CN102590519B

CN102590519B - 检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条

Info

Publication number: CN102590519B
Application number: CN201210045398.1A
Authority: CN
Inventors: 徐飞; 吴小平; 何丹婷; 王照鹏; 李娜; 赵宁; 李向梅; 杨铮
Original assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Ying Tai gray Testing Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: CN102590519A

Abstract

本发明公开了一种检测黄曲霉素试剂盒或试纸条。本发明提供的检测黄曲霉素的酶联免疫试剂盒，包括抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体；所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1的保藏编号为CGMCC No.5779。本发明的试剂盒和试纸条具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。本发明提供的试剂盒和试纸条，适用于测定奶制品中黄曲霉素的残留量。本发明的抗体、试剂盒、试纸条及检测方法在黄曲霉素的检测中将发挥重大作用。

Description

检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条

技术领域

本发明涉及检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条。

背景技术

随着人类生活水平的改善，食品安全日益成为餐桌上人们最为关注的问题之一吗，人们每天都会食用的牛奶可能会含有对人体健康有害的黄曲霉素M₁。哺乳动物摄入被黄曲霉素B₁污染的饲料或食品后，在体内可被羟化而生成黄曲霉素M₁。研究表明，黄曲霉素M₁为强致癌剂。世界卫生组织制定食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，美国联邦政府有关法律规定人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能300μg/kg。我国今年发布的《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》国家标准中规定食品中黄曲霉素M₁在乳及乳制品中的限量为0.5μg/kg。而欧盟国家规定更加严格，原奶、热处理奶及加工奶产品中M₁限量为0.05μg/kg，婴儿食品(包括婴幼儿奶)中M₁限量为0.025μg/kg。因此，建立特异、敏感的黄曲霉素M₁的检测方法是当务之急。

目前国内外研究主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫亲和柱法以及酶联免疫法等。TLC法的特异性较差，灵敏度也相对较差，所需标准品浓度较高，潜在的污染性较高。HPLC法所需仪器设备投资大，操作技术要求高，净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但需结合HPLC仪和荧光光度计才能定量检测，检测技术要求和成本较高。ELISA法相比而言，操作简便、快捷、污染较小、灵敏度也较高，适合批量样品的普检和筛选，特别是研制成功的试剂盒，给检测人员带来很大的方便，同时也节省了成本，符合目前国际上检测领域的发展方向。免疫胶体金层析技术不需任何仪器设备和试剂，特别适合于基层单位大批量时间紧的检测和大面积普查，因此酶免疫法在食品安全分析中应用广泛。

发明内容

本发明的目的是提供检测黄曲霉素试剂盒的或试纸条。

本发明提供的检测黄曲霉素的酶联免疫试剂盒，包括抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体。

抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1，简称杂交瘤细胞2A1，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5779。

所述试剂盒可为如下1)至4)中的任意一种：

1)包括式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物、所述单克隆抗体和酶标记抗抗体的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原；

2)包括式(I)所示化合物的酶标记物、所述单克隆抗体和抗抗体的试剂盒；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)包括式(I)所示化合物的酶标记物和所述单克隆抗体的试剂盒；其中，所述单克隆抗体作为包被原；

4)包括式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物和所述单克隆抗体的酶标记物的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原。

式(I)。

式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物具体如式(II)所示。

式(II)。

所述载体蛋白可为卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)。

所述偶联物中，式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为(8-10)∶1。所述偶联比指的是摩尔比。式(I)所示化合物与所述载体蛋白具体可通过活性酯法偶联。

所述试剂盒还包括洗涤液、样品浓缩液、底物显色液和终止液中的至少一种。

每1升洗涤液可按照如下方法配制得到：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到洗涤液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7.2-7.6、0.005M-0.015M的磷酸盐缓冲液，具体可为的浓度可为pH7.4、0.01M)的磷酸钠缓冲液。

所述样品浓缩液可为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，优选为pH7.4、0.04mol/L的PBS缓冲液。

所述底物显色液包括显色液A和显色液B，可为独立包装的显色液A和显色液B，也可直接将显色液A和显色液B等体积混合得到。所述显色液可为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液；所述显色液B可为邻苯二胺(0PD)溶液或四甲基联苯胺(TMB)溶液。所述显色液A具体可为2％(g/100ml)过氧化脲水溶液。所述显色液B具体可为1％(g/100ml)四甲基联苯胺水溶液。

所述终止液具体可为0.2M硫酸水溶液。

以上任一所述试剂盒均可用于检测黄曲霉素。

以上任一所述试剂盒均可用于检测待测样本中是否含有黄曲霉素。

本发明还保护一种检测黄曲霉素的胶体金试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；沿试纸条的轴向，所述样品吸收垫、所述胶体金垫、所述反应膜和所述吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体；所述单克隆抗体为抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T线)和质控区(C线)均为与所述试纸轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物(包被原)，质控区包被羊抗鼠二抗。

所述样品吸收垫为纤维素滤膜。所述胶体金垫为包被有胶体金标记的所述单克隆抗体的玻璃纤维膜。所述反应膜为硝酸纤维素膜(NC膜)。所述吸水垫为吸水纸。

所述样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

所述胶体金试纸条可用于检测黄曲霉素。

所述胶体金试纸条用于检测待测样本中是否含有黄曲霉素。

以上任一所述黄曲霉素可为黄曲霉素M₁或黄曲霉素M₂。

本发明采用高特异性的黄曲霉素单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的试剂盒、试纸条及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品。本发明的试剂盒和试纸条(胶体金试纸卡)具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。本发明提供的试剂盒和试纸条，适用于测定液态奶、奶粉及奶制品中黄曲霉素的残留量。本发明的抗体、试剂盒、试纸条及检测方法在黄曲霉素的检测中将发挥重大作用。

附图说明

图1为黄曲霉素M₁人工抗原的紫外光谱图。

图2为采用黄曲霉素M₁制作的标准曲线图。

图3为试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。卵清蛋白简称OVA。

黄曲霉素M₁如式(III)所示，分子量为328.27。

式(III)

对肼基苯甲酸如式(IV)所示，分子量为152.15。

式(IV)

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)如式(V)所示。

式(V)

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)如式(VI)所示。

式(VI)

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)如式(VII)所示。

式(VII)

实施例1、制备黄曲霉素M₁半抗原

一、黄曲霉素M₁半抗原的制备

将10mg黄曲霉素M₁溶于5ml无水吡啶，加入对肼基苯甲酸10mg，70℃加热回流搅拌反应5h，旋蒸除去吡啶，将残留物用1mL甲醇溶解，以二氯甲烷∶甲醇(体积比9∶1)为展开剂，通过薄层层析(TLC)分离纯化，收集比移值(R_f值)为0.35的样本，即为黄曲霉素M₁半抗原(得到8mg)。

二、黄曲霉素M₁半抗原的表征

对步骤一制备的产物进行元素分析，结果如下：

C：62.32；H：3.94；N：6.08；0：27.66。

结果表明，步骤一制备的产物为式(I)所示化合物，又称为M1-HBA。

式(I)。

实施例2、黄曲霉素M₁人工抗原的制备和表征

一、黄曲霉素M₁免疫原的合成和表征

1、黄曲霉素M₁免疫原的合成

(1)将5mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于1mL N，N’-二甲基酰胺中，加入4mg N-羟基琥珀酰亚胺和4mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液I。

(2)将30mg牛血清白蛋白加入3mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II。

(3)将溶液I加至溶液II中，缓慢搅拌24h后入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，然后于4℃条件下，8000rmp离心30min，取上清，即黄曲霉素M₁免疫原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存，黄曲霉素M₁免疫原简称M1-BSA，黄曲霉素M₁免疫原溶液简称M1-BSA溶液。

(4)将M1-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原M1-BSA溶液中的M1-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。M1-BSA溶液中的M1-BSA浓度为6.1mg/ml。

2、黄曲霉素M₁免疫原的表征

将M1-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使M1-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL M1-HBA的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。

溶液乙的最大吸收波长值为262nm，溶液丙的最大吸收波长值为280nm。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。

分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，式(I)所示化合物和BSA的偶联比为8∶1，即8个式(I)所示化合物结合1个BSA。

二、黄曲霉素M₁包被原的制备和表征

1、黄曲霉素M₁包被原的制备

用卵清蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤一的1。

黄曲霉素M₁包被原简称M1-OVA，黄曲霉素M₁包被原溶液简称M1-OVA溶液。

M1-OVA溶液中的M1-OVA浓度为3.8mg/ml。

2、黄曲霉素M₁包被原的表征

用M1-OVA代替M1-BSA，用OVA代替BSA，其它同步骤一的2。

式(I)所示化合物和OVA的偶联比为10∶1，即10个式(I)所示化合物结合1个OVA。

实施例3、黄曲霉素单克隆抗体的制备

Balb/c小鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司；

SP2/0骨髓瘤细胞：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为08060101。

一、动物免疫

将实施例2制备的M1-BSA溶液免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μgM1-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，后三次的免疫方式为腹膜内注射。

二、细胞融合与克隆化

1、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。

2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到一株可以分泌黄曲霉素M₁单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1(简称杂交瘤细胞2A1)。杂交瘤细胞2A1已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5779。

三、细胞冻存和复苏

用冻存液将杂交瘤细胞2A1制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

四、单克隆抗体的制备与纯化

1、增量培养法

细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。

将杂交瘤细胞2A1置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液(-20℃保存)。

单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为18.9mg/ml。

2、腹水制备

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞株(5×10⁵个/只)。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。

五、单克隆抗体的鉴定

将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：

1、抗体效价的测定

(1)采用实施例2制备的M1-OVA溶液(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔；M1-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。

(2)4℃孵育16小时。

(3)封闭并洗板。

(4)每孔加入100μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液或其稀释液(采用PBS缓冲液进行梯度稀释)。

(5)室温孵育2h，洗板。

(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

(7)洗板。

(8)加入TMB显色液，避光显色15min。

(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

以OD值达到1.0左右时判定为阳性。抗体效价为1∶320000。

2、单克隆抗体灵敏度的计算

(1)至(3)同步骤1的(1)至(3)。

(4)每孔加入50μL黄曲霉素M₁标准品溶液(由黄曲霉素M₁和PBS缓冲液组成；黄曲霉素M₁的浓度分别为0.03μg/L、0.09μg/L、0.18μg/L、0.36μg/L、0.72μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)；每个浓度设置3个复孔。

(5)每孔加入50μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液。

(6)室温孵育2h，洗板。

(7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

(8)洗板。

(9)加入TMB显色液，避光显色15min。

(10)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

将采用各个浓度的标准品溶液得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的黄曲霉素M1浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图2。

对照图2，得到纵坐标数值等于50％对应的黄曲霉素M1浓度(μg/L)，即为IC50值。单克隆抗体检测黄曲霉素M1的灵敏度(IC50值)为0.05μg/L。

3、亲和常数测定

(1)用M1-OVA作为包被原包被酶标板

采用实施例2制备的M1-OVA溶液(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔；分别设置以下OVA-SAL包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。

(2)4℃孵育16小时。

(3)封闭并洗板。

(4)每孔加入100μL单克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀释液中的蛋白质浓度分别为1.25、0.625、0.3125、1.5625×10^-1、7.8×10^-2、3.9×10^-2、1.95×10^-2、9.75×10^-3、4.88×10^-3、2.44×10^-3、1.22×10^-3、6.1×10^-4mg/L。

(5)室温孵育2h，洗板。

(7)洗板。

(8)加入.TMB显色液，避光显色15min。

(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

以单克隆抗体中的蛋白质浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标制作曲线。

每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S曲线的顶部，对应的OD₄₅₀值设定为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。采用1μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为2.8×10^-12mol/L。采用0.5μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为27.7×10^-12mol/L。采用0.25μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为190.4×10^-12mol/L。采用0.125μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为368.2×10^-12mol/L。

将4个浓度两两一组，根据公式计算单克隆抗体的亲和常数

Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t₁-[Ab]t₂)

公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t₁、[Ab]t₂分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。例如：1μg/mL包被浓度50％OD₄₅₀对应的抗体浓度为2.8×10^-12mol/L，包被0.5μg/mL包被浓度50％OD₄₅₀对应的抗体浓度为27.7×10^-12mol/L，Ka＝(2-1)/2(2×27.7×10^-12-2.8×10^-12)＝9.5×10⁹M^-1。依次类推，得到其余5个Ka值，分别为1.41×10⁹M^-1、0.91×10⁹M^-1、1.97×10⁹M^-1、1.03×10⁹M^-1、1.18×10⁹M^-1，取平均值计算得出单克隆抗体的亲和常数为2.67×10⁹M^-1。

六、杂交瘤细胞株的稳定性

将杂交瘤细胞2A1体外连续传30代，每隔5代取培养上清进行ELISA测定(方法同步骤五的1)。结果显示连续30代的效价无显著差异，杂交瘤细胞2A1能稳定传代。

实施例4、黄曲霉素多克隆抗体的制备

新西兰大白兔：购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

将新西兰大白兔以实施例2中制备的黄曲霉素M₁免疫原(M1-BSA)进行免疫(免疫方式为颈背部皮下多点注射)。每只兔子每次免疫1.5mg(以BSA量计)，每三周免疫一次，第一次免疫时将黄曲霉素M₁免疫原与弗氏完全佐剂混合制成乳化剂进行免疫，第二次至第六次免疫将黄曲霉素M₁免疫原与弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂进行免疫，第七次免疫只将黄曲霉素M₁免疫原进行免疫，第七次免疫10天后心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

实施例5、检测黄曲霉素的酶联免疫试剂盒的制备

一、酶联免疫试剂盒的组成

酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

1、洗涤液：每1升洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液(pH7.4、0.01M)混合，得到洗涤液。

2、包被M1-OVA的酶标板

用碳酸盐缓冲液将实施例2制备的M1-OVA溶液稀释(使M1-OVA的浓度为0.5μg/mL)，即为包被液；将包被液加入96孔聚苯乙烯酶标板(48孔也可)，每孔100μL，37℃温育2h；倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30s，拍干；然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

每1升所述封闭液按照如下方法配制：将5ml马血清、1g叠氮化钠和30g酪蛋白用磷酸盐缓冲液(pH7.2、0.02M)溶解并定容至1000ml，得到封闭液。

3、样品浓缩液：PBS缓冲液(pH7.4、0.04M)。

将样本浓缩液用水稀释至20倍体积，即为样品稀释液。

4、抗体工作液：将实施例3的步骤四的1得到的单克隆抗体溶液用样品稀释液稀释，使蛋白质浓度为5.5ng/mL。

5、酶标二抗工作液

辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A7058，按说明书配制酶标二抗工作液。

6、标准品溶液

标准品为黄曲霉素M₁(FERMENTEK产品；产品目录号为FER005)。

用样品稀释液稀释溶解黄曲霉素M₁，得到各个标准品溶液。各个标准品溶液中分别为0.03μg/L、0.09μg/L、0.18μg/L、0.36μg/L、0.72μg/L。

样品稀释液作为黄曲霉素M₁浓度为0μg/L的标准品溶液(0标准)。

7、底物显色液

由A液和B液等体积混合而成，A液为2％(g/100ml)过氧化脲水溶液，B液为1％(g/100ml)四甲基联苯胺水溶液。

8、终止液：0.2M硫酸水溶液。

二、试剂盒检测方法

采用步骤一制备的试剂盒进行如下检测：

(一)样品前处理

检测样本为液态奶或还原乳时：取待检样品于离心管中，充分平衡至室温，加入样品稀释液，充分涡动后，取70μL作为待测样本溶液。

检测样本为奶粉时：称取奶粉样品于离心管中，加入去离子水，剧烈涡动至奶粉完全溶解，加入样品稀释液，充分涡动后，取70μL作为待测样本溶液。

检测样本为酸奶：称取酸奶样品于离心管中，加入样品稀释液，充分涡动30s，取70μL作为待测样本溶液。

(二)试剂盒检测方法

1、标准曲线的制作

向包被M1-OVA的酶标板中加入标准品溶液(70μL/孔；每个标准品溶液设置三个复孔)，再加入抗体工作液(30μL/孔)，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min；倒出孔中液体，洗涤5次(每次洗涤的步骤均为：每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体)，用吸水纸拍干；加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，洗涤5次(步骤同上)；每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min；每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长)。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。运用Originpro 7.0软件对数据结果进行分析，以标准品浓度(μg/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴拟合出标准曲线。标准曲线见图3。

2、样品中黄曲霉素浓度的测定

向包被M1-OVA的酶标板中加入待测样本溶液或其稀释液(70μL/孔；设置三个复孔)，再加入抗体工作液(30μL/孔)，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min；倒出孔中液体，洗涤5次(步骤同上)，用吸水纸拍干；加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，37℃恒温箱中反应30min，洗涤5次(步骤同上)；每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min；每孔加入盐终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长)。

结果判断：用每个待测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。相对应每一个待测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出黄曲霉素M₁的浓度值，再乘以相应样品的稀释倍数，换算出待测样本溶液中黄曲霉素M₁的含量。

三、试剂盒检测效果评价

(一)准确度和精密度试验

向不含黄曲霉素的牛奶样品中添加黄曲霉素M₁(标准品)，使黄曲霉素M₁在样品中的终浓度分别为0.1μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg；将添加后的样品分别按照步骤二的

(一)中所述方法进行前处理，得到待测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如步骤二的(二)的2中所述，每个实验重复5次，根据待测样本溶液中黄曲霉素M₁的含量计算检测样本中黄曲霉素M₁的含量，结果见表1。

表1 应用各个试剂盒检测得出的牛奶样品中黄曲霉素M₁的含量(μg/kg)

	试剂盒1	试剂盒2	试剂盒3
				黄曲霉素M₁在样品中的终浓度为0.1μg/kg	0.084	0.087	0.091
黄曲霉素M₁在样品中的终浓度为0.3μg/kg	0.28	0.26	0.24
				黄曲霉素M₁在样品中的终浓度为0.5μg/kg	0.44	0.42	0.41

分别计算回收率和变异系数，结果见表2。

回收率＝应用试剂盒检测计算出的黄曲霉素M₁的含量÷牛奶中实际添加的黄曲霉素M₁的含量×100％。

变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

板内变异系数的计算方法：板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。

批内变异系数的计算方法：批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

表2 回收率和变异系数结果

结果表明：所有样品的回收率在79.3％～94.5％，批内变异系数在4.3％～8.6％，批间变异系数在12.8％～15.1％。

(二)试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、黄曲霉素M₁添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

(三)交叉反应率试验

向包被M1-OVA的酶标板中加入结构类似物标准品溶液(结构类似物标准品溶液由结构类似物和PBS缓冲液组成，结构类似物的浓度分别为0.03μg/L、0.09μg/L、0.18μg/L、0.36μg/L、0.72μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔；50μL/孔；每个浓度设置3个复孔)，再加入抗体工作液(50μL/孔)，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min；倒出孔中液体，洗涤5次(步骤同上)，用吸水纸拍干；加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，37℃恒温箱中反应30min，洗涤5次(步骤同上)；每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min；每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长)。

用下式计算试剂盒对其它结构类似物的交叉反应率。

结果见表3。

表3 试剂盒的特异性

结构类似物名称	购自的公司名称及其产品目录号	交叉反应率
			黄曲霉素M₁	FERMENTEK公司；产品目录号为FER005	100％
黄曲霉素M₂	FERMENTEK公司；产品目录号为FER006	约94％
			黄曲霉素B₁	FERMENTEK公司；产品目录号为FER001	约18.7％
黄曲霉素B₂	FERMENTEK公司；产品目录号为FER002	约5.4％
			黄曲霉素G₁	FERMENTEK公司；产品目录号为FER003	＜1％
黄曲霉素G₂	FERMENTEK公司；产品目录号为FER004	＜1％
			牛血清白蛋白	Fluorochem Limi ted公司；产品目录号为S02375	＜1％
脱氧雪腐镰刀菌烯醇	FERMENTEK公司；产品目录号为FER008	＜1％

实验表明，与黄曲霉素M₂的交叉反应率为94％、与黄曲霉素B₁、黄曲霉素B₂分别有18.7％和5.4％的交叉反应，与其他结构结构类似物无交叉反应。

实施例6、检测黄曲霉素的试纸条及其制备与应用

一、试纸条的结构

所述试纸条由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例3的步骤四的1得到的单克隆抗体；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T线)和质控区(C线)均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被实施例2制备的M1-OVA，质控区包被羊抗鼠二抗。

样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

二、试纸条的制备

(1)胶体金标记抗体

①胶体金溶液的制备

取0.01％氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2-8℃保存。

②金标抗体溶液的制备

用0.1mol/L K₂CO₃水溶液调节胶体金溶液的pH至8.2，然后取10mL加入50mL烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入实施例3的步骤四的1得到的单克隆抗体溶液(含0.35mg蛋白质)，逐滴加入3mL 5g/100mL BSA水溶液，持续搅拌10min。

③将金标抗体溶液常温低速(1500r/min)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液。

④将步骤③的溶液4℃、11000r/min离心40min，溶液分为三层(透明上清、管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层)，将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1g/100mL BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液混悬至原金标抗体溶液的体积，过夜，4℃、11000r/min离心40min，收集沉淀。

⑤用含1g/100mL BSA和0.02g/100mL NaN3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液将步骤④的沉淀混悬至原金标抗体溶液的体积的1/40，2-8℃保存。

(2)喷金：将步骤(1)得到的混悬液喷到玻璃纤维膜上，制成胶体金垫。

(3)喷膜：在反应膜上的T线位置喷上实施例2制备的M1-OVA溶液、C线位置喷上羊抗鼠抗体。

(4)组装：将样品吸收垫(纤维素滤膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫(吸水纸)按常规方法进行组装，然后切条，将试纸条装入塑料制卡中，形成试纸卡。

三、用试纸卡进行检测

(1)样品前处理及检测

检测样本为液态奶；取3mL混匀的液态奶于离心管中，加入3mL乙酸乙酯，混匀后静置2-3min；4000g离心10min，取1.5mL上层液体，氮气吹干；取150μL样品稀释液于样品管中充分涡动，静置5min，即为待测样本溶液。

取出试纸卡，开封后平放于桌面，吸取待测样本溶液逐滴加入4滴于样品孔中；5-10min判断结果，15min后的判断结果无效。

结果判断标准：

阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性；

阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性；

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。

四、试纸卡的效果

(1)假阳性率和假阴性率

取经确证的阴性牛奶(含黄曲霉素M₁＜0.5μg/L)50份，取经确证的阳性牛奶(含黄曲霉素M₁≥0.5μg/L)50份。将样品分别用试纸卡进行检测，计算假阳性率和假阳性率。

结果：在50份阴性牛奶样品中，试纸卡检测出阳性样品共1份，假阳性率为2％。在50份阳性牛奶样品测定中，试纸卡检测出阴性样品0份，假阴性率为0％。

(2)试纸卡保存期

稳定性试验结果表明，本试纸卡在2-8℃或室温条件***凉干燥处可保存1年。

Claims

1.一种检测黄曲霉素的酶联免疫试剂盒，包括抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体；所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1的保藏编号为CGMCC No.5779；所述黄曲霉素为黄曲霉素M₁或黄曲霉素M₂；

所述试剂盒为如下1）至4）中的任意一种：

1）包括式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白的偶联物、所述单克隆抗体和酶标记抗抗体的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原；

2）包括式（Ⅰ）所示化合物的酶标记物、所述单克隆抗体和抗抗体的试剂盒；其中，所述抗抗体作为包被原；

3）包括式（Ⅰ）所示化合物的酶标记物和所述单克隆抗体的试剂盒；其中，所述单克隆抗体作为包被原；

4）包括式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白的偶联物和所述单克隆抗体的酶标记物的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原；

式(I)。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗涤液、样品浓缩液、底物显色液和终止液中的至少一种。

4.一种检测黄曲霉素的胶体金试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，所述样品吸收垫、所述胶体金垫、所述反应膜和所述吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体；所述单克隆抗体为抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体；所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1的保藏编号为CGMCC No.5779；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区和质控区均为与所述试纸轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白的偶联物，质控区包被羊抗鼠二抗；

所述黄曲霉素为黄曲霉素M₁或黄曲霉素M₂。

5.权利要求1至3中任一所述试剂盒，或，权利要求4所述胶体金试纸条，在检黄曲霉素中的应用；所述黄曲霉素为黄曲霉素M₁或黄曲霉素M₂。

6.权利要求1至3中任一所述试剂盒，或，权利要求4所述胶体金试纸条，在检测待测样本是否含有黄曲霉素中的应用；所述黄曲霉素为黄曲霉素M₁或黄曲霉素M₂。