JP3325128B2 - 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 - Google Patents
新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法Info
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Description
有用な新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝
子、新規な組み換え体DNA及びクレアチンアミジノハ
イドロラーゼの製造法に関する。
クレアチンを加水分解してザルコシン及び尿素を生成す
る触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中
のクレアチン量の測定に用いることができ、腎臓病をは
じめとする各種の疾患の診断薬として利用することがで
きる。しかしながら、従来のクレアチンアミジノハイド
ロラーゼは、pH安定性が4.5〜8.5と狭く、pH8.5を超え
る高pH領域において不安定であるため、該pH領域下での
精製が困難であり、又、Km値が大きいため、試料測定の
ために長時間を要するなどの欠点があった。
エスピー(Alcaligenes sp.)KS-85株(FREM BP-4487)を
クレアチンを含む培地に接種、培養すれば、高pH領域に
おいて安定で、かつKm値の小さい新規なクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを得ることができること等の知見を
得、先に特許出願を行なった(特願平5-318675号出
願)。
的手法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼを生産
することを目的として、その生産の元となるクレアチン
アミジノハイドロラーゼ遺伝子、更に、該遺伝子を含む
組み換え体DNA及び該組み換え体DNAを用いるクレ
アチンアミジノハイドロラーゼの製造法を提供すること
である。
した結果、本発明者等は、アルカリゲネス由来のクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を単離及び構造決定
することに成功し、また更に、クレアチンアミジノハイ
ドロラーゼをコードする遺伝子をベクターDNAに挿入
した組み換え体DNAを得、この組み換え体をエッシェ
リシア(Escherichia)属に属する菌株に含ませたクレア
チンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する菌株を培地
に培養すると、培地中にクレアチンを添加することな
く、効率よくクレアチンアミジノハイドロラーゼが生産
されること等を見出し、本発明を完成した。
載のアミノ酸配列をコードする新規なクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子であり、本願の第2の発明は、
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクターD
NAに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体DN
Aであり、また本願の第3の発明は、クレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入した組
み換え体DNAを含み、クレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を
培地に培養し、培養物からクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼを採取することを特徴とするクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼの製造法である。
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子は、例えば次
のようにして得ることができる。先ず、アルカリゲネス
・エスピー.KS-85 株を、例えばCurrent Protocols in
Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の
方法等により培養し、得られた菌株から染色体DNAを
抽出する。
は、京都府内の土壌中より新たに検索して得た菌株で、
その菌学的性質は以下に示す通りである。菌学的性質の
同定のための実験法は、主として長谷川武治編著「微生
物の分類と同定」東京大学出版会(1975年)によって行
なった。また分類同定の基準としてバージーズ・マニュ
アル・オブ・デターミネィティブ・バクテリオロジー第
8版(1974年)を参考にした。
学的性質〕 (A) 形態的性質 顕微鏡的観察〔肉汁寒天培地(pH 9.0)上で、30℃、24〜
48時間培養〕 (1) 細胞の形及び大きさ:0.5〜1.0×0.5〜4.0ミクロン
の直状桿菌である。(2)運動性の有無:周毛を有し、運
動性を有する。 (3) 胞子の有無:無し。 (4) グラム染色性:陰性。 (5) 抗酸性:陰性。
ロニーを形成する。表面は円滑で脂肪様光沢があり、周
縁は透明である。(白っぽいが淡い黄色味も帯びてい
る。) (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、9日間の静置培養で拡布状の生育を示す。色はベ
ージュ色の菌体で、色素の産生は認められない。 (3) 肉汁液体培養 30℃、9日間の静置培養で、培地液面に膜状に生育し、
下部に沈殿を生成する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30日間の静置培養で、培地上部にのみ生育し、ゼ
ラチンを液化しない。 (5) リトマスミルク 30℃、9日間の静置培養で、リトマスミルクの凝固、液
化は認められないが、培地中でアルカリを産出し、培地
初発pHを上昇させる。
成) (3) MRテスト:陰性。 (4) VPテスト:陰性。 (5) インドールの生成:生成しない。 (6) 硫化水素の生成:生成しない。 (7) デンプンの加水分解:加水分解しない。 (8) クエン酸の利用:利用しない。 (9) 無機窒素源の利用:利用しない。(硝酸塩及びアン
モニウム塩) (10)色素の生成:生成しない。 (11)ウレアーゼ:陰性。 (12)オキシダーゼ:陽性。 (13)カタラーゼ:陽性。 (14)生育の範囲:温度;15〜45℃、pH;6.0〜9.0 (15)酸素に対する態度:好気性。 (16) O−Fテスト(Hugh-Leifson法):酸化、発酵共に
無し。 (17)糖類からの酸及びガスの生成:無し。(下記の糖類
について検討した。) L-アラビノース、D-キシロース、D-グルコース、D-マン
ノース、D-フラクトース、D-ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、イノシット、グリセリン、デンプン
カリゲネス属に属するものと判定された。従って本菌株
を、アルカリゲネス・エスピー.KS-85 と同定命名し
た。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-4487として寄託されている。
Iにより部分分解し、染色体DNA断片混合物を得る。
このようにして得たDNA断片混合物から、例えば、通
常のアガロースゲル電気泳動法により、好ましくは2〜
5Kbの大きさのDNA断片混合物を得、これに必要によ
りアルカリフォスファターゼ処理等を行なった後、更に
必要により、例えばフェノール抽出等の精製手段により
精製し、また更に、例えばエタノール沈殿等の方法によ
り濃縮し、純化されたDNA断片混合物(この中にクレ
アチンアミジノハイドロラーゼをコードする遺伝子を含
有するDNA断片が含まれる)を得る。
ベクターDNAとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターDNA、プラスミドベクターDNA等が挙げら
れるが、具体的にはpUC118(宝酒造社製)等が好まし
い。上記プラスミドベクターDNAをEcoRI断片取り込
み可能な状態にするため、例えば、EcoRI(宝酒造社
製)を作用させて消化し、更に必要によりエタノール沈
殿処理等を行なうことにより、EcoRI断片取り込み可能
なプラスミドDNAベクターを得る。
レアチンアミジノハイドロラーゼをコードする遺伝子を
含有するDNA断片と、同じく上記のようにして得たEc
oRI断片取り込み可能なプラスミドベクターDNAを混
合し、これに、例えばT4DNAリガーゼ(ベーリンガ
ーマンハイム社製)を作用させて組み換え体プラスミド
DNAを得る。
を用いて、例えば大腸菌K12、好ましくは大腸菌JM109
(東洋紡社製)、XL-Blue(フナコシ(株)製)等を形質
転換して、様々な遺伝子断片を保有する組み換え体DN
Aのコロニーを得ることができる。得られたコロニーの
中より、クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含
むDNA断片を保有する組み換え体DNAを検索するに
は、例えば、実施例1の項目(3) に記載の方法に従って
得られた遺伝子断片の末端に対してジコギシゲニン(ベ
ーリンガーマンハイム社製)で標識したオリゴヌクレオ
チドをプローブとして、前記Current Protocols in Mol
ecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の方法
によりコロニーハイブリダイゼーションを行なうことが
できる。
アチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含有してい
る。)より、純化されたプラスミドDNAを得るには、
例えば超遠心CsCl濃度勾配分離法等の方法を用いること
ができる。上記の純化されたプラスミドDNAを用い
て、実施例1の項目(4) に示すような方法によって、ク
レアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子の全塩基配列の
解析を行ない、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定す
る。このアミノ酸配列は、配列番号2に示されるとおり
である。このようにして確定されたアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子が本発明のクレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ遺伝子である。
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含む組み換え体D
NAは、大腸菌で発現するためのプロモーターを有しな
いので、組み換え体DNAを保有する形質転換株はクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを生産しない。そこで、
以下の操作によりクレアチンアミジノハイドロラーゼ生
産株を得る。
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子のN末端、C
末端各10個のアミノ酸に対応する30個の塩基のオリゴヌ
クレオチド(C末端側は相補鎖である。)を合成して、
これをプライマーとし、更に上記で得られた純化した組
み換え体プラスミドを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反
応(以下PCR法と略す)を行ない、クレアチンアミジノ
ハイドロラーゼをコードする領域のみからなるDNAを
得る。得られたDNAを、大腸菌ラクトースオペロン等
に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム
結合部位等の発現領域を含むDNA配列(The Operon,P
227,Cold Spring Harbor Laboratory,1980年を参照)を
保有するベクターDNAに挿入する。用いられるベクタ
ーDNAはとしては、例えばプラスミドDNA、バクテ
リオファージDNA等が挙げられる。得られた組み換え
体DNAを用いて、例えば大腸菌K-12、好ましくは大腸
菌JM109(東洋紡社製)、XL-Blue(フナコシ(株)製)等
を形質転換又は形質導入して夫々の菌株を得る。
n Enzymology,68,326-331,1979)に行なうことができ
る。また、形質導入はB.Hohnの方法(Method in Enzymo
logy,68,299-309,1979)により行なうことができる。
ジノハイドロラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する菌株を用いてクレアチンアミジノハイドロラーゼ
を生産するには、下記のようにして行なうことができ
る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培
養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養す
るのが好ましい。
は、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
テイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等
の1種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム,リン酸
水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第2鉄、硫酸
第2鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりクレアチンアミジノハイドロラーゼを採取す
るには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを採取することが好まし
い。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、
超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の
破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如
き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、
トリトンX-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を
抽出する方法等により、菌体からクレアチンアミジノハ
イドロラーゼを採取するのが好ましい。
アチンアミジノハイドロラーゼを単離するには、通常の
酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安
塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ
法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ
法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好まし
い。
ゼは、下記の酵素化学的性質及び理化学的性質を有す
る。 (1) 作用 1モルのクレアチンを加水分解し、1モルのザルコシン
と1モルの尿素を生成する。 (2) 基質特異性 クレアチンに基質特異性を有する。
4.0〜6.0)、50 mMリン酸緩衝液(pH 6.0〜7.5)及び5
0 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5〜9.0)を用い、各pHにお
ける本酵素の活性測定を行なった結果、図1に示す通り
であった。図1より、本酵素の至適pHは、7.0〜9.0と認
められた。 (4) 至適温度 後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図2に示す通りであった。図2より、本酵素の
至適温度は、35〜45℃と認められた。
4.0〜6.0)、50mMリン酸緩衝液(pH 6.0〜8.0)、50 m
M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0〜9.0)、50 mM グリシン−N
aOH緩衝液(pH 9.0〜10.0)及び50mM CAPS緩衝液(pH1
0.0〜11.0)を用い、pH 4.0〜11.0において25℃で17時間
夫々処理した後、本酵素の残存活性を測定した結果、図
3に示す通りであった。図3より、安定pH域はpH 5.0〜
10.5であった。 (6) 熱安定性 50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)を用いて、各温度で30
分間処理した場合の熱安定性の結果は図4に示す通りで
あり、本酵素は、45℃程度迄安定であると認められた。
1分間に1マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を1
単位とする。 (試薬調製) 1液;基質液) クレアチン6.63gを50mMリン酸緩衝液(pH7.7)500mlに
溶解する。 2液;発色液) ρ−ジメチルアミノベンズアルデヒド10gを500mlの特
級エタノールに溶解し、レジン水575ml、濃塩酸75mlを
混合したものと混合する。
ンする。 2)酵素液(1〜2U/ml程度に調整)0.1 mlを混合し、37
℃において10分間反応させる。 3)10分間の反応後、上記2液2mlを混合する。 4)2液と混合後、25℃にて20分間放置し、後に435 nmの
吸光度を測定する。(ODsample) 5)ブランク値の測定は、1液0.9 mlを37℃にて10分間イ
ンキュベーションした後、上記2液2mlを混合し、更に
酵素液0.1 mlを混合、25℃にて20分間放置し、その後43
5 nmの吸光度を測定することによって行なった。(ODbl
ank)
添加して、その影響を調べた結果、表1に示す通りであ
り、AgNO3 、HgCl2 、CuSO4 等により本酵素は強く阻害
された。
×10-2M(クレアチンに対して)であった。 (10)分子量 TSKgel G3000SWXLによるゲル濾過法で、 80,000±5000
であった。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
地(1%バクトートリプトン、0.5 %ペプトン、0.25%
NaCl)200mlに接種して、30℃で20時間振とう培養し培
養物を得た。この培養物を6000rpmで10分間遠心分離す
ることにより集菌して菌体を得た。この菌体を25mlのソ
ルビトール溶液(0.9M ソルビトール、0.1Mトリス塩酸 p
H8.0、0.1M EDTA)に懸濁した後、Current Protocols in
Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の
方法に従い、染色体DNA500 μgを得た。
製)により部分分解した後、アガロースゲル電気泳動に
より2〜5kb画分の断片を10μgを得た。プラスミドD
NAベクター pUC118(宝酒造社より入手)1μgのEcoR
I消化物と上記で得られた染色体DNAのEcoRI消化物
2μgとをT4DNAリガーゼ(ベーリンガーマンハイ
ム社製)1ユニットで連結し、得られたプラスミドをD.
M.Morrisonの方法(Method in Enzymology,68,326-331,
1979)に従って大腸菌JM109株を形質転換した結果、600
個のコロニーを得、アマシャム社のプロトコールに従っ
てナイロンメンブレンフィルターHybond-N+(アマシャ
ム社製)へブロッティングした。
るクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子の単離 フラボバクテリウム属由来のクレアチンアミジノハイド
ロラーゼ遺伝子を含むpKL501(特開昭62-205786号公報
記載)を、SplI及びSmaI両制限酵素にて部分分解し、
通常のアガロースゲル電気泳動法によりクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ遺伝子部分(1.2kb)を切り出し、GEN
ECLEAN II(フナコシ(株)製)にて精製した。得られた
遺伝子断片の末端に対し、DIG-Labeling Kit (ベーリン
ガーマンハイム社製)を用いてジコギシゲニン標識を行
ない、コロニーハイブリダイゼーションのプローブとし
た。Current Protocols in Molecular Biology(WILEY I
ntersciense,1989) 記載の方法に従い、コロニーハイブ
リダイゼーションを行ない、ポジティブコロニー2株を
得た。
伝子の解析 単離したポジティブコロニー2株の内、1株よりクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子が含まれるプラスミ
ドDNAを超遠心法にて調製し、EcoRIで切断したとこ
ろ、約2.5kbのアルカリゲネス属由来の染色体DNA断
片が挿入されていることが判った。そこで、このプラス
ミドDNAについてKilo-Seaqence用deletion kit(宝
酒造社製)及び370DNA Seaqencing System(アプライド
バイオシステム社製)を用いて塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列を配列番号1に、また、該DNA
配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列
番号2に夫々示した。クレアチンアミジノハイドロラー
ゼ遺伝子は、1215のコーディング領域をもち、404のア
ミノ酸をコードしていた。
製 先ず、特開平5-317055号公報に記載の方法により発現ベ
クターpUTE100を作製した。具体的には、プラスミドベ
クターpBR322DNAをEcoRI及びNruIで切断消化後、D
NA Blunting Kit(宝酒造社製)で平滑末端とした後、
常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い、GENECLEAN
II(フナコシ(株)製)により複製起点を含む約3.4 kbの
DNA断片を取得した。得られたDNA断片はT4DN
Aリガーゼにより環状にした後、EcoRI切断を行ない、
直鎖にした。次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及
びリボソーム結合部位等の発現調節領域並びにHpaI切断
部位を含むDNA配列(The Operon,p.227,Cold Spring
Harbor Laboratory,1980 を参照):
iosystems 社製)で合成し、上記で得られたEcoRI切断
と連結して発現ベクターpUTE100を作製した。次いで、
クレアチンアミジノハイドロラーゼのN末端及びC末端
アミノ酸配列に対応する夫々配列番号3及び配列番号4
の塩基配列のオリゴヌクレオチドをDNA Synthesizer Mo
del 392(アプライドバイオシステム社製)で合成してプ
ライマーとし、上記で得られた組み換え体プラスミドD
NAのEcoRI消化物を鋳型にしてGeneamp DNA Amplific
ation Reagent Kit with AmpliTaq(宝酒造社製)を用い
たPCR法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼコー
ディング領域のみを合成した後、上記発現プラスミドベ
クターpUTE100 DNAのHpaI部位に挿入し、組み換え
体プラスミドpUCE100 DNAを得た。
gy,68,326-331,1979)に従い、組み換え体プラスミドD
NApUCE100を用いて大腸菌JM109(東洋紡社製)を形質
転換し、形質転換株、大腸菌(E.coli) JM109 (pUCE100)
を得た。なお、該株は工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM BP-4803として寄託されている。得られた大腸
菌 JM109 (pUCE100)を、1mMイソプロピル−β−D−ガ
ラクトシドを含むTY培地(1%バクトートリプトン、0.
5 %バクトーイースト・エクストラクト、0.5%NaCl、p
H7.0)にて16時間振とう培養した後、前述した酵素活性
測定法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼ活性を
測定し、尿素の検量線に基づき活性の算出を行なったと
ころ、1.1U/mlであった。
添加することなく、クレアチンアミジノハイドロラーゼ
を効率よく生産することができる。
p.)KS-85 株名:FREM BP-4487 配列: 54 ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA TGG CAC AAC GGC GAA AAA GAT TAT 108 TCG CCG TTT TCG GAT GCC GAG ATG ACC CGC CGC CAA AAC GAC GTT CGC GGC TGG 162 ATG GCC AAG AAC AAT GTC GAT GCG GCG CTG TTC ACC TCT TAT CAC TGC ATC AAC 216 TAC TAT TCC GGC TGG CTG TAC TGC TAT TTC GGA CGC AAG TAC GGC ATG GTC ATC 270 GAC CAC AAC AAC GCC ACG CCG ATT TCG GCC GGC ATC GAC GGC GGC CAG CCC TGG 324 CGC CGC AGC TTC GGC GAC AAC ATT ACC TAC ACC GAC TGG CGC CGC GAC ATT TTC 378 TAT CGC GCC GTG GCG CAG CTG ACC ACG GGC GCC AAG CGC ATC GGC ATC GAG TTC 432 GAC CAC GTC AAT CTC GAC TTC CGC CGC CAG CTC GAG GAA AAC CTA CCG GGC GTC 486 GAG TTC GTC GAC ATC AGC CAG CCC TCG ATG TGG ATG CGC ACC ATC AAG TCG CTC 540 GAA GAG CAG AAG CTG ATC CGC GAA GGC GCC CGC GTG TGT GAC GTC GGC GGC GCG 594 GCC TGC GCG GCT GCC ATC AAG GCC GGC GTG CCC GAG CAT GAC ATG GCG ATC GCC 648 ACC ACC AAT GCG ATG ATC CGC GAG ATC GCC AAA TCG TTC CCC TTC GTG GAG CTG 702 ATG GAC ACC TGG ACC TGG TTC CAG TCG GGC ATC AAC ACC GAC GGC GCG CAC AAT 756 CCG GTC ACC AAC CGC ATC GTG CAA TCC GGC GAC ATC CTT TCG CTC AAC ACC TTC 810 CCG ATG ATC TTC GGC TAC TAC AAC CCG CTG GAG CGC ACG CTG TTC TGC GAC CAT 864 GTC GAT GAC GCC AGC CTC GAC ATC TGG GAG AAG AAC GTG GCC GTG CAT CGC CGC 918 GGG CTC GAG CTG ATC AAG CCG GGC GCG CGC TGC AAG GAC ATC GCC ATC GAG CTC 972 AAC GAG ATG TAC CGC GAG TGG GAC CTG CTG AAG TAC CGC TCC TTC GGC TAT GGC 1026 CAC TCC TTC GGC GTG CTG TGC CAC TAC TAC GGT CGC GAG GCG GGC GTG GAG CTG 1080 CGC GAG GAC ATC GAC ACC GAG CTG AAG CCC GGC ATG GTG GTC TCC ATG GAG CCG 1134 ATG GTG ATG CTG CCG GAG GGC ATG CCC GGT GCC GGC GGC TAT CCC GAG CAC GAC 1188 ATC CTG ATC GTC GGG GAG GAC GGT GCC GAG AAC ATC ACC GGC TTC CCG TTC GGT 1215 CCG GAA CAC AAC ATC ATC CGC AAC TGA
ジノハイドロラーゼの至適pHを示す図である。
ジノハイドロラーゼの至適温度を示す図である。
ジノハイドロラーゼのpH安定性を示す図である。
ジノハイドロラーゼの熱安定性を示す図である。
Claims (5)
- 【請求項1】 受託番号がFERM BP-4803である大腸菌が
保有するプラスミドpUCE100のEcoRI部位とEcoRI部位と
の間に含まれ、1215塩基のコーディング領域を有するク
レアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子であって、5’
末端側の配列が配列番号2に示すアミノ酸配列のうち第
1番目〜第78番目の配列をコードするものからなり、か
つ、3’末端側の配列が配列番号2に示すアミノ酸配列
のうち第376番目〜第404番目の配列をコードするものか
らなる、クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子。 - 【請求項2】 受託番号がFERM BP-4803である大腸菌が
保有するプラスミドpUCE100のEcoRI部位とEcoRI部位と
の間に含まれ、1215塩基のコーディング領域を有するク
レアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子であって、5’
末端側の配列が配列番号1に示す塩基配列のうち第1番
目〜第234番目の配列からなり、かつ、3’末端側の配列
が配列番号1に示す塩基配列のうち第1125番目〜第1215
番目の配列からなる、クレアチンアミジノハイドロラー
ゼ遺伝子。 - 【請求項3】 請求項1又は2記載のクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したこと
を特徴とする組み換え体DNA。 - 【請求項4】 請求項3記載の組み換え体DNAを含む形
質転換体。 - 【請求項5】 請求項3記載の組み換え体DNAを含み、
クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有するエッ
シェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物か
らクレアチンアミジノハイドロラーゼを採取することを
特徴とするクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造
法。
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US08/947,726 US5932466A (en) | 1994-09-29 | 1997-10-09 | Creatine amidinohydrolase gene, a novel recombinant DNA, and a process for producing creatine amidinohydrolase |
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JP23573794A JP3325128B2 (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 |
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