JP2551406B2

JP2551406B2 - アフラトキシンを検出する方法

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Publication number: JP2551406B2
Application number: JP61042076A
Authority: JP
Inventors: デイーグロープマンジヨン; エヌウオーガンジエラルド; マーシヤク−ロスステインアン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-02-28
Filing date: 1986-02-28
Publication date: 1996-11-06
Anticipated expiration: 2011-11-06
Also published as: JPS61269069A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、アフラトキシンを検出する方法に関す
る。

ヒト及び他の動物が、食物、水及び空気を介して毒性
物質にさらされること及びその効果は、我々の生存にと
って極めて重大な問題である。一般的な毒性物質郡の中
で、アフラトキシン（aflatoxin）類、フルオランテ
ン、ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニトロクリ
セリン及びアミノビフェニルのような低分子量（1000ダ
ルトン又はそれ以下）の突然変異原物質及び／又は発癌
物質を検出することがより重要になってきている。特
に、アフラトキシンのような物質にヒトがさらされてい
るかどうかを評価する非侵入性スクリーニング方式は、
毒物そのものと、その代謝物、特に血清や尿のような体
液中でDNA及びタンパク質と形成される共有結合付加物
の両方を検出できなければならない。

アフラトキシンは、この群に含まれる毒性及び発癌性
化合物の代表的なものである。アフラトキシンはマイコ
トキシンと呼ばれる、菌類の二次代謝物であり、アスパ
ラギルス・フラブス（Aspergillus flavus）及びアスパ
ラギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticu
s）によって生産され、構造的には縮合ジヒドロフロフ
ラン部分を含む置換フマリン類である。アフラトキシン
はピーナツ、ピーナツミール、綿実ミール、トウモロコ
シ、乾燥チリこしょう等に天然に含まれている。しかし
ながら、カビの生育自体によっては、この毒素の存在及
び濃度を予測することができない。なぜならば、アフラ
トキシンの産出量は、カビの生育条件及びその種の遺伝
的性質に依存するからである。種々のアフラトキシン、
すなわちB₁型、B₂型、G₁型、G₂型、M₁型、及びM₂型は単
離され、特徴づけられている。アフラトキシンB₁型（以
下、AFB₁という）はこれらの化合物の中で最も生物的に
活性で、多くの動物種に対して毒的で、突然変異原物質
及び発癌物質として作用する。このマイコトキシンは世
界の多くの地域でヒトの食物にしばしば混入しており、
これらの地域、特にアジア及びアフリカでは、ヒト肝臓
癌の発生頻度が高くなっているという統計がある（ブス
ビーら、Food−Born Infections and Intoxications
（リーマン及びブリアン編）、第２版、アカデミック・
プレス社、1979,pp.519−610）、ウォーガン・ジー・エ
ヌ、Methods Cncer Res.7:pp.309−344（1973））。

AFB₁はまた、酸化的代謝を受けた後DNA中のグアニン
と共有結合性の付加物を形成して非常に反応性に富んだ
2.3−エポキシドになる。代表的な付加物は2,3−ジヒド
ロ−２−（N⁷−グアニル）−３−ヒドロキシアフラトキ
シンB₁（以下、AFB₁−N⁷−Guaと記載する）である（リ
ンら、Cancer Res.37:pp.4430−4438（1977）；マーチ
ンら、Nature,（ロンドン）、267;pp.863−865（197
7））。AFB₁−N⁷−Gua付加物及びその推定される誘導体
である2,3−ジヒドロ−２−（N⁵−ホルミル−２′,5′,
6′−トリアミノ−４′−オキソ−N⁵−ピリミジル）−
３−ヒドロキシアフラトキシンB₁（以下、AF−N⁷−Gua
と記載する）は、ラットの生体肝臓、ヒト気管支及び結
腸組織培養物、ヒト肺臓細胞培養物のような組織及び系
中で、一時的に又は慢性的に投与した後固定されている
（ハウゲンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:pp.4124−4
127（1987））。

免疫学的方法及び単一クローン抗体を用いた、AFB₁及
びそのDNA付加物を包含する代謝物質の定量方法が研究
されている（ハーツォグら、Carcinogensis 3:pp.825−
828（1982）；ハウゲンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
8:pp.4124−4127（1981））。同様な研究が、免疫学的
方法及び試薬を用いて、我々の環境中に見出される他の
低分子量の毒物について行なわれている（ジョンソン
ら、J.Analyt.Toxicol.4:pp.86−90;ヒューら、J.Food
Prot.47:pp.562−569（1984））。それにもかかわら
ず、現在知られている限りでは、このような環境中に存
在する発癌物質にヒト及び動物がさらされているかどう
かを評価する一般的な非侵入性スクリーニング方法はい
まだ確立されていない。

この発明は、アフラトキシンを含んでいるかもしれな
い試料を、固相吸着剤とこの上に固定化され、前記アフ
ラトキシンに対して特異的なモノクローナル抗体とを含
む親和性カラム上に載せる工程と、溶媒をカラムに通
し、第１の流出物を回収し、それによって前記アフラト
キシルを前記モノクローナル抗体によって前記カラム上
に保持する工程と、溶離剤をカラムに通して第２の流出
物を回収し、それによって前記アフラトキシンを前記モ
ノクローナル抗体から溶離させて前記第２の流出物中に
回収する工程と、前記アフラトキシンの存在を検出する
ために前記第２の流出物をさらに精製することなく紫外
線にさらすことによって蛍光測定を行なう工程とを含む
被検試料中のアフラトキシンを検出する方法を提供す
る。

本発明の方法は、いずれの型のアフラトキシンにも適
用可能であり、特にアフラトキシンB₁及びアフラトキシ
ンM₁の試験に有用である。また、本明細書で言う「検
出」には存在の検出及び定量の両者が包含される。な
お、以下の実施例得られたハイブリドーマはアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託してあり、
その寄託番号はATCC HB8719である。

I.アフラトキシン免疫原の製造好ましい免疫原は、ウシガンマグロブリン（以下BGG
という）にAFB₁が結合されたものを含む組成物である。
まず、BGGをpH7.0のリン酸緩衝液（以下、PBSという）
に10mg/mlの濃度で溶解した。ｍ−クロロパーオキシ安
息香酸を用いた方法（マーチンら、ネイチャー誌（ロン
ドン）267:pp.863−865）を修飾した方法によってAFB₁
をBGGに結合した。典型的には1mgのAFB₁（3.2μmol）を
2.0mlの塩化メチレンに溶かし、これを、予め2.0mlの塩
化メチレンに溶解された５モル過剰のｍ−クロロパーオ
キシ安息香酸（mCPBA）に加えた。この反応混合物に、P
BS中に溶けたBGGを加え、タンパク含量に対し５モル過
剰のアフラトキシンを生成した。反応混合物を室温で一
夜激しく混合し、次に2000gで20分間遠心することによ
って反応を停止した。修飾BGGタンパク質を含む水性の
上層（上清）をpH7.4のPBSに対し十分に透析した。362n
mにおける吸光度を測定し、モル消衰係数が18000である
ことを利用して修飾グロブリンタンパク質の濃度を測定
した。上記方法により得られた反応生成物AFB₁−BGG
は、平均して１分子のBGGに40ないし50のAFB₁残基が結
合していた。

上記方法を用いてAFB₁を他の担体に結合することもで
きる。例えば、AFB₁がウシ血清アルブミン（以下、BSA
という）に結合されたものは有用な代替物である。しか
しながら、ウシ血清アルブミンへのAFB₁の結合は、通
常、１分子のBSAに対しアフラトキシンが20ないし30分
子である。他の有用な担体も、この分野において知られ
た方法を用いてAFB₁と結合することができる。このよう
な結合体の例を列挙すると以下のとおりである。AFB₁−
BGG（mCPBA）、一本鎖AFB₁−DNA−meBSA、AFB₁−N⁷−Gu
a−BGG−PABA（パラ安息香酸）、AFB₁−カルボキシメチ
ルオキシム−KLH（ケホール・リンペット・ヘモシアニ
ン（Kehole Limpet Hemocyanin）、AFB₁−ポリ−Gua−B
GG II.マウスの免疫化約16週令のメスBALB/By（ジャクソン・ラボラトリ
ー）を、PBSに溶解され、等体積のフロインドの完全ア
ジュバンドで乳化したAFB₁−BGGで免疫化した。それぞ
れ５匹のマウスから成る２群を用い、免疫化は37.5μｇ
又は12μｇのAFB₁−BGG（アジュバンドを含む）のPBS溶
液（終体積0.2ml）を腹腔内投与することによって行な
った。最初の注射から５週間及び９週間後、それぞれの
マウスに、フロインドの不完全アジュバントで乳化した
同量のAFB₁−BGGを投与した。２回目の注射から約10日
後、尾から出血させて血清試料をとり、ELISA免疫定量
によって抗アフラトキシン抗体活性を測定した。血清中
に特異的抗体が見出されたマウスに対し、殺す３日前に
同じAFB₁−BGGのPBS溶液（0.ml）を尾の静脈に注射し
た。

ELISA免疫定量はまた、マウス血清中のAFB₁に対する
特異的抗体の存在を調べるためにも（そして次に特異的
ハイブリドーマを固定するためにも）用いた。これらの
定量方法は、この分野において公知の方法を修飾したも
のである（ハウゲンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:p
p.4124−4127（1981）、グロープマンら、Cancer Res.4
2:pp.3120−3124（1982））。この方法を簡単に要約す
ると、AFB₁−BSAを2.0μg/mlの濃度にPBSに溶かし、こ
の液体混合物の50μｌをポリビニルマイクロタイタープ
レートのそれぞれのウェルに入れ、室温で２ないし４時
間インキュベートした。ウェルのいくつかには、２μg/
mlの濃度のBSAのPBS溶液50μｌを入れ、対照とした。そ
れぞれのウェル中の液体を吸引し、ウェルをなま水で３
回洗った。次に、それぞれのウェルに、0.2％BAS又は0.
2％ゼラチン（タイプIV、シグマ社）を含むPBS溶液を入
れ、プレートを室温でさらに１時間インキュベートし
た。この操作は抗体の非特異的結合を制限するために行
なった。プレートを次になま水中で洗い、50μｌのマウ
ス血清試料又はハイブリドーマ媒地をそれぞれのウェル
に入れた。マウス血清を滴定するために、10％のウシ胎
児血清を含むPBS中に連続する３倍希釈により、1:50な
いし3:50000の範囲の希釈物をつくった。ハイブリドー
マ培地を用いた場合には、希釈物と共に50μｌを用い
た。どちらの場合も、マイクロタイタープレートを37℃
で90分間インキュベートし、その後なま水で完全に洗っ
た。それぞれのウェルの表面に結合した特異的抗体は、
それぞれのウェルに、アルカリフォスファターゼに結合
されたラットの抗マウスカッパ抗体の1:200希釈物を50
μｌ加え、室温で４時間又は４℃で一夜インキュベート
することによって測定した。それぞれのプレートのウェ
ルは次に、なま水で再び洗った。pH9.8の0.1Mジエタノ
ールアミン緩衝液中でつくった1.0mg/mlのｐ−ニトロフ
ェニルフォスフェート溶液100μｌをそれぞれのウェル
に加え、１ないし２時間反応させた。マイクロタイター
プレートリーダーを（ダイナテック・ラボラトリー）用
いて405nmでのウェルの吸光度を測定することによって
ｐ−ニトロフェノール反応生成物を定量した。

マウス免疫グロブリンのサブタイプの固定のための市
販のキット（ベーリンガー−マンハイム社）を用いた非
競合的ELISAにより、単一クローン抗体のイソタイプを
決定した（すなわち、異なる抗体Ｈ−鎖群を固定し
た）。

III.ハイブリドーマの製造及び単一クローン抗体産性細胞の単離予めフロインドの完全アジュバンド中AFB₁−BGGで免
疫化したメスのBALB/By CJマウスが有意の抗AFB₁血清タ
イマーを有しているかどうかを上述の非競合的ELISAを
用いて調べた。抗タイターを示すマウスを殺し、マーシ
ャク−ロスシュタインら、ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジー122、pp.2491−2497（1979）に記載された方法に
従ってハイブリドーマをつくった。20％（v/v）のウシ
胎児血清、580μg/mlのグルタミン、10ユニット/mlのペ
ニシリン、100μg/mlのスレプトマイシン、及び非必須
アミノ酸（ギブコ社）を加えたダルベッコの修飾イーグ
ル媒地（以下、DME媒地という）中に維持したSP2/0ミエ
ローマ株細胞を融合細胞のために用いた。マウスを殺
し、0.01Mのリン酸で緩衝された、pH7.2のハンクの平衡
塩溶液（以下、HPBSという）を用いて脾細胞の懸濁液を
つくった。

これらのマウスからの脾細胞を、ゲフターら、Somati
c Cell Genet.3:pp.321（1977）に記載された方法を修
飾した方法を用いてSP2/0ミエローマ細胞と融合した。
他に断りがない限り、全ての遠心は室温で700gで５分間
行なった。好ましくは、5x10⁶個のSP2/0ミエローマ細胞
と5x10⁷個の免疫脾細胞とを丸底プラスチック管中で１
つにし、遠心し、血清を含まない10mlのDME培地で再懸
濁し、再び遠心した。上清を慎重に捨て、遠心管中に残
った細胞ペレットを分散させるように、蛇口の水をペレ
ットに鋭くかけた。次に細胞を無血清DME中に溶けた30
％（v/v）のポリエチレングリコール1000（ベーカー・
ケミカル社）の溶液0.5mlに６分間さらした。この６分
の間に細胞をゆっくりと遠心した（150gで３分間）。次
に細胞ペレットに4.0mlの無血清DMEを加え、細胞を蛇口
の水で再び懸濁した。管の内容物を100x17mmのペトリ皿
に移し、20％のウシ胎児血清を含むDME培地中で１日培
養した。次に細胞を再び懸濁し、ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジンを含む生育培地（以下、HAT培
地という）中で再懸濁した。平底マイクロタイタープレ
ートのそれぞれのウェルに、細胞を0.1ml（約10⁵個のSP
2/0細胞を含む）づつ入れた。１週間インキュベートし
た後、ヒポキサンチン及びチミジンのみを含む生育培地
（以下、HT培地という）を0.05mlづつそれぞれのウェル
に加えた。融合２週間後、それぞれの培養物について、
上述したELISA免疫定量法を用いて特異的抗−AFB₁抗体
の有無を調べた。

AFB₁に対し高い親和性を有するIgM抗体を分泌してい
るハイブリドーマを、予め0.5mlのプリステン（アドリ
ッチ社）を注射したBALB/Cマウス中に腹水腫瘍細胞とし
て生育した。マウス中で生育したハイブリドーマは特異
的IgM抗体を多量に生産し、これはマウスが死ぬ前に腹
水として回収された。これらの動物からの腹水を貯蔵
し、そのまま又は飽和硫酸アンモニウム沈殿及びPBSに
対する透析によりさらに精製して免疫定量法に用いた。
肉眼で病理調査を行なったところ、全てのマウスは、広
範囲に広がる腫瘍の侵入、すなわち、注射されたハイブ
リドーマ細胞の増殖の結果死んだことがわかった。

この方法により得られた単一クローン抗体はAFB₁分子
に対して特異性を有する抗親和性IgM抗体であることが
示された。この抗体の親和定数をスカッチャード（Scat
chardプロット分析及びミュラーの方法（J.Immunol.Met
h:34,pp.345−352（1980））により決定したところ、8x
10⁸及び１×10⁹リットル／モルであった。これらの値
は、下記の競合的RIA法により得られたデータから導か
れたものである。

この分析は300μｌの試料を用いて行ない、その100μ
ｌはモラベク・バイオケミカルズ社から購入した［³H］
−AFB₁トレーサー（比活性3.4Ci/mmol）から成る。トレ
ーサー原液を、0.1％のBSAを含む通常マウス血清の１％
PBS溶液で希釈し、約20200cpm/100μｌの濃度にした。
単一クローン抗体を、AFB₁トレーサーの30ないし50％が
沈殿する濃度にまで希釈した。10％ウシ胎児血清PBS溶
液を含む抗体を100μｌづつ反応混合液に加えた。非放
射標識AFB₁又は、主なAFB₁−DNA付加物であるAF−N⁷−G
ua及びAF−FAPyrを包含するその代謝物から成る試料を1
00μｌづつ管に加えた。反応混合物を室温で２時間イン
キュベートし、次いで混合物をPBSで1.0mlの体積になる
ように希釈した。次に等量の氷冷飽和硫酸アンモニウム
を加え、試料を混合し、氷中に15分間立てた。試料を次
に2000gで15分間遠心し、ミュラー法を用いて反応の阻
害率（％）を求めた。

AFB₁及びその代謝物に対するIgM抗体の特異性が第１
図及び第２図に示されている。なお、これらの結果は、
飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ、PBSに対して透析す
ることによって最初に分画された高親和性の精製IgM抗
体を用いて得られたものである。抗体を次に高圧液体ク
ロマトグラフィーで精製した。この際、IgM抗体の分子
量が大きなこと（900000ダルトン）を利用して、立体的
排他性により分離した。ここに記載する方法において用
いたものは、その特異性及び高親和性を有するこの精製
IgM抗体の特徴及び性質である。競合的RIA法において、
アフラトキシンB₁、アフトキシンB₂、及びアフラトキシ
ンM₁について阻害率が50％となるのは3.0ピコモルであ
ったが、アフラトキシンG₁、アフラトキシンG₂、及びア
フラトキシンQ₁についてはそれぞれ60.0、84.0、及び27
5.0ピコモルであった。第２図に示されたデータは、AFB
₁及び２つの主たるアフラトキシンDNA付加物であるAF−
N⁷−Gua及びAF−FAPyrに対するIgM抗体の特異性及び阻
害率が50％となる点を示している。50％阻害値はそれぞ
れ3.0、24.0、及び89.0ピコモルであった。従って、デ
ータは、このIgM抗体がAF−FAPyr付加物を検出する感度
がAF−N⁷−Gua付加物を検出する感度よりも約４倍高い
ことを示している。

IV.固定化抗AFB₁IgM単一クローン抗体を含む親和性マト
リックスこの精製されたIgM単一クローン抗体を用いて、ファ
ーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の方
法によって親和性マトリックス材料をつくった。十分量
（2.0mg）の単一クローン抗体を、0.1M NaHCO₃0.5M NaC
lとを含む結合緩衝液（pH8.3）に溶解した。この抗体溶
液を、予め8.0mlの0.001M HCl中で一液インキュベート
した、臭化シアノーゲンによって活性化されたセファロ
ース−4B（シグマ社）に加えた。セファロースと抗体溶
液とを１時間反応させた後、この固相吸着材料を、1.0M
のエタノールアミン（pH8.5）で１時間インキュベート
することによって、抗体が結合されたゲルの未結合部位
をブロックした。固相吸着材料上に固定化されたIgM抗
体によって親和性マトリックスが形成され、これを次に
１ないし2mlの体積づつ用いた。

好ましい固相吸着材料は活性化されたセファロース4B
ゲルであるけれども、他の多くの材料を固相材料として
用いることができることが認められている。例えば他の
アガロースゲル組成物、デキストラン、ガラス板を包含
する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げることができる。同
様に、抗親和性IgM抗体をそれぞれの化学組成物上に固
定化する方法もこの分野において公知であり、記載され
ている。

V.液体試料中のアフラトキシンを検出し単離する方法被検試料中のアフラトキシン及びアフラトキシン−DN
A付加物を検出する方法は、次の工程を含む親和性クロ
マトグラフィー法である。（１）アフラトキシン又は目
的のアフラトキシン−DNA付加物に対して特異的な抗親
和性IgM抗体が固相吸着材料上に固定化された、均一な
親和性マトリックスを製造する。（２）被検試料中のア
フラトキシンが、親和性マトリックスのIgM抗体によっ
て結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリ
ックスとを接触させる。（３）IgM抗体からアフラトキ
シンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに
加える。この溶離剤は、ジメチルスルフォキシド、ジメ
チルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドから成る
群より選ばれる非プロトン性溶媒の、50％（v/v）以上
の濃度の水溶液である。（４）親和性マトリックスから
の回収された流出物中にアフラトキシンが存在するかど
うかを同定する。

抗アフラトキシンIgM単一クローン抗体の重要な特徴
は、AFB₁抗原に対する特異的性だけではなく、その高い
親和定数（少なくとも約１×10⁸リットル／モル、好ま
しくは１×10⁹リットル／モル）も重要な特徴である。
従って、親和性カラム中に共有結合されている抗体に目
的のアフラトキシンが結合した後、これを溶離するため
の溶離剤には特殊なものを使わなければならない。この
ことは次の実施例に示されている。すなわち、次の実施
例では、吸着剤に結合した抗体が、目的のアフラトキシ
ンに結合する能力を示すのみならず、アフラトキシンが
親和性カラムに吸着した後、これを選択的に解離させる
のに、従来の溶解剤を用いたのではこれを行ない得ない
ことを示している。

実施例１最初の実験は、セファロース4B上に固定化された抗AF
B₁IgM抗体がAFB₁を結合する能力を測定するために行な
った。これらの実験では、放射標識した³H−AFB₁を10ml
のPBS中に1ngの濃度で用いた。この濃度は、汚染された
食品にさらされたヒトの体液中に検出されるであろうと
予想されるアフラトキシンの濃度である。先ず、100μ
ｌの³H−AFB₁トレーサーと、0.1％のBSAと、10mMのNaN₃
と、0.lmlの通常マウス血清と、３μｌの³H−AFB₁とを
含むPBS10.0mlを約0.1mlのゲル床に加えた。流出カラム
流速は0.25ml/分よりも少し大きかった。約200μｌのPB
Sをトレーサーに加え、親和性マトリックスの頂部が空
気にさらされるまで（カラムが乾燥することなしに）カ
ラムを下降させることによってカラムに移した。さらに
2.0mlのPBSを加えてトレーサーをカラムから洗い出し、
流出液をカラスビンに単一の分画として集めた（No.
1）。このようにして約24486CPMのトレーサーをカラム
に加え、それぞれの分画が回収されることごとにシンチ
レーションによって放射標識物質の含量を測定した。次
に異なる溶離剤を親和性マトリックスに加え、AFB₁トレ
ーサーを放出する能力を測定した。これらの結果は以下
の第１表に示されている。

明らかなように、元のトレーサーの約10％は親和性マ
トリックスに吸着されず、溶離剤を加える前に流出分画
No.1として回収された。これは、トレーサー中の非特異
的トリチウム交換に起因する。引き続き行なった、列挙
した個々の溶離剤との反応により、流出分画２〜７にお
いては、マトリックスのIgM抗体によってトレーサーAFB
₁の放出は実質的に起こらないことがわかった。50％ジ
メチルスルフォキシド（以下、DMSOという）を用いて初
めて多量（90％）のAFB₁トレーサーが親和性マトリック
スから放出された。また、DMSOを親和性カラムに加える
と、マトリックス中の明確な色の変化が見えるようにな
り、カラム床自体がより半透明になった。DMSO流出分画
を回収した後にPBSを親和性マトリックスに加えると、
ゲル床はももとの不透明な通常の状態に戻った。

親和性マトリックスは、セファロースゲルに結合され
たIgM抗体を損傷し又は修飾（変性、沈殿等）すること
なくもとの状態に復帰した。このことは、DMSO遊離剤を
加えその後PBSで洗う実験を継続することによって示さ
れた。

200μｌのPBSに溶けた第２の100μｌのトレーサー³H
−AFB₁を、前に第１の³H−AFB₁トレーサー試料を単離す
るのに用いた同じカラムに加えた。第２のトレーサーを
加えた後、2.0mlのPBSでカラムをすすぎ、流出物を分画
No.8として回収した。次に2.0mlのDMSOのPBS溶液を加
え、流出物を分画No.9として回収した。カラムを次に２
回2.0mlPBSでそれぞれ洗い、流出液を分画10及び11とし
て回収した。結果を下記第２表に示す。

第２のトレーサーは約24486cpmの総放射能を有してい
たが、また、その約10％が親和性マトリックスに保持さ
れなかった。分画９はまた、多量のAFB₁トレーサー（約
60％）がDMSOによって溶離され、残りは、いくらかの残
留DMSOを含む第１回目のPBS洗浄によって分画10中に回
収されることを示している。

さらに、溶離効果をもたらすためには少なくとも50％
の濃度のDMSOを用いることが必要であることを示すため
に、この実験の変形を行なった。この実験に用いた100
μｌの³H−AFB₁は合計で約27000ないし28000cpmの³H−A
FB₁を含んでいた。100μ13のトレーサーを親和性カラム
に載せ、200μｌのPBSで洗浄して保持されていない保持
されていないトレーサーをカラムから除去した。次にマ
トリックスを1.0mlづつの、濃度が増加するDMSOで洗っ
た。結果を次の第３表に示す。

第３表より、DMSOの50％溶液を使用する前は、親和性
マトリックスから³H−AFB₁が実質的に溶離されないこと
かわかる。また、DMSOの濃度を50％より大きくしても、
親和性マトリックスからのAFB₁の放出は検出可能な程度
には増加しないことがわかる。このため、DMSOはその濃
度が少なくとも50％あれば、この方法において溶離剤と
して用いるのに十分である。この方法に用いるのに適し
た他の溶離剤はジメチルフォルムアミド及びジメチルア
セトアミドである。有効な溶離剤とするためには、これ
らの溶離剤も少なくとも50％の濃度で用いなければなら
ない。これらの溶離剤、すなわち、さらに一般的に非プ
ロトン性溶媒を用いた場合、親和性マトリックスは繰り
返し再使用することができる。このような非プロトン性
溶媒で溶離してもマトリックス材料は損傷されない。こ
のことはマイコトキシンの検出及び測定を産業的に行な
う場合に重要である。産業的にこの方法を行なう場合に
は、その経済的理由により親和性マトリックスを再使用
する必要があるが、DMSOのような非プロトン溶媒で溶出
することはこの要求に合致している。

一方、溶離はメタノールやエタノールのような親油性
溶媒を用いても行なうことができるが、親和性マトリッ
クスあるいはカラムは実質的に再使用できなくなる。こ
の発明のこの局面では、好ましくは50ないし100％、特
に好ましくは100％のメタノール又はエタノールを、DMS
Oの代りにこれらを用いることを除いて上記した方法と
同様にして用いることができる。

VI.ヒトの尿、血清、及び母乳からのアフラトキシンの
生体外における単離上で示されたように、放射滴定又は吸光度測定により
示されたIgM抗体親和性マトリックスのAFB₁を結合する
能力は、1mlのカラム床当り、10mlのPBSからのAFB₁1.0
ないし1.3μｇである。これらのパラメーターは、ヒト
の尿、血清、母乳試料から、生体外でアフラトキシンを
下記のようにして単離し検出するのに用いることができ
る。

ヒト血清（10mlづつ）又はヒト母乳（10mづつ）を、
前処理することなしに直接抗体マトリックスに施すこと
ができる。どちらの場合にも、液体試料中のアフラトキ
シンが抗体マトリックスに定量的に結合し、これらは、
溶離剤として50％濃度のDMSOを用いることによって定量
的に回収される。このことは、上述したようにして、³H
−AFB₁を1ngづつ血清又は母乳試料に直接加えることに
よって経験的に見出された。従って、血清又は母乳を試
験する場合には、アフラトキシンを定量的に回収するた
めには、なんらの準備工程もいらない。

しかしながら、尿は、試料中の妨害物質、例えば塩を
除くために、アフラトキシンの単離及び回収を行なう前
に、クロマトグラフィーを包含する前処理を行なわなけ
ればならない。これは第３図に模式的に示されており、
ここではセプパック（Sep−Pak）C₁₈カートリッジ（ウ
ォーターズ・アソシエイツ社）を用いて妨害物質を除去
した。尿試料をまず、準備的な低圧液体クロマトグラフ
ィーカートリッジに通してタンパク質や他の妨害物質を
除去すれば、ヒトの尿試料中に存在するアフラトキシン
の90ないし95％はこの発明の方法により一貫して定量的
に回収できる。

また、AFB₁に対して特異的である抗親和性IgM抗体を
用いることは、AFB₁−DNA付加物、AF−N⁷−Guaを定量的
に検出し回収するのに有用である。これらのアフラトキ
シンDNA付加物は、血清や他の体液から、何等の前処理
を行なうことなく検出され、定量的に回収される。ヒト
又は動物からの尿を被検試料とする場合には、試料を親
和性マトリックスに加える前に、先ずカーボンクロマト
グラフィーカートリッジを通す高圧液体クロマトグラフ
ィーにより試料を前処理することが好ましい。このよう
にして、環接的に汚染された人々からの複雑な生物学的
試料からのAFB₁及びその代謝物を定量的及び定性的に単
離し精製することができる。さらに、この方法は、アフ
ラトキシン自体を検出する分析法としても働く。

上述したことより、この発明は、試料中の種々の濃度
のアフラトキシンを簡単に正確に検出することができる
ことがわかる。この発明の重要な局面は、特異的単一ク
ローン抗体が結合された親和性マトリックスすなわちカ
ラムである。固相吸着材上に固定化された抗体を含むこ
のような親和性マトリックスを用いることは、迅速で効
率の高い、被検試料の精製手段を提供する。単一クロー
ン抗体の高親和性及び選択性の故に、試料の粗抽出物を
抗体マトリックスカラムに通し、それによって目的の毒
物が抗体に結合され、該試料抽出物の他の全ての成分は
通過する。DMSO又はメタノールのような適当な溶離剤で
溶離することによって、もとの粗試料から、定量的な収
量で高度に精製された毒物が溶離され、回収される。こ
のような効率的な１工程精製方法は、特に毒物の分析の
分野において有利である。

抗体マトリックス材料によってアフラトキシンを精製
した後、蛍光分析によりアフラトキシンを検出又は定量
する。いずれにせよ、この発明は、単一クローン抗体が
結合された親和性マトリックスを用い、分析し検出する
ための試料を親和性マトリックスに１回通すことによる
簡単で迅速な精製方法を提供する。

アフラトキシンも蛍光分析により検出又は定量され
る。すなわち、精製した試料を紫外線（365nm）に当て
るとアフラトキシンは425nmの蛍光を発する。この型の
分析方法は、その分析性能及び、ある程度の定量分析も
可能であるということにより、特に好ましい。このよう
な蛍光分析操作は、AOAC法（AOAC Method,第26章、pp.4
14−429（1980））の方法に従うことによって行なうこ
とができる。

抗体結合マトリックスにより毒物を含む試料の１工程
精製が可能になるので、この発明は、産業廃棄物やトウ
モロコシ、ピーナッツのような食品、及び体液中に含ま
れる種々の毒物を検査するのに適用することができる。
トウモロコシ試料を例として、全体的な操作方法を次に
示す。

上述からわかるように、共通の重要な工程は、特異的
単一クローン抗体が結合した親和性カラムを用いること
による試料の精製にあることが明らかである。試料が一
旦精製されると、毒物の濃度又は存在は種々の方法によ
り定性的に又は定量的に測定することができる。

定性分析この発明によると毒物はまず定性的に検出することが
できる。例えば、トウモロコシ試料中のアフラトキシン
は、次の工程により検出することができる。

（１）すりつぶしたトウモロコシの50gを計量する。

（２）すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。

（３）メタノールを混合機に加える。

（４）１分間混合する。

（５）混合物に蒸留水を加え混合する。

（６）フィルターを介して混合機から抽出物を取る。

（７）抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。

（８）蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。

（９）親和性カラム（好ましくはシリンジに含まれたも
の）にメタノールを通し、蛍光照明手段を有する反応容
器にこれを回収する。

（10）蛍光照明手段を有する容器を取り、蛍光量を可視
的に測定（定量的ではない）するための装置に入れる。

（11）容器を取り、捨てる。

定量分析一方、毒物の濃度は次の操作により定量的に測定する
ことができる。再び、トウモロコシ中のアフラトキシン
の測定を例として挙げる。

（１）すりつぶしたトウモロコシの50gを計量する。

（２）すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。

（３）メタノールを混合機に加える。

（４）１分間混合する。

（５）混合物に蒸留水を加え混合する。

（６）フィルターを介して混合機から抽出物を取る。

（７）抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。

（８）蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。

（９）親和性カラムにメタノールを通し、測定装置に含
まれた試験キュベットに回収する。

（10）測定値を読む。

（11）試料を取り出し捨てる。

【図面の簡単な説明】

第１図は³H−AFB₁と種々のアフラトキシンを用いてIgM
抗体の特異性を測定するための競合的放射免疫分析の結
果を示すグラフ、第２図は³H−AFB₁トレーサーとアフラ
トキシンB₁及び主たる代謝的アフラトキシン−DNA付加
物を用い、IgM抗体を用いた競合的放射免疫分析の結果
を示すグラフ、第３図は毒物を検出し単離するための一
般的な方法の概略を示す模式フローチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９７Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９７ (72)発明者ジヨンデイーグロープマンアメリカ合衆国マサチユーセツツ州リンフイールドメロウロード 25 (72)発明者ジエラルドエヌウオーガンアメリカ合衆国マサチユーセツツ州ベルモントクラフリンストリート 125 (72)発明者アンマーシヤク−ロスステインアメリカ合衆国マサチユーセツツ州ニユートンロイスロード 40 (56)参考文献特開昭50−72692（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，81（1984）Ｐ．7728−7731

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アフラトキシンを含んでいるかもしれない
試料を、固相吸着剤とこの上に固定化され、前記アフラ
トキシンに対して特異的なモノクローナル抗体とを含む
親和性カラム上に載せる工程と、溶媒をカラムに通し、
第１の流出物を回収し、それによって前記アフラトキシ
ンを前記モノクローナル抗体によって前記カラム上に保
持する工程と、溶離剤をカラムに通して第２の流出物を
回収し、それによって前記アフラトキシンを前記モノク
ローナル抗体から溶離させて前記第２の流出物中に回収
する工程と、前記アフラトキシンの存在を検出するため
に前記第２の流出物をさらに精製することなく紫外線に
さらすことによって蛍光測定を行なう工程とを含む被検
試料中のアフラトキシンを検出する方法。
【請求項２】前記溶離剤は濃度50％以上の非プロトン性
溶媒の溶液である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記非プロトン性溶媒はジメチルスルフォ
キシド、ジメチルホルムアミド又はジメチルアセトアミ
ドである特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】前記溶離剤は親油性溶媒の50ないし100％
溶液である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】前記親油性溶媒は100％メタノール又は100
％エタノールである特許請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】前記抗体は検出しようとするアフラトキシ
ンに対して特異的であり、その親和定数は少なくとも約
１×10⁸リットル／モルである特許請求の範囲第１項な
いし第５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】前記アフラトキシンはアフラトキシンB₁又
はアフラトキシンM₁である請求項６記載の方法。
【請求項８】前記試料は血清、尿又は食品である特許請
求の範囲第１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】前記第２の流出物は波長365nmの紫外線に
さらされる特許請求の範囲第１項ないし８のいずれか１
項記載の方法。
【請求項１０】前記第２の流出物は、前記試料中のアフ
ラトキシンの量を検出するために定量分析に付される特
許請求の範囲第１ないし９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】アフラトキシンB₁又はアフラトキシンM₁
を含んでいるかもしれない試料を準備する工程と、固相
吸着剤とこの上に固定化され、前記アフラトキシンに対
して特異的であり、その親和定数は少なくとも１×10⁹
リットル／モルであるIgM抗体とを含む親和性カラム上
に前記試料を載せる工程と、溶媒をカラムに通し、第１
の流出物を回収し、それによって前記アフラトキシンを
前記抗体によって前記カラム上に保持する工程と、溶離
剤をカラムに通して第２の流出物を回収し、それによっ
て前記アフラトキシンを前記抗体から溶離させて前記第
２の流出物中に回収する工程と、前記アフラトキシンの
存在を検出するために前記第２の流出物をさらに精製す
ることなく紫外線にさらすことによって蛍光測定を行な
う工程とを含む被検試料中のアフラトキシン類を検出す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。