CN105866295A - 一种快速检测中药材中黄曲霉素b1含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析测试技术领域，涉及黄曲霉素B1的检测方法，尤其是涉及一种快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法。本发明所述方法包括以下步骤：改进的QuEChERS法萃取；采用超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用仪对待测液进行检测；黄曲霉素B1标准溶液的配制；黄曲霉素B1定性定量方法的建立。待测样品经QuEChERS萃取、超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用(UPLC‑MS/MS)分析，采用外标法，在电喷雾离子源电离和多反应监测模式条件下进行定量测定。实验结果表明，本方法灵敏度高、稳定性好，适用于大量样品中黄曲霉素B1残留的准确快速检测，适用于中药材中黄曲霉素B1残留的监测。

Description

一种快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法

技术领域

本发明属于分析测试技术领域，涉及黄曲霉素B1的检测方法，尤其是涉及一种快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法。

背景技术

黄曲霉毒素(AF)是由真菌属的黄曲霉和寄生曲霉等在高温潮湿环境下产生的一类结构相似的有毒次生代谢物，具有极强的致癌性、致畸性和致突变性，其主要作用于人类和动物的肝脏。已经鉴定的黄曲霉毒素有多种，比较常见的有AFB1和AFB2，其中AFB1毒性最强，在1977年就被国际癌症研究机构列为一类致癌物，具有较大危害。《中华人民共和国药典》(2015版)要求对部分中药材如远志、大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海。莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁等必需开展AFB1检测，并规定AFB1不得过5μg/kg。

目前，黄曲霉毒素AFB1主要的检测手段有酶标仪法、液相色谱法气质联用法和液质联用法。其中，液相色谱法灵敏度达不到要求范围内，检出限较高，荧光检测，检测过程复杂。酶联免疫法检测快速，但由于其使用的酶极不稳定，导致假阳性率比较高，对定性和定量都有显著地影响。液相色谱与质谱联用法可同时提供目标化合物的保留时间和分子结构信息，具有杂质影响小，不需要衍生就能够准确对目标物进行定性和定量。

QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)，是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，由美国农业部Anastassiades教授等于2003年开发的。QuEChERS步骤可归纳为：(1)样品粉碎；(2)单一溶剂乙腈提取分离；(3)加入MgSO₄等盐类除水；(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附剂除杂；(5)上清液进行LC-MS检测。

本发明采用优化QuEChERS方法，主要包括：(1)样品粉碎；(2)单一溶剂乙腈提取分离；(3)加入MgSO₄等盐类除水；(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附剂除杂；(5)上清液进行LC-MS检测。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法。

本发明所述的快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法，包括以下步骤：

(1)QuEChERS萃取：取5.00g中药材样品，粉碎研磨，得粒径为0.02mm的样品粉末，加入100mL锥形瓶中；容量瓶中配制50mL乙腈-水(体积比为90:10)溶液，加入到所述锥形瓶中，350r/min震荡25min，静置沉淀，过滤，取上清液过净化柱，浓缩过0.22μm滤膜后待测；

(2)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对待测液进行检测；

色谱条件为：采用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm×1.7μm)色谱柱；流动相为1％甲酸水-乙腈(10:90，V/V)；进样体积：10.0μL；流速：0.3mL/min；柱温45.0℃；样品室温度：25.9℃；

质谱条件为：采用Waters XEVO TQD三重四级杆质谱联用仪；电喷雾离子源为正离子模式(ESI+)，扫描方式选用多反应监测(MRM)，毛细管电压为3.5kV，离子源温度设为152℃，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流量1000L/h，锥孔气流速1L/h，雾化压力0.6MPa，碰撞气流速为0.2mL/min；

黄曲霉素AFB1的质谱(MS/MS)参数设置：母离子：m/z 313.2；锥孔电压50V；碎片离子1：m/z 213.1，碰撞电压45V；碎片离子2：m/z 269.2，碰撞电压33V；碎片离子3：m/z 285.2，碰撞电压22V；

(3)黄曲霉素B1标准溶液的配制：准确称取500ng黄曲霉素B1标准品于25.00mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成20ng/mL的储备液，密封储存于-4℃冰箱中备用；

(4)黄曲霉素B1定性定量方法的建立：取出黄曲霉素B1标准溶液的储备液，逐级稀释成质量浓度梯度为0.2、1.0、3.0、5.0、10.0ng/mL的标准溶液，采用步骤(2)所述方法进行测定，以质量浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标Y，绘制出黄曲霉素B1标准工作曲线；从所述标准工作曲线中求出待测样品中黄曲霉素B1的含量。

本发明所述的快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法的原理是：待测样品经QuEChERS萃取、超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用(UPLC-MS/MS)分析，采用外标法，在电喷雾离子源电离和多反应监测模式条件下进行定量测定。

本发明对现有的QuEChERS方法进行了优化，将原来的五步骤优化为四个步骤，包括：(1)样品粉碎；(2)混合溶剂乙腈-水提取分离；(3)净化柱除杂；(4)上清液进行LC-MS检测。与传统QuEChERS法相比，本发明采用乙腈-水混合溶剂提取，省略了MgSO₄除水的步骤，节省了药品、简化实验过程和节约了时间。

实验结果表明，本方法灵敏度高、稳定性好，适用于大量样品中黄曲霉素B1残留的准确快速检测，适用于中药材中黄曲霉素B1残留的监测。

附图说明

图1是不同提取溶液对提取效果的影响。图中，A为乙腈-水(体积比75:25)；B为(90:10)乙腈-水(体积比90:10)；C为纯乙腈；D为纯甲醇。

图2是不同提取时间对提取效果的影响。

图3是不同提取方法对提取效果的影响。图中，A：250r/min摇床震荡30min；B：350r/min摇床震荡30min；C：450r/min摇床震荡30min；D：超声提取30min；E：涡旋5min后350r/min摇床震荡30min。

图4是不同流动相下AFB1标准溶液色谱图。

图5是黄曲霉素B1标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：本发明所述的快速测定中药材中黄曲霉素B1含量的方法

本发明所述的快速测定方法适用于中药材样品中黄曲霉素B1含量的快速检测，该方法包括以下步骤：

(1)QuEChERS萃取：取5.00g中药材样品，粉碎研磨，得粒径为0.02mm的样品粉末，加入100mL锥形瓶中；容量瓶中配制50mL乙腈-水(体积比为90:10)溶液，加入到所述锥形瓶中，350r/min震荡25min，静置沉淀，过滤，取上清液过净化柱，浓缩过0.22μm滤膜后待测；

(2)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对待测液进行检测；

色谱条件为：采用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm×1.7μm)色谱柱；流动相为1％甲酸水-乙腈(10:90，V/V)；进样体积：10.0μL；流速：0.3mL/min；柱温45.0℃；样品室温度：25.9℃；

质谱条件为：采用Waters XEVO TQD三重四级杆质谱联用仪；电喷雾离子源为正离子模式(ESI+)，扫描方式选用多反应监测(MRM)，毛细管电压为3.5kV，离子源温度设为152℃，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流量1000L/h，锥孔气流速1L/h，雾化压力0.6MPa，碰撞气流速为0.2mL/min；

黄曲霉素AFB1的质谱(MS/MS)参数设置：母离子：m/z 313.2；锥孔电压50V；碎片离子1：m/z 213.1，碰撞电压45V；碎片离子2：m/z 269.2，碰撞电压33V；碎片离子3：m/z 285.2，碰撞电压22V；

(3)黄曲霉素B1标准溶液的配制：准确称取500ng黄曲霉素B1标准品于25.00mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成20ng/mL的储备液，密封储存于-4℃冰箱中备用；

(4)黄曲霉素B1定性定量方法的建立：取出黄曲霉素B1标准溶液的储备液，逐级稀释成质量浓度梯度为0.2、1.0、3.0、5.0、10.0ng/mL的标准溶液，采用步骤(2)所述方法进行测定，以质量浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标Y，绘制出黄曲霉素B1标准工作曲线；从所述标准工作曲线中求出待测样品中黄曲霉素B1的含量。

实施例2：QuEChERS萃取方法的改进

取样品经粉碎研磨后得粒径为0.02mm粉末5.00g，加入100mL锥形瓶中，容量瓶中配制50mL溶剂加入到锥形瓶中，提取，静置沉淀，过滤之后取上清液过多功能净化柱，去掉样品中脂肪、色素和基质等其他检测项目外的杂质。

(1)提取溶剂选择的优化

分别选择甲醇、乙腈、乙腈-水(75:25，V/V)以及乙腈-水(90:10，V/V)作为提取剂考察对AFB1提取效果的影响，结果见图1。由图1可知，乙腈-水(90:10，V/V)的提取效果最好，故本提取溶剂选择。

(2)提取时间的优化

以乙腈-水(90:10，V/V)作为提取剂，以摇床震荡提取作为提取方式，分别进行10min、20min、30min、40min4个不同时间的震荡提取，考察对AFB1提取效果的影响，结果见图2。由图2可知，随着提取时间延长，提取率明显增大，但当超过30min时，提取效率反而下降，为节约时间并达到最佳提取效果，选择提取时间为30min。

(3)提取方式的优化

以乙腈-水(90:10，V/V)作为提取剂，分别以250r/min摇床震荡30min、350r/min摇床震荡30min、450r/min摇床震荡30min、超声波提取30min以及涡旋5min后350r/min摇床震荡30min五种不同提取方式考察对AFB1提取效果的影响，结果见图3。由图3可知，当提取方式为350r/m摇床震荡30min时，黄曲霉素AFB1提取效果最好，故提取方式选用350r/m摇床震荡30min。

实施例3：色谱流动相配比优化

使用体积为9:1的乙腈-水溶液作为溶剂对AFB1标准品配制浓度为5.0ng/mL的标准溶液，UPLC-MS/MS检测，分别考察使用流动相为70：30、80：20、90：10和100:0％的乙腈-0.1％甲酸水(V/V)，观察黄曲霉素的总离子流色谱图，结果见图4。由图4可知，使用90：10的乙腈-0.1％甲酸水(V/V)作为色谱流动相时，所得超高效液相色谱图响应值最高，峰型最明显，无出现的拖尾分叉等，故选用90:10的乙腈-0.1％甲酸水(V/V)作为色谱流动相。

实施例4：线性范围与检出限实验

在优化条件下，采用UPLC-MS/MS进行测定，以质量浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标Y，绘制出黄曲霉素AFB1标准工作曲线，结果见图5。如图5所示，AFB1在0.2-10.0.ng/mL浓度范围内，色谱峰面积与AFB1质量浓度呈现良好的线性关系，其线性回归方程为y＝2835.5x-1513.7，相关系数为0.9991，检出限达到0.06ng/mL，

实施例5：精密度实验

取质量浓度为5ng/mL AFB1溶液在优化条件下连续进样5次，结果如表1所示，平均回收率在97.5％～99.0％之间，说明该方法测得数据准确性高。而RSD为0.57％，表明该方法重现性好，精密度高。

表1：精密度测定结果(n＝5)

实施例6：实际样品测定

取中药材样品经粉碎研磨后得粒径为0.02mm粉末5.00g，采用QuEChERS优化条件萃取，制备待测溶液，然后进行UPLC-MS/MS测定。采用标准加入法向其中加入一定量的AFB1后检测。具体方法参见实施例1。测定结果见表2。

表2：实际样品的测量结果以及加标回收率(单位：％)

由表2可知方法的回收率为88.7％～98.9％，相对标准偏差为2.1％～0.6％。因此，本发明所述的快速测定方法适用于大量样品中黄曲霉素B1残留的准确快速检测。

Claims (1)

1.一种快速检测中药材中黄曲霉素B1含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)QuEChERS萃取：取5.00g中药材样品，粉碎研磨，得粒径为0.02mm的样品粉末，加入100mL锥形瓶中；容量瓶中配制50mL乙腈-水(体积比为90:10)溶液，加入到所述锥形瓶中，350r/min震荡25min，静置沉淀，过滤，取上清液过净化柱，浓缩过0.22μm滤膜后待测；

(2)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对待测液进行检测；

色谱条件为：采用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm×1.7μm)色谱柱；流动相为1％甲酸水-乙腈(10:90，V/V)；进样体积：10.0μL；流速：0.3mL/min；柱温45.0℃；样品室温度：25.9℃；

质谱条件为：采用Waters XEVO TQD三重四级杆质谱联用仪；电喷雾离子源为正离子模式(ESI+)，扫描方式选用多反应监测(MRM)，毛细管电压为3.5kV，离子源温度设为152℃，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流量1000L/h，锥孔气流速1L/h，雾化压力0.6MPa，碰撞气流速为0.2mL/min；

黄曲霉素AFB1的质谱(MS/MS)参数设置：母离子：m/z 313.2；锥孔电压50V；碎片离子1：m/z 213.1，碰撞电压45V；碎片离子2：m/z 269.2，碰撞电压33V；碎片离子3：m/z 285.2，碰撞电压22V；

(3)黄曲霉素B1标准溶液的配制：准确称取500ng黄曲霉素B1标准品于25.00mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成20ng/mL的储备液，密封储存于-4℃冰箱中备用；

(4)黄曲霉素B1定性定量方法的建立：取出黄曲霉素B1标准溶液的储备液，逐级稀释成质量浓度梯度为0.2、1.0、3.0、5.0、10.0ng/mL的标准溶液，采用步骤(2)所述方法进行测定，以质量浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标Y，绘制出黄曲霉素B1标准工作曲线；从所述标准工作曲线中求出待测样品中黄曲霉素B1的含量。