JP2640932B2 - Ｔａｎ−８６６、その製造法および微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は細菌感染症の治療剤として有用な新規物質TA
N−866A,B,CまたはＤあるいはそれらの鉄遊離体および
それらの製造法ならびにTAN−866A,B,CおよびＤのうち
少くとも１種を生産する能力を有する微生物に関する。

従来の技術 後述するTAN−866A,B,CおよびＤの物理化学的性状に
最も類似する化合物としてサクシニマイシン［Succinim
ycin−ジャーナル・オブ・アンティビオティクス（Jour
nal of Antibiotics），第16巻,67頁（1963年）］が挙
げられる。

発明が解決しようとする問題点 細菌によって惹起される疾病は抗生物質投与による治
療法の発達によってかなり克服されている。しかし、従
来の抗生物質を長期あるいは大量に投与することによる
起因菌の変化（菌交代減少）および耐性菌の出現（耐性
化現象）などによる疾患の増大、あるいは免疫力低下に
起因する日和見菌感染の増加などは現在の感染症治療医
学分野で大きな問題となっている。この問題を克服する
ために、当分野では、常に新規骨格を有し、新しい生物
活性を示す物質、あるいはそれらを合成するための中間
原料が求められている。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、新規な物質の探索を目的として多数の
微生物を土壌より分離し、その産生する物質を分離探索
したところ、ある種の微生物が新規な物質を産生するこ
と、該微生物がシュードモナス属に属する菌種であるこ
と、該微生物を適宜の培地に培養することによって主と
してグラム陰性菌に対して抗菌力を示す物質を培地中に
蓄積しうることなどを知り、これらの物質を単離し、そ
の物理化学的および生物学的緒性質から、当該物質が新
規な物質であることを確め、これらをTAN−866A,B,Cお
よびＤとそれぞれ称することにした。

本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を
重ねた結果、本発明を完成した。

すなわち本発明は、 （１） 一般式（Ｉ） ［式中、R₁は水素または水酸基を、R₂,R₃およびR₄は水
素またはメチル基を示す。ただし、（１）R₁が水素であ
る時は、R₂,R₃およびR₄は水素であるか、またはR₂,R₃お
よびR₄のうち２つは水素であり残り１つはメチルであ
り、（２）R₁が水酸基である時は、R₂,R₃およびR₄は水
素である。］で表される化合物またはその鉄遊離体、 （２） シュードモナス属に属し、化合物（Ｉ）のうち
少くとも１種を生産する能力を有する微生物を培地に培
養し、培養物中に該化合物を生成蓄積せしめ、これを採
取し、必要に応じて鉄遊離反応に付すことを特徴とする
化合物（Ｉ）の製造法、 および （３） 化合物（Ｉ）のうち少くとも１種を生産する能
力を有するシュードモナス・フルオレッセンスに関す
る。

なお、本明細書においてはペプチドTAN−866A,B,Cお
よびＤは次の化合物を意味するものとする。

TAN−866A:一般式（Ｉ）においてR₁,R₂,R₃およびR₄がす
べて水素である。

TAN−866B:一般式（Ｉ）においてR₁は水酸基、R₂,R₃お
よびR₄はすべて水素である。

TAN−866C:一般式（Ｉ）においてR₁は水素であり、R₂,R
₃およびR₄のうち２つが水素であり、残り１つはメチル
でかつ後述するHPLCのRtが5.8分である。

TAN−866D:一般式（Ｉ）においてR₁は水素であり、R₂,R
₃およびR₄のうち２つが水素であり、残り１つはメチル
でかつ後述するHPLCのRtが6.2分である。

本願ではペプチドTAN−866A,B,CおよびＤを単に「TAN
−866A,B,CおよびＤ」、それらの鉄遊離ペプチドを「鉄
遊離体」、とそれぞれ称し、また、TAN−866A,B,Cおよ
びＤを総称して「TAN−866」と称することもある。

本発明で使用されるTAN−866生産菌としては、シュー
ドモナス（Pseudomons）属に属し、TAN−866を産生する
能力を有するものであれば如何なる微生物でもよい。そ
の例としては、たとえばシュードモナス・フルオレッセ
ンス（Pseudomons fluorescens）があげられる。その
具体例としては、本発明者らが香川県善通寺市の土壌よ
り採取したシュードモナス・フルオレッセンスYK−310
株（以下、「YK−310株」と略称することもある。）が
あげられる。

YK−310株の菌学的性状は下記のとおりである。

（ａ）形態 肉汁寒天斜面上で24℃,5日間培養後の観察では、細胞
は直径0.6〜1.2μｍ、長さ0.8〜2.1μｍの桿状であり、
極毛の鞭毛を有し、運動性を有する。胞子を形成せず、
またグラム染色は陰性である。

（ｂ）各種培地上での成育状態 24℃で培養し、１ないし14日間にわたって観察した。

肉汁寒天平板培養：コロニーは無色、不透明、円形、
表面は頭状、周縁は波状である。拡散性色素は生成しな
い。

肉汁寒天斜面培養：良好な光沢のある拡布状の成育を
示し、不透明、無色を呈する。

肉汁液体培養：混濁状に成育し、弱い菌膜を形成す
る。沈澱は生じない。

肉汁ゼラチン穿刺培養：主として上部で生育し、液化
する。

リトマス・ミルク：リトマスの還元能は認められな
い。ペプトン化活性は認められるが凝固は認められな
い。

（ｃ）生理的性質 硝酸塩の還元：− 脱窒反応：− MR（メチルレッド）テスト：− VP（フォーゲス・プロスカウエル）テスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成（TSI寒天および酢酸鉛紙）：− デンプンの加水分解：− クエン酸の利用（コーゼル，クリステンセンおよびシ
モンズの各培地）：＋ 無機窒素源の利用 ｉ）硝酸カリウム：＋ ii）硫酸アンモニウム：＋ 色素の生成（キングA,Bおよびマンニット酵母エキス
寒天の各培地）：キングＢ培地で黄緑色の拡散性色素の
生成が認められる。キングＡおよびマンニット酵母エキ
ス寒天培地では、拡散性色素の生成は認められない。

ウレアーゼ：＋ オキシダーゼ：＋ カタラーゼ：＋ 成育の範囲 ｉ）pH:pH4.7〜10.0で成育するが、最適pHは7.2〜8.4。

培地：グルコース0.1％，イーストエキストラクト0.01
％，硫酸アンモニウム0.1％，食塩0.1％，硫酸マグネシ
ウム（７水塩）0.05％，リン酸バッファー0.1％Ｍ（別
滅菌）。

ii）温度:10〜34℃で成育するが最適温度は10〜30℃。

培地：肉汁液体培地。

酸素に対する態度：好気的 Ｏ−Ｆ（オキシダテイブーファーメンタテイブ）テス
ト［ヒュー・レイフソン（Hugh・Leifson）法］：酸化
型 糖からの酸，ガスの生成および糖の利用性： DNAのＧ＋Ｃ（グアニン−シトシン）含量:65.9％±1.
0％（Tm法） 多糖の分解能： カルボキシメチルセルロース：− コロイダルキチン：− アルギン酸ナトリウム：− トウィーン（Tween）80の分解：＋ 以上の菌学的性状を有するYK−310株を、バージーズ
・マニュアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオ
ロジー（Bergey′s Manual of Determinative Bacterio
logy）第８版およびインターナショナル・ジャーナル・
オブ・システマテイック・バクテリオロジー（Internat
ional Journal of Systematic Bacteriology）第30巻22
5〜420頁（1980年）、同第32巻146〜149頁（1982年）に
記載の種と照合すると、グラム陰性桿菌で、鞭毛による
運動性を示し、好気性で、カララーゼ陽性、オキシダー
ゼ陽性であり、DNAのＧ＋Ｃ含量あ65.9±1.1モル％であ
ることから、シュードモナス（Pseudomons）属に属する
と考えられた。

上記バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイテ
イブ・バクテリオロジーによれば、シュードモナス属
は、栄養要求性，ポリ・ベータ・ヒドロキシブチレート
の菌体内蓄積、DL−アルギニンの利用性および40℃にお
ける成育からセクションI,II,IIIおよびIVに分けられて
いる。

YK−310株の性質について追加実験し得られた結果を
第１表に示した。

^※＋：陽性，−：陰性^※※ スティナー（Stanier）の培地［ジャーナル・オブ
・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Journal of Gener
al Microbiology）43巻,159頁〜271頁（1966年）に記
載］を使用した。

YK−310株は、栄養要求性がなく、菌体内にポリ・ベ
ータ・ヒドロキシチレートを蓄積しないことから、セク
ションＩに属すると考えられた。

セクションＩには、10種の菌種が含まれている。YK−
310株は、蛍光性の色素を生成し、アルギニン・ジヒド
ロラーゼを有することから、シュードモナス・エルギノ
ーザ，シュードモナス・プチダ，シュードモナス・フル
オレッセンス，シュードモナス・クロロライフィス，シ
ュードモナス・オーレオファッシエンスのいずれかの菌
種に属するものと考えられた。

YK−310株は、脱窒反応において、シュードモナス・
エルギノーザおよびシュードモナス・クロロラフィスと
相違した。また、ゼラチンの加水分解、ショ糖の利用性
で、シュードモナス・プチダと、非蛍光性色素の生成
能，硝酸塩の還元においてシュードモノナス・オーレオ
ファッシエンスと相違した。YK−−310株の性質は、シ
ュードモナス・フルオレッセンスのそれと良く一致を示
したので、YK−310株を、シュードモナス・フルオレッ
センスと同定し、シュードモナス・フルオレッセンスYK
−310（Pseudomons fluorescens YK−310）と呼称する
ことにした。

上記シュードモナス・フルオレッセンスYK−310株
は、昭和61年７月３日から通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所（FRI,日本国茨城県筑波郡谷田部町東１
丁目１番３号）に受託番号FERM Ｐ−8833として寄託さ
れ、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられ
て、受託番号FERM BP−1369として同研究所に保管され
ている。また昭和61年６月24日から財団法人発酵研究所
（IFO,日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目17番85
号）にIFO 14516として寄託されている。

本発明に用いられるシュードモナス属細菌は一般にそ
の性状が変化しやすく、たとえば紫外線,X線，化学薬品
（例、ニトロソグアニジン，エチルメタンスルホン酸）
などを用いる人工変異手段で容易に変異しうるものであ
り、どの様な変異株であっても本発明の対象とするTAN
−866の生産能を有するものはすべて本発明に使用する
ことができる。

TAN−866生産菌の培養に際しては、炭素源としは、た
とえばグルコース，フラクトース，ガラクトース，ソル
ブル・スターチ，デキストリン，油脂類（例、大豆油，
オリーブ油など），有機酸類（例、クエン酸，コハク
酸，グルコン酸など）など菌が資化しうるものが適宜用
いられる。窒素源としては、とたえば大豆油粉，棉実
粉，コーン・グルテン・ミール，乾燥酵母，酵母エキ
ス，肉エキス，ペプトン，尿素などの有機窒素化合物が
利用できる。また、無機塩としては、たとえば塩化ナト
リウム，塩化カリウム，炭酸カルシウム，硫酸マグネシ
ウム，リン酸一カリウム，リン酸二ナトリウムなどの通
常細菌の培養に必要な無機塩類が単独もしくは適宜、組
合せて使用される。

また、硫酸第１鉄，硫酸銅などの重金属類，ビタミン
B₁,ビオチンなどのビタミン類なども必要に応じて添加
される。さらにシリコーンオイルやポリアルキレングコ
ールエーテルなどの消泡剤や界面活性剤を培地に添加し
てもよい。その他菌の発育を助け、TAN−866の生産を促
進するような有機物や無機物を適宜に添加してもよい。

培養方法としては、一般の抗生物質の生産方法と同様
に行なえばよく、固体培養でも液体培養でもよい。液体
培養の場合は静置培養，撹拌培養，振盪培養，通気培養
などいずれを実施してもよいがとくに通気撹拌培養が好
ましい。又培養温度はおよび15℃〜32℃の範囲が好まし
く、培地のpHは約５〜８の範囲でおよそ８時間〜168時
間、好ましくは24時間〜144時間培養する。

培養物から目的とするTAN−866を採取するには微生物
の生産する代謝物をその微生物の培養物から採取するの
に通常使用される分離手段が適宜利用される。たとえば
TAN−866は中性物質の性質を示し、主として培養ろ液中
に含まれるので、まず培養液にろ過補助剤を加えてろえ
過あるいは遠心分離によって菌体を除去し、得られた培
養ろ液を水と混和しない有機溶媒で有効成分を抽出する
抽出法，あるいはろ液を適宜の担体に接触させてろ液中
の有効成分を吸着させ、次いで適宜の溶媒で有効物質を
脱着させ、分別採取するクロマトグラフィー法などが有
利に利用される。クロマトグラフィーの担体としてはシ
リカゲル、粉末セルロース、吸着性樹脂など化合物の吸
着性の差を利用、あるいは分子ふるい性担体類など化合
物の分子量の差を利用するものが有利に用いられる。こ
れら担体から目的とする化合物を溶出するためには担体
の種類、性質によって組み合せが異なるが、たとえば有
機溶媒，水溶性有機溶媒の含水溶液すなわち、含水アセ
トン、含水アルコール類などが適宜組み合わせて用いら
れる。また、これらのクロマトグラフィーによって得ら
れた本化合物の粗物質を分取用逆相系高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）に付し、さらに精製する事もでき
る。

さらに詳しく述べるならば、担体として吸着性樹脂た
とえばアンバーライトンXAD−II（ローム・アンド・ハ
ース社製，米国），タイアイオンHP−10,HP−20およびS
P−207（三菱化成工業株式会社製）などを用いるとろ液
中の活性物質は吸着され、有機溶媒と水溶液の混合液す
なわちアセトンあるいはメタノールなどを適宜含有させ
た水または塩類あるいは酸含有の水溶液もしくは緩衝液
などとの混合液で溶出される。

またTAN−866は水溶液中から水と分離し得る有機溶媒
たとえばｎ−ブタノール,iso−ブタノール,n−アミルア
ルコール,iso−アミルアルコールなどで抽出される。さ
らにTAN−866Aはシリカゲルたとえばキーゼルゲル60
（メルク社製，***）あるいは分子ふるい性担体たとえ
ばセファデックスLH−20（ファルマシア社製，スウェー
デン）などの担体に吸着され、適当な有機溶媒たとえば
クロロフォルム，酢酸エチル，アセトン，アルコール類
（例、メタノール等）あるいはこれらの混合溶媒によっ
て溶出される。

逆相系HPLCに用いられる担体としてはたとえばYMCゲ
ル（山村化学研究所製）が挙げられ、移動相としてはメ
タノールあるいはアセトニトリルなどと緩衝液との混合
液などが用いられる。TAN−866の精製には以上述べた方
法の組み合わせの他に濃縮，晶出，凍結乾燥など通常の
実験室で用いられる方法が随時組み合わされる。

TAN−866は三価の鉄錯体として培養液中に存在し、そ
のままの形態で上述した方法により精製，単離される
が、単離された鉄錯体は通常の鉄イオン除去剤たとえば
８オキシキノリンを用いて、あるいは強酸性イオン交換
樹脂たとえばアンバーライトIR−120（ローム・アンド
・ハース社製，米国），ダウエックス50W（ダウ・ケミ
カル社製，米国）などを用いて、TAN−866の鉄遊離体に
変えることができる。またデアシルTAN−866についても
同様の方法により、鉄遊離体に変えることができる。さ
らに、TAN−866の遊離体の水溶液に三価の鉄イオン化合
物、たとえば塩化第２鉄あるいは硫酸第２鉄などを加え
るとTAN−866が得られる。

後述する実施例１および２で得られたTAN−866A,B,C
およびＤの物理化学的性状は下記のとおりである。

TAN−866 １）外観：赤橙色固体 ２）比旋光度：▲［α］²⁵ _D▼＋170゜（ｃ＝0.1,水中） ３）分子式:C₅₁H₈₂N₁₃O₁₉Fe ４）元素分析値（％）：五酸化リン上で40℃,6時間乾燥
した試料（水５モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 45.86 46.15 H, 6.67 6.99 N, 13.68 13.72 O, 28.93 Fe, 5.0 4.21 ５）分子量測定値:SI−MS法による m/z 1237（Ｍ＋Ｈ）^＋ ６）紫外部および可視部吸収（UV＆VS）スペクトル： ７）紫外部吸収（IR）スペクトル：臭化カリウム（KB
r）中，主な吸収を示す。（第１図） 3350,2950,1750,1660,1530,1460,1380,124,1040,980,
720,550（cm^-1） ８）構成アミノ酸組成： ａ）6N塩酸中,110℃,15時間加水分解した 試料：セリン（２モル），グリシリン（３モル），アラ
ニン（１モル），バリン（１モル） ｂ）57％ヨウ化水素酸中,100℃,15時間加水分解した試
料：セリン（２モル），グリシン（３モル），アラニン
（１モル），バリン（１モル），オルニチン（３モル） ９）HPLC:担体;YMCパックA312（山村化学研究所製），
移動相;36％CH₃CN水，流速;2ml/min,Rt＝5.3（min.） 10）溶解性： 可溶；水，ジメチルスルフォキサイド，メタノール 難溶;n−ヘキサン，ジエチルエーテル 11）物質の区分：中性物質 TAN−866B １）外観：赤橙色固体 ２）比旋光度：▲［α］²⁵ _D▼＋164゜（ｃ＝0.1,水中） ３）分子式:C₅₁H₈₂N₁₃O₁₉Fe ４）元素分析値（％）：五酸化リン上で40℃,6時間乾燥
した試料（水６モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 45.07 45.00 H, 6.88 6.96 N, 13.47 13.38 O, 30.56 Fe, 3.0 4.10 ５）分子量測定値:SI−MS法による m/z 1253（Ｍ＋Ｈ）^＋ ６）紫外部および可視部吸収（UV＆VS）スペクトル： ７）紫外部吸収（IR）スペクトル：臭化カリウム（KB
r）中，主な吸収を示す。（第２図） 3370,2930,1750,1660,1530,1470,1380,123,1040,980,
720,560（cm^-1） ８）構成アミノ酸組成： ａ）6N塩酸中,110℃,15時間加水分解した 試料：セリン（３モル），グリシリン（３モル），バリ
ン（１モル） ｂ）57％ヨウ化水素酸中,100℃,15時間加水分解した試
料：セリン（３モル），グリシン（３モル），バリン
（１モル），オルニチン（３モル） ９）HPLC:担体;YMCパックA312（山村化学研究所製），
移動相;36％CH₃CN水，流速;2ml/min,Rt＝4.7（min.） 10）溶解性： 可溶；水，ジメチルスルフォキサイド，メタノール 難溶;n−ヘキサン，ジエチルエーテル 11）物質の区分：中性物質 TAN−866C １）外観：赤橙色固体 ２）比旋光度：▲［α］²⁵ _D▼＋187゜（ｃ＝0.1,水中） ３）分子式:C₅₁H₈₄N₁₃O₁₉Fe ４）元素分析値（％）：五酸化リン上で40℃,6時間乾燥
した試料（水４モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 47.29 47.20 H, 7.12 7.01 N, 13.88 13.76 O, 27.81 Fe, 4.3 4.22 ５）分子量測定値:SI−MS法による m/z 1251（Ｍ＋Ｈ）^＋ ６）紫外部および可視部吸収（UV＆VS）スペクトル： ７）紫外部吸収（IR）スペクトル：臭化カリウム（KB
r）中，主な吸収を示す。（第３図） 3400,2930,1750,1660,1540,1470,1380,1240,1020,98
0,730,560（cm^-1） ８）構成アミノ酸組成： ａ）6N塩酸中,110℃,15時間加水分解した 試料：セリン（２モル），グリシリン（３モル），アラ
ニン（１モル），バリン（１モル） ｂ）57％ヨウ化水素酸中,100℃,15時間加水分解した試
料：セリン（２モル），グリシン（３モル），アラニン
（１モル），バリン（１モル），オルニチン（３モル） ９）HPLC:担体;YMCパックA312（山村化学研究所製），
移動相;36％CH₃CN水，流速;2ml/min,Rt＝5.8（min.） 10）溶解性： 可溶；水，ジメチルスルフォキサイド，メタノール 難溶;n−ヘキサン，ジエチルエーテル 11）物質の区分：中性物質 TAN−866D １）外観：赤橙色固体 ２）比旋光度：▲［α］²⁵ _D▼＋176゜（ｃ＝0.1,水中） ３）分子式:C₅₁H₈₄N₁₃O₁₉Fe ４）元素分析値（％）：五酸化リン上で40℃,6時間乾燥
した試料（水４モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 47.10 47.20 H, 7.07 7.01 N, 13.80 13.76 O, 27.81 Fe, 4.2 4.22 ５）分子量測定値:SI−MS法による m/z 1251（Ｍ＋Ｈ）^＋ ６）紫外部および可視部吸収（UV＆VS）スペクトル： ７）紫外部吸収（IR）スペクトル：臭化カリウム（KB
r）中，主な吸収を示す。（第４図） 3400,2940,1750,1660,1530,1370,1240,1010,980,730,
560（cm^-1） ８）構成アミノ酸組成： ａ）6N塩酸中,110℃,15時間加水分解した 試料：セリン（２モル），グリシリン（３モル），アラ
ニン（１モル），バリン（１モル） ｂ）57％ヨウ化水素酸中,100℃,15時間加水分解した試
料：セリン（２モル），グリシン（３モル），アラニン
（１モル），バリン（１モル），オルニチン（３モル） ９）HPLC:担体;YMCパックA312（山村化学研究所製），
移動相;36％CH₃CN水，流速;2ml/min,Rt＝6.2（min.） 10）溶解性： 可溶；水，ジメチルスルフォキサイド，メタノール 難溶;n−ヘキサン，ジエチルエーテル 11）物質の区分：中性物質 さらに、前記TAN−866A,B,CおよびＤの¹H NMRスペク
トル（重水中,400MHz,δppm,JEOL GX−400）はそれぞ
れ第5,6,7および８図に示すとおりである。

TAN−866各成分の構成アミノ酸中オルニチンが各３モ
ル検出されるが、これらのデータと¹H NMRスペクトル
［COSY法（¹H−¹H）］の結果からTAN−866AおよびＢ中
には３個のN⁵−アセチル−N⁵−ハイドロキシ−オルニチ
ンが含まれており、またTAN−866CおよびＤ中には２個
のN⁵−アセチル−N⁵−ハイドロキシ−オルニチンと１個
のN⁵−プロピオニル−N⁵−ハイドロキシ−オルニチンが
含まれていることが推定される。該アミノ酸のＮ−水酸
基は３価の鉄イオンが存在するとＮ−ハイドロキシアニ
オン となって３個で鉄イオン１個と配位することが知られて
いる［ジャーナル・オブ・アンチビオティクス（J.Anti
biotics），24,830,（1974）］。

TAN−866Aを塩基性水溶液中20℃ないし60℃、好まし
くは25℃ないし50℃で30分ないし８時間、好ましくは１
時間ないし４時間撹拌あるいは放置するとTAN−866Aの
分子中に存在するラクトン基が加水分解され、カルボン
酸体が得られる。該化合物はダイアイオンHP−20などの
クロマトグラフィーで精製され、モノナトリウム塩（C
₅₁H₈₃N₁₃O₂₀FeNa）として単離された。

上記カルボン酸体をシュードモナス・アシドボランス
（Pseudomonas acidovorans）IFO 13582の菌体中に含
まれるアミダーゼを用いて加水分解すると脂肪酸部分が
除去され、アミノ酸のみで精製される鎖状の鉄配位ペプ
チド，デアシルTAN−866A（C₄₁H₆₈N₁₃O₁₉Fe）が得られ
る。該酵素反応はpH3ないし９、好ましくはpH5ないし８
のリン酸バッファー中で行なわれ、反応温度は25℃ない
し45℃、好ましくは30℃ないし40℃で、反応時間は５時
間なしい30時間、好ましくは10時間ないし25時間であ
る。基質に対する素酵素の濃度は重量比で５ないし15倍
量、好ましくは８ないし12倍量が用いられる。

後述する参考例１で得られたデアシルTAN−866Aの物
理化学的性状は以下に示す通りである。

１）外観：赤橙色固体 ２）分子量測定値:m/z 1103（Ｍ＋Ｈ）^＋ （SI−MS
法） ３）元素分析値： 実測値 計算値^※ C, 40.19 40.07 H, 6.37 6.72 N, 14.34 14.82 O, 33.85 Fe, 4.0 4.54 ^＊ （水分子７モルを含むとして計算） ４）分子式:C₄₁H₆₈N₁₃O₁₉Fe ５）可視部吸収スペクトル（メタノール中）： ６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム中主な吸収 3380,3070,2950,1660,1590,1540,1470,1380,1240,105
0,980,790,730,560（cm^-1） ７）溶解性： 可溶；水，ジメチルスルフォキサイド，メタノール 難溶；酢酸エチル，クロロフォルム ８）物質の区分：両性物質 次に、TAN−866B,CおよびＤを上記加水分解に付す
と、それぞれ対応したデアシル体が得られた。これら化
合物のHPLCとSI−MSのデータを下記に示す。

^※カラム:ODS,YMC−Pack Ａ−312,移動相:8％アセトニ
トリル/0.01Mリン酸バッファー（pH6.3），流速:2ml/mi
n,検出法:214nm またこれらの化合物のアミノ酸組成は対応するTAN−8
66A,B,CおよびＤのそれらと同一であった。

以上述べたデータおよび以下に述べる方法によりTAN
−866の化学構造は式（Ｉ）のとおり決定された。すな
わち脂肪酸部分はTAN−866各成分およびそれらに対応す
るデアシル体のSI−MS法によるデータおよび¹H NMRス
ペクトル［COSY法（¹H−¹H）］のデータからすべて、CH
₃（CH₂）₅CH＝CHCH₂CO−であることが判明した。次に、
各デアシル体をアミノ酸シークエンサー（Amino acid s
equencer）に付すことによりＣおよびＮ−末端アミノ酸
を含む各アミノ酸の配列順序が決定した。また、TAN−8
66各成分はラクトン体であるが、これはＣ−末端アミノ
酸とセリンの水酸基によって形成され、その位置はTAN
−866各成分の¹H NMRスペクトル［NOE法］データから
確認された。

次にTAN−866およびその鉄遊離体の生物学的性状につ
いて述べる。TAN−866の各種細菌に対する抗菌活性は、
第２表に示す通りである。

（注１）培地として、バクト・アンテイビオテイック・
メディウム３（デイフコ・ラボラトリーズ，米国）;17.
5g,バクト・イースト・エキストラクト（デイフコ・ラ
ボラトリーズ，米国）;5.0g,バクト・アガー（デイフコ
・ラボラトリーズ，米国）;20g,蒸留水;1000ml（pH無調
整）を用い、接種菌液として約10⁶コロニー・フォーミ
ング・ユニット/mlを用いた。

また、TAN−866およびその鉄遊離体のシュードモナス
・エルギノーサＰ−９を用いた実験的マウス感染症にお
ける皮下投与による治療効果は第３表に示すとおりであ
る。

さらに、TAN−866Aを1000mg/kgでマウスに腹腔内投与
あるいは経口投与しても急性毒性は全く認められなかっ
た。

これらのデータから明らかなようにTAN−866およびそ
の鉄遊離体は主としてグラム陰性菌に体して抗菌性を示
し、哺乳動物などに毒性を示さない抗生物質であると言
える。したがってTAN−866またはその鉄遊離体はヒトお
よび家畜（例、牛，馬，豚等），家禽（例、ニワトリ
等）などの細菌感染症の治療に用いることが出来る。

TAN−866またはその鉄遊離体をたとえば緑濃菌感染症
の治療薬として用いるには、たとえばTAN−866またはそ
の鉄遊離体を生理的食塩水に溶解して注射剤として非経
口的に皮下または筋肉内に0.1〜20mg/kg/日，好ましく
は0.5〜10mg/kg/日投与する。また経口剤として、TAN−
866またはその鉄遊離体を乳糖と混合してカプセル剤と
し、TAN−866またはその鉄遊離体として0.5〜100mg/kg/
日、好ましくは２〜50mg/kg/日投与する。

またデアシルTAN−866は、その構造中にアミノ基およ
びカルボキシル基を有しており、炭素数１ないし20の脂
肪酸ハライド（例、塩化ミリスチル，塩化リノレイニ
ル，塩化カプリル等）と弱アルアリ溶液中で反応させる
ことにより、Ｎ−アシル誘導体を製造することができ
る。このようにして得られたＮ−アシル化合物は、適当
な溶媒（例、DMF）中で縮合反応試薬（例、DCC）によ
り、あるいは反応溶液を酸性化することによりラクトン
化される。かくして得られた新規化合物は、たとえば抗
緑濃菌活性を有すると予想される。

上記のように、TAN−866は新規医薬品の合成原料とし
ても有望な化合物である。

実施例 以下に実施例および参考例をもってさらに詳細に本発
明の内容を説明するが、これによって本発明が限定され
るものではない。なおパーセントは、特にことわりのな
いかぎり重量／容量％を示す。

実施例１ 栄養寒天斜面上に成育させたシュードモナス・フルオ
レッセンスYK−310（FERM BP−1369:IFO 14516）の菌
株を、グルコース２％，ソルブル・スターチ３％，生大
豆粉１％，コーン・スティープ・リカー0.3％，ポリペ
プトン（大五栄養化学社製）0.5％，食塩0.3％を含有す
る水溶液（pH7.0）に沈降性炭酸カルシウム0.5％を添加
した培地500mlを含む２容坂口フラスコに接種して、2
4℃で48時間往復振盪培養した。この培養液全量を上記
培地に消泡剤アクトコール（武田薬品工業社製）0.05％
を添加した培地120を含む容量200のタンクに接種
し、24℃で通気量120／分,180回転／分の条件下で、4
8時間培養した。この培養液50をグリセリン２％，グ
ルコース0.5％，ポリペプトン0.5％，肉エキス（和光純
薬工業社製）0.5％，食塩0.1％，酵母エキス（大五栄養
化学社製）0.1％を含有する水溶液（pH6.5）にアクトコ
ール0.05％を添加した培地1200を含む容量2000のタ
ンクに接種し、17℃で通気量1200／分,150回転／分の
条件下で42時間培養した。

かくして得られた培養液をハイフロ・スーパーセル
（ジョンズ・マンビル社製，米国）を用いてろ過。ろ液
（1300）をダイアイオンHP−20（50）のカラムクロ
マトグラフィーに付した。活性物質を80％メタノール水
（350）で溶出し、溶出液を濃縮し、メタノールを留
去した。水層部（30）をpH7に調整後、イソ−ブタノ
ール（20）で抽出した。抽出液を２％炭酸水素ナトリ
ウム溶液,0.05N塩酸水などで洗滌後、イソ−ブタノール
層を濃縮した。濃縮液（３）をｎ−ヘキサン（10）
中に加え、沈澱物を得た。上澄液をデカンテーションで
分離し、さらにｎ−ヘキサン（３）を加えて、TAN−8
66Aが含まれる粗物質（21.1g）が得られた。粗物質（2
0.5g）を50％メタノール水に溶解し、ダイアイオンHP−
20（50−100メッシュ,1）のカラムクロマトグラフィ
ーに付し、60％メタノール水（６）でカラムを洗滌
後、70％メタノール水（６）で抗菌性物質を溶出，分
画した。溶出分画を濃縮し、残渣を少量のメタノールに
溶かし、エーテル溶液中に加えると粉末（532mg）が得
られた。同様に処理して得られた粉末（1g）をメタノー
ル（20ml）にとかしてセファデックスLH−20（１）の
カラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出し
た。溶出液の濃縮残渣（530mg）を水（10ml）にとか
し、ダイアイオンHP−20（50−100メッシュ,200ml）の
クロマトグラフィーで精製した。得られた精製粉末（27
4mg）はHPLCのピークパターンから近接した化合物の混
合物と推定された。そこでこの粉末（250mg）を分取用
逆相系HPLC（カラム:YMCパックSH343;移動相:30％アセ
トニトリル／水）に付し、主成分のピーク部分を採取
し、濃縮後TAN−866Aの赤橙色粉末（64mg）を得た。

実施例２ 実施例１と同様のスケールで培養，ろ過,HP−20カラ
ムクロマトグラフィー，イソ−ブタノール抽出を行った
後、抽出液の濃縮液（３）をシリカゲル（1.5）の
クロマトグラフィーに付した。イソ−ブタノール（4.5
），イソ−プロパノール（4.5），イソ−プロパノ
ール：メタノール（1:1）（4.5）でカラムを洗滌後、
メタノール（4.5）で溶出した溶出液を濃縮乾固し、
粉末（10.6g）を得た。この粉末中にはTAN−866A（3.5
g）が含まれていることがHPLCによって定量された。

次に上記と同様に処理して得られた粉末31gを50％メ
タノール水（１）に溶解し、ダイアイオンHP−20（10
0〜200メッシュ,1）のカラムクロマトグラフィーに付
した。カラムを50％メタノール水（３）および60％メ
タノール水（１）で洗滌後、70％メタノール水（３
）および75％メタノール水（２）で抗菌性物質を溶
出，分画した。各分画を濃縮，凍結乾燥し、粉末Ｉ（Ａ
の含量67％,7.6g），粉末II（Ａの含量48％,8.0g）およ
び粉末III（Ａの含量34％,4.4g）を得た。

次に粉末Ｉ（7.5g）を分取用逆相系液体クロマトグラ
フィーに付した。カラムはYMCパックＲ−355（25/44）
（山村化学研究所製）を用い、溶媒系32％アセトニトリ
ル水で抗生物質を溶出した。各フラクションを分析用高
速液体クロマトグラフィーにより各成分量を定量し、濃
縮，凍結乾燥すると成分ＡおよびＢが含まれる粉末（1.
7g），成分Ａのみが含まれる粉末（2.2g），成分A,Cお
よびＤが含まれる粉末（0.33g）を得た。ＡおよびＢが
含まれる粉末を再度分取用液体クロマトグラフィー（カ
ラム:YMCパックＳ−363 Ｉ−15,溶媒系は上記の分取用
HPLCと同じ）に付し、成分Ａ（1.15g），成分Ｂ（209m
g）を赤橙色粉末として単利した。また成分A,CおよびＤ
を含む粉末を同様に処理して成分Ｃ（70mg）および成分
Ｄ（150mg）を赤橙色粉末として得た。

実施例３ 実施例１で得られたTAN−866Aの精製粉末（40mg）を
水（2ml）にとかし、８−オキシノリン（40mg）のメタ
ノール（2ml）溶液を加えた。反応液を４℃で15時間放
置後、生じた黒色沈澱物をろ紙でろ過した。ろ液中のメ
タノールを留去後、水（20ml）を加えて、クロロフォル
ム（10ml）で４回洗浄した。水槽部を濃縮、凍結乾燥
し、TAN−866Aの鉄遊離体（29mg）を白色粉末として得
た。

分子式:C₅₁H₈₅N₁₃O₁₉ 元素分析値（％）：（五酸化リン上,60℃で８時間乾燥
した試料，水３モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 49.33 49.47 H, 7.45 7.41 N, 14.78 14.70 O, 28.42 分子量測定値:SI−MS法による m/z 1184（Ｋ＋Ｈ）^＋ UVスペクトル：（水中） 末端吸収 IRスペクトル：（KBr中）主の吸収を示す。

3300,2930,1640,1520,1230,570（cm^-） 実施例４ 実施例３と同様の方法により、実施例２で得られたTA
N−866B,C,Dの精製粉末（それぞれ20mg,10mg,20mg）か
ら、TAN−866B,C,Dの鉄遊離体を白色粉末（それぞれ20m
g,8mg,19mg）として得た。

TAN−866B鉄遊離体 分子式:C₅₁H₈₅N₁₃O₂₀ 元素分析値（％）：（五酸化リン上,60℃で８時間乾燥
した試料，水2.5モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 49.03 49.19 H, 7.24 7.28 N, 14.59 14.67 分子量測定値:SI−MS法による m/z 1200（Ｋ＋Ｈ）^＋ UVスペクトル：（水中） 末端吸収 IRスペクトル：（KBr中）主の吸収を示す。

3300,2940,1665,1530,1240,590（cm^-） TAN−866C鉄遊離体 分子式:C₅₂H₈₇N₁₃O₁₉ 元素分析値（％）：（五酸化リン上,60℃で８時間乾燥
した試料，水3.5モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 49.36 49.51 H, 7.21 7.35 N, 14.26 14.38 分子量測定値:SI−MS法による m/z 1198（Ｋ＋Ｈ）^＋ UVスペクトル：（水中） 末端吸収 IRスペクトル：（KBr中）主の吸収を示す。

3300,2940,1665,1530,1235,590（cm^-） TAN−866D鉄遊離体 分子式:C₅₂H₈₇N₁₃O₁₉ 元素分析値（％）：（五酸化リン上,60℃で８時間乾燥
した試料，水３モルを含むとして計算） 実測値 計算値 C, 49.71 49.87 H, 7.22 7.48 N, 14.41 14.54 分子量測定値:SI−MS法による m/z 1198（Ｋ＋Ｈ）^＋ UVスペクトル：（水中） 末端吸収 IRスペクトル：（KBr中）主の吸収を示す。

3400,2940,1665,1530,1240,590（cm^-） 参考例１ TAN−866A（150mg）0.05Mリン酸バッファー（pH9.150
ml）に溶解し、40℃で２時間撹拌した。反応液をダイア
イオンHP−20（20ml）（三菱化成社製）のカラムクロマ
トグラフィーに付し、50％メタノール水で溶出した。溶
出液を濃縮，乾固するとTAN−866Aのカルボン酸体がナ
トリウム塩として得られた［SI−MS:m/z 1277（Ｍ＋
Ｈ）⁺,分子式:C₅₁H₈₃N₁₃O₂₀FeNa］。

上記カルボン酸体（150mg）をシュードモナス属菌の
生産するアミダーゼ粗酵素（1.5g）を含む0.05Mリン酸
バッファー（pH7,150ml）中に加え、37℃で18時間撹拌
した。反応液を遠心分離し、上清液をpH2.5に調整し、
酢酸エチルで抽出した。抽出液には脂肪酸が含有されて
いる。水層をダイアイオンHP−20（50−100メッシュ,30
ml）のカラムクロマトグラフィーに付し、５〜20％メタ
ノール水で溶出分画した。ペプチドを含む画分を濃縮，
乾固するとデアシルTAN−866Aの赤橙色粉末（97mg）が
得られた。

参考例２ 参考例１と同様の方法でTAN−866B（10mg）,C（2mg）
またはＤ（10mg）を加水分解すると、対応するデアシル
TAN−866B（5mg）,C（1.5mg）またはＤ（5.7mg）が得ら
れた。

発明の効果 シュードモナス属に属する菌が産生する鉄含有ペプチ
ドTAN−866およびその鉄遊離体は、主としてグラム陰性
菌に対し抗菌作用を有し、哺乳動物，家禽等の緑濃菌感
染症などの治療剤として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図および第５〜８図は実施例１および２で得ら
れたTAN−866A,B,CおよびＤの赤外部吸収スペクトル（K
Br法）および¹H−NMRスペクトルをそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:39） Ｃ０７Ｋ 103:00

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 ［式中、R₁は水素または水酸基を、R₂,R₃およびR₄は水
   素またはメチル基を示す。ただし、（１）R₁が水素であ
   る時は、R₂,R₃およびR₄は水素であるか、またはR₂,R₃お
   よびR₄のうち２つは水素であり残り１つはメチルであ
   り、（２）R₁が水酸基である時は、R₂,R₃およびR₄は水
   素である。］で表される化合物またはその鉄遊離体。
2. 【請求項２】シュードモナス属に属し、一般式 ［式中、R₁は水素または水酸基を、R₂,R₃およびR₄は水
   素またはメチル基を示す。ただし、（１）R₁が水素であ
   る時は、R₂,R₃およびR₄は水素であるか、またはR₂,R₃お
   よびR₄のうち２つは水素であり残り１つはメチルであ
   り、（２）R₁が水酸基である時は、R₂,R₃およびR₄は水
   素である。］で表される化合物のうち少くとも１種を生
   産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に
   該化合物を生産蓄積せしめ、これを採取し、必要に応じ
   て鉄遊離反応に付すことを特徴とする前記式で表される
   化合物またはその鉄遊離体の製造方法。
3. 【請求項３】一般式 ［式中、R₁は水素または水酸基を、R₂,R₃およびR₄は水
   素またはメチル基を示す。ただし、（１）R₁が水素であ
   る時は、R₂,R₃およびR₄は水素であるか、またはR₂,R₃お
   よびR₄のうち２つは水素であり残り１つはメチルであ
   り、（２）R₁が水酸基である時は、R₂,R₃およびR₄は水
   素である。］で表される化合物のうち少くとも１種を生
   産する能力を有するシュードモナス・フルオレッセン
   ス。