JP2023535384A - 抗ｐｄ－１抗体医薬組成物及びその用途 - Google Patents

抗ｐｄ－１抗体医薬組成物及びその用途 Download PDF

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Abstract

本開示は、抗ＰＤ－１抗体医薬組成物及びその用途に関する。具体的に、本開示は、抗ＰＤ－１抗体及び緩衝液を含む医薬組成物を提供する。

Description

本開示は薬物製剤分野に属し、具体的に、抗ＰＤ－１抗体を含む医薬組成物、及びその薬剤としての用途に関する。
ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、単に本開示に関連する背景情報を提供する。
腫瘍免疫療法は、腫瘍患者体内におけるキラーＴ細胞を十分に活用して動員し、腫瘍を殺傷する治療方法である。その一方、腫瘍細胞の逃避は、腫瘍免疫治療の直面している大きな障害であり、腫瘍細胞は免疫系への自己阻害作用により、腫瘍の急速な成長を促進する。腫瘍の免疫逃避機構と体の腫瘍への免疫応答との間には、極めて複雑な関係がある。腫瘍免疫治療の初期に、腫瘍特異的なキラーＴ細胞はその生物活性を有するが、腫瘍の成長につれて、後期になると、殺傷機能が無くなってしまう。
ヒト体内におけるＴ細胞の活性化は、２本のシグナル伝達経路系を採用し、抗原提示細胞によりＭＨＣ－抗原ペプチドをＴ細胞に提示することで第１のシグナルを提供することに加え、一連の共刺激分子により第２のシグナルを提供する必要もあり、これによってはじめてＴ細胞の正常な免疫応答を可能にする。この二重シグナル伝達経路系は、体内免疫系のバランスに対して非常に重要な役割を果たし、自己抗原及び非自己抗原に対する体の異なる免疫応答を厳密に調節している。共刺激分子により提供される第２のシグナルを欠くと、Ｔ細胞の不応答又は持続的な特異的免疫応答を引き起こし、免疫寛容を発生させることになってしまう。従って、第２のシグナル伝達経路は、体の免疫応答の全過程において非常に肝心な調節作用を果たしている。
プログラム死分子１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１、ＰＤ－１）は１９９２年に発見された、Ｔ細胞表面に発現しているタンパク質受容体の一つであり、細胞のアポトーシス過程に関与している。ＰＤ－１はＣＤ２８ファミリーに属し、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４、ＣＴＬＡ－４）と２３％のアミノ酸相同性を有するが、その発現がＣＴＬＡとは異なり、主に活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞と骨髄細胞に発現している。ＰＤ－１は、それぞれＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２である２つのリガンドを有する。ＰＤ－Ｌ１は、主にＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞と樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）に発現しており、活性化された細胞での発現は、アップレギュレートすることができる。一方、ＰＤ－Ｌ２の発現は、比較的限られており、主に、活性化されたマクロファージ細胞と樹状細胞などの抗原提示細胞に発現している。
抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１間の結合を遮断することにより、腫瘍に対する患者の自己免疫系反応を最大限に向上させ、腫瘍細胞を殺傷するような目的を達成することができる。
本開示は、抗ＰＤ－１抗体医薬組成物及びその用途を提供する。
一態様では、本開示は、抗ＰＤ－１抗体及び緩衝液を含む医薬組成物を提供し、そのうち、上記緩衝液は酢酸塩緩衝液、ヒスチジン塩緩衝液又はコハク酸塩緩衝液である。好ましくは、上記緩衝液のｐＨは約４．５～約６．０、好ましいｐＨは約４．７～約５．７、より好ましいｐＨは約５．２であり、上記酢酸塩緩衝液は酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液が好ましく、上記ヒスチジン塩緩衝液はヒスチジン－酢酸塩緩衝液が好ましく、上記コハク酸塩緩衝液はコハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液が好ましく、上記抗ＰＤ－１抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記重鎖可変領域は配列番号６５で示されるＨＣＤＲ１、配列番号６６で示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号６７で示されるＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は配列番号６８で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号６９で示されるＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、そのうち、上記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域は配列番号８で示されるＨＣＤＲ１、配列番号９で示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号１０で示されるＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は配列番号４９で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号１３で示されるＬＣＤＲ３を含む。具体的な配列は下記の表１に示される：
Figure 2023535384000001
幾つかの選択的な実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域は配列が配列番号８で示されるＨＣＤＲ１、配列が配列番号９で示されるＨＣＤＲ２、及び配列が配列番号１０で示されるＨＣＤＲ３を含み、上記軽鎖可変領域は配列が配列番号１２で示されるＬＣＤＲ２、配列が配列番号１３で示されるＬＣＤＲ３、及び配列が一般式ＲＳＳＱＳＸ１３ＶＨＳＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＴＹＬＥ（配列番号６８）で示されるＬＣＤＲ１を含み、そのうち、Ｘ１３はＬから選ばれ、Ｘ１４はＮ、Ｑ、Ｌ、Ｔ又はＤから選ばれ、Ｘ１５はＧ、Ａ又はＶから選ばれ、Ｘ１６はＮから選ばれる。
幾つかの選択的な実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は、下記の（ａ）～（ｅ）の何れか一項に記載の抗ＰＤ－１抗体から選ばれる：
（ａ）配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９と配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列がそれぞれ配列番号１２と配列番号１３で示されるＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、及び配列が配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１又は５２で示されるＬＣＤＲ１を含む抗ＰＤ－１抗体、
（ｂ）配列がそれぞれ配列番号１４、配列番号１５と配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列がそれぞれ配列番号１７、配列番号１２と配列番号１８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む抗ＰＤ－１抗体、
（ｃ）配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列がそれぞれ配列番号２４、配列番号２５と配列番号２６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む抗ＰＤ－１抗体、
（ｄ）配列がそれぞれ配列番号１４、配列番号１５と配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列がそれぞれ配列番号１２と配列番号１３で示されるＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、及び配列が配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１又は５２で示されるＬＣＤＲ１を含む抗ＰＤ－１抗体、並びに
（ｅ）上記重鎖可変領域は配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９と配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、及び上記軽鎖可変領域は配列がそれぞれ配列番号１７、配列番号１２と配列番号１８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、上記重鎖可変領域は配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９と配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、及び上記軽鎖可変領域は配列がそれぞれ配列番号４９、配列番号１２と配列番号１３で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、上記重鎖可変領域は配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３を含み、及び上記軽鎖可変領域は配列がそれぞれ配列番号２４、配列番号２５と配列番号２６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態では、本開示の上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は１０－７ Ｍ以下の解離平衡定数（ＫＤ値）でヒトＰＤ－１に結合され、幾つかの実施形態では、１０－８ Ｍ、１０－９ Ｍ、１０－１０ Ｍ又は１０－１１ Ｍ以下の解離平衡定数でヒトＰＤ－１に結合される。上記ＫＤ値は表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定され、例えば、本開示の試験例１に記載される方法により検出される。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記緩衝液のｐＨ値は約４．５～約６．０、好ましくは４．５～６．０であり、幾つかの実施形態では、上記緩衝液のｐＨ値は約４．７～約５．７、好ましくは４．７～５．７であり、別の幾つかの実施形態では、上記緩衝液のｐＨ値は約５．２、好ましくは５．２であり、別の幾つかの実施形態では、上記緩衝液はｐＨが約４．７～約５．７の酢酸塩緩衝液であり、別の幾つかの実施形態では、上記緩衝液はｐＨが５．２の酢酸塩緩衝液である。別の幾つかの実施形態では、緩衝液のｐＨ値の非限定的な実施例は、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、及びこれらのポイント値間の何れか１つの範囲を含む。幾つかの実施形態では、上記医薬組成物のｐＨ値は、その緩衝液のｐＨ値に一致又はほぼ一致している（当業者に公知されているように、薬物製剤の調製中に、ｐＨドリフト（製剤ｐＨと緩衝液ｐＨとの間に存在する若干の差分値を、ｐＨドリフト値という）が存在することがあり、ｐＨのドリフト値は一般的に±０．３の範囲にあり、特に説明のない限り、本開示に係る医薬組成物のｐＨドリフト値は±０．３の範囲内、好ましくは±０．２の範囲内、より好ましくは±０．１の範囲内にある）。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記緩衝液の濃度は約５ ｍＭ～約３０ ｍＭ、好ましくは５ ｍＭ～３０ ｍＭであり、幾つかの実施形態では、緩衝液の濃度は約５ ｍＭ～約１５ ｍＭ、好ましくは５ ｍＭ～１５ ｍＭであり、幾つかの実施形態では、緩衝液の濃度は約１０ ｍＭ、好ましくは１０ ｍＭである。緩衝液の濃度の非限定的な実施例は、約５ ｍＭ、約７ ｍＭ、約８ ｍＭ、約９ ｍＭ、約１０ ｍＭ、約１１ ｍＭ、約１２ ｍＭ、約１３ ｍＭ、約１４ ｍＭ、約１５ ｍＭ、約１６ ｍＭ、約１８ ｍＭ、約２０ ｍＭ、約２５ ｍＭ、約３０ ｍＭ、及びこれらのポイント値間の何れか１つの範囲を含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体の濃度は約１ ｍｇ／ｍＬ～約１５０ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ ｍｇ／ｍＬ～１５０ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の濃度は約９０ ｍｇ／ｍＬ～約１５０ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは９０ ｍｇ／ｍＬ～１５０ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の濃度は約１００ ｍｇ／ｍＬ～約１２０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の濃度は約１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の濃度は１００ ｍｇ／ｍＬである。抗ＰＤ－１抗体の濃度の非限定的な実施例は、約１ ｍｇ／ｍＬ、約１０ ｍｇ／ｍＬ、約２０ ｍｇ／ｍＬ、約３０ ｍｇ／ｍＬ、約４０ ｍｇ／ｍＬ、約５０ ｍｇ／ｍＬ、約６０ ｍｇ／ｍＬ、約７０ ｍｇ／ｍＬ、約８０ ｍｇ／ｍＬ、約９０ ｍｇ／ｍＬ、約１００ ｍｇ／ｍＬ、約１１０ ｍｇ／ｍＬ、約１２０ ｍｇ／ｍＬ、約１３０ ｍｇ／ｍＬ、約１４０ ｍｇ／ｍＬ、約１５０ ｍｇ／ｍＬ、及びこれらのポイント値間の何れか１つの範囲を含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、浸透圧調整剤を更に含む。幾つかの実施形態では、浸透圧調整剤は、糖（単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含む）、アミノ酸（アルギニン、グリシン、システイン、ヒスチジンなどを含む）又は塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）である。幾つかの実施形態では、上記糖はグルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール（ソルビットともいう）、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、マルトースアルコール、ラクトースアルコールとイソ－マルツロースから選ばれる。幾つかの実施形態では、上記糖は非還元二糖であり、幾つかの実施形態では、上記糖は、トレハロース又はスクロースが好ましく、スクロースが最も好ましい。幾つかの実施形態では、上記浸透圧調整剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、グリシンと塩化ナトリウムからなる群から選ばれる１つ又は複数である。幾つかの実施形態では、浸透圧調整剤の濃度は、約５０ ｍｇ／ｍＬ～約１００ ｍｇ／ｍＬが好ましく、約７０ ｍｇ／ｍＬ～約９０ ｍｇ／ｍＬがより好ましく、約８０ ｍｇ／ｍＬが最も好ましい。幾つかの実施形態では、浸透圧調整剤の濃度の非限定的な実施例は、約５０ ｍｇ／ｍＬ、約６０ ｍｇ／ｍＬ、約６５ ｍｇ／ｍＬ、約７０ ｍｇ／ｍＬ、約７５ ｍｇ／ｍＬ、約８０ ｍｇ／ｍＬ、約８５ ｍｇ／ｍＬ、約９０ ｍｇ／ｍＬ、約９５ ｍｇ／ｍＬ、約１００ ｍｇ／ｍＬ、及びこれらのポイント値何れ間のか１つの範囲を含む。幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は等張製剤である。幾つかの実施形態では、上記浸透圧調整剤は、上記医薬組成物の浸透圧を２８０ ｍＯｓｍ～３２０ ｍＯｓｍになるように制御し、好ましくは浸透圧を約３００ ｍＯｓｍになるように制御する。幾つかの実施形態では、上記浸透圧調整剤は、約７０ ｍｇ／ｍＬ～約９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースが好ましく、約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースが最も好ましい。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、界面活性剤を更に含み、上記界面活性剤は、ポリソルベート２０（ツイーン２０ともいう）、ポリソルベート８０（ツイーン８０ともいう）、ポロクサマー、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリル－スルホベタイン、ミリスチル－スルホベタイン、リノール－スルホベタイン、ステアリン－スルホベタイン、ラウリル－サルコシン、ミリスチル－サルコシン、リノール－サルコシン、ステアリン－サルコシン、リノール－ベタイン、ミリスチル－ベタイン、セチル－ベタイン、ラウラミドプロピル－ベタイン、コカミドプロピル－ベタイン、リノールアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ベタイン、パルミタミドプロピル－ベタイン、イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ジメチルアミン、パルミタミドプロピル－ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、メチルココイルナトリウム、メチルオレイルタウリンナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールの共重合体などから選ばれてもよい。好ましい界面活性剤はポリソルベート８０又はポリソルベート２０で、より好ましくはポリソルベート８０である。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記界面活性剤の濃度は約０．１ ｍｇ／ｍＬ～約１．０ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．８ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態では、界面活性剤の濃度は約０．４ ｍｇ／ｍＬ～約０．８ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．６ ｍｇ／ｍＬ～約０．８ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態では、界面活性剤の濃度は約０．６ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．６ ｍｇ／ｍＬである。非限定的な実施例は、約０．１ ｍｇ／ｍＬ、約０．２ ｍｇ／ｍＬ、約０．３ ｍｇ／ｍＬ、約０．４ ｍｇ／ｍＬ、約０．４５ ｍｇ／ｍＬ、約０．５ ｍｇ／ｍＬ、約０．５５ ｍｇ／ｍＬ、約０．６ ｍｇ／ｍＬ、約０．７ ｍｇ／ｍＬ、約０．８ ｍｇ／ｍＬ、約０．９ ｍｇ／ｍＬ、約１．０ ｍｇ／ｍＬ、及びこれらのポイント値何れ間のか１つの範囲を含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物中の抗ＰＤ－１抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、全ヒト抗体、又はヒト化抗体である。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物中の抗ＰＤ－１抗体は、ヒト化抗体である。幾つかの実施形態では、上記ヒト化抗体は、ヒト抗体由来のフレームワーク領域又はそのフレームワーク領域変異体を含む。幾つかの実施形態では、上記フレームワーク領域変異体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域の上でそれぞれ多くとも１１個のアミノ酸の復帰変異を有するものである。幾つかの実施形態では、上記フレームワーク領域変異体は、ヒト抗体由来のフレームワーク領域と比べ、下記の（ｆ）～（ｈ）から選ばれる何れか１つに記載の変異を含む：
（ｆ）軽鎖可変領域には２Ｇアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は重鎖可変領域には２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ｔ、６９Ｌ、８２Ｆと９３Ｔから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異が含まれ、
（ｇ）軽鎖可変領域には２Ｖアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は重鎖可変領域には２６Ｄ、２７Ｆ、３０Ｔ、３８Ｋ、４３Ｈ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ、８２Ｆと９３Ｔから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異が含まれ、及び
（ｈ）軽鎖可変領域には４２Ｇ、４４Ｖと７１Ｙから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は重鎖可変領域には１Ｋ及び／又は９４Ｓアミノ酸復帰変異が含まれる。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物中の抗ＰＤ－１抗体は、下記から選ばれる抗体可変領域を含む：
（ａ２）それぞれ配列番号８、配列番号９と配列番号１０で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３と、２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ｔ、６９Ｌ、８２Ｆと９３Ｔから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異を有する重鎖フレームワーク領域とを含む重鎖可変領域、及び
それぞれ配列番号１２と配列番号１３で示されるＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３と、配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１又は５２で示されるＬＣＤＲ１と、２Ｇアミノ酸復帰変異を有する軽鎖フレームワーク領域とを含む軽鎖可変領域、
（ｂ２）それぞれ配列番号１４、配列番号１５と配列番号１６で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３と、２６Ｄ、２７Ｆ、３０Ｔ、３８Ｋ、４３Ｈ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ、８２Ｆと９３Ｔから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異を有する重鎖フレームワーク領域とを含む重鎖可変領域、及び
それぞれ配列番号１７、配列番号１２と配列番号１８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３と、２Ｖアミノ酸復帰変異を有する軽鎖フレームワーク領域とを含む軽鎖可変領域、
（ｃ２）配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２と配列番号２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３と、１Ｋ及び／又は９４Ｓアミノ酸復帰変異を有する重鎖フレームワーク領域とを含む重鎖可変領域、及び
それぞれ配列番号２４、配列番号２５と配列番号２６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３と、４２Ｇ、４４Ｖと７１Ｙから選ばれる１つ又は複数のアミノ酸復帰変異を有する軽鎖フレームワーク領域とを含む軽鎖可変領域。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物中の抗ＰＤ－１抗体は、下記の（ｉ）～（ｏ）から選ばれる何れか１つに記載の抗体可変領域を含む：
（ｉ）配列が配列番号４で示され、又は配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号５で示され、又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｊ）配列が配列番号６で示され、又は配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号７で示され、又は配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｋ）配列が配列番号１９で示され、又は配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号２０で示され、又は配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｌ）配列が配列番号２７、３０、３１若しくは３２で示され、又は配列番号２７、３０、３１若しくは３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３若しくは６４で示され、又は配列番号２８、２９、３４、３５、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３若しくは６４と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｍ）配列が配列番号３３、３６、３７、３８、３９若しくは４０で示され、又は配列番号３３、３６、３７、３８、３９若しくは４０と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号３４、３５、２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３若しくは６４で示され、又は配列番号３４、３５、２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３若しくは６４と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｎ）配列が配列番号４１、４５若しくは４６で示され、又は配列番号４１、４５若しくは４６と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号４２、４３若しくは４４で示され、又は配列番号４２、４３若しくは４４と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｏ）配列が配列番号７０で示され、又は配列番号７０と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号７１で示され、又は配列番号７１と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｐ）配列が配列番号２７、３０、３１若しくは３２で示され、又は配列番号２７、３０、３１若しくは３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列が配列番号３４若しくは３５で示され、又は配列番号３４若しくは３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域。
そのうち、配列番号７０と配列番号７１の配列は一般式であり、具体的な配列は表２に示される：
Figure 2023535384000002

幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域は配列番号２７で示され、又は配列番号２７と少なくとも９０％の同一性を有し、且つ上記抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号５５で示され、又は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域は配列番号４６で示され、又は配列番号４６と少なくとも９０％の同一性を有し、且つ上記抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号４３で示され、又は配列番号４３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
上記「少なくとも９０％の同一性」は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有することを含む。
別の幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は、抗体重鎖定常領域及び／又は抗体軽鎖定常領域を更に含み、別の幾つかの実施形態では、上記抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、上記抗体軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖の定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、別の幾つかの実施形態では、上記抗体重鎖定常領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａのうちの１つ又は複数の変異が導入されたＩｇＧ４の重鎖定常領域を含み、例えば、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａという３つのアミノ酸変異を含み、別の幾つかの実施形態では、上記抗体は、配列が配列番号７２又は配列番号７９で示される重鎖定常領域、及び配列が配列番号７３で示される軽鎖定常領域を含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７８で示され、又は配列番号７８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する軽鎖と、配列番号７７若しくは８２で示され、又は配列番号７７若しくは８２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する重鎖とを含み、或いは、配列番号７５で示され、又は配列番号７５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する軽鎖と、配列番号７４、７６、８０若しくは８１で示され、又は配列番号７４、７６、８０若しくは８１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する重鎖とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物において、上記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７４で示される重鎖と配列番号７５で示される軽鎖、又は配列番号７７で示される重鎖と配列番号７８で示される軽鎖を含む。
幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は、
ａ）濃度が約１ ｍｇ／ｍＬ～約１５０ ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体と、
ｂ）濃度が約５ ｍＭ～約３０ ｍＭ、ｐＨが約４．５～約６．０である酢酸塩緩衝液と、
ｃ）スクロース、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、グリシンと塩化ナトリウムから選ばれる、濃度が約５０ ｍｇ／ｍＬ～約１００ ｍｇ／ｍＬである浸透圧調整剤と、
ｄ）濃度が約０．２ ｍｇ／ｍＬ～約０．８ ｍｇ／ｍＬであるポリソルベートと、を含み、
幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は、
Ａ１）濃度が約９０ ｍｇ／ｍＬ～約１５０ ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体と、
Ｂ１）濃度が約１０ ｍＭ～約３０ ｍＭ、ｐＨが約４．７～約５．７である酢酸塩緩衝液と、
Ｃ１）濃度が約７０ ｍｇ／ｍＬ～約９０ ｍｇ／ｍＬであるスクロースと、
Ｄ１）濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬ～約０．８ ｍｇ／ｍＬであるポリソルベート８０と、を含み、
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．０の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．５の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２のヒスチジン－酢酸塩緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約３０ ｍＭと、濃度が約１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．２ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．８ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのトレハロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約５０ ｍｇ／ｍＬのソルビットと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約１００ ｍＭのアルギニンと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約１００ ｍＭのグリシンと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約１００ ｍＭのＮａＣｌと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約２０ ｍＭと、濃度が約１５０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約４．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約２１．９ ｍＭと、濃度が約１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約４．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約９０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約２０ ｍＭと、濃度が約１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約２０ ｍＭと、濃度が約９０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１５０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約４．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約３０ ｍＭと、濃度が約９０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約４．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約１５０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約３０ ｍＭと、濃度が約１５０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約１０ ｍＭと、濃度が約９０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが約５．７の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液約３０ ｍＭと、濃度が約１０７．７ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液１０ ｍＭと、濃度が１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が７０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液１０ ｍＭと、濃度が１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が９０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、ｐＨが５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液１０ ｍＭと、濃度が１２０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含み、そのうち、上記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７４で示される重鎖、及び配列番号７５で示される軽鎖を有する。幾つかの実施形態では、本開示は、抗ＰＤ－１抗体原液を緩衝液で置換するステップを含む、上記医薬組成物を調製する方法を提供する。幾つかの実施形態では、上記緩衝液は酢酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液又はコハク酸塩緩衝液から選ばれる。
本開示は、再溶解されると、上記の何れか一項に記載の医薬組成物を形成することができる凍結乾燥製剤を更に提供する。
幾つかの実施形態では、本開示は、上記医薬組成物を凍結乾燥することにより得られる、抗ＰＤ－１抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。選択的な実施形態では、上記調製において、上記凍結乾燥は順に予備凍結、一次乾燥と二次乾燥のステップを含む。
幾つかの実施形態では、本開示は、再溶解されると、上記医薬組成物を形成することができる、抗ＰＤ－１抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
幾つかの実施形態では、本開示は、上記の何れか一項に記載の医薬組成物の凍結乾燥形態である凍結乾燥製剤を提供する。
幾つかの実施形態では、上記医薬組成物又は凍結乾燥製剤は安定な製剤であり、幾つかの実施形態では、上記医薬組成物又は凍結乾燥製剤は、冷蔵温度（２℃～８℃）の条件下で６ヶ月保存されると、ＳＥＣモノマーの百分率が５％以下低減される。幾つかの実施形態では、上記医薬組成物又は凍結乾燥製剤は、２℃～８℃で少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月又は少なくとも２４ヶ月安定している。幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は４℃の条件下で６ヶ月置かれると、製剤のＳＥＣモノマーの百分率が２％以下（例えば、２％未満、１％未満、０．８％未満、０．５％未満、更にそれ以下）低減され、幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、強制分解条件（４０℃ Ｍ１）下で、Ｄ０時のＳＥＣ値と比べ、ＳＥＣの下げ幅が約１０％以下、好ましくは約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％以下であり、より好ましいＳＥＣの下げ幅は１．１％～２．７％の間にある。幾つかの実施形態では、上記医薬組成物は、４℃の条件下で６ヶ月置かれると、製剤のＳＥＣモノマーの百分率が９４％よりも大きい（例えば、９４．５％、９５％、９８％よりも大きい）。
幾つかの実施形態では、本開示は、上記凍結乾燥製剤を再溶解することにより得られる、抗ＰＤ－１抗体を含む再溶解溶液を提供する。その再溶解に用いられる溶液は、注射用水、生理食塩水又はグルコース溶液を含むが、これらに限定されず、好ましくは注射用水である。
幾つかの実施形態では、本開示は、上記の何れか一項に記載の凍結乾燥製剤の再溶解形態である再溶解溶液を提供する。
幾つかの実施形態では、本開示は、上記のような医薬組成物、凍結乾燥製剤又は再溶解溶液が入った容器を含む製品を提供する。幾つかの実施形態において、当該容器は、中性ホウケイ酸ガラス管製の注射剤ボトルである。
本開示は、上記の医薬組成物、凍結乾燥製剤、再溶解溶液又は製品の、疾患又は病状を治療／予防するための薬剤の調製における用途を更に提供する。
本開示は、疾患又は病状を治療／予防する薬剤としての上記医薬組成物、凍結乾燥製剤、再溶解溶液又は製品を更に提供する。
本開示は、対象に治療有効量又は予防有効量の上記医薬組成物、凍結乾燥製剤、再溶解溶液又は製品を投与することを含む、疾患又は病状を治療又は予防する方法を更に提供する。
幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の疾患又は病状は、ＰＤ－１に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の疾患は、腫瘍である。別の幾つかの実施形態において、上記の何れか一項に記載の疾患は、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝細胞腫、肝内胆管がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイド症とメルケル細胞がんから選ばれ、そのうちの幾つかの実施形態では、上記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、上記肺がんは非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、上記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれ、別の幾つかの実施形態では、上記疾患は、ＰＤ－Ｌ１陽性の黒色腫、肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、胃がん、腎がん、膀胱がん、腸がんと結腸がんから選ばれ、別の幾つかの実施形態では、上記疾患は黒色腫、肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、胃がん、腎がん、膀胱がん、腸がんと結腸がんから選ばれる。
抗ＰＤ－１抗体によるＰＤ－１とそのリガンドとの結合への遮断試験の結果である。 ＰＢＭＣ細胞によるＩＦＮγの分泌に対する抗ＰＤ－１抗体の影響である。 マウス結腸がんＭＣ３８移植腫瘍に対する抗ＰＤ－１抗体の治療効果である。 マウス結腸がんＭＣ３８腫瘍体積に対する抗ＰＤ－１抗体の影響である。 抗ＰＤ－１抗体製剤のＤＯＥフィッティング図である。
用語
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で別途明示的に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
「緩衝液」又は「緩衝剤」は、その酸－塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に耐える緩衝液を指す。ｐＨを適当な範囲に制御する緩衝液の例は、酢酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、グルコース酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、シュウ酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酒石酸塩緩衝液、フマル酸塩緩衝液、グリシルグリシン緩衝液と他の有機酸緩衝液を含む。
「酢酸塩緩衝剤」又は「酢酸塩緩衝液」は、酢酸イオンを含む緩衝液である。酢酸塩緩衝液の例は、酢酸－酢酸ナトリウム、ヒスチジン－酢酸塩、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどを含む。本開示の幾つかの実施形態では、酢酸塩緩衝液は酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（酢酸ナトリウム塩ともいい、ＡＡと略す）である。
「ヒスチジン塩緩衝剤」又は「ヒスチジン緩衝液」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝液である。ヒスチジン緩衝液の例は、ヒスチジン－塩酸塩、ヒスチジン－酢酸塩、ヒスチジン－リン酸塩、ヒスチジン－硫酸塩などの緩衝液を含む。本開示の幾つかの実施形態では、緩衝液はヒスチジン－酢酸塩緩衝液（ヒスチジン酢酸塩ともいい、Ｈｉｓ－ＡＡと略す）である。
「コハク酸塩緩衝剤」又は「コハク酸塩緩衝液」は、コハク酸イオンを含む緩衝液である。コハク酸塩緩衝液の例は、コハク酸－コハク酸ナトリウム、コハク酸－コハク酸カリウム、コハク酸－コハク酸カルシウム緩衝液などを含む。本開示の幾つかの実施形態では、コハク酸塩緩衝液は、コハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液（コハク酸ナトリウム塩ともいい、ＳＡと略す）である。
「クエン酸塩緩衝剤」又は「クエン酸塩緩衝液」は、クエン酸イオンを含む緩衝剤である。クエン酸塩緩衝剤の実例は、クエン酸－クエン酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸カリウム、クエン酸－クエン酸カルシウム、クエン酸－クエン酸マグネシウム緩衝液などを含む。好ましいクエン酸塩緩衝剤は、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液（クエン酸ナトリウム塩ともいい、ＣＡと略す）である。
浸透圧調整剤は、溶液の浸透圧を調整するための物質を指す。浸透圧調整剤の実例は、糖類（単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含む）、アミノ酸（アルギニン、グリシン、システイン、ヒスチジンなどを含む）、塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、浸透圧調整剤は糖であり、上記糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール（ソルビットともいう）、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビット、マルトースアルコール、ラクトースアルコールとイソ－マルツロースから選ばれ、幾つかの実施形態では、糖は非還元二糖であり、幾つかの実施形態では、上記糖は、トレハロース又はスクロースが好ましく、スクロースが最も好ましい。幾つかの実施形態では、上記浸透圧調整剤はアミノ酸であり、アルギニン、グリシンが好ましく、幾つかの実施形態では、上記浸透圧調整剤は塩類であり、塩化ナトリウムが好ましい。
「等張」は、製剤がヒトの血液とほぼ同じ浸透圧を有することを示す。等張は、この分野における公知の方法により測定可能であり、例えば、蒸気圧又は凍結型浸透圧計により測定されてもよい。投与経路が皮下注射である場合、医薬組成物の浸透圧は２８０ ｍＯｓｍ～３２０ ｍＯｓｍに制御することが好ましく、浸透圧調整剤は７０ ｍｇ／ｍＬ～９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースが好ましく、薬物製剤の浸透圧は３００ ｍＯｓｍ程度に制御することがより好ましく、浸透圧調整剤は含有量が８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースが好ましい。
「医薬組成物」は、１種又は複数種の本明細書に記載される化合物又はその生理学的／薬学的に使用可能な塩又はプロドラッグと、生理学的／薬学的に使用可能なベクターと賦形剤などの他の化学成分とを含む混合物を示す。医薬組成物は、抗体の活性成分の安定性を保持し、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物活性を発揮する。本明細書において、「医薬組成物」と「製剤」は互いに排他的ではない。
「置換」は、抗体タンパク質を溶解する溶剤系の置換を指し、例えば、抗体タンパク質が安定な製剤に存在するように、製剤を安定化する緩衝系で物理的な操作方式により抗体タンパク質を含む高塩又は高浸透圧の溶剤系を置換する。上記物理的な操作方式は、限外ろ過、透析又は遠心分離後の再溶解を含むが、これらに限定されない。
本開示の医薬組成物又は製剤は、この分野における公知の方法により調製することができる。例示的に、抗体医薬組成物又は製剤の調製は以下の通りである。ステップ１：一定量の精製された抗体溶液を取り、抗体を含まない緩衝剤（例えば、ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム塩緩衝液１０ ｍＭ）で溶剤を置換し（好ましくは限外ろ過）、限外ろ過膜により少なくとも６倍の体積で置換し、抗体を約１３０ ｍｇ／ｍＬに濃縮する。スクロースの最終濃度が８０ ｍｇ／ｍＬになるように、一定体積のスクロース母液を加え、均一に混合する。ポリソルベート８０の最終濃度が０．６ ｍｇ／ｍＬになるように、一定体積のポリソルベート８０母液を加え、均一に混合する。抗体濃度が１２０ ｍｇ／ｍＬになるように、ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム塩緩衝液１０ ｍＭを加えて定容する（他の試験待ち製剤又は安定な製剤は、このようなステップに従って調製されてもよい）。製品をろ過した後にセンターコンソールによってサンプリングして無菌性を検出する。原液を０．２２ μｍのろ材に通し、ろ液を収集する。ステップ２：装入量を調節し、ろ液をバイアル瓶に充填し、栓をして、それぞれ充填開始、充填中、充填終了時にサンプリングしてセンターコンソールによって装入量の差を検出する。ステップ３：蓋付け機をオンにし、アルミニウム蓋を施し、蓋を圧着する。ステップ４：目視により、製品に不正確な装入量などの欠陥がないと確認する。バイアル瓶のラベルを印刷し、貼り付け、カートンのラベルを印刷し、カートンを折り畳み、カートンに入れ、カートンのラベルを貼り付ける。
本開示に記載される医薬組成物の溶液形態は、特に説明のない限り、そのうちの溶剤は水である。
「凍結乾燥製剤」は、液体若しくは溶液形態の医薬組成物又は液体若しくは溶液製剤に対して真空凍結乾燥工程を行った後に得られた製剤又は医薬組成物を示す。「凍結乾燥製剤」は、医薬組成物又は液体若しくは溶液製剤を凍結乾燥することにより得ることができる。製剤の凍結及びその後の一次乾燥に適する温度での水の昇華により、凍結乾燥を行う。この条件下で、生成物の温度は製剤の低共融点又は分解温度よりも低い。通常約５０ミリトル～２５０ミリトルの範囲にある適当な圧力で、一般的に、一次乾燥の保存温度の範囲は約－３０℃～２５℃である（生成物が一次乾燥中に凍結されたままであると仮定する）。乾燥に必要な時間は、製剤、試料を収容する容器（例えば、ガラスバイアル）の大きさと種類及び液体の体積によって決められ、上記時間の範囲は、数時間から数日間（例えば、４０時間～６０時間）であってもよい。二次乾燥段階は約０℃～４０℃で行われてもよく、これは、主に容器の種類と大きさ及び使用されるタンパク質の種類によって決められる。二次乾燥の時間は、生成物における所望の残りの湿度レベルによって決められ、通常、少なくとも約５時間が必要である。通常、低圧で凍結乾燥された製剤の含水量は約５％よりも低く、好ましくは約３％よりも低い。圧力は、一次乾燥工程に適用される圧力と同じであってもよく、好ましくは、二次乾燥の圧力が一次乾燥よりも低い。凍結乾燥の条件は、製剤及びバイアルの大きさによって変えてもよい。
本開示の界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロクサマー、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリル－スルホベタイン、ミリスチル－スルホベタイン、リノール－スルホベタイン、ステアリン－スルホベタイン、ラウリル－サルコシン、ミリスチル－サルコシン、リノール－サルコシン、ステアリン－サルコシン、リノール－ベタイン、ミリスチル－ベタイン、セチル－ベタイン、ラウラミドプロピル－ベタイン、コカミドプロピル－ベタイン、リノールアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ベタイン、パルミタミドプロピル－ベタイン、イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ジメチルアミン、パルミタミドプロピル－ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、メチルココイルナトリウム、メチルオレイルタウリンナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールの共重合体などから選ばれてもよい。好ましい界面活性剤はポリソルベート８０又はポリソルベート２０で、より好ましくはポリソルベート８０である。
本明細書に使用される「約」又は「ほぼ」という用語は、数値が当業者により測定される具体値の許容可能な誤差範囲にあることを意味し、上記数値部分が如何に計測又は測定するか（即ち、計測システムの限度）によって決められる。例えば、この分野での各回の実行において「約」は、１以内又は１を超えた標準差を意味してもよい。又は、「約」又は「ほぼ」は、多くとも２０％の範囲を意味してもよい。例えば、「約」又は「ほぼ」の後にある具体的な数値の上で±２０％、±１９％、±１８％、±１７％、±１６％、±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％又はそれ以下にし、当該範囲は、当業者に通常採用されている測定方法、技術的条件、検出試薬及び／又は検出機器によって決定され、このような範囲は、この分野で公知のものである。更に、特に生物学的システム又は過程について、当該用語は、多くとも１桁又は数値の多くとも５倍を意味してもよい。特に説明のない限り、具体値が本願及び特許請求の範囲に現れる場合、「約」又は「ほぼ」の意味は、当該具体値の許容可能な誤差範囲内にあると仮定すべきである。
本開示に記載される医薬組成物は、安定的な効果を達成することができ、そのうちの抗体は貯蔵された後、基本的にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を保持しており、好ましくは、医薬組成物は貯蔵された後、基本的にその物理的・化学的安定性及びその生物学的活性を保持している。貯蔵期間は、一般的に医薬組成物の所定の保存期間によって選択される。現在、タンパク質の安定性を測定する分析技術は多種あり、選択された温度で、選択された期間貯蔵された後の安定性を測定することができる。例えば、安定な薬物抗体製剤は、冷蔵温度（２℃～８℃）で例えば少なくとも３ヶ月、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１年間、更により好ましくは２年間も保存された場合に、顕著な変化が認められない製剤である。安定な製剤は、例えば、視覚分析で、薬物抗体製剤が無色、又は透明からやや乳白色であり、上記製剤の濃度、ｐＨと重量モル浸透圧濃度は±１０％以下の変化を有し、通常、約１０％以下、好ましくは約５％以下の切断が見られ、通常、約１０％以下、好ましくは約５％以下の凝集などが形成される。幾つかの実施形態では、本開示に係る医薬組成物又は凍結乾燥製剤は、２℃～８℃で少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月又は少なくとも２４ヶ月安定している。幾つかの実施形態では、製剤の強制分解（例えば、４０℃ Ｍ１）、加速条件下（例えば、２５℃ Ｍ６）、Ｄ７振とう（例えば、２５℃、３００ ｒｐｍ、１０日間振とう）、複数の凍結融解などの条件下での製剤の外観、ＳＥＣ、非還元ＣＥ－ＳＤＳとｉＣＩＥＦなどの指標を観察することにより、製剤の相対的安定性を検出することができる。
色及び／又は透明度を目視で検査した後、又はＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された後、抗体が顕著な凝集の増加、沈殿及び／又は変性を示さないと、上記抗体は、薬物製剤において「その物理的安定性を保持している」。タンパク質の配座の変化は、蛍光分光法（タンパク質の三次構造を確定するもの）により、及びＦＴＩＲ分光法（タンパク質の二次構造を確定するもの）により評価されてもよい。
抗体が顕著な化学的変化を示さないと、上記抗体は、薬物製剤において「その化学的安定性を保持している」。化学的に形態が変化されたタンパク質を検出・定量することにより、化学的安定性を評価することができる。タンパク質の化学構造を常に変化させる分解プロセスは、加水分解又は切断（サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの方法により評価される）、酸化（質量分析法又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせるペプチドマッピングなどの方法により評価される）、脱アミド化（イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸の測定などの方法により評価される）及び異性化（イソアスパラギン酸の含有量の測定、ペプチドマッピングなどにより評価される）を含む。
所定の期間における抗体の生物活性が薬物製剤の調製時に示された生物活性の所定範囲にあると、上記抗体は、薬物製剤において「その生物活性を保持している」。抗体の生物活性は、例えば、抗原結合測定によって決定することができる。
「プログラム死１」、「細胞プログラム死１」、「タンパク質ＰＤ－１」、「ＰＤ－１」、「ＰＤＣＤ１」と「ｈＰＤ－１」という用語は互いに交換して使用されてもよく、且つヒトＰＤ－１の変異体、アイソタイプ、種ホモログ、及びＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全なＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６４８６３で見出すことができる。
「プログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）」という用語は、ＰＤ－１の２種類の細胞表面糖タンパク質リガンドの一方であり（他方はＰＤ－Ｌ２）、ＰＤ－１と結合する時にＴ細胞の活性化とサイトカインの分泌をダウンレギュレートする。本明細書に使用されるような「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１の変異体、アイソタイプと種間ホモログ、及びｈＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを有する５種類の類似体を含む。完全なｈＰＤ－Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７で見出すことができる。
「サイトカイン」という用語は、１つの細胞集団から放出された、細胞間物質として他の細胞に作用するタンパク質の一般的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、ケモカインと伝統的なポリペプチドホルモンを含む。例示的なサイトカインは、ヒトＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１７とＩＬ－５を含む。
本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
本開示に記載される「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用されており、且つ異なる抗体構造を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）と抗体断片を含むが、これらに限定されず、それらが所望の抗原結合活性と特異性を示せばよい。本開示に記載される「抗体」は、「全長抗体」及びその「抗原結合断片」を含む。本開示の幾つかの実施例に記載されるＰＤ－１抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７４０９８に記載された抗ＰＤ－１抗体、例えば、「Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ」抗体である。本開示は、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７４０９８の全ての内容を本願に組み込んでいる。
「全長抗体」、「完全抗体」、「完全な抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書で互いに交換して使用されてもよく、ほぼ完全な形態の抗体を指し、以下定義される抗原結合断片と区別するものである。
「抗原結合断片」又は「機能断片」という用語は、完全抗体の、抗原（例えば、ＰＤ－１）と特異的に結合する能力が保たれた１つ又は複数の断片である。抗原結合断片の実例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメイン又はｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）を含むが、これらに限定されない。なお、Ｆｖ断片は、２つのドメインＶＬ及びＶＨが分離した遺伝子でコードされるが、組換え法により、合成されたリンカーでそれらを連結することで、その中のＶＬ及びＶＨ領域がペアになって１価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照）として産生することができる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれる。このような抗体断片は、当業者に知られている通常の技術により得られ、且つ、完全抗体と同じように、断片が機能性によってスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、又は、完全な免疫グロブリンを酵素的若しくは化学的に切断することにより産生することができる。幾つかの実施形態では、本開示の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量化のＶ領域（二重抗体）、ジスルフィド結合安定化のＶ領域（ｄｓＦｖ）などを含む。
抗体重鎖及び軽鎖において、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列は変化が大きく、可変領域（Ｖ領域）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は比較的に安定的で、定常領域（Ｃ領域）となる。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、４つの配列が比較的に保存的な骨格領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と、４つのＦＲ領域とからなり、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。
「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」又は「超可変領域」という用語は、抗体の可変ドメインにおいて抗原結合を促進する主な６つの超可変領域の１つを指す。通常、それぞれの重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、それぞれの軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５－７７（２００３）を参照）などを含む様々な公知の方案の何れか１つによって、ＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができる。例えば、典型的な書式では、Ｋａｂａｔ規則によれば、上記重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸の番号は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるアミノ酸残基の番号は２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）である。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方を組み合わせたＣＤＲ定義によって、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基である２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）と９５～１０２（ＨＣＤＲ３）及びヒトＶＬにおけるアミノ酸残基である２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）と８９～９７（ＬＣＤＲ３）により構成される。ＩＭＧＴ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）及び８９～９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴ規則によれば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎによって決定することができる。ＡｂＭ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸の番号は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５０～５８（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり、ＶＬにおけるアミノ酸残基の番号は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。特に説明のない限り、本開示の実施例に係る抗体可変領域及びＣＤＲ配列は何れも、「Ｋａｂａｔ」番号付け規則に適用する。
本開示に記載されるヒト抗体の重鎖定常領域及びヒト抗体の軽鎖定常領域の「通常変異体」とは、従来技術に開示された、抗体可変領域の構造と機能を変更しないヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の変異体であり、例示的な変異体は、重鎖定常領域に対して部位特異的に改造とアミノ酸置換を行ったＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域変異体を含み、具体的な置換は、例えば、従来技術における既知のＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、及び／又は、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ構造を得た変異（抗体重鎖にｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃの組み合わせを付与する）であり、これらの変異は、抗体可変領域の機能を変更せずに、抗体に新しい性能を付与することが確認された。
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び全ヒト抗体を含み、好ましくはヒト化抗体である。
「マウス抗体」という用語は、本開示においてこの分野の知識と技術により調製されたヒトＰＤ－１に対するモノクローナル抗体である。調製時にＰＤ－１抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現したハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい一実施形態において、上記マウス抗ＰＤ－１抗体は、マウスκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。
「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、マウス抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。通常、キメラ抗体を作成するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成してから、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、更に必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、発現ベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体を発現する。本開示の好ましい一実施形態において、上記ＰＤ－１キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含む。上記ＰＤ－１キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくはその変異体の重鎖定常領域を更に含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ変異、及び／又は、Ｓ２２８Ｐ変異）のＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４変異体を使用する。
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なる種類のヒト生殖細胞系の抗体フレームワーク配列に移植して発生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことにより誘導された異種反応性を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む共通ＤＮＡデータベース又は開示された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで取得可能）、及びＫａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版から見出すことができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保つことができる。本開示のヒト化抗体は、更に酵母菌で提示される、ＣＤＲに対して親和性成熟変異を行ったヒト化抗体も含む。
本開示における「ヒト抗体」（ＨｕＭＡｂ）、「ヒト抗体」、「全ヒト抗体」、「完全ヒト抗体」は、互いに交換して使用されてもよく、そのアミノ酸配列は、ヒト又はヒト細胞から産生された抗体のアミノ酸配列に対応し、又は、ヒト抗体ライブラリーや他のヒト抗体で配列がコードされた非ヒト由来のアミノ酸配列から誘導される。当該ヒト抗体についての定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。幾つかの技術案において、完全なヒト抗体は、遺伝子又は染色体トランスフェクション方法及びファージディスプレイ技術により構築されてもよく、体外で活性化されたＢ細胞で構築されてもよく、これらは全てこの分野で知られているものである。
「アミノ酸差異」又は「アミノ酸変異」という用語は、元のタンパク質又はポリペプチドと比べて、元のタンパク質又はポリペプチドを基にして発生された１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む、変異体タンパク質又はポリペプチドにアミノ酸の変化又は変異があることを指す。
「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」という用語は、当該可変ドメインの抗原結合環（ＣＤＲ）のステントとして用いられる可変ドメインＶＬ又はＶＨの一部を指す。実質的に、それは、ＣＤＲを有しない可変ドメインである。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、抗原における免疫グロブリン又は抗体に特異的に結合する部位（例えば、ＰＤ－１分子における特定の部位）である。エピトープは通常、独特な空間配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続的又は非連続的なアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅｄ．（１９９６）が参照される。
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」という用語は、予め決定された抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。通常、抗体は、約１０－７ Ｍ未満、例えば、約１０－９ Ｍ、１０－１０ Ｍ、１０－１１ Ｍ未満、又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合する。
「ＫＤ」又は「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体‐抗原が互いに作用する解離平衡定数を指す。通常、本開示の抗体は、約１０－７ Ｍ未満、例えば、約１０－８ Ｍ又は１０－９ Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＰＤ－１に結合し、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によりＢＩＡＣＯＲＥ機器にて測定される。
「競合」という用語は、同じエピトープの抗原結合タンパク質の競合（例えば、抗原結合タンパク質の中和又は抗体の中和）に利用される場合に、抗原結合タンパク質間の競合を指し、下記の測定法により測定される：上記測定法において、検出待ちの抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能断片）により、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド又は参照抗体）と共通抗原（例えば、ＰＤ－１抗原又はその断片）との特異的結合を防止又は阻害（例えば、低減）する。様々な競合的結合測定は、１つの抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合しているかを確定するために利用することができ、これらの測定は、例えば、固相直接又は間接放射免疫測定（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合測定（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照）、固相直接標識測定、固相直接標識サンドイッチ測定（例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体、実験マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ－１２５マーカーを用いる固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５４６－５５２を参照）、及び直接標識するＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）である。通常、上記測定法は、未標識の検出抗原結合タンパク質及び標識した参照抗原結合タンパク質の何れか１つを担持した固相表面又は細胞に結合する精製した抗原の使用に関わっている。測定される抗原結合タンパク質の存在下で固相表面又は細胞に結合する標識量を測定することにより、競合的阻害を測定する。通常、測定される抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合的測定（競合的抗原結合タンパク質）により同定される抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質と、参照抗原結合タンパク質の結合エピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質とを含み、上記２つのエピトープは空間的に互いに干渉し合いながら結合を行う。本明細書の実施例には、競合的結合を測定するための方法の他の詳細な資料が提供される。通常、競合的抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合に、参照抗原結合タンパク質と共通抗原との特異的結合は、少なくとも４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％又は７５％以上阻害（例えば、低減）される。結合は、少なくとも８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９７％又は９７％以上阻害される場合がある。
本明細書に使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、単鎖又は二重鎖であってもよく、好ましくは、二重鎖ＤＮＡ又は単鎖ｍＲＮＡ又は修飾されたｍＲＮＡである。核酸が別の核酸配列と共に機能的関係に置かれる場合、核酸は「効果的に連結されている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、上記コード配列に効果的に連結されている。
「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは、他のＤＮＡセグメントをそれに連結可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す「プラスミド」である。別の実施形態において、ベクターは、他のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結可能なウイルスベクターである。本願に開示されたベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）。
従来技術においてよく知られている抗体及び抗原結合断片の産生・精製方法は、例えば、冷泉港の抗体実験技術マニュアルの５～８章及び１５章の通りである。例えば、マウスはヒトＰＤ－１又はその断片により免疫可能であり、得られた抗体は復元、精製されることができると共に、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は、同じく通常の方法により調製することができる。発明に記載される抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒトのＣＤＲ領域に１つ以上のヒトＦＲ領域が加えられる。ヒトＦＲ生殖細胞系配列は、ＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアをアラインメントすることにより、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のホームページであるｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから取得し、又は免疫グロブリン雑誌である２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得ることができる。
「宿主細胞」という用語は、その中に発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物又は動物の細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。好適な微生物は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。好適な動物宿主細胞系は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）及びＮＳ０細胞を含む。
本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローンニングしてＧＳ発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。更に好ましい従来技術の一つとして、哺乳類発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体を発現することにより、安定的なクローンが得られる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製が行われる。非特異的に結合した成分を洗い流す。更にｐＨ勾配法により、結合した抗体を溶離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で凍結し、又は凍結乾燥しなければならない。
「投与」、「与える」及び「処理」は動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「投与」、「与える」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬と細胞との接触、及び試薬と流体との接触を含み、ここで、上記流体は細胞と接触する。「投与」、「与える」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
「治療」は、例えば、本開示の何れか１つの結合化合物の組成物を含む経口又は外用治療剤を患者に与えることを意味し、上記患者は１種又は複数種の疾患症状を有するが、既知の上記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有する。通常、治療される患者又はグループには、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導し、又は臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこれらの症状を抑制する。何れかの具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の患者において必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。当該症状の重症度や進行状況を評価するために医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる何れの臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、各標的疾患症状の緩和において無効である可能性があるが、この分野で既知の任意の統計学的検定方法、例えばＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を低減するはずであることが確認された。
「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」は、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖の配座や剛性など）を有する他のアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸を置換することで、タンパク質の生物学的活性を変えずに頻繁に変化可能にすることを意味する。当業者に知られているように、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換によって、基本的に生物学的活性を変えることはない（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４ページ、（第４版）を参照）。また、構造又は機能が類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換は、「例示的なアミノ酸保存的置換」という下記の表に記載される。
Figure 2023535384000003
「有効量」又は「有効用量」は、何れか１種又は複数種の有益又は必要な治療結果を得るために必要な薬剤、化合物又は医薬組成物の量を指す。予防的用途として、有益又は必要な結果は、病症、その合併症と病症の進行中に現れた中間的な病理学的表現型の生化学的、組織学的及び／又は行動的症状を含め、リスクの解消や低減、重症度の軽減又は病症の発作の遅延を含む。治療的応用として、有益又は必要な結果は、様々な本開示の標的抗原関連病症の罹患率の低減又は上記病症の１つ又は複数の症状の改善、病症の治療に必要な他の薬剤の用量の低減、別の薬剤の治療効果の向上、及び／又は、患者の本開示の標的抗原関連病症の進行の遅延などの臨床的結果を含む。
「外因性」は、場合によって生物、細胞やヒトの体外で発生された物質を意味する。「内因性」は、場合によって細胞、生物やヒトの体内で発生された物質を意味する。
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列の類似性である。２つの比較される配列における位置が何れも同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンに占められる場合、上記分子が当該位置で相同である。２つの配列間の相同性百分率は、２つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って１００をかける関数である。例えば、配列の最適アラインメントを行う際に、２つの配列中の１０個の位置に６個がマッチングし、又は相同である場合は、２つの配列が６０％相同であり、２つの配列中の１００個の位置に９５個がマッチングし、又は相同である場合は、２つの配列が９５％相同である。通常、２つの配列をアライメントする際に、最大百分率の相同性が得られるように、比較を行う。比較は、例えば、各参照配列の全長にわたって各配列間の最大マッチングが得られるようにアルゴリズムのパラメータを選択するＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、実行することができる。下記の参考文献は、配列分析によく用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに言及している：ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ）：Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ， Ｗ．ｅｔ ａｌ．、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６。その他、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴにより提供される通常のＢＬＡＳＴアルゴリズムも、当業者によく知られている。
本明細書に使用される「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」という表現は、互いに交換して使用されてもよく、これらの名称は何れも子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という単語は、移転数を考慮せずに、初代被験細胞及びそれより誘導された培養物を含む。また、意図する又は意図しない変異のために、あらゆる子孫は、ＤＮＡ含有量において精確に同じであり得ないと理解すべきである。最初の形質転換細胞からスクリーニングされたものと同様の機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なる名称を指す場合は、文脈から明らかに分かる。
本明細書に使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、その中の微量の特定部分の核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡが、例えば米国特許番号４，６８３，１９５に記載されるように増幅するプログラム又は技術を指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーの設計が可能になるように、目標領域末端からの配列情報又はそれ以外の配列情報を取得する必要があり、これらのプライマーは配列において、増幅すべきテンプレートの対応する鎖と同様又は類似である。２つのプライマーの５’端ヌクレオチドは、増幅待ち材料の末端に一致してもよい。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定ＤＮＡ配列、及び全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、ファージ又はプラスミド配列などの増幅に用いることができる。一般的に、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｏｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅｒｌｉｃｈ、（１９８９）ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）が参照される。本明細書に用いられるＰＣＲは、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一実例とされるが、唯一の実例ではなく、上記方法は、核酸の特定部分を増幅又は産生するために、プライマーとなる既知の核酸及び核酸ポリメラーゼを用いることを含む。
「単離した」とは、精製状態であり、且つこの場合、指定された分子に、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの他の生物分子、又は細胞破片や成長培地などの他の材料を基本的に含まないことを意味する。通常、「単離した」という用語は、例えば、本明細書に記載される化合物の実験や治療的用途を明らかに干渉する量で存在しない限り、これらの材料が全然存在しない、又は水、緩衝液や塩が存在しないことを意味する意図はない。
「任意選択」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしもその必要はないことを意味する。
また、本開示は、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）陽性細胞に関連する疾患を治療するための薬剤を含み、上記薬剤は、本開示の抗ＰＤ－１抗体を活性成分として含む。
本開示において、ＰＤ－１に関連する疾患は制限がなく、ＰＤ－１に関連する疾患であればよく、例えば、本開示の分子により誘導される治療反応は、ヒトＰＤ－１に結合し、そしてＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２との結合を阻害し、又はＰＤ－１を過剰発現した腫瘍細胞を殺傷することにより実現することができる。従って、治療的応用に適用される調製物及び製剤にある場合、本開示の分子は、腫瘍又はがん、好ましくは黒色腫、結腸がん、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎がん、非小細胞肺がん、膀胱がんなどを罹患しているヒトに非常に有用である。
また、本開示は、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）の免疫検出又は測定に利用される方法、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）の免疫検出又は測定に利用される試薬、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）を発現した細胞の免疫検出又は測定に利用される方法、及び標的抗原（例えば、ＰＤ－１）陽性細胞に関連する疾患の診断に利用される診断剤に関し、本開示の標的抗原（例えば、ヒトＰＤ－１）を特異的に認識すると共に細胞外領域のアミノ酸配列又はその３次元構造に結合する抗体又は抗体断片を活性成分として含む。
本開示において、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）の量の検出又は測定に利用される方法は、何れの既知の方法であってもよい。例えば、免疫検出又は測定方法が含まれる。
免疫検出又は測定方法は、標識された抗原又は抗体を用いて抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫検出又は測定方法の実例としては、放射性物質で標識する免疫抗体方法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法、物理化学的方法などが含まれる。
上記ＰＤ－１陽性細胞に関連する疾患は、本開示の抗体又は抗体断片により、ＰＤ－１を発現した細胞を検出又は測定することで診断することができる。
ポリペプチドを発現した細胞を検出するために、既知の免疫検出方法、好ましくは、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法などを利用することができる。更に、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）による蛍光抗体染色法などを利用することができる。
本開示において、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）の検出又は測定に利用される生体試料は特に制限がなく、標的抗原（例えば、ＰＤ－１）を発現した細胞を含む可能性があるものであればよく、例えば、組織球、血液、血漿、血清、膵液、尿液、糞便、組織液又は培養液である。
必要な診断方法に応じて、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む診断剤は、抗原－抗体反応を実行するための試薬又は反応を検出するための試薬を更に含んでもよい。抗原－抗体反応を実行するための試薬は、緩衝剤、塩などを含む。検出するための試薬は、一般的に免疫検出又は測定方法に利用される試薬、例えば、上記モノクローナル抗体、その抗体断片又はその結合物の標識を認識する第２抗体と上記標識に対応する基質などを含む。
幾つかの技術案において、抗原は次のように調製される。
Ｎ末端がヒトＰＤ－１細胞外領域の１５０個のアミノ酸で、Ｃ末端がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）であるヒトＰＤ－１－ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を設計して合成する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの親和性カラムにより精製し、抗ＰＤ－１抗体と抗原の結合を検出するための高純度の組換えＰＤ－１－Ｆｃタンパク質を得ることができる。
ヒトＰＤ－１－ＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号１）：
Figure 2023535384000004
注記：下線部はシグナルペプチド、ローマン体部はヒトＰＤ－１細胞外領域、イタリック体部はｈＩｇＧ１Ｆｃ（シグナルペプチド＋細胞外領域＋ｈＩｇＧ１Ｆｃ）である。
ヒトＰＤ－１－ｈｉｓ（配列番号２）：
Figure 2023535384000005
トランスフェクション細胞の核酸でコードされたＰＤ－１抗原（配列番号３）：
Figure 2023535384000006
幾つかの技術案において、抗ヒトＰＤ－１抗体は、免疫マウスから産生されてもよく、抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーから取得されてもよい。
免疫マウスからヒトＰＤ－１抗体を調製する方法は、以下の通りである。
１．免疫：雌で６週齢～８週齢の実験用ＳＪＬ白いマウス、及び雌で６週齢～８週齢のＢａｌｂ／ｃ白いマウスである。飼育環境：ＳＰＦグレード。マウスを購入した後、１２／１２時間の明／暗周期で調節し、温度が２０℃～２５℃、湿度が４０％～６０％である実験室環境で１週間飼育する。環境に適応したマウスには異なる方案で免疫し、１群あたり６匹～１０匹である。免疫抗原は、精製された組換えタンパク質ＰＤ－１－ＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号１参照）、ＰＤ－１－ｈｉｓ（配列番号２参照）、又はＰＤ－１を抗原（配列番号３参照）としてトランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ／ＣＨＯ－ＰＤ－１細胞であってもよく、単一の抗原を使用して異なる免疫アジュバント又は様々な免疫原と合わせて交差免疫してもよい。免疫部位は、腹腔又は背部皮下であってもよく、又は２つの位置で交互に免疫してもよい。免疫アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ(登録商標） Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（以下、Ｔｉｔｅｒｍａｘと略し、Ｓｉｇｍａから購入し、製品番号Ｔ２６８４）とＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ（以下、Ａｌｕｍと略し、Ｐｉｅｒｃｅから購入し、製品番号７７１６１）で交差免疫する。抗原とアジュバント（Ｔｉｔｅｒｍａｘ）の割合は１：１、抗原とアジュバント（Ａｌｕｍ）の割合は３：１であり、２５ μｇ／匹～５０ μｇ／匹（初回免疫）、５０ μｇ／匹（追加免疫）、又は１×１０７個のＪｕｒｋａｔ／ＣＨＯ－ＰＤ－１細胞／匹である。０日目に乳化された抗原を２５ μｇ／匹～５０ μｇ／匹で腹膜内に注射し、初回免疫後に週１回又は２週間に１回、合計５回～８回でＴｉｔｅｒｍａｘとＡｌｕｍを交互に使用する。
２．細胞の融合：血清中抗体力価の高いマウスを選択して脾細胞の融合を行い、初回免疫の７２ ｈ（「ｈ」は「時間」の略語で、以下同様）後のマウスの眼球から放血し、頚椎脱臼により致死し、７５％のエタノールに入れて消毒する。最適化されたＰＥＧ媒介性の融合工程により、脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（中国科学院）を融合してハイブリドーマ細胞を得る。融合済みのハイブリドーマ細胞をＨＡＴ完全培地（２０％のＦＢＳ、１×ＨＡＴと１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）で再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに分注し（１×１０５／１５０ μＬ／ウェル）、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートし、プレート１０枚～３０枚程度に接種する。融合後の５日間にＨＡＴ完全培地を加え、５０ μＬ／ウェルで、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートする。融合後の７日目～８日目に、細胞の成長密度によって溶液を全て置換し、２００ μＬ／ウェルで、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。
３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング：融合後の７日目～９日目に、細胞の成長密度によって、抗体のＰＤ－１との結合をＥＬＩＳＡ方法で検出し、検出される陽性ウェル細胞に対してＰＤ－１／ＰＤＬ１結合の阻断をＥＬＩＳＡで検出し、陽性ウェルにおいて溶液を置換し、細胞密度によって２４ウェルプレートに適時に増幅する。２４ウェルプレートに移入した細胞株を再測定した後、種として保存して初回のサブクローニングを行う。初回のサブクローニングで陽性としてスクリーニングされたものを種として保存し、そして単細胞クローンが得られるまで２回目又は３回目のサブクローニングを行う。数回の融合により、ＰＤ－１とＰＤＬ１の結合への遮断効果を有するハイブリドーマ細胞を得る。
抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーから抗ヒトＰＤ－１抗体を得る方法は、以下の通りである。
１．抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーの構築：血清中抗体力価の高いマウスの脾臓を選択し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ．１５５９６－０１８）により組織の全ＲＮＡを抽出する。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ(商標) ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ試薬キット（Ｔａｋａｒａ Ｃａｔ Ｎｏ．６２１０Ａ）により逆転写を行ってｃＤＮＡを得る。ＩＭＧＴデータベースに従ってライブラリーを構築するプライマーを設計して合成する。３ラウンドのＰＣＲ反応により、単鎖抗体断片を得る。単鎖抗体断片及び改変されたライブラリー構築用のベクターｐＣａｎｔａｂ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＧＥ Ｃａｔ Ｎｏ．２７－９４００－０１）をＳｆｉ１（ＮＥＢ Ｃａｔ Ｎｏ．＃Ｒ０１２３Ｌ）で酵素切断し、電気泳動後に、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．(登録商標） Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｃａｔ Ｎｏ．Ｄ２５００－０２）で精製回収する。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ Ｃａｔ Ｎｏ．＃Ｍ０２０２Ｌ）により１６℃で１６時間～１８時間連結し、そして上記試薬キットで精製回収し、最後に脱イオン水で溶離する。１ μｇの連結生成物を１本のエレクトロポレーションコンピテントＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ．６０５０２－２）と混合し、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ）のパラメータを２．５ ｋＶ、２００ Ω、２５ ｕＦに設定し、エレクトロポレーションする。エレクトロポレーションを１０回繰り返し、プレートに塗布し、３７℃で１６時間～１８時間倒置培養する。全てのコロニーを擦って洗い落として一緒に混合し、最終濃度が１５％のグリセリンを加え、－８０℃で保存して使用に備える。
２．抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーのスクリーニング：包装された抗ヒトＰＤ－１ファージ免疫ライブラリー（１×１０１２～１×１０１３）と１００ μＬのストレプトアビジンビーズ（Ｍｉ１ｅｎｖｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を２％の脱脂乳を含むリン酸塩緩衝液（ＭＰＢＳと略す）１ ｍＬに入れて室温で１時間インキュベートし、磁気フレームに置き、上清を取る。上清をビオチン化したヒトＰＤ－１－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）１０ μｇ／ｍＬに入れて室温で１時間インキュベートし、更にストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズ（１ ｍＬのＭＰＢＳでプレインキュベートされる）１００ μＬを加えて室温で１時間インキュベートする。また、選別のためにそれを磁気フレームシステムに載せ、上清を吸い取る。１ ｍＬのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸塩緩衝液）を加え、数回反転させ、吸い尽くした後に新鮮な洗浄液を更に加え、１１回繰り返すことで、未結合の抗体断片を除去し、０．５ ｍＬの溶離液を加える（１０ ｍｇ／ｍＬのｔｒｙｐｓｉｎ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（原液）５０ μＬをＰＢＳ４５０ μＬに加える）。室温で１５ ｍｉｎ（「ｍｉｎ」は「分間」の略語で、以下同様）振とうする。磁気フレームに置き、上清を新しいＥＰ管へ吸い出す。ＴＧ１を２ＹＴ培地に接種して細菌密度ＯＤ６００＝０．４になるまで培養する。各管にＴＧ１（ＯＤ６００＝０．４）１．７５ ｍＬを加え、そして溶離されたファージ（ｐｈａｇｅ）２５０ μＬを加え、３７℃で水浴に静置して３０ ｍｉｎインキュベートし、勾配希釈してプレートに塗布し、力価の試験に用いる。残りのＴＧ１溶液を遠心分離し、プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートする。
ファージマウス免疫ライブラリーをビオチン化されたヒトＰＤ－１－ＥＣＤ－ｈｉｓ抗原により、２ラウンド～３ラウンドのＭＡＣＳスクリーニング（ストレプトマイシン磁気ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を経て、最終的に、ＰＤ－１と結合すると共にＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を遮断するモノクローナル抗体を取得し、シークエンシングして検証し、抗体の可変領域配列を得る。
幾つかの技術案において、抗体又は抗原タンパク質の精製方法は、以下の通りである。
１．ハイブリドーマ上清の分離・精製／ＰｒｏｔｅｉｎＧ親和性クロマトグラフィー：
マウスハイブリドーマ上清の精製には、第一選択として、ＰｒｏｔｅｉｎＧで親和性クロマトグラフィーを行い、培養して得られたハイブリドーマを遠心分離して上清を取り、上清の体積によって１０％～１５％の体積のＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～８．５）１ Ｍを加えて上清のｐＨを調節する。ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対して６ Ｍの塩酸グアニジンにより３倍～５倍のカラム体積を洗浄してから、純水で３倍～５倍のカラム体積を洗浄し、例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝系を平衡緩衝液として利用してクロマトグラフィーカラムに対して３倍～５倍のカラム体積を平衡し、細胞上清を低流速でカラムにかけて結合し、保持時間が約１ ｍｉｎ又はそれ以上になるように流速を制御し、紫外線吸収が基線に反落されるように、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でクロマトグラフィーカラムに対して３倍～５倍のカラム体積を洗浄し、０．１ Ｍの酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液により試料を溶離し、紫外線検出によって溶離ピークを収集し、溶離生成物を１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によりｐＨ５～６に速く調整して暫く保存する。溶離生成物に対しては、当業者によく知られている方法により溶液を置換することができ、例えば、限外ろ過管により限外ろ過して濃縮し、且つ溶液を所望の緩衝系に置換し、又はＧ－２５脱塩などのサイズ排除により所望の緩衝系に置換し、又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００などの高分解能サイズ排除カラムにより溶離生成物中の量体成分を除去することで試料の純度を向上させる。
２．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性クロマトグラフィーによるタンパク質又は抗体の精製：
まず、抗原タンパク質又は抗体を発現する細胞培養上清を高速に遠心分離して上清を収集する。ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性カラムに対して６ Ｍの塩酸グアニジンにより３倍～５倍のカラム体積を洗浄し、そして純水により３倍～５倍のカラム体積を洗浄する。例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝系を平衡緩衝液として利用してクロマトグラフィーカラムに対して３倍～５倍のカラム体積を平衡する。細胞上清を低流速でカラムにかけて結合し、保持時間が約１ ｍｉｎ又はそれ以上になるように流速を制御し、結合完了後に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により、紫外線吸収が基線に反落されるように、クロマトグラフィーカラムに対して３倍～５倍のカラム体積を洗浄する。０．１ Ｍの酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０～３．５）緩衝液により試料を溶離し、紫外線検出によって溶離ピークを収集し、溶離生成物を１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によりｐＨ５～６に速く調整して暫く保存する。溶離生成物に対しては、当業者によく知られている方法により溶液を置換することができ、例えば、限外ろ過管により限外ろ過して濃縮し、且つ溶液を所望の緩衝系に置換し、又はＧ－２５脱塩などのサイズ排除により所望の緩衝系に置換し、又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００などの高分解能サイズ排除カラムにより溶離生成物中の量体成分を除去することで試料の純度を向上させる。
以下、実施例と合わせて本開示を更に説明するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限するものではない。実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に、例えば冷泉港の抗体技術実験マニュアル、分子クローニングマニュアルなどの通常の条件、又は原料や商品のメーカーにより推薦された条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
実施例１．抗ヒトＰＤ－１マウス抗体の取得
上記方法により得られた抗ヒトＰＤ－１マウス抗体に対して抗原結合実験を行い、スクリーニングしてＭ２３、Ｍ３２とＭ３３を含む活性の良い抗体を複数株取得し、単細胞クローンを増幅培養し、ＲＮＡを抽出し、ｍｏｕｓｅ－Ｉｇの縮重プライマーを利用して逆転写増幅（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、抗体の可変領域配列を得た。当該マウス抗体の可変領域配列をヒト抗体の定常領域配列に連結し、クローニングして当該マウスモノクローナル抗体を発現するキメラ抗体を組換えし、体外活性実験を行い、得られたモノクローナル抗体の可変領域配列の正確性を確認した。
測定によると、マウス抗体Ｍ２３、Ｍ３２とＭ３３の可変領域配列は以下の通りである。
マウス抗体Ｍ２３の重鎖可変領域（配列番号４）：
Figure 2023535384000007
マウス抗体Ｍ２３の軽鎖可変領域（配列番号５）：
Figure 2023535384000008
マウス抗体Ｍ３２の重鎖可変領域（配列番号６）：
Figure 2023535384000009
マウス抗体Ｍ３２の軽鎖可変領域（配列番号７）：
Figure 2023535384000010
マウス抗体Ｍ３３の重鎖可変領域：（配列番号１９）
Figure 2023535384000011
マウス抗体Ｍ３３の軽鎖可変領域：（配列番号２０）
Figure 2023535384000012
備考：上記抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域配列において、下線部はＫａｂａｔ番号付けシステムで決定されたＣＤＲ配列であり、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
Figure 2023535384000013
実施例２．抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖・軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子のデータベースとのアラインメント及びＭＯＥソフトウェアによる分析により、Ｍ２３、Ｍ３２、Ｍ３３の重鎖・軽鎖配列と同一性の高いヒト生殖細胞系重鎖・軽鎖可変領域の生殖細胞系遺伝子をテンプレートとしてそれぞれ選択し、この３つのマウス抗体のＣＤＲを対応するヒト抗体テンプレートにそれぞれ移植し、その対応するヒト化抗体をそれぞれ構築した。
１．マウス抗体Ｍ２３のヒト化
１．１ マウス抗体Ｍ２３のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｍ２３は、ヒト化軽鎖テンプレートがＩＧＫＶ２－４０＊０１とＩＧＫＪ４＊０１で、ヒト化重鎖テンプレートがＩＧＨＶ１－６９＊０２とＩＧＨＪ６＊０１であり、ヒト化改変後に、可変領域配列は以下の通りである（下線部はＣＤＲである）。
Ｈｕ２３ＶＨ－ＣＤＲグラフト：（配列番号２７）
Figure 2023535384000014
Ｈｕ２３ＶＬ－ＣＤＲグラフト：（配列番号２８）
Figure 2023535384000015
１．２ マウス抗体Ｍ２３のヒト化テンプレートの選択と復帰変異の設計
Figure 2023535384000016
Ｍ２３のヒト化抗体軽鎖／重鎖可変領域配列は、以下の通りである。
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｈｕ２３ＶＬ－ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄと同様）：（配列番号２８）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（配列番号２９）
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ２３ＶＨ１（Ｈｕ２３ＶＨ－ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄと同様）：（配列番号２７）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＦＳＹＹＧＳＴＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ２３ＶＨ２（配列番号３０）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＦＳＹＹＧＳＴＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ２３ＶＨ３（配列番号３１）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＤＲＴＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＦＳＹＹＧＳＴＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ２３ＶＨ４（配列番号３２）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＤＲＴＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＲＦＳＹＹＧＳＴＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
１．３ マウス抗体Ｍ２３のヒト化配列の組み合わせ
マウス抗体Ｍ２３のヒト化後に得られた抗体及びその可変領域の組み合わせは、下記の表に示される。
Figure 2023535384000017
上記の表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えばＨｕ２３－１）は、それぞれ抗体軽鎖／重鎖定常領域に連結して全長抗体を形成することができ、本開示に明記のない限り、全長抗体を形成する時に、軽鎖可変領域は配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域と連結して抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域又は配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して抗体重鎖を形成し、且つ表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせの名称（例えばＨｕ２３－１）に、「．ＩｇＧ４ＡＡ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、「．ＩｇＧ４Ｐ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、例えば、「Ｈｕ２３－１．ＩｇＧ４ＡＡ」は、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。「Ｈｕ２３－１．ＩｇＧ４Ｐ」は、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。
２．マウス抗体Ｍ３２のヒト化
２．１ マウス抗体Ｍ３２のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｍ３２は、ヒト化軽鎖テンプレートがＩＧＫＶ２－４０＊０１とＩＧＫＪ４＊０１で、ヒト化重鎖テンプレートがＩＧＨＶ１－６９＊０２とＩＧＨＪ６＊０１であり、ヒト化可変領域配列は以下の通りである（下線部はＣＤＲである）。
Ｈｕ３２ＶＨ－ＣＤＲグラフト：（配列番号３３）ＩＧＨＶ１－６９＊０２とＩＧＨＪ６＊０１
Figure 2023535384000018
Ｈｕ３２ＶＬ－ＣＤＲグラフト：（配列番号３４）
Figure 2023535384000019
２．２ マウス抗体Ｍ３２のヒト化テンプレートの選択と復帰変異の設計
Figure 2023535384000020
マウス抗体Ｍ３２のヒト化抗体の軽鎖・重鎖可変領域配列は、以下の通りである。
＞Ｈｕ３２ＶＬ１（Ｈｕ３２ＶＬ－ＣＤＲグラフトと同様）：（配列番号３４）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ３２ＶＬ２（配列番号３５）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ３２ＶＨ１（Ｈｕ３２ＶＨ－ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄと同様）：（配列番号３３）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３２ＶＨ２（配列番号３６）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＳＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３２ＶＨ３（配列番号３７）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＦＴＦＳＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３２ＶＨ４（配列番号３８）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＳＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３２ＶＨ５（配列番号３９）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＦＴＦＴＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３２ＶＨ６（配列番号４０）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＦＴＦＴＤＹＥＩＨＷＶＫＱＡＰＧＨＧＬＥＷＩＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
２．３ マウス抗体Ｍ３２のヒト化配列の組み合わせ
マウス抗体Ｍ３２のヒト化後に得られた抗体及びその可変領域の組み合わせである。
Figure 2023535384000021
上記の表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えばＨｕ３２－１）は、それぞれ抗体軽鎖／重鎖定常領域に連結して全長抗体を形成することができ、本開示に明記のない限り、全長抗体を形成する時に、軽鎖可変領域は配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域と連結して抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域又は配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して抗体重鎖を形成し、且つ表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせの名称（例えばＨｕ３２－１）に、「．ＩｇＧ４ＡＡ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、「．ＩｇＧ４Ｐ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、例えば、「Ｈｕ３２－１．ＩｇＧ４ＡＡ」は、Ｈｕ３２ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。「Ｈｕ３２－１．ＩｇＧ４Ｐ」は、Ｈｕ３２ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。
３．マウス抗体Ｍ３３のヒト化
３．１ マウス抗体Ｍ３３のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｍ３３は、ヒト化軽鎖テンプレートがＩＧＫＶ１－３９＊０１とＩＧＫＪ４＊０１で、ヒト化重鎖テンプレートがＩＧＨＶ３－７とＩＧＨＪ６＊０１であり、ヒト化可変領域配列は以下の通りである。
Ｈｕ３３ＶＨ－ＣＤＲグラフト（配列番号４１）：
Figure 2023535384000022
Ｈｕ３３ＶＬ－ＣＤＲグラフト（配列番号４２）：
Figure 2023535384000023
３．２ マウス抗体Ｍ３３のヒト化テンプレートの選択と復帰変異の設計
Figure 2023535384000024
マウス抗体Ｍ３３のヒト化抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域の配列は、以下の通りである。
＞Ｈｕ３３ＶＬ１（Ｈｕ３３ＶＬ－ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄと同様）：（配列番号４２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ３３ＶＬ２（配列番号４３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ３３ＶＬ３（配列番号４４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＧＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
＞Ｈｕ３３ＶＨ１（Ｈｕ３３ＶＨ－ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄと同様）：（配列番号４１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＶＤＴＹＹＱＤＮＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＹＧＨＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３３ＶＨ２（配列番号４５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＶＤＴＹＹＱＤＮＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＧＨＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
＞Ｈｕ３３ＶＨ３（配列番号４６）
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＶＤＴＹＹＱＤＮＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＧＨＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
３．３ マウス抗体Ｍ３３のヒト化配列の組み合わせ
Figure 2023535384000025
上記の表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えばＨｕ３３－６）は、それぞれ抗体軽鎖／重鎖定常領域に連結して全長抗体を形成することができ、本開示に明記のない限り、全長抗体を形成する時に、軽鎖可変領域は配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域と連結して抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域又は配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して抗体重鎖を形成し、且つ表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせの名称（例えばＨｕ３３－６）に、「．ＩｇＧ４ＡＡ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、「．ＩｇＧ４Ｐ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、例えば、「Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ」は、Ｈｕ３３ＶＨ３重鎖可変領域と配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ３３ＶＬ２軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。「Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４Ｐ」は、Ｈｕ３３ＶＨ３重鎖可変領域と配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ３３ＶＬ２軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。
４．ヒト化抗体の突変異体
４．１ Ｈｕ２３ヒト化抗体の変異抗体
コンピューターシミュレーションにより、Ｈｕ２３ヒト化抗体の軽鎖ＬＣＤＲ１（配列番号１１）の特定部位のアミノ酸に対して部位特異的変異を行い、具体的な変異は表１１に示される。
Figure 2023535384000026
ＬＣＤＲ１変異後のＨｕ２３ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列は、以下の通りである。
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｑ）配列：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５３）
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｌ）配列：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＬＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５４）
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）配列：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５５）
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｄ）配列：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５６）
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｇ２９Ａ）配列：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＡＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５７）
＞Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｇ２９Ｖ）配列：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＶＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５８）
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（Ｎ２８Ｑ）配列：
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（Ｎ２８Ｌ）配列：
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＬＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（Ｎ２８Ｔ）配列：
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６１）
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（Ｎ２８Ｄ）配列：
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６２）
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（Ｇ２９Ａ）配列：
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＡＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６３）
＞Ｈｕ２３ＶＬ２（Ｇ２９Ｖ）配列：
ＤＧＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＶＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６４）
Figure 2023535384000027
上記の表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えばＨｕ２３－１１）は、それぞれ抗体軽鎖／重鎖定常領域に連結して全長抗体を形成することができ、本開示に明記のない限り、全長抗体を形成する時に、軽鎖可変領域は配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域と連結して抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域又は配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して抗体重鎖を形成し、且つ表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせの名称（例えばＨｕ２３－１１）に、「．ＩｇＧ４ＡＡ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、「．ＩｇＧ４Ｐ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、例えば、「Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ」は、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。「Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４Ｐ」は、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。
実験の結果に示されるように、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｑ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｌ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｔ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｄ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｇ２９Ａ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｇ２９Ｖ）という部位が変異されたヒト化抗体は、何れもＰＤ－１との結合能力を保持している（表１６）。
４．２ Ｈｕ３２ヒト化抗体の変異抗体
配列分析によると、Ｍ２３由来の一連のヒト化抗体Ｈｕ２３とＭ３２由来の一連のヒト化抗体Ｈｕ３２の配列とは同一性が比較的に高く、Ｈｕ２３軽鎖可変領域とＨｕ３２の重鎖可変領域とは、新たな軽鎖・重鎖可変領域の組み合わせとして組み合わせられる。実験の結果に示されるように、新たに組み合わせられた軽鎖・重鎖可変領域を含むヒト化抗体は、何れもＰＤ－１抗原との結合能力を保持している（表１６）。
Figure 2023535384000028
Figure 2023535384000029
Figure 2023535384000030
上記の表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えばＨｕ３２ａ－８５）は、それぞれ抗体軽鎖／重鎖定常領域に連結して全長抗体を形成することができ、本開示に明記のない限り、全長抗体を形成する時に、軽鎖可変領域は配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域と連結して抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域又は配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して抗体重鎖を形成し、且つ表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせの名称（例えばＨｕ３２ａ－８５）に、「．ＩｇＧ４ＡＡ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、「．ＩｇＧ４Ｐ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、例えば、「Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ」は、Ｈｕ３２ＶＨ６重鎖可変領域と配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。「Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４Ｐ」は、Ｈｕ３２ＶＨ６重鎖可変領域と配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。
Figure 2023535384000031
上記の表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えばＨｕ２３ａ－５７）は、それぞれ抗体軽鎖／重鎖定常領域に連結して全長抗体を形成することができ、本開示に明記のない限り、全長抗体を形成する時に、軽鎖可変領域は配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域と連結して抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域又は配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して抗体重鎖を形成し、且つ表中に示された抗体軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせの名称（例えばＨｕ３２ａ－８５）に、「．ＩｇＧ４ＡＡ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、「．ＩｇＧ４Ｐ」という接尾語を付ける場合は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域と連結して形成された全長抗体を示し、例えば、「Ｈｕ２３ａ－５７．ＩｇＧ４ＡＡ」は、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２で示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。「Ｈｕ２３ａ－５７．ＩｇＧ４Ｐ」は、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９で示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域を連結して形成された重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３で示されるＫａｐｐａ鎖定常領域を連結して形成された軽鎖とからなる全長抗体を示す。
５．ヒト化抗体のスクリーニング
Ｂｉａｃｏｒｅにより様々なヒト化抗体の親和性を検出した（方法は試験例３を参照）が、結果は表１６に示されており、結果に示されるように、様々なヒト化抗体はＰＤ－１に対する結合能力を保持しており、一部のヒト化抗体の親和性はそのマウス抗体にほぼ近いまでになっている。
Figure 2023535384000032
実施例３．ＰＤ－１ヒト化抗体の構築と発現
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を組立て、更に発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域付きの遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）断片）と相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。ＩｇＧ４－ＰはＳ２２８Ｐ（配列番号７２又は配列番号７９の配列の１０８番目に対応）変異を表し、ＩｇＧ４－ＡＡはＦ２３４Ａ（配列番号７２又は配列番号７９の配列の１１４番目に対応）、Ｌ２３５Ａ（配列番号の７２又は配列番号７９の配列の１１５番目に対応）とＳ２２８Ｐ（配列番号７２又は配列番号７９の配列の１０８番目に対応）変異を表し、ＩｇＧ４－ＡＡとＩｇＧ４－Ｐ抗体形態はＩｇＧ４抗体形態を簡単に点変異して得ることができる。
ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域配列は、以下の通りである（配列番号７２）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
抗体の軽鎖（Ｋａｐｐａ鎖）定常領域配列は、以下の通りである（配列番号７３）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
構築されたＩｇＧ４ＡＡ形態の全長抗体配列は、例示的に次のように挙げられる。
Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ抗体重鎖（配列番号７４）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＦＳＹＹＧＳＴＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ軽鎖（配列番号７５）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ重鎖（配列番号７６）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＦＴＦＴＤＹＥＩＨＷＶＫＱＡＰＧＨＧＬＥＷＩＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡの軽鎖（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡの軽鎖と同様で、配列番号７５）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ重鎖（配列番号７７）：
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＶＤＴＹＹＱＤＮＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＧＨＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ軽鎖（配列番号７８）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
ＩｇＧ４－Ｐの重鎖定常領域配列は以下の通りである（配列番号７９）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
構築されたＩｇＧ４－Ｐ形態の全長抗体配列は、例示的に次のように挙げられる。
Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４Ｐ抗体重鎖（配列番号８０）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＤＹＥＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＦＳＹＹＧＳＴＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４Ｐ軽鎖（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡの軽鎖と同様で、配列番号７５）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４Ｐ重鎖（配列番号８１）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＤＦＴＦＴＤＹＥＩＨＷＶＫＱＡＰＧＨＧＬＥＷＩＧＬＦＤＰＥＴＧＧＩＶＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＮＲＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４Ｐの軽鎖（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡの軽鎖と同様で、配列番号７５）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４Ｐ重鎖（配列番号８２）：
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＶＤＴＹＹＱＤＮＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＹＧＨＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４Ｐ軽鎖（Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ軽鎖と同様で、配列番号７８）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
試験例
試験例１．抗ＰＤ－１抗体の体外におけるＰＤ－１リガンドとの結合及び結合遮断のＥＬＩＳＡ実験
腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞表面のＰＤ－１との結合により、Ｔ細胞の増殖を阻害する効果を果たす。ＰＤ－１の抗体はＰＤ－１との結合により、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１のシグナル伝達経路を遮断し、更にＴ細胞の増殖を刺激することができる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合遮断実験は、抗ＰＤ－１抗体によるシグナル伝達経路への遮断活性を検出するためである。
この実験では、ＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質（Ｃａｔ．＃ １０３７７Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で９６ウェルプレートを被覆した後、それぞれ検出待ちの抗ＰＤ－１抗体（抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ及びＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、陽性対照抗体：Ｈ００５－１（ＷＯ２０１５０８５８４７中のＨ００５－１抗体を参照）を含む）を加え、インキュベートして反応させ、暫くした後、更にＨＲＰで標識されたｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｃａｔ．＃ １０９－０３５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、インキュベートして反応させた。プレートを洗浄した後、ＨＲＰで標識されたｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の結合量を検出し、抗ＰＤ－１抗体のリガンドＰＤ－１に対する結合のＥＣ５０値を算出して得た。
この実験では、細胞外領域とＦｃを融合したＰＤ－１タンパク質（ＰＤ－１－Ｆｃで、配列が配列番号１で示される）で９６ウェルプレートを被覆した後、それぞれ検出待ちの抗ＰＤ－１抗体（抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、陽性対照抗体：Ｈ００５－１（ＷＯ２０１５０８５８４７中のＨ００５－１抗体を参照）を含む）を加え、インキュベートして反応させ、暫くした後、更にビオチンで標識されたＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２を加え、インキュベートして反応させた。プレートを洗浄した後、ビオチンで標識されたＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の結合量を検出し、抗ＰＤ－１抗体のリガンドＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２結合に対する遮断のＩＣ５０値を算出して得た。
ｐＨ９．６のＣＢ緩衝液（１．５９ ｇのＮａ２ＣＯ３と２．９３ ｇのＮａＨＣＯ３を１ Ｌの蒸留水に溶けた）によりＰＤ－１－Ｆｃを１ μｇ／ｍＬに希釈し、１００ μＬ／ウェルの体積で９６ウェルプレートに入れ、４℃で１６ ｈ～２０ ｈ置いた。９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ緩衝液を吸引除去し、ＰＢＳＴ（０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）緩衝液でプレートを１回洗浄した後、１２０ μＬ／ウェルでＰＢＳＴ／１％のｍｉｌｋを加え、室温でインキュベートして１ ｈブロッキングした。ブロッキング液を除去して、ＰＢＳＴ緩衝液でプレートを１回洗浄した後、試料希釈液（５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で適当な濃度に希釈された検出待ちの抗ＰＤ－１抗体９０ μＬを加え、４℃で置いて１ ｈプレインキュベートした。１０ μＬ／ウェルの体積で１０×濃度のビオチンで標識されたＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２（北京義翹神州生物技術有限公司）（１０ μｇ／ｍＬ）を加え、振とう機にて振とうし、均一に混合した後、３７℃で置いて１ ｈインキュベートした。反応系を除去し、ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した後、ＰＢＳＴ緩衝液により１：４００で希釈されたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ － Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ（ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼ重合体）を１００ μＬ／ウェルで加え、室温で振とうして５０分間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した後、１００ μＬ／ウェルでＴＭＢを加え、室温で５ ｍｉｎ～１０ ｍｉｎインキュベートした。１００ μＬ／ウェルで１ ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を中止した。マイクロプレートリーダーにより４５０ ｎｍで吸収値を読み取り、抗ＰＤ－１抗体のリガンドＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の結合に対する遮断のＩＣ５０値を算出した。データは、下記の表１７に詳しく示される。
Figure 2023535384000033
本開示の例示的な抗ＰＤ－１抗体であるＨｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡは、何れもＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の結合を効果的に遮断することができ、その遮断活性は陽性対照抗体と類似する。
試験例２．例示的な抗体のリガンド遮断試験
抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合への遮断作用を検討した。実験過程は、次のように簡単に説明される。
ＣＨＯＫ１／ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を消化し、１００ μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて２４時間培養した。ＰＢＳにより対照品と試料を所望の濃度に希釈した。Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１細胞（ＰＤ－１を安定的にトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞）をカウントし、一定の割合でＣＨＯＫ１／ＰＤ－Ｌ１細胞を接種した細胞培養プレート（９０ μＬ／ウェル）に１０ μＬ／ウェルで、希釈された抗体（抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、陽性対照抗体：Ｈ００５－１、陰性対照ＩｇＧ４タンパク質、抗体の勾配希釈濃度が０．３ ｍｇ／ｍＬ、３ ｍｇ／ｍＬ、３０ ｍｇ／ｍＬである）を同時に入れ、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて５時間培養した。細胞培養プレートを取り出し、室温で５分間置いてから、各ウェルに５０ μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ(商標) Ｒｅａｇｅｎｔを入れ、室温で５分間インキュベートし、プレートを読み取った。実験の結果は図１に示される。
結果から明らかなように、本開示における例示的な抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を効果的に遮断可能である。
試験例３．例示的な抗体のＢＩＡｃｏｒｅ抗体親和性実験
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサチップ（Ｃａｔ．＃ ２９１２７５５６、ＧＥ）によりＩｇＧを親和的に捕捉し、ｈｕｍａｎ ＰＤ－１抗原（Ｃａｔ．＃ １０３７７Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｃｙｎｏ ＰＤ－１抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）をチップの表面で流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によりＰＤ－１抗体と抗原ＰＤ－１反応シグナルをリアルタイムに検出して結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌのｐＨ１．５の緩衝液１０ ｍＭによりバイオセンサチップを洗浄して再生した。実験緩衝系は１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝溶液（Ｃａｔ＃ ＢＲ－１００１－８８、ＧＥ）であった。実験終了後にＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ソフトウェアにより（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでデータをフィッティングし、親和性の数値を得て、結果は表１８に示される。
Figure 2023535384000034
結果に示されるように、本開示に係る例示的な抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡは、何れもヒトＰＤ－１とサルＰＤ－１に結合可能である。
試験例４．抗体のＰＢＭＣ－Ｔリンパ球活性化実験における細胞ＩＦＮγの分泌への作用
抗ＰＤ－１抗体によるヒト初代Ｔリンパ球機能への影響を検討するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集・精製し、ツベルクリン（ＴＢ）により体外で５日間刺激した後、サイトカインＩＦＮγの分泌レベルを検出した。実験過程は、次のように簡単に説明される。
新鮮な血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１７－５４４２－０２、ＧＥ）により、密度勾配で遠心分離（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）してＰＢＭＣを得て、ＲＰＭＩ １６４０（ＳＨ３０８０９．０１、ＧＥ）培地において培養し、当該培地に１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（１００９９－１４１、Ｇｉｂｃｏ）を加え、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。
分離精製したばかりのＰＢＭＣをＲＰＭＩ １６４０培地により密度が２×１０６個／ｍＬになるように調整し、２０ ｍＬの細胞懸濁液に４０ μＬのツベルクリン（９７－８８００、Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ）を加え、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで５日間培養した。５日目に、上記培養された細胞を収集して遠心分離し、新鮮なＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁し、密度が１．１×１０６個／ｍＬになるように調整し、９６ウェル細胞培養プレートに接種し、１ウェルあたり９０ μＬであった。勾配希釈された抗体試料（本開示に係る抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、陽性対照抗体Ｈ００５－１、及び陰性対照ＩｇＧ４タンパク質、抗体の勾配希釈濃度が０．３ ｍｇ／ｍＬ、３ ｍｇ／ｍＬ、３０ ｍｇ／ｍＬである）を同時に加え、ＰＢＳ（Ｂ３２０、Shanghai BasalMedia）で希釈し、１ウェルあたり１０ μＬであった。細胞培養プレートを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータに入れて３日間インキュベートした。細胞培養プレートを取り出し、遠心分離（４０００ ｒｐｍ、１０ ｍｉｎ）して細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡの方法（ヒトＩＦＮ－γ検出試薬キット（ＥＨＣ１０２ｇ．９６、NeoBioscience））により、ＩＦＮ－γのレベルを検出した。具体的な操作は、試薬の取扱説明書を参照した。
試験の結果は図２に示されており、結果から明らかなように、本開示に係る抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ、及びＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡは、何れもＩＦＮ－γの分泌を活性化できる。
試験例５．トランスジェニックＰＤ－１マウス結腸がんモデルＭＣ３８における抗ＰＤ－１抗体の作用
ＭＣ３８細胞を５×１０＊５細胞／マウス／１００ μＬで９０匹のｈＰＤ－１ ＴＧマウス（バイオサイトジェン）の右側肋骨部の皮下に接種し、１０日間後に腫瘍体積が大きすぎたり小さすぎたりした動物を除去し、平均腫瘍体積が約１２０ ｍＭ３であることによってマウスをランダムにブランク対照Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）、陽性対照Ｈ００５－１ ３ ｍｐｋ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ １ ｍｐｋ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ ３ ｍｐｋ、Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ １ ｍｐｋ、Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ ３ ｍｐｋ、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ ３ ｍｐｋの合計７群に分け、１群あたり８匹であった。Ｄａｙ０（０日目）から各群の抗体を週３回腹腔内注射し、１週目には投与終了後に腫瘍が顕著に阻害されたことが認められ、２、３週目には投与頻度を週１回に調整し、合計５回投与した。週２回で腫瘍体積、動物の重量をモニターしてデータを記録した。腫瘍体積が２０００ ｍＭ３を超えたり、多くの腫瘍に潰瘍が現れたり、体重が２０％低減されたりした場合、担腫瘍動物を安楽死させて実験のエンドポイントとした。
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×Ｌ長×Ｌ短 ２
腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）＝１－Ｔ／Ｃ％
そのうち、Ｔ、Ｔ０は、それぞれ抗体投与群の試験終了と試験開始時の腫瘍体積を示し、Ｃ、Ｃ０はそれぞれブランク対照群の試験終了と試験開始時の腫瘍体積を示す。
試験の結果は表１９と図３に示されており、試験の結果によると、ブランク対照と比べ、本開示の抗体は何れもマウス結腸がんＭＣ３８移植腫瘍の成長を顕著に阻害することができ、そのうち、腫瘍阻害率の最も高いものはＨｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ－３ ｍｐｋ群であり、最終回測定時に腫瘍阻害率が７７．６４％である。投与頻度が週３回で３回投与すると、７日目に検出した時の結果、本開示の抗体の腫瘍阻害率は何れも顕著に陽性対照抗体Ｈ００５－１よりも優れていたことが示されているが、その後、投与頻度が週１回で２回投与するように低減されると（Ｄａｙ２１）、本開示の抗体間の薬効は次第に差が出ると共に、用量依存性が示されるようになり、そのうち、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡは、同等用量のＨ００５－１よりも顕著に優れていた（ｐ＜０．０５）。また、担腫瘍マウスは抗ＰＤ－１抗体に対する耐性が何れも良く、投与の全過程において体重が穏やかに上昇され、薬剤による減量などの症状が有意に発生されなかった。
Figure 2023535384000035
試験例６．トランスジェニックＰＤ－１マウス結腸がんモデルＭＣ３８における抗ＰＤ－１抗体の作用
トランスジェニックＰＤ－１マウスは、購入されたトランスジェニックＰＤ－１マウス（ＩＳＩＳ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆｆｉｃｅｓ、Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｑｕａｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ ＯＸ１ ２ＪＤ、Ｅｎｇｌａｎｄ）がＣｅｐｈｒｉｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．で培養された第５世代マウスに由来した。ＭＣ３８細胞を５×１０５個／１００ μＬ／匹でｈＰＤ－１トランスジェニックマウス（雌と雄が半々）の右側肋骨後部の皮下に接種し、マウスの平均腫瘍体積が８０ ｍＭ３～１００ ｍＭ３の間に達すると、体重や腫瘍が大きすぎたり小さすぎたりした動物を除去し、腫瘍体積のサイズによって担腫瘍マウスをランダムに陰性対照ｈＩｇＧ ｃｏｎｔｒｏｌ ３０ ｍｐｋ、Ｈ００５－１ １０ ｍｐｋ、Ｈ００５－１ ３０ ｍｐｋ、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ １０ ｍｐｋ、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ ３０ ｍｐｋという５群に分けた（１群あたり８匹）。群分け投与日はＤａｙ０とした。群分け後に各薬剤を腹腔内投与し、投与周期を２２日間とし、２日ごとに１回、合計１１回投与した。週２回で腫瘍体積を測定し、体重を量り、データを記録した。各群の動物の体重、腫瘍体積は、何れも平均値±標準差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示されると共に、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５とＥｘｃｅｌソフトウェアによりプロットし、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔにより統計分析を行った。
腫瘍体積（ＴＶ）＝０．５２３６×Ｌ長×Ｌ短 ２
腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
腫瘍阻害率％ＴＧＩ＝１－Ｔ／Ｃ（％）。
そのうち、Ｔ、Ｔ０は、それぞれ抗体投与群の試験終了と試験開始時の腫瘍体積を示し、Ｃ、Ｃ０はそれぞれブランク対照群の試験終了と試験開始時の腫瘍体積を示す。
試験の結果は表２０と図４に示されており、試験の結果によると、対照群と比べ、本開示の抗体はマウス結腸がんＭＣ３８移植腫瘍の成長を顕著に阻害することができ、そのうち、腫瘍阻害率の最も高いものはＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ ３０ ｍｐｋ群であり、２０日目の測定時に腫瘍阻害率が８０．４％である。低用量群（１０ ｍｐｋ）では、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ－１０ ｍｐｋの薬効が陽性対照Ｈ００５－１－１０ ｍｐｋより優れている。
Figure 2023535384000036
試験例７．抗ＰＤ－１抗体のカニクイザルでの薬物動態試験
２歳～５歳、２ ｋｇ～５ ｋｇで雄の実験用カニクイザル６匹であった。広東前沿生物科技有限公司から購入され、ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Guangdong）２０１５－００３７、動物合格証明書番号：４４６１３９０００００２１９であった。
飼育の環境：室温を１８℃～２６℃に、相対湿度を４０％～７０％に制御し、明暗交互に１２時間光りを照らした。断食が必要な場合を除き、餌と水が無限に得られるとした。
動物への投与前に体重を量り、体重が２．８１ ｋｇ～３．５２ ｋｇの間にあった。注射ポンプにより前肢又は後肢皮下に静脈内輸注で投与し、各群の投与量は何れも１ ｍｇ／ｋｇ（１ ｍｐｋ）であり、単回静脈内注射で投与し、投与速度が０．１ ｍＬ／ｋｇ／ｍｉｎ、投与時間が約３０ ｍｉｎであった。動物は投与前に、静脈輸注開始後の５ ｍｉｎ、０．２５ ｈ、０．５ ｈ（投与終了直後）、１ ｈ、２ ｈ、４ ｈ、８ ｈ、１ ｄ、２ ｄ、３ ｄ、４ ｄ、５ ｄ、７ ｄ、１０ ｄ、１３ ｄ、１４ ｄ、２１ ｄと２８ ｄに、後肢静脈から全血が採取され、血清が分離された。ここで、投与前に、静脈輸注開始後の１４ ｄ、２１ ｄ、２８ ｄに全血約２ ｍＬが採取され、残りの採血点に全血約１ ｍＬが採取された。ＥＬＩＳＡにより血清中の血中濃度を検出し、ＰＫ分析を行い、結果は表２１に示される。
Figure 2023535384000037

結果に示されるように、Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡとＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡの薬物動態活性は良い。
以下、例示的な試験により抗ＰＤ－１抗体の安定な製剤を調製し、以下の製剤の実施における抗ＰＤ－１抗体は上記のＨｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡであり、調製中に使用された機器及び結果の算出方法は以下の通りである。
ＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィー：ゲル細孔の孔径のサイズと高分子試料分子のコイル寸法間の相関関係に基づいて溶質を分離する分析方法である。ＳＥＣモノマーの含有量百分率＝Ａモノマー／Ａ総＊１００％（Ａモノマーは、試料中の主ピークモノマーのピーク面積であり、Ａ総は、全てのピーク面積の和である）。ＳＥＣ測定用機器：アジレント１２６０、カラム：ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｇｅ ＢＥＨ２００Å ＳＥＣ（３００×７．８ ｍＭ、３．５ μｍ）。
ＣＥキャピラリーゲル電気泳動：ゲルをキャピラリーに支持媒体として移動して行われる電気泳動であり、一定の電圧で試料の分子量の大きさによって分離する方法である。非還元ＣＥ（ＮＲ－ＣＥ）純度百分率＝Ａ主ピーク／Ａ総＊１００％（Ａ主ピークは、試料中の主ピークのピーク面積であり、Ａ総は、全てのピーク面積の和である）。ＣＥ測定用機器：Ｂｅｃｋｍａｎ、型番ｐｌｕｓ８００。
ｉＣＩＥＦイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＥと略す）：タンパク質の等電点ｐＩの違いによって分離する技術である。ｉＣＩＥＦ中性ピークの含有量百分率＝中性ピーク面積／総面積＊１００％（総面積は、酸性ピーク、中性ピークと塩基性ピークの面積の和である）。ｉＣＩＥＦ測定用の機器：ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、型番ｍｕａｒｉｃｅ。
浸透圧：凝固点法により浸透圧を測定し、凝固点降下値と溶液のモル濃度との正比例関係に基づき、感度の高い感温素子を採用し、溶液の凝固点を測定し、電気量により浸透圧に変換した。機器メーカー：ルーザーＬｏｓｅｒ、型番：ＯＭ８１５。
試験例８：抗ＰＤ－１抗体製剤の緩衝系とｐＨスクリーニング
下記の緩衝液により、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、タンパク質濃度が１００ ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製し、そのうち、緩衝液は以下の通りである：
１）酢酸ナトリウム塩（ＡＡと略す）１０ ｍＭ、ｐＨ５．０、
２）酢酸ナトリウム塩１０ ｍＭ、ｐＨ５．２、
３）酢酸ナトリウム塩１０ ｍＭ、ｐＨ５．５、
４）酢酸ナトリウム塩１０ ｍＭ、ｐＨ５．７、
５）コハク酸ナトリウム塩（ＳＡと略す）１０ ｍＭ、ｐＨ５．２、
６）クエン酸ナトリウム塩（ＣＡと略す）１０ ｍＭ、ｐＨ５．２、
調製済みの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。強制分解条件下（４０℃ Ｍ１、即ち、４０℃の高温条件下で１ヶ月置かれた）と加速条件下（２５℃ Ｍ６、即ち、２５℃の温度条件下で６ヶ月置かれた）での試料の安定性を調べ、且つ外観、ＳＥＣと非還元ＣＥ－ＳＤＳを評価指標として製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２２に示される。
４０℃ Ｍ１の強制分解条件下で、ＡＡとＳＡ緩衝系のタンパク質製剤は外観がＣＡ系より優れており、ｐＨ５．２～５．７のＡＡ緩衝系のタンパク質製剤は、純度項がｐＨ５．０ ＡＡ緩衝系とｐＨ５．２ ＳＡ緩衝系より優れており、２５℃ Ｍ６の加速条件下で、外観は群間に有意差がない。
Figure 2023535384000038
なお、もう１つのロットの抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）に対して、下記の緩衝液により、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、タンパク質濃度が１００ ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製し、そのうち、緩衝液は以下の通りである：
１）酢酸ナトリウム塩１０ ｍＭ、ｐＨ５．２、
２）コハク酸ナトリウム塩１０ ｍＭ、ｐＨ５．２、
３）ヒスチジン酢酸塩（Ｈｉｓ－ＡＡと略す）１０ ｍＭ、ｐＨ５．２、
調製済みの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。加速条件下（２５℃ Ｍ６、即ち、２５℃の温度条件下で６ヶ月置かれた）での試料の安定性を調べ、製剤のＳＥＣとｉＣＩＥＦ指標を調べ、製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２３に示される。
２５℃ Ｍ６の加速条件下で、ｐＨ５．２ ＡＡとｐＨ５．２ Ｈｉｓ－ＡＡのＳＥＣ／ｉＣＩＥＦのデータはｐＨ５．２ ＳＡ群よりも高く、ｐＨ５．２ ＡＡ緩衝系のｉＣＩＥＦはｐＨ５．２ Ｈｉｓ－ＡＡ緩衝系よりもやや高かった。総合的に考えると、製剤緩衝系は酢酸塩とヒスチジン塩緩衝系が好ましく、ＡＡ又はＨｉｓ－ＡＡ緩衝系が好ましい。
Figure 2023535384000039
試験例９：抗ＰＤ－１抗体製剤の緩衝系イオン強度のスクリーニング
緩衝系イオン強度がそれぞれ１０ ｍＭと３０ ｍＭであるｐＨ５．２の酢酸ナトリウム塩を利用し、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含み、タンパク質濃度が１２０ ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製した。添加物の組成：
１）ＡＡ １０ ｍＭ ｐＨ５．２、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬとスクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、
２）ＡＡ ３０ ｍＭ ｐＨ５．２、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬとスクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、
調製済みの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。強制分解条件下（４０℃ Ｍ１）での試料の安定性を調べ、且つＳＥＣを評価指標として製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２４に示される。
実験のデータから、４０℃ Ｍ１の強制分解条件下で、１０ ｍＭイオン強度群はＳＥＣデータが３０ ｍＭイオン強度群よりもやや高いことが示されているので、ｐＨ５．２酢酸ナトリウム塩緩衝系のイオン強度は１０ ｍＭであることが好ましい。
Figure 2023535384000040
試験例１０：抗ＰＤ－１抗体製剤における界面活性剤スクリーニング
ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム塩緩衝液１０ ｍＭに、下記の１）～５）の異なる濃度のツイーン８０を含む抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製した。そのうち、タンパク質濃度は１００ ｍｇ／ｍＬであり、他の添加物は以下の通りである：
１）スクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）０．２ ｍｇ／ｍＬ、
２）スクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．４ ｍｇ／ｍＬ、
３）スクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬ、
４）スクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．８ ｍｇ／ｍＬ、
５）スクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）０．６ ｍｇ／ｍＬ。
調製済みの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を（２５℃、３００ ｒｐｍ、１０日間）振とうして長期安定性（２℃～８℃ ６ヶ月）実験を行い、外観、ＳＥＣ、非還元ＣＥ－ＳＤＳを評価指標として製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２５に示される。
実験の結果によると、Ｄ１０振とう条件下で、０．６ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０、０．８ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と０．６ ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０群の外観は、大量の粒子が現れた０．２ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０と０．４ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０群よりも優れており、２℃～８℃条件下で６ヶ月置かれた場合に、外観から見ると、０．６ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０、０．８ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０は濁った０．６ ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０群よりも優れており、純度項は群間に有意差がない。従って、界面活性剤はポリソルベート８０が選ばれ、濃度は０．６ ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
Figure 2023535384000041
試験例１１：抗ＰＤ－１抗体製剤における浸透圧調整剤スクリーニング
下記の１）～７）の異なる種類の添加物を含むｐＨ５．２の酢酸ナトリウム塩緩衝液１０ ｍＭにおいて、タンパク質濃度が１００ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製した。具体的な添加物は、以下の通りである：
１）ポリソルベート８０（ＰＳ８０）０．６ ｍｇ／ｍＬ、
２）スクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬ、
３）トレハロース８０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬ、
４）ソルビット５０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬ、
５）アルギニン１００ ｍＭ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬ、
６）グリシン１００ ｍＭ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬ、
７）ＮａＣｌ １００ ｍＭ、ＰＳ８０ ０．６ｍｇ／ｍＬ、
調製済みの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。強制分解条件下（４０℃ Ｄ２２（４０℃の高温条件下で２２日間置かれた））での試料の安定性を調べ、且つ外観、ＳＥＣと非還元ＣＥ－ＳＤＳを評価指標として製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２６に示される。
４０℃ Ｄ２２の強制分解条件下で、各群間に外観は有意差がなく、純度項のデータから見ると、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、８０ ｍｇ／ｍＬのトレハロースと５０ ｍｇ／ｍＬのソルビット群の製剤は、ＳＥＣと非還元ＣＥ－ＳＤＳが他の群よりもやや高いが、この３群の製剤間に純度項は有意差がない。投与経路が皮下注射である場合、製剤浸透圧は２８０ ｍＯｓｍ～３２０ ｍＯｓｍに制御されるので、スクロースの含有量は７０ ｍｇ／ｍＬ～９０ ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースを含む製剤の浸透圧は３００ ｍＯｓｍ程度であり、スクロースの含有量は８０ ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
Figure 2023535384000042
試験例１２：抗ＰＤ－１抗体製剤のタンパク質濃度スクリーニング
緩衝系がｐＨ５．２である酢酸ナトリウム塩１０ ｍＭを利用し、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、タンパク質濃度が１００ ｍｇ／ｍＬ又は１２０ ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製した。
１）タンパク質濃度１００ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬとスクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、
２）タンパク質濃度１２０ ｍｇ／ｍＬ、ＰＳ８０ ０．６ ｍｇ／ｍＬとスクロース８０ ｍｇ／ｍＬ、
それぞれの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。強制分解条件下（４０℃ Ｍ１）での試料の安定性を調べ、且つ外観、ＳＥＣ、非還元ＣＥ－ＳＤＳとＩＣＥを評価指標として製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２７に示される。
実験のデータから、４０℃ Ｍ１の強制分解条件下で、１００ ｍｇ／ｍＬと１２０ ｍｇ／ｍＬの製剤群の外観及び純度項には有意差がないことが示されている。
Figure 2023535384000043
試験例１３：抗ＰＤ－１抗体製剤の安定性実験
タンパク質濃度１２０ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｍＭの酢酸ナトリウム塩ｐＨ５．２、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含む抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製した。
調製済みの製剤をろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。強制分解条件（４０℃ Ｍ１）、５回の凍結融解とＤ７の振とう（２５℃、３００ ｒｐｍ）下での試料の安定性を調べ、且つ外観、ＳＥＣ、非還元ＣＥ－ＳＤＳとＩＥＣを評価指標として製剤の安定性を調べた。実験の結果は、表２８に示される。
実験の結果によると、最終的な処方製剤は、外観から見ると、各強制分解条件下で透明性を保っており、純度項のデータから見ると、５回の凍結融解又は７日間の振とう（２５℃、３００ ｒｐｍ）下で顕著な変化がなく、Ｄ０ ４０℃ Ｍ１の強制分解条件下と比べてＳＥＣが１．９％低減され、ＮＲ－ＣＥが２．５％低減され、且つＩＥＣが１４．８％低減されており、比較的良い安定性を有する。
Figure 2023535384000044
また、製剤の２５℃ Ｍ６（２５℃の温度条件下で６ヶ月置かれた）の加速降解条件下及び４℃ Ｍ６（４℃の温度条件下で６ヶ月置かれた）条件下での製剤の安定性を更に観察したが、実験の結果は表２９に示されており、実験の結果に示されるように、４℃ Ｍ６の長期条件下で本開示の製剤は良い安定性を有し、２５℃Ｍ６の加速降解条件下でも本開示の製剤は依然として良い安定性を有し、Ｄ０と比べて、製剤のＳＥＣが２．２％のみ低減され、非還元ＣＥ－ＳＤＳが２．７％のみ低減され、ＩＥＣが９．３％低減されている。
Figure 2023535384000045
試験例１４：抗ＰＤ－１抗体製剤の処方最適化実験
酢酸ナトリウム塩のイオン強度、ｐＨ値とタンパク質濃度を変数としてＤＯＥ実験の設計を行い、ＤＯＥ実験因子及びレベルをイオン強度１０ ｍＭ～３０ ｍＭ、ｐＨ４．７～５．７、抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）濃度９０ ｍｇ／ｍＬ～１５０ ｍｇ／ｍＬとして、一連の処方を設計し（表３０を参照）、４０℃の高温条件下で１ヶ月置く強制分解実験により、外観、ＳＥＣ、ＩＥＣを評価指標として、最小二乗法で結果を統計分析し、結果は表３１と図５に示される。
結果に示されるように、４０℃の高温条件下で１ヶ月置かれると、各処方は、外観が何れも透明であり、純度項のＳＥＣ下げ幅が１．１％～２．７％の間で、ｉＣＩＥＦ下げ幅が５．６％～８．５％の間であり、強制分解条件下での下げ幅は許容可能な範囲内にあり、且つ群間差は機器の検出誤差範囲内にある。従って、抗ＰＤ－１抗体の試料は、タンパク質濃度９０ ｍｇ／ｍＬ～１５０ ｍｇ／ｍＬ、イオン強度１０ ｍＭ～３０ ｍＭとｐＨ４．７～５．７である、範囲内に何れも良好な安定性を有する。データをフィッティングすると、イオン強度が低い時に純度項はより安全な範囲にあることが認められたので、タンパク質濃度１２０ ｍｇ／ｍＬ、イオン強度１０ ｍＭ、ｐＨ５．２であることが好ましい。
Figure 2023535384000046
Figure 2023535384000047
試験例１５：抗ＰＤ－１抗体製剤の凍結乾燥
１０ ｍＭのＡＡ ｐＨ５．２の緩衝液に、１００ ｍｇ／ｍＬの抗体、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含む抗ＰＤ－１抗体（Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ）製剤を調製し、製剤試料を凍結乾燥し、凍結乾燥手順は予備凍結、一次乾燥と二次乾燥であった（パラメータは表３２を参照）。凍結乾燥手順の終了後、真空引きしてプラグを入れた。再溶解試料に対して凍結乾燥前後の比較を行った。その結果、再溶解溶液は、液体製剤の良好な性能を保つことができることが明らかになる。
Figure 2023535384000048
明らかに理解されるように、図面と実例によって上記発明を詳しく説明したが、説明と実例は、本開示を制限する範囲として解釈すべきではない。本明細書に引用された全ての特許と科学文献の開示内容は、引用により完全且つ明らかに組み込まれている。

Claims (15)

  1. 抗ＰＤ－１抗体及び緩衝液を含む医薬組成物であって、そのうち、
    前記緩衝液は酢酸塩緩衝液、ヒスチジン塩緩衝液又はコハク酸塩緩衝液、好ましくは、前記緩衝液のｐＨは約４．５～約６．０、好ましいｐＨは約４．７～約５．７、より好ましいｐＨは約５．２であり、前記酢酸塩緩衝液は酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液が好ましく、前記ヒスチジン塩緩衝液はヒスチジン－酢酸塩緩衝液が好ましく、前記コハク酸塩緩衝液はコハク酸－コハク酸ナトリウム緩衝液が好ましく、
    前記抗ＰＤ－１抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は配列番号６５で示されるＨＣＤＲ１、配列番号６６で示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号６７で示されるＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号６８で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号６９で示されるＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、そのうち、前記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域は配列番号８で示されるＨＣＤＲ１、配列番号９で示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号１０で示されるＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は配列番号４９で示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２で示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号１３で示されるＬＣＤＲ３を含む、
    医薬組成物。
  2. 前記緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約３０ｍＭであり、約１０ｍＭ～約３０ｍＭが好ましく、約１０ｍＭがより好ましい、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記抗ＰＤ－１抗体濃度は約１ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬであり、約９０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬが好ましく、約１２０ｍｇ／ｍＬ又は約１００ｍｇ／ｍＬがより好ましい、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 界面活性剤を更に含み、前記界面活性剤はポリソルベートが好ましく、ポリソルベート８０がより好ましく、界面活性剤の濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬが好ましく、約０．６ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬがより好ましく、約０．６ｍｇ／ｍＬが最も好ましい、請求項１～３の何れか一項に記載の医薬組成物。
  5. 浸透圧調整剤を更に含み、好ましくは、前記浸透圧調整剤は糖、アミノ酸及び／又は塩であり、より好ましくは、前記浸透圧調整剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、グリシンと塩化ナトリウムからなる群から選ばれる１つ又は複数であり、前記浸透圧調整剤の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬが好ましく、約７０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬがより好ましく、約８０ｍｇ／ｍＬが最も好ましい、請求項１～４の何れか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域は配列番号２７で示され、又は配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び軽鎖可変領域は配列番号５５で示され、又は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体は配列番号２７で示される重鎖可変領域、及び配列番号５５で示される軽鎖可変領域を有する、請求項１～５の何れか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記抗ＰＤ－１抗体は重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、より好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７２で示される重鎖定常領域及び配列番号７３で示される軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７４で示され、又は配列番号７４と少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、及び配列番号７５で示され、又は配列番号７５と少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む、請求項１～６の何れか一項に記載の医薬組成物。
  8. ａ）濃度が約１ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体と、
    ｂ）濃度が約５ｍＭ～約３０ｍＭ、ｐＨが約４．５～約６．０である酢酸塩緩衝液と、
    ｃ）スクロース、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、グリシンと塩化ナトリウムから選ばれる、濃度が約５０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである浸透圧調整剤と、
    ｄ）濃度が約０．２ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬであるポリソルベートと、を含み、
    好ましくは、前記医薬組成物は、
    Ａ１）濃度が約９０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬである抗ＰＤ－１抗体と、
    Ｂ１）濃度が約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、ｐＨが約４．７～約５．７である酢酸塩緩衝液と、
    Ｃ１）濃度が約７０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬであるスクロースと、
    Ｄ１）濃度が約０．６ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬであるポリソルベート８０と、を含み、
    より好ましくは、前記医薬組成物は、濃度が約１０ｍＭおよびｐＨが約５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液と、濃度が約１２０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が約８０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が約０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含む、
    請求項１～７の何れか一項に記載の医薬組成物。
  9. 濃度が１０ｍＭおよびｐＨが５．２の酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液と、濃度が１２０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１抗体と、濃度が８０ｍｇ／ｍＬのスクロースと、濃度が０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０とを含み、そのうち、前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７４で示される重鎖、及び配列番号７５で示される軽鎖を有する、医薬組成物。
  10. 請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物を調製する方法であって、抗ＰＤ－１抗体原液を緩衝液で置換するステップを含む、方法。
  11. 抗ＰＤ－１抗体を含む凍結乾燥製剤であって、請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥することにより得られる、凍結乾燥製剤。
  12. 抗ＰＤ－１抗体を含む再溶解溶液であって、請求項１１に記載の凍結乾燥製剤を再溶解することにより得られる、再溶解溶液。
  13. 抗ＰＤ－１抗体を含む凍結乾燥製剤であって、再溶解されると、請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物を形成することができる、凍結乾燥製剤。
  14. 請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物、請求項１１若しくは１３に記載の凍結乾燥製剤又は請求項１２に記載の再溶解溶液が入った容器を含む製品。
  15. 疾患又は病状を治療又は予防する方法であって、対象に有効量の請求項１～９の何れか一項に記載の医薬組成物、又は請求項１１若しくは１３に記載の凍結乾燥製剤、又は請求項１２に記載の再溶解溶液、又は請求項１４に記載の製品を投与することを含み、好ましくは、そのうち、前記疾患又は病状は腫瘍であり、より好ましくは、前記疾患は頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝細胞腫、肝内胆管がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイド症とメルケル細胞がんから選ばれ、最も好ましくは、前記疾患はＰＤ－Ｌ１陽性の黒色腫、肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、胃がん、腎がん、膀胱がん、腸がんと結腸がんから選ばれ、選択的に、前記疾患はＰＤ－１に関連する疾患である、方法。
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