SU1523046A3 - Способ очистки человеческого @ -интерферона - Google Patents
Способ очистки человеческого @ -интерферона Download PDFInfo
- Publication number
- SU1523046A3 SU1523046A3 SU833593070A SU3593070A SU1523046A3 SU 1523046 A3 SU1523046 A3 SU 1523046A3 SU 833593070 A SU833593070 A SU 833593070A SU 3593070 A SU3593070 A SU 3593070A SU 1523046 A3 SU1523046 A3 SU 1523046A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- solution
- interferon
- column
- crude
- blue
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к медицине и может быть использовано дл очистки человеческого β-интерферона. Цель - повышение производительности процесса. Раствор сырого интерферона пропускают через обездвиженный синий агарозный гель, элюируют и элюат дополнительно пропускают через хелатметаллический носитель с остатком хелатировани , включающим по меньшей мере ион одного металла из группы CO+2, NI+2, ZN+2. PH контактировани с синим агарозным гелем 5-9.
Description
Изобретение относитс к медицине, а именно к способу очистки человеческого интерферона, особенно человеческого (5-интерферона.
Цель изобретени - повышение производительности процесса.
Способ осуществл ют следующим образом .
Сырой интерферон, полученный в результате де тельности клеток человека , обрабатывают обездвиженным синим носителем, ИнтерЛерон, поглощенный на обездвиженном синем носителе, элюируют элюентом. Затем отбираемый раствор интерферона обрабатывают хелат- металлическим носителем с остатком хелатировани , включаюш5 м по меньшей мере ион одного металла, выбранный
14 24из группы, состо щей из Со , Ni и Zn . Интерферон, поглощенный на хе- латметаллическом носителе, отдел ют от носител , получа препарат интерферона большой чистоты и высокой Кон- центрации.
Раствор сырого интерферона сначала привод т в контакт с обездвиженным синим носителем, .
Синий краситель можно обездвиживать на любом из разнообразных обычно йс- пользуемых носителей, способном соедин тьс с красителем. В число таких носителей вход т (А) соединение красител через амино-группу антрахи1юно- вой части с агарозой, активированной бромистым цианом; (в) соединение красител с гелем поперечно св занной агарозы способом триазинового соединени через эфирную св зь; (с) соединение синего декстрана R (декстран, соединенный с синим красителем, фирма Фармесиэ) с агарозой, активированной бромистым цианом методом триазинового соединени ; (д) соединение синего красител , св занного с
сд to
со
о
4
О
СМ
315
боковой цепью Аффиа-гел 10® Кфирмы Био-Рад лэб. именуемой ниже Вио-Рад ) через пептидную св зь с полисахаридным носителем. Можно также использовать другие носители, например поперечно св занный дёкстрано- вый гель, например Сефадекс , (фирма Фармесиэ), и виниловый полимер с гидроксильными группами, который также можно использовать как носитель дп дл хелатметаллической хроматог- раЛии в следующей стадии, предпочтителен гидрофшп Ш;,1Й гранулированный полимер, например, Тойопёрл,; (фирма Тойо сода комп.).
Предпочтительно использовать синий агарозовый гель, соответствующий. I;B), так как он весьма эффективно св зываетс с интерфероном, не вызывает отделени красител от носител , поскольку соединение красител с носителем вл етс весьма стабильным в услови х рН от 6 до 13, и он легко доступен на рынке. Этот синий агарозо вый гель имеет следующую структуру и реализуетс под товарным наименованием сефароз СЪ-бв {фирма Фармесиэ ) Матрекс гель блу А® (фирма Амикон корп .) и Аффи-гель блу® (фирма Вио-Рад)
О NH-i
SOaH .,.,
TSIH N. /
t NH4ON Поперечно свN . занный агаро80зН О вый
гель
Дл контактировани обездвиженного синего носител с раствором сырого интерферона можно использовать либо порционный метод, либо колонный способ.
Пример 1. Раствор сырого интерферона бып получен путем обработки человеческих фибробластовых клеток в среде MEM Игла, содержавшей 0,4% метилцеллюлозы с поли 1; поли С, с последующей обработкой цикло- гексимидом и актиномипином Д,
К 30 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 6,2 и10 имфедо бьшо добавлено 21 мг белка и 100 мкг, актиномицина Д на 1 л 30 мл гел синей агарозы (Аффи- гель блу® фирмы Вио-Рад). После перемешивани в течение 40 ч и вы-
держивани в течение 3 ч надосадоч- на жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой физиологическим раствором, содержащим фосфатнокислотный буфер Надосадочна жидкость была извлечена снова. Колонну дважды промывали и элюировапио Использовали следую щие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (320 мл):
раствор 1,0 М хлористого натри , содержащий 10 мМ фосфор- . нокислого натри fpH 7,2) второй промывочный раствор (280 мл):
25%-ный раствор этиленгликол , содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри и 1,0 М хлористого натри (рН 7,2) элюент (400 мл):
55%-ный раствор этиленгликол , содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри и 1,0 М хлористого натри (рН 7,2)о
Получен выход частично очищенного интерферона в элюате(300 мл) 81% от исходного раствора интерферона, очищение в 33 раза.
В колонну с хелатом цинка (10 мп) элюат (285 мл) и колонны гел синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мл/г„ После двойной промывки колонну элюировалио Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (300 мл):
дистиллированную воду и О,Г М фосфорнокислого натри (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/г в течение 1 ч поочередно
второй промывочный раствор (50 мл)г 20 мМ раствор лимоннокислого натри (рН 5,0) элюент;
0,1М буферный раствор уксусна кислота - уксуснокислый натрий (рН 4,5).
Выкод хелатцинковой хроматографии 87%, а общий выход 70%„ Достигнута очистка э 330 раз.
Активность и выход интерферона, количество белка и удельна активность каждой стадии показаны в табл.1,
Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакриламид ного гел о
Часть конечного элюа та подвергли диализу в присутствии додецилсульфата натри (НДС) и лиофилировалио Поле восстановлени лиофилированного диализата 2-меркаптоэтанолом восстановленный материал подвергли электрофорезу с использованием полиакрил- амидного гел в присутствии НДС согласно способу Лэмпи (Нейчэр, 227, 680-635 (1970)) дл проведени аналза активности интерферона и красител с о о.. 00 а блест щей синью R 200. В результате активность интерферона и теммо-син полоса были обнаружены только в положении, соответствовавшем молекул рному весу примерно 23000 о
Анализ актиномицина Д„
Анализ актиномицина Д был проведен способом биологической пробы
Часть конечного элюата обессолили путем гель-хроматографии, использу Сефадекс G 25® после добавлени сывроточного альбумина человека (1 мг/мл). Добавл дополнительно небольшое количество сывороточного альбумина человека и лактозы обессоленный злюат профильтровали через фильтр 2 мкм и лиофилировали, Акти- номицин Д был обнаружен в количестве не больше 0,0003 мкг/10 иМаед активности интерферона,
Элюат из колонны гел синей агаро зы содержал; 0,7 мкг/м актиномицина До Общее количество актиномицина Д составило 210 мкг. Кроме того, присутствие актиномицина Д в элюате из колонны гел синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 нм) и путем биопробыо
Часть элюата из колонны гел синей агарозы обессолили способом гель хроматографии с использованием Сефадекс G-25® после добавлени человеческого сывороточного альбумина. Удал этиленгликоль, обессоленный элюат лиофилировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/10 имоедо интерферонной активности актиномици- на Д.
Пирогенное испытание на кроликах
Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилирован ный материал инъектировали внутривенно трем кроликам ( иМоед./кг
массы кроликаJ, Суммирование пирек- сии дл всех трех кроликов было 0,6 С. Интерферон, очищенный по предлагаемому способу, оказалс отрицательным к пирогенному испытанию на кроликахо
Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны гел синей агарозы, инъектировали внутривенно
трем кроликам ( ед/кг массы
кролика/о Суммирование пирексии дл
всех трех кроликов было 1,5 С, Интерферон , очищенный согласно способу хроматографии синей агарозы, оказалс неопределенно отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах
Пример 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интер- ферона, подобный использовавшемус в примере 1.
20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей агарозы объемом 20 мл (Матрекс гель блу А® , фирмы .Амикон корп). Колонну трижды промыли и элюировалио Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (200 мл):
1 М хлористый натрий, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри (рН 7,2). второй промывочный раствор (200 мл):
25%-ный раствор этиленгликол , содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри и 1 М хлористого натри (рН 7,2). третий промывочный раствор (40 мл);
40%-ный раствор этиленгликол , содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри и 1 М хл&ристого натри (рН 7,2). элюент (200 мл):
55%-ный раствор этиленгликол , содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри и 1 М хлористого нат- ри о
Хелатцинковую колонну (5 мл) соединили с выходом колонны синей агарозы после начала элюировани , и элюат из колонны синей агарозы непосред- ственно пропускали через хелатцинко- вую колоннуо Затем хелатцинковую колонну дважды промыли и элюировалн Промыв очные растворы и элюент были следующими:
первый промывочный раствор (200 мл);
дистиллированна вода и 0,1 М фосфорнокислого натри (рН 6,7) поочередно второй промывочный раствор (20 мл)
.20 мМ лимоннокислый натрий (рН 5,0): элюент:
0,2 М буферный раствор уксусна кислота - уксуснокислый на грий, содержащий 1 М хлористого натри .
Интерферонна активность, выход, количество белка и удельна активность каждой стадии показаны в табло2,
П р и М е р 3, 20 л раствора сырого интерферона с интерферонной активностью 15-10 им, едо и 60 мг/л общего белка контактировали с ДО мл синеагарозного носител (Матрекс гель Блу А® фирмы Амикон корПо). Носитель, на который был адсорбирован интерферон, загрузили на колонну . Затем колонну дважда промыли и элюировалио Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (400 мл):
раствор хлористого натри 1 М, .содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри (рН 7,2)о второй промывочный раствор (400 мл):
25%-ный раствор этиленгликол , содержащий 10 мМ фосфорнокислого натри и 1 М хлористого натри (рН 7,2)а элюент;(400 мл).
100 Mrt раствора интерферона, отобранного из колонны синей агарозы, пропустили через 5 мл хелатникелевую колонну . Использованна колонна хелата никел была.приготовлена так же, как в примере 1, за исключением того, что вместо раствора хлористого цинка использовали раствор хлористого никел Хелатникелевую колонну промьши и элюировали. Использовали следующие промывочный раствор и элюент: промывочный раствор
дистиллированна вода и 0,1 М фосфорнокислого натри (рН 6,7 использовали поочередно элюент:
0,2 М буферный раствор уксусна кислота - уксуснокислый
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
натрий, содержащий 1 М хлористого натри (рН 4,5). Интерферонна активность, выход, количество белка и удельна активность каждой стадии показаны в ,
Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогенных веществ и был отрицательным относительно испытани Лимулуса, В нем не было обнаружено актиномицина Д.
Пример 4, Была повторена процедура примера 3 за тем исключением , что хелаткобальтовую колонну использовали вместо хелатникелевой колонны , причем хелаткобальтовую ко-, лонну приготовили как в примере 1, Но вместо хлористого цинка использовали раствор хлористого кобальта,
Элюат (15 мл) содержал 4,5-10 им„ едо.интерферона выход 60%) и 0,25 мг белка Удельна активность составл ла 1,8-10 им„ едо/мг белка, Конеч- ньй элюат был отрицательным к испытанию Лимулуса, В нем не бьшо обнаружено актиномицина Д.
П р и М е р 5с Культивировали . штамм Е. коли, в котором бьш интегрирован структурный ген ft-интерферона , и культивированный штамм.подвергли процедурам сбора бактерий, измельчени бактерий, удалени нуклеиновой кислоты и осаждени сульфатом аммоний . Белковую фракцию, содержащую |Э-интерферон, .полученный из штамма Е.КОЛИ, растворили в 25%-ном растворе этиленгликол , содержащем 1 М хлористого натри и 10 мМ фосфорнокислого натри (рН 7,2), с целью получени раствора сырого интерферона. Раствор сырого интерферона имел интерферон-, ную активность 5«10 им,ед. и 20 мг белка на 1 мло
40 мл раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мл синей агарозы (Матрекс .гель блу А фирмы Амикон корп.) уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натри , содержащим 1 М хлористого натри о Колонну дважды промьши с целью удалени примерно 95% белка в растворе сырого интерферона, и элюировали с фракционированием в каждую фракцию 2 мл. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (10 мп): 25%-ный раствор этиленгликол , содержащий 1 М хлористого натл®
ри и 10 мМ фосфорнокислого нат ри
второй промывочный раствор (10 мл) 40%-ный раствор этиленгликол , содержащий 1 М хлористого натри и 10 мМ фосфорнокислого натри элюент:
60%-ный раствор этиленгликол , содержащий 1 М хлористого натри и 10 мМ фосфорнокислого натри
Элюат (12 мл) из колонны синей ага розы имел интерферонную активность 1,6-10 им.едо (выход 80%) и 4,6 мг бвлкао Средн удельна активность в каждой фракции была 2,5-10 иМоед„/мг белка (максо ; 510 им.еДо/мг белка).
Элюат подвергли анализу так же, как в примере 1. В результате чистота интерферонной активности при молекул рном весе примерно 19000 составл ла 10-50% (средн 25%).
6 МП элюата из колонны синей агаро зы пропустили через 1 мп хелатцинко- вой колонны, уравновешенной 60%-ным раствором этиленгликол , содержащим 1 М хлористого натри и 1 мМ фосфорнокислого натри о Колонну трижды промыли и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (6 мл): 60%-ный раствор этиленгликол , содержащий 1 М хлористого натри и 10 мМ фосфорнокислого натри . второй промывочный раствор (6 мл):
дистиллированна вода третий промывочный раствор (6 мл): 220 мМ буферный раствор фосфорнокислого натри , содержащий .2 М хлористого натри (рН 6,0), элюент:
0,1 М буферный раствор уксуснокислого натри , содержащий 1 М хлористого натри (рН 4,0). Конечный элюат (4 мп) имел интерферонную активность 4,0-10 имоед, (выход 50%) и 0,4 мг белка. Удельна активность была 1-10 имо едо/мг белка .
Конечный элюат подвергли анализу как и в примере 1 и обнаружили одну полосу в положении молекул рного веса примерно 19000. Чистота была больще 97%.
Пример 6. Была повторена про-, цедура примера 3, за тем исключением,
10
5
0
5
0
5
0
5
0
5
что вместо хелатникелевой колонны использовали хелатцинковую колонну и в качестве элюента использовали 0,2 М раствор Ij-гистидин, - уравновешенный хлористый натрием (рН 7,0).
Элюат (20 мп) .имел 50-10 имовд интерферона (выход 67%) и 50 г общего белка. Удельна активность была 1,0-10 им.ед./мг белка„
Пр и М-е р 7. Использовали сырой, интерферон, полученный из-человеческих фибробластовых клеток, аналогичный интерферону, использованному в примере 1.
К 20 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 4210 иМоед. и концентрацией бё.пка -70 мг/л добавили 30 МП гел синей агарозы CMatrex Gel Blue А® Amicon corp) После перемешивани смеси в течение 3 сут и выдержки в течение ч удалили надосадочный слой и гель синей агарозы пропустили через колонну, промыва 200 мп 1,0 М раствора хлористого натри , содержащего 10 мМ фосфата натри с рН 7,2 (буфер А).
Затем колонну дважды промылио Перед элюированием интерферона дл улучшени очистки к выходз вьшеука- занной колонки подсоединили колонку. с 15 мл свежего гел агарозы, уравновешенного буфером А, содержащим 25%-ный раствор этиленгликол о После третьей промывки интерферон элюировали . Использовали следующие промывочные растворы и элюент:
первый промывочный раствор (200 мп) буфер А
второй промывочный раствор (ЗОО нл); буфер А, содержащий 25%-раствор этиленгликол ,
третий промывочный раствор (120 мл), 3 М раствор хлористого натри , содержащий 30 мМ фосфорнокиело- го натри (рН 7,2) и 30%-11ЫЙ раствор этиленгликол у
элюент (600 мп):
буфер А, содержащий 55%-ный раствор этиленгликол о
Раствор элюата фракциониривалио Результаты представлены в табЛо4о
Фракцию второго элюировани подвергли дальнейшей очистке с помощью хелатцинковой хроматографии.
В колонну с хелатом цинка (15 мл) ввели буфер А, содержащий 50%-ньгй
ч152304
раствор этиленгликол . Часть (270 мл) фракции второго элюировани из вышеуказанной колонны синей агарозы развели 27 мл буфера А до получени 50%-ного раствора этиленгликол и пропустили через колонну с хелатом цинка при скорости потока 30 мл/ч.
темпеВсе операции проводили при
ратуре 2-8°С. После двойной промывки
10
10
колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элю- ент:
первый промывочный раствор (200 мл) , дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфорнокислогонатри (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/ч в течение 1 ч поочередно
Интерферон из элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликол , из Которой колонны гел синей агарозы подвергли.такому же анализу, как в примере 7, дл определени его чисто- ты и проведени пирогенного испытани .
Чистота его была 60% и результат испытани Лумулуса положительный.
Сравнительный пример 2. Колонну
второй промывочный раствор (30 мл):2о из хелата цинка (50 мл) уравновеши2 М раствор хлористого натри , содержащий 20 мМ фосфорнокислог- го натри (рН )
элюент
0,1 М уксусной кислоты - уксуснокислого натри буферный раствор , содержащий 0,1 М хлористого натри (рН 7,4). Активность, выход интерферона, количество/ белка и уде 1ьна активность этой процедуры очистки представлены в табл.5.
Интерферон из колонны с хелатом цинка подвергли анализу посредством электрофореза поли акрил амидного гел ... в присутствии додецилсульфата натри (НДС) дп определени чистоты Элюат подвергли пирогенному испытанию с помощью теста Лимулуса, использу обнаруживающий эндотоксин реагент. Чистота интерферона 90%, элюат отрицательный к испытанию., Лимулуса при содержании интерферона 1,6-10 им ед./мпо
Сравнительный пример .1. Во вторую колонну гел агарозы (Matrex Gel Blue А®4 мп) загрузили 2 М раствор хлористого натри , содержащий 20 мМ фосфорнокислого натри , рН 7,2 (буфер в).
Часть ;;р...кдии (45 мп) второго элюировани ич Kb. -oH;ibi гел синей агарозы , .описаь Юй в примере /, разбавили
25
30
35
вали при помощи PBS. Неочищенньш интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30 «10 ме/мл и концентрацию протеина 70 мг/л, пропускали через колонну хелата цинка с объемной скоростью 100 МП/ч. После промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор и элюент{
промывочный раствор (400 мл), дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натри (рН 6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч в течение 1 ч, с чередованием элюент:
0,1 М буферный раствор уксусной кислоты т ацетата натри , содержащий 1,0 М хлорида натри (рН 4,7), Фракцию элюировани на колонне хелата цинка использовали дл последующей очистки при помощи хроматог- 45 рафии на голубом агаре.
Колонну из голубого агара (5 мл) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натри , содер- CQ жащим 1,0 М хлорида натри . Фракцию элюировани из вышеупом нутой колонны хелата цинка пропускали через колонну , с голубым а:гаром с объемной скоростью 10 мл/ч. После двухкрат40
5 мл буфера А и 75 мл буфера В и про- ее ой промывки колонну подвергали элюированию . При этом использовали следующие промывочный раствор и элюант:, первый промывочный раствор (50 мл) 1,0 М раствор хлорида натри .
пустили через вторую колонну гел синей агарозы при скорости потока 20 МП/ч. Все операции проводили при 15-25 С.
12
Буфер, содержащий 30, ДО и 50%- ный раствор этиленгликол соответственно пропустили через колонну со скоростью потока 20 мп/Чо
Результаты второй хроматографии Гел синей агарозы представлены в табл.6.
Интерферон из элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликол , из Которой колонны гел синей агарозы подвергли.такому же анализу, как в примере 7, дл определени его чисто- ты и проведени пирогенного испытани .
Чистота его была 60% и результат испытани Лумулуса положительный.
Сравнительный пример 2. Колонну
из хелата цинка (50 мл) уравновеши5
0
5
вали при помощи PBS. Неочищенньш интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30 «10 ме/мл и концентрацию протеина 70 мг/л, пропускали через колонну хелата цинка с объемной скоростью 100 МП/ч. После промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор и элюент{
промывочный раствор (400 мл), дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натри (рН 6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч в течение 1 ч, с чередованием элюент:
0,1 М буферный раствор уксусной кислоты т ацетата натри , содержащий 1,0 М хлорида натри (рН 4,7), Фракцию элюировани на колонне хелата цинка использовали дл последующей очистки при помощи хроматог- 5 рафии на голубом агаре.
Колонну из голубого агара (5 мл) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натри , содер- Q жащим 1,0 М хлорида натри . Фракцию элюировани из вышеупом нутой колонны хелата цинка пропускали через колонну , с голубым а:гаром с объемной скоростью 10 мл/ч. После двухкрат0
содержащий 10 мМ фосфата натри , рН 7,2 (буфер А), второй промывочный раствор ГЗО мл буфер А, содержащий 25% этилен- гликол : элюант:
буфер А, содержащий 55% гликол ,
Раствор элюата подвергали фракционированию . Результаты приведены в табл.7,
Сравнительный пример 3„ В качестве исходного материала использовали неочищенный интерферон фибробласта, .который имел активность интерферона 7,7-10 ме/мл и концентрацию протеина 35 мг/л. Этот исходный раствор (2,0 л) смешивали с 5 г (17 мл) ошри ков ЦРГ (пористыми стекл нными шариками с размером пор 350 А) и смесь энергично перемешивали в течение 13 ч. Затем смесь пропускали через стекл нный фильтр и шарики ЦРГ упаковывали в колонну (диаметр 0,9 см) Далее колонну промывали 00 мл PBS, а затем 0,01 М раствором глицйна-НС1 при рН 3,5, и элюировали 0,3 М буфером глицина-НС при рН 2,0, содержащим 0,1 мг/мл альбумина сыворотки человека.
Элюаты подвергали диализу с использованием 41 л 1 М раствора ЫаС1 буферированного 0,02 М раствором фосфата (рН 7,4).
Диализированный раствор :пропуска- ли через колонну с хелатом цинка с размерами 0,6.7 см,затем колонну промы- :вали 10 мл 1 М раствора хлорида натри , .буферированногй 0,02М раствором фосфата (рЫ 7,4) и 10 мл 0,1 М буфера ацетата натри (рН 5,9). Затем колонну элюировали 0,1 М буфером ацетата натри (рН 4).
Полученные результаты приведены в табл.8.
Срат.1Нпте. ирпмрр. 4 Использусырпн че.иовечргки |}.лтбробластный
орфег: Н, анпло пчпмГг используемок;г ни :-{у в примере
PiirTBop сырого чт 7ррфгфона, имеющего активность итгюрферона 38-10 им ед./л 5 конпентрацию белка 63 мг/л и удельную активность ) 10 ./мг белка, регулируют до рН 2 путем добавлени 6 н. НС и загружают в колонку- SP-Сефадекг.а (20 мл, 2 см « Кб,4 см). После г.чгрузки 6 л раство0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
ра сырого интерферона со скоростью потока 40 МП/ч колонку промывают 2ПО мл дистиллированной воды. Затем колонку элюируют 320 мл 0,1 М буферного раствора фосфорнокислого натри (рН 8,3). Раствор элюата фракционируют . Результаты приведены в табл,9о Вторую и третью фракции элюирова- ни используют дл последующего способа очистки путем хелатцинковой хро- , матографиио
Колонну с хелатом цинка (З мл, 1 см 3,8 см) уравновешивают 0,1 М буферным раствором фосфорнокислого натри (рН 8,3). Вышеуказанные фракции (ЗОО мл) из колонки ЗР-Сефадекса пропускают через хелатцинковую колонну со скоростью потока 6 мл/ч. После промывки дважды колонну элюируют. Используют следующие промывочный раст - вор и элюент:с
первый промывочный раствор (40 мл): дистиллированна вода и М раствор фосфорнокислого натри (рН 6,7|, используемые пооче-; редно со скоростыо потока 6 мл/ч в течение 1 ч второй промывочный раствор (б мл): 2 М хлористый натрий, содержащий 20 мМ фосфорнокислого натри (рН 7,2) элюент:
0,1 М буферный раствор уксусна кислота - уксуснокислый натрий. Содержащий 0,1 М хлористого натри (рН 4,7) Результаты этого способа очистки приведены в табл.10.
Используемый в качестве исходного материала раствор сырого интерферона имеет рН 7,3о После отстаивани в те- |Чение 10 дней его интерферонна активность составл ет 3810 им.ед./л и никаких изменений в активности интер- . фарона не обнаружено. Тогда как после отстаивани в течение 10 дней раствора сырого интерферона, имеющего рН 2, перед загрузкой его в колонку SP-Сефадекса, интерферонна активность снижаетс до 16 10 им.ед./л.- Это означает, что раствор сырого интерферона неустойчив при рН 2о
Изобретение имеет следующие существенные признаки и преимущества по сравнению с известным техническим решением.
Способ очистки в соответствии с известным техническим решением вклю
чает SP-Сефадексовую хроматографию на колонках с последующей хелатметал- лической хроматографией. Сырой интерферон , очищаемый в соответствии с известным способом , имеет низкую концентрацию, например используемый в примере 1 сырой интерферон имеет активность интерферона 3,2-10 им едс,/л и концентрацию белка 20 мг/л, а используемый в примере 2 сырой интерферон имеет активность интерферона 5-10 им.едо/л и концентрацию белка 25 мг/ло Известное техническое решение имеет в виду очистку сырого интерферона с относительно низкой концентрацией о
Предлагаемый способ очистки включает хроматографию на обездвиженном синем носителе с последующей хелат- металлической хроматографией В соответствии -с этим способом очистки Сырой интерферон с высокой концентра- {цией (например, сырой интерферон, |используемый в примере 7, имеет активность интерферона 42 10 иМоеДо/л и концентрацию белка 70 мг/л Может быть удовлетворительно очищено
Кроме того, как видно из примера 7, в котором использовали сырой интерферон с высокой концентрацией, извлечение продукта по известному способу составило самое большое 47% , Таким образом, известный способ непргоден дп очистки сырого интерферона с высокой концентрацией Это становитс более очевидным из сравнени результатов примера 7 с- результатами сравнительного примера 4 (в обоих прмерах материалом дп очистки был сы- рой интерферон с высокой концентрацией ,,
очистительстади очистительстади
7 69
36 20
Применение известного способа ограничиваетс сырым интерфероном с относительно низкой концентрацией Предлагаемый способ применим к сырому интерферону как с низкой концент0
5
0
0
5
0
35
45
5U
55
рацией, так и с высокой концентра- дией о
Известный способ имеет недостаток заключающийс в том,что перед загрузкой колонки SP-Сефадекса сырой интерферон об зательно делают сильнокислотным поскольку интерферонна активность при таком кислотном состо нии заметно тер етс , как показано в сравнительном примере 4о
Этот недостаток известного способа не обнаруживаетс в изобретении, поскольку хроматографию на обездвиженном синем носителе осуществл ют в услови х почти нейтрального рН.
ПримерЗо Используемый раствор неочищенного интерферона получают путем обравотки клеток человеческого фибробласта с использованием методики, аналогичной примеру 1,
К раствору неочищенного интерферона , который имеет активность интерферона , равную 30000 едо/л, белковую концентрацию, равную 0,11 мг/мп и рН 7,2, прибавл ют 6 н„ раствор НС1 или I Но раствор NaOH с тем, чтобы довести рН до 2,3, 4,5,6,7,8,9 или 10.
Устойчивость каждого раствора неочищенного интерферона испь1тывают путем определени титра, оставшегос после отстаивани каждого раствора неочищенного интерферона при температуре в течение 16 ч.
Ниже приведены результаты испытани , выраженньш в процентном содержании
рНУстоЙ11ивость ,%
283
369
480
590
697
7100
898
994
1080
Затем 15 мл каждого раствора неочищенного интерферона помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку , в которую также помещают 0,05 мл синего красител в качестве носител (Matrex Gel Blue/Р)и смесь перемешивают при в течение 16 ч. После удалени надосадочного сло и промывани дважды 2,5 мл 10 гМ раствора фосфат натри - 1 Но NaCl (рН 7,2) 2 мл
10 мМ.фосфата натри - 1 н NaCl (рН 7,2), содержащего 55%-ный этилен . гликоль, прибавл ют к носителю После центрифугировани удал ют надоса- дочный слой, содержащий частично очищенный интерфероно
Затем определ ют коли.чества потер нного интерферона Гобщее содержание интерферона, не абсорбированного на носителе, и интерферона, содержащегос в промывном растворе) и восстановленного интерферона.
Ниже приведены результаты ,зыражен- ные в процентном содержании
рН
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
0
5
Claims (1)
- Как видно из вьшеприведенных результатов , когда рН раствора неочищенного интерферона был доведен до 5-9, раствор неочищенного интерферона оставалс устойчивым и восстайов- ление частично очищенного интерферона было высоким. Формула изобретениСпособ очистки человеческого -интерферона путем контактировани .раствора неочищенного интерферона с сорбентом , обработки сигнала элюанТом с последующей металл-хелатной хрома- тографией полученного элюата, при которой носитель содержит хепатообра- зующий остаток, а в качестве иона - Со или N1 или Zn и элюции целевого продукта гистидином или кис- лотрым буферным раствором, отличающийс тем, что, с целью повышени производительности процесса , в качестве сорбента используют синий агарозный гель, а контактирование провод т при рН 5-9 оТ а б л и ц а 1сть -ра та30,000 18632,000 320 280 300285 285 30050 10 20 3030,2 1,4 15014350,610 60 64 1248132 34 10630570 20 15 151471.841,0 0,16 1,23,0101,0-102,5-1р 6-10 4-10 1,0-106ы -20,000 3004001002026065 0,755Таблица2Т a б л и ц a 312002,872701,0-10740,55ЫОРаствор сырого интерферона Пропущенный через300Раствор сырого интерферона . Пропущенный черезколоннуЭлюирование30%-ным растворомэтиленгликол40%-ным растворомэтиленгликол50%-ным растворомзтиленгликолТаблицаТаблицаЗ39015,42500Таблицаб2,5 1,6 1,72500 6011 0,21 3300 42 0,15 17000 8 0,07 7100Пропускаетс через + .промывка1- фракци элюиро- вани2- фракци элюирова1 ;з б л и ц а 7Таблицав10,3-101,3-1069
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LV930959A LV5408A3 (lv) | 1982-05-17 | 1993-06-30 | Cilveka beta-interferona attirisanas panemiens |
LTRP1024A LT2589B (lt) | 1982-05-17 | 1993-09-21 | Zmogaus alpha -interferono isvalymo budas |
MD94-0031A MD48C2 (ru) | 1982-05-17 | 1993-11-12 | Способ очистки человеческого -интерферона |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57081505A JPS58201794A (ja) | 1982-05-17 | 1982-05-17 | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1523046A3 true SU1523046A3 (ru) | 1989-11-15 |
Family
ID=13748211
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU833593070A SU1523046A3 (ru) | 1982-05-17 | 1983-05-16 | Способ очистки человеческого @ -интерферона |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4541952A (ru) |
EP (1) | EP0094672B1 (ru) |
JP (1) | JPS58201794A (ru) |
CA (1) | CA1213216A (ru) |
DE (1) | DE3361838D1 (ru) |
SU (1) | SU1523046A3 (ru) |
UA (1) | UA6303A1 (ru) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IN156128B (ru) | 1980-04-03 | 1985-05-18 | Biogen Nv | |
US4723000A (en) * | 1983-07-05 | 1988-02-02 | Biospectrum, Inc. | Human interferon gamma and interleukin-2 |
US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
JPS6169799A (ja) * | 1984-09-14 | 1986-04-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | インタ−フエロンの精製法 |
EP0190606B1 (de) * | 1985-02-04 | 1990-05-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Adsorbens für die Reinigung von Proteinen |
US4960702A (en) * | 1985-09-06 | 1990-10-02 | Codon | Methods for recovery of tissue plasminogen activator |
US4732683A (en) * | 1986-12-02 | 1988-03-22 | Biospectrum, Inc. | Purification method for alpha interferon |
US4961969A (en) * | 1987-05-11 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-β |
US4808314A (en) * | 1987-09-18 | 1989-02-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Method for reducing bacterial endotoxin contamination in solutions of macromolecules |
US5597485A (en) * | 1988-05-13 | 1997-01-28 | Vilmax S.A. | Process for separating proteins |
US5034133A (en) * | 1990-07-26 | 1991-07-23 | Schering-Corporation | Purification of human interleukin-4 from a CHO-cell line culture medium |
US6479300B1 (en) * | 1999-03-15 | 2002-11-12 | Millipore Corporation | Metal loaded ligand bound membranes for metal ion affinity chromatography |
US7354721B2 (en) * | 2000-09-22 | 2008-04-08 | Clontech Laboratories, Inc. | Highly sensitive proteomic analysis methods, and kits and systems for practicing the same |
CZ20032526A3 (cs) | 2001-02-27 | 2003-12-17 | Maxygen Aps | Nové molekuly podobné interferonu beta |
US7176278B2 (en) | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
KR100524872B1 (ko) * | 2003-12-04 | 2005-11-01 | 씨제이 주식회사 | 인터페론 베타의 정제방법 |
KR100524871B1 (ko) * | 2003-12-04 | 2005-10-31 | 씨제이 주식회사 | 인터페론 베타의 정제방법 |
DE102009032179A1 (de) | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Biogenerix Ag | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE27262C (de) * | H. HEWITT in Birmingham | Stahlfeder mit Kugelspitze | ||
DE11435C (de) * | M. MERZBACH in Berlin C, Seydelstrafse 9 | Verschlufs für Koffer, Chatoullen, Bücher, Taschenbügel u. s. w. vermittelst Buchstabenschlosses | ||
JPS5564799A (en) * | 1978-11-07 | 1980-05-15 | Toray Ind Inc | Multi-stage concentration and purification of interferon originated from human fibroblast |
FI77877C (fi) * | 1979-04-20 | 1989-05-10 | Technobiotic Ltd | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. |
US4289689A (en) * | 1980-03-14 | 1981-09-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Preparation of homogeneous human fibroblast interferon |
US4278661A (en) * | 1979-10-12 | 1981-07-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Purification of interferon |
NL7907791A (nl) * | 1979-10-23 | 1981-04-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
-
1982
- 1982-05-17 JP JP57081505A patent/JPS58201794A/ja active Granted
-
1983
- 1983-05-11 CA CA000427891A patent/CA1213216A/en not_active Expired
- 1983-05-12 US US06/494,021 patent/US4541952A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-16 UA UA3593070A patent/UA6303A1/ru unknown
- 1983-05-16 SU SU833593070A patent/SU1523046A3/ru active
- 1983-05-16 EP EP83104821A patent/EP0094672B1/en not_active Expired
- 1983-05-16 DE DE8383104821T patent/DE3361838D1/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Положительное решение по за вке У 2838809, кл. А 61 К 45/02, 29.07.85. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0094672A1 (en) | 1983-11-23 |
JPS58201794A (ja) | 1983-11-24 |
CA1213216A (en) | 1986-10-28 |
JPH0112760B2 (ru) | 1989-03-02 |
DE3361838D1 (en) | 1986-02-27 |
EP0094672B1 (en) | 1986-01-15 |
UA6303A1 (ru) | 1994-12-29 |
US4541952A (en) | 1985-09-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU1523046A3 (ru) | Способ очистки человеческого @ -интерферона | |
US4257938A (en) | Purification method of human fibroblast interferon | |
CA2050277A1 (en) | Process for purifying a protein | |
EP0524681B1 (en) | Process for the purification of serum albumin | |
US5849874A (en) | Process for the purification of serum albumin | |
CA1101847A (en) | Process for the concentration of a placenta-specific glycoprotein | |
JP2573467B2 (ja) | 第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 | |
US4065445A (en) | Pregnancy-specific β1 -glycoprotein and process for isolating it | |
JPH09506256A (ja) | メンブレンクロマトグラフィーによるビタミンk依存性蛋白の精製 | |
Bassett | Large scale preparation of wheat germ agglutinin | |
US6555661B1 (en) | Simple, environmentally benign, method for purifying protein A | |
US5698104A (en) | Purification process for hirudin using affinity chromatography | |
SU551339A1 (ru) | Способ очистки ферментных препаратов | |
JPH0679172A (ja) | クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法 | |
JP2882828B2 (ja) | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 | |
CA1065305A (en) | PROCESS FOR THE ENRICHMENT OF THE PREGNANCY-SPECIFIC .beta.1-GLYCOPROTEIN | |
Kessner et al. | Isolation of human urinary protease inhibitor by single-step affinity chromatography | |
JPH084503B2 (ja) | ウロキナーゼの回収方法及びそれにより得られるウロキナーゼ含有画分 | |
JPS6159292B2 (ru) | ||
CN118147116A (zh) | 一种重组羧肽酶b的纯化方法及其应用 | |
JPH05339297A (ja) | オボトランスフェリンの分離方法 | |
JPS6048930A (ja) | アンチトロンビン3の精製法 | |
JPS5810522A (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン3の精製法 | |
JPS59169490A (ja) | 酸性プロテア−ゼの採取法 | |
ATIO | Purification and Some Chemical and Physical Properties of, rijution unlimited. Staphylococcal Enterotoxin A |