JP2787767B2 - 毒性物質を検出する方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、毒物を検出する方
法に関する。すなわち、本発明は、環境的に発生してい
る毒素に対するヒト及び動物の暴露を評価するための非
侵入性免疫学的スクリーニング操作に関する。さらに詳
細に言うと、本発明は、世界の多くの地域に存在する突
然変異原物質及び発癌物質を検出するための免疫学的方
法に関する。 【0002】ヒト及び他の動物が、食物、水及び空気を
介して毒性物質にさらされること及びその効果は我々の
生存にとって極めて重大な問題である。一般的な毒性物
質群の中で、アフラトキシン(aflatoxin)類、フルオラ
ンテン、ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニトロ
クリセン及びアミノビフェニルのような低分子量(10
00ダルトン又はそれ以下)の突然変異原物質及び/又
は発癌物質を検出することがより重要になってきてい
る。特に、アフラトキシンのような物質にヒトがされさ
れているかどうかを評価する非侵入性スクリーニング方
法は、毒物そのものと、その代謝物、特に血清や尿のよ
うな体液中でDNA及びタンパク質と形成される共有結
合付加物の両方を検出できなければならない。 【0003】アフラトキシンは、この群に含まれる毒性
及び発癌性化合物の代表的なものである。アフラトキシ
ンはマイコトキシンと呼ばれる、菌類の二次代謝物であ
り、アスパラギルス・フラブス(Aspergillus flavus)
及びアスパラギルス・パラシティカス(Aspergillus pa
rasiticus)によって生産され、構造的には縮合ジヒドロ
フロフラン部分を含む置換フマリン類である。アフラト
キシンはピーナツ、ピーナツミール、綿実ミール、トウ
モロコシ、乾燥チリ胡椒等に天然に含まれている。しか
しながら、カビの生育自体によっては、この毒素の存在
及び濃度を予測することができない。なぜなら、アフラ
トキシンの産出量は、カビの生育条件及びその種の遺伝
的性質に依存するからである。種々のアフラトキシン、
すなわちB1 型、B2 型、G1 型、G2 型、M1 型及び
M2 型は単離され、特徴づけられている。アフラトキシ
ンB1 型(以下、AFB1 という)はこれらの化合物の
中で最も生物的に活性で、多くの動物種に対して毒的
で、突然変異原物質及び発癌物質として作用する。この
マイコトキシンは世界の多くの地域でヒトの食物にしば
しば混入しており、これらの地域、特にアジア及びアフ
リカでは、ヒト肝臓癌の発生頻度が高くなっているとい
う統計がある(ブスビーら、Food-Born Infections and
Intoxications(リーマン及びブリアン編)、第2版、
アカデミック・プレス社、1979, pp.519-610)、ウォー
ガン・ジー・エヌ、Methods Cancer Res. 7: pp.309-34
4 (1973)) 。 【0004】AFB1 はまた、酸化的代謝を受けた後D
NA中のグアニンと共有結合性の付加物を形成して非常
に反応性に富んだ2,3−エポキシドになる。代表的な
付加物は2,3−ジヒドロ−2−(N7 −グアニル)−
3−ヒドロキシアフラトキシンB(以下、AFB1-N7-Gua
と記載する)である(リンら、Cancer Res. 37: pp.443
0-4438 (1977);マーチンら、Nature(ロンドン)、267:
pp.863-865 (1977))。AFB1-N7-Gua 付加物及びその推
定される誘導体である2,3-ジヒドロ-2-(N5- ホルミル-
2',5',6'-トリアミノ-4'-オキソ-N5-ピリミジル)-3-
ヒドロキシアフラトキシンB1 (以下、AF-N7-Gua と記
載する)は、ラットの生体肝臓、ヒト気管支及び結腸組
織培養物、ヒト肺臓細胞培養物のような組織及び系中
で、一時的に又は慢性的に投与した後同定されている
(ハウゲンら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:pp.4124
-4127 (1987))。 【0005】免疫学的方法及びモノクローナル抗体を用
いた、AFB1 及びそのDNA付加物を包含する代謝物
質の定量方法が研究されている(ハーツォグら、Carcin
ogenesis 3: pp.825-828 (1982);ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981))。同様な
研究が、免疫学的方法及び試薬を用いて、我々の環境中
に見出される他の低分子量の毒物について行われている
(ジョンソンら、J. Analyt. Toxicol. 4:pp.86-90; ヒ
ューら、J. Food Prot. 47: pp.562-569 (1984))。それ
にもかかわらず、現在知られている限りでは、このよう
な環境中に存在する発癌物質にヒト及び動物がさらされ
ているかどうかを評価する一般的な非侵入性スクリーニ
ング方法は未だ確立されていない。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
にかつ正確に毒物を測定することができる、毒性物質の
検出方法を提供することである。 【0007】 【課題を解決するための手段】本発明は、毒性物質(ア
フラトキシンを除く)を含んでいるかもしれない試料を
準備する工程と、固相吸着剤とこの上に固定化され、前
記毒性物質に対して特異的なモノクローナル抗体とを含
む親和性カラム上に該試料を載せる工程と、溶媒をカラ
ムに通し、第1の流出物を回収し、それによって前記毒
性物質を前記モノクローナル抗体によって前記カラム上
に保持する工程と、溶離剤をカラムに通して第2の流出
物を回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクロ
ーナル抗体から溶離させて前記第2の流出物中に回収す
る工程と、前記毒性物質の存在を検出するために前記第
2の流出物をさらに精製することなく紫外線にさらすこ
とによって蛍光分析を行なう工程とを含む、被検試料中
の毒性物質を検出する方法を提供する。なお、本明細書
で言う「検出」には存在の検出及び定量の両者が包含さ
れる。 【0008】 【発明の実施の形態】本発明は、毒性物質が次の2つの
性質を有する限り、毒性物質一般の検出及び単離に有用
である。第1の性質は分子量が約1000ダルトン以下
であること、第2の性質は、その毒性物質が単独で又は
他の化合物と結合して、動物生体中で免疫応答を誘起す
ることができることである。 【0009】分子量が約1000以下であるという第1
の要件は、あらゆる毒性物質について容易に決定でき
る。ここで用いる「毒性物質」という語は、生体外試験
又は生体試験(疫学試験を含む)において、有害、危険
的、又は破壊的であることが示されている全ての化合物
を包含する。最も注目すべきものは、この分野において
用いられ認められている意味において突然変異原的、遺
伝毒的、及び/又は発癌的であることが示されている化
合物である。 【0010】被検動物体内に導入された場合に免疫応答
を誘起するという、毒性物質の第2の性質は、主として
(排他的ではないが)その抗体形成を誘起する能力に依
存する。抗体の産生は、しばしば、他の免疫応答の前及
び後のいずれでも起こり、抗体の生産は抗原(又はハプ
テン)の製造方法及び導入方法に依存し、これらは定量
的及び定性的抗体反応に直接影響することが認められて
いる。このため、ある種の免疫応答が観察される限り、
この分野において現在知られている方法及び操作を用い
て特異的抗体を産生できることが理解されるべきであ
る。 【0011】本発明は従って、上記2つの要件に合致す
る全ての毒性物質に一般的に適用される。この群の化合
物に特に包含されるものとしてフルオランテン、ニトロ
ピレン、ニトロソピレン、ニトロフルオランテン、ニト
ロクリセン及びアミノビフェニル類(及びそれらの誘導
体)のような多核芳香族炭化水素を挙げることができ
る。この芳香族炭化水素類及び上述した例はいずれも認
められた免疫原であり、その性質上変異原的/発癌的な
ものである。免疫原でもある毒性物質を全て列挙するこ
とは広範囲にわたり、化学組成及び構造が多岐にわた
り、米国健康及び人間サービス局の増え続けるリストに
鑑みて増え続けるものである。このことに鑑み、毒性物
質を全て完全に列挙することは不可能でもあり望ましく
もないのでここでは試みない。その代わり、代表的な毒
性物質であるAFB1 を、検出される毒性物質として記
載するが、その説明は、本発明の方法が適用される、上
記2つの基本的要件を満たす全ての群の毒性物質に適用
される。 【0012】以下、本発明のここの部分を別々のセクシ
ョンに分離して記載する。なお、以下の実施例で得られ
たハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託してあり、その受託番号はATCC HB8
719 である。 【0013】I.アフラトキシン免疫原の製造 好ましい免疫原は、ウシガンマグロブリン(以下BGG
という)にAFB1 が結合されたものを含む組成物であ
る。先ず、BGGをpH7.0のリン酸緩衝液(以下、
PBSという)に10mg/mlの濃度で溶解した。m
−クロロパーオキシ安息香酸を用いた方法(マーチン
ら、ネイチャー誌(ロンドン)267:pp.863-865)を修飾
した方法によってAFB1 をBGGに結合した。典型的
には1mgのAFB1 (3.2μmol)を2.0ml
の塩化メチレンに溶かし、これを、予め2.0mlの塩
化メチレンに溶解された5モル過剰のm−クロロパーオ
キシ安息香酸(mCPBA)に加えた。この反応混合物
に、PBS中に溶けたBGGを加え、タンパク含量に対
し5モル過剰のアフラトキシンを生成した。反応混合物
を室温で一夜激しく混合し、次の2000gで20分間
遠心することによって反応を停止した。修飾BGGタン
パク質を含む水性の上層(上清)をpH7.4のPBS
に対し十分に透析した。362nmにおける吸光度を測
定し、モル消衰係数が18000であることを利用して
修飾グロブリンタンパク質の濃度を測定した。上記方法
により得られた反応生成物AFB1 −BGGは、平均し
て1分子のBGGに40ないし50のAFB1 残基が結
合していた。 【0014】上記方法を用いてAFB1 を他の担体に結
合することもできる。例えば、AFB1 がウシ血清アル
ブミン(以下、BSAという)に結合されたものは有用
な代替物である。しかしながら、ウシ血清アルブミンへ
のAFB1 の結合は、通常、1分子のBSAに対しアフ
ラトキシンが20ないし30分子である。他の有用な担
体も、この分野において知られた方法を用いてAFB1
と結合することができる。このような結合体の例を列挙
すると以下のとおりである。AFB1 −BGG(mCP
BA)、一本鎖AFB1 −DNA−meBSA、AFB
1 −N7-Gua-BGG-PABA(パラ安息香酸)、AFB1 −カ
ルボキシメチルオキシム−KLH(キーホール・リンペ
ット・ヘモシアニン)、AFB1 −ポリ−Gua-BGG 。 【0015】II. マウスの免疫化 約16週齢のメスのBALB/By(ジャクソン・ラボ
ラトリー)を、PBSに溶解され、等体積のフロインド
の完全アジュバントで乳化したAFB1 −BGGで免疫
化した。それぞれ5匹のマウスから成る2群を用い、免
疫化は37.5μg又は12μgのAFB1 −BGG
(アジュバントを含む)のPBS溶液(終体積0.2m
l)を腹腔内投与することによって行った。最初の注射
から5週間及び9週間後、それぞれのマウスに、フロイ
ンドの不完全アジュバントで乳化した同量のAFB1 −
BGGを投与した。2回目の注射から約10日後、尾か
ら出血させて血清試料を取り、ELISA免疫定量によ
って抗アフラトキシン抗体活性を測定した。血清中に特
異的抗体が見出されたマウスに対し、殺す3日前に同じ
AFB1 −BGGのPBS溶液(0.1ml)を尾の静
脈に注射した。 【0016】ELISA免疫定量はまた、マウス血清中
のAFB1 に対する特異的抗体の存在を調べるためにも
(そして次に特異的ハイブリドーマを同定するために
も)用いた。これらの定量方法は、この分野において公
知の方法を修飾したものである(ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981) 、グロー
プマンら、Cancer Res. 42:pp.3120-3124 (1982))。こ
の方法を簡単に要約すると、AFB1 −BSAを2.0
μg/mlの濃度にPBSに溶かし、この液体混合物の
50μlをポリビニルマイクロタイタープレートのそれ
ぞれのウェルに入れ、室温で2ないし4時間インキュベ
ートした。ウェルのいくつかには、2μg/mlの濃度
のBSAのPBS溶液50μlを入れ、対照とした。そ
れぞれのウェル中の液体を吸引し、ウェルを水で3回洗
った。次に、それぞれのウェルに、0.2%BSA又は
0.2%ゼラチン(タイプIV、シグマ社)を含むPBS
溶液を入れ、プレートを室温でさらに1時間インキュベ
ートした。この操作は抗体の非特異的結合を制限するた
めに行った。プレートを次に水中で洗い、50μlのマ
ウス血清試料又はハイブリドーマ培地をそれぞれのウェ
ルに入れた。マウス血清を滴定するために、10%のウ
シ胎児血清を含むPBS中に連続する3倍希釈により、
1:50ないし3:50000の範囲の希釈物をつくっ
た。ハイブリドーマ培地を用いた場合には、希釈物と共
に50μlを用いた。どちらの場合も、マイクロタイタ
ープレートを37℃で90分間インキュベートし、その
後水で完全に洗った。それぞれのウェルの表面に結合し
た特的抗体は、それぞれのウェルに、アルカリフォスフ
ァターゼに結合されたラットの抗マウスカッパ抗体の
1:200希釈物を50μl加え、室温で4時間又は4
℃で一夜インキュベートすることによって測定した。そ
れぞれのプレートのウェルは次に、水で再び洗った。p
H9.8の0.1Mジエタノールアミン緩衝液中でつく
った1.0mg/mlのp−ニトロフェニルフォスフェ
ート溶液100μlをそれぞれのウェルに加え、1ない
し2時間反応させた。マイクロタイタープレートリーダ
ー(ダイナテック・ラボラトリー)を用いて405nm
でのウェルの吸光度を測定することによってp−ニトロ
フェノール反応生成物を定量した。 【0017】マウス免疫グロブリンのサブタイプの同定
のための市販のキット(ベーリンガー−マンハイム社)
を用いた非競合的ELISAにより、モノクローナル抗
体のイソタイプを決定した(すなわち、異なる抗体H鎖
群を同定した)。 【0018】III.ハイブリドーマの製造及びモノクロー
ナル抗体産生細胞の単離 予めフロインドの完全アジュバント中にAFB1 −BG
Gで免疫化したメスのBALB/By CJマウスが有
意の抗AFB1 血清タイターを有しているかどうかを上
述の非競合的ELISAを用いて調べた。抗タイターを
示すマウスを殺し、マーシャク−ロスシュタインら、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー、122、pp.2491-24
97(1979)に記載された方法に従ってハイブリドーマをつ
くった。20%(v/v)のウシ胎児血清、580μg
/mlのグルタミン、10ユニット/mlのペニシリ
ン、100μg/mlのストレプトマイシン、及び非必
須アミノ酸(ギブコ社)を加えたダルベッコの修飾イー
グル培地(以下、DME培地という)中に維持したSP
2/0ミエローマ株細胞を融合細胞のために用いた。マ
スを殺し、0.01Mのリン酸で緩衝された、pH7.
2のハンクの平衡塩溶液(以下、HPBSという)を用
いて脾細胞の懸濁液をつくった。 【0019】これらのマウスからの脾細胞を、ゲフター
ら、Somatic Cell Genet. 3: pp.321(1977) に記載され
た方法を修飾した方法を用いてSP2/0ミエローマ細
胞と融合した。他に断りがない限り、全ての遠心は室温
で700gで5分間行った。好ましくは、5x106 個
のSP2/0ミエローマ細胞と5x107 個の免疫脾細
胞とを丸底プラスチック管中で1つにし、遠心し、血清
を含まない10mlのDME培地で再懸濁し、再び遠心
した。上清を慎重に捨て、遠心管中に残った細胞ペレッ
トを分散させるように、蛇口の水をペレット中に鋭くか
けた。次に細胞を無血清DME中に溶けた30%(v/
v)のポリエチレングリコール1000(ベーカー・ケ
ミカル社)の溶液0.5mlに6分間さらした。この6
分の間に細胞をゆっくりと遠心した(150gで3分
間)。次に細胞ペレットに4.0mlの無血清DMEを
加え、細胞を蛇口の水で再び懸濁した。管の内容物を1
00.17mmのペトリ皿に移し、20%のウシ胎児血
清を含むDME培地中で1日培養した。次に細胞を再び
懸濁し、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む生育培地(以下、HAT培地という)中で再懸濁
した。平底マイクロタイタープレートのそれぞれのウェ
ルに、細胞を0.1ml(約105 個のSP2/0細胞
を含む)ずつ入れた。1週間インキュベートした後、ヒ
ポキサンチン及びチミジンのみを含む生育培地(以下、
HAT培地という)を0.05mlずつそれぞれのウェ
ルに加えた。融合2週間後、それぞれの培養物につい
て、上述したELISA免疫定量法を用いて特異的抗A
FB1 抗体の有無を調べた。 【0020】AFB1 に対し高い親和性を有するIgM
抗体を分泌しているハイブリドーマを、予め0.5ml
のプリステン(アドリッチ社)を注射したBALB/c
マウス中に腹水腫瘍細胞として生育した。マウス中で生
育したハイブリドーマは特異的IgM抗体を多量に生産
し、これはマウスが死ぬ前に腹水として回収された。こ
れらの動物からの腹水を貯蔵し、そのまま又は飽和硫酸
アンモニウム沈殿及びPBSに対する透析によりさらに
精製して免疫定量法に用いた。肉眼で病理調査を行った
ところ、全てのマウスは、広範囲に広がる腫瘍の侵入、
すなわち、注射されたハイブリドーマ細胞の増殖の結果
死んだことがわかった。 【0021】この方法により得られたモノクローナル抗
体はAFB1 分子に対して特異性を有する抗親和性Ig
M抗体であることが示された。この抗体の親和定数をス
カッチャード(Scatchard)プロット分析及びミュラーの
方法(J. Immunol. Meth: 34, pp.345-352 (1980))によ
り決定したところ、8x108 及び1x109 リットル
/モルであった。これらの値は、下記の競合的RIA法
により得られたデータから導かれたものである。 【0022】この分析は300μlの試料を用いて行
い、その100μlはモラベク・バイオケミカルズ社か
ら購入した[3H]-AFB1、トレーサー(非活性3.4Ci
/mmol)から成る。トレーサー原液を、0.1%の
BSAを含む通常マウス血清の1%PBS溶液で希釈
し、約20200cpm/100μlの濃度にした。モ
ノクローナル抗体を、AFB1 トレーサーの30ないし
50%が沈殿する濃度にまで希釈した。10%ウシ胎児
血清PBS溶液を含む抗体を100μlずつ反応混合物
に加えた。非放射標識AFB1 又は、主なAFB1 −D
NA付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrを包含するそ
の代謝物から成る試料を100μlずつ管に加えた。反
応混合物を室温で2時間インキュベートし、次いで混合
物をPBSで1.0mlの体積になるように希釈した。
次に等量の氷冷飽和硫酸アンモニウムを加え、試料を混
合し、氷中に15分間立てた。試料を次に2000gで
15分間遠心し、ミュラー法を用いて反応の阻害率
(%)を求めた。 【0023】AFB1 及びその代謝物に対するIgM抗
体の特異性が図1及び図2に示されている。なお、これ
らの結果は、飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ、PBS
に対して透析することによって最初に分画された高親和
性の精製IgM抗体を用いて得られたものである。抗体
を次に高圧液体クロマトグラフィーで精製した。この
際、IgM抗体の分子量が大きなこと(900000ダ
ルトン)を利用して、立体的排他性により分離した。こ
こに記載する方法において用いたものは、その特性及び
高親和性を有するこの精製IgM抗体の特徴及び性質で
ある。競合的RIA法において、アフラトキシンB1 、
アフラトキシンB2 、及びアフラトキシンM1 について
阻害率が50%となるのは3.0ピコモルであったが、
アフラトキシンG1 、アフラトキシンG2 、及びアフラ
トキシンQ1 についてはそれぞれ60.0、84.0、
及び275.0ピコモルであった。図2に示されたデー
タは、AFB1 及び2つの主たるアフラトキシン−DN
A付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrに対するIgM
抗体の特異性及び阻害率が50%となる点を示してい
る。50%阻害値はそれぞれ3.0、24.0、及び8
9.0ピコモルであった。従って、データは、このIg
M抗体がAF-FAPyr付加物を検出する感度がAF-N7-Gua 付
加物を検出する感度よりも約4倍高いことを示してい
る。 【0024】IV. 固定化抗AFB1 IgMモノクローナ
ル抗体を含む親和性マトリックス この精製されたIgMモノクローナル抗体を用いて、フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の
方法によって親和性マトリックス材料をつくった。十分
量(2.0mg)のモノクローナル抗体を、0.1M
NaHCO3 と0.5M NaClとを含む結合緩衝液
(pH8.3)に溶解した。この抗体溶液を、予め8.
0mlの0.001M HCl中で一夜インキュベート
した、臭化シアノーゲンによって活性化されたセファロ
ース−4B(シグマ社)に加えた。セファロースと抗体
溶液とを1時間反応させた後、この固相吸着材料を、
1.0Mのエタノールアミン(pH8.5)で1時間イ
ンキュベートすることによって、抗体が結合されたゲル
の未結合部位をブロックした。固相吸着材料上に固定化
されたIgM抗体によって親和性マトリックスが形成さ
れ、これを次に1ないし2mlの体積ずつ用いた。 【0025】好ましい固相吸着材料は活性化されたセフ
ァロース4Bゲルであるけれども、他の多くの材料を固
相材料として用いることができることが認められてい
る。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、
ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げるこ
とができる。同様に、抗親和性IgM抗体をそれぞれの
化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知
であり、記載されている。 【0026】V.液体試料中のアフラトキシンを検出し単
離する方法 被検試料中のアフラトキシン及びアフラトキシン−DN
A付加物を検出する方法は、次の工程を含む親和性クロ
マトグラフィー法である。(1) アフラトキシン又は目的
のアフラトキシン−DNA付加物に対して特異的な抗親
和性IgM抗体が固相吸着材料上に固定化された、均一
な親和性マトリックスを製造する。(2)被検試料中のア
フラトキシンが、親和性マトリックスのIgM抗体によ
って結合され保持されるように、被検試料と親和性マト
リックスとを接触させる。(3) IgM抗体からアフラト
キシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックス
に加える。この溶離剤は、ジメチルスルフォキシド、ジ
メチルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドから成
る群より選ばれる非プロトン性溶媒の、50%(v/
v)以上の濃度の水溶液である。(4) 親和性マトリック
スからの回収された流出物中にアフラトキシンが存在す
るかどうかを同定する。 【0027】抗アフラトキシンIgMモノクローナル抗
体の重要な特徴は、AFB1 抗原に対する特異性だけで
はなく、その高い親和定数(少なくとも約1x108 リ
ットル/モル、好ましくは1x109 リットル/モル)
も重要な特徴である。従って、親和性カラム中に共有結
合されている抗体に目的のアフラトキシンが結合した
後、これを溶離するための溶離剤には特殊なものを使わ
なければならない。このことは次の参考例に示されてい
る。すなわち、次の参考例では、吸着剤に結合した抗体
が、目的のアフラトキシンに結合する能力を示すのみな
らず、アフラトキシンが親和性カラムに吸着した後、こ
れを選択的に解離させるのに、従来の溶離剤を用いたの
ではこれを行い得ないことを示している。 【0028】参考例1 最初の実験は、セファロース4B上に固定化された抗A
FB1 IgM抗体がAFB1 を結合する能力を測定する
ために行った。これらの実験では、放射標識した3H-AFB
1 を10mlのPBS中に1ngの濃度で用いた。この
濃度は、汚染された食品にさらされたヒトの体液中に検
出されるであろうと予想されるアフラトキシンの濃度で
ある。先ず、100μlの3H-AFB1 トレーサーと、0.
1%のBSAと、10mMのNaN3 と、0.1mlの
通常マウス血清と、3μlの3H-AFB1 とを含むPBS1
0.0mlを約1.0mlのゲル床に加えた。流出カラ
ム流速は0.25ml/分よりも少し大きかった。約2
00μlのPBSをトレーサーに加え、親和性マトリッ
クスの頂部が空気にさらされるまで(カラムが乾燥する
ことなしに)カラムを加工させることによってカラムに
移した。さらに2.0mlのPBSを加えてトレーサー
をカラムから洗い出し、流出液をガラスビンに単一の分
画として集めた(No.1)。このようにして約244
86cpmのトレーサーをカラムに加え、それぞれの分
画が回収されるごとにシンチレーションによって放射標
識物質の含量を測定した。次に異なる溶離剤を親和性マ
トリックスに加え、AFB1 トレーサーを放出する能力
を測定した。これらの結果は以下の表1に示されてい
る。 【0029】 【表1】 【0030】明らかなように、元のトレーサーの約10
%は親和性マトリックスに吸着されず、溶離剤を加える
前に流出分画No.1として回収された。これはトレー
サー中の非特異的トリチウム交換に起因する。引き続き
行った、列挙した個々の溶離剤との反応により、流出分
画2〜7においては、マトリックスのIgM抗体によっ
てトレーサーAFB1 の放出は実質的に起こらないこと
がわかった。50%ジメチルスルフォキシド(以下、D
MSOという)を用いて初めて多量(90%)のAFB
1 トレーサーが親和性マトリックスから放出された。ま
た、DMSOを親和性カラムに加えると、マトリックス
中の明確な色の変化が見えるようになり、カラム床自体
がより半透明になった。DMSO流出分画を回収した後
にPBSを親和性マトリックスるに加えると、ゲル床は
元の不透明な通常の状態に戻った。 【0031】親和性マトリックスは、セファロースゲル
に結合されたIgM抗体を損傷し又は修飾(変性、沈殿
等)することなくもとの状態に復帰した。このことは、
DMSO遊離剤を加えその後PBSで洗う実験を継続す
ることによって示された。 【0032】200μlのPBSに溶けた第2の100
μlのトレーサー3H-AFB1 を、前に第1の3H-AFB1 トレ
ーサー試料を単離するのに用いた同じカラムに加えた。
第2のトレーサーを加えた後、2.0mlのPBSでカ
ラムをすすぎ、流出物を分画No.8として回収した。
次に2.0mlのDMSOのPBS溶液を加え、流出物
を分画No.9として回収した。カラムを次に2回2.
0mlPBSでそれぞれ洗い、流出液を分画10及び1
1として回収した。結果を下記表2に示す。 【0033】 【表2】 【0034】第2のトレーサーは約24486cpmの
総放射能を有していたが、また、その約10%が親和性
マトリックスに保持されなかった。分画9はまた、多量
のAFB1 トレーサー(約60%)がDMSOによって
溶離され、残りは、いくらかの残留DMSOを含む第1
回目のPBS洗浄によって分画10中に回収されること
を示している。 【0035】さらに、溶離効果をもたらすためには少な
くとも50%の濃度のDMSOを用いることが必要であ
ることを示すために、この実験の変形を行った。この実
験に用いた100μlの3H-AFB1 は合計で約27000
なし28000cpmの3H-AFB1 を含んでいた。100
μlのトレーサーを親和性カラムに載せ、200μlの
PBSで洗浄して保持されていないトレーサーをカラム
から除去した。次にマトリックスを1.0mlずつの、
濃度が増加するDMSOで洗った。結果を次の表3に示
す。 【0036】 【表3】【0037】表3より、DMSOの50%溶液を使用す
る前は、親和性マトリックスから3H-AFB1 が実質的に溶
離されないことがわかる。また、DMSOの濃度を50
%より大きくしても、親和性マトリックスからのAFB
1 の放出は検出可能な程度には増加しないことがわか
る。このため、DMSOはその濃度が少なくとも50%
あれば、この方法において溶離剤として用いるのに十分
である。この方法に用いるのに適した他の溶離剤はジメ
チルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドである。
有効な溶離剤とするためには、これらの溶離剤も少なく
とも50%の濃度で用いなければならない。これらの溶
離剤、すなわち、さらに一般的に非プロトン性溶媒を用
いた場合、親和性マトリックスは繰り返し再使用するこ
とができる。このような非プロトン性溶媒で溶離しても
マトリックス材料は損傷されない。このことはマイコト
キシンの検出及び測定を産業的に行う場合に重要であ
る。産業的にこの方法を行う場合には、その経済的理由
により親和性マトリックスを再使用する必要があるが、
DMSOのような非プロトン溶媒で溶出することはこの
要求に合致している。 【0038】一方、溶離はメタノールやエタノールのよ
うな新油性溶媒を用いて行うこともできるが、親和性マ
トリックスあるいはカラムは実質的に再使用できなくな
る。本発明のこの局面では、好ましくは50ないし10
0%、特に好ましくは100%のメタノール又はエタノ
ールを、DMSOの代わりにこれらを用いることを除い
て上記した方法と同様にして用いることができる。 【0039】VI. ヒトの尿、血清、及び母乳からのアフ
ラトキシンの生体外における単離 上で示されたように、放射滴定又は吸光度測定により示
されたIgM抗体親和性マトリックスのAFB1 を結合
する能力は、1mlのカラム床当たり、10mlのPB
SからのAFB1 1.0ないし1.3μgである。これ
らのパラメーターは、ヒトの尿、血清、母乳試料から、
生体外でアフラトキシンを下記のようにして単離し検出
するのに用いることができる。 【0040】ヒト血清(10mlずつ)又はヒト母乳
(10mlずつ)を、前処理することなしに直接抗体マ
トリックスに施すことができる。どちらの場合にも、液
体試料中のアフラトキシンが抗体マトリックスに定量的
に結合し、これらは、溶離剤として50%濃度のDMS
Oを用いることによって定量的に回収される。このこと
は、上述したようにして、3H-AFB1 を1ngずつ血清又
は母乳試料に直接加えることによって経験的に見出され
た。従って、血清又は母乳を試験する場合には、アフラ
トキシンを定量的に回収するためには、何らの準備工程
もいらない。 【0041】しかしながら、尿は、試料中の妨害物質、
例えば塩を除くために、アフラトキシンの単離及び回収
を行う前に、クロマトグラフィーを包含する前処理を行
わなければならない。これは図3に模式的に示されてお
り、ここではセプパック(Sep-Pak)C18 カートリッジ
(ウォーターズ・アソシエイツ社)を用いて妨害物質を
除去した。尿試料を先ず、準備的な低圧液体クロマトグ
ラフィーカートリッジに通してタンパク質や他の妨害物
質を除去すれば、ヒトの尿試料中に存在するアフラトキ
シンの90ないし95%は本発明の方法により一貫して
定量的に回収できる。 【0042】また、AFB1 に対して特異的である抗親
和性IgM抗体を用いることは、AFB1 −DNA付加
物、AF-N7-Gua を定量的に検出し回収するのに有用であ
る。これらのアフラトキシンDNA付加物は、血清や他
の体液から、何らの前処理を行うことなく検出され、定
量的に回収される。ヒト又は動物からの尿を被検試料と
する場合には、試料を親和性マトリックスに加える前
に、先ずカーボンクロマトグラフィーカートリッジを通
す高圧液体クロマトグラフィーにより試料を前処理する
ことが好ましい。このようにして、環境的に汚染された
人々からの複雑な生物学的試料からのAFB1 及びその
代謝物を定量的及び定性的に単離し精製することができ
る。さらに、この方法は、アフラトキシン自体を検出す
る分析法としても働く。 【0043】上述したことより、本発明は、試料中の種
々の濃度の毒物を簡単に正確に検出することができるこ
とがわかる。本発明の重要な局面は特異的モノクローナ
ル抗体が結合された親和性マトリックスすなわちカラム
である。固相吸着剤上に固定化された抗体を含むこのよ
うな親和性マトリックスを用いることは、迅速で効率の
高い、被検試料の精製手段を提供する。モノクローナル
抗体の高親和性及び選択性の故に、試料の粗抽出物を抗
体マトリックスカラムに通し、それによって目的の毒物
が抗体に結合され、該試料抽出物の他の全ての成分は通
過する。DMSO又はメタノールのような適当な溶離剤
で溶離することによって、元の粗試料から、定量的な収
量で高度に精製された毒物が溶離され、回収される。こ
のような効率的な1工程精製方法は、特に毒物の分析の
分野において遊離である。 【0044】本発明のこの重要な局面は、目的の毒物に
対して特異的なモノクローナル抗体が結合されたマトリ
ックス又はカラムを用いることによって、他の毒物、特
にマイコトキシンを検出し、測定するのに広範囲に適用
することができる。抗体マトリックス材料によって毒物
が一旦精製されたならば、所望により、蛍光法、免疫分
析、放射免疫分析、ELISA法、薄層クロマトグラフ
ィー、高圧液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、比色定量等の種々の方法により毒物を検出する
ことができる。どの検出方法を用いるかは、毒物の性
質、毒物の予想濃度、検出データの用途を包含する種々
の因子に依存する。いずれにせよ、この発明は、モノク
ローナル抗体が結合された親和性的を用い、分析し検出
するための試料を親和性マトリックスに1回通すことに
よる簡単で迅速な精製方法を提供する。なお、親和性マ
トリックスを通した後は、さらに精製することを要しな
い。 【0045】アフラトキシンについては、1つの好まし
い検出方法は蛍光分析である。すなわち、精製した試料
を紫外線(365nm)に当てるとアフラトキシンは4
25nmの蛍光を発する。この型の分析方法は、その分
析性能及び、ある程度の定量分析も可能であるというこ
とにより、特に好ましい。このような蛍光分析操作は、
AOAC法(AOAC Method,第26章、pp.414-429(1
980)) の方法に従うことによって行うことができる。 【0046】抗体結合マトリックスにより毒物を含む試
料の1工程精製が可能になるので、本発明は、産業廃棄
物やトウモロコシ、ピーナッツのような食品、及び体液
中に含まれる種々の毒物を検査するのに適用することが
できる。トウモロコシ試料を例として、全体的な操作方
法を図4に示す。 【0047】上記からわかるように、共通の重要な工程
は、特異的モノクローナル抗体が結合した親和性カラム
を用いることによる試料の精製にあることが明らかであ
る。試料が一旦精製されると、毒物の濃度又は存在は種
々の方法により定性的に又は定量的に測定することがで
きる。 【0048】定性分析 この発明によると毒物は先ず定性的に検出することがで
きる。例えば、トウモロコシ試料中のアフラトキシン
は、次の工程により検出することができる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの50gを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) 1分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラム(好ましくはシリンジに含まれたも
の)にメタノールを通し、蛍光照明手段を有する反応容
器にこれを回収する。 (10)蛍光照明手段を有する容器を取り、蛍光量を可視的
に測定(定量的ではない)するための装置に入れる。 (11)容器を取り、捨てる。 【0049】定量分析 一方、毒物の濃度は次の操作により定量的に測定するこ
とができる。再び、トウモロコシ中のアフラトキシンの
測定を例として挙げる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの50gを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) 1分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラムにメタノールを通し、測定装置に含ま
れた試験キュベットに回収する。 (10)測定値を読む。 (11)試料を取り出し捨てる。
法に関する。すなわち、本発明は、環境的に発生してい
る毒素に対するヒト及び動物の暴露を評価するための非
侵入性免疫学的スクリーニング操作に関する。さらに詳
細に言うと、本発明は、世界の多くの地域に存在する突
然変異原物質及び発癌物質を検出するための免疫学的方
法に関する。 【0002】ヒト及び他の動物が、食物、水及び空気を
介して毒性物質にさらされること及びその効果は我々の
生存にとって極めて重大な問題である。一般的な毒性物
質群の中で、アフラトキシン(aflatoxin)類、フルオラ
ンテン、ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニトロ
クリセン及びアミノビフェニルのような低分子量(10
00ダルトン又はそれ以下)の突然変異原物質及び/又
は発癌物質を検出することがより重要になってきてい
る。特に、アフラトキシンのような物質にヒトがされさ
れているかどうかを評価する非侵入性スクリーニング方
法は、毒物そのものと、その代謝物、特に血清や尿のよ
うな体液中でDNA及びタンパク質と形成される共有結
合付加物の両方を検出できなければならない。 【0003】アフラトキシンは、この群に含まれる毒性
及び発癌性化合物の代表的なものである。アフラトキシ
ンはマイコトキシンと呼ばれる、菌類の二次代謝物であ
り、アスパラギルス・フラブス(Aspergillus flavus)
及びアスパラギルス・パラシティカス(Aspergillus pa
rasiticus)によって生産され、構造的には縮合ジヒドロ
フロフラン部分を含む置換フマリン類である。アフラト
キシンはピーナツ、ピーナツミール、綿実ミール、トウ
モロコシ、乾燥チリ胡椒等に天然に含まれている。しか
しながら、カビの生育自体によっては、この毒素の存在
及び濃度を予測することができない。なぜなら、アフラ
トキシンの産出量は、カビの生育条件及びその種の遺伝
的性質に依存するからである。種々のアフラトキシン、
すなわちB1 型、B2 型、G1 型、G2 型、M1 型及び
M2 型は単離され、特徴づけられている。アフラトキシ
ンB1 型(以下、AFB1 という)はこれらの化合物の
中で最も生物的に活性で、多くの動物種に対して毒的
で、突然変異原物質及び発癌物質として作用する。この
マイコトキシンは世界の多くの地域でヒトの食物にしば
しば混入しており、これらの地域、特にアジア及びアフ
リカでは、ヒト肝臓癌の発生頻度が高くなっているとい
う統計がある(ブスビーら、Food-Born Infections and
Intoxications(リーマン及びブリアン編)、第2版、
アカデミック・プレス社、1979, pp.519-610)、ウォー
ガン・ジー・エヌ、Methods Cancer Res. 7: pp.309-34
4 (1973)) 。 【0004】AFB1 はまた、酸化的代謝を受けた後D
NA中のグアニンと共有結合性の付加物を形成して非常
に反応性に富んだ2,3−エポキシドになる。代表的な
付加物は2,3−ジヒドロ−2−(N7 −グアニル)−
3−ヒドロキシアフラトキシンB(以下、AFB1-N7-Gua
と記載する)である(リンら、Cancer Res. 37: pp.443
0-4438 (1977);マーチンら、Nature(ロンドン)、267:
pp.863-865 (1977))。AFB1-N7-Gua 付加物及びその推
定される誘導体である2,3-ジヒドロ-2-(N5- ホルミル-
2',5',6'-トリアミノ-4'-オキソ-N5-ピリミジル)-3-
ヒドロキシアフラトキシンB1 (以下、AF-N7-Gua と記
載する)は、ラットの生体肝臓、ヒト気管支及び結腸組
織培養物、ヒト肺臓細胞培養物のような組織及び系中
で、一時的に又は慢性的に投与した後同定されている
(ハウゲンら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:pp.4124
-4127 (1987))。 【0005】免疫学的方法及びモノクローナル抗体を用
いた、AFB1 及びそのDNA付加物を包含する代謝物
質の定量方法が研究されている(ハーツォグら、Carcin
ogenesis 3: pp.825-828 (1982);ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981))。同様な
研究が、免疫学的方法及び試薬を用いて、我々の環境中
に見出される他の低分子量の毒物について行われている
(ジョンソンら、J. Analyt. Toxicol. 4:pp.86-90; ヒ
ューら、J. Food Prot. 47: pp.562-569 (1984))。それ
にもかかわらず、現在知られている限りでは、このよう
な環境中に存在する発癌物質にヒト及び動物がさらされ
ているかどうかを評価する一般的な非侵入性スクリーニ
ング方法は未だ確立されていない。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
にかつ正確に毒物を測定することができる、毒性物質の
検出方法を提供することである。 【0007】 【課題を解決するための手段】本発明は、毒性物質(ア
フラトキシンを除く)を含んでいるかもしれない試料を
準備する工程と、固相吸着剤とこの上に固定化され、前
記毒性物質に対して特異的なモノクローナル抗体とを含
む親和性カラム上に該試料を載せる工程と、溶媒をカラ
ムに通し、第1の流出物を回収し、それによって前記毒
性物質を前記モノクローナル抗体によって前記カラム上
に保持する工程と、溶離剤をカラムに通して第2の流出
物を回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクロ
ーナル抗体から溶離させて前記第2の流出物中に回収す
る工程と、前記毒性物質の存在を検出するために前記第
2の流出物をさらに精製することなく紫外線にさらすこ
とによって蛍光分析を行なう工程とを含む、被検試料中
の毒性物質を検出する方法を提供する。なお、本明細書
で言う「検出」には存在の検出及び定量の両者が包含さ
れる。 【0008】 【発明の実施の形態】本発明は、毒性物質が次の2つの
性質を有する限り、毒性物質一般の検出及び単離に有用
である。第1の性質は分子量が約1000ダルトン以下
であること、第2の性質は、その毒性物質が単独で又は
他の化合物と結合して、動物生体中で免疫応答を誘起す
ることができることである。 【0009】分子量が約1000以下であるという第1
の要件は、あらゆる毒性物質について容易に決定でき
る。ここで用いる「毒性物質」という語は、生体外試験
又は生体試験(疫学試験を含む)において、有害、危険
的、又は破壊的であることが示されている全ての化合物
を包含する。最も注目すべきものは、この分野において
用いられ認められている意味において突然変異原的、遺
伝毒的、及び/又は発癌的であることが示されている化
合物である。 【0010】被検動物体内に導入された場合に免疫応答
を誘起するという、毒性物質の第2の性質は、主として
(排他的ではないが)その抗体形成を誘起する能力に依
存する。抗体の産生は、しばしば、他の免疫応答の前及
び後のいずれでも起こり、抗体の生産は抗原(又はハプ
テン)の製造方法及び導入方法に依存し、これらは定量
的及び定性的抗体反応に直接影響することが認められて
いる。このため、ある種の免疫応答が観察される限り、
この分野において現在知られている方法及び操作を用い
て特異的抗体を産生できることが理解されるべきであ
る。 【0011】本発明は従って、上記2つの要件に合致す
る全ての毒性物質に一般的に適用される。この群の化合
物に特に包含されるものとしてフルオランテン、ニトロ
ピレン、ニトロソピレン、ニトロフルオランテン、ニト
ロクリセン及びアミノビフェニル類(及びそれらの誘導
体)のような多核芳香族炭化水素を挙げることができ
る。この芳香族炭化水素類及び上述した例はいずれも認
められた免疫原であり、その性質上変異原的/発癌的な
ものである。免疫原でもある毒性物質を全て列挙するこ
とは広範囲にわたり、化学組成及び構造が多岐にわた
り、米国健康及び人間サービス局の増え続けるリストに
鑑みて増え続けるものである。このことに鑑み、毒性物
質を全て完全に列挙することは不可能でもあり望ましく
もないのでここでは試みない。その代わり、代表的な毒
性物質であるAFB1 を、検出される毒性物質として記
載するが、その説明は、本発明の方法が適用される、上
記2つの基本的要件を満たす全ての群の毒性物質に適用
される。 【0012】以下、本発明のここの部分を別々のセクシ
ョンに分離して記載する。なお、以下の実施例で得られ
たハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託してあり、その受託番号はATCC HB8
719 である。 【0013】I.アフラトキシン免疫原の製造 好ましい免疫原は、ウシガンマグロブリン(以下BGG
という)にAFB1 が結合されたものを含む組成物であ
る。先ず、BGGをpH7.0のリン酸緩衝液(以下、
PBSという)に10mg/mlの濃度で溶解した。m
−クロロパーオキシ安息香酸を用いた方法(マーチン
ら、ネイチャー誌(ロンドン)267:pp.863-865)を修飾
した方法によってAFB1 をBGGに結合した。典型的
には1mgのAFB1 (3.2μmol)を2.0ml
の塩化メチレンに溶かし、これを、予め2.0mlの塩
化メチレンに溶解された5モル過剰のm−クロロパーオ
キシ安息香酸(mCPBA)に加えた。この反応混合物
に、PBS中に溶けたBGGを加え、タンパク含量に対
し5モル過剰のアフラトキシンを生成した。反応混合物
を室温で一夜激しく混合し、次の2000gで20分間
遠心することによって反応を停止した。修飾BGGタン
パク質を含む水性の上層(上清)をpH7.4のPBS
に対し十分に透析した。362nmにおける吸光度を測
定し、モル消衰係数が18000であることを利用して
修飾グロブリンタンパク質の濃度を測定した。上記方法
により得られた反応生成物AFB1 −BGGは、平均し
て1分子のBGGに40ないし50のAFB1 残基が結
合していた。 【0014】上記方法を用いてAFB1 を他の担体に結
合することもできる。例えば、AFB1 がウシ血清アル
ブミン(以下、BSAという)に結合されたものは有用
な代替物である。しかしながら、ウシ血清アルブミンへ
のAFB1 の結合は、通常、1分子のBSAに対しアフ
ラトキシンが20ないし30分子である。他の有用な担
体も、この分野において知られた方法を用いてAFB1
と結合することができる。このような結合体の例を列挙
すると以下のとおりである。AFB1 −BGG(mCP
BA)、一本鎖AFB1 −DNA−meBSA、AFB
1 −N7-Gua-BGG-PABA(パラ安息香酸)、AFB1 −カ
ルボキシメチルオキシム−KLH(キーホール・リンペ
ット・ヘモシアニン)、AFB1 −ポリ−Gua-BGG 。 【0015】II. マウスの免疫化 約16週齢のメスのBALB/By(ジャクソン・ラボ
ラトリー)を、PBSに溶解され、等体積のフロインド
の完全アジュバントで乳化したAFB1 −BGGで免疫
化した。それぞれ5匹のマウスから成る2群を用い、免
疫化は37.5μg又は12μgのAFB1 −BGG
(アジュバントを含む)のPBS溶液(終体積0.2m
l)を腹腔内投与することによって行った。最初の注射
から5週間及び9週間後、それぞれのマウスに、フロイ
ンドの不完全アジュバントで乳化した同量のAFB1 −
BGGを投与した。2回目の注射から約10日後、尾か
ら出血させて血清試料を取り、ELISA免疫定量によ
って抗アフラトキシン抗体活性を測定した。血清中に特
異的抗体が見出されたマウスに対し、殺す3日前に同じ
AFB1 −BGGのPBS溶液(0.1ml)を尾の静
脈に注射した。 【0016】ELISA免疫定量はまた、マウス血清中
のAFB1 に対する特異的抗体の存在を調べるためにも
(そして次に特異的ハイブリドーマを同定するために
も)用いた。これらの定量方法は、この分野において公
知の方法を修飾したものである(ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981) 、グロー
プマンら、Cancer Res. 42:pp.3120-3124 (1982))。こ
の方法を簡単に要約すると、AFB1 −BSAを2.0
μg/mlの濃度にPBSに溶かし、この液体混合物の
50μlをポリビニルマイクロタイタープレートのそれ
ぞれのウェルに入れ、室温で2ないし4時間インキュベ
ートした。ウェルのいくつかには、2μg/mlの濃度
のBSAのPBS溶液50μlを入れ、対照とした。そ
れぞれのウェル中の液体を吸引し、ウェルを水で3回洗
った。次に、それぞれのウェルに、0.2%BSA又は
0.2%ゼラチン(タイプIV、シグマ社)を含むPBS
溶液を入れ、プレートを室温でさらに1時間インキュベ
ートした。この操作は抗体の非特異的結合を制限するた
めに行った。プレートを次に水中で洗い、50μlのマ
ウス血清試料又はハイブリドーマ培地をそれぞれのウェ
ルに入れた。マウス血清を滴定するために、10%のウ
シ胎児血清を含むPBS中に連続する3倍希釈により、
1:50ないし3:50000の範囲の希釈物をつくっ
た。ハイブリドーマ培地を用いた場合には、希釈物と共
に50μlを用いた。どちらの場合も、マイクロタイタ
ープレートを37℃で90分間インキュベートし、その
後水で完全に洗った。それぞれのウェルの表面に結合し
た特的抗体は、それぞれのウェルに、アルカリフォスフ
ァターゼに結合されたラットの抗マウスカッパ抗体の
1:200希釈物を50μl加え、室温で4時間又は4
℃で一夜インキュベートすることによって測定した。そ
れぞれのプレートのウェルは次に、水で再び洗った。p
H9.8の0.1Mジエタノールアミン緩衝液中でつく
った1.0mg/mlのp−ニトロフェニルフォスフェ
ート溶液100μlをそれぞれのウェルに加え、1ない
し2時間反応させた。マイクロタイタープレートリーダ
ー(ダイナテック・ラボラトリー)を用いて405nm
でのウェルの吸光度を測定することによってp−ニトロ
フェノール反応生成物を定量した。 【0017】マウス免疫グロブリンのサブタイプの同定
のための市販のキット(ベーリンガー−マンハイム社)
を用いた非競合的ELISAにより、モノクローナル抗
体のイソタイプを決定した(すなわち、異なる抗体H鎖
群を同定した)。 【0018】III.ハイブリドーマの製造及びモノクロー
ナル抗体産生細胞の単離 予めフロインドの完全アジュバント中にAFB1 −BG
Gで免疫化したメスのBALB/By CJマウスが有
意の抗AFB1 血清タイターを有しているかどうかを上
述の非競合的ELISAを用いて調べた。抗タイターを
示すマウスを殺し、マーシャク−ロスシュタインら、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー、122、pp.2491-24
97(1979)に記載された方法に従ってハイブリドーマをつ
くった。20%(v/v)のウシ胎児血清、580μg
/mlのグルタミン、10ユニット/mlのペニシリ
ン、100μg/mlのストレプトマイシン、及び非必
須アミノ酸(ギブコ社)を加えたダルベッコの修飾イー
グル培地(以下、DME培地という)中に維持したSP
2/0ミエローマ株細胞を融合細胞のために用いた。マ
スを殺し、0.01Mのリン酸で緩衝された、pH7.
2のハンクの平衡塩溶液(以下、HPBSという)を用
いて脾細胞の懸濁液をつくった。 【0019】これらのマウスからの脾細胞を、ゲフター
ら、Somatic Cell Genet. 3: pp.321(1977) に記載され
た方法を修飾した方法を用いてSP2/0ミエローマ細
胞と融合した。他に断りがない限り、全ての遠心は室温
で700gで5分間行った。好ましくは、5x106 個
のSP2/0ミエローマ細胞と5x107 個の免疫脾細
胞とを丸底プラスチック管中で1つにし、遠心し、血清
を含まない10mlのDME培地で再懸濁し、再び遠心
した。上清を慎重に捨て、遠心管中に残った細胞ペレッ
トを分散させるように、蛇口の水をペレット中に鋭くか
けた。次に細胞を無血清DME中に溶けた30%(v/
v)のポリエチレングリコール1000(ベーカー・ケ
ミカル社)の溶液0.5mlに6分間さらした。この6
分の間に細胞をゆっくりと遠心した(150gで3分
間)。次に細胞ペレットに4.0mlの無血清DMEを
加え、細胞を蛇口の水で再び懸濁した。管の内容物を1
00.17mmのペトリ皿に移し、20%のウシ胎児血
清を含むDME培地中で1日培養した。次に細胞を再び
懸濁し、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む生育培地(以下、HAT培地という)中で再懸濁
した。平底マイクロタイタープレートのそれぞれのウェ
ルに、細胞を0.1ml(約105 個のSP2/0細胞
を含む)ずつ入れた。1週間インキュベートした後、ヒ
ポキサンチン及びチミジンのみを含む生育培地(以下、
HAT培地という)を0.05mlずつそれぞれのウェ
ルに加えた。融合2週間後、それぞれの培養物につい
て、上述したELISA免疫定量法を用いて特異的抗A
FB1 抗体の有無を調べた。 【0020】AFB1 に対し高い親和性を有するIgM
抗体を分泌しているハイブリドーマを、予め0.5ml
のプリステン(アドリッチ社)を注射したBALB/c
マウス中に腹水腫瘍細胞として生育した。マウス中で生
育したハイブリドーマは特異的IgM抗体を多量に生産
し、これはマウスが死ぬ前に腹水として回収された。こ
れらの動物からの腹水を貯蔵し、そのまま又は飽和硫酸
アンモニウム沈殿及びPBSに対する透析によりさらに
精製して免疫定量法に用いた。肉眼で病理調査を行った
ところ、全てのマウスは、広範囲に広がる腫瘍の侵入、
すなわち、注射されたハイブリドーマ細胞の増殖の結果
死んだことがわかった。 【0021】この方法により得られたモノクローナル抗
体はAFB1 分子に対して特異性を有する抗親和性Ig
M抗体であることが示された。この抗体の親和定数をス
カッチャード(Scatchard)プロット分析及びミュラーの
方法(J. Immunol. Meth: 34, pp.345-352 (1980))によ
り決定したところ、8x108 及び1x109 リットル
/モルであった。これらの値は、下記の競合的RIA法
により得られたデータから導かれたものである。 【0022】この分析は300μlの試料を用いて行
い、その100μlはモラベク・バイオケミカルズ社か
ら購入した[3H]-AFB1、トレーサー(非活性3.4Ci
/mmol)から成る。トレーサー原液を、0.1%の
BSAを含む通常マウス血清の1%PBS溶液で希釈
し、約20200cpm/100μlの濃度にした。モ
ノクローナル抗体を、AFB1 トレーサーの30ないし
50%が沈殿する濃度にまで希釈した。10%ウシ胎児
血清PBS溶液を含む抗体を100μlずつ反応混合物
に加えた。非放射標識AFB1 又は、主なAFB1 −D
NA付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrを包含するそ
の代謝物から成る試料を100μlずつ管に加えた。反
応混合物を室温で2時間インキュベートし、次いで混合
物をPBSで1.0mlの体積になるように希釈した。
次に等量の氷冷飽和硫酸アンモニウムを加え、試料を混
合し、氷中に15分間立てた。試料を次に2000gで
15分間遠心し、ミュラー法を用いて反応の阻害率
(%)を求めた。 【0023】AFB1 及びその代謝物に対するIgM抗
体の特異性が図1及び図2に示されている。なお、これ
らの結果は、飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ、PBS
に対して透析することによって最初に分画された高親和
性の精製IgM抗体を用いて得られたものである。抗体
を次に高圧液体クロマトグラフィーで精製した。この
際、IgM抗体の分子量が大きなこと(900000ダ
ルトン)を利用して、立体的排他性により分離した。こ
こに記載する方法において用いたものは、その特性及び
高親和性を有するこの精製IgM抗体の特徴及び性質で
ある。競合的RIA法において、アフラトキシンB1 、
アフラトキシンB2 、及びアフラトキシンM1 について
阻害率が50%となるのは3.0ピコモルであったが、
アフラトキシンG1 、アフラトキシンG2 、及びアフラ
トキシンQ1 についてはそれぞれ60.0、84.0、
及び275.0ピコモルであった。図2に示されたデー
タは、AFB1 及び2つの主たるアフラトキシン−DN
A付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrに対するIgM
抗体の特異性及び阻害率が50%となる点を示してい
る。50%阻害値はそれぞれ3.0、24.0、及び8
9.0ピコモルであった。従って、データは、このIg
M抗体がAF-FAPyr付加物を検出する感度がAF-N7-Gua 付
加物を検出する感度よりも約4倍高いことを示してい
る。 【0024】IV. 固定化抗AFB1 IgMモノクローナ
ル抗体を含む親和性マトリックス この精製されたIgMモノクローナル抗体を用いて、フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の
方法によって親和性マトリックス材料をつくった。十分
量(2.0mg)のモノクローナル抗体を、0.1M
NaHCO3 と0.5M NaClとを含む結合緩衝液
(pH8.3)に溶解した。この抗体溶液を、予め8.
0mlの0.001M HCl中で一夜インキュベート
した、臭化シアノーゲンによって活性化されたセファロ
ース−4B(シグマ社)に加えた。セファロースと抗体
溶液とを1時間反応させた後、この固相吸着材料を、
1.0Mのエタノールアミン(pH8.5)で1時間イ
ンキュベートすることによって、抗体が結合されたゲル
の未結合部位をブロックした。固相吸着材料上に固定化
されたIgM抗体によって親和性マトリックスが形成さ
れ、これを次に1ないし2mlの体積ずつ用いた。 【0025】好ましい固相吸着材料は活性化されたセフ
ァロース4Bゲルであるけれども、他の多くの材料を固
相材料として用いることができることが認められてい
る。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、
ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げるこ
とができる。同様に、抗親和性IgM抗体をそれぞれの
化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知
であり、記載されている。 【0026】V.液体試料中のアフラトキシンを検出し単
離する方法 被検試料中のアフラトキシン及びアフラトキシン−DN
A付加物を検出する方法は、次の工程を含む親和性クロ
マトグラフィー法である。(1) アフラトキシン又は目的
のアフラトキシン−DNA付加物に対して特異的な抗親
和性IgM抗体が固相吸着材料上に固定化された、均一
な親和性マトリックスを製造する。(2)被検試料中のア
フラトキシンが、親和性マトリックスのIgM抗体によ
って結合され保持されるように、被検試料と親和性マト
リックスとを接触させる。(3) IgM抗体からアフラト
キシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックス
に加える。この溶離剤は、ジメチルスルフォキシド、ジ
メチルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドから成
る群より選ばれる非プロトン性溶媒の、50%(v/
v)以上の濃度の水溶液である。(4) 親和性マトリック
スからの回収された流出物中にアフラトキシンが存在す
るかどうかを同定する。 【0027】抗アフラトキシンIgMモノクローナル抗
体の重要な特徴は、AFB1 抗原に対する特異性だけで
はなく、その高い親和定数(少なくとも約1x108 リ
ットル/モル、好ましくは1x109 リットル/モル)
も重要な特徴である。従って、親和性カラム中に共有結
合されている抗体に目的のアフラトキシンが結合した
後、これを溶離するための溶離剤には特殊なものを使わ
なければならない。このことは次の参考例に示されてい
る。すなわち、次の参考例では、吸着剤に結合した抗体
が、目的のアフラトキシンに結合する能力を示すのみな
らず、アフラトキシンが親和性カラムに吸着した後、こ
れを選択的に解離させるのに、従来の溶離剤を用いたの
ではこれを行い得ないことを示している。 【0028】参考例1 最初の実験は、セファロース4B上に固定化された抗A
FB1 IgM抗体がAFB1 を結合する能力を測定する
ために行った。これらの実験では、放射標識した3H-AFB
1 を10mlのPBS中に1ngの濃度で用いた。この
濃度は、汚染された食品にさらされたヒトの体液中に検
出されるであろうと予想されるアフラトキシンの濃度で
ある。先ず、100μlの3H-AFB1 トレーサーと、0.
1%のBSAと、10mMのNaN3 と、0.1mlの
通常マウス血清と、3μlの3H-AFB1 とを含むPBS1
0.0mlを約1.0mlのゲル床に加えた。流出カラ
ム流速は0.25ml/分よりも少し大きかった。約2
00μlのPBSをトレーサーに加え、親和性マトリッ
クスの頂部が空気にさらされるまで(カラムが乾燥する
ことなしに)カラムを加工させることによってカラムに
移した。さらに2.0mlのPBSを加えてトレーサー
をカラムから洗い出し、流出液をガラスビンに単一の分
画として集めた(No.1)。このようにして約244
86cpmのトレーサーをカラムに加え、それぞれの分
画が回収されるごとにシンチレーションによって放射標
識物質の含量を測定した。次に異なる溶離剤を親和性マ
トリックスに加え、AFB1 トレーサーを放出する能力
を測定した。これらの結果は以下の表1に示されてい
る。 【0029】 【表1】 【0030】明らかなように、元のトレーサーの約10
%は親和性マトリックスに吸着されず、溶離剤を加える
前に流出分画No.1として回収された。これはトレー
サー中の非特異的トリチウム交換に起因する。引き続き
行った、列挙した個々の溶離剤との反応により、流出分
画2〜7においては、マトリックスのIgM抗体によっ
てトレーサーAFB1 の放出は実質的に起こらないこと
がわかった。50%ジメチルスルフォキシド(以下、D
MSOという)を用いて初めて多量(90%)のAFB
1 トレーサーが親和性マトリックスから放出された。ま
た、DMSOを親和性カラムに加えると、マトリックス
中の明確な色の変化が見えるようになり、カラム床自体
がより半透明になった。DMSO流出分画を回収した後
にPBSを親和性マトリックスるに加えると、ゲル床は
元の不透明な通常の状態に戻った。 【0031】親和性マトリックスは、セファロースゲル
に結合されたIgM抗体を損傷し又は修飾(変性、沈殿
等)することなくもとの状態に復帰した。このことは、
DMSO遊離剤を加えその後PBSで洗う実験を継続す
ることによって示された。 【0032】200μlのPBSに溶けた第2の100
μlのトレーサー3H-AFB1 を、前に第1の3H-AFB1 トレ
ーサー試料を単離するのに用いた同じカラムに加えた。
第2のトレーサーを加えた後、2.0mlのPBSでカ
ラムをすすぎ、流出物を分画No.8として回収した。
次に2.0mlのDMSOのPBS溶液を加え、流出物
を分画No.9として回収した。カラムを次に2回2.
0mlPBSでそれぞれ洗い、流出液を分画10及び1
1として回収した。結果を下記表2に示す。 【0033】 【表2】 【0034】第2のトレーサーは約24486cpmの
総放射能を有していたが、また、その約10%が親和性
マトリックスに保持されなかった。分画9はまた、多量
のAFB1 トレーサー(約60%)がDMSOによって
溶離され、残りは、いくらかの残留DMSOを含む第1
回目のPBS洗浄によって分画10中に回収されること
を示している。 【0035】さらに、溶離効果をもたらすためには少な
くとも50%の濃度のDMSOを用いることが必要であ
ることを示すために、この実験の変形を行った。この実
験に用いた100μlの3H-AFB1 は合計で約27000
なし28000cpmの3H-AFB1 を含んでいた。100
μlのトレーサーを親和性カラムに載せ、200μlの
PBSで洗浄して保持されていないトレーサーをカラム
から除去した。次にマトリックスを1.0mlずつの、
濃度が増加するDMSOで洗った。結果を次の表3に示
す。 【0036】 【表3】【0037】表3より、DMSOの50%溶液を使用す
る前は、親和性マトリックスから3H-AFB1 が実質的に溶
離されないことがわかる。また、DMSOの濃度を50
%より大きくしても、親和性マトリックスからのAFB
1 の放出は検出可能な程度には増加しないことがわか
る。このため、DMSOはその濃度が少なくとも50%
あれば、この方法において溶離剤として用いるのに十分
である。この方法に用いるのに適した他の溶離剤はジメ
チルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドである。
有効な溶離剤とするためには、これらの溶離剤も少なく
とも50%の濃度で用いなければならない。これらの溶
離剤、すなわち、さらに一般的に非プロトン性溶媒を用
いた場合、親和性マトリックスは繰り返し再使用するこ
とができる。このような非プロトン性溶媒で溶離しても
マトリックス材料は損傷されない。このことはマイコト
キシンの検出及び測定を産業的に行う場合に重要であ
る。産業的にこの方法を行う場合には、その経済的理由
により親和性マトリックスを再使用する必要があるが、
DMSOのような非プロトン溶媒で溶出することはこの
要求に合致している。 【0038】一方、溶離はメタノールやエタノールのよ
うな新油性溶媒を用いて行うこともできるが、親和性マ
トリックスあるいはカラムは実質的に再使用できなくな
る。本発明のこの局面では、好ましくは50ないし10
0%、特に好ましくは100%のメタノール又はエタノ
ールを、DMSOの代わりにこれらを用いることを除い
て上記した方法と同様にして用いることができる。 【0039】VI. ヒトの尿、血清、及び母乳からのアフ
ラトキシンの生体外における単離 上で示されたように、放射滴定又は吸光度測定により示
されたIgM抗体親和性マトリックスのAFB1 を結合
する能力は、1mlのカラム床当たり、10mlのPB
SからのAFB1 1.0ないし1.3μgである。これ
らのパラメーターは、ヒトの尿、血清、母乳試料から、
生体外でアフラトキシンを下記のようにして単離し検出
するのに用いることができる。 【0040】ヒト血清(10mlずつ)又はヒト母乳
(10mlずつ)を、前処理することなしに直接抗体マ
トリックスに施すことができる。どちらの場合にも、液
体試料中のアフラトキシンが抗体マトリックスに定量的
に結合し、これらは、溶離剤として50%濃度のDMS
Oを用いることによって定量的に回収される。このこと
は、上述したようにして、3H-AFB1 を1ngずつ血清又
は母乳試料に直接加えることによって経験的に見出され
た。従って、血清又は母乳を試験する場合には、アフラ
トキシンを定量的に回収するためには、何らの準備工程
もいらない。 【0041】しかしながら、尿は、試料中の妨害物質、
例えば塩を除くために、アフラトキシンの単離及び回収
を行う前に、クロマトグラフィーを包含する前処理を行
わなければならない。これは図3に模式的に示されてお
り、ここではセプパック(Sep-Pak)C18 カートリッジ
(ウォーターズ・アソシエイツ社)を用いて妨害物質を
除去した。尿試料を先ず、準備的な低圧液体クロマトグ
ラフィーカートリッジに通してタンパク質や他の妨害物
質を除去すれば、ヒトの尿試料中に存在するアフラトキ
シンの90ないし95%は本発明の方法により一貫して
定量的に回収できる。 【0042】また、AFB1 に対して特異的である抗親
和性IgM抗体を用いることは、AFB1 −DNA付加
物、AF-N7-Gua を定量的に検出し回収するのに有用であ
る。これらのアフラトキシンDNA付加物は、血清や他
の体液から、何らの前処理を行うことなく検出され、定
量的に回収される。ヒト又は動物からの尿を被検試料と
する場合には、試料を親和性マトリックスに加える前
に、先ずカーボンクロマトグラフィーカートリッジを通
す高圧液体クロマトグラフィーにより試料を前処理する
ことが好ましい。このようにして、環境的に汚染された
人々からの複雑な生物学的試料からのAFB1 及びその
代謝物を定量的及び定性的に単離し精製することができ
る。さらに、この方法は、アフラトキシン自体を検出す
る分析法としても働く。 【0043】上述したことより、本発明は、試料中の種
々の濃度の毒物を簡単に正確に検出することができるこ
とがわかる。本発明の重要な局面は特異的モノクローナ
ル抗体が結合された親和性マトリックスすなわちカラム
である。固相吸着剤上に固定化された抗体を含むこのよ
うな親和性マトリックスを用いることは、迅速で効率の
高い、被検試料の精製手段を提供する。モノクローナル
抗体の高親和性及び選択性の故に、試料の粗抽出物を抗
体マトリックスカラムに通し、それによって目的の毒物
が抗体に結合され、該試料抽出物の他の全ての成分は通
過する。DMSO又はメタノールのような適当な溶離剤
で溶離することによって、元の粗試料から、定量的な収
量で高度に精製された毒物が溶離され、回収される。こ
のような効率的な1工程精製方法は、特に毒物の分析の
分野において遊離である。 【0044】本発明のこの重要な局面は、目的の毒物に
対して特異的なモノクローナル抗体が結合されたマトリ
ックス又はカラムを用いることによって、他の毒物、特
にマイコトキシンを検出し、測定するのに広範囲に適用
することができる。抗体マトリックス材料によって毒物
が一旦精製されたならば、所望により、蛍光法、免疫分
析、放射免疫分析、ELISA法、薄層クロマトグラフ
ィー、高圧液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、比色定量等の種々の方法により毒物を検出する
ことができる。どの検出方法を用いるかは、毒物の性
質、毒物の予想濃度、検出データの用途を包含する種々
の因子に依存する。いずれにせよ、この発明は、モノク
ローナル抗体が結合された親和性的を用い、分析し検出
するための試料を親和性マトリックスに1回通すことに
よる簡単で迅速な精製方法を提供する。なお、親和性マ
トリックスを通した後は、さらに精製することを要しな
い。 【0045】アフラトキシンについては、1つの好まし
い検出方法は蛍光分析である。すなわち、精製した試料
を紫外線(365nm)に当てるとアフラトキシンは4
25nmの蛍光を発する。この型の分析方法は、その分
析性能及び、ある程度の定量分析も可能であるというこ
とにより、特に好ましい。このような蛍光分析操作は、
AOAC法(AOAC Method,第26章、pp.414-429(1
980)) の方法に従うことによって行うことができる。 【0046】抗体結合マトリックスにより毒物を含む試
料の1工程精製が可能になるので、本発明は、産業廃棄
物やトウモロコシ、ピーナッツのような食品、及び体液
中に含まれる種々の毒物を検査するのに適用することが
できる。トウモロコシ試料を例として、全体的な操作方
法を図4に示す。 【0047】上記からわかるように、共通の重要な工程
は、特異的モノクローナル抗体が結合した親和性カラム
を用いることによる試料の精製にあることが明らかであ
る。試料が一旦精製されると、毒物の濃度又は存在は種
々の方法により定性的に又は定量的に測定することがで
きる。 【0048】定性分析 この発明によると毒物は先ず定性的に検出することがで
きる。例えば、トウモロコシ試料中のアフラトキシン
は、次の工程により検出することができる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの50gを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) 1分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラム(好ましくはシリンジに含まれたも
の)にメタノールを通し、蛍光照明手段を有する反応容
器にこれを回収する。 (10)蛍光照明手段を有する容器を取り、蛍光量を可視的
に測定(定量的ではない)するための装置に入れる。 (11)容器を取り、捨てる。 【0049】定量分析 一方、毒物の濃度は次の操作により定量的に測定するこ
とができる。再び、トウモロコシ中のアフラトキシンの
測定を例として挙げる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの50gを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) 1分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラムにメタノールを通し、測定装置に含ま
れた試験キュベットに回収する。 (10)測定値を読む。 (11)試料を取り出し捨てる。
【図面の簡単な説明】
【図1】3H-AFB1 と種々のアフラトキシンを用いてIg
M抗体の特異性を測定するための競合的放射免疫分析の
結果を示すグラフである。 【図2】3H-AFB1 トレーサーとアフラトキシンB1 及び
主たる代謝的アフラトキシン−DNA付加物を用い、I
gM抗体を用いた競合的放射免疫分析の結果を示すグラ
フである。 【図3】毒物を検出し単離するための一般的な方法の概
略を示す模式フローチャートである。 【図4】トウモロコシ中の毒物を定性分析及び定量分析
する方法の概略を示す模式フローチャートである。
M抗体の特異性を測定するための競合的放射免疫分析の
結果を示すグラフである。 【図2】3H-AFB1 トレーサーとアフラトキシンB1 及び
主たる代謝的アフラトキシン−DNA付加物を用い、I
gM抗体を用いた競合的放射免疫分析の結果を示すグラ
フである。 【図3】毒物を検出し単離するための一般的な方法の概
略を示す模式フローチャートである。 【図4】トウモロコシ中の毒物を定性分析及び定量分析
する方法の概略を示す模式フローチャートである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
G01N 33/543 521 G01N 33/543 521
// C12N 5/10 C12P 21/08
15/02 C12N 5/00 B
C12P 21/08 15/00 C
(72)発明者 ジョン ディー グロープマン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
リンフィールド メロウ ロード 25
(72)発明者 ジェラルド エヌ ウォーガン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
ベルモントクラフリン ストリート
125
(72)発明者 アン マーシヤク−ロスステイン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
ニュートンロイス ロード 40
(56)参考文献 PROC.NATL.ACAD.SC
I.USA,81 (1984) P.7728−
7731
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
G01N 30/88
G01N 33/53
G01N 33/543
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.アフラトキシン以外の毒性物質を含んでいるかもし
れない試料を準備する工程と、固相吸着剤とこの上に固
定化され、前記毒性物質に対して特異的なモノクローナ
ル抗体とを含む親和性カラム上に該試料を載せる工程
と、溶媒をカラムに通し、第1の流出物を回収し、それ
によって前記毒性物質を前記モノクローナル抗体によっ
て前記カラム上に保持する工程と、溶離剤をカラムに通
して第2の流出物を回収し、それによって前記毒性物質
を前記モノクローナル抗体から溶離させて前記第2の流
出物中に回収する工程と、前記毒性物質の存在を検出す
るために前記第2の流出物をさらに精製することなく紫
外線にさらすことによって蛍光分析を行なう工程とを含
む、被検試料中の毒性物質を検出する方法。 2.前記溶離剤は濃度50%以上の非プロトン性溶媒の
溶液である特許請求の範囲第1項記載の方法。 3.前記非プロトン性溶媒はジメチルスルフォキシド、
ジメチルホルムアミド又はジメチルアセトアミドである
特許請求の範囲第2項記載の方法。 4.前記溶離剤は親油性溶媒の50ないし100%溶液
である特許請求の範囲第1項記載の方法。 5.前記親油性溶媒は100%メタノール又は100%
エタノールである特許請求の範囲第4項記載の方法。 6.前記毒性物質は分子量約1,000 ダルトン以下のマイ
コトキシンである特許請求の範囲第1項ないし5項のい
ずれか1項に記載の方法。 7.前記毒性物質はフルオランタン、ニトロソピレン、
ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニトロクリセ
ン、アミノビフェニル並びにこれらの結合体及び誘導体
から成る群より選ばれる特許請求の範囲第6項記載の方
法。
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US70698485A | 1985-02-28 | 1985-02-28 | |
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1986
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-
1995
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