｐＨ７，４、０，１５ＭＮａＣｌ
）で十分に洗浄後、ヒト血漿１．０１１７を添加した。
さらに、上記洗浄液１．０ｊｌｊでカラム内壁を洗浄し
、溶出した両分を「素通り画分」とした。次に未吸着物
質を上記洗浄液２．０ＩＩｊで溶出し、「洗浄画分」と
した。以上の操作はすべて４℃で行なった。分取した「
素通り画分」及び「洗浄画分」は、即に４℃で脱塩、濃
縮を行な１ つだ、 ヒトα２−プラスミンインヒビター検量線の作成α！−
プラスミンインヒビター量は、本発明者らが、先に出願
した明細書く昭和５９年５月１日付出願；発明の名称１
ヒトα、７ブラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキラ） ’））
Ｃ記載された、サンドイツチ法を用いて測定した。
、溶出した両分を「素通り画分」とした。次に未吸着物
質を上記洗浄液２．０ＩＩｊで溶出し、「洗浄画分」と
した。以上の操作はすべて４℃で行なった。分取した「
素通り画分」及び「洗浄画分」は、即に４℃で脱塩、濃
縮を行な１ つだ、 ヒトα２−プラスミンインヒビター検量線の作成α！−
プラスミンインヒビター量は、本発明者らが、先に出願
した明細書く昭和５９年５月１日付出願；発明の名称１
ヒトα、７ブラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキラ） ’））
Ｃ記載された、サンドイツチ法を用いて測定した。
本実施例で使用した第１及び第２抗体は１本発明者らが
先に出願した明細書（昭和５９年４月１７日付出願；発
明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドーマ細胞及
びモノクローナル抗体の製造方法″）に記載された方法
によって得られた下記のものを使用した。
先に出願した明細書（昭和５９年４月１７日付出願；発
明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドーマ細胞及
びモノクローナル抗体の製造方法″）に記載された方法
によって得られた下記のものを使用した。
第１抗体
前記出願明細書の実施例３において得られた抗体名’
ＩＤｌ０ＣＩ ’を使用し、これを下記の如く不溶性担
体（マイクロタイタープレート）に固定化させて用いた
。この抗体はα、−プラスミンインヒビタ−におけるプ
ラスミンの線雑木溶解作用の阻止部位（リアクティブサ
イト）を特異的にｇ臓し得るモノクローナル抗体である
。
ＩＤｌ０ＣＩ ’を使用し、これを下記の如く不溶性担
体（マイクロタイタープレート）に固定化させて用いた
。この抗体はα、−プラスミンインヒビタ−におけるプ
ラスミンの線雑木溶解作用の阻止部位（リアクティブサ
イト）を特異的にｇ臓し得るモノクローナル抗体である
。
１ａ２抗体
前記出願明細書の実施例３において得られた抗体名’
ＩＢＩＯＧＩＩ ’を使用した。この抗体はα、−プラ
スミンインヒビタ−におけるり７クテイプサイト以外の
部位を特異的Ｋｇ識するモノクローナル抗体であり、ア
ルカリ性フォスファターゼで１ｉＡＲ化して使用した。
ＩＢＩＯＧＩＩ ’を使用した。この抗体はα、−プラ
スミンインヒビタ−におけるり７クテイプサイト以外の
部位を特異的Ｋｇ識するモノクローナル抗体であり、ア
ルカリ性フォスファターゼで１ｉＡＲ化して使用した。
濃度２０μｍ１／１１１のヒトαヨープラスミンインヒ
ビタ−におけるリアクティブサイトを特異的Ｋｌ！！織
す木モノクローナル抗体（ＩＤＩＯＣＩ）をマイクロタ
イタープレート上に４℃で一晩放置し固定化した。これ
にＩＸ牛血清アルブミンを含む緩衝液（１５ｍ Ｍ Ｎ
１２ＣＯ３＋ ３５ ｍ Ｍ ＮａＨＣＯ２＋３ ｍ
Ｍ ＮａＮ、 ）を加え室温で４時間放置した後、１９
６牛血清アルブミンを含む洗浄液（２０ｍＭリン酸緩衝
液＋ ０．１３５Ｍ ＮａＣｌ ＋ ２ ｍ Ｍ Ｎａ
Ｎ、 ＋０．０５ ｊ％’ Ｔｗｅｅｎ ２０ ）で５
回洗浄した。次に希釈用溶液（２０ｍＭリン敗緩衝液ｐ
Ｈ７，４ｓＯ，１３５Ｍ ＮａＣｌ）で種々の濃度とな
るように希釈したα鵞−プラスミンインヒビターを加え
、室温で４時間放置した。
ビタ−におけるリアクティブサイトを特異的Ｋｌ！！織
す木モノクローナル抗体（ＩＤＩＯＣＩ）をマイクロタ
イタープレート上に４℃で一晩放置し固定化した。これ
にＩＸ牛血清アルブミンを含む緩衝液（１５ｍ Ｍ Ｎ
１２ＣＯ３＋ ３５ ｍ Ｍ ＮａＨＣＯ２＋３ ｍ
Ｍ ＮａＮ、 ）を加え室温で４時間放置した後、１９
６牛血清アルブミンを含む洗浄液（２０ｍＭリン酸緩衝
液＋ ０．１３５Ｍ ＮａＣｌ ＋ ２ ｍ Ｍ Ｎａ
Ｎ、 ＋０．０５ ｊ％’ Ｔｗｅｅｎ ２０ ）で５
回洗浄した。次に希釈用溶液（２０ｍＭリン敗緩衝液ｐ
Ｈ７，４ｓＯ，１３５Ｍ ＮａＣｌ）で種々の濃度とな
るように希釈したα鵞−プラスミンインヒビターを加え
、室温で４時間放置した。
その後前記洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカリ性フォ
スファターゼで標識したα、−プラスミンインヒビタ−
におけるリアクティブサイト以外の部位な認識するモノ
クローナル抗体（ＩＢＩＯＧＩＩ）を加え４℃で一晩放
置した。前記洗浄液で洗浄後アルカリ性フォスファター
ゼ基Ｊ［ｆｆｚ Ｗｉ ｔ Ｉ Ｗ ／ １ＬｔｃＤ
濃度Ｙ：加え、 ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＰＨＯＴＯ部Ｔ
ＥＲ（コロナ電気■製、ＭＴＰ−２０）で２０分後Ｋ
４０５ ｎｍの波長における吸光度を測定した。その結
果を添付図１ｉｌｌＫ示した、この図面からσ、−プラ
スミンインヒビタ−の濃度と吸光度との関係は直線関係
になることが埋屑できる。従ってα、−プラスミンイン
ヒビタ−におけるリアクティブサイトを特異的Ｋｇ繊す
るモノクローナル抗体をサンドインチ法における一つの
抗体とし【使用することによって、α、−プラスミンイ
ンヒビタ−の量を容易に測定することができる。
スファターゼで標識したα、−プラスミンインヒビタ−
におけるリアクティブサイト以外の部位な認識するモノ
クローナル抗体（ＩＢＩＯＧＩＩ）を加え４℃で一晩放
置した。前記洗浄液で洗浄後アルカリ性フォスファター
ゼ基Ｊ［ｆｆｚ Ｗｉ ｔ Ｉ Ｗ ／ １ＬｔｃＤ
濃度Ｙ：加え、 ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＰＨＯＴＯ部Ｔ
ＥＲ（コロナ電気■製、ＭＴＰ−２０）で２０分後Ｋ
４０５ ｎｍの波長における吸光度を測定した。その結
果を添付図１ｉｌｌＫ示した、この図面からσ、−プラ
スミンインヒビタ−の濃度と吸光度との関係は直線関係
になることが埋屑できる。従ってα、−プラスミンイン
ヒビタ−におけるリアクティブサイトを特異的Ｋｇ繊す
るモノクローナル抗体をサンドインチ法における一つの
抗体とし【使用することによって、α、−プラスミンイ
ンヒビタ−の量を容易に測定することができる。
添付図面を検量線として用い、ヒト血漿［素通り画分」
及び「洗浄画分」のα、−プラスミンインヒビター量を
測定した。
及び「洗浄画分」のα、−プラスミンインヒビター量を
測定した。
試料中のα、−プラスミンインヒビター量の測定ヒトα
オープラスミンインヒビタ−におけるリアクティブサイ
トを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＩＤＩＯＣ
Ｉ）を濃度２０μｍ１７Ｍでマイクロタイタープレート
上に４℃で一晩放置し固定化した。これに１％牛血清フ
ルプミンを含む緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ１ＣＯ３１３５
ｍＭＮａＨｃｏ＠ ＋３ ｍ ＭＮａＮｓ ）を加え室
温で４時間放置した彼。
オープラスミンインヒビタ−におけるリアクティブサイ
トを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＩＤＩＯＣ
Ｉ）を濃度２０μｍ１７Ｍでマイクロタイタープレート
上に４℃で一晩放置し固定化した。これに１％牛血清フ
ルプミンを含む緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ１ＣＯ３１３５
ｍＭＮａＨｃｏ＠ ＋３ ｍ ＭＮａＮｓ ）を加え室
温で４時間放置した彼。
ＩＮ牛血清フルプミンを含む洗浄液（２０ｍＭリン酸ａ
！衝液１０．１３５ Ｍ ＮａＣ／＋ ２ ｍＭＮａＮ
ｌ １０．０５％Ｔｖｒｅｅｎ ２ Ｇ ）で５回洗浄
した。次に希釈用溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液＋ ０．
１３５ ＭＮａＣ／ ）で徨々の濃度となるように希釈
した試料（前記「素通り画分」、「洗浄画分」及びヒト
血漿）を加え室温で４時間放置した。
！衝液１０．１３５ Ｍ ＮａＣ／＋ ２ ｍＭＮａＮ
ｌ １０．０５％Ｔｖｒｅｅｎ ２ Ｇ ）で５回洗浄
した。次に希釈用溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液＋ ０．
１３５ ＭＮａＣ／ ）で徨々の濃度となるように希釈
した試料（前記「素通り画分」、「洗浄画分」及びヒト
血漿）を加え室温で４時間放置した。
その後、前記洗浄液で５回洗浄し、アルカリ性フォスフ
ァターゼで標識したヒトαオープラスミンインヒビタ−
におけるリアクティブサイト以外の部位を認識する七ツ
クローナル抗体（ＩＢＩＯＧＩＩ）を加え、４℃で一晩
放置した。
ァターゼで標識したヒトαオープラスミンインヒビタ−
におけるリアクティブサイト以外の部位を認識する七ツ
クローナル抗体（ＩＢＩＯＧＩＩ）を加え、４℃で一晩
放置した。
前記洗浄液で洗浄後、アルカリ性フォスファターゼ基質
溶液１１９／紅を加え、 ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＰＨＯ
ＴＯＭＥＴＥＲ（コロナ電気＃Ｍシ、ＭＴＰ−１２）で
２０分後Ｋ ４０５ ｎｍの波長における吸光度を測定
した。
溶液１１９／紅を加え、 ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥＰＨＯ
ＴＯＭＥＴＥＲ（コロナ電気＃Ｍシ、ＭＴＰ−１２）で
２０分後Ｋ ４０５ ｎｍの波長における吸光度を測定
した。
結果を下記表に示す。「索量り画分」、「洗浄画分」釦
はα、−プラスミンインヒビタ−は検出されず、ヒト血
漿を前記吸着体に添加することＫよってヒト血漿からα
、−プラスミンインヒビタ−が完全に分離されたことが
確認できた。
はα、−プラスミンインヒビタ−は検出されず、ヒト血
漿を前記吸着体に添加することＫよってヒト血漿からα
、−プラスミンインヒビタ−が完全に分離されたことが
確認できた。
表（各試料中のα、−プラスミンインヒビター景）
離村Ｖ５６４はヒトαオープラスミンインヒビタ−の２
４ ［と吸光度との関係を示すものである。
４ ［と吸光度との関係を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミンの繊維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して
結合し得るモノクローナル抗体を不溶性担体に結合させ
たヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対する選択的
吸着体。 ２、該不溶性担体が、セファロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、デキストラン及びマレイン酸ポリマー
なる群から選ばれた少くとも一種である第１項記載の選
択的吸着体。 ３、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミンの繊維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して
結合し得るモノクローナル抗体を不溶性担体に結合させ
たヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対する選択的
吸着体を用いて、ヒトα＿２−プラスミンインヒビター
含有血漿中よりヒトα＿２−プラスミンインヒビターを
分離する方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59217312A JPS6197230A (ja) | 1984-10-18 | 1984-10-18 | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
| NO851518A NO171169C (no) | 1984-04-17 | 1985-04-16 | Monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, spesifikke for alfa2-plasmininhibitor |
| DK170485A DK166627B1 (da) | 1984-04-17 | 1985-04-16 | Monoklont antistof, der er specifikt over for human-alfa-2-plasmininhibitor, fremgangsmaade til fremstilling af et hybridom, der producerer antistoffet, anvendelse af antistoffet til immunologisk analyse for human-alfa-2-plasmininhibitor og anvendelse af antistoffet til fraskillelse og udvinding af human-alfa-2-plasmininhibitor |
| EP85104629A EP0159025B1 (en) | 1984-04-17 | 1985-04-17 | Monoclonal antibody specific to human alpha2-plasmin |
| DE3587714T DE3587714T2 (de) | 1984-04-17 | 1985-04-17 | Menschliches alpha 2-Plasmin spezifischer monoklonaler Antikörper. |
| US07/716,694 US5534255A (en) | 1984-04-17 | 1991-06-17 | Monoclonal antibody specific to human α2 -plasmin inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59217312A JPS6197230A (ja) | 1984-10-18 | 1984-10-18 | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6197230A true JPS6197230A (ja) | 1986-05-15 |
| JPH0455200B2 JPH0455200B2 (ja) | 1992-09-02 |
Family
ID=16702182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59217312A Granted JPS6197230A (ja) | 1984-04-17 | 1984-10-18 | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6197230A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6410173A (en) * | 1987-07-03 | 1989-01-13 | Teijin Ltd | Method for measuring blood fibrinolytic activity |
| JPH01233298A (ja) * | 1988-03-11 | 1989-09-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | 抗体、その製造法、ｈｍｌｃを測定するための試薬、ならびにモノクローナル抗体 |
-
1984
- 1984-10-18 JP JP59217312A patent/JPS6197230A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6410173A (en) * | 1987-07-03 | 1989-01-13 | Teijin Ltd | Method for measuring blood fibrinolytic activity |
| JPH01233298A (ja) * | 1988-03-11 | 1989-09-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | 抗体、その製造法、ｈｍｌｃを測定するための試薬、ならびにモノクローナル抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0455200B2 (ja) | 1992-09-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |