JP2023073507A - オリゴヌクレオチド-リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、オリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。【解決手段】これらのリガンドは、主に、単糖に由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。【選択図】なし
Description
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、2013年7月11日に出願された米国仮特許出願第61/845,279号明細書の利益を主張するものである。
本発明は、オリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。これらのリガンドは、主に、単糖に由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。
インビボでの細胞への効率的な送達は、特異的標的化および細胞外環境、特に、血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。特異的標的化を行う一方法は、標的化部分をiRNA剤にコンジュゲートすることである。標的化部分は、iRNA剤を所要の標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。この取り込み機構は、膜構造の陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたiRNA剤の移動を含む。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。ガラクトース、マンノース、マンノース-6-リン酸などの糖、ペプチドならびにトランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ビタミンB12、インスリンおよび上皮成長因子(EGF)などのタンパク質を認識するものを含む、多くの受容体を介したエンドサイトーシス系が公知であり、研究されている。アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)は、肝細胞に非常に多く存在する高容量受容体(high capacity receptor)である。ASGP-Rは、N-アセチル-D-ガラクトシルアミン(GalNAc)に対してD-Galより50倍高い親和性を示す。過去の研究により、nM親和性を得るのに多価が必要とされる一方、糖間の間隔も重要であることが示されている。
最近、特定の糖質コンジュゲートが、siRNA送達のためのリポソームの代わりに有益な送達であることが示された。
本発明は、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質の向上した送達、より低い製造コストまたはより少ない製造上の問題、またはより良好な化学安定性などの1つ以上の有利な特性を有するオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質のリガンドコンジュゲートに関する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドおよび他の生物学的に活性な物質の有効な送達を提供する。
一実施形態において、本発明は、式I:
(式中、
オリゴヌクレオチドが、siRNA、マイクロRNA、アンチmiR、アンタゴmir、マイクロRNA模倣体、デコイ、免疫刺激、G-四量体、スプライシング変化、ssRNA、アンチセンス、アプタマー、ステムループRNAもしくはDNAまたは任意の二本鎖RNAもしくはDNAの2つの鎖のうちの1つまたは二本鎖のより短い方のRNAもしくはDNA(例えば、siRNA)などのオリゴヌクレオチドであり;
生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
リンカーが、リガンドとオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり、ここで、リンカーが、表1または1A中の連結基から選択されてもよく;および
リガンドが、糖に由来し、ここで、(i)リガンドが、リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、かつ(ii)コンジュゲートが、1~12個のリガンド(好ましくは、1~5個または1~3個のリガンド)を含有し、(iii)リガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか(その場合、k=1)、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサ(リガンド骨格とも呼ばれる)であり、
R3が、表3から選択される標的化モノマーであり、かつkが、1~6(好ましくは、1~5または1~3)であり、各R3が、R2中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい);および
(c)表4または4A中のリガンド
から選択されてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のリガンド(例えば、糖質)コンジュゲートに関する。
オリゴヌクレオチドが、siRNA、マイクロRNA、アンチmiR、アンタゴmir、マイクロRNA模倣体、デコイ、免疫刺激、G-四量体、スプライシング変化、ssRNA、アンチセンス、アプタマー、ステムループRNAもしくはDNAまたは任意の二本鎖RNAもしくはDNAの2つの鎖のうちの1つまたは二本鎖のより短い方のRNAもしくはDNA(例えば、siRNA)などのオリゴヌクレオチドであり;
生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
リンカーが、リガンドとオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり、ここで、リンカーが、表1または1A中の連結基から選択されてもよく;および
リガンドが、糖に由来し、ここで、(i)リガンドが、リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、かつ(ii)コンジュゲートが、1~12個のリガンド(好ましくは、1~5個または1~3個のリガンド)を含有し、(iii)リガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか(その場合、k=1)、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサ(リガンド骨格とも呼ばれる)であり、
R3が、表3から選択される標的化モノマーであり、かつkが、1~6(好ましくは、1~5または1~3)であり、各R3が、R2中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい);および
(c)表4または4A中のリガンド
から選択されてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のリガンド(例えば、糖質)コンジュゲートに関する。
コンジュゲートは、表1または1Aまたは実施例からの少なくとも1個のリンカー、表2、2A、4、または4Aからの1個のリガンド、あるいは表3または3Aからの1個の標的化モノマーを含む。例えば、実施例に記載されるヌクレオシドリンカーが、リンカーとして使用され得る。一実施形態において、コンジュゲートは、(i)表1または1Aまたは実施例からの少なくとも1個のリンカー、(ii)表2、2A、4、または4Aからの1個のリガンド、および(iii)表3または3Aからの1個の標的化モノマーを含む。
R2が、アミノ酸-、ポリペプチド-(例えば、ジペプチドまたはトリペプチド)、ヘテロアリール-(例えば、トリアゾール)、または糖含有基であり得る。好ましい一実施形態において、各R3基が、アミド、エーテル、またはアミノ基を介してR2に結合される。一実施形態において、R3がアミド基を介して結合される。表2、2A、4、および4A中の各項目は、少なくとも1個の標的化モノマーに結合されたスペーサを示す。スペーサは、窒素原子などのヘテロ原子(スペーサの末端にある)を介して標的化モノマーに、またはアノマー炭素において、(以下に示されるような)標的化モノマーの糖基に結合される。表2、2A、4、および4Aに示される構造中のヘテロ原子結合点は、糖基(リガンドの左側)からリガンドの残りの部分(右側)へと、鎖に沿って移動する場合、第1の窒素原子である。表2A中の2個のリガンドのためのスペーサが、以下の表に示される(矢印は、標的化モノマーR3のための結合点を示し、スペーサの右側は、リンカーに結合される)。好適なスペーサはまた、以下の表5に示される。
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、(i)オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なくオリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在するヌクレオシドの1つ以上の塩基部分を介して、リンカーに結合される。
一実施形態において、リガンドは、リンカーを介して二本鎖siRNAの2つの鎖のうちの1つにコンジュゲートされる。
一実施形態において、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)を標的にする。別の実施形態において、リガンドは、肝臓の実質細胞など、肝臓を標的にする。リガンドは、非修飾または修飾単糖、二糖、三糖、四糖、またはより高次の多糖であり得る。
オリゴヌクレオチドは、切断可能な基(例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはアミド)または切断できない基(例えば、エーテル、カルバメート、もしくはC-C(例えば、2つの炭素原子間の結合または-CH2-CH2-))を介してリンカーに結合され得る。本明細書に記載されるように、切断可能なまたは切断できない基は、式Iのオリゴヌクレオチドの中にある。
一実施形態において、-リンカー-リガンドは、L96(実施例に示される)でない。
本明細書に記載されるコンジュゲートの式(式(I)など)において、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質は、脂質ナノ粒子(LNP)(PEG-脂質またはカチオン性脂質など)またはポリマーの成分によって置換され得る。コンジュゲートされたLNP成分または共役ポリマーは、標的部位への生物学的に活性な物質の送達を促進するための送達物質として有用であり得る。
表1 - リンカー基a,b
以下のリンカーが、保護基DMTrとともに示される。コンジュゲートされるとき、DMTr基が除去され、隣接する酸素原子は、オリゴヌクレオチドへの(例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基への)リンカーの結合部位である。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、-OH、または-NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、
)に結合された反応性ホスホロアミダイト(例えば、
)であり得る。
以下のリンカーが、保護基DMTrとともに示される。コンジュゲートされるとき、DMTr基が除去され、隣接する酸素原子は、オリゴヌクレオチドへの(例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基への)リンカーの結合部位である。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、-OH、または-NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、
表1A-リンカー基
表1A中で以下に示されるリンカーは、それに1つ以上のオリゴヌクレオチドが結合された状態で示される。リンカーが、オリゴヌクレオチドを含まない化学的部分であることが、当業者に理解されるであろう。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、-OH、または-NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、
)に結合された反応性ホスホロアミダイト(例えば、
)であり得る。「オリゴヌクレオチド/ヌクレオチド」という語句は、単一のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指すことが意図される。
表1A中で以下に示されるリンカーは、それに1つ以上のオリゴヌクレオチドが結合された状態で示される。リンカーが、オリゴヌクレオチドを含まない化学的部分であることが、当業者に理解されるであろう。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、-OH、または-NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、
リガンド
リガンドはまた、以下の2つの一般式
から選択することができ、式中、矢印が、オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示す(すなわち、リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される)。リガンドを導入するのに有用な中間体としては、上に示される化合物が挙げられる。上記の式中、変数は、以下に示される定義を有する:
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
であり;
Q1が、H、C1~C4アルキル、
であり;
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である。
リガンドはまた、以下の2つの一般式
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
Q1が、H、C1~C4アルキル、
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である。
リガンドは、以下の表4または4Aに示される式で表され得る。
表2、2A、3、3A、4、および4Aおよび糖部分に1つ以上の-OAc置換基を含む他の式において、本発明の化合物は、示される1つ以上の-OAcの位置に-OH置換基を含有する同一の化合物を含む。一般に、アセチル(Ac)基は、ヒドロキシル部分のための保護基として機能する。したがって、対応するヒドロキシ化合物が、本発明の範囲内にあり、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質とともに最終的なコンジュゲートに使用されることが意図されることが、当業者に理解されるであろう。
さらに、本発明の化合物は、糖部分における任意の-NHAc置換基が、ヒドロキシ基で置換される(例えば、その場合、糖部分の2位における-NHAc基が、2つの-OH基で置換される)ものも含む。一実施形態において、ヒドロキシ基による-NHAc基の置換に加えて、糖部分における任意の-OAc置換基も、ヒドロキシ基で置換される。
一実施形態において、リガンドは、
から選択され、式中、
Aが、リンカーへの結合点であり、リンカーに結合された結合または化学結合基(例えば、アミド、カルバメート、尿素、-C-N-(例えば、-CH2-NH-または-C(Ra)(Rb)-N(Rc)-、ここで、Ra、Rb、およびRcが、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択される)、C=NH、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはヒドラジン)を表すことができ;
Yが、任意の官能基(例えば、二価基として使用されるとき、それは、-CONH-、-NHCO-、またはSであり得、または、例えば、一価基として使用されるとき、それは、-OH、-SH、またはハロゲンであり得る)、-CH2-、保護基、または化学的に不活性なキャップであり;
Qが、OH、または本明細書に記載される糖のC6位に対する任意の修飾であり;および
nが、1~6である。
さらに別の実施形態において、上記のリガンドまたは標的化モノマー(表2、2A、3、3A、4、および4A中などの)のいずれかの糖部分は、以下の式III
(式中、
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、-Z-R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、-N3、-CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、-COCH3)、置換アシル(例えば、-COCF3)、-OC(O)OR11、-NHC(O)OR11、-NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;および
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、-OHまたは-OAcでない)
の糖部分で置換され得る。
Aが、リンカーへの結合点であり、リンカーに結合された結合または化学結合基(例えば、アミド、カルバメート、尿素、-C-N-(例えば、-CH2-NH-または-C(Ra)(Rb)-N(Rc)-、ここで、Ra、Rb、およびRcが、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択される)、C=NH、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはヒドラジン)を表すことができ;
Yが、任意の官能基(例えば、二価基として使用されるとき、それは、-CONH-、-NHCO-、またはSであり得、または、例えば、一価基として使用されるとき、それは、-OH、-SH、またはハロゲンであり得る)、-CH2-、保護基、または化学的に不活性なキャップであり;
Qが、OH、または本明細書に記載される糖のC6位に対する任意の修飾であり;および
nが、1~6である。
さらに別の実施形態において、上記のリガンドまたは標的化モノマー(表2、2A、3、3A、4、および4A中などの)のいずれかの糖部分は、以下の式III
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、-Z-R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、-N3、-CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、-COCH3)、置換アシル(例えば、-COCF3)、-OC(O)OR11、-NHC(O)OR11、-NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;および
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、-OHまたは-OAcでない)
の糖部分で置換され得る。
これらの中間体は、本発明のオリゴヌクレオチド-リガンドコンジュゲートを調製するのに有用である。
さらに別の実施形態は、式IIIA
の中間化合物であり、式中、
R52が、1~12個の原子の長さの二価化学基であり;
リンカーが、上に定義されるとおりであり;
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、-Z-R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、-N3、-CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、-COCH3)、置換アシル(例えば、-COCF3)、-OC(O)OR11、-NHC(O)OR11、-NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり;および
Xが、
(式中、球体が、固体担体を表す)、
、脱離基、H、-OH、または-NH2であり、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、-OHまたは-OAcでない。
R52が、1~12個の原子の長さの二価化学基であり;
リンカーが、上に定義されるとおりであり;
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、-Z-R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、-N3、-CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、-COCH3)、置換アシル(例えば、-COCF3)、-OC(O)OR11、-NHC(O)OR11、-NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり;および
Xが、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、-OHまたは-OAcでない。
好ましい一実施形態において、式IIIまたはIIIA中の糖基の3位および4位における置換はそれぞれ、水平方向(equatorial)および軸方向(axial)である。
一実施形態において、式IIIまたはIIIA中の糖は、α立体配置にある。別の実施形態において、糖は、β立体配置にある。
本発明は、式IIIA(式中、Xが、オリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載される他の生物学的に活性な物質で置換される)の化合物も含む。
本明細書に記載される同じ結合または結合の組合せは、2つ以上のリガンド/リンカー部分を、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質に結合するのに使用され得る。例えば、一実施形態において、本発明は、式IV
(式中、
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり;
オリゴヌクレオチド-1およびオリゴヌクレオチド-2が、上記のオリゴヌクレオチドと同じ定義を有し;
生物学的に活性な物質-1および生物学的に活性な物質-2が、上記の生物学的に活性な物質と同じ定義を有し;および
各リガンドが、同じであってもまたは異なっていてもよく、各オリゴヌクレオチドが、同じであってもまたは異なっていてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートに関する。
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり;
オリゴヌクレオチド-1およびオリゴヌクレオチド-2が、上記のオリゴヌクレオチドと同じ定義を有し;
生物学的に活性な物質-1および生物学的に活性な物質-2が、上記の生物学的に活性な物質と同じ定義を有し;および
各リガンドが、同じであってもまたは異なっていてもよく、各オリゴヌクレオチドが、同じであってもまたは異なっていてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートに関する。
式IV中、リンカーは、2つの結合を介してオリゴヌクレオチドの2つの部分(オリゴヌクレオチド1および2)を結合する。オリゴヌクレオチドの各部分は、少なくとも1つのヌクレオシド部分を表す。
さらに別の実施形態は、式V:
(式中、
各オリゴヌクレオチド(または生物学的に活性な物質)およびリガンドが、独立して、本明細書に定義されるとおりであり;
各リンカーが、独立して、本明細書に記載されるいずれかのもの(例えば、表1または1A中)であり得、または式
で表され得、式中、R4が、(例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基を介した)オリゴヌクレオチドの結合部位であり、ヒドロキシプロリンにおけるヒドロキシ基は、さらなる-リンカー-リガンド基の結合部位であり;および
tが、1~6の範囲(例えば、1、2、3、4、5、または6)である)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートである。
各オリゴヌクレオチド(または生物学的に活性な物質)およびリガンドが、独立して、本明細書に定義されるとおりであり;
各リンカーが、独立して、本明細書に記載されるいずれかのもの(例えば、表1または1A中)であり得、または式
tが、1~6の範囲(例えば、1、2、3、4、5、または6)である)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートである。
好ましい一実施形態において、tが2である。
好ましい一実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート中のオリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。
一実施形態において、コンジュゲートは、式:
(式中、各Rが、独立して、リガンド(本明細書に記載されるものなど)である)で表されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。好ましい一実施形態において、リガンドRは同じである。
本発明は、オリゴヌクレオチドのリガンドコンジュゲートであって、少なくとも1個のヌクレオシドが、(i)ヌクレオシドの核酸塩基を介して、または(ii)ヌクレオシドの2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされるリガンドコンジュゲートにも関する。
一実施形態は、オリゴヌクレオチドの糖質コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、ヌクレオシドの核酸塩基中の窒素原子を介して、糖質含有リガンド(例えば、糖含有リガンド)にコンジュゲートされる糖質コンジュゲートである。本明細書に記載される任意のリガンドが使用され得る。一実施形態において、コンジュゲート中のヌクレオシドは、式VI:
(式中、
式VI中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が、核酸塩基(例えば、ウラシル、シトシン、アデノシン、またはグアニン)であり、かつ任意選択的に、核酸塩基に結合された窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子(例えば、アミノ基)に結合され;および
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。リガンドR8は、例えば、-R2-R3または表2、2A、4、および4A中のリガンドであり得る。
式VI中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が、核酸塩基(例えば、ウラシル、シトシン、アデノシン、またはグアニン)であり、かつ任意選択的に、核酸塩基に結合された窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子(例えば、アミノ基)に結合され;および
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。リガンドR8は、例えば、-R2-R3または表2、2A、4、および4A中のリガンドであり得る。
一実施形態において、R6が、ウラシルであって、その5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されるウラシルであり、ここで、R7が、アミド基の窒素原子を介してR6に結合される。
別の実施形態において、R6が、シトシンであって、その5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されるシトシンであり、ここで、R7が、アミド基の窒素原子を介してR6に結合される。
別の実施形態は、オリゴヌクレオチドの糖質コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位においてリガンド(例えば、糖含有リガンド)にコンジュゲートされる糖質コンジュゲートである。本明細書に記載される任意のリガンドが使用され得る。一実施形態において、コンジュゲート中のヌクレオシドは、式VII:
(式中、
式VII中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスフェートを介して3’末端および/またはホスホロチオエートを介して5’末端でリンカーに結合されてもよく、または逆もまた同様である。
式VII中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスフェートを介して3’末端および/またはホスホロチオエートを介して5’末端でリンカーに結合されてもよく、または逆もまた同様である。
リガンド部分(例えば、糖質部分)は、標的部位へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。リガンド部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。特定の理論によって制約されるものではないが、この取り込み機構は、膜構造の陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたオリゴヌクレオチドの移動を含むものと考えられる。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。受容体を介したエンドサイトーシス系は、ガラクトースなどの糖を認識するものを含む。したがって、リガンド部分は、上述されるものなどの、1つ以上の単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類を含み得る。好ましい一実施形態において、リガンド部分は、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体2(ASGPR2)などの、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)によって認識される部分であり得る。このような糖質部分は、例えば、糖(例えば、ガラクトースまたはN-アセチル-D-ガラクトシルアミン)を含み得る。
さらに別の実施形態は、2つ以上のヌクレオチドがそれぞれ-リンカー-リガンド部分を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド中の-リンカー-リガンド部分は、同じであってもまたは異なっていてもよい。一実施形態において、5’末端から1番目、3番目、および5番目のヌクレオチドがそれぞれ、-リンカー-リガンド部分にコンジュゲートされる。別の実施形態において、3’末端から1番目、3番目、および5番目のヌクレオチドがそれぞれ、-リンカー-リガンド部分にコンジュゲートされる。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの3’および5’末端から1番目、3番目、および5番目のヌクレオチドがそれぞれ、-リンカー-リガンド部分にコンジュゲートされる。
さらに別の実施形態は、本発明のiRNA剤のコンジュゲートを調製することによって治療用RNAを製剤化する方法であって、iRNA剤の鎖が治療用RNAを含む方法である。
さらに別の実施形態は、本発明のiRNA剤のコンジュゲートを患者に投与することによって、治療用RNAを、それを必要とする患者に送達する方法であって、iRNA剤の鎖が治療用RNAを含む方法である。好ましい投与経路としては、皮下および静脈内経路が挙げられる。
定義
「オリゴヌクレオチド」という用語は、約100ヌクレオチド未満(例えば、約50ヌクレオチド未満の長さを有する化学的に修飾されたまたは非修飾の核酸分子(RNAまたはDNA)を指す。核酸は、例えば、(i)一本鎖DNAまたはRNA、(ii)ヘアピンループを有する二本鎖DNAまたはRNAを含む二本鎖DNAまたはRNA、または(iii)DNA/RNAハイブリッドであり得る。二本鎖RNAの非限定的な例としては、siRNA(低分子干渉RNA)が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロRNA、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約5~約50ヌクレオチド(約10~約50ヌクレオチドなど)の範囲の長さを有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約15~約30ヌクレオチドなどの約6~約30ヌクレオチドの範囲の長さを有する。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約18~約23ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、約100ヌクレオチド未満(例えば、約50ヌクレオチド未満の長さを有する化学的に修飾されたまたは非修飾の核酸分子(RNAまたはDNA)を指す。核酸は、例えば、(i)一本鎖DNAまたはRNA、(ii)ヘアピンループを有する二本鎖DNAまたはRNAを含む二本鎖DNAまたはRNA、または(iii)DNA/RNAハイブリッドであり得る。二本鎖RNAの非限定的な例としては、siRNA(低分子干渉RNA)が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロRNA、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約5~約50ヌクレオチド(約10~約50ヌクレオチドなど)の範囲の長さを有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約15~約30ヌクレオチドなどの約6~約30ヌクレオチドの範囲の長さを有する。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約18~約23ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
「GalNAc」という用語は、N-アセチル-ガラクトサミンを指す。
本明細書において使用される際の「固体担体」という用語は、特に、オリゴヌクレオチドの合成が起こる任意の粒子、ビーズ、または表面を表す。本明細書に記載される方法の異なる実施形態において使用され得る固体担体は、例えば、無機担体および有機担体から選択され得る。無機担体は、好ましくは、シリカゲルおよび制御多孔質ガラス(controlled pore glass)(CPG)から選択される。有機担体は、好ましくは、高度に架橋されたポリスチレン、Tentagel(ポリエチレングリコール(PEGまたはPOE)がグラフト化される低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフト化コポリマー)、ポリ酢酸ビニル(PVA)、Poros-ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマー、アミノポリエチレングリコールおよびセルロースから選択される。本発明に適した好ましい固体担体としては、疎水性であるものが挙げられる。本発明の好ましい実施形態は、ポリスチレン系固体担体を用いる。多くの他の固体担体が、市販されており、本発明に適している。
本明細書において使用される際の「ヒドロキシ保護基」という用語は、合成手順の際の好ましくない反応からヒドロキシル基を保護する不安定な化学的部分を指す。合成手順の後、ヒドロキシ保護基は、選択的に除去され得る。当該技術分野において公知のヒドロキシ保護基は、T.H.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,John Wiley&Sons,New York(1999)に一般に記載されている。ヒドロキシル保護基の例としては、以下に限定はされないが、ベンジルオキシカルボニル、4-ニトロベンジルオキシカルボニル、4-ブロモベンジルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、メトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル、2-(トリメチルシリル)エトキシカルボニル、2-フルフリルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、アセチル、ホルミル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、メチル、t-ブチル、2,2,2-トリクロロエチル、2-トリメチルシリルエチル、1,1-ジメチル-2-プロペニル、3-メチル-3-ブテニル、アリル、ベンジル、パラ-メトキシベンジルジフェニルメチル、トリフェニルメチル(トリチル)、テトラヒドロフリル、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、2,2,2-トリクロロエトキシメチル、2-(トリメチルシリル)エトキシメチル、メタンスルホニル、パラ-トルエンスルホニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、およびトリイソプロピルシリルが挙げられる。本発明のための好ましいヒドロキシル保護基は、アセチル(Acまたは--C(O)CH3)、ベンゾイル(Bzまたは--C(O)C6H5)、およびトリメチルシリル(TMSまたは--Si(CH3)3)である。
本明細書において使用される際の「アミノ保護基」という用語は、合成手順の際の好ましくない反応からアミノ基を保護する不安定な化学的部分を指す。合成手順の後、本明細書に記載されるアミノ保護基は、選択的に除去され得る。当該技術分野において公知のアミノ保護基は、T.H.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,John Wiley&Sons,New York(1999)に一般に記載されている。アミノ保護基の例としては、以下に限定はされないが、アセチル、t-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルメトキシカルボニル、およびベンジルオキシカルボニルが挙げられる。
「カルボン酸保護基」という用語は、化合物の他の機能的部位に関与する反応が行われながら、カルボン酸官能基をブロックまたは保護するのに用いられるカルボン酸保護基を指す。このようなカルボキシ保護基は、対応するカルボン酸への加水分解方法によるかまたは水素化分解方法による切断の容易さで知られている。カルボン酸エステル保護基の例としては、以下に限定はされないが、メチル、tert-ブチル、ベンジル、4-メトキシベンジル、C2~C6アルカノイルオキシメチル、2-ヨードエチル、4-ニトロベンジル、ジフェニルメチル(ベンズヒドリル)、フェナシル、4-ハロフェナシル、ジメチルアリル、2,2,2-トリクロロエチル、トリ(C1~C3アルキル)シリル、スクシンイミドメチルおよび類似のエステル形成部分が挙げられる。カルボキシ基のエステル保護に加えて、このような基はまた、第三級アミン塩基の存在下で、塩化アセチル、塩化プロピオニル、塩化イソブチリルおよび他の酸塩化物とともに形成されるものなどの混合無水物として保護され得る。E.Haslam in Protective Groups in Organic Chemistry(上掲),Chapter 5に記載されるものなどの他の公知のカルボキシ保護基が好適である。エステル形成保護基が好ましい。
上記の定義において、ヒドロキシおよびカルボキシ保護基は、網羅的に定義されていない。このような基の機能は、調製工程中の反応性官能基を保護し、次に、分子の残りの部分を中断せずに、後のある時点で除去されることである。多くの保護基が、当該技術分野で公知であり、本明細書において上で特に言及されていない他の保護基の使用が同様に適用可能である。
好適なペプチド結合試薬としては、以下に限定はされないが、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)、DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)、ジ-p-トルオイルカルボジイミド、BDP(1-ベンゾトリアゾールジエチルホスフェート-1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニルエチル)カルボジイミド)、EDC(1-(3-ジメチルアミノプロピル-3-エチル-カルボジイミド塩酸塩)、フッ化シアヌル、塩化シアヌル、TFFH(テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート)、DPPA(アジドリン酸ジフェニル)、BOP(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、HBTU(O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)、TBTU(O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート)、TSTU(O-(N-スクシンイミジル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート)、HATU(N-[(ジメチルアミノ)-1-H-1,2,3-トリアゾロ[4,5,6]-ピリジン-1-イルメチレン]-N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートN-オキシド)、BOP-Cl(ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド)、PyBOP((1-H-1,2,3-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)-トリス(ピロリジノ)ホスホニウムテトラフルオロホスフェート)、BrOP(ブロモトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、DEPBT(3-(ジエトキシホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン)PyBrOP(ブロモトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)が挙げられる。EDC、HOAT、BOP-ClおよびPyBrOPが、好ましいペプチド結合試薬である。ペプチド結合試薬の量は、約1.0~約10.0当量の範囲である。アミド結合形成反応に使用され得る任意選択の試薬としては、約1.0~約10.0当量の範囲の量の、DMAP(4-ジメチルアミノピリジン)またはHOBT(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、HOAT(ヒドロキシアザベンゾトリアゾール)、HOSu(ヒドロキシスクシンイミド)、HONB(endo-N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキサミド)などの活性なエステル試薬が挙げられる。
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のうちのいずれかの基を指す。
「アルキル」という用語は、N、O、またはSで任意選択的に介在され得る、示された数の炭素原子(これらとしては、以下に限定はされないが、プロピル、アリル、またはプロパルギルが挙げられる)を含有する、直鎖状または分枝鎖状であり得る飽和および不飽和の非芳香族炭化水素鎖を指す。例えば、C1~C10は、基が、その中に1つ以上10個以下の炭素原子を有し得ることを示す。「アルキレン」という用語は、二価のアルキル(すなわち、-R-)を指す。
「アルコキシ」という用語は、-O-アルキル基を指す。
「アルキレンジオキソ」という用語は、構造-O-R-O-(式中、Rがアルキレンを表す)の二価の種を指す。
「アミノアルキル」という用語は、アミノ基で置換されるアルキルを指す。
「メルカプト」という用語は、-SH基を指す。
「チオアルコキシ」という用語は、-S-アルキル基を指す。
「アリール」という用語は、各環の0、1、2、3、または4つの原子が置換基で置換され得る、6-炭素単環式または10-炭素二環式芳香環系を指す。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
「アリールアルキル」および「アラルキル」という用語は、アリールで置換されるアルキルを指す。
「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されるアルコキシを指す。
本明細書において用いられる際の「シクロアルキル」という用語は、3~12個の炭素、例えば、3~8個の炭素、例えば、3~6個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、任意選択的に置換され得る。シクロアルキル基としては、以下に限定はされないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合1~3つのヘテロ原子、二環式の場合1~6つのヘテロ原子、または三環式の場合1~9つのヘテロ原子を有する芳香族5~8員単環式、8~12員二環式、または11~14員三環式環系を指し、ここで、ヘテロ原子は、O、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ1~3つ、1~6つ、または1~9つの、N、O、またはSのヘテロ原子)、各環の0、1、2、3、または4つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、およびチアゾリルが挙げられる。
「ヘテロアリールアルキル」および「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルキルを指す。
「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合1~3つのヘテロ原子、二環式の場合1~6つのヘテロ原子、または三環式の場合1~9つのヘテロ原子を有する非芳香族5~8員単環式、8~12員二環式、または11~14員三環式環系を指し、ここで、ヘテロ原子は、O、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ1~3つ、1~6つ、または1~9つの、N、O、またはSのヘテロ原子)、各環の0、1、2または3つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、およびテトラヒドロフラニルが挙げられる。
「オキソ」という用語は、炭素に結合されるとカルボニルを形成し、窒素に結合されるとN-オキシドを形成し、硫黄に結合されるとスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、そのいずれも、1つ以上の置換基でさらに置換され得る。
「DMTr」という用語は、特に規定されない限り、4,4’-ジメトキシトリチルを指す。
「置換」という用語は、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族を含むがそれらに限定されない規定される置換基のラジカルによる、所与の構造中の1つ以上の水素ラジカルの置換を指す。置換基は、さらに置換され得ることが理解される。
「単糖」という用語は、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、D-フシトール、L-フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、D-ガラクトサミニトール、N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース-6-リン酸、グロースグリセルアルデヒド、L-グリセロ-D-マンノス-ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース-6-リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロースおよびキシルロースのラジカルを包含する。単糖は、D-またはL-立体配置にあり得る。単糖はさらに、デオキシ糖(水素で置換されたアルコールヒドロキシ基)、アミノ糖(アミノ基で置換されたアルコールヒドロキシ基)、チオ糖(チオールで置換されたアルコールヒドロキシ基、またはC=Sで置換されたC=O、または硫黄で置換された環状形態の環酸素)、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖(窒素で置換された環炭素)、イミノ糖(窒素で置換された環酸素)、ホスファノ糖(リンで置換された環酸素)、ホスファ糖(リンで置換された環炭素)、C-置換単糖(炭素で置換された、非末端炭素原子における水素)、不飽和単糖、アルジトール(CHOH基で置換されたカルボニル基)、アルドン酸(カルボキシ基で置換されたアルデヒド基)、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などであり得る。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン(kansosamine)、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換され得ることが理解される。
「二糖」、「三糖」および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、2-デオキシリボース、2-デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース(evemitrose)、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β-マルトース、マルトリオース、マンナン-オリゴ糖、マンニノトリオース、メレジトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリマイシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α,α-トレハロース、トレハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどのラジカルを包含する。さらに、「二糖」、「三糖」および「多糖」などは、さらに置換され得ることが理解される。二糖は、アミノ糖およびそれらの誘導体、特に、C-4’位で誘導体化されたミカミノースまたはC-6’位で誘導体化された4デオキシ-3-アミノ-グルコースも含む。
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、アンチマイクロRNA、マイクロRNA模倣体、アンチmiR、アンタゴmir、dsRNA、ssRNA、アプタマー、免疫刺激、デコイオリゴヌクレオチド、スプライシング変化オリゴヌクレオチド、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、G-四量体またはアンチセンスであり得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、iRNA剤である。
ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、UNA(ロックされていない(unlocked)核酸)ヌクレオチドである1つ以上のモノマーを含む。UNAは、ロックされていない非環状核酸を指し、ここで、糖の結合の少なくとも1つが、除去されており、ロックされていない「糖」残基を形成する。一例において、UNAは、C1’~C4’の間の結合(すなわち、C1’-C4’炭素の間の炭素-酸素-炭素共有結合)が除去されているモノマーも包含する。別の例において、糖のC2’-C3’結合(すなわち、C2’およびC3’炭素の間の炭素-炭素共有結合)が除去されている(参照により本明細書に援用されるFluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039を参照)。
「iRNA剤」という用語は、標的遺伝子(例えば、siRNA)、好ましくは、内因性または病原体標的RNAの発現を下方制御することができるRNA剤(またはRNA剤へと切断され得る)を指す。理論によって制約されるのを望むものではないが、iRNA剤は、標的mRNA(当該技術分野においてRNAiと呼ばれる)の転写後切断、または転写前または翻訳前機序を含むいくつかの機序のうちの1つ以上によって作用し得る。iRNA剤は、一本鎖を含むことができ、または2本以上の鎖を含むことができ、例えば、iRNA剤は、二本鎖iRNA剤であり得る。iRNA剤が一本鎖である場合、iRNA剤は、1つ以上のリン酸基またはリン酸基の1つ以上の類似体を含む5’修飾を含み得る。好ましい一実施形態において、iRNA剤は二本鎖である。
iRNA剤は、典型的に、標的遺伝子に十分に相同な領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さを有し、それによって、iRNA剤、またはその断片は、標的遺伝子の下方制御を媒介し得る。iRNA剤は、少なくとも部分的に、ある実施形態において完全に、標的RNAに相補的である領域であるかまたはそれを含む。iRNA剤と標的との間の完全な相補性がある必要はないが、iRNA剤、またはその切断産物が、例えば、標的RNA、例えば、mRNAのRNAi切断によって、配列特異的なサイレンシングを指令することが可能であるほど一致が十分であるのが好ましい。
iRNA剤中のヌクレオチドは、修飾されてもよく(例えば、1つ以上のヌクレオチドは、2’-Fまたは2’-OCH3基を含み得る)、またはヌクレオチドサロゲートであってもよい。iRNA剤の一本鎖領域は、修飾されてもよく、またはヌクレオシドサロゲートを含んでいてもよく、例えば、非対合領域またはヘアピン構造の領域、例えば、2つの相補的な領域を結合する領域は、修飾またはヌクレオシドサロゲートを有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、iRNA剤の1つ以上の3’末端または5’末端を安定化させる修飾。修飾は、C3(またはC6、C7、C12)アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサ(C3、C6、C9、C12、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール)、ホスホロアミダイトとして生じ、別のDMT保護されたヒドロキシル基を有し、RNA合成の際の複数の結合を可能にする特殊なビオチンまたはフルオレセイン試薬を含み得る。修飾は、例えば、リボース糖の2’OH基における修飾の使用、例えば、デオキシリボヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチドの代わりにデオキシチミジンの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾も含み得る。ある実施形態において、異なる鎖が、異なる修飾を含む。
ある実施形態において、鎖は、iRNA剤が分子の一端または両端で一本鎖または非対合領域を含むように選択されるのが好ましい。二本鎖iRNA剤は、好ましくは、オーバーハング、例えば、1つまたは2つの5’または3’オーバーハング(好ましくは、少なくとも、2~3個のヌクレオチドの3’オーバーハング)と対合される鎖を有する。好ましいiRNA剤は、各末端で1つまたは好ましくは、2つまたは3つのヌクレオチド長の一本鎖オーバーハング、好ましくは、3’オーバーハングを有する。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことの結果、または同じ長さの2つの鎖が互い違いに交差されることの結果であり得る。
iRNA剤の鎖の間の二本鎖領域の好ましい長さは、6~30ヌクレオチド長である。好ましい二本鎖領域は、15~30、最も好ましくは、18、19、20、21、22、および23ヌクレオチド長である。他の好ましい二本鎖領域は、6~20ヌクレオチド、最も好ましくは、6、7、8、9、10、11および12ヌクレオチド長である。
オリゴヌクレオチドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されているものであり得る。
本明細書において使用される際の「一本鎖siRNA化合物」は、単一の分子から構成されるsiRNA化合物である。それは、鎖内対合によって形成される二本鎖領域を含んでいてもよく、例えば、それは、ヘアピンまたはフライパンの柄の構造であるかまたはそれを含み得る。一本鎖siRNA化合物は、標的分子に対してアンチセンスであり得る。
一本鎖siRNA化合物は、RISCに入り、標的mRNAのRISCを介した切断に関与することができるのに十分に長くなり得る。一本鎖siRNA化合物は、少なくとも14ヌクレオチド長、他の実施形態において、少なくとも15、20、25、29、35、40、または50ヌクレオチド長である。特定の実施形態において一本鎖siRNA化合物は、200、100、または60ヌクレオチド長未満である。
ヘアピンsiRNA化合物は、17、18、19、29、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対以上の二本鎖領域を有する。二本鎖領域は、200、100、または50長以下であり得る。特定の実施形態において、二本鎖領域の範囲は、15~30、17~23、19~23、19~21ヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一本鎖オーバーハングまたは末端の非対合領域を有し得る。特定の実施形態において、オーバーハングは、2~3ヌクレオチド長である。ある実施形態において、オーバーハングは、ヘアピンのセンス側にあり、ある実施形態において、ヘアピンのアンチセンス側にある。
本明細書において使用される際の「二本鎖siRNA化合物」は、鎖間ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成し得る、2つ以上、場合によっては2つの鎖を含むsiRNA化合物である。
二本鎖siRNA化合物のアンチセンス鎖は、14、15、16 17、18、19、25、29、40、または60ヌクレオチド長以上であり得る。それは、200、100、または50ヌクレオチド長以下であり得る。範囲は、17~25、19~23、19~21ヌクレオチド長であり得る。本明細書において使用される際、「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば標的RNAに対して十分に相補的なsiRNA化合物の鎖を意味する。
二本鎖siRNA化合物のセンス鎖は、14、15、16 17、18、19、25、29、40、または60ヌクレオチド長以上であり得る。それは、200、100、または50、ヌクレオチド長以下であり得る。範囲は、17~25、19~23、および19~21ヌクレオチド長であり得る。
二本鎖siRNA化合物の二本鎖部分は、14、15、16 17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、または60ヌクレオチド対の長さ以上であり得る。それは、200、100、または50、ヌクレオチド対の長さ以下であり得る。範囲は、15~30、17~23、19~23、および19~21ヌクレオチド対の長さであり得る。
多くの実施形態において、siRNA化合物は、より小さいsiRNA化合物、例えば、siRNA剤を産生するように、内因性分子によって、例えば、Dicerによって切断され得るほど十分に大きい。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖siRNA化合物が、分子の一端または両端で一本鎖または非対合領域を含むように選択され得る。したがって、二本鎖siRNA化合物は、1~3個のヌクレオチドのオーバーハング、例えば、1つまたは2つの5’または3’オーバーハング、または3’オーバーハングを含有するように対合されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有し得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことの結果、または同じ長さの2つの鎖が互い違いに交差されることの結果であり得る。ある実施形態は、少なくとも1つの3’オーバーハングを有する。一実施形態において、siRNA分子の両端は、3’オーバーハングを有する。ある実施形態において、オーバーハングは、2個のヌクレオチドである。
特定の実施形態において、二本鎖領域の長さは、例えば、上述されるssiRNA化合物の範囲内で、15~30、または18、19、20、21、22、および23ヌクレオチド長である。ssiRNA化合物は、天然のDicerによって長いdsiRNAからプロセシングされた産物と長さおよび構造が類似し得る。ssiRNA化合物の2つの鎖が結合される、例えば、共有結合される実施形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および3’オーバーハングを提供する他の一本鎖構造も考えられる。
二本鎖siRNA化合物および一本鎖siRNA化合物を含む本明細書に記載されるsiRNA化合物は、標的RNA、例えば、mRNA、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物のサイレンシングを媒介することができる。便宜上、このようなmRNAは、本明細書においてサイレンシングされるmRNAとも呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるRNAは、内因性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、mRNA以外のRNA、例えば、tRNA、およびウイルスRNAも標的にされ得る。
本明細書において使用される際、「RNAiを媒介する」という語句は、配列特異的に、標的RNAをサイレンシングする能力を指す。理論によって制約されるのを望むものではないが、サイレンシングは、RNAiの機構またはプロセスおよびガイドRNA、例えば、21~23個のヌクレオチドのssiRNA化合物を使用するものと考えられる。
一実施形態において、siRNA化合物が、標的RNA、例えば、標的mRNAに対して「十分に相補的」であり、それによって、siRNA化合物は、標的mRNAによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態において、siRNA化合物は、標的RNAに対して「正確に相補的」であり、例えば、標的RNAおよびsiRNA化合物は、例えば、正確な相補性の領域においてワトソン・クリック塩基対のみから構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的」な標的RNAは、標的RNAに対して正確に相補的な(例えば、少なくとも10ヌクレオチドの)内部領域を含み得る。さらに、特定の実施形態において、siRNA化合物は、具体的に、単一のヌクレオチドの違いを識別する。この場合、siRNA化合物は、正確な相補性が、単一のヌクレオチドの違いがある(例えば、7ヌクレオチド内の)領域に見られる場合のみ、RNAiを媒介する。
マイクロRNA
マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物のゲノム中のDNAから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小さいRNA分子の高度に保存された種類である。プロセシングされるmiRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれ、発達、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の主要調節因子として認識されている一本鎖約17~25ヌクレオチド(nt)RNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’-不飽和領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。RISCは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物のゲノム中のDNAから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小さいRNA分子の高度に保存された種類である。プロセシングされるmiRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれ、発達、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の主要調節因子として認識されている一本鎖約17~25ヌクレオチド(nt)RNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’-不飽和領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。RISCは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
これまでに同定されたmiRNA配列の数は、多数であり、ますます増加しており、その例示的な例が、例えば、“miRBase:microRNA sequences,targets and gene nomenclature”Griffiths-Jones S,Grocock RJ,van Dongen S,Bateman A,Enright AJ.NAR,2006,34,Database Issue,D140-D144;“The microRNA Registry”Griffiths-Jones S.NAR,2004,32,Database Issue,D109-D111;およびさらにhttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/に見られる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択される配列に相補的なDNAまたはRNA、例えば標的遺伝子mRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なmRNAに結合することによって遺伝子発現を阻害するものと考えられる。標的mRNAへの結合は、それに結合することによって相補的なmRNA鎖の翻訳を防ぐことによって、または標的mRNAの分解をもたらすことによって、遺伝子発現の阻害をもたらし得る。アンチセンスDNAは、特定の、相補的(コードまたは非コード)RNAを標的にするのに使用され得る。結合が起こる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNase Hによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10~約50個のヌクレオチド、より好ましくは、約15~約30個のヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的でないことがあり得るアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合、または標的配列との1つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合が想定される。
一実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択される配列に相補的なDNAまたはRNA、例えば標的遺伝子mRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なmRNAに結合することによって遺伝子発現を阻害するものと考えられる。標的mRNAへの結合は、それに結合することによって相補的なmRNA鎖の翻訳を防ぐことによって、または標的mRNAの分解をもたらすことによって、遺伝子発現の阻害をもたらし得る。アンチセンスDNAは、特定の、相補的(コードまたは非コード)RNAを標的にするのに使用され得る。結合が起こる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNase Hによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10~約50個のヌクレオチド、より好ましくは、約15~約30個のヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的でないことがあり得るアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合、または標的配列との1つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合が想定される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、タンパク質合成の有効な標的化阻害剤であることが実証されており、その結果、標的化遺伝子によってタンパク質合成を特異的に阻害するのに使用され得る。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン2型アセチルコリン受容体の合成は、そのそれぞれのmRNA配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される(それぞれが参照により援用される米国特許第5,739,119号明細書および米国特許第5,759,829号明細書)。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子(MDG1)、ICAM-1、E-セレクチン、STK-1、線条体GABAA受容体およびヒトEGFで実証されている(それぞれが参照により援用される、Jaskulski et al.,Science.1988 Jun 10;240(4858):1544-6;Vasanthakumar and Ahmed,Cancer Commun.1989;1(4):225-32;Peris et al.,Brain Res Mol Brain Res.1998 Jun 15;57(2):310-20;米国特許第5,801,154号明細書;米国特許第5,789,573号明細書;米国特許第5,718,709号明細書および米国特許第5,610,288号明細書)。さらに、アンチセンス構築物が、様々な異常な細胞増殖、例えば癌を阻害し、それを治療するのに使用され得ることも記載されている(それぞれが参照により援用される、米国特許第5,747,470号明細書;米国特許第5,591,317号明細書および米国特許第5,783,683号明細書)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する方法が、当該技術分野において公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するように容易に適合され得る。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択される標的配列の分析ならびに二次構造、Tm、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二量体、ヘアピン、または宿主細胞中の標的mRNAへの特異的な結合を減少させるかまたは妨げ得る他の二次構造を形成するそれらの相対的な能力の低さに基づいて選択され得る。mRNAの非常に好ましい標的領域は、AUG翻訳開始コドンにおけるまたはその近くの領域およびmRNAの5’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造の分析および標的部位の選択判断は、例えば、OLIGOプライマー分析ソフトウェアのv.4(Molecular Biology Insights)および/またはBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.1997,25(17):3389-402)を用いて行われ得る。
アンタゴmir
アンタゴmirは、RNAse保護ならびに向上した組織および細胞取り込みなどの薬理学的特性のための様々な修飾を有するRNA様のオリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖、ホスホロチオエート骨格および、例えば、3’末端におけるコレステロール部分の完全な2’-O-メチル化によって、通常のRNAと異なる。アンタゴmirは、アンタゴmirおよび内因性miRNAを含む二本鎖を形成し、それによって、miRNAに誘発される遺伝子サイレンシングを防ぐことによって、内因性miRNAを効率的にサイレンシングするのに使用され得る。アンタゴmirを介したmiRNAサイレンシングの例は、全体が参照により本明細書に明示的に援用されるKrutzfeldt et al,Nature,2005,438:685-689に記載されるmiR-122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いて合成され得る。米国特許出願公開第2007/0123482号明細書および同第2007/0213292号明細書(それぞれが参照により本明細書に援用される)を参照されたい。
アンタゴmirは、RNAse保護ならびに向上した組織および細胞取り込みなどの薬理学的特性のための様々な修飾を有するRNA様のオリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖、ホスホロチオエート骨格および、例えば、3’末端におけるコレステロール部分の完全な2’-O-メチル化によって、通常のRNAと異なる。アンタゴmirは、アンタゴmirおよび内因性miRNAを含む二本鎖を形成し、それによって、miRNAに誘発される遺伝子サイレンシングを防ぐことによって、内因性miRNAを効率的にサイレンシングするのに使用され得る。アンタゴmirを介したmiRNAサイレンシングの例は、全体が参照により本明細書に明示的に援用されるKrutzfeldt et al,Nature,2005,438:685-689に記載されるmiR-122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いて合成され得る。米国特許出願公開第2007/0123482号明細書および同第2007/0213292号明細書(それぞれが参照により本明細書に援用される)を参照されたい。
アンタゴmirは、オリゴヌクレオチド合成のためのリガンドがコンジュゲートされたモノマーサブユニットおよびモノマーを含み得る。例示的なモノマーが、全体が参照により援用される米国特許出願公開第2005/0107325号明細書に記載されている。アンタゴmirは、全体が参照により援用される国際公開第2004/080406号に記載されるようなZXY構造を有し得る。アンタゴmirは、両親媒性部分と複合体を形成し得る。オリゴヌクレオチド作用物質とともに使用するための例示的な両親媒性部分は、全体が参照により援用される国際公開第2004/080406号に記載されている。
アプタマー
アプタマーは、高い親和性および特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である(それぞれ、全体が参照により援用される、Tuerk and Gold,Science 249:505(1990);Ellington and Szostak,Nature 346:818(1990))。大きいタンパク質から小さい有機分子まで多くの様々な実体に結合するDNAまたはRNAアプタマーの産生が成功している。それぞれ、全体が参照により援用される、Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.1:10-16(1997)、Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324-9(1999)、およびHermann and Patel,Science 287:820-5(2000)を参照されたい。アプタマーは、RNAまたはDNAベースであってもよく、リボスイッチを含み得る。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的の結合が遺伝子の活性に影響を与えるmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAが、その標的分子の存在または非存在に応じて、それ自体の活性を調節するのに直接関与する。一般に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的に結合するための反復するインビトロでの選択または同等に、SELEX(試験管内進化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))によって操作される(engineered)。アプタマーは、合成、組み換え、および精製方法を含む任意の公知の方法によって調製されてもよく、単独で、または同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により詳細に記載されるように、「アプタマー」という用語は、具体的に、2つ以上の公知のアプタマーを所与の標的と比較することから導かれるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
アプタマーは、高い親和性および特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である(それぞれ、全体が参照により援用される、Tuerk and Gold,Science 249:505(1990);Ellington and Szostak,Nature 346:818(1990))。大きいタンパク質から小さい有機分子まで多くの様々な実体に結合するDNAまたはRNAアプタマーの産生が成功している。それぞれ、全体が参照により援用される、Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.1:10-16(1997)、Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324-9(1999)、およびHermann and Patel,Science 287:820-5(2000)を参照されたい。アプタマーは、RNAまたはDNAベースであってもよく、リボスイッチを含み得る。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的の結合が遺伝子の活性に影響を与えるmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAが、その標的分子の存在または非存在に応じて、それ自体の活性を調節するのに直接関与する。一般に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的に結合するための反復するインビトロでの選択または同等に、SELEX(試験管内進化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))によって操作される(engineered)。アプタマーは、合成、組み換え、および精製方法を含む任意の公知の方法によって調製されてもよく、単独で、または同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により詳細に記載されるように、「アプタマー」という用語は、具体的に、2つ以上の公知のアプタマーを所与の標的と比較することから導かれるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
リボザイム
別の実施形態によれば、核酸-脂質粒子は、リボザイムと結合される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するRNA分子錯体である(Kim and Cech,Proc Natl Acad Sci USA.1987 Dec;84(24):8788-92;Forster and Symons,Cell.1987 Apr 24;49(2):211-20)。例えば、多数のリボザイムは、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断する高度な特異性で、リン酸エステル転移反応を加速する(Cech et al.,Cell.1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96;Michel and Westhof,J Mol Biol.1990 Dec 5;216(3):585-610;Reinhold-Hurek and Shub,Nature.1992 May 14;357(6374):173-6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が塩基対形成相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因するとされている。
別の実施形態によれば、核酸-脂質粒子は、リボザイムと結合される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するRNA分子錯体である(Kim and Cech,Proc Natl Acad Sci USA.1987 Dec;84(24):8788-92;Forster and Symons,Cell.1987 Apr 24;49(2):211-20)。例えば、多数のリボザイムは、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断する高度な特異性で、リン酸エステル転移反応を加速する(Cech et al.,Cell.1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96;Michel and Westhof,J Mol Biol.1990 Dec 5;216(3):585-610;Reinhold-Hurek and Shub,Nature.1992 May 14;357(6374):173-6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が塩基対形成相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因するとされている。
天然の酵素的RNAの少なくとも6つの基本的な種が現在知られている。それぞれが、生理的条件下で、トランスでRNAホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる(したがって、他のRNA分子を切断することができる)。一般に、酵素的核酸は、まず、標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、標的RNAを切断するように機能する分子の酵素部分に近接して保たれる酵素的核酸の標的結合部分によって起こる。したがって、酵素的核酸は、まず、標的RNAを認識し、次に、相補的な塩基対形成によって標的RNAに結合し、正確な部位に結合されると、標的RNAを切断するように酵素的に作用する。このような標的RNAの戦略的切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を損なうであろう。酵素的核酸は、そのRNA標的に結合し、そのRNA標的を切断した後、別の標的を探すためにそのRNAから放出され、新たな標的との結合および切断を繰り返すことができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、グループIイントロンまたはRNaseP RNA(RNAガイド配列と結合されている)またはアカパンカビ属(Neurospora)VS RNAモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体例が、Rossi et al.Nucleic Acids Res.1992 Sep 11;20(17):4559-65によって記載されている。ヘアピンモチーフの例が、Hampel et al.(欧州特許出願公開第EP0360257号明細書)、Hampel and Tritz,Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33;Hampel et al.,Nucleic Acids Res.1990 Jan 25;18(2):299-304および米国特許第5,631,359号明細書によって記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例が、Perrotta and Been,Biochemistry.1992 Dec 1;31(47):11843-52によって記載され;RNasePモチーフの例が、Guerrier-Takada et al.,Cell.1983 Dec;35(3 Pt 2):849-57によって記載され;アカパンカビ属(Neurospora)VS RNAリボザイムモチーフが、Collins(Saville and Collins,Cell.1990 May 18;61(4):685-96;Saville and Collins,Proc Natl Acad Sci USA.1991 Oct 1;88(19):8826-30;Collins and Olive,Biochemistry.1993 Mar 23;32(11):2795-9)によって記載され;グループIイントロンの例が、米国特許第4,987,071号明細書に記載されている。使用される酵素的核酸分子の重要な特性は、それらが、標的遺伝子DNAまたはRNA領域の1つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有すること、およびそれらが、分子にRNA切断活性を与える基質結合部位の内部または周囲にヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイム構築物は、本明細書に記載される特定のモチーフに限定される必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列に標的化されるリボザイムを産生する方法は、当該技術分野において公知である。リボザイムは、それぞれが具体的に参照により本明細書に援用される国際特許出願公開国際公開第93/23569号および国際公開第94/02595号に記載されるように設計され、それらの文献に記載されるように、インビトロおよびインビボで試験されるように合成され得る。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変更するか、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する修飾(例えば、酵素的RNA分子の糖部分に行われ得る様々な化学修飾を記載する、国際特許出願公開国際公開第92/07065号、国際公開第93/15187号、および国際公開第91/03162号;欧州特許出願公開第92110298.4号明細書;米国特許第5,334,711号明細書;および国際特許出願公開国際公開第94/13688号を参照)、細胞におけるそれらの有効性を高める修飾、およびRNA合成時間を短縮し、化学的条件を減少させるためのステムII塩基の除去を有するリボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
免疫刺激オリゴヌクレオチド
哺乳動物または他の患者であり得る被験体に投与されるとき、免疫応答を誘発することが可能な免疫刺激オリゴヌクレオチド(ISS;一本鎖または二本鎖)を含む、脂質粒子と結合される核酸は、免疫刺激性であり得る。ISSは、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定のパリンドローム(全体が参照により援用されるYamamoto S.,et al.(1992)J.Immunol.148:4072-4076を参照)、またはCpGモチーフ、ならびに他の公知のISSの特徴(多重Gドメインなど、全体が参照により援用される国際公開第96/11266号を参照)を含む。
哺乳動物または他の患者であり得る被験体に投与されるとき、免疫応答を誘発することが可能な免疫刺激オリゴヌクレオチド(ISS;一本鎖または二本鎖)を含む、脂質粒子と結合される核酸は、免疫刺激性であり得る。ISSは、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定のパリンドローム(全体が参照により援用されるYamamoto S.,et al.(1992)J.Immunol.148:4072-4076を参照)、またはCpGモチーフ、ならびに他の公知のISSの特徴(多重Gドメインなど、全体が参照により援用される国際公開第96/11266号を参照)を含む。
免疫応答は、自然免疫応答または適応免疫応答であり得る。免疫系は、脊椎動物のさらなる自然免疫系、および獲得適応免疫系に分けられ、後者は、体液性細胞成分にさらに分けられる。特定の実施形態において、免疫応答は、粘膜性であり得る。
特定の実施形態において、免疫刺激核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与される場合にのみ免疫刺激性であり、その「遊離形態」で投与される場合、免疫刺激性でない。このようなオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性であるとみなされる。
免疫刺激核酸は、免疫応答を誘発するために、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、標的ポリヌクレオチドの発現を低下させる必要がない場合、非配列特異的であるとみなされる。したがって、特定の免疫刺激核酸は、天然の遺伝子またはmRNAの領域に対応する配列を含み得るが、それでもなお非配列特異的免疫刺激核酸とみなされ得る。
一実施形態において、免疫刺激核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはCpGジヌクレオチドは、メチル化されていなくてもまたはメチル化されていてもよい。別の実施形態において、免疫刺激核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む。一実施形態において、核酸は、単一のCpGジヌクレオチドを含み、ここで、前記CpGジヌクレオチド中のシトシンがメチル化される。代替的な実施形態において、核酸は、少なくとも2個のCpGジヌクレオチドを含み、ここで、CpGジヌクレオチド中の少なくとも1個のシトシンがメチル化される。さらなる実施形態において、配列中に存在するCpGジヌクレオチド中の各シトシンがメチル化される。別の実施形態において、核酸は、複数のCpGジヌクレオチドを含み、ここで、前記CpGジヌクレオチドの少なくとも1つが、メチル化シトシンを含む。
リンカー
リンカーは、オリゴヌクレオチドをリガンドに結合するための任意の好適な基であり得る。リンカーの他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
リンカーは、オリゴヌクレオチドをリガンドに結合するための任意の好適な基であり得る。リンカーの他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
リンカーへのオリゴヌクレオチドの結合点
オリゴヌクレオチドは、両者を結合するための任意の好適な基を介してリンカーに結合され得る。基は、切断可能であるかまたは切断不可能であり得る。リンカーおよび好適な結合基の例が、本明細書に記載される。結合基の他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。好適な結合基としては、例えば、NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NHまたは以下に限定はされないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの、原子の鎖が挙げられ、そのそれぞれが、置換または非置換であってもよく、1つ以上のメチレンが、O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、または置換または非置換複素環式によって介在または終端され得、ここで、R8が、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
オリゴヌクレオチドは、両者を結合するための任意の好適な基を介してリンカーに結合され得る。基は、切断可能であるかまたは切断不可能であり得る。リンカーおよび好適な結合基の例が、本明細書に記載される。結合基の他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。好適な結合基としては、例えば、NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NHまたは以下に限定はされないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの、原子の鎖が挙げられ、そのそれぞれが、置換または非置換であってもよく、1つ以上のメチレンが、O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、または置換または非置換複素環式によって介在または終端され得、ここで、R8が、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
切断可能な基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞中に入ると切断されて、基が結合している2つの部分を放出する基である。好ましい実施形態において、切断可能な基は、被験体の血液中、または(例えば、血液または血清中で見られる条件を模倣するかまたは表すように選択され得る)第2の参照条件下より少なくとも10倍以上、好ましくは、少なくとも100倍以上速く、標的細胞または(例えば、細胞内条件を模倣するかまたは表すように選択され得る)第1の参照条件下で切断される。
切断可能な基は、切断因子、例えば、pH、酸化還元電位または分解分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断因子は、血清または血液中より細胞内でより高いレベルまたは活性で、より広くまたはより多く見られる。このような分解因子の例としては、例えば、酸化還元で切断可能な基を還元によって分解することができる、細胞内に存在するメルカプタンなどの酸化もしくは還元酵素または還元剤を含む、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性を有さない酸化還元剤;エステラーゼ;エンドソームまたは酸性環境を生じさせることが可能な薬剤、例えば、5以下のpHを生じさせる薬剤;一般酸として作用することによって酸で切断可能な基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)、およびホスファターゼが挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な基は、pHの影響を受けやすいことがある。ヒト血清のpHは、7.4である一方、平均の細胞内pHは、わずかにより低く、約7.1~7.3の範囲である。エンドソームは、5.5~6.0の範囲のより酸性のpHを有し、リソソームは、約5.0のさらにより酸性のpHを有する。いくつかのリンカーは、好ましいpHで切断される切断可能な基を有し、それによって、細胞内のリガンドから、または細胞の所望の区画中に、カチオン性脂質を放出する。
コンジュゲートは、特定の酵素によって切断することができる切断可能な基を含み得る。コンジュゲート中に組み込まれる切断可能な基のタイプは、標的にされる細胞に応じて決まる。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含む化学的部分を介してカチオン性脂質に結合され得る。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、基は、エステラーゼが豊富でない細胞型中より効率的に肝細胞中で切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含む結合基が、肝細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞型を標的にする場合に使用され得る。
一般に、候補の切断可能な基の好適性は、候補の基を切断する分解因子の能力(または条件)を試験することによって評価され得る。血液中でのまたは他の非標的組織と接触したときの切断に抵抗する能力についても候補の切断可能な基を試験することも望ましい。このように、第1の条件と第2の条件との間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、ここで、第1の条件は、標的細胞内での切断を示すように選択され、第2の条件は、他の組織または生体液、例えば、血液または血清中での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系で、細胞で、細胞培養で、器官もしくは組織培養で、または動物全体で行われ得る。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)と比較して少なくとも2、4、10または100倍速く、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)で切断される。
i.酸化還元で切断可能な基
切断可能な基の1つの種類は、還元または酸化により切断される酸化還元で切断可能な基である。還元で切断可能な基の例は、ジスルフィド連結基(-S-S-)である。候補の切断可能な基が、好適な「還元で切断可能な連結基」であるか、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール(DTT)、または細胞内、例えば、標的細胞内で観察される切断の速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を用いた他の還元剤を用いたインキュベーションによって評価され得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価され得る。好ましい実施形態において、候補の化合物は、血液中で10%以下切断される。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)と比較して少なくとも2、4、10または100倍速く、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)で分解される。候補の化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択され、細胞外媒体を模倣するように選択される条件と比較される条件下で標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され得る。
切断可能な基の1つの種類は、還元または酸化により切断される酸化還元で切断可能な基である。還元で切断可能な基の例は、ジスルフィド連結基(-S-S-)である。候補の切断可能な基が、好適な「還元で切断可能な連結基」であるか、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール(DTT)、または細胞内、例えば、標的細胞内で観察される切断の速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を用いた他の還元剤を用いたインキュベーションによって評価され得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価され得る。好ましい実施形態において、候補の化合物は、血液中で10%以下切断される。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)と比較して少なくとも2、4、10または100倍速く、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)で分解される。候補の化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択され、細胞外媒体を模倣するように選択される条件と比較される条件下で標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され得る。
ii.ホスフェート系の切断可能な基
ホスフェート系の切断可能な基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の連結基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、および-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
ホスフェート系の切断可能な基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の連結基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、および-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
iii.酸で切断可能な基
酸で切断可能な基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸で切断可能な基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0、またはそれを下回る)のpHを有する酸性環境において、または一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低いpHの細胞小器官が、酸で切断可能な連結基のための切断環境を提供することができる。酸で切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸で切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、または-OC(O)で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合される炭素(アルコキシ基)がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはt-ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
酸で切断可能な基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸で切断可能な基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0、またはそれを下回る)のpHを有する酸性環境において、または一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低いpHの細胞小器官が、酸で切断可能な連結基のための切断環境を提供することができる。酸で切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸で切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、または-OC(O)で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合される炭素(アルコキシ基)がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはt-ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
iv.エステル系の基
エステル系の切断可能な基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルで切断可能な連結基は、一般式-C(O)O-、または-OC(O)-で表される。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
エステル系の切断可能な基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルで切断可能な連結基は、一般式-C(O)O-、または-OC(O)-で表される。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
v.ペプチド系の切断基
ペプチド系の切断可能な基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-で表され、式中、RAおよびRBが、2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。本明細書において使用される際、「糖質」は、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖単位(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成されるそれ自体糖質である化合物;または酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、それぞれが少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖(単糖、二糖、三糖および約4~9つの単糖単位を含有するオリゴ糖)、ならびにでんぷん、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖類が挙げられる。具体的な単糖としては、C5以上(好ましくは、C5~C8)糖が挙げられ;二糖および三糖としては、2つまたは3つの単糖単位(好ましくは、C5~C8)を有する糖が挙げられる。
ペプチド系の切断可能な基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-で表され、式中、RAおよびRBが、2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。本明細書において使用される際、「糖質」は、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖単位(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成されるそれ自体糖質である化合物;または酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、それぞれが少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖(単糖、二糖、三糖および約4~9つの単糖単位を含有するオリゴ糖)、ならびにでんぷん、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖類が挙げられる。具体的な単糖としては、C5以上(好ましくは、C5~C8)糖が挙げられ;二糖および三糖としては、2つまたは3つの単糖単位(好ましくは、C5~C8)を有する糖が挙げられる。
リガンド
リガンドは、本明細書に記載される任意のリガンドであり得る。
他の好適なリガンドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
リガンドは、本明細書に記載される任意のリガンドであり得る。
他の好適なリガンドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
製剤
本明細書に記載されるコンジュゲートは、被験体に投与するために製剤化され得る。説明しやすくするために、この項における製剤、組成物および方法は、主に、非修飾iRNA剤のコンジュゲートに関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法が、他のオリゴヌクレオチド、例えば、修飾されたiRNA剤のコンジュゲートで実施することができ、このような実施が本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
本明細書に記載されるコンジュゲートは、被験体に投与するために製剤化され得る。説明しやすくするために、この項における製剤、組成物および方法は、主に、非修飾iRNA剤のコンジュゲートに関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法が、他のオリゴヌクレオチド、例えば、修飾されたiRNA剤のコンジュゲートで実施することができ、このような実施が本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
製剤化されたiRNAコンジュゲートは、様々な状態をとり得る。ある例において、コンジュゲートは、少なくとも部分的に結晶性、均一の結晶性、および/または無水(例えば、80、50、30、20、または10%未満の水)である。別の例において、iRNAコンジュゲートは、水相中、例えば、水を含む溶液中にある。
水相または結晶性コンジュゲートは、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム(特に、水相の場合)または粒子(例えば、結晶性組成物に適切であり得るように、微小粒子)中に組み込まれ得る。一般に、iRNAコンジュゲートは、意図される投与方法と適合する方法で製剤化される。iRNAコンジュゲートは、核酸脂質ナノ粒子中に組み込まれ得る。一実施形態において、各ナノ粒子は、コンジュゲート、カチオン性脂質(例えば、約5~約7などの約4~約11の範囲のpKaを有するカチオン性脂質)、非カチオン性脂質(中性脂質など)、凝集還元剤(ポリエチレングリコール(PEG)またはPEG修飾脂質など)、および任意選択的にステロール(例えば、コレステロール)を含む。
特定の実施形態において、組成物は、以下の方法、すなわち、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技術の組合せ;または脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己集合のうちの少なくとも1つによって調製される。
iRNAコンジュゲートは、別の薬剤、例えば、別の治療剤またはiRNAを安定させる薬剤、例えば、iRNAと複合体を形成して、iRNPを形成するタンパク質と組み合わせて製剤化され得る。さらに他の薬剤としては、キレート剤、例えば、EDTA(例えば、Mg2+などの二価カチオンを除去するため)、塩、RNAse阻害剤(例えば、RNAsinなどの広い特異性のRNAse阻害剤)などが挙げられる。
一実施形態において、iRNA組成物は、少なくとも1つの第2の治療剤(例えば、RNAまたはDNA以外の薬剤)を含む。例えば、ウイルス性疾患、例えば、HIVの治療用のiRNA組成物は、公知の抗ウイルス剤(例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤)を含んでいてもよい。別の例において、癌の治療用のiRNA組成物は、化学療法剤をさらに含んでいてもよい。
iRNAコンジュゲートは、細胞中へのiRNA剤の取り込みに影響を与える(例えば、増加させる)薬剤とともに製剤化されてもよい。薬剤は、iRNA剤が投与される前、その後、またはそれと同時に投与され得る。薬剤はまた、iRNA剤に共有結合され得る。薬剤は、例えば、リポ多糖、p38 MAPキナーゼの活性化因子、またはNF-κBの活性化因子であり得る。薬剤は、細胞に一過性の影響を与え得る。
一実施形態において、使用される薬剤は、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および/または中間体フィラメントを破壊することによって、細胞中へのiRNA剤の取り込みを増加させる。薬剤は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
薬剤はまた、例えば、炎症反応を活性化することによって、細胞中へのiRNAコンジュゲートの取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的な薬剤としては、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン-1β、またはγインターフェロンが挙げられる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、実施例は、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献、係属中の特許出願および公開特許の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
略語:TBAHSは、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩であり;DCMは、ジクロロメタンであり;NHSは、N-ヒドロキシスクシンアミドであり;DIEAは、N,N-ジイソプロピルエチルアミンであり;EDCは、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである。
i.(S)-1-((S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)エタン-1,2-ジオール201の合成
メタノール(60mL)中の市販の(R)-メチル2-((S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)-2-ヒドロキシアセテート200(1.9g)の撹拌溶液に、固体水素化ホウ素ナトリウム(0.4g)を、0~5℃で加え、添加後、反応混合物を室温に温め、20分間撹拌する。反応混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈し、ジクロロメタンで抽出する。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物(1.6g)を単離し、それをさらに精製せずに次の工程にそのまま使用する。
メタノール(60mL)中の市販の(R)-メチル2-((S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)-2-ヒドロキシアセテート200(1.9g)の撹拌溶液に、固体水素化ホウ素ナトリウム(0.4g)を、0~5℃で加え、添加後、反応混合物を室温に温め、20分間撹拌する。反応混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈し、ジクロロメタンで抽出する。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物(1.6g)を単離し、それをさらに精製せずに次の工程にそのまま使用する。
ii.(S)-2-((S)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)-2-ヒドロキシエチルメタンスルホネート202の合成
ジクロロメタン(60mL)中のアルコール201(1.6g)の溶液に、トリエチルアミン(1.5mL)を加え、混合物を撹拌しながら冷却する。この撹拌溶液に、ジクロロメタン(30mL)中のメタンスルホニルクロリド(1.3g)を滴下して加え、混合物を室温で2時間撹拌し、その後、反応混合物を、飽和NaHCO3溶液(100mL)、続いて塩水(100mL)で洗浄し、有機層を、無水Na2SO4上で乾燥させた後、濃縮する。このように得られた粗生成物を、シリカゲルを用いて精製すると、純粋な生成物が得られた。
ジクロロメタン(60mL)中のアルコール201(1.6g)の溶液に、トリエチルアミン(1.5mL)を加え、混合物を撹拌しながら冷却する。この撹拌溶液に、ジクロロメタン(30mL)中のメタンスルホニルクロリド(1.3g)を滴下して加え、混合物を室温で2時間撹拌し、その後、反応混合物を、飽和NaHCO3溶液(100mL)、続いて塩水(100mL)で洗浄し、有機層を、無水Na2SO4上で乾燥させた後、濃縮する。このように得られた粗生成物を、シリカゲルを用いて精製すると、純粋な生成物が得られた。
iii.203a~dの合成のための一般的な手順
一般的な手順において、核酸塩基(2当量)を、110℃で無水DMF(100mL)に溶解させ、この撹拌溶液に、固体CsCO3(2g)およびヨウ化ナトリウム(2g)を加え、混合物を激しく撹拌する。この撹拌溶液に、無水DMF(10mL)中のメシレート202(1当量)の溶液を滴下して加える。反応混合物を、110℃でさらに30分間撹拌した後、減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解させ、有機層を、飽和NaHCO3(100mL)、塩水(100mL)で洗浄し、乾燥させる(無水Na2SO4)。有機層の濃縮により、粗生成物が得られ、それを、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物203a~dを単離する。
一般的な手順において、核酸塩基(2当量)を、110℃で無水DMF(100mL)に溶解させ、この撹拌溶液に、固体CsCO3(2g)およびヨウ化ナトリウム(2g)を加え、混合物を激しく撹拌する。この撹拌溶液に、無水DMF(10mL)中のメシレート202(1当量)の溶液を滴下して加える。反応混合物を、110℃でさらに30分間撹拌した後、減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解させ、有機層を、飽和NaHCO3(100mL)、塩水(100mL)で洗浄し、乾燥させる(無水Na2SO4)。有機層の濃縮により、粗生成物が得られ、それを、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物203a~dを単離する。
iv.204a~dの合成
アルコール203a~dを、トリエチルアミンの存在下で、炭酸ジスクシンイミジル(DSC)で最初に処理して、スクシンイミジルエステルを得て、それを、ピリジンの存在下で、モノフタルイミド保護されたヘキサンジアミンで処理したところ、カラム精製の後、アミン置換された生成物204a~dが得られる。
アルコール203a~dを、トリエチルアミンの存在下で、炭酸ジスクシンイミジル(DSC)で最初に処理して、スクシンイミジルエステルを得て、それを、ピリジンの存在下で、モノフタルイミド保護されたヘキサンジアミンで処理したところ、カラム精製の後、アミン置換された生成物204a~dが得られる。
v.205a~dの合成
204a~d中のアセトニド保護を、報告される条件下で、酢酸で処理することによって除去したところ、205a~dが得られ、それを次の工程にそのまま使用する。
204a~d中のアセトニド保護を、報告される条件下で、酢酸で処理することによって除去したところ、205a~dが得られ、それを次の工程にそのまま使用する。
vi.206a~dの合成
ピリジン中のDMTrClによるジオール205a~dの処理により、モノDMT保護されたアルコール206a~dが得られるであろう。
ピリジン中のDMTrClによるジオール205a~dの処理により、モノDMT保護されたアルコール206a~dが得られるであろう。
vii.207a~dの合成
フタルイミド保護されたアミン206a~dを、室温で一晩、メタノール(20倍)中のメチルアミンの溶液で処理する。反応混合物の濃縮、続いてカラム精製により、脱保護アミン207a~dが得られる。
フタルイミド保護されたアミン206a~dを、室温で一晩、メタノール(20倍)中のメチルアミンの溶液で処理する。反応混合物の濃縮、続いてカラム精製により、脱保護アミン207a~dが得られる。
viii.208a~dの合成
EDCおよびヒューニッヒ塩基を用いた、アミン207a~dによる一本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、リガンドがコンジュゲートされたモノマー208a~dが生じ得る。
EDCおよびヒューニッヒ塩基を用いた、アミン207a~dによる一本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、リガンドがコンジュゲートされたモノマー208a~dが生じ得る。
ix.209a~dの合成
同様の結合手順を用いて、アミン207a~dによる、三本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、三本鎖GalNAcがコンジュゲートされたモノマー209a~dが生じ得る。
同様の結合手順を用いて、アミン207a~dによる、三本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、三本鎖GalNAcがコンジュゲートされたモノマー209a~dが生じ得る。
x.210a~dおよび211a~dの合成
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いた、アルコール208a~dおよび209a~dのリン酸化により、対応するアミダイト210a~dおよび211a~dが、フラッシュカラム精製後に得られた。
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いた、アルコール208a~dおよび209a~dのリン酸化により、対応するアミダイト210a~dおよび211a~dが、フラッシュカラム精製後に得られた。
i.222の合成
市販の(R)-グリシドールを、文献に報告されるようにODMTr保護されたエポキシド220に転化した。30分間にわたるマイクロ波照射下での、110℃での1,6-ジメチルアミノヘキサン221(6mmol、2当量)によるエポキシド220(1.12g、3mmol)の処理により、エポキシド開環生成物222が90%の収率で得られた。
市販の(R)-グリシドールを、文献に報告されるようにODMTr保護されたエポキシド220に転化した。30分間にわたるマイクロ波照射下での、110℃での1,6-ジメチルアミノヘキサン221(6mmol、2当量)によるエポキシド220(1.12g、3mmol)の処理により、エポキシド開環生成物222が90%の収率で得られた。
ii.224の合成
カルボン酸223とのアミン222の結合により、結合された生成物224が良好な収率で得られた。
カルボン酸223とのアミン222の結合により、結合された生成物224が良好な収率で得られた。
iii.225の合成
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いたアルコール224のリン酸化により、フラッシュカラム精製の後、対応するアミダイト225が得られた。
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いたアルコール224のリン酸化により、フラッシュカラム精製の後、対応するアミダイト225が得られた。
例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6~C10アリール、C6~C10複素環式芳香族、C1~C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6~C10アリール、C6~C10複素環式芳香族、C1~C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6~C10アリール、C6~C10複素環式芳香族、C1~C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6~C10アリール、C6~C10複素環式芳香族、C1~C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
実施例8:ASGPRリガンドの中間体(スキーム4~8)の合成
ASGPRリガンドを調製するのに有用な中間体が、以下のスキーム4~8に示されるように合成され得る。
ASGPRリガンドを調製するのに有用な中間体が、以下のスキーム4~8に示されるように合成され得る。
化合物9の合成:N-アセチルグルコサミン(50g、226mmol)を、アリルアルコールに取り込み、90℃で24時間加熱する。反応混合物を室温に冷まし、アリルアルコールを蒸留によって除去する。残渣をピリジンに溶解させ、塩化ピバロイルと反応させたところ、化合物3が得られる。ピバロイルエステルを、2時間にわたってピリジン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、混合物を、水を加えることによってクエンチする。混合物を、90℃で24時間加熱したところ、生成物4が得られる。エステル基を、ナトリウムメトキシドによる処理によって除去し、化合物5を単離する。ヒドロキシル基をジメトキシプロパンによって保護したところ、生成物6が得られる。次に、それをDMF中の塩化トシルおよびアジ化ナトリウムと反応させたところ、化合物7が得られる。化合物7を、クリック付加環化(Click cylco-addition)およびMCPBAによるエポキシ化に供したところ、化合物9が生成される。
化合物13の合成:エポキシド13を、LiClO4の存在下でアンモニアと反応させたところ、アミノアルコール10が生成される。これを、ペプチド結合条件下で、N-Cbzアミノヘキサン酸と結合させたところ、化合物11が得られる。アセトニド保護の除去およびヒドロキシル基のベンゾイル化により、化合物12が生成される。MeOH中のPd/Cを用いた化合物12の水素化により、アミン13がTFA塩として生成される。
化合物17の合成:ペプチド結合条件下で、アミン13を、トリカルボン酸14と反応させたところ、化合物15が生成される。水素化により、化合物16が得られ、次に、それを、モノベンジルドデカン二酸と反応させたところ、保護された三本鎖中間体17が得られる。
ヒドロキシプロリン中間体20の合成:化合物17を、バルーン圧力下で水素化したところ、カルボン酸18が得られ、次に、それをアミン19と反応させたところ、ペプチド結合条件下で化合物20が生成される。
固体担体21の合成:ヒドロキシプロリン20を、無水コハク酸およびDMAPと反応させたところ、スクシネート誘導体が生成される。このスクシネート誘導体を、ペプチド結合条件を用いて固体担体上に充填したところ、担体21が得られる。
実施例9:三本鎖β-アノマー-コンジュゲート構成単位の合成(スキーム9~10)
カルボン酸29の合成:化合物22を、DCE中のTMSOTfの存在下で、アルコール23と反応させたところ、カルボキシレート24が生成される。アセテート基を、MeOH中のTEAによって除去したところ、化合物25が得られる。DMTrをO-6位に導入し、ヒドロキシル基をベンゾイル化したところ、化合物26が得られる。酸性条件下でのDMTr基の除去およびMs-Clとの反応により、メシル誘導体が生成される。このメシル誘導体とアジ化ナトリウムとの反応により、C-6アジド誘導体27が得られる。クリック反応およびメチルエステルの脱保護により、カルボン酸29が得られる。
固体担体32の合成:カルボン酸29を、ペプチド結合条件下で三本鎖アミンと反応させたところ、三本鎖誘導体31が生成される。これを水素化し、カルボン酸をヒドロキシプロリンと反応させる。この中間体を無水コハク酸と反応させ、スクシネートを固体担体上に充填したところ、化合物32が得られる。
実施例10:二本鎖α-アノマー-コンジュゲート構成単位の合成(スキーム11~14)
カルボン酸36の合成:ヒドロキシプロリン誘導体33を、HBTU/DIEAを用いてモノベンジルヘキサン二酸と反応させたところ、カルボキシレート35が生成され、それをさらに水素化したところ、カルボン酸36が得られる。
二本鎖固体担体41の合成:N-Bocグルタミン酸を、HBTU/DIEAを用いてアミン13と反応させたところ、化合物38が得られる。Boc保護基の脱保護およびカルボン酸36とこのアミンとの反応により、ヒドロキシプロリン誘導体39が得られる。TBDMSの除去および無水コハク酸とこのヒドロキシル基との反応により、スクシネート誘導体が生成される。これを固体担体上に充填したところ、二本鎖固体担体41が得られる。
同様に、化合物54が、以下のスキーム13および14に示されるように調製され得る。
実施例12:三本鎖α-アノマーsiRNAコンジュゲートの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位21(スキーム8を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
前述されるコンジュゲート構成単位21(スキーム8を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
実施例13:三本鎖β-アノマーsiRNAコンジュゲートの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位32(スキーム10を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
前述されるコンジュゲート構成単位32(スキーム10を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
実施例14:二本鎖α-アノマーsiRNAコンジュゲートの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位41(スキーム12を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。
前述されるコンジュゲート構成単位41(スキーム12を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。
102の合成:GalNAc酸100(8.39g、18.71mmol)およびヒドロキシプロリンアミン(10.00g、18.77mmol)を、ジクロロメタン中で合わせた。HBTU(10.68g、28.12mmol)およびDIEA(9.80mL、3当量)を加え、混合物を周囲温度で2時間撹拌した。生成物をTLCで調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物102が淡黄色のふんわりした固体(11.77g、63%)として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO)δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.69(t,J=5.6Hz、1H)、7.39-7.09(m,9H)、6.86(ddd,J=9.0、5.4、2.1Hz、4H)、5.20(d,J=3.4Hz、1H)、5.03-4.83(m,2H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.41-4.07(m,2H)、4.04-3.95(m,3H)、3.86(dt,J=11.2、8.9Hz、1H)、3.79-3.68(m,6H)、3.68-3.36(m,3H)、3.21-2.88(m,5H)、2.26-2.14(m,2H)、2.09(s,3H)、2.02(t,J=6.7Hz、2H)、1.98(s,3H)、1.87(d,J=7.5Hz、3H)、1.76(s,3H)、1.53-1.29(m,7H)。
104の合成:ヒドロキシプロリン誘導体102(6.00g、6.24mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。DIEA(2.20mL、3当量)およびクロロアミダイト試薬を加えた。反応混合物を30分間撹拌し、TLCで調べた。それを分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO)δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.68(s,1H)、7.42-7.06(m,8H)、7.01-6.73(m,4H)、5.20(d,J=3.3Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2、3.3Hz、1H)、4.63(d,J=4.7Hz、1H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.15(s,1H)、4.01(s,3H)、3.86(d,J=11.0Hz、1H)、3.70(d,J=16.5Hz、9H)、3.45(ddd,J=37.0、23.3、16.4Hz、6H)、2.99(dd,J=12.3、6.4Hz、3H)、2.74(dd,J=9.2、5.8Hz、2H)、2.21(s,2H)、2.09(s,3H)、2.05-1.95(m,5H)、1.88(s,3H)、1.76(s,3H)、1.52-1.16(m,11H)、1.16-1.02(m,11H).31P NMR δ=151.78、151.61、151.50、151.30。
105の合成:化合物102(2.10g、2.18mmol)をDCM(20mL)に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸(0.441g、4.36mmol)およびDMAP(0.532g、当量)、続いてTEA(1ML)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。そのTLCを調べ、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを無水アセトニトリルに溶解させた。HBTU(1.59g、4.20mmol)およびDIEA(1.10ml)を加え、混合物を5分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸/Py混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、MeOH/DCMおよびエーテル(27.10g、55umol/g)で再度洗浄した。
実施例16:一本鎖αアノマーsiRNAの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位104および105(スキーム16を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
前述されるコンジュゲート構成単位104および105(スキーム16を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。
化合物2の合成:Z-アミノカプロン酸(22.2g、82.50mmol)をDMF(250mL)に溶解させ、0℃に冷却した。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(44.4mL、275mmol)、HBTU(40.4g、106.7mmol)、およびHOBT(30.0g、220mmol)を加えた。0℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した後、4-ヒドロキシ-l-プロリンメチルエステル塩酸塩(20.0g、110mmol)を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、酢酸エチル(250mL)を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物2(Rf=10%のMeOH/DCM中0.5、24.30g)が得られた。不純物を除去するために、まず2%のメタノール/ジクロロメタン、続いて5%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物2を精製したところ、21.36g(65%)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):環におけるアミド結合による観察される回転異性体。δ7.35(m,5H)、5.15(d,OH、D2O交換可能)、4.99(s,2H)、4.27(m,1H)、3.97(m,1H)、3.58(s,1H)3.20-3.47(m,5H)、2.94-3.02(m,2H)、2.10-2.32(m,2H)、1.74-2.01(m,2H)、1.35-1.4(m,4H)、1.22-1.28(m,4H)。
化合物3の合成:化合物2(21.36g、54.43mmol)をTHF(200mL)に溶解させた。反応混合物を、0℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、水素化ホウ素リチウム(1.19g、54.43mmol)を、0℃で20分間にわたって溶液に加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を0℃に冷却した。過剰な水素化ホウ素リチウムを、5MのNaOH(30mL)でクエンチした。30分間撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、ジクロロメタン(200mL)を加えた。有機層を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物3(Rf=10%のMeOH/DCM中0.4、35.88g)が得られた。不純物を除去するために、3%のメタノール/ジクロロメタン、続いて5%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによってカラムクロマトグラフィーによって化合物3を精製したところ、9.21g(49%)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):環におけるアミド結合による観察される回転異性体。δ7.35(m,5H)、4.99(s,H)、4.91(d,OH、D2O交換可能)、4.77(t,OH、D2O交換可能)、4.27(m,1H)、3.97(m,1H)、3.20-3.47(m,5H)、2.94-3.02(m,2H)、2.10-2.32(m,2H)、1.74-2.01(m,2H)、1.35-1.4(m,4H)、1.22-1.28(m,4H).13C NMR(100mMHz、DMSO-d6):δ171.4、171.1(回転異性体のために小さい)、156.1、137.3、128.9、128.3、128.2、127.7、125.3、68.2、67.4、65.1、63.4、62.0、57.6、55.1、54.9、53.3、40.1、39.9、39.7、39.5、39.3、39.1、38.9、37.4、36.1、34.2、32.6、29.3、26.1、26.0、24.6、24.1、21.0。
化合物4の合成:化合物3(9.21g、25.27mmol)を、無水ピリジン(80mL)と2回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。化合物3を高真空から取り出し、無水ピリジン(200mL)に溶解させた。この溶液に、触媒量のジメチルアミノピリジン(0.35g、2.53mmol)を加えた。反応混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、DMT-Cl(9.0g、26.53mmol)を0℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。過剰なDMT-Clを、メタノール(15mL)の添加によってクエンチした。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン(200mL)を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物4(Rf=100%のEtOAc中0.6、14.02g)が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中50%の酢酸エチル(1%のTEA)、続いて100%の酢酸エチル(1%のTEA)で溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物4を精製したところ、12.36g(73.4%)が白色の発泡体状の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.17-7.33(m,14H)、4.99(s,2H)、4.91(d,OH、D2O交換可能)、4.37(m,1H)、4.01(m,1H)、3.72(s,6H)3.56(m,1H)3.29(m,1H)、3.14(m,1H)、2.93-3.02(m,4H)、2.18(m,2H)1.74-2.01(m,2H)、1.37-1.41(m,6H)。
化合物5の合成:化合物4(12.36g、18.54mmol)を、10%のメタノール/酢酸エチル(300mL)に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Degussaタイプ(1.3g)に担持された10重量%のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で2回パージし、次に、水素を、10秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで2回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物5(Rf=.05 10%のMeOH/DCM、9.16g、93%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.15-7.31(m,9H)、6.86(m,4H)4.99(s,1H)、4.37(m,1H)、4.01(m,2H)、3.72(s,6H)3.56(m,1H)3.29(m,1H)、3.14(m,1H)、2.93-3.02(m,2H)、2.45(m,2H)、2.18(m,2H)1.74-2.01(m,2H)、1.37-1.41(m,3H)1.13-1.38(m,4H)。
化合物6の合成:化合物5(9.16g、17.2mmol)をジクロロメタン(200mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(4.80mL、34.4mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(3.05mL、25.8mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物6(Rf=0.6 10%のMeOH/DCM、10.89g)が得られた。5%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物6(8.76g、81%)が黄色の発泡体状の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.56-7.09(m,9H)、7.01-6.52(m,4H)、5.34-5.04(m,1H)、4.99-4.78(m,1H)、4.48-4.25(m,2H)、3.83-3.67(m,6H)、3.60-3.50(m,1H)、3.49-3.18(m,2H)、3.16-2.91(m,2H)、2.89-2.56(m,2H)、2.54-2.32(m,2H)、2.32-1.69(m,3H)、1.59-1.03(m,4H).19F NMR(400MHz、DMSO-d6):-77.14(s,3F)。
化合物7の合成:化合物6(8.76g、13.93mmol)、ジメチルアミノピリジン(5.10g、41.79mmol)、およびトリエチルアミン(3.90mL、27.86mmol)をジクロロメタン(300mL)に溶解させた。反応混合物を、10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(2.80g、27.86mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、わずかに飽和した塩化ナトリウムの溶液で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物7(Rf=0.9 10%のMeOH/DCM、10.87g、94%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物8の合成:化合物7(2.00g、2.41mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.68mL、9.64mmol)およびHBTU(1.83g、4.82mmol)を加えた。反応混合物を10分間にわたって振とうした。CPG(27g)をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。CPG化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタンで洗浄し、続いて、10%のメタノール/ジクロロメタンで2回洗浄し、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(5.0mg)を脱ブロック(de-blocking)へと送った。残りのCPG化合物に、25%の無水酢酸/ピリジン(100mL)を加え、混合物を一晩振とうした。CPG化合物および反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(7.1mg)を脱ブロックへと送った。分光光度計:キャッピング前.9892Abs(502.0nm)65マイクロモル/g、キャッピング後1.4403(502.0nm)67マイクロモル/g。
化合物9の合成:化合物6(8.89g、14.14mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(4.93mL、28.28mmol)を無水ジクロロメタン(60mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、N,N-ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホロアミド酸塩化物(5.63mL、16.26mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で30分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応の完了がTLCによって観察された。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物9(Rf=0.44 5%のMeOH/DCM、11.02g)が得られた。3%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物9(6.31g、54%)が黄色の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ9.37(s,1H)、7.63(d 1H)、7.42-6.98(m,8H)、6.92-6.77(m,4H)、4.25-3.90(m,2H)、3.78-3.64(m,7H)、3.48(d,3H)、3.29(d,1H)、3.23-2.92(m,4H)、2.86(d,1H)、2.73(t,1H)、2.58(t,1H)、2.53-2.47(m,4H)、2.33-1.87(m,4H)、1.55-0.97(m,12H)。31P(400MHz、DMSO-d6):151.68(d,1P)。
4-Z-アミノブタノール13:4-アミノブタン-1-オール(26mL、280mmol)およびCbz-Oスクシネート(104.7g、420mmol)をジクロロメタン(200mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、10℃で、アルゴン下で反応混合物を撹拌し続けながら、トリエチルアミン(78mL、560mmol)を溶液に加えた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物2(Rf=0.5 10%のMeOH/DCM、71.97g)が白色の固体として得られた。これをさらに精製せずに次の工程に使用した。
DSCで活性化された4-Z-アミノブタノール14:粗化合物13(6.0g)およびDSC(10.33g 40.31mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。反応混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。トリエチルアミン(7.88mL、53.74mmol)を滴下して加え、混合物を、0℃で5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を、水、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物14(Rf=0.85 10%のMeOH/DCM、11.14g)が淡褐色の固体として得られた。これをさらに精製せずに次の工程に使用した。
化合物17:化合物16(5.00g、7.48mmol)を、10%のメタノール/酢酸エチル(100mL)に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Degussaタイプ(0.5g)に担持された10重量%のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で2回パージし、次に、水素を、10秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、Celiteが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで2回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物17(Rf=.03 5%のMeOH/DCM、3.4g、87%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.41-7.14(m,9H)、6.99-6.72(m,4H)、4.96(d,1H)、4.30(s,1H)、4.04-3.58(m,6H)、3.46-3.25(m,1H)、3.21-2.81(m,3H)、2.52-2.46(m,2H)、1.97(d,3H)、1.63-1.42(m,4H)。
化合物18:化合物17(3.2g、5.98mmol)をジクロロメタン(80mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(1.67mL、11.96mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(1.06mL、8.97mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物18(Rf=0.45 5%のMeOH/DCM、3.33g、88%)が黄色の発泡体状の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.46-7.03(m,9H)、6.86(d,4H)、4.93(s,1H)、4.29(s,1H)、4.11-3.63(m,2H)、3.53-2.79(m,5H)、2.53(d,2H)、2.30(d,2H)、1.99(d,3H)、1.76(s,1H)、1.36(t,4H).19F NMR(400MHz、DMSO-d6):-77.11(s,3F)。
化合物19:化合物18(2.0g、3.17mmol)、ジメチルアミノピリジン(1.16g、3.48mmol)、およびトリエチルアミン(0.88mL、6.34mmol)をジクロロメタン(50mL)に溶解させた。反応混合物を、10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(0.63g、6.34mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、わずかに飽和した塩化ナトリウムの溶液で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物19(Rf=0.9 10%のMeOH/DCM、3.23g)が得られた。5%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物12(2.58g、98%)が白色の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ9.43(d,1H)、7.45-7.04(m,9H)、7.02-6.71(m,4H)、5.51-4.91(m,2H)、4.16-2.95(m,9H)、2.67(q,4H)、2.58-2.36(m,6H)、2.31-2.02(m,2H)、1.33(d,4H)。
化合物20:化合物19(2.03g、2.40mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.67mL、9.64mmol)およびHBTU(1.82g、4.82mmol)を加えた。反応混合物を10分間にわたって振とうした。CPG(27g)をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。CPG化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタンで洗浄し、続いて、10%のメタノール/ジクロロメタンで2回洗浄し、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(6.7mg)を脱ブロックへと送った。残りのCPG化合物に、25%の無水酢酸/ピリジン(150mL)を加え、混合物を一晩振とうした。CPG化合物および反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(6.9mg)を脱ブロックへと送った。分光光度計:キャッピング前1.8396Abs(502.0nm)90.3マイクロモル/g、キャッピング後1.8798Abs(502.0nm)89.6マイクロモル/g。
化合物21:化合物18(4.26g、6.75mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(2.35mL、13.5mmol)を、無水ジクロロメタン(40mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、N,N-ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホロアミド酸塩化物(1.73mL、7.76mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で30分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応の完了がTLCによって観察された。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物14(Rf=0.44 5%のMeOH/DCM、11.02g)が得られた。3%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物14(6.31g、54%)が黄色の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.41-6.99(m,8H)、6.85(d,4H)、4.10-3.62(m,2H)、3.59-3.24(m,7H)、3.13(d,3H)、2.75-2.68(m,1H)、2.59-2.45(m,4H)、2.10(d,1H)、1.37(t,1H)、1.25-1.00(m,10H)。
実施例19:ピリミジン、プリン、および脱塩基部位におけるGalNAcコンジュゲーション(スキーム19~33)
パラジウムの結合の化学的作用を用いて、GalNAcリガンドおよびカチオン性分子が、2’位に様々な置換基を有するピリミジンヌクレオシドのC-5位に導入され得る。以下のスキーム(スキーム19~スキーム27)に示されるように、ヌクレオシド構成単位がそれに応じて合成され得る。スキーム28および29において、GalNAcリガンドを含有する設計されたプリンヌクレオシド類似体が示される。スキーム30において、GalNAcリガンドが、C-1’位に導入される。クリックの化学的作用を用いて、スキーム31および32に示されるように、GalNAcが、脱塩基部位に導入され得る。スキーム33は、プリン環上のC-2位にGalNAcリガンドを導入するための交換可能なヌクレオシド手法を示す。
パラジウムの結合の化学的作用を用いて、GalNAcリガンドおよびカチオン性分子が、2’位に様々な置換基を有するピリミジンヌクレオシドのC-5位に導入され得る。以下のスキーム(スキーム19~スキーム27)に示されるように、ヌクレオシド構成単位がそれに応じて合成され得る。スキーム28および29において、GalNAcリガンドを含有する設計されたプリンヌクレオシド類似体が示される。スキーム30において、GalNAcリガンドが、C-1’位に導入される。クリックの化学的作用を用いて、スキーム31および32に示されるように、GalNAcが、脱塩基部位に導入され得る。スキーム33は、プリン環上のC-2位にGalNAcリガンドを導入するための交換可能なヌクレオシド手法を示す。
i.化合物103(R=F)の合成
ピリジン(70mL)中の102(R=F;11.2g、30.1mmol;Antiviral Chemistry&Chemotherapy,2010,21,15-31)の溶液に、DMTrCl(11.2g、32.1mmol)を加えた。反応混合物を室温で14時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中5%のMeOH、Rf=0.23)によって精製したところ、化合物103(17.8g、26.4mmol、88%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.81(s,1H)、8.07(s,1H)、7.46-7.14(m,10H)、6.88(dd,J=8.9、1.8Hz、4H)、5.83(d,J=20.5Hz、1H)、5.60(d,J=7.0Hz、1H)、5.16(dd,J=53.4、4.8Hz、1H)、4.43-4.20(m,1H)、4.08-3.90(m,1H)、3.74(s,7H)、3.23(d,J=2.7Hz、2H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ160.68、158.09、158.07、149.89、145.13、144.72、136.12、135.46、135.37、129.71、127.93、127.67、126.70、123.90、85.61、81.30、69.75、62.47、55.06、55.03。
ピリジン(70mL)中の102(R=F;11.2g、30.1mmol;Antiviral Chemistry&Chemotherapy,2010,21,15-31)の溶液に、DMTrCl(11.2g、32.1mmol)を加えた。反応混合物を室温で14時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中5%のMeOH、Rf=0.23)によって精製したところ、化合物103(17.8g、26.4mmol、88%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.81(s,1H)、8.07(s,1H)、7.46-7.14(m,10H)、6.88(dd,J=8.9、1.8Hz、4H)、5.83(d,J=20.5Hz、1H)、5.60(d,J=7.0Hz、1H)、5.16(dd,J=53.4、4.8Hz、1H)、4.43-4.20(m,1H)、4.08-3.90(m,1H)、3.74(s,7H)、3.23(d,J=2.7Hz、2H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ160.68、158.09、158.07、149.89、145.13、144.72、136.12、135.46、135.37、129.71、127.93、127.67、126.70、123.90、85.61、81.30、69.75、62.47、55.06、55.03。
ii.化合物104(R=F)の合成
CH3CN(75mL)中の化合物103(R=F;6.40g、9.49mmol)の溶液に、PdCl2(PhCN)2(73mg、0.190mmol)、Et3N(2.65mL、19.0mmol)およびCF3CH2OH(6.91mL、94.9mmol)を加えた。混合物を、COガス雰囲気下で、60℃で撹拌した。蒸発後、残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させた。ろ液を濃縮し、得られた粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%のMeOH)によって精製したところ、104(4.30g、6.37mmol、67%、Rf=CH2Cl2中5%のMeOHによって展開される0.32)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.78(s,1H)、8.52(s,1H)、7.41(d,J=7.4Hz、2H)、7.34-7.16(m,8H)、6.93-6.80(m,4H)、5.90(d,J=20.1Hz、1H)、5.63(d,J=7.1Hz、1H)、5.26(d,J=4.4Hz、1H)、5.12(d,J=4.5Hz、1H)、4.50-4.17(m,3H)、4.07(dd,J=7.3、5.0Hz、1H)、3.73(d,J=1.2Hz、7H)、3.31-3.17(m,2H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ160.70、158.96、158.08、158.06、149.18、148.89、144.76、135.47、135.33、129.70、129.66、127.80、127.61、126.66、124.62、121.86、102.57、94.10、92.27、90.68、90.32、85.56、81.36、68.11、67.95、62.36、59.26、58.91、54.98.19F NMR(376MHz、DMSO-d6):δ-74.94、-74.96、-74.99、-201.81、-201.86、-201.87、-201.93、-201.95、-202.01、-202.07.C33H30F4N2NaO9についての分子量(M+Na)+計算値697.1785、実測値697.2。
CH3CN(75mL)中の化合物103(R=F;6.40g、9.49mmol)の溶液に、PdCl2(PhCN)2(73mg、0.190mmol)、Et3N(2.65mL、19.0mmol)およびCF3CH2OH(6.91mL、94.9mmol)を加えた。混合物を、COガス雰囲気下で、60℃で撹拌した。蒸発後、残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させた。ろ液を濃縮し、得られた粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%のMeOH)によって精製したところ、104(4.30g、6.37mmol、67%、Rf=CH2Cl2中5%のMeOHによって展開される0.32)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.78(s,1H)、8.52(s,1H)、7.41(d,J=7.4Hz、2H)、7.34-7.16(m,8H)、6.93-6.80(m,4H)、5.90(d,J=20.1Hz、1H)、5.63(d,J=7.1Hz、1H)、5.26(d,J=4.4Hz、1H)、5.12(d,J=4.5Hz、1H)、4.50-4.17(m,3H)、4.07(dd,J=7.3、5.0Hz、1H)、3.73(d,J=1.2Hz、7H)、3.31-3.17(m,2H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ160.70、158.96、158.08、158.06、149.18、148.89、144.76、135.47、135.33、129.70、129.66、127.80、127.61、126.66、124.62、121.86、102.57、94.10、92.27、90.68、90.32、85.56、81.36、68.11、67.95、62.36、59.26、58.91、54.98.19F NMR(376MHz、DMSO-d6):δ-74.94、-74.96、-74.99、-201.81、-201.86、-201.87、-201.93、-201.95、-202.01、-202.07.C33H30F4N2NaO9についての分子量(M+Na)+計算値697.1785、実測値697.2。
iii.化合物105(R=F)の合成
化合物104(R=F;4.15g、6.15mmol)を、室温で一晩、3-(ジメチルアミノ)-1-プロピルアミン(25mL)で処理した。反応混合物を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水Na2SO4上で乾燥させたところ、粗材料105が得られた。C36H42FN4O8についての分子量(M+H)+計算値677.2987、実測値677.1。
化合物104(R=F;4.15g、6.15mmol)を、室温で一晩、3-(ジメチルアミノ)-1-プロピルアミン(25mL)で処理した。反応混合物を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水Na2SO4上で乾燥させたところ、粗材料105が得られた。C36H42FN4O8についての分子量(M+H)+計算値677.2987、実測値677.1。
実施例20.リボース環におけるGalNAcコンジュゲーション(スキーム34~44)
GalNAcおよびその誘導体を、ヌクレオシド中のリボース環にコンジュゲートするための合成手法が以下に示される。スズ-修飾ヌクレオシドが、臭化アルキルと結合されて、2’-および3’-結合生成物が生成され得る。得られた第一級アミンまたは活性化エステルならびに末端アルケンのそれぞれが、適切な反応条件を用いて、GalNAcリガンドと結合され得る。これらの構成単位は、標準的なホスホロアミダイトの化学的作用を用いて、オリゴヌクレオチド中に組み込まれる。GalNAcリガンドはまた、合成後手法によって、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得る。
GalNAcおよびその誘導体を、ヌクレオシド中のリボース環にコンジュゲートするための合成手法が以下に示される。スズ-修飾ヌクレオシドが、臭化アルキルと結合されて、2’-および3’-結合生成物が生成され得る。得られた第一級アミンまたは活性化エステルならびに末端アルケンのそれぞれが、適切な反応条件を用いて、GalNAcリガンドと結合され得る。これらの構成単位は、標準的なホスホロアミダイトの化学的作用を用いて、オリゴヌクレオチド中に組み込まれる。GalNAcリガンドはまた、合成後手法によって、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得る。
2’-および3’-O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジン(2a、2b)。DMF(105mL)中の、報告されるように得られた2’,3’-O-ジブチルスタンニレン-5-メチルウリジン(28g、57.24mmol)(J.Org.Chem.,1974,24-30)、6-ブロモヘキシルフタルイミド(35.5g、114.48mmol)およびNaI(1.72g、11.45mmol)の溶液を、3.5時間にわたってマイクロ波中で、100℃で加熱した。DMFを除去した後、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Rf=CH2Cl2中5%のMeOH中の0.26)によって精製したところ、O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジンの2’-および3’-異性体が、分離できない混合物(10.1g、20.7mmol、36%)として得られた。MS m/z 488.0(M+H)+、510.2(M+Na)+、486.2(M-H)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.29(s,1H)、7.88-7.79(m,4H)、7.78-7.70(m,1H)、5.81(d,J=5.3Hz、1H)、5.72(d,J=5.6Hz、1H)、5.25(d,J=6.2Hz、1H)、5.12(t,J=5.0Hz、1H)、5.00(d,J=5.9Hz、1H)、4.14(dd,J=11.3、5.6Hz、1H)、4.07(dd,J=10.1、5.0Hz、1H)、3.89-3.79(m,2H)、3.76-3.72(m,1H)、3.63(ddd,J=11.1、8.8、5.4Hz、1H)、3.59-3.47(m,4H)、3.41(dt,J=11.6、6.6Hz、1H)、3.28(s,1H)、1.75(d,J=3.7Hz、3H)、1.64-1.41(m,5H)、1.27(d,J=14.2Hz、5H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ167.99、167.97、163.78、163.73、150.79、150.57、136.22、136.07、134.40、131.60、131.56、123.02、109.38、109.26、87.73、85.89、85.07、82.71、80.82、77.49、72.43、69.69、69.51、68.38、60.86、60.61、54.92、37.39、37.35、29.23、28.96、27.93、27.76、26.15、26.07、25.76、25.39、25.16、24.96、21.27、12.26。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジン(3a)。2aおよび2bの混合物(10.11g、20.73mmol)を、ピリジン(50mL)と同時蒸発させ、次に、ピリジン(80mL)に溶解させ、氷浴中で0℃に冷却した。この混合物に、ジメトキシトリチルクロリド(7.73g、22.80mmol)を加え、反応物を、0℃で2時間、次に、室温で1時間撹拌した。さらなる0.4当量のジメトキシトリチルクロリドを加え、反応物を一晩撹拌した。反応をMeOH(5mL)でクエンチし、次に、減圧下で蒸発させた。反応混合物をDCMで希釈し、塩水で2回洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、次に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、4.48gの3a(27.4%、5.67mmol;Rf=ヘキサン中60%のEtOAc中の0.35)が得られた。MS m/z 812.3(M+Na)+、788.3(M-H)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.35(s,1H)、7.87-7.77(m,4H)、7.48(d,J=0.8Hz、1H)、7.38(d,J=7.4Hz、2H)、7.30(t,J=7.6Hz、2H)、7.23(dd,J=12.1、8.1Hz、5H)、6.89(d,J=8.0Hz、4H)、5.11(d,J=6.3Hz、1H)、4.18(dd,J=11.1、5.4Hz、1H)、3.99(ddd,J=12.0、11.2、5.9Hz、3H)、3.72(s,6H)、3.62-3.46(m,4H)、3.21(ddd,J=12.9、10.7、3.3Hz、2H)、1.98(d,J=1.8Hz、1H)、1.60-1.44(m,5H)、1.38(s,3H)、1.35-1.19(m,5H)、1.16(t,J=7.1Hz、1H)、0.87(dd,J=10.1、4.7Hz、1H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ170.33、167.92、163.61、158.19、158.16、150.41、144.67、135.45、135.32、135.11、134.33、131.58、129.74、127.93、127.65、126.84、122.97、113.27、109.60、86.46、85.91、83.09、80.53、69.63、68.76、63.48、63.19、59.75、55.06、37.31、30.16、28.89、27.92、26.07、24.95、20.76、20.72、18.60、14.08、13.55、11.66。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジン(3b)。3’-異性体(3b)を、カラムクロマトグラフィー(3.36g、20.5%、4.26mmol;Rf=ヘキサン中60%のEtOAc中の0.18)によって単離した。MS m/z 812.0(M+Na)+、788.3(M-H)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.34(s,1H)、7.88-7.76(m,4H)、7.50(s,1H)、7.36(d,J=7.5Hz、2H)、7.33-7.15(m,7H)、6.87(d,J=7.8Hz、4H)、5.75-5.69(m,1H)、5.37(d,J=6.0Hz、1H)、4.27(dd,J=10.5、5.1Hz、1H)、4.05-3.94(m,2H)、3.91(t,J=5.2Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.56(ddd,J=22.7、11.8、6.7Hz、3H)、3.21(ddd,J=24.1、10.8、3.3Hz、2H)、1.98(t,J=4.5Hz、1H)、1.60-1.37(m,7H)、1.34-1.13(m,5H)、0.94-0.83(m,1H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ170.41、167.93、163.69、158.17、158.16、150.57、144.63、135.73、135.30、135.17、134.35、131.58、129.71、127.91、127.63、126.82、122.97、113.24、109.37、88.69、85.91、80.60、77.27、72.18、69.67、63.49、62.95、59.76、55.03、54.90、37.33、30.17、29.09、27.88、26.08、25.08、20.76、20.72、18.87、18.61、14.09、13.55、11.74。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-5-メチルウリジン(4a)。3a(15.0g、18.99mmol)を190mLのMeOHに溶解させた。ヒドラジン(3.04g、94.52mmol)を不均一混合物に加え、3.5時間にわたって加熱還流させた(66℃)。混合物を室温に冷まし、減圧下で蒸発させたところ、白色の粉末が得られた。生成物をDCMに溶解させ、水酸化アンモニウムおよび飽和NaCl溶液で2回洗浄した。DCM層をMgSO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、11.8gが得られた。粗材料を次の工程に使用した。(Rf=DCM中5%のMeOH中の0.02)。MS m/z 660.2(M+H)+、682.1(M+Na)+、658.1(M-H)-.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.5Hz、2H)、7.30(t,J=7.5Hz、2H)、7.24(d,J=8.9Hz、5H)、6.89(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(s,1H)、4.19(t,J=5.0Hz、1H)、3.97(t,J=4.9Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.27-3.15(m,3H)、1.48(d,J=6.4Hz、2H)、1.38(s,3H)、1.34-1.18(m,6H)。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-5-メチルウリジン(5a)。粗材料4a(6.00g)を、DCM(250mL)およびトリエチルアミン(3.8mL、27.30mmol)に溶解させ、10分間撹拌した。GalNAc-C5-NHSエステル(7.31g、10.0mmol)を加え、反応混合物を2時間撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、塩水で洗浄し、次に、有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗材料を、カラムクロマトグラフィー(Rf=DCM中5%のMeOH中の0.36)によって精製したところ、5a(9.56g、7.49mmol、83%)が得られた。MS m/z 1298.3(M+Na)+.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.36(s,1H)、7.99-7.86(m,5H)、7.73-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、3H)、7.41-7.34(m,4H)、7.30(t,J=7.6Hz、2H)、7.23(dd,J=11.1、8.1Hz、4H)、6.88(d,J=8.1Hz、4H)、5.83(d,J=4.8Hz、1H)、5.74(d,J=3.9Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.11(d,J=6.3Hz、1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.50-4.39(m,2H)、4.38-4.14(m,4H)、3.95(t,J=4.8Hz、2H)、3.82-3.68(m,7H)、3.63-3.43(m,4H)、3.28-3.15(m,3H)、2.98(dd,J=12.9、6.5Hz、2H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.40-1.15(m,9H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ171.73、169.40、165.20、165.16、164.86、163.62、158.18、158.15、150.41、144.64、135.31、135.10、133.50、129.73、129.16、129.00、128.70、128.59、127.91、127.64、126.82、113.26、109.59、100.89、85.91、83.09、80.60、71.86、69.97、69.74、68.77、67.92、63.19、62.03、55.04、49.74、35.03、29.17、29.04、28.59、26.25、25.12、22.69、21.85、11.66。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-3’-O-スクシネート-5-メチルウリジン(6a)。5a(2.00g、1.57mmol)をDCM(50mL)に溶解させた。DMAP(574mg、4.70mmol)および無水コハク酸(313mg、3.14mmol)を加え、反応混合物を、室温で17時間撹拌した。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(φ=4.2cm×15cm)によって精製し、DCM中2%のTEAで処理した。生成物を、DCM中の0~5%のMeOHおよび2~5%のTEAで溶離し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、2.11g(91%、1.43mmol)の6aがTEA塩(Rf=DCM中5%のMeOH/5%のTEA中の0.41)として得られた。MS m/z 1397.4(M+Na)+、1373.4(M-H)-.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.44(s,1H)、8.11(d,J=9.0Hz、1H)、7.90(dd,J=10.2、4.1Hz、4H)、7.75(s,1H)、7.72-7.52(m,7H)、7.51-7.44(m,3H)、7.34(ddd,J=24.0、13.7、7.9Hz、6H)、7.22(d,J=8.7Hz、5H)、6.89(d,J=7.9Hz、4H)、5.83(d,J=6.1Hz、1H)、5.73(d,J=3.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.26-5.22(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.47-4.40(m,2H)、4.37-4.22(m,3H)、4.12(d,J=3.5Hz、1H)、3.83-3.69(m,6H)、3.53-3.19(m,15H)、2.97(d,J=7.8Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.68(s,2H)、1.56-1.11(m,15H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ173.40、171.76、171.63、169.39、165.20、165.15、164.86、163.50、158.22、150.50、144.48、135.12、134.95、133.48、129.70、129.16、129.03、128.70、128.58、127.95、127.61、113.30、110.16、100.91、86.13、69.97、67.91、62.04、55.04、49.73、45.48、40.12、39.92、39.71、39.50、39.29、39.08、38.87、38.33、34.98、29.13、28.93、26.19、25.08、22.68、21.82、11.69、10.48。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-3’-O-CPG-5-メチルウリジン(7a)。アセトニトリル(100mL)中の6a(2.01g、1.36mmol)の溶液に、HBTU(1.03g、2.72mmol)、DIEA(528mg、4.08mmol)およびCPG(16.0g、130μmol/g、540Å)を加え、混合物を24時間にわたって振とうした。CPGをろ過して取り除き、DCM、DCM中20%のMeOH、次にエーテルで洗浄した。次に、CPGを、1時間にわたってピリジン(75mL)およびTEA(1mL)中の無水酢酸(25mL)で処理した。CPGをろ過して取り除き、上記と同じ溶媒で洗浄した。充填量(loading)を、分光光度計を用いて2回測定し、平均充填量を計算した(73.1μmol/g)。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-3’-O-(N,N-ジイソプロピル)-β-シアノエチルホスホロアミダイト-5-メチルウリジン(8a)。5a(2.90g、2.27mmol)を、無水アセトニトリルと2回同時蒸発させ、次に、完全なアルゴン雰囲気下に置いた。5aを無水DCM(35mL)に溶解させ、0℃に冷却した。2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.37g、4.55mmol)を、撹拌している混合物に加えた後、DCI(268mg、2.27mmol)を加えた。混合物を、0℃で20分間、次に室温で17時間撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、次に、塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(φ=4.2cm×19cm;Rf=EtOAc中0.39)によって精製したところ、3.20gの8a(95%、2.17mmol)が得られた。MS m/z 1498.3(M+Na)+.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.39(s,1H)、8.06-7.84(m,5H)、7.78-7.16(m,21H)、6.93-6.82(m,4H)、5.82(d,J=4.3Hz、1H)、5.74(s,1H)、5.35(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.50-4.20(m,5H)、4.10(dd,J=12.8、7.7Hz、2H)、3.74(t,J=11.5Hz、7H)、3.66-3.44(m,6H)、3.29-3.18(m,2H)、2.98(d,J=5.3Hz、2H)、2.76(t,J=5.8Hz、1H)、2.57(dd,J=10.0、5.3Hz、1H)、2.49(d,J=1.5Hz、5H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.59-1.03(m,29H)、0.99-0.81(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.60、169.26、165.07、165.03、164.73、163.48、158.10、158.07、150.24、150.22、144.39、144.34、135.32、135.08、134.99、134.97、134.87、134.80、133.64、133.37、133.34、129.65、129.07、129.03、128.90、128.88、128.87、128.83、128.56、128.45、127.75、127.56、127.50、126.74、118.72、118.57、113.08、109.63、109.54、100.76、87.02、86.62、85.92、85.90、82.13、79.89、71.72、69.84、68.61、67.78、62.57、62.23、61.89、58.43、57.81、57.65、54.91、49.60、46.05、45.53、42.42、34.88、29.02、28.97、28.45、26.17、25.04、24.19、24.13、24.03、22.55、21.71、11.50.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ154.01、153.65。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-5-メチルウリジン(4b)。3b(3.64g、4.61mmol)をMeOHに溶解させた。ヒドラジン(738mg、23.04mmol)を加え、反応混合物を5.5時間にわたって還流させた。4aについて記載されるのと同じ手順にしたがったところ、2.93gの粗製の4bが得られた。(Rf=DCM中5%のMeOH中の0.02)。MS m/z 660.2(M+H)+、682.1(M+Na)+、658.1(M-H)-。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.50(s,1H)、7.43-7.16(m,9H)、6.88(d,J=8.7Hz、4H)、5.73(d,J=4.6Hz、1H)、4.29(t,J=4.8Hz、1H)、4.02-3.89(m,3H)、3.46-3.15(m,5H)、2.24-2.16(m,1H)、2.05(s,1H)、1.58-1.10(m,13H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ163.73、158.04、158.02、150.58、144.49、135.54、135.18、135.06、129.56、127.78、127.50、126.69、113.11、109.23、88.49、85.78、80.47、77.20、72.02、69.62、62.84、54.91、41.44、33.12、29.17、26.24、26.11、25.31、11.62。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-5-メチルウリジン(5b)。DCM(45mL)およびTEA(1.8mL)中の4b(2.85g、4.32mmol)の溶液に、GalNAc-NHSエステル(3.47g、4.75mmol)を加えた。さらなる0.2当量のGalNAc-NHSエステルを加える前に、反応物を2時間撹拌し、次に、さらに1時間撹拌した。5aについて記載されるのと同じ手順にしたがったところ、3.62gの5b(2.84mmol、66%)が得られた。(Rf=DCM中5%のMeOH中の0.24)。MS m/z 1297.4(M+Na)+.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.35(s,1H)、8.02-7.87(m,5H)、7.74-7.44(m,11H)、7.41-7.34(m,4H)、7.33-7.19(m,7H)、6.88(d,J=8.8Hz、4H)、5.74(dd,J=5.9、4.1Hz、2H)、5.41-5.33(m,2H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(t,J=7.9Hz、2H)、4.31(ddd,J=16.9、12.6、7.9Hz、3H)、4.03-3.95(m,1H)、3.91(t,J=5.1Hz、1H)、3.83-3.75(m,1H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,2H)、3.22(dd,J=7.8、2.9Hz、2H)、2.99(d,J=6.2Hz、2H)、2.87(s,1H)、2.72(s,1H)、2.04(t,J=6.4Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.14(m,14H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6):δ171.74、169.40、165.20、165.16、164.86、163.65、162.27、158.16、150.57、144.58、135.70、135.32、135.17、133.74、133.45、129.68、129.15、129.01、128.94、128.67、128.57、127.89、127.63、126.81、113.23、109.37、100.89、88.58、85.91、80.64、77.36、72.17、71.84、69.98、69.73、68.74、67.92、62.98、62.03、55.02、54.85、49.75、40.33、40.05、39.77、39.49、39.21、38.94、38.66、38.34、35.74、35.02、30.74、29.23、29.12、28.58、26.26、25.21、22.66、21.84、11.68。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-2’-O-スクシネート-5-メチルウリジン(6b)。DCM(20mL)中の5b(1.10g、0.86mmol)の溶液に、DMAP(315mg、2.58mmol)および無水コハク酸(172mg、1.73mmol)を加えた。反応混合物を、23時間撹拌し、次に、6aと同様の方法で精製し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、1.03gの6b(81%、0.70mmol)が得られた。(Rf=DCM中5%のMeOH中の0.18)。MS m/z 1397.4(M+Na)+、1373.4(M-H)-.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.69(dd,J=11.3、7.5Hz、3H)、7.65-7.51(m,5H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.33(m,4H)、7.32-7.16(m,7H)、6.87(d,J=8.7Hz、4H)、5.85(d,J=3.9Hz、1H)、5.74(d,J=3.2Hz、1H)、5.48-5.41(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.29(s,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.39(m,2H)、4.38-4.19(m,4H)、3.28(ddd,J=37.9、12.7、5.4Hz、11H)、3.08-2.90(m,3H)、2.69(q,J=7.2Hz、5H)、2.60-2.52(m,2H)、2.05(d,J=3.5Hz、2H)、1.76(s,1H)、1.69(s,3H)、1.56-0.94(m,28H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6):δ173.63、173.44、172.79、171.92、171.52、169.54、165.29、165.24、164.94、163.78、158.23、150.33、144.57、136.18、135.27、135.18、133.84、133.58、129.77、129.24、129.05、128.76、128.65、127.96、127.70、126.90、113.29、109.73、100.98、85.97、80.75、73.31、71.96、70.48、62.40、55.10、52.06、51.36、45.45、35.04、33.35、29.20、29.09、28.95、28.77、22.70、21.89、11.81、10.05、7.26、7.17。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-2’-O-CPG-5-メチルウリジン(7b)。アセトニトリル(50mL)中の6b(970mg、0.66mmol)の溶液に、HBTU(497mg、1.31mmol)、DIEA(339mg、1.97mmol)およびCPG(8.20g、130μmol/g、540Å)を加え、混合物を21時間にわたって振とうした。CPGをろ過し、洗浄し、キャッピングし、7aと同じように測定したところ、56.1μmol/gの平均充填量でCPG 7bが得られた。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-2’-O-(シアノエチルN,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト-5-メチルウリジン(8b)。5b(1.98g、1.55mmol)を、8aについて記載されるのと同じように処理し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、1.89g(83%、1.28mmol)の8bが得られた。(Rf=100%のEtOAc中の0.43)。MS m/z 1497.4(M+Na)+、1474.3(M-H)-.1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.38(s,1H)、8.00-7.87(m,5H)、7.75-7.18(m,22H)、6.88(dd,J=8.9、2.7Hz、4H)、5.88(dd,J=9.2、5.1Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.61-4.50(m,1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.01(ddd,J=19.3、11.6、4.8Hz、3H)、3.85-3.47(m,14H)、2.98(s,2H)、2.71(ddd,J=11.6、8.9、3.9Hz、2H)、2.10-1.95(m,4H)、1.69(s,3H)、1.57-0.99(m,31H)、0.94-0.83(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6):δ171.72、169.37、165.18、165.14、164.85、163.58、163.50、158.18、158.16、150.48、150.43、144.52、135.15、134.98、133.74、133.48、133.44、129.66、129.14、129.01、128.99、128.98、128.93、128.67、128.56、127.91、127.88、127.57、126.84、118.81、118.71、113.25、113.21、109.72、109.68、100.86、86.17、86.02、71.82、69.95、69.86、68.72、67.88、63.45、62.00、55.00、49.72、39.80、39.63、39.46、39.30、39.13、38.96、38.33、35.00、30.12、30.03、29.26、29.14、29.11、28.56、26.29、25.27、25.25、24.28、24.22、24.08、24.02、22.65、21.84、20.67、19.80、19.75、19.67、19.62、18.56、14.04、13.50、11.68、11.55.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ155.08、154.60。
実施例21.S-およびC-結合GalNAc誘導体および構成単位の合成(スキーム45~51)
化合物の合成(スキーム45~51)
化合物1(15.6g、40.1mmol)を、DCE中のTMSOTf(7.98mL、44.1mmol)で処理したところ、化合物2が得られた。C14H20NO8についての分子量(M+H)+計算値330.12、実測値330.0。
化合物1(15.6g、40.1mmol)を、DCE中のTMSOTf(7.98mL、44.1mmol)で処理したところ、化合物2が得られた。C14H20NO8についての分子量(M+H)+計算値330.12、実測値330.0。
化合物3の合成:DCE中の化合物2(1.65g、5mmol)およびtert-ブチル5-メルカプトペンタノエート(1.0g、5.25mmol)を、TMSOTf(0.181mL、1.0mmol)で一晩処理した。水性後処理(aqueous work-up)およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物3(380mg、0.731mmol、15%)が得られた。C23H37NNaO10Sについての分子量(M+H)+計算値542.20、実測値542.1。
化合物7の合成:CH2Cl2(4mL)中の化合物3(380mg、0.731mmol)の溶液に、TFA(1mL)を0℃で加えた。混合物を、0℃で2時間、次に室温で3時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をトルエンと同時蒸発させたところ、粗化合物7が得られた。この材料を、精製せずに次の工程に使用した。C19H30NO10Sについての分子量(M+H)+計算値464.1590、実測値464.1。
化合物8の合成:前の工程からの化合物7(約0.731mmol)を、14時間にわたってCH2Cl2(5mL)中のEDCI(280mg、1.46mmol)およびDIEA(0.764mL、4.38mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(168mg、1.46mmol)で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物8(284mg、0.507mmol、2工程にわたって69%)が得られた。C23H33N2O12Sについての分子量(M+H)+計算値561.1754、実測値561.1。
臭化アルキンによる化合物6のS-アルキル化により、化合物9が得られる。同様に、化合物14は、化合物11から調製される(J.Org.Chem.,2002,67,2995-2999)。酸12は、報告される手順にしたがって調製される。
化合物13の合成:化合物12(2.40g、5.18mmol)を、14時間にわたってCH2Cl2(30mL)中のEDCI(1.19g、6.22mmol)およびDIEA(2.70mL、15.5mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(716mg、6.22mmol)で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物13(1.83g、3.26mmol、63%)が得られた。C23H33N2O12Sについての分子量(M+H)+計算値561.1754、実測値561.2。
化合物16を、報告される手順を用いて調製した(J.Org.Chem.,2006,71,3619-3622;Carbohydrate Research,1998,309,319-330)。
化合物22の合成:CH2Cl2(20mL)中の化合物16(1.94g、5.22mmol)、4-ペンテン酸ベンジル(2.99g、15.7mmol)および第二世代グラブス触媒(433mg、0.522mmol)を、40℃で40時間加熱した。溶媒を除去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物22(1.87g、3.50mmol、67%)が得られた。C27H36NO10についての分子量(M+H)+計算値534.2339、実測値534.2。
化合物23の合成:EtOAc(30mL)中の化合物22(1.85g、3.47mmol)の溶液に、パラジウム炭素を加えた(Aldrich:330108-50G、10重量%、DegussaタイプE101 NE/W:185mg)。反応混合物を、14時間にわたってH2雰囲気下で撹拌した。Celiteに通したろ過の後、ろ液を減圧下で除去した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物23(903mg、2.03mmol、59%)が得られた。C20H32NO10についての分子量(M+H)+計算値446.2026、実測値446.1。
化合物24の合成:化合物23(326mg、0.732mmol)を、14時間にわたってCH2Cl2(5mL)中のEDCI(211mg、1.10mmol)およびDIEA(0.383mL、2.20mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(127mg、1.10mmol)で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物24(300mg、0.553mmol、76%)が得られた。C24H35N2O12についての分子量(M+H)+計算値543.2190、実測値543.2。
16の酸化的切断により、アルデヒド25が得られる。それをアルコールに還元し、ベンジル-保護されたトリフレートによるO-アルキル化、続いて、脱保護およびエステル化に供したところ、28が得られる。25の還元的アミノ化により、酸29が得られ、その後、エステル化により、30が得られる。
化合物35は、文献に報告されるのと同様の方法で合成され得る(J.Org.Chem.,1996,61,6442-6445)。スキーム48について上述されるように、化合物38、42、および44を調製する。
活性化エステル8、13、24、38、28、42、30、44を、トリアミン-(45)またはモノアミン-(48)を含有するヒドロキシプロリノールと結合したところ、それぞれ46および49が得られる。これらの化合物を、それらの対応するホスホロアミダイトに転化するかまたは固体担体上に充填する。
DMTr-保護されたジ-アジド53を、クリック化学作用を用いてアルキン含有GalNAc誘導体と結合したところ、化合物54が得られる。それを、その対応するホスホロアミダイトに転化するかまたは固体担体上に充填したところ、55が得られる。
実施例22.ASGPR結合のためのC2-誘導体化されたガラクトサミン類似体の合成(スキーム52~53)
C2-誘導体化されたガラクトサミン類似体が、以下のスキーム52および53に示されるように調製され得る。
C2-誘導体化されたガラクトサミン類似体が、以下のスキーム52および53に示されるように調製され得る。
化合物58を、報告される手順と同様の方法で調製する(例えば、国際公開第96/39411号を参照)。O-アルキル化、続いて、アセチル基の選択的切断により、化合物60および63が得られる。NHSエステル61および64を、標準的なエステル化によって調製する。65のアセチル基を選択的に除去し、得られたヒドロキシル基を、ベンジル基によって保護したところ、66が得られる。末端アルケンの酸化的切断により、67が得られる。エステル化、続いて水素化により、61/64が得られる。
トリフルオロメチルアセトアミド-(TFA-)保護されたガラクトサミン(GalN-TFA)NHSエステルを、合成後手法において、アミン含有オリゴヌクレオチド(69/71)と結合して、Gal-TFA含有オリゴヌクレオチド(70/72)を生成する。
実施例23.プソイドウリジン骨格を含有するASGPRリガンド模倣体の合成(スキーム55~56)
プソイドウリジンリガンドが、スキーム55および56に示されるように調製され得る。
プソイドウリジンリガンドが、スキーム55および56に示されるように調製され得る。
化合物452:1Mの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pH8.5、780mL)およびEtOH(940mL)中のプソイドウリジン451(20g、81.9mmol)の溶液に、アクリル酸メチル(235mL、2.61mol)を滴下して加えた。反応混合物を16時間撹拌した。溶媒の除去の後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中10%のMeOH、Rf=0.23)によって精製したところ、化合物452(26.6g、80.5mmol、98%)が得られた。1H NMR(MeOH-d4、400MHz):δ7.77(d,J=0.8Hz、1H)、4.58(d,J=4.8Hz、1H)、4.15(t,J=5.2Hz、1H)、4.05(t,J=5.0Hz、1H)、3.98-4.02(m,2H)、3.91-3.94(m,1H)、3.80(dd,J=12.0Hz、3.3Hz、1H)、3.67(s,3H)、3.66(dd,J=12.0Hz、3.3Hz、1H)、2.73-2.77(m,2H).13C NMR(CDCl3、100MHz):δ173.1、165.4、152.5、145.8、112.9、85.6、81.5、75.6、72.6、63.3、52.5、46.2、33.7.C13H19N2O8についてのMW(M+H)+計算値330.11、実測値331.0。
化合物453:DMF(65mL)中の化合物452(11.67g、35.3mmol)の溶液に、ジ-tert-ブチルシリルビス(トリフルオロメタンスルホネート)(15.46mL、42.4mmol)を、0℃で撹拌しながら滴下して加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し続け、イミダゾール(12.0g、176.5mmol)で処理した。混合物を、0℃で10分間、次に室温で30分間撹拌した。TBDMSCl(7.98g、53.0mmol)を加え、反応混合物を75℃で6時間加熱した。反応混合物を、Et2Oおよび飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc=1:1、Rf=0.50)によって精製したところ、化合物453(15.0g、25.6mmol、73%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.39(s,1H)、7.54(s,1H)、4.55(s,1H)、4.34-4.38(m,1H)、4.18(d,J=4.4Hz、1H)、3.86-4.00(m,5H)、3.58(s,3H)、2.67(t,J=6.6Hz、2H)、1.02(s,9H)、0.99(s,9H)、0.89(s,9H)、0.13(s,3H)、0.087(s,3H).C27H49N2O8Si2についてのMW(M+H)+計算値585.30、実測値585.2。
化合物454:化合物453(1.24g、2.12mmol)を、室温で2時間にわたってエチレンジアミン(10mL)で処理した。エチレンジアミンを蒸発によって除去し、残渣を減圧下で乾燥させた。粗材料をCH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮したところ、454が白色の固体(1.16g、1.89mmol、89%)として得られた。1H NMR(MeOD-d4、400MHz):δ7.49(s,1H)、4.63(s,1H)、4.39-4.41(m,1H)、4.29(d,J=3.6Hz、1H)、4.00-4.04(m,5H)、3.18-3.26(m,2H)、2.69(t,J=6.2Hz、2H)、2.56-2.61(m,2H)、1.07(s,9H)、1.04(s,9H)、0.94(s,9H)、0.17(s,3H)、0.13(s,3H).C28H53N4O7Si2についてのMW(M+H)+計算値613.35、実測値613.2。
化合物455:DMF(10mL)中のGalNAc酸(930mg、2.08mmol)の溶液に、HBTU(789mg、2.08mmol)およびiPr2NEt(1.65mL、9.45mmol)を加えた。10分後、DMF(15mL)中の化合物454を溶液に加え、一晩撹拌した。反応混合物を、Et2Oおよび飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。蒸発後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中10%のMeOH、Rf=0.43)によって精製したところ、化合物455(1.83g、1.76mmol、93%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.36(s,1H)、7.98(s,1H)、7.82(d,J=9.2Hz、1H)、7.77、(s,1H)、7.51(s,1H)、5.21(d,J=3.6Hz、1H)、4.96(dd,J=11.4Hz、3.4Hz、1H)、4.53(s,1H)、4.48(d,J=8.4Hz、1H)、4.33-4.36(m,1H)、4.18(d,J=4.4Hz、1H)、3.85-4.02(m,9H)、3.67-3.73(m,1H)、3.37-3.43(m,1H)、3.04(s,4H)、2.39-2.44(m,2H)、2.10(s,3H)、2.02-2.05(m,2H)、1.99(s,3H)、1.89(s,3H)、1.77(s,3H)、1.46-1.49(m,4H)、1.01(s,9H)、0.99(s,9H)、0.89(s,9H)、0.12(s,3H)、0.080(s,3H).13C NMR(DMSO-d6、100MHz):δ172.0、169.8、169.7、169.5、169.2、162.3、150.3、143.4、110.6、100.8、83.4、76.2、74.7、73.1、70.3、69.7、68.5、67.5、66.6、61.3、54.9、54.8、49.3、44.6、38.3、38.0、34.9、33.9、28.5、27.3、26.7、25.7、25.6、22.6、22.0、21.6、20.4、20.3、19.8、17.8、-4.5、-5.1.C47H79N5NaO17Si2についてのMW(M+Na)+計算値1064.49、実測値1064.2。
化合物456:フッ化水素-ピリジン(約70%のHF、0.165mL、6.34mmol)を、冷却しながらピリジン(2mL)で希釈した。得られた溶液を、0℃でCH2Cl2中の化合物455の溶液に加え、混合物を0℃で2時間撹拌した。反応溶液をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。蒸発後、粗材料を減圧下で乾燥させたところ、白色の発泡体が得られた。ピリジン(15mL)中のこの材料の溶液に、DMTrCl(596mg、1.76mmol)を加えた。反応混合物を室温で4時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中10%のMeOH、Rf=0.57)によって精製したところ、化合物456(1.65g、1.37mmol、78%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.33(s,1H)、7.92(s,1H)、7.81(d,J=9.6Hz、1H)、7.75、(s,1H)、7.42-7.44(m,3H)、7.19-7.32(m,7H)、6.87-6.90(m,4H)、5.21(d,J=3.2Hz、1H)、4.96(dd,J=11.4Hz、3.4Hz、1H)、4.63(d,J=6.4Hz、1H)、4.53(d,J=2.4Hz、1H)、4.48(d,J=8.4Hz、1H)、4.02-4.07(m,4H)、3.81-3.91(m,3H)、3.73(s,6H)、3.68-3.70(m,2H)、3.53-3.63(m,1H)、3.23-3.40(m,2H)、3.02-3.14(m,5H)、2.32-2.35(m,2H)、2.10(s,3H)、2.00-2.04(m,2H)、1.99(s,3H)、1.89(s,3H)、1.76(s,3H)、1.44-1.47(m,4H)、0.87(s,9H)、0.064(s,3H)、0.041(s,3H).C60H81N5NaO19SiについてのMW(M+Na)+計算値1226.52、実測値1226.4。
化合物457:CH2Cl2(20mL)中の化合物456(1.86g、1.54mmol)の溶液に、2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.47mL、4.63mmol)および4,5-ジシアノイミダゾール(182mg、1.54mmol)を0℃で加えた。反応混合物を、アルゴン雰囲気下で20時間にわたって室温で撹拌した。反応混合物を、CH2Cl2(300mL)で希釈し、飽和NaHCO3(100mL)で洗浄した。有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させた。ろ液を濃縮し、得られた粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc、次に、CH2Cl2中0~3%のMeOH)によって精製したところ、457(1.80g、1.28mmol、83%、Rf=CH2Cl2中10%のMeOHによって展開される0.43)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ11.34(s,0.5H)、11.33(s,0.5H)、7.91(s,1H)、7.81(d,J=9.2、1H)、7.75(s,1H)、7.56(s,0.5H)、7.52(s,0.5H)、7.43(t,J=8.2、2H)、7.19-7.32(m,7H)、6.85-6.90(m,4H)、5.21(s,0.5H)、5.21(s,0.5H)、4.96(dd,J=11.2、3.4、1H)、4.47-4.51(m,2H)、4.36-4.41(m,1H)、4.02-4.07(m,5H)、3.83-3.90(m,1H)、3.73(s,3H)、3.72(s,3H)、3.69-3.71(m,3H)、3.31-3.60(m,xxH)、3.04-3.26(m,6H)、2.69-2.73(m,1H)、2.35(t,J=6.3、2H)、2.10(s,3H)、2.03(m,2H)、1.99(s,3H)、1.89(s,3H)、1.77(s,3H)、1.45-1.48(m,4H)、0.91-1.08(m,12H)、0.85(s,9H)、0.063(s,1.5H)、0.046(s,1.5H)、0.035(3H).31P NMR(DMSO-d6、162MHz)δ147.92、147.70.C69H98N7NaO20PSiについてのMW(M+Na)+計算値1426.63、実測値1426.5。
化合物458:ピリジン(400mL)中の452(21.5g、65.1mmol)の溶液に、DMAP(1.59g、13.0mmol)およびDMTrCl(22.1g、65.1mmol)を加えた。反応混合物を室温で6時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、EtOAcおよび飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中5%のMeOH、Rf=0.30)によって精製したところ、458(36.2g、57.2mmol、88%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.37(s,1H)、7.48(s,1H)、7.36(d,J=8.0Hz、2H)、7.27-7.32(m,6H)、7.20-7.23(m,1H)、6.87-6.90(m,4H)、5.06(d,J=4.8Hz、1H)、4.80(d,J=6.4Hz、1H)、4.54(d,J=2.8Hz、1H)、3.84-3.93(m,1H)、3.73(s,6H)、3.56-3.69(m,2H)、3.53(s,3H)、3.15-3.17(m,2H)、2.58(t,J=6.6Hz、2H).13C NMR(MeOH-d4、100MHz):δ172.7、165.5、160.2、152.7、146.4、144.5、137.4、137.3、131.5、131.4、129.6、128.9、128.0、114.2、114.0、87.5、83.0、81.1、76.2、72.4、64.7、55.8、52.4、46.2、33.5.C34H36N2NaO10についてのMW(M+Na)+計算値655.23、実測値655.2。
化合物459:化合物458(13.9g、22.0mmol)を、室温で18時間にわたってエチレンジアミン(75mL)で処理した。エチレンジアミンを蒸発によって除去し、トルエンと同時蒸発させた。残渣を、CH2Cl2/MeOH(180mL/20mL)およびH2O(50mL)で抽出し、有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、次に濃縮した。粗材料を、ヘキサンおよびCH2Cl2で結晶化させたところ、459が淡黄色の固体(11.7g、17.7mmol、80%)として得られた。1H NMR(MeOD-d4、400MHz):δ7.57(s,1H)、7.21-7.48(m,9H)、6.86-6.88(m,4H)、4.71(d,J=3.2Hz、1H)、4.02-4.17(m,3H)、3.79-3.82(m,1H)、3.78(s,6H)、3.31-3.36(m,3H)、3.15(t,J=6.2Hz、2H)、2.63(t,J=6.0Hz、2H)、2.41(t,J=6.2Hz、2H).C35H40N4NaO9についてのMW(M+H)+計算値683.27、実測値683.2。
化合物460:DMF(50mL)中のGalNAc酸(5.60g、12.5mmol)の溶液に、HBTU(4.70g、12.4mmol)およびiPr2NEt(10.3mL、59.3mmol)を加えた。10分後、DMF(50mL)中の化合物459を溶液に加え、一晩撹拌した。反応混合物を、EtOAcおよびH2Oで抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。蒸発後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中10%のMeOH、Rf=0.50)によって精製したところ、化合物460(6.85g、6.28mmol、59%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.33(s,1H)、7.93(s,1H)、7.81(d,J=9.2Hz、1H)、7.75、(s,1H)、7.41-7.44(m,3H)、7.27-7.31(m,6H)、7.18-7.22(m,1H)、6.87-6.89(m,4H)、5.21(d,J=3.2Hz、1H)、5.03(d,J=4.8Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2Hz、3.6Hz、1H)、4.78(d,J=6.4Hz、1H)、4.51(d,J=2.8Hz、1H)、4.48(d,J=8.4Hz、1H)、4.02(m,3H)、3.82-3.92(m,4H)、3.73(s,6H)、3.54-3.70(m,3H)、3.36-3.42(m,1H)、3.02-3.21(m,6H)、2.35(t,J=6.6Hz、2H)、2.09(s,3H)、2.02(t,J=7.0Hz、2H)、1.99(s,3H)、1.88(s,3H)、1.76(s,3H)、1.43-1.49(m,4H).13C NMR(DMSO-d6、100MHz):δ172.0、169.9、169.8、169.5、169.4、169.2、162.6、157.9、150.3、144.9、143.2、135.7、135.6、129.7、127.7、126.5、113.0、111.3、100.9、85.2、80.7、79.8、73.5、70.8、70.4、69.7、68.5、66.6、64.1、61.3、54.9、54.8、49.3、48.5、44.8、38.3、38.1、34.9、33.9、28.5、22.7、21.6、20.4、20.3.C54H67N5NaO19についてのMW(M+Na)+計算値1112.43、実測値1112.2。
化合物461:ピリジン(10mL)中の化合物460(1.55g、1.42mmol)の溶液に、TBDMSCl(214mg、1.42mmol)およびイミダゾール(290mg、4.26mmol)を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。蒸発後、残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中5%のMeOH、Rf=0.15)によって精製したところ、化合物461(550mg、0.457mmol、32%)およびその2’-O-TBDMS異性体456(390mg、0.324mmol、23%)が得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ11.32(s,1H)、7.94(s,1H)、7.82(d,J=9.2Hz、1H)、7.75、(s,1H)、7.54(s,1H)、7.40-7.41(m,2H)、7.21-7.32(m,7H)、6.87-6.89(m,4H)、5.21(d,J=3.2Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2Hz、3.6Hz、1H)、4.73(d,J=4.8Hz、1H)、4.47-4.49(m,2H)、3.95-4.02(m,5H)、3.83-3.88(m,2H)、3.72(s,6H)、3.68-3.71(m,3H)、3.38-3.41(m,1H)、3.03-3.19(m,6H)、2.39(t,J=6.6Hz、2H)、2.10(s,3H)、2.02(t,J=7.0Hz、2H)、1.99(s,3H)、1.89(s,3H)、1.77(s,3H)、1.45-1.50(m,4H)、0.74(s,9H)、-0.034、(s,3H)、-0.11(s,3H).C60H81N5NaO19SiについてのMW(M+Na)+計算値1226.52、実測値1227.4。
化合物462:CH2Cl2(60mL)中の化合物461(2.28g、1.89mmol)の溶液に、DMAP(693mg、5.67mmol)および無水コハク酸(378mg、3.78mmol)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。水性後処理を伴わない粗混合物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中10%のMeOH/10%のEt3N、Rf=0.44)により、化合物462が対応するトリエチルアンモニウム塩(2.50g、1.78mmol、94%)として得られた。1H NMR(DMSO-d6、400MHz):δ8.42(s,1H)、8.18(s,1H)、8.05(d,J=9.2Hz、1H)、7.71(s,1H)、7.48-7.50(m,2H)、7.29-7.40(m,7H)、6.95-6.97(m,4H)、5.28-5.30(m,2H)、5.07(dd,J=11.2Hz、3.6Hz、1H)、4.70(d,J=4.0Hz、1H)、4.60(d,J=8.4Hz、1H)、4.37(t,J=5.8Hz、1H)、4.09-4.13(m,3H)、3.91-3.97(m,2H)、3.81(s,6H)、3.78-3.85(m,3H)、3.42-3.49(m,2H)、3.27-3.30(m,1H)、3.10-3.16(m,5H)、2.43-2.53(m,5H)、2.18(s,3H)、2.12(t,J=7.2Hz、2H)、2.07(s,3H)、1.97(s,3H)、1.85(s,3H)、1.52-1.57(m,4H)、0.79(s,9H)、0.00(s,3H)、-0.075(s,3H).13C NMR(DMSO-d6、100MHz):δ173.8、172.2、172.1、171.5、169.9、169.6、169.5、169.3、162.5、158.1、150.4、144.7、144.6、135.5、135.4、129.7、127.7、126.6、113.1、109.5、100.9、85.6、81.6、77.5、74.2、71.0、70.5、69.8、68.5、66.7、63.6、61.4、52.0、49.3、38.4、38.2、34.9、34.0、30.0、29.5、28.5、25.8、25.5、25.4、22.7、21.6、21.4、20.5、20.4、17.5、14.7、7.1、-5.1、-5.4.C64H84N5O22SiについてのMW(M-H)-計算値1302.54、実測値1302.4。
化合物463:DMF(10mL)中の化合物462(98mg、0.07mmol)の溶液に、HBTU(30mg、0.077mmol)、iPr2NEt(0.061mL、0.35mmol)、およびアミノメチルポリスチレン担体(ARTVISION、70mol/g、1.10g、0.077mmolであると考えられる)を連続して加えた。混合物を24時間にわたって振とうし、次にろ過し、CH2Cl2で洗浄し、減圧下で乾燥させた。残りのアミノ基を、ピリジン(15mL)、無水酢酸(5mL)、およびトリエチルアミン(1mL)とともに1時間振とうすることによってキャッピングした。ろ過後、CH2Cl2(100mL)、次に50%のMeOH/CH2Cl2(100mL)で洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、化合物463(1.12g)が得られた。充填量:47mol/g。
実施例24.N-グリコシド結合を含有するASGPRリガンド模倣体の合成(スキーム57~63)
N-グリコシド結合を含有するASGPRリガンドが、スキーム57~63に示されるように調製され得る。
N-グリコシド結合を含有するASGPRリガンドが、スキーム57~63に示されるように調製され得る。
実施例25.ASGPRリガンド模倣体(スキーム64~73)
以下のASGPRリガンドが、スキーム64~73に示されるように調製され得る。
以下のASGPRリガンドが、スキーム64~73に示されるように調製され得る。
実施例26.リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするためのアミノリンカー(スキーム74~76)
リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするためのアミノリンカーが、以下のスキーム74~76によって調製され得る。
リガンドをオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするためのアミノリンカーが、以下のスキーム74~76によって調製され得る。
QAおよびQBが、本明細書に記載されるASGPRリガンドのいずれかである。
実施例29.siRNA-リガンドコンジュゲート
RNA合成および二本鎖アニーリング
RNA合成および二本鎖アニーリング
1.オリゴヌクレオチド合成
全てのオリゴヌクレオチドを、AKTAoligopilot合成装置またはABI 394合成装置で合成した。特に規定されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体(dT-CPG、500Å、Prime Synthesis)および標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト(Pierce Nucleic Acids Technologies)を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。2’-Fホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホロアミダイトを、(Promega)から購入した。10%のTHF/ANC(v/v)中0.2Mの濃度で使用したグアノシンを除いて、全てのホスホロアミダイトを、アセトニトリル(CH3CN)中0.2Mの濃度で使用した。16分間の結合/再利用時間を使用した。活性剤は、5-エチルチオテトラゾール(0.75M、American International Chemicals)であり、PO-酸化については、ヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS-酸化については、2,6-ルチジン/ACN(1:1v/v)中のPADS(2%)を使用した。
全てのオリゴヌクレオチドを、AKTAoligopilot合成装置またはABI 394合成装置で合成した。特に規定されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体(dT-CPG、500Å、Prime Synthesis)および標準的な保護基を有するRNAホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホロアミダイト(Pierce Nucleic Acids Technologies)を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。2’-Fホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホロアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホロアミダイトを、(Promega)から購入した。10%のTHF/ANC(v/v)中0.2Mの濃度で使用したグアノシンを除いて、全てのホスホロアミダイトを、アセトニトリル(CH3CN)中0.2Mの濃度で使用した。16分間の結合/再利用時間を使用した。活性剤は、5-エチルチオテトラゾール(0.75M、American International Chemicals)であり、PO-酸化については、ヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS-酸化については、2,6-ルチジン/ACN(1:1v/v)中のPADS(2%)を使用した。
リガンドがコンジュゲートされた鎖を、対応するリガンドを含有する固体担体を用いて合成した。例えば、配列の3’末端における糖質部分/リガンド(例えば、GalNAcの場合)の導入を、対応する糖質固体担体を用いて合成を開始することによって行った。同様に、3’末端のコレステロール部分を、コレステロール担体上で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分を、前の実施例に記載される最適なテザーを介してトランス-4-ヒドロキシプロリノールに連結して、ヒドロキシプロリノール-リガンド部分を得た。次に、ヒドロキシプロリノール-リガンド部分を、スクシネートリンカーを介して固体担体に結合するか、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホロアミダイトに転化して、所望の糖質コンジュゲート構成単位を得た。フルオロフォア標識siRNAを、対応するホスホロアミダイトまたは固体担体(Biosearch Technologiesから購入した)から合成した。オレイルリトコール酸(GalNAc)3ポリマー担体を、38.6μmol/グラムの充填量で、社内で作製した。マンノース(Man)3ポリマー担体も、42.0μmol/グラムの充填量で、社内で作製した。
所望の位置、例えば配列の5’末端における最適なリガンドのコンジュゲーションを、特に規定されない限り、標準的なホスホロアミダイト結合条件下で、対応するホスホロアミダイトを成長鎖に結合することによって行った。固体に結合されたオリゴヌクレオチドに対する、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール活性剤の存在下における無水CH3CN中のホスホロアミダイトの0.1Mの溶液の延長された15分間の結合。(1)Beaucage,S.L.(2008)Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotide.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,11,203-216;(2)Mueller,S.,Wolf,J.and Ivanov,S.A.(2004)Current Strategies for the Synthesis of RNA.Curr.Org.Synth.,1,293-307および(3)Xia,J.,Noronha,A.,Toudjarska,I.,Li,F.,Akinc,A.,Braich,R.,Frank-Kamenetsky,M.,Rajeev,K.G.,Egli,M.and Manoharan,M.(2006)Gene Silencing Activity of siRNAs with a Ribo-difluorotoluyl Nucleotide.ACS Chem.Biol.,1,176-183に報告されるように標準的なヨウ素-水を用いて、またはコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの10分間の酸化待ち時間を伴う、tert-ブチルヒドロペルオキシド/アセトニトリル/水(10:87:3)を用いた処理によって、ヌクレオチド間ホスファイトからホスフェートへの酸化を行った。DDTT(AM Chemicalsから購入した)、PADSおよびまたはボーケージ(Beaucage)試薬などの硫黄移動剤を用いることによって、ホスホロチオエートを、ホスファイトからホスホロチオエートの酸化によって導入した。コレステロールホスホロアミダイトを、社内で合成し、ジクロロメタン中0.1Mの濃度で使用した。コレステロールホスホロアミダイトの結合時間は、16分間であった。
2.脱保護-I(核酸塩基脱保護)
合成の完了の後、担体を、100mlのガラス瓶(VWR)に移した。55℃で6.5時間にわたって、80mLの、エタノールアンモニアの混合物[アンモニア:エタノール(3:1)]を用いて、塩基およびリン酸基を同時に脱保護しながら、オリゴヌクレオチドを、担体から切断した。瓶を、氷上で短時間冷却し、次に、エタノールアンモニア混合物をろ過して、新たな250mlの瓶に入れた。CPGを、2×40mLの分量のエタノール/水(1:1v/v)で洗浄した。次に、混合物の体積を、ロータリーエバポレータ(roto-vap)によって約30mlまで減少させた。次に、混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバック(speed vac)で、減圧下で乾燥させた。
合成の完了の後、担体を、100mlのガラス瓶(VWR)に移した。55℃で6.5時間にわたって、80mLの、エタノールアンモニアの混合物[アンモニア:エタノール(3:1)]を用いて、塩基およびリン酸基を同時に脱保護しながら、オリゴヌクレオチドを、担体から切断した。瓶を、氷上で短時間冷却し、次に、エタノールアンモニア混合物をろ過して、新たな250mlの瓶に入れた。CPGを、2×40mLの分量のエタノール/水(1:1v/v)で洗浄した。次に、混合物の体積を、ロータリーエバポレータ(roto-vap)によって約30mlまで減少させた。次に、混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバック(speed vac)で、減圧下で乾燥させた。
3.脱保護-II(2’TBDMS基の除去)
乾燥した残渣を、26mlのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA.3HF)またはピリジン-HFおよびDMSO(3:4:6)に再懸濁させ、60℃で90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次に、反応を、50mlの20mMの酢酸ナトリウムでクエンチし、pHを6.5に調整し、精製するまで冷凍庫で貯蔵した。
乾燥した残渣を、26mlのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA.3HF)またはピリジン-HFおよびDMSO(3:4:6)に再懸濁させ、60℃で90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次に、反応を、50mlの20mMの酢酸ナトリウムでクエンチし、pHを6.5に調整し、精製するまで冷凍庫で貯蔵した。
4.分析
精製の前に、オリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートされるリガンドの性質によって決まる。
精製の前に、オリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートされるリガンドの性質によって決まる。
5.HPLC精製
リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、逆相分取HPLCによって精製した。コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドを、社内で充填したTSKゲルカラムで、アニオン交換HPLCによって精製した。緩衝液は、10%のCH3CN中の20mMのリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液A)および10%のCH3CN、1MのNaBr中の20mMのリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液B)であった。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを、水で150μlに希釈し、次に、CGEおよびLC/MS分析用の特殊なバイアル中にピペットで取った。化合物を、最後に、LC-ESMSおよびCGEによって分析した。
リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、逆相分取HPLCによって精製した。コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドを、社内で充填したTSKゲルカラムで、アニオン交換HPLCによって精製した。緩衝液は、10%のCH3CN中の20mMのリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液A)および10%のCH3CN、1MのNaBr中の20mMのリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液B)であった。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを、水で150μlに希釈し、次に、CGEおよびLC/MS分析用の特殊なバイアル中にピペットで取った。化合物を、最後に、LC-ESMSおよびCGEによって分析した。
6.RNAi剤の調製
RNAi剤の調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、95℃で5分間にわたって1×PBS中で加熱し、ゆっくりと室温に冷ました。二本鎖の完全性を、HPLC分析によって確認した。以下の表1は、合成されたRNAi剤を示している。
RNAi剤の調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、95℃で5分間にわたって1×PBS中で加熱し、ゆっくりと室温に冷ました。二本鎖の完全性を、HPLC分析によって確認した。以下の表1は、合成されたRNAi剤を示している。
実施例30:合成後方法を用いたsiRNA-リガンドコンジュゲートの合成
所望のアミノリンカーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドを、実施例30(スキーム79)に記載される固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件に適合する対応するアミノリンカーモノマーを用いて合成した。脱保護の後、アミノが結合されたオリゴヌクレオチドを、スキーム79の下の表に示されるリガンドのNHSエステルと反応させた後、アンモニアによる処理およびHPLC精製を行った。各精製されたリガンドがコンジュゲートされた一本鎖オリゴヌクレオチドを、相補的な鎖の等モル混合物でアニールしたところ、表5に示されるsiRNAが得られた。スキーム79および表5に示される(1+1+1)設計が、アミノリンカーホスホロアミダイトをアミノリンカー固体担体に連続して結合し(2つの合成サイクル)、その後、実施例29に記載されるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを連続して結合することによって得られた。
所望のアミノリンカーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドを、実施例30(スキーム79)に記載される固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件に適合する対応するアミノリンカーモノマーを用いて合成した。脱保護の後、アミノが結合されたオリゴヌクレオチドを、スキーム79の下の表に示されるリガンドのNHSエステルと反応させた後、アンモニアによる処理およびHPLC精製を行った。各精製されたリガンドがコンジュゲートされた一本鎖オリゴヌクレオチドを、相補的な鎖の等モル混合物でアニールしたところ、表5に示されるsiRNAが得られた。スキーム79および表5に示される(1+1+1)設計が、アミノリンカーホスホロアミダイトをアミノリンカー固体担体に連続して結合し(2つの合成サイクル)、その後、実施例29に記載されるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを連続して結合することによって得られた。
各コンジュゲート中のTTR siRNAは同じであった。同様に、各コンジュゲート中のAT3 siRNAは同じであった。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
実施例31:RNAi剤のインビトロスクリーニング
細胞培養およびトランスフェクション
ヒトHep3B細胞またはラットH.II.4.E細胞(ATCC,Manassas,VA)を、10%のFBS、ストレプトマイシン、およびグルタミン(ATCC)が補充されたRPMI(ATCC)中、5%のCO2の雰囲気下、37℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によってプレートから解放した。ウェル当たり14.8μlのOpti-MEMおよび0.2μlのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)を、96ウェルプレート内のウェル当たり5μlのsiRNA二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で15分間インキュベートした。次に、約2×104個のHep3B細胞を含む、抗生物質を有さない80μlの完全増殖培地を、siRNA混合物に加えた。RNA精製の前に、細胞を24時間または120時間インキュベートした。10nMおよび0.1nMの最終二本鎖濃度で単回投与実験を行い、10nMの最終二本鎖濃度の最大用量で、8、4倍連続希釈を用いて用量応答実験を行った。
細胞培養およびトランスフェクション
ヒトHep3B細胞またはラットH.II.4.E細胞(ATCC,Manassas,VA)を、10%のFBS、ストレプトマイシン、およびグルタミン(ATCC)が補充されたRPMI(ATCC)中、5%のCO2の雰囲気下、37℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によってプレートから解放した。ウェル当たり14.8μlのOpti-MEMおよび0.2μlのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)を、96ウェルプレート内のウェル当たり5μlのsiRNA二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で15分間インキュベートした。次に、約2×104個のHep3B細胞を含む、抗生物質を有さない80μlの完全増殖培地を、siRNA混合物に加えた。RNA精製の前に、細胞を24時間または120時間インキュベートした。10nMおよび0.1nMの最終二本鎖濃度で単回投与実験を行い、10nMの最終二本鎖濃度の最大用量で、8、4倍連続希釈を用いて用量応答実験を行った。
DYNABEADS mRNA単離キット(Invitrogen,part#:610-12)を用いた総RNA単離
細胞を採取し、150μlの溶解/結合緩衝液中に溶解させ、次に、Eppendorf Thermomixerを用いて850rpmで5分間混合した(混合速度は、プロセス全体を通して同一であった)。10マイクロリットルの磁気ビーズおよび80μlの溶解/結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、1分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、5分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを150μlの洗浄緩衝液Aで2回洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの洗浄緩衝液Bで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを2分間乾燥させた。乾燥後、50μlの溶出緩衝液を加え、70℃で5分間混合した。ビーズを磁石上に5分間捕捉した。40μlの上清を除去し、別の96ウェルプレートに加えた。
細胞を採取し、150μlの溶解/結合緩衝液中に溶解させ、次に、Eppendorf Thermomixerを用いて850rpmで5分間混合した(混合速度は、プロセス全体を通して同一であった)。10マイクロリットルの磁気ビーズおよび80μlの溶解/結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、1分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、5分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを150μlの洗浄緩衝液Aで2回洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの洗浄緩衝液Bで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを2分間乾燥させた。乾燥後、50μlの溶出緩衝液を加え、70℃で5分間混合した。ビーズを磁石上に5分間捕捉した。40μlの上清を除去し、別の96ウェルプレートに加えた。
ABI高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat#4368813)を用いたcDNA合成
反応当たり、1μlの10倍緩衝液、0.4μlの25倍dNTP、1μlのランダムプライマー、0.5μlの逆転写酵素、0.5μlのRNase阻害剤および1.6μlのH2Oのマスターミックスを、5μlの総RNAに加えた。以下の工程によって、Bio-Rad C-1000またはS-1000サーモサイクラー(Hercules,CA)を用いて、cDNAを生成した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間、4℃で保持。
反応当たり、1μlの10倍緩衝液、0.4μlの25倍dNTP、1μlのランダムプライマー、0.5μlの逆転写酵素、0.5μlのRNase阻害剤および1.6μlのH2Oのマスターミックスを、5μlの総RNAに加えた。以下の工程によって、Bio-Rad C-1000またはS-1000サーモサイクラー(Hercules,CA)を用いて、cDNAを生成した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間、4℃で保持。
リアルタイムPCR
2μlのcDNAを、384ウェルプレート(Roche cat#04887301001)中で、ウェル当たり、0.5μlのGAPDH TaqMan Probe(Applied Biosystems Cat#4326317E(ヒト)Cat#4308313(げっ歯類))、0.5μlのTTR TaqMan probe(Applied Biosystems cat#HS00174914_m1(ヒト)cat#Rn00562124_m1(ラット))および5μlのLightcycler 480プローブマスターミックス(Roche Cat#04887301001)を含むマスターミックスに加えた。Roche LC 480リアルタイムPCR機械(Roche)中でリアルタイムPCRを行った。特に断りのない限り、各二本鎖を少なくとも2つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを2回アッセイした。
2μlのcDNAを、384ウェルプレート(Roche cat#04887301001)中で、ウェル当たり、0.5μlのGAPDH TaqMan Probe(Applied Biosystems Cat#4326317E(ヒト)Cat#4308313(げっ歯類))、0.5μlのTTR TaqMan probe(Applied Biosystems cat#HS00174914_m1(ヒト)cat#Rn00562124_m1(ラット))および5μlのLightcycler 480プローブマスターミックス(Roche Cat#04887301001)を含むマスターミックスに加えた。Roche LC 480リアルタイムPCR機械(Roche)中でリアルタイムPCRを行った。特に断りのない限り、各二本鎖を少なくとも2つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを2回アッセイした。
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔCt方法を用いて、リアルタイムデータを分析し、10nMのAD-1955でトランスフェクトした細胞、または疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。XLFitを用いて4パラメータフィットモデルを用いてIC50を計算し、同じ用量範囲にわたる非標的特異的な対照でトランスフェクトした細胞または未感作細胞、またはそれ自体の最も少ない用量に対して正規化した。IC50を、それぞれの個々のトランスフェクションに対してならびに組み合わせて計算し、ここで、1つのIC50を、両方のトランスフェクションからのデータにフィッティングした。
実施例32:TTRを標的にする化学修飾されたRNAi剤のインビトロでのサイレンシング活性
以下の実験は、TTRを標的にするRNAi剤のサイレンシング活性に対する、GalNAc3リガンドとともに三重項反復モチーフの導入を含む化学修飾の有益な効果を実証した。
以下の実験は、TTRを標的にするRNAi剤のサイレンシング活性に対する、GalNAc3リガンドとともに三重項反復モチーフの導入を含む化学修飾の有益な効果を実証した。
Hep3B細胞におけるIC50の評価のためのプロトコル
各修飾siRNAのIC50を、Lipofectamine RNAiMAXを用いて標準的な逆トランスフェクションによって、Hep3B細胞中で決定した。簡潔に述べると、5μLのOpti-MEMを、ウェル当たり10μLのOpti-MEMおよび0.5μLのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)とともに、96ウェルプレート内のウェル当たり5μLのsiRNA二本鎖に加えることにより逆トランスフェクションを行い、室温で15~20分間インキュベートした。インキュベーションの後、次に、12,000~15,000個のHep3B細胞を含む、抗生物質を有さない100μLの完全増殖培地を、各ウェルに加えた。細胞を、溶解ならびにbDNA(Quantigene)によるTTRおよびGAPDH mRNAの分析の前に、5%のCO2の雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。10nM~0.6pMの範囲の7つの異なるsiRNA濃度を、IC50の決定のために評価し、siRNAトランスフェクト細胞のTTR/GAPDHを、10nMのLuc siRNAでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。
各修飾siRNAのIC50を、Lipofectamine RNAiMAXを用いて標準的な逆トランスフェクションによって、Hep3B細胞中で決定した。簡潔に述べると、5μLのOpti-MEMを、ウェル当たり10μLのOpti-MEMおよび0.5μLのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)とともに、96ウェルプレート内のウェル当たり5μLのsiRNA二本鎖に加えることにより逆トランスフェクションを行い、室温で15~20分間インキュベートした。インキュベーションの後、次に、12,000~15,000個のHep3B細胞を含む、抗生物質を有さない100μLの完全増殖培地を、各ウェルに加えた。細胞を、溶解ならびにbDNA(Quantigene)によるTTRおよびGAPDH mRNAの分析の前に、5%のCO2の雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。10nM~0.6pMの範囲の7つの異なるsiRNA濃度を、IC50の決定のために評価し、siRNAトランスフェクト細胞のTTR/GAPDHを、10nMのLuc siRNAでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。
自由取り込み(free-uptake)IC50の評価のためのプロトコル
初代カニクイザルまたはマウス肝細胞における自由取り込みサイレンシングを、4時間または24時間にわたるTTR siRNAを用いたインキュベーションの後に評価した。サイレンシングを、最初の曝露から24時間の時点で測定した。
初代カニクイザルまたはマウス肝細胞における自由取り込みサイレンシングを、4時間または24時間にわたるTTR siRNAを用いたインキュベーションの後に評価した。サイレンシングを、最初の曝露から24時間の時点で測定した。
実施例33:マウスにおけるTTR mRNAサイレンシングおよびTTRタンパク質抑制
RNAi剤の有効性を評価するために、これらの薬剤をマウスに投与した。RNAi剤またはPBS対照を、5mg/kgまたは1mg/kgの単回の皮下投与でマウスに投与した。約48時間後、マウスを200μlのケタミンで麻酔をかけ、次に、右尾動脈を切断することによって放血させた。全血を単離し、血漿を単離し、アッセイまで-80℃で貯蔵した。肝組織を採取し、急速冷凍し、プロセシングまで-80℃で貯蔵した。
RNAi剤の有効性を評価するために、これらの薬剤をマウスに投与した。RNAi剤またはPBS対照を、5mg/kgまたは1mg/kgの単回の皮下投与でマウスに投与した。約48時間後、マウスを200μlのケタミンで麻酔をかけ、次に、右尾動脈を切断することによって放血させた。全血を単離し、血漿を単離し、アッセイまで-80℃で貯蔵した。肝組織を採取し、急速冷凍し、プロセシングまで-80℃で貯蔵した。
処置の有効性を、(i)投与の48および144時間後の時点での肝臓中のTTR mRNAの測定、および(ii)放血前および投与の48/144時間後の時点での血漿中のTTRタンパク質の測定によって評価した。TTR肝臓mRNAレベルを、分岐DNAアッセイ-QuantiGene 2.0(Panomics cat#:QS0011)を用いてアッセイした。簡潔に述べると、マウス肝臓試料をすり潰し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物(最終濃度が20mg/mlになるような、1容量の溶解混合物、2容量のヌクレアーゼを含まない水および10ulのプロテイナーゼ-K/mlの混合物)を、65℃で35分間インキュベートした。次に、20μlのWorking Probe Set(遺伝子標的のためのTTRプローブおよび内在性コントロールのためのGAPDH)および80ulの組織溶解物を、捕捉プレート(Capture Plate)に加えた。捕捉プレートを、55℃±1℃(約16~20時間)インキュベートした。翌日、捕捉プレートを、1倍の洗浄緩衝液(ヌクレアーゼを含まない水、緩衝液成分1および洗浄緩衝液成分2)で3回洗浄し、次に、240gで1分間遠心分離することによって乾燥させた。100μlの前置増幅器作動試薬(pre-Amplifier Working Reagent)を、アルミニウム箔で封止した捕捉プレートに加え、55℃±1℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーションの後、洗浄工程を繰り返し、次に、100μlの増幅器作動試薬(Amplifier Working Reagent)を加えた。1時間後、洗浄および乾燥工程を繰り返し、100μlのLabel Probeを加えた。捕捉プレートを、50℃±1℃で1時間インキュベートした。次に、プレートを、1倍の洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、100μlの基質を捕捉プレートに加えた。捕捉プレートを、5~15分間のインキュベーションの後、SpectraMax Luminometerを用いて読み取った。各3つの試料から平均バックグラウンドを減算し、得られた3つのGAPDH(対照プローブ)およびTTR(実験プローブ)値を平均し、次に、(実験プローブ-バックグラウンド)/(対照プローブ-バックグラウンド)の比率を計算することによって、bDNAデータを分析した。
血漿TTRレベルを、製造業者のガイドラインにしたがって、市販のキットを用いてアッセイした。簡潔に述べると、マウス血漿を、1倍の混合物希釈剤中で1:10,000に希釈し、キット標準とともに予め被覆されたプレートに加え、室温で2時間インキュベートした後、キット洗浄緩衝液で5回洗浄した。50マイクロリットルのビオチン化プレアルブミン抗体を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で5回洗浄した。50マイクロリットルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを各ウェルに加え、プレートを室温で30分間インキュベートした後、上述されるように洗浄した。反応物を、50μl/ウェルのクロモゲン基質の添加によって発色させ、室温で10分間インキュベートし、50μl/ウェルの停止溶液の添加によって反応を停止させた。450nmでの吸光度を、Versamaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)で読み取り、データを、Softmax 4.6ソフトウェアパッケージ(Molecular Devices)を用いて分析した。
代表的なsiRNA-コンジュゲートの有効性の結果が、図1に示される。アノマー結合修飾リガンドのほとんどが、5mg/kgの用量で同様のTTRタンパク質抑制を示した。
実施例34:インビトロおよびインビボでのAT3 mRNAサイレンシング
マウスにおけるAT3のインビボでの遺伝子サイレンシングを、インビボでのTTR遺伝子サイレンシングについて実施例33に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって、AT3 siRNA-リガンドコンジュゲートの単回皮下投与によって決定した。インビトロでの遺伝子サイレンシングを、実施例31および32に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって評価した。
マウスにおけるAT3のインビボでの遺伝子サイレンシングを、インビボでのTTR遺伝子サイレンシングについて実施例33に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって、AT3 siRNA-リガンドコンジュゲートの単回皮下投与によって決定した。インビトロでの遺伝子サイレンシングを、実施例31および32に記載されるのと類似のプロトコルにしたがって評価した。
siRNAコンジュゲート54944および56881を、3つの異なる単回用量レベル:5、10および25mg/kgで、C57/BL6マウスに皮下投与し、PBS対照と比較したAT3タンパク質レベルを、投与の72時間後に測定した。結果が図2に示される。コンジュゲート54944および56881は、上記および図2中で、それぞれ70001および70002と呼ばれる。
102の合成:GalNAc酸100(8.39g、18.71mmol)およびヒドロキシプロリンアミン(10.00g、18.77mmol)を一緒にジクロロメタンに入れた。HBTU(10.68g、28.12mmol)およびDIEA(9.80mL、3当量)を加え、混合物を周囲温度で2時間撹拌した。TLCを調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物102が淡黄色のふんわりした固体(11.77g、63%)として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO)δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.69(t,J=5.6Hz、1H)、7.39-7.09(m,9H)、6.86(ddd,J=9.0、5.4、2.1Hz、4H)、5.20(d,J=3.4Hz、1H)、5.03-4.83(m,2H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.41-4.07(m,2H)、4.04-3.95(m,3H)、3.86(dt,J=11.2、8.9Hz、1H)、3.79-3.68(m,6H)、3.68-3.36(m,3H)、3.21-2.88(m,5H)、2.26-2.14(m,2H)、2.09(s,3H)、2.02(t,J=6.7Hz、2H)、1.98(s,3H)、1.87(d,J=7.5Hz、3H)、1.76(s,3H)、1.53-1.29(m,7H)。
104の合成:ヒドロキシプロリン誘導体102(6.00g、6.24mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。それに、DIEA(2.20mL、3当量)およびクロロアミダイト試薬を加えた。反応混合物を30分間撹拌し、TLCによって調べた。それを分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO)δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.68(s,1H)、7.42-7.06(m,8H)、7.01-6.73(m,4H)、5.20(d,J=3.3Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2、3.3Hz、1H)、4.63(d,J=4.7Hz、1H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.15(s,1H)、4.01(s,3H)、3.86(d,J=11.0Hz、1H)、3.70(d,J=16.5Hz、9H)、3.45(ddd,J=37.0、23.3、16.4Hz、6H)、2.99(dd,J=12.3、6.4Hz、3H)、2.74(dd,J=9.2、5.8Hz、2H)、2.21(s,2H)、2.09(s,3H)、2.05-1.95(m,5H)、1.88(s,3H)、1.76(s,3H)、1.52-1.16(m,11H)、1.16-1.02(m,11H).31P NMR δ=151.78、151.61、151.50、151.30。
105の合成:化合物102(2.10g、2.18mmol)をDCM(20mL)に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸(0.441g、4.36mmol)およびDMAP(0.532g、当量)、続いてTEA(1ml)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物のTLCを調べ、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを、無水アセトニトリルに溶解させた。HBTU(1.59g、4.20mmol)およびDIEA(1.10ml)を加え、混合物を5分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸/Py混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、MeOH/DCMおよびエーテル(27.10g、55umol/g)で再度洗浄した。
実施例36:オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのためのモノ-GalNAc NHSエステルの合成
オリゴヌクレオチドコンジュゲーションに有用なモノ-GalNAc NHSエステルが、以下のスキーム81~86に示されるように調製され得る。
オリゴヌクレオチドコンジュゲーションに有用なモノ-GalNAc NHSエステルが、以下のスキーム81~86に示されるように調製され得る。
化合物5001の合成:DCM中の化合物5000(23.22g、63.6mmol)の撹拌溶液に、NaN3(12.4g、190.8mmol)およびTBAHS(21.6g、63.6mmol)を加えた後、150mLの飽和NaHCO3溶液を加えた。得られた混合物を14時間撹拌した。次に、反応混合物を、酢酸エチル(3×250ml)で抽出し、水、塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗材料が得られた。この材料を酢酸エチル(150mL)に溶解させた後、150mLのヘキサンを加えたところ、白色の固体としての生成物の沈殿が生じた。固体を減圧下で乾燥させたところ、化合物5001(16.2g、68.4%)が得られた。化合物5001についてのLCMS:計算値:372.33(M+)、実測値:407.1(M-+Cl-)。
化合物5002の合成:THF(600mL)中の化合物5001(13.2g、35.5mmol)の撹拌溶液に、PtO2(0.6g)を加え、反応混合物を、室温で14時間にわたって水素雰囲気下で撹拌した。触媒をろ過によって除去した。溶媒の濃縮により、化合物5002(13.0g)が得られた。
化合物5003の合成:DCM(100mL)中の化合物5002(10.0g、28.89mmol)およびグルタル酸無水物(3.29g、28.89mmol)の撹拌溶液に、ピリジン(4.6g)およびDMAP(0.176g)を加えた。反応混合物を14時間撹拌した。得られた混合物を濃縮し、次に、ろ過カラム(filter column)にかけたところ、化合物5003(11.45g、86%)が得られた。化合物5003についてのLCMS:計算値:460.43(M+)、実測値:459.3(M--1)、495.0(M-+Cl-)。
化合物5004の合成:DCM(100mL)中の化合物5003(7.6g、16.51mmol)、NHS(2.09g、18.16mmol)およびEDC(3.8g、19.8mmol)の撹拌溶液に、DIEA(7.16mL、41.27mmol)を滴下して加えた。得られた混合物を14時間撹拌した。次に、100mLの水を加え、生成物を、DCM(2×50mL)で抽出し、クエン酸(20%)、飽和NaHCO3、塩水で洗浄し、次に、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、化合物5004(6g、65%)が得られた。化合物5004についてのLCMS:計算値:557.5(M+)、実測値:558.0(M++1)。
化合物5005の合成:アセトニトリル(50mL)中の化合物5002(3.0g、8.66mmol)の撹拌溶液に、DSC(2.22g、8.66mmol)を加え、得られた混合物を室温で一晩(14時間)撹拌した。溶媒を濃縮し、次に、生成物を、酢酸エチル(3×50mL)で抽出し、水、10%のクエン酸、塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、化合物5005(3.8g、95%)が得られた。C19H25N3O12についてのLCMS計算値:487.41(M+)、実測値:488.1(M++1)、510.1(M++Na+)。
化合物5006の合成:DCM(15mL)中の化合物5005(0.663g、1.36mmol)の撹拌溶液に、アミン(0.526g、1.5mmol)およびトリエチルアミン(0.4mL)を加えた。溶媒を濃縮し、次に、生成物を、酢酸エチル(3×50mL)で抽出し、水、10%のクエン酸、塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、化合物5006(0.7g、93%)が得られた。C25H33N3O11についてのLCMS計算値551.54(M+)、実測値:552.2(M++1)、574.2(M++Na+)。
化合物5007の合成:EtOH(15mL)中の化合物5005(0.7g、1.26mmol)の撹拌溶液に、Pd/C(0.1g)を加え、得られた混合物を一晩(14時間)水素雰囲気下で撹拌した。触媒を、セライト上でのろ過によって除去し、混合物をEtOH(950mL)で洗浄し、濃縮したところ、生成物が得られ、それを精製せずに次の工程に使用した。DCM(20mL)中の上記の酸の撹拌溶液に、EDC(488mg、2.56mmol)、NHS(730mg、6.35mmol)およびDIEA(0.88mL、5.07mmol)を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物の濃縮、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物5007(250mg、35%)が得られた。C22H30N4O13についてのLCMS計算値:558.49(M+)、実測値:559.2(M++1)、581.1(M++Na+)。
化合物5012の合成:化合物4999(15.6g、40.1mmol)を、DCE中のTMSOTf(7.98mL、44.1mmol)で処理したところ、化合物5011が得られた。C14H20NO8についての分子量(M+H)+計算値330.12、実測値330.0。DCE中の化合物5011(1.65g、5mmol)およびtert-ブチル5-メルカプトペンタノエート(1.0g、5.25mmol)を、TMSOTf(0.181mL、1.0mmol)で一晩処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物5012(380mg、0.731mmol、15%)が得られた。C23H37NNaO10Sについての分子量(M+H)+計算値542.20、実測値542.1。
化合物5013の合成:CH2Cl2(4mL)中の化合物5012(380mg、0.731mmol)の溶液に、0℃でTFA(1mL)を加えた。混合物を、0℃で2時間、次に、室温で3時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をトルエンと同時蒸発させたところ、粗化合物5013が得られた。この材料を、精製せずに次の工程に使用した。C19H30NO10Sについての分子量(M+H)+計算値464.1590、実測値464.1。
化合物5014の合成:前の工程からの化合物5013(約0.731mmol)を、14時間にわたってCH2Cl2(5mL)中のEDCI(280mg、1.46mmol)およびDIEA(0.764mL、4.38mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(168mg、1.46mmol)で処理した。水性後処理、次にカラムクロマトグラフィーにより、化合物5014(284mg、0.507mmol、2工程にわたって69%)が得られた。C23H33N2O12Sについての分子量(M+H)+計算値561.1754、実測値561.1。
臭化アルキンによる化合物5009のS-アルキル化により、化合物5010が得られる。
化合物5016は、化合物5015から調製される(J.Org.Chem.,67,2995-2999,2002を参照)。酸5017は、報告される手順にしたがって調製される。
化合物5018の合成:化合物5017(2.40g、5.18mmol)を、14時間にわたって、CH2Cl2(30mL)中のEDCI(1.19g、6.22mmol)およびDIEA(2.70mL、15.5mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(716mg、6.22mmol)で処理した。水性後処理、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物5018(1.83g、3.26mmol、63%)が得られた。C23H33N2O12Sについての分子量(M+H)+計算値561.1754、実測値561.2。
化合物5024を、報告される手順を用いて調製した(J.Org.Chem.,71,3619-362,2006およびCarbohydrate Research,309,319-330,1998を参照)。
化合物5025の合成:CH2Cl2(20mL)中の化合物5024(1.94g、5.22mmol)、4-ペンテン酸ベンジル(2.99g、15.7mmol)および第二世代グラブス触媒(433mg、0.522mmol)を40℃で40時間加熱した。溶媒を除去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物5025(1.87g、3.50mmol、67%)が得られた。C27H36NO10についての分子量(M+H)+計算値534.2339、実測値534.2。
化合物5028の合成:EtOAc(30mL)中の化合物5025(1.85g、3.47mmol)の溶液に、パラジウム炭素(Aldrich:330108-50G、10重量%、DegussaタイプE101 NE/W:185mg)を加えた。反応混合物を、14時間にわたって水素の雰囲気下で撹拌した。Celiteに通したろ過の後、ろ液を減圧下で除去した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物5028(903mg、2.03mmol、59%)が得られた。C20H32NO10についての分子量(M+H)+計算値446.2026、実測値446.1。
化合物5031の合成:化合物5028(326mg、0.732mmol)を、14時間にわたってCH2Cl2(5mL)中のEDCI(211mg、1.10mmol)およびDIEA(0.383mL、2.20mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(127mg、1.10mmol)で処理した。水性後処理、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物5031(300mg、0.553mmol、76%)が得られた。C24H35N2O12についての分子量(M+H)+計算値543.2190、実測値543.2。
化合物5024の酸化的切断により、アルデヒド5026が得られる。それをアルコールに還元し、次に、ベンジル-保護されたトリフレートによるO-アルキル化、続いて、脱保護およびエステル化により、化合物5032が得られる。化合物5026の還元的アミノ化により、酸化合物5030が得られ、それをエステル化したところ、化合物5033が得られる。
化合物5038を、文献に報告されるのと同様の方法で調製した(J.Org.Chem.,61,6442-6445,1996を参照)。化合物5046、5047、および5048は、スキーム91に示されるのと類似の方法で調製される。
化合物5050の合成:N-アセチルグルコサミン(10g)を、BF3.Et2Oの存在下で、ヘキサノール(過剰)を用いて還流させたところ、化合物5050が得られた。
化合物5052の合成:化合物5050を、文献に報告されるように塩化ピバロイルで処理した。このピバロイルエステルを、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、続いて、還流状態で、水で処理したところ、化合物5052が得られた。
化合物5055の合成:化合物5052を、まず、水酸化ナトリウムで処理して、ピバロイルエステルを除去し、次に、得られたトリヒドロキシル誘導体を、無水安息香酸で処理したところ、化合物5054が得られた。二重結合を後に酸化させたところ、カルボン酸5055が得られた。
化合物5056の合成:化合物5055(502mg、0.732mmol)を、14時間にわたってCH2Cl2(5mL)中のEDCI(211mg、1.10mmol)およびDIEA(0.383mL、2.20mmol)の存在下で、N-ヒドロキシスクシンイミド(127mg、1.10mmol)で処理した。水性後処理、続いてカラムクロマトグラフィーにより、化合物5056(400mg、0.553mmol、76%)が得られた。C38H38N2O13についての分子量(M+H)+計算値730.24、実測値730.25。
実施例40:合成後方法を用いた新規なGalNAcコンジュゲートの合成
実施例41:siRNA-リガンドコンジュゲート
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲート43527、60148、60146、60142、60133、60139、60134、60132および/または60125は、実施例33に記載されるように、マウス中で試験される。結果が、図1に示される。
実施例42:siRNA-リガンドコンジュゲート
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、示される位置でsiRNAのセンス鎖に結合した。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、示される位置でsiRNAのセンス鎖に結合した。
図4~7は、siRNA-リガンドコンジュゲート56718~56727、56729および55727の結合親和性を示す。
実施例43:siRNA-リガンドコンジュゲート
以下の表中のsiRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、AT3を標的にしていた。以下のリガンドを、示されるように各siRNAのセンス鎖に結合した。
以下の表中のsiRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、AT3を標的にしていた。以下のリガンドを、示されるように各siRNAのセンス鎖に結合した。
実施例44:
表中のsiRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、AT3を標的にしていた。リガンドを、表に示される位置でセンス鎖に結合した。
表中のsiRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、AT3を標的にしていた。リガンドを、表に示される位置でセンス鎖に結合した。
図8および9は、SiRNA-リガンドコンジュゲート56876、66875、56874、66878、56880、56879、54944、56877、56881および/または56882の結合親和性を示す。これらのコンジュゲートのKi値が、以下に報告される。
実施例45:異なるGalNAcリガンドを有するsiRNA(三本鎖誘導体)
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
図10は、72および144時間後の、三本鎖GalNAcリガンド43527、60126、60138、60128、60127、60316、および60123(15mg/kgおよび5mg/kgの用量での)のインビボでの有効性を示す。
実施例46:異なるGalNAcリガンドを有するsiRNA(三本鎖誘導体(1+1+1))
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。
AT3に向けられたsiRNAコンジュゲート(そのうちの2つが実施例30および34に記載される)を調製し、試験した。58137の構造が以下に示される。各コンジュゲートは、同じAT3 siRNA配列を有していた。図11は、三本鎖GalNAcリガンド54944、56881および58137[(1+1+1)設計]のインビボでの有効性を示す。
TTRに向けられたsiRNAコンジュゲートを調製し、試験した。各コンジュゲートは、同じTTR siRNA配列を有していた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。リガンドの表示の左側が、センス鎖の3’末端への結合部位を示す。図12は、三本鎖GalNAcリガンド55727、58138および58139[(1+1+1)設計]のインビボでの有効性を示す。二本鎖55727、58138および58139のためのリガンド設計が、以下に示される。
化合物102の合成:GalNAc酸100(8.39g、18.71mmol)およびヒドロキシプロリンアミン(10.00g、18.77mmol)を一緒にジクロロメタンに入れた。HBTU(10.68g、28.12mmol)およびDIEA(9.80mL、3当量)を加え、混合物を周囲温度で2時間撹拌した。生成物を、薄層クロマトグラフィーによって調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物102が淡黄色のふんわりした固体(11.77g、63%)として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.69(t,J=5.6Hz、1H)、7.39-7.09(m,9H)、6.86(ddd,J=9.0、5.4、2.1Hz、4H)、5.20(d,J=3.4Hz、1H)、5.03-4.83(m,2H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.41-4.07(m,2H)、4.04-3.95(m,3H)、3.86(dt,J=11.2、8.9Hz、1H)、3.79-3.68(m,6H)、3.68-3.36(m,3H)、3.21-2.88(m,5H)、2.26-2.14(m,2H)、2.09(s,3H)、2.02(t,J=6.7Hz、2H)、1.98(s,3H)、1.87(d,J=7.5Hz、3H)、1.76(s,3H)、1.53-1.29(m,7H)。
化合物104の合成:ヒドロキシプロリン誘導体102(6.00g、6.24mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。DIEA(2.20mL、3当量)および2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを加えた。反応混合物を30分間撹拌し、薄層クロマトグラフィーによって調べた。混合物を分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.68(s,1H)、7.42-7.06(m,8H)、7.01-6.73(m,4H)、5.20(d,J=3.3Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2、3.3Hz、1H)、4.63(d,J=4.7Hz、1H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.15(s,1H)、4.01(s,3H)、3.86(d,J=11.0Hz、1H)、3.70(d,J=16.5Hz、9H)、3.45(ddd,J=37.0、23.3、16.4Hz、6H)、2.99(dd,J=12.3、6.4Hz、3H)、2.74(dd,J=9.2、5.8Hz、2H)、2.21(s,2H)、2.09(s,3H)、2.05-1.95(m,5H)、1.88(s,3H)、1.76(s,3H)、1.52-1.16(m,11H)、1.16-1.02(m,11H).31P NMR:δ151.78、151.61、151.50、151.30。
化合物105の合成:化合物102(2.10g、2.18mmol)を、DCM(20mL)に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸(0.441g、4.36mmol)およびDMAP(0.532g、当量)、続いてTEA(1ML)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応物を、薄層クロマトグラフィーによって調べ、次に、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを、無水アセトニトリルに溶解させた。HBTU(1.59g、4.20mmol)およびDIEA(1.10ml)を加え、混合物を5分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸/ピリジン混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、MeOH/DCMおよびエーテル(27.10g、55μmol/g)で再度洗浄した。
化合物101:Z-アミノカプロン酸(22.2g、82.50mmol)をDMF(250mL)に溶解させ、0℃に冷却した。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(44.4mL、275mmol)、HBTU(40.4g、106.7mmol)、およびHOBT(30.0g、220mmol)を加えた。0℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した後、4-ヒドロキシ-L-プロリンメチルエステル塩酸塩(20.0g、110mmol)を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、酢酸エチル(250mL)を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物101(Rf=10%のMeOH/DCM中0.5、24.30g)が得られた。不純物を除去するために、まず2%のメタノール/ジクロロメタン、続いて5%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物101を精製したところ、21.36g(65%)の生成物が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.35(m,5H)、5.15(d,OH、D2O交換可能)、4.99(s,2H)、4.27(m,1H)、3.97(m,1H)、3.58(s,1H)3.20-3.47(m,5H)、2.94-3.02(m,2H)、2.10-2.32(m,2H)、1.74-2.01(m,2H)、1.35-1.4(m,4H)、1.22-1.28(m,4H)。
化合物102:化合物101(21.36g、54.43mmol)をTHF(200mL)に溶解させた。反応混合物を、0℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、水素化ホウ素リチウム(1.19g、54.43mmol)を、0℃で20分間にわたって溶液に加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を0℃に冷却した。過剰な水素化ホウ素リチウムを、5MのNaOH(30mL)でクエンチした。30分間撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、ジクロロメタン(200mL)を加えた。有機層を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物102(Rf=10%のMeOH/DCM中0.4、35.88g)が得られた。不純物を除去するために、3%のメタノール/ジクロロメタン、続いて5%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによってカラムクロマトグラフィーによって化合物102を精製したところ、9.21g(49%)の生成物が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.35(m,5H)、4.99(s,2H)、4.91(d,OH、D2O交換可能)、4.77(t,OH、D2O交換可能)、4.27(m,1H)、3.97(m,1H)、3.20-3.47(m,5H)、2.94-3.02(m,2H)、2.10-2.32(m,2H)、1.74-2.01(m,2H)、1.35-1.4(m,4H)、1.22-1.28(m,4H)。
化合物103:化合物102(9.21g、25.27mmol)を、無水ピリジン(80mL)と2回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。化合物102を、高真空から取り出し、無水ピリジン(200mL)に溶解させた。この溶液に、触媒量のジメチルアミノピリジン(0.35g、2.53mmol)を加えた。反応混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、DMT-Cl(9.0g、26.53mmol)を0℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。過剰なDMT-Clを、メタノール(15mL)の添加によってクエンチした。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン(200mL)を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物103(Rf=100%のEtOAc中0.6、14.02g)が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中50%の酢酸エチル(1%のTEA)、続いて100%の酢酸エチル(1%のTEA)で溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物103を精製したところ、12.36g(73.4%)の生成物が白色の発泡体状の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.17-7.33(m,14H)、4.99(s,2H)、4.91(d,OH、D2O交換可能)、4.37(m,1H)、4.01(m,1H)、3.72(s,6H)3.56(m,1H)3.29(m,1H)、3.14(m,1H)、2.93-3.02(m,4H)、2.18(m,2H)1.74-2.01(m,2H)、1.37-1.41(m,6H)。
化合物104:化合物103(12.36g、18.54mmol)を、10%のメタノール/酢酸エチル(300mL)に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Degussaタイプ(1.3g)に担持された10重量%のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で2回パージし、次に、水素を、10秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで2回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物104(溶離剤DCM中10%のMeOH、9.16g、93%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.15-7.31(m,9H)、6.86(m,4H)4.99(s,1H)、4.37(m,1H)、4.01(m,2H)、3.72(s,6H)3.56(m,1H)3.29(m,1H)、3.14(m,1H)、2.93-3.02(m,2H)、2.45(m,2H)、2.18(m,2H)1.74-2.01(m,2H)、1.37-1.41(m,3H)1.13-1.38(m,4H)。MS:533.4(+H)、555.3(+Na)。
化合物105:化合物104(9.16g、17.2mmol)をジクロロメタン(200mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(4.80mL、34.4mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(3.05mL、25.8mmol)を滴下して加え、混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物105(Rf=0.6 DCM中10%のMeOH、10.89g)が得られた。5%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物105(8.76g、81%)が黄色の発泡体状の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.56-7.09(m,9H)、7.01-6.52(m,4H)、5.34-5.04(m,1H)、4.99-4.78(m,1H)、4.48-4.25(m,2H)、3.83-3.67(m,6H)、3.60-3.50(m,1H)、3.49-3.18(m,2H)、3.16-2.91(m,2H)、2.89-2.56(m,2H)、2.54-2.32(m,2H)、2.32-1.69(m,3H)、1.59-1.03(m,4H)。19F NMR(DMSO-d6):-77.14(s,3F).MS:627.3(-H)、663.3(+Cl)。
化合物106:化合物105(8.76g、13.93mmol)、DMAP(5.10g、41.79mmol)、およびトリエチルアミン(3.90mL、27.86mmol)をジクロロメタン(300mL)に溶解させた。反応混合物を、10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(2.80g、27.86mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を飽和塩化ナトリウム溶液で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物106(Rf=0.9 DCM中10%のMeOH、10.87g、94%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。MS:727.2(-H)、763.2(+Cl)。このように得られたスクシネート(2.00g、2.41mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.68mL、9.64mmol)およびHBTU(1.83g、4.82mmol)を加えた。反応混合物を10分間にわたって振とうした。長鎖アミノアルキル制御多孔質ガラス担体(CPG)(27g)をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。CPG化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタンで洗浄し、続いて、ジクロロメタン中10%のメタノールで2回洗浄し、ジクロロメタン中1%のトリエチルアミン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPGを、ピリジン(100mL)中25%の無水酢酸でキャッピングし、混合物を4時間振とうした。洗浄手順を上記のように繰り返し、化合物を減圧下で乾燥させたところ、CPG 106(28g、67μmol/g)が得られた。
化合物107:化合物105(8.89g、14.14mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(4.93mL、28.28mmol)を無水ジクロロメタン(60mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(5.63mL、16.26mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で30分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物107(Rf=0.44 DCM中5%のMeOH、11.02g)が得られた。DCM中3%のメタノール(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物107(6.31g、54%)が黄色の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ9.37(s,1H)、7.63(d 1H)、7.42-6.98(m,8H)、6.92-6.77(m,4H)、4.25-3.90(m,2H)、3.78-3.64(m,7H)、3.48(d,3H)、3.29(d,1H)、3.23-2.92(m,4H)、2.86(d,1H)、2.73(t,1H)、2.58(t,1H)、2.53-2.47(m,4H)、2.33-1.87(m,4H)、1.55-0.97(m,12H).31P(DMSO-d6):151.68(d,1P)。
化合物118:セリノール116(2.05g、22.5mmol)および化合物117(8.03g、24.75mmol)を、アルゴン下でDMF(120mL)に溶解させた。トリエチルアミン(5.0mL、67.5mmol)を反応混合物に加え、それを室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣を酢酸エチル(120mL)に溶解させた。次に、それを、水(30mL)および飽和塩化ナトリウム(2×50mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物(5.33g、Rf=0.21 DCM中15%のMeOH)を、溶離剤としてジクロロメタン中10%のメタノールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物118(4.98g、78%)が白色の発泡体として得られた。m/z:324.13(+Na)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ9.39(s,2NH、D2O交換可能)、3.34-3.06(m,7H)、3.06-2.91(m,2OH、D2O交換可能)、2.30-2.00(m,2H)、1.97-0.86(m,6H)。13C NMR(101MHz、CD3CN):δ172.18(s)、156.41(s)、117.50(s)、60.30(s)、52.85(s)、38.88(s)、35.35(s)、28.11(s)、25.90(s)、25.29(s)。
化合物119:化合物118(3.70g、12.3mmol)を、無水ピリジン(30mL)と2回同時蒸発させ、次に、高真空下で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン(90mL)に溶解させた。この溶液に、触媒量のDMAP(0.15g、1.23mmol)を加え、混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。DMTr-Cl(4.38g、12.9mmol)を、0℃で溶液に加え、室温で2時間撹拌し続けた。次に、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン(150mL)に溶解させ、水(2×100mL)、続いて飽和塩化ナトリウム(100mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物(6.83g、Rf=DCM中5%のMeOH中の0.44)を、まずジクロロメタン(1%のTEAを含む)、続いてジクロロメタン中3%のメタノール(1%のTEAを含む)で溶離することによって、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物119(2.32g、23%)が白色の発泡体として得られた。m/z:601.2(-1)、637.2(+Cl)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ9.38(s,2NH、D2O交換可能)、7.31-7.13(m,7H)、6.86(d,J=8.9Hz、6H)、4.60(t,J=5.2Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.54-3.23(m,6H)、2.95(ddd,J=36.9、8.8、5.8Hz、1OH、D2O交換可能)、2.08(t,J=7.4Hz、2H)、1.47(tt、J=14.6、7.4Hz、2H)、1.34-1.12(m,4H)。13C NMR(101MHz、CD3CN):δ172.83(s)、158.97(s)、157.28(s)、156.93(s)、146.13(s)、136.82(s)、136.52(s)、130.70(s)、128.68(d,J=4.0Hz)、127.49(s)、118.41(s)、115.54(s)、114.02(s)、86.08(s)、63.66(s)、61.84(s)、55.93(s)、51.77(s)、46.68(s)、40.99(d,J=21.0Hz)、40.72(s)、40.68(s)、40.47(s)、40.26(s)、40.05(s)、39.84(s)、36.31(s)、29.04(s)、26.85(s)、25.95(s)。
化合物120:化合物119(1.0g、1.7mmol)、DMAP(620mg、5.1mmol)、およびトリエチルアミン(0.5mL、3.4mmol)をジクロロメタン(15mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(340mg、3.4mmol)を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈し、飽和塩化ナトリウム(2×25mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物(Rf=0.3 Hex中50%のEtOAc)1.01g(98%)が白色の固体として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。MS:702.3(-H)、737.5(+Cl)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ9.42(t,J=5.2Hz、2NH、D2O交換可能)、7.87(s,1OH、D2O交換可能)、7.47-7.15(m,7H)、6.99-6.74(m,6H)、4.32-3.94(m,3H)、3.90-3.42(m,8H)、3.31-2.72(m,6H)、2.57-2.29(m,2H)、1.30-0.87(m,6H)。
化合物121:スクシネート120(1.0g、1.4mmol)をアセトニトリル(60mL)に溶解させた。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.15mL、5.6mmol)およびHBTU(1.26g、2.8mmol)を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。CPG(14g)をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。CPGをろ過し、ジクロロメタン、ジクロロメタン中10%のメタノール、ジクロロメタンおよび無水ジエチルエーテルで連続して洗浄した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。充填されたCPGを、3時間にわたって25%の無水酢酸/ピリジン(100mL)でキャッピングした。CPGをろ過し、前述されるのと同じ洗浄手順を繰り返した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、高真空下で一晩乾燥させたところ、化合物120(14g、77μmol/g)が得られた。
化合物122:L-トレオニノール(3.54g、33.7mmol)および化合物117(12.0g、37.1mmol)を、アルゴン下でDMF(90mL)に溶解させた。トリエチルアミン(14.0mL、101.1mmol)を反応混合物に加え、それを室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣を酢酸エチル(120mL)に溶解させた。次に、それを、水(50mL)および飽和塩化ナトリウム(2×50mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物(3.60g、Rf=0.43 ヘキサン中50%のEtOAc)を、溶離剤として、ヘキサン中50%の酢酸エチル、続いて、100%の酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物122(3.20g、87%)が黄色の発泡体として得られた。m/z:315.1(+H)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ8.76(t,2NH、D2O交換可能)3.93-3.21(m,1H)、3.21-3.01(m,2OH、D2O交換可能)、3.05-2.83(m,3H)、2.75-2.51(m,1H)、2.55-2.37(m,1H)、2.20-1.98(m,2H)、1.70-1.39(m,7H)、1.28-1.06(m,3H)。13C NMR(101MHz、DMSO-d6):δ176.1(s)、156.3(s)、158.33(s)、65.36(s)、64.20(s)、60.51、38.88(s)、36.34(s)、27.98(s)、25.79(s)、25.70-24.33(m)、20.05(s)。
化合物123:化合物122(3.00g、9.60mmol)を、無水ピリジン(15mL)と2回同時蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン(90mL)に溶解させた。この溶液に、触媒量のDMAP(0.12g、0.96mmol)を加え、混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。DMTr-Cl(3.39g、10.08mmol)を0℃で溶液に加え、室温で2時間にわたって撹拌を続けた。次に、揮発性物質を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン(150mL)に溶解させ、水(2×100mL)、続いて飽和塩化ナトリウム(100mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物(7.02g、Rf=ヘキサン中25%のEtOAc中の0.6)を、まずヘキサン中5%の酢酸エチル(1%のTEAを含む)、続いてヘキサン中15%の酢酸エチル(1%のTEAを含む)で溶離することによって、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物123(700mg、11%)が白色の発泡体として得られた。m/z:615.2(-1)、651.2(+Cl)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ8.76(t,2NH、D2O交換可能)7.87-6.93(m,7H)、6.93-6.63(m,6H)、4.19-3.63(m,10H)、3.61(m,1OH、D2O交換可能)、2.74-1.98(m,4H)、1.71-1.10(m,6H)、1.08-0.76(m,3H).13C NMR(101MHz、DMSO-d6):δ172.12(d,J=9.4Hz)、157.88(d,J=15.4Hz)、145.13(s)、140.22(s)、135.86(d,J=6.4Hz)、131.07-130.03(m)、130.03-129.28(m)、128.90(s)、127.66(d,J=7.1Hz)、127.38(s)、126.45(d,J=9.7Hz)、112.89(d,J=30.1Hz)、85.08(s)、65.00(s)、63.22(d,J=48.5Hz)、54.97(s)、53.72(s)、45.56(s)、40.02(d,J=21.0Hz)、39.85-39.80(m)、39.71(s)、39.50(s)、39.29(s)、39.08(s)、38.88(s)、35.24(s)、28.02(s)、25.86(s)、25.13(d,J=13.6Hz)、21.15(s)、20.20(s)、10.35(s)。
化合物124:化合物123(600mg、1.0mmol)、DMAP(420mg、3.0mmol)、およびトリエチルアミン(0.4mL、2.0mmol)をジクロロメタン(15mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(230mg、2.0mmol)を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物をジクロロメタン(50mL)で希釈し、飽和塩化ナトリウム(2×25mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物124(Rf=0.6 ヘキサン中25%のEtOAc)760mg(99%)が灰色の発泡体として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。MS:715.3(-H)。
化合物125:化合物124(760mg、1.0mmol)をアセトニトリル(60mL)に溶解させた。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.74mL、4.0mmol)およびHBTU(800mg、2.0mmol)を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。CPG(10g)をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。CPGをろ過し、ジクロロメタン、ジクロロメタン中10%のメタノール、ジクロロメタンおよび無水ジエチルエーテルで連続して洗浄した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。充填されたCPGを、3時間にわたってピリジン(100mL)中25%の無水酢酸でキャッピングした。CPGをろ過し、前述されるのと同じ洗浄手順を繰り返した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、高真空下で一晩乾燥させたところ、化合物125(10.2g、.71μmol/g)が得られた。
化合物128:化合物127(5.0g、12.5mmol)および炭酸水素ナトリウム(4.2g、25mmol)を、ジクロロメタン(250mL)中で混合した。反応混合物を室温で5分間撹拌した。次に、メタクロロ過安息香酸(16g、31.25mmol)を加え、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を、重亜硫酸ナトリウム(500mg)の添加によってクエンチし、室温で30分間撹拌させた。反応混合物を、水、飽和重炭酸塩溶液、水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、化合物128(Rf=0.25 ヘキサン中5%のEtOAc)(5.06g、97.3%)が黄色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.48-7.08(m,7H)、6.88(t,J=5.9Hz、6H)、3.74(d,J=19.4Hz、3H)、3.32(s,6H)、3.04-2.77(m,1H)、2.65-2.35(m,2H)、1.69-1.09(m,6H)。
化合物129:化合物128(5.0g、9.56mmol)をエタノール(15mL)に溶解させた。水(3mL)中30%の水酸化アンモニウムを反応混合物に加え、それを、一晩、圧力容器中の油浴中で、85℃で撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、次に、トルエン(10mL)と2回同時蒸発させた。次に、化合物をジクロロメタン(50mL)と同時蒸発させたところ、粗化合物129(Rf=0.1 ヘキサン中25%のEtOAc、5.48g)が褐色の油として得られ、それを精製せずに使用した。
化合物130:化合物129(5.48g、粗材料)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(4.0mL、19.1mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(5.0mL、28.7mmol)を10℃で滴下して加えた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。次に、反応混合物を、水で2回、続いて飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物130(Rf=0.43 50%のEtOAc/Hex、6.12g)が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中5%の酢酸エチル(1%のTEA)、続いて、さらなる不純物から生成物を溶離するために、ヘキサン中10%の酢酸エチル(1%のTEA)で溶離することによる、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる化合物130の精製により、1.51g(化合物129から30%)が白色の発泡体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.69-7.12(m,7H、1NH、D2O交換可能)、7.10-6.70(m,6H)、4.12-3.48(m,9H、1OH、D2O交換可能)、3.29(dd,J=19.7、12.9Hz、2H)、2 1.57-1.17(m,6H).13C NMR(101MHz、DMSO-d6):δ157.97(s)、156.56(s)、156.20(s)、145.27(s)、136.08(s)、129.58(s)、127.69(d,J=7.7Hz)、126.51(s)、117.45(s)、114.58(s)、113.09(s)、85.15(s)、67.93(s)、62.78(s)、54.96(s)、45.67(s)、40.13(s)、39.92(s)、39.71(s)、39.50(s)、39.30(s)、39.09(s)、38.88(s)、34.28(s)、29.51(s)、21.92(s)。
化合物131:化合物130(1.49g、2.8mmol)、DMAP(1.02g、8.4mmol)、およびトリエチルアミン(0.8mL、5.6mmol)をジクロロメタン(30mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(600mg、5.6mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈し、次に、2回分の50mLの分量のわずかに飽和した塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物131(Rf=0.24 ヘキサン中25%のEtOAc)(1.77g、99%)が白色の発泡体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物132:化合物131(1.77g、2.8mmol)をアセトニトリル(120mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.95mL、11.2mmol)およびHBTU(2.13、5.6mmol)を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。CPG(26g)をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。反応混合物を、焼結漏斗上にデカントし、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタンで洗浄し、続いて、ジクロロメタン中10%のメタノールで2回洗浄し、ジクロロメタン中1%のトリエチルアミン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置き、次に、それを、ピリジン(200mL)中25%の無水酢酸でキャッピングし、混合物を3時間にわたって振とうした。次に、反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、一晩、高真空下に置いた。(27g、83μmol/g)。
化合物134:5-ヘキセノール(6.0mL、50.5mmol)およびアジ化ナトリウム(17g、252.5mmol)を、DMF(120mL)に溶解させた。この溶液に、トリエチルアミン(14mL、151.5mmol)を加えた。反応混合物を10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、メタンスルホニルクロリド(4.25mL、50.5mmol)を、20分間にわたって溶液に滴下して加えた。室温で2日間にわたってアルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を氷水中にデカントし、次に、それを、5×50mLの分量のジエチルエーテルで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物134(Rf=5%のMeOH/DCM中の0.67、6.0g)が得られた。不純物を除去するために、まずジクロロメタン、続いて2%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによる、カラムクロマトグラフィーによる化合物134の精製により、4.6g(72%)の透明の液体が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ5.78(ddt,J=16.9、10.2、6.6Hz、1H)、5.16-4.74(m,2H)、2.68-2.14(m,2H)、1.64-1.27(m,4H)、1.24-0.92(m,2H)。
化合物135:化合物134(4.5g、25.5mmol)を、耐圧瓶(pressure bottle)中でDMF(100mL)に取り込んだ。この混合物に、NaN3(10g)を加え、混合物を80℃で一晩加熱した。次に、固体をろ過によって除去した。揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去したところ、化合物134134が淡黄色の液体(3.6g、82%)として得られた。m/z:132.1(-N2)。
化合物136:化合物135(2.0g、16mmol)およびN-メチルモルホリン-N-オキシド(2.25g、19.2mmol)を、アセトン(60mL)中10%の水に溶解させた。反応物を室温で5分間撹拌した。次に、アセトン(1.3mL、0.16mmol)中10%の水中の四酸化オスミウムを加え、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物をCelite上にデカントし、2回分の50mLの分量のアセトンで洗浄した。反応混合物を蒸発乾固させ、次に、100mLの酢酸エチルに溶解させた。有機層を、50mLの分量の1NのHClで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、化合物136 1.70g(67%)が褐色の液体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物137:化合物136(1.5g、9.40mmol)を、無水ピリジン(10mL)と2回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。次に、化合物を高真空から取り出し、無水ピリジン(60mL)に溶解させた。この溶液に、触媒量のDMAP(0.11g、.94mmol)を加えた。反応混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、DMT-Cl(3.35g、10.06mmol)を0℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、1.5時間にわたって室温で、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン(100mL)を加えた。有機層を、水で2回、続いて飽和塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物137(Rf=0.8 1:1のEtOAc/ヘキサン、5.3.3g)がオレンジ色の油として得られ、それを精製せずに使用した。
化合物138:化合物137(3.3g、粗材料)およびトリフェニルホスフィン(1.7g、6.48mmol)を、テトラヒドロフランに溶解させた。反応混合物を室温で5分間撹拌した。次に、水(1mL)を加え、混合物を室温で一晩撹拌し続けた。反応の完了がTLCによって観察されたら、反応混合物を蒸発乾固させ、次に、トルエンと同時蒸発させた。反応混合物をジクロロメタン(60mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(1.5mL、10.75mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(6.5mL、54.0mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和重炭酸塩溶液、水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物138(Rf=0.5 50%のEtOAc/Hex、3.40g)が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中5%の酢酸エチル、続いてヘキサン中15%の酢酸エチルで溶離することによる、カラムクロマトグラフィーによる化合物の精製により、2.1g(化合物136から42%)が黄色の油として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ9.36(s,1NH、D2O交換可能)、7.47-7.14(m,7H)、6.87(d,J=8.8Hz、6H)、3.86-3.48(m,7H)、3.33(s,1OH、D2O交換可能)、3.13(dd,J=12.1、6.4Hz、4H)、1.54-1.06(m,6H).19F NMR(376MHz、DMSO-d6):δ-82.54(s).13C NMR(101MHz、DMSO-d6):δ161.42(s)、159.73(s)、159.37(s)、148.65(s)、139.41(d,J=6.7Hz)、136.65(s)、135.74-135.30(m)、134.92(d,J=9.8Hz)、133.16(s)、132.18(d,J=11.8Hz)、131.18(d,J=6.0Hz)、129.96(s)、116.51(s)、88.50(s)、72.39(s)、71.10(s)、63.20(s)、58.43(s)、43.58(s)、43.37(s)、43.16(s)、42.95(s)、42.80-42.53(m)、42.33(s)、36.88(s)、31.79(s)、25.67(s)、17.51(s)。
化合物139:化合物138(1.0g、1.9mmol)、DMAP(700mg、5.7mmol)、およびトリエチルアミン(0.55mL、3.8mmol)をジクロロメタン(20mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(380mg、3.8mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン(50mL)で希釈し、次に、2回分の25mLの分量のわずかに飽和した塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物139(溶離剤1:1のEtOAc/ヘキサン)1.18g(99%)がピンク色の油として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。
化合物140:化合物139(1.18g、1.9mmol)をアセトニトリル(60mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.3mL、7.6mmol)およびHBTU(1.43g、3.8mmol)を加えた。全ての内容物が溶解されるまで、反応混合物を回転させた。CPG(12g)をフラスコに加え、混合物を一晩振とうした。CPG化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、ジクロロメタン中1%のトリエチルアミンで洗浄し、続いて、10%のメタノール/ジクロロメタンで2回洗浄し、ジクロロメタン中1%のトリエチルアミン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPGを1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPGを、25%の無水酢酸/ピリジン(100mL)でキャッピングし、混合物を3時間にわたって振とうした。反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。このように得られたCPG 140を、1時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、一晩、高い真空下に置いた(12g、77μmol/g)。
化合物142:DCM中の(R)-グリシドール(2.3g、31mmol)の撹拌溶液に、トリエチルアミン(5mL、36.5mmol)を加えた後、室温でDCM中のDMTrCl(10.66g、31.5mmol)の1Mの溶液を加えた。TLCによって示される出発材料がなくなるまで、反応物を撹拌させた。数滴のMeOHを加えて、未反応のDMTrClを加水分解し、混合物を10分間撹拌した。生成物を、H2O、塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。生成物を、ヘキサン/EtOAc(9:1)の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、6g(52%)の純粋な生成物142が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ7.38(d,J=7.6Hz、2H)、7.31(t,J=7.6Hz、2H)、7.27-7.12(m,5H)、6.87(d,J=6.1Hz、4H)、3.72(s,6H)、3.24(dd,J=10.9、2.4Hz、1H)、3.15-3.08(m,1H)、2.86(dd,J=10.9、6.0Hz、1H)、2.70(t,J=4.6Hz、1H)、2.54(m,1H).13C NMR(101MHz、DMSO-d6):δ158.07、144.75、135.48、135.45、129.60、127.85、127.59、126.69、113.46、113.21、85.46、64.52、55.01、50.37、43.59。
化合物144:DMFに溶解され、90℃に加熱されたN1,N6-ジメチルヘキサン-1,6-ジアミン143(4.225g、29mmol)およびK2CO3(0.15g、1mmol)の撹拌溶液に、化合物142(5.06g、13.5mmol)を滴下して加えた。化合物142が残らなくなるまで反応混合物を一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、DCMで抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、DCM(2.5%のNEt3)MeOH(30%)の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、7.8g(63%)の純粋な化合物144が得られた。1H NMR(500MHz、DMSO-d6):δ7.40(d,J=7.6Hz、2H)、7.35-7.14(m,7H)、6.88(d,J=8.5Hz、4H)、4.12(s,1H)、3.80-3.64(s,6H)、3.37(m,2H)、3.11-2.89(m,5H)、2.85(dt,J=15.1、7.6Hz、1H)、2.82-2.76(m,2H)、2.69(s,3H)、2.48-2.38(s,3H)、1.61(m,4H)、1.28(m,4H).13C NMR(DMSO-d6):δ158.03、144.82、135.54、135.48、129.72、127.79、127.69、126.63、113.15、85.41、65.77、64.74、58.49、55.03、54.92、52.02、47.83、45.17、40.00、39.92、39.83、39.76、39.66、39.50、39.33、39.16、39.00、32.11、25.50、25.40、24.99、23.29、8.37、7.23。
化合物146:(OBz)GalNAc酸145(6.95g、13.3mmol)、HOBt(3.59g、26.6mmol)、HBTU(5.04g、13.3mmol)、およびDIPEA(5mL、28.5mmol)を、15分間にわたって無水DMF(80mL)中で撹拌した。この溶液に、化合物144を加えた。出発材料が残らなくなるまで、混合物を45分間撹拌した。生成物を酢酸エチル(100ml)に溶解させ、有機層を、H2O、飽和NaHCO3、塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、次に、EtOAc(1%のNEt3):MeOH(15%)の勾配を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、5.35g(36%)の純粋な化合物146が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6):δ8.08-7.85(m,4H)、7.82-7.11(m,20H)、6.86(d,J=8.8Hz、4H)、5.76(d,J=3.3Hz、1H)、5.36(dt,J=26.7、13.3Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.61-4.40(m,3H)、4.32(ddd,J=25.2、16.9、9.1Hz、2H)、3.88-3.60(m,1H)、3.71(s,6H)、3.63-3.45(m,1H)、3.18(dd,J=14.6、7.4Hz、2H)、3.03-2.81(m,4H)、2.74(s,3H)、2.42-2.29(m,1H)、2.31-2.12(m,5H)、2.07(s,3H)、1.69(s,3H)、1.60-0.99(m,12H).13C NMR(DMSO-d6):δ171.45、171.37、170.36、170.29、169.32、165.19、165.14、164.86、157.91、145.23、145.22、136.01、135.98、133.75、133.49、133.45、129.70、129.57、129.20、129.15、129.02、128.99、128.95、128.68、128.57、127.78、127.62、126.45、113.10、112.98、100.85、85.01、71.88、69.98、68.80、68.73、67.94、67.72、66.39、63.45、62.08、60.72、59.72、57.68、57.64、54.96、54.88、49.72、48.89、46.60、42.83、40.09、40.00、39.92、39.83、39.76、39.67、39.59、39.50、39.33、39.17、39.00、34.67、32.69、32.17、31.51、30.14、28.65、28.54、27.90、26.76、26.74、26.48、26.22、26.06、22.67、21.41、21.11、20.73、20.69、18.58、14.06、13.52。
化合物147:DCM中の化合物146(1.136g、1mmol)およびDIPEA(1mL、6mmol)の撹拌溶液に、無水コハク酸(220mg、2.2mmol)を加えた。出発材料が残らなくなるまで、反応物を一晩撹拌した。生成物を、H2O、次に塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させたところ、850mg(69%)の化合物147が得られた。1H NMR(500MHz、DMSO-d6):δ8.11(dd,J=15.3、9.3Hz、1H)、7.98-7.84(m,4H)、7.73-7.16(m,19H)、6.87(d,J=8.7Hz、4H)、5.74(d,J=3.1Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、2.6Hz、1H)、5.01(s,1H)、4.76(dd,J=8.5、2.6Hz、1H)、4.45(m,2H)、4.37-4.23(m,2H)、3.71(s,6H)、3.54(dd,J=13.7、10.4Hz、1H)、3.21-3.02(m,4H)、3.02-2.93(m,4H)、2.87(s,2H)、2.73(s,1H)、2.55-2.30(m,8H)、2.30-2.12(m,5H)、2.07(s,3H)、1.68(s,3H)、1.58-1.07(m,8H).13C NMR(126MHz、DMSO-d6):δ173.83、172.03、171.45、171.38、169.31、165.19、165.13、164.85、158.01、144.84、135.54、133.74、133.45、129.57、129.19、129.14、129.02、128.99、128.94、128.67、128.56、127.75、127.59、126.59、113.10、100.84、85.14、71.92、70.73、69.97、68.72、67.93、63.16、62.09、57.39、57.33、56.90、54.97、49.69、48.89、47.86、46.59、42.65、40.00、39.92、39.83、39.76、39.67、39.59、39.50、39.33、39.16、39.00、38.23、34.68、32.72、32.68、32.15、31.49、30.09、29.89、29.84、28.62、28.53、27.89、26.72、26.34、26.16、26.01、22.66、21.40、21.09、20.46、16.64。
化合物148:化合物147(0.85g、0.64mmol)、CPG(5g、0.67mmol)、HBTU(0.485g、1.3mmol)、およびDIPEA(0.4mL、2mmol)をアセトニトリルに溶解させ、2時間にわたって振とうした。生成物をろ過し、DCM、DCM:MeOH(9:1)の溶液で洗浄し、次に乾燥させた。次に、固体を、キャッピングのために3時間にわたってピリジン:無水酢酸(35%)の溶液を用いて振とうした。生成物をろ過し、DCM、DCM:MeOH(9:1)、ヘキサン、DCMで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させたところ、5.2g(70.4μmol/gの充填量)の化合物148が得られた。
化合物149:化合物146(2.3g、2.025mmol)を、ピリジン中で(3回)共沸して、全ての水分を確実に除去し、この時点以降、アルゴン下に保った。使用される全ての溶媒をアルゴンで脱気した。0℃でピリジン中の化合物4およびDIPEA(1.3mL、7.2mmol)の撹拌溶液に、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(1g、4.2mmol)を加えた。TLCが全ての出発材料の消失を示すまで混合物を撹拌した。反応混合物を濃縮し、EtOAc:NEt3(1%):DCM(20%)の溶液に溶解させ、全ての塩をろ過して取り除くために、EtOAc:NEt3(3%):DCM(25%)を用いたシリカゲルの急速ろ過カラムに通した。ろ液を濃縮し、EtOAcに再度溶解させ、生成物がオイルアウト(oiled out)するまでヘプタンを加えた。上清層をデカントし、生成物を濃縮した。生成物をEtOAcに再度溶解させ、生成物が沈殿するまで0℃のヘプタンの溶液に滴下して加えた。ヘプタンをデカントし、固体を乾燥させたところ、2.2g(79%)の化合物149が得られた。31P NMR(162MHz、CD3CN)δ148.03、147.94。1H NMR(400MHz、CD3CN):δ8.00-7.95(m,4H)、7.80-7.76(m,2H)、7.69-7.42(m,10H)、7.38-7.18(m,10H)、6.89-6.66(m,5H)、5.83(d,J=3.0Hz、1H)、5.45-5.37(m,1H)、4.80(d,J=8.6Hz、1H)、4.51(ddd,J=10.7、6.4、2.3Hz、1H)、4.41-4.31(m,3H)、3.77-3.75(m,5H)、3.31-3.07(m,4H)、2.93-2.34(m,8H)、2.32-2.18(m,5H)、2.14(m,4H)、1.94(dt,J=4.9、2.5Hz、3H)、1.77-1.73(m,3H)、1.64-1.56(m,4H)、1.36-1.10(m,16H)、1.09(d,J=6.8Hz、2H)、0.99(d,J=6.2Hz、1H).13C NMR(101MHz、CD3CN):δ173.16、171.09、166.76、166.71、166.43、159.80、159.75、146.11、137.19、136.98、136.93、134.74、134.45、134.36、131.12、131.06、130.87、130.59、130.56、130.50、130.46、130.38、129.94、129.66、129.59、129.16、129.07、128.97、128.90、128.84、128.78、127.96、127.90、118.73、118.37、114.19、114.14、114.06、114.01、101.98、87.45、87.15、73.13、71.75、70.13、69.21、63.22、59.00、56.00、55.98、51.70、50.42、48.02、46.06、43.01、42.79、35.70、33.56、32.93、32.69、29.84、29.75、29.19、28.25、28.09、27.96、27.87、27.50、27.36、25.12、23.48、23.31、23.18、22.55、22.28、20.94、20.89、20.66、14.47、2.21、2.02、1.81、1.61、1.40、1.19、0.99、0.89、0.78。
3,4-ジ-アセチル-6-メシルGalNAcエステル2:無水DCM(20mL)中の6-ヒドロキシ誘導体1(2.00g、4.3mmol)の溶液に、Ar雰囲気下でDIEA(1.2mL、6.5mmol)、および塩化メシル(0.5mL、6.5mmol)を連続して加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次に、5%のNaCl水溶液(60mL)の添加によってクエンチした。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。残渣を、無水ACNと1回同時蒸発させ、残りの発泡体状の非晶質固体を、高真空下で一晩乾燥させたところ、2.38g(定量的)の粗化合物2が得られ、それをさらに精製せずに次の工程に使用した。MS(AcOEt中):(+)モード:484(M-t-Bu);(-)モード:598(M+AcOH)。1H1 NMR(400MHz)、DMSO-d6、J(Hz):1.38(s,9H);1.47(m,4H);1.76(s,3H);1.88(s,3H);2.10(s,3H);2.16(t,2H、J=7.1);3.18(s,3H);3.41(m,1H)、3.71(m,1H);3.87(q,1H、J=8.9);4.10(m,1H);4.19(m,2H);4.50(d,1H、J=8.5);4.96(dd,1H、J1=3.4、J2=11.2);5.25(d,1H、J=2.8);1.80(d,1H、J=9.2)。
非保護6-メシルGalNAcエステル3:無水MeOH(10mL)中の3,4-ジアセチル誘導体2(1.29g、2.2mmol)の低温の(0℃)溶液に、アルゴン雰囲気下で、MeOH(0.05mL、0.22mmol)中のMeONaの25重量%の溶液を加えた。混合物を0℃で2.5時間撹拌し、トリエチルアミン塩酸塩(34mg、0.25mmol)の添加によってクエンチし、減圧下で蒸発させたところ、1.20g(定量的)の粗化合物3が得られ、それをさらに精製せずに次の工程に使用した。MS(MeOH中):(+)モード:400(M-t-Bu);(-)モード:490(M+Cl)。H1 NMR(400MHz)、DMSO-d6、J(Hz):1.37(s,9H);1.46(m,4H);1.78(s,3H);2.16(t,2H、J=7.5);3.17(s,3H);3.36(m,1H)、3.46(m,1H);3.67(m,4H);4.28(m,3H);4.72(d,1H、J=6.2);4.85(d,1H、J=4.0);7.63(d,1H、J=9.0)。
3,4-イソプロピリデン-6-メシルGalNAcエステル4:粗化合物3(1.20g、2.2mmol)を含有する前の工程からの残渣を、2,2-ジメトキシプロパン(10mL)とアセトン(2mL)との混合物に溶解させた後、メタンスルホン酸(2滴)を加えた。混合物を室温で2.5時間撹拌し、トリエチルアミン(4滴)の添加によって中和し、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウムとに分液した。有機相を分離し、飽和NaClで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、残渣を無水ACNと同時蒸発させ、高真空下で乾燥させたところ、1.10g(定量的)の粗化合物4が得られ、それをさらに精製せずに次の工程に使用した。MS(AcOEt中):(+)モード:496(M)、440(M-t-Bu);(-)モード:530(M+Cl)、554(M+AcOH);H1 NMR(400MHz)、DMSO-d6、J(Hz):1.23(s,3H);1.38(s,9H);1.40(s,3H);1.46(m,4H);1.79(s,3H);2.16(t,2H、J=7.0);3.21(s,3H);3.67(m,1H)、3.55(m,1H);3.68(m,1H);4.14(m,3H);4.27(dd,1H、J1=8.4、J2=10.7);4.36(d,1H、J=8.7);4.42(dd,1H、J1=3.3、J2=10.9);7.86(d,1H、J=9.0)。
6-(1-イミダゾリル)エステル5a:無水DMA(3mL)中のメシレート化合物4(200mg、0.4mmol)、イミダゾール(136mg、2mmol)、およびDBU(0.075mL、0.5mmol)の溶液を、23時間にわたって140℃でおよびアルゴン雰囲気下で加熱した。混合物を室温に冷まし、飽和塩化アンモニウムと水(40mL)との1:1混合物で希釈し、AcOEtで抽出した。有機相を分離し、飽和塩水で2回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させ、残渣を、AcOEt中のMeOH(0~50%)の勾配を用いてシリカゲルのカラム上でクロマトグラフィーにかけたところ、74mg(40%)の化合物5aが得られた。MS(AcOEt中):(+)モード:468(M);(-)モード:502(M+Cl)、526(M+AcOH)。1H NMR(400MHz)、ACN-d3、J(Hz):1.29(s,3H);1.41(s,9H);1.48(s,3H);1.50(m,4H);1.85(s,3H);2.16(t,2H、J=7.0);3.31(dt,1H、J1=6.2、J2=10.0);3.64(m,2H);3.99(m,1H);4.03(dd,1H、J1=2.0、J2=5.1);4.20(m,3H);4.30(d,1H、J=8.8);6.67(d,1H、J=9.2);6.92(sスプリット,1H);7.08(sスプリット,1H);7.52(sスプリット,1H)。
6-(3-[3-メトキシフェニル]-イミダゾリル-1)エステル5b:無水DMA(4mL)中のメシレート化合物4(300mg、0.6mmol)、2-(3-メトキシフェニル)イミダゾール(520mg、3mmol)、およびDBU(0.14mL、0.9mmol)の溶液を、76時間にわたってアルゴン雰囲気下で、140℃で加熱した。混合物を室温に冷まし、飽和塩化アンモニウムと水(40mL)との1:1混合物で希釈し、AcOEtで抽出した。有機相を分離し、5%のNaCl水溶液、飽和NaClで連続して洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、AcOEt中のMeOH(0~30%)の勾配を用いてシリカゲルのカラム上でクロマトグラフィーにかけたところ、63mg(18%)の化合物5bが得られた。MS(AcOEt中):(+)モード:574(M);(-)モード:608(M+Cl)、532(M+AcOH)。1H NMR(400MHz)、ACN-d3、J(Hz):1.31(s,3H);1.40(s,9H);1.47(m,4H);1.50(s,3H);1.85(s,3H);2.13(t,2H、J=7.1);3.33(m,1H);3.65(m,2H);3.80(s,3H);4.03(m,1H);4.08(dd,1H、J1=2.1、J2=5.2);4.20(m,3H);4.32(d,1H、J=8.8);6.48(d,1H、J=9.2);6.77(ddd,1H、J1=1.2、J2=2.5、J3=8.1);7.52(t,1H、J=8.2);7.33(m,2H);7.48(d,1H、J=1.3);7.56(d,1H、J=1.3)。
脱保護されたイミダゾリル誘導体6aおよび6b:保護された誘導体5aまたは5b(0.11mmol)を98%のギ酸(2mL)に溶解させ、水(0.05mL)を加えた。溶液を室温で一晩置いておき、ギ酸を減圧下で蒸発させ、残渣を、エタノールとトルエン(6mL)との1:1混合物と2回同時蒸発させた。残渣をメタノール(3mL)に溶解させ、トリエチルアミン(0.15mL)を加え、溶液を65℃で4時間撹拌した。メタノールを減圧下で除去し、残渣を、3mLのピリジンと3回同時蒸発させたところ、それぞれ49および73mgの粗化合物6aおよび6bが得られた。生成物を、アセトニトリル-メタノール混合物からの結晶化によってさらに精製した。6a:MS(MeOH中):(+)モード:472(MH+);(-)モード:370(M-H+)。1H NMR(400MHz)、DMSO-d6、J(Hz):1.44(m,4H);1.78(s,3H);2.17(t,2H、J=7.0);3.26(m,1H);3.43(dd,1H、J1=3.0、J2=10.6);3.51(d,1H、J=2.8);3.57(m,2H);3.70(q,1H、J=10.4);4.11(m,2H);4.18(d,1H、J=8.4);6.86(s,1H);7.14(s,1H);7.59(m,2H);12.0(sブロード,COOH).6b:MS(MeOH中):(+)モード:478(MH+);(-)モード:476(M-H+).H1 NMR(400MHz)、DMSO-d6、J(Hz):1.44(m,4H);1.78(s,3H);2.16(t,2H、J=7.0);3.28(m,1H);3.45(m,1H);3.55(sブロード,1H);3.62(m,2H);3.71(m,1H);3.76(s,3H);4.15(m,2H);4.22(d,1H、J=8.4);4.71(sブロード,1H、OH);4.92(sブロード,1H、OH);6.73(ddd,1H、J1=1.4、J2=2.5、J3=8.0);7.23(t,1H、J=8.0);7.28(m,2H);7.63(m,3H)、12.0(sブロード,COOH)。
ヒスタミン誘導体8:無水DCM(3mL)およびピリジン(0.05mL)中のNHSエステル化合物7(200mg、0.33mmol)およびヒスタミン塩基(52mg、0.47mmol)の懸濁液を、室温で5日間撹拌した。反応を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の添加によってクエンチし、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機相を分離し、飽和塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。生成物化合物8を、DCM中のMeOH(0~30%)の勾配を用いたシリカゲルにおけるカラムクロマトグラフィーによって単離した。収量:64mg、32%。MS(MeOH中):(+)モード:599(M);(-)モード:633(M+Cl)。1H NMR(400MHz)、ACN-d3、J(Hz):1.41(s,9H);1.54(m,4H);1.83(s,3H);1.91(s,3H);2.09(s,3H);2.18(t,2H、J=7.0);2.69(t,2H、J=6.5);3.29(m,2H);3.47(m,1H);3.78(m,1H);3.87(t,1H、J=6.3);3.94(q,1H、J=11.0);4.04(m,2H);4.51(d,1H、J=8.5);5.00(dd,1H、J1=3.2、J2=11.2);5.26(d,1H、J=2.9);5.91(sブロード,1H);6.40(d,1H、J=9.4);6.81(sブロード,1H);7.49(sブロード,1H)。
脱保護されたヒスタミン誘導体9:98%のギ酸(2mL)中の保護されたヒスタミン誘導体8(63mg、0.11mmol)の溶液を、一晩室温に保ち、次に、トルエン(10mL)で希釈し、減圧下で蒸発させた。残渣を、MeOH-ACN混合物と1回、およびMeOH-ピリジン混合物と1回同時蒸発させた。生成物を高真空下で乾燥させ、メタノール(3mL)に溶解させ、トリエチルアミン(0.3mL)を加えた。混合物を65℃で一晩撹拌し、ろ過し、蒸発させ、残渣を、ピリジン(3mL)と3回、ACN(5mL)と1回同時蒸発させ、高真空下で乾燥させたところ、50mg(定量的)の化合物9が非常に吸湿性の白色の固体として得られた。MS(MeOH中):(-)モード:457(M-H).1H NMR(400MHz)、DMSO-d6、J(Hz):1.46(m,4H);1.78(s,3H);2.18(t,2H、J=7.3);2.61(t,2H、J=7.6);3.18(q,2H、J=6.9);3.34(m,2H);3.44(dd,1H、J1=3.0、J2=10.6);3.51(t,1H、J=5.8);3.60(d,1H、J=2.4);3.68(m,2H);4.04(d,2H、J=5.8);4.23(d,1H、J=8.4);4.67(sブロード,2H);6.77(s,1H);7.23(t,1H、J=5.5);7.52(s,1H);7.60(d,1H、J=9.0);12.01(sブロード,2H)。
化合物102の合成:化合物101(5g、22.6mmol)を、16時間にわたって5-ヘキセン-1-オール(80mL)および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート(0.5mL)とともに100℃で加熱した。Et2Oを用いた研和により、化合物102(4.0g、13.2mmol、58%)が得られた。C14H26NO6についての分子量(M+H)+計算値304.1760、実測値304.2。
化合物103の合成:化合物102(1.48g、4.88mmol)を、ピリジン(30mL)およびAc2O(10mL)中で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物103(1.48g、3.45mmol、70%)が得られた。C20H32NO9についての分子量(M+H)+計算値430.2077、実測値430.2。
化合物104の合成:化合物103(1.37g、3.19mmol)を、64時間にわたってジオキサン(13.7mL)およびフタル酸水素カリウム緩衝液(54.8mL、pH=4)中のカンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)に由来するリパーゼ(3.43g)で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物104(680mg、1.76mmol、55%)が得られた。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ5.85-5.75(m,1H)、5.59(d,J=9.7Hz、1H)、5.33-5.32(m,1H)、5.21(dd,J=11.3Hz、3.2Hz、1H)、5.06-4.96(m,2H)、4.86(d,J=3.7Hz、1H)、4.63-4.57(m,1H)、4.01(td、J=6.5Hz、1.2Hz、1H)、3.73-3.62(m,2H)、3.51-3.39(m,2H)、2.19(s,3H)、2.12-2.06(m,2H)、2.02(s,3H)、1.96(s,3H)、1.66-1.59(m,2H)、1.49-1.41(m,2H)。
化合物105の合成:化合物104(747mg、1.74mmol)を、18時間にわたってTHF(17mL)中のトリフェニルホスフィン(913mg、3.48mmol)、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(0.674mL、3.48mL)およびジフェニルホスホリルアジド(0.752mL、3.48mL)で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物105(752mg、定量的)が得られた。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ5.85-5.75(m,1H)、5.56(d,J=9.7Hz、1H)、5.30(d,J=2.7Hz、1H)、5.15(dd,J=11.3、3.3Hz、1H)、5.05-4.97(m,2H)、4.88(d,J=3.7Hz、1H)、4.60-4.54(m,1H)、4.06(dd,J=8.8、3.6Hz、1H)、3.77-3.71(m,1H)、3.49-3.40(m,2H)、3.13(dd,J=12.8、4.1Hz、1H)、2.17(s,3H)、2.12-2.07(m,2H)、1.99(s,3H)、1.96(s,3H)、1.65-1.60(m,2H)、1.50-1.44(m,2H)。
化合物106の合成:化合物105(730mg、1.77mmol)を、18時間にわたってCH2Cl2(5mL)およびCH3CN(5mL)およびH2O(7mL)中の塩化ルテニウム(III)水和物(18mg、0.089mmol)および過ヨウ素酸ナトリウム(1.89g、8.85mL)で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物106(677mg、1.57mmol、89%)が得られた。C17H27N4O9についての分子量(M+H)+計算値431.1778、実測値431.1。
化合物107の合成:化合物106(200mg、0.465mmol)を、18時間にわたってCH2Cl2(3mL)中のN-ヒドロキシスクシンイミド(80mg、0.698mmol)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(134mg、0.698mmol)およびDIEA(0.244mL、1.40mmol)で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物107(183mg、0.347mmol、75%)が得られた。C21H30N5O11についての分子量(M+H)+計算値528.1942、実測値528.1。
化合物108の合成:MeOH(2mL)中の化合物106(227mg、0.527mmol)および3-エチニルアニソール(0.080mL、0.632mmol)の溶液に、H2O(0.1mL)中のTHPTA(11mg、0.0264mmol)およびCuSO4.5H2O(1.3mg、0.00527mmol)の溶液およびH2O(0.1mL)中のアスコルビン酸ナトリウム(10mg、0.0527mmol)の溶液を加えた。反応混合物を室温で18時間撹拌した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物108(264mg、0.469mmol、89%)が得られた。C26H35N4O10についての分子量(M+H)+計算値563.2353、実測値563.2。
化合物109の合成:化合物108(233mg、0.414mmol)を、18時間にわたってCH2Cl2(4mL)中のN-ヒドロキシスクシンイミド(72mg、0.621mmol)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(119mg、0.621mmol)およびDIEA(0.216mL、1.24mmol)で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物109(100mg、0.152mmol、37%)が得られた。C30H38N5O12についての分子量(M+H)+計算値660.2517、実測値660.2。
化合物110の合成:MeOH(2mL)中の化合物106(223mg、0.518mmol)および2-メチル-8-(プロパ-2-イン-1-イルオキシ)キノリン(123mg、0.622mmol)の溶液に、H2O(0.1mL)中のTHPTA(11.2mg、0.0259mmol)およびCuSO4.5H2O(1.3mg、0.00518mmol)の溶液およびH2O(0.1mL)中のアスコルビン酸ナトリウム(10.3mg、0.0518mmol)の溶液を加えた。反応混合物を室温で18時間撹拌した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物110(320mg、0.510mmol、98%)が得られた。C30H38N5O10についての分子量(M+H)+計算値628.2619、実測値628.2。
化合物111の合成:化合物110(307mg、0.489mmol)を、18時間にわたってCH2Cl2(4mL)中のN-ヒドロキシスクシンイミド(85mg、0.734mmol)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(141mg、0.734mmol)およびDIEA(0.256mL、1.47mmol)で処理した。水性後処理およびシリカゲルカラムによる精製により、化合物111(155mg、0.207mmol、42%)が得られた。C34H41N6O12についての分子量(M+H)+計算値725.2782、実測値725.1。
化合物112の合成:化合物106(240mg、0.558mmol)を、5日間にわたってMeOH(9mL)およびEt3N(1mL)中で処理したところ、化合物112(250mg、0.558mmol、定量的)が得られた。C13H23N4O7についての分子量(M+H)+計算値347.1567、実測値347.1。
化合物121の合成:化合物106の代わりに化合物120を用いて、化合物108について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物121(300mg、0.495mmol、80%)が得られた。C29H40FN4O9についての分子量(M+H)+計算値607.2779、実測値607.1。
化合物122の合成:化合物106の代わりに化合物120を用いて、化合物108について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物122(417mg、0.635mmol、90%)が得られた。C30H40F3N4O9についての分子量(M+H)+計算値657.2747、実測値657.2。
化合物123の合成:化合物106の代わりに化合物120を用いて、化合物108について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物123(343mg、0.559mmol、80%)が得られた。C30H40N5O9についての分子量(M+H)+計算値614.2826、実測値614.2。
化合物124の合成:化合物106の代わりに化合物120を用いて、化合物108について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物124(340mg、0.537mmol、79%)が得られた。C29H40N5O11についての分子量(M+H)+計算値634.2724、実測値634.0。
化合物125の合成:化合物106の代わりに化合物120を用いて、化合物108について記載されるのと類似の手順にしたがったところ、化合物125(323mg、0.54mmol、83%)が得られた。C29H41N4O10についての分子量(M+H)+計算値605.2823、実測値605.2。
化合物126の合成:化合物121(290mg、0.478mmol)を、18時間にわたってギ酸(10mL)で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物126(241mg、0.438mmol、92%)が得られた。C25H32FN4O9についての分子量(M+H)+計算値551.2153、実測値551.0。
化合物127の合成:化合物122(407mg、0.620mmol)を、18時間にわたってギ酸(10mL)で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物127(318mg、0.530mmol、85%)が得られた。C26H32F3N4O9についての分子量(M+H)+計算値601.2121、実測値601.0。
化合物128の合成:化合物123(333mg、0.543mmol)を、18時間にわたってギ酸(10mL)で処理し。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物128(281mg、0.504mmol、93%)が得られた。C26H32N5O9についての分子量(M+H)+計算値558.2200、実測値558.2。
化合物129の合成:化合物124(330mg、0.521mmol)を、18時間にわたってギ酸(10mL)で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物129(277mg、0.480mmol、92%)が得られた。C25H32N5O11についての分子量(M+H)+計算値578.2098、実測値578.0。
化合物130の合成:化合物125(313mg、0.518mmol)を、18時間にわたってギ酸(10mL)で処理した。溶媒を除去した後、シリカゲルカラムによる精製により、化合物130(253mg、0.461mmol、89%)が得られた。C25H33N4O10についての分子量(M+H)+計算値549.2197、実測値549.0。
NHSエステル化合物131、132、133、134および135を、それぞれ化合物126、127、128、129および130を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミドを用いた標準的なエステル化プロセスによって調製する。完全に脱保護されたGalNAc誘導体136、137、138、139および140を、Et3N/MeOHによる処理によって、化合物126、127、128、129および130から調製する。
201の合成:化合物200(20g、44.74mmol)を、ジクロロメタン(150mL)中で撹拌した。次に、EDAC(12.8g、65mmol)、DMAP(2g、触媒)、およびt-ブタノール(20mL)を加えた。混合物を室温で2日間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、ジクロロメタン(3×100mL)で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を、酢酸エチルおよびヘキサンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物201(15g、68%)が得られた。C23H37NO11についての分子量計算値503.24、実測値526.23(M+Na)。
化合物202の合成:化合物104の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、10gの化合物201を、化合物202(7.6g、78%)に転化した。C21H35NO10についての分子量計算値461.23、実測値484.25(M+Na)。
化合物203の合成:化合物105の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物203を合成した(5.2g、64%)。C21H34N4O9についての分子量計算値486.23、実測値509.24(M+Na)。
化合物204の合成:化合物203(6.34g、13.03mmol)を、ギ酸(20ml)中で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。粗生成物を、酢酸エチル/ヘキサンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物204.(4.6g、82%)が得られた。C17H26N4O9についての分子量計算値430.17、実測値453.18(M+Na)。
化合物205の合成:化合物204(0.50g、1.16mmol)をジクロロメタン(50mL)に溶解させた。次に、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.200g、1.5当量)、EDACおよびDIEAを加え、得られた混合物を一晩撹拌した。次に、混合物を水および塩水で洗浄した。溶媒を除去し、残渣を、酢酸エチル/ヘキサンを用いたろ過クロマトグラフィーによって精製したところ、化合物205が得られた。
化合物206の合成:化合物204(1.00g、2.32mmol)を、メタノール/水の混合物(2:1)中で撹拌した。次に、1-エチニル-3-メトキシベンゼン(204A)(0.367g、2.7mmol)、CuSO4.×H2O(0.050g、触媒量)およびアスコルビン酸ナトリウム(0.25g、1mmol))を加え、混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、次に、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物206が得られた。C26H34N4O10についての分子量計算値562.23、実測値585.22(M+Na)。
化合物207の合成:化合物207を、化合物205(320mg、95%)の合成について記載されるのと同様の手順を用いて調製した。
化合物207の合成:化合物202(2.8g、6.07mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させ、混合物を氷水浴中で冷却した。この混合物に、DSC(1.3g、1.5当量)およびTEA(0.7mL)を加え、溶液を一晩撹拌した。次に、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、分液漏斗に移した。混合物を水および塩水で洗浄し、次に、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を減圧下で一晩乾燥させた。得られた生成物を、さらに精製せずに次の反応段階に使用した。
化合物208の合成:DSC誘導体化合物207(0.5g、0.83mmol)を、ジクロロメタン(20mL)中で撹拌した。ベンジルアミン(0.100g、1mmol)およびピリジン(5mL)を加え、混合物を一晩撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。粗生成物を、ジクロロメタン/メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物208(0.300g、65%)が得られた。C29H42N2O11についての分子量計算値594.28、実測値595.29(M+)。
化合物209の合成:DSC誘導体化合物207(0.5g、0.83mmol)を、ジクロロメタン(20mL)中で撹拌した。次に、エタノールアミン(0.07g、1mmol)およびピリジン(5mL)を加え、混合物を一晩撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。粗生成物を、ジクロロメタン/メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物209(0.25g、42%)が得られた。C24H40N2O12についての分子量計算値548.26、実測値549.27(M+H)。
化合物210の合成:化合物208(250mg、0.42mmol)をギ酸(20mL)に溶解させ、溶液を一晩撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。粗化合物をジクロロメタンに溶解させ、水および塩水で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、ジクロロメタン/メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物210(200mg、87%)が得られた。次に、この化合物をメタノールに溶解させ、TEA(2mL)を加えた。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をピリジンと2回同時蒸発させた。生成物を水にさらに溶解させ、次に、凍結乾燥させたところ、化合物210が白色の粉末として得られた。C21H30N2O9についての分子量計算値454.20、実測値477.21(M+Na)。
化合物211の合成:化合物211を、化合物210の調製に使用されるのと同様の方法を用いて化合物209から調製した。C16H28N2O10についての分子量計算値408.17、実測値431.20(M+Na)。
化合物213の合成:グルタメート誘導体A(0.174g、1mmol)をDMF(10mL)に溶解させた。HBTU(0.390g、1.05mmol)およびDIEAを加え、混合物を室温で数分間撹拌した。DMF中のアミノ誘導体化合物212(0.400g、1mmol)をこの溶液に加え、一晩、撹拌を続けた。次に、溶媒を減圧下で除去した。粗化合物を、ジクロロメタン/メタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物213(0.350g、57%)が得られた。C23H40N4O10についての分子量計算値532.27、実測値555.28(M+Na)。
化合物214の合成:化合物213(300mg、0.56mmol)をギ酸に溶解させ、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をトルエンと2回同時蒸発させた。この残渣を水に溶解させ、凍結乾燥させたところ、化合物214(200mg、74%)が白色の粉末として得られた。C19H32N4O10についての分子量計算値476.21、実測値477.20(M+H)。
化合物215の合成:化合物215を、化合物B(140mg)から同様の手順で調製した。C27H48N4O10についての分子量計算値588.34、実測値611.33(M+Na)。
化合物216の合成:化合物216を、化合物214(0.125g、35%)を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物215から調製した。C23H40N4O10についての分子量計算値532.27、実測値555.25(M+Na)。
化合物217の合成:化合物216を、化合物Cおよびアミノ誘導体212(.250mg、65%)から調製した。C25H41N5O9についての分子量計算値555.29、実測値556.31(M+H)。
化合物218の合成:化合物218を、化合物214(0.140mg、45%)を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物217から調製した。C21H33N5O9についての分子量計算値499.23、実測値500.25(M+H)。
化合物219の合成:化合物219を、化合物213(0.525g、43%)を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物Dおよびアミノ誘導体212から調製した。C24H43N3O9についての分子量計算値517.30、実測値518.28(M+H)。
化合物220の合成:化合物220を、化合物214(95mg、26%)を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物219から調製した。C20H35N3O9についての分子量計算値461.24、実測値462.26(M+H)。
化合物221の合成:化合物221を、化合物Eおよびアミノ誘導体化合物212(0.320g、65%)からの化合物から調製した。C21H37N3O9についての分子量計算値475.25、実測値476.23(M+H)。
化合物222の合成:化合物222を、化合物214(85mg、56%)を調製するのに使用されるのと同様の手順を用いて化合物221から調製した。C17H29N3O9についての分子量計算値419.19、実測値420.20(M+Na)。
化合物58を、国際公開第96/39411号に報告されるのと同様の方法で調製する。O-グリコシル化、続いて加水分解により、化合物60および63が得られる。NHSエステル化合物61および64を、NHSを用いた標準的なエステル化によって調製する。化合物65のアセチル基を、選択的に除去し、得られたヒドロキシル基を、ベンジル基によって保護したところ、化合物66が得られる。末端アルケンの酸化的切断により、化合物67が得られる。エステル化、続いて水素化により、化合物61および64が得られる。化合物58のO-グリコシル化、続いて酸化および加水分解により、化合物60が得られる。化合物60のエステル化により、化合物61が得られる
トリフルオロメチルアセトアミド(TFA)保護されたガラクトサミン(GalN-TFA)NHSエステルを、合成後手法において、アミン含有オリゴヌクレオチド(化合物69および71)と結合して、Gal-TFA含有オリゴヌクレオチド(化合物70および72)を生成する。
化合物5009の合成:ピリジン(100mL)中の化合物5008(25.0g、83mmol)の撹拌溶液に、TsCl(19.8g、103.7mmol)を加えた。得られた混合物を室温で一晩(14時間)撹拌した。溶媒を濃縮し、生成物を、酢酸エチル(3×50mL)で抽出し、水、塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗化合物5009(25g)が得られた。C21H29NO8SについてのLCMS計算値:455.16(M+)、実測値:456.1(M++1)、478.0(M++Na+)。
化合物5010の合成:DMF(200mL)中の化合物5009(19.0g、41.7mmol)の撹拌溶液に、NaN3(16g、246mmol)を加えた。得られた混合物を80℃で3日間撹拌した。次に、さらに8gのNaN3を加え、溶液を14時間にわたって100℃に加熱した。溶媒を濃縮し、生成物を、酢酸エチル(3×50mL)で抽出し、水、塩水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒の濃縮により、粗化合物5010が得られ、それを、カラムクロマトグラフィー(5g、37%)によって精製した。C14H22N4O5についてのLCMS計算値:326.35(M+)、実測値:327.1(M++1)。
化合物5011の合成:THF(10mL)中のLAH(139mg、3.52mmol)の撹拌溶液に、0℃でTHF(10mL)中の化合物5010(574mg、1.76mmol)の溶液を滴下して加えた。混合物を室温で一晩(14時間)撹拌した。反応混合物を1mLの水でクエンチした後、Celite上でろ過し、酢酸エチル(25mL)で洗浄した。溶媒の濃縮により、粗生成物(0.5g)が得られ、それをDCM(0mL)に溶解させ、グルタル酸無水物(251mg、2.2mmol)の撹拌溶液に加えた。反応混合物を室温で14時間撹拌した。溶媒の濃縮により、粗製の酸(285mg)が得られ、それを、20mLの、ジエチルエーテル中2NのHClに溶解させ、3時間撹拌した。溶媒の濃縮により、化合物5011(200mg)が得られた。C16H26N2O8についてのLCMS計算値:374.39(M+)、実測値:373.1(M--1)。
化合物5012の合成:DMF(10mL)中の化合物5011(200mg、0.53mmol)およびNHS(112mg、1.06mmol)の撹拌溶液に、DCC(218mg、1.06mmol)を加えた。混合物を室温で14時間撹拌した。次に、20mLの酢酸エチルを加えた。固体のろ過により、化合物5012(150mg、60%)が得られた。C20H29N3O10についてのLCMS計算値:471.46(M+)、実測値:506(M-+Cl-)。
化合物143の合成:DMF(12mL)中の三価のGalNAc酸化合物142(1.80g、0.898mmol)の溶液に、HBTU(341mg、0.898mmol)およびi-Pr2NEt(0.568mL、3.26mmol)を加えた。10分後、化合物141(500mg、0.816mmol)を溶液に加え、混合物を一晩撹拌した。DMFを減圧下で除去した後、残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出した。有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~15%のMeOH)によって精製したところ、化合物143(1.75g、0.673mmol、82%)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.96(s,1H)、7.84-7.81(m,6H)、7.76-7.72(m,4H)、7.50(d,J=0.9Hz、1H)、6.98(s,1H)、5.21(d,J=3.4Hz、3H)、4.96(dd,J=11.2、3.4Hz、3H)、4.53(s,1H)、4.48(d,J=8.5Hz、3H)、4.35-4.33(m,1H)、4.17(d,J=4.5Hz、1H)、4.05-3.83(m,17H)、3.73-3.64(m,3H)、3.57-3.52(m,12H)、3.43-3.38(m,3H)、3.06-3.00(m,16H)、2.44-2.39(m,2H)、2.27(t,J=6.4Hz、6H)、2.10(s,9H)、2.04(t,J=7.3Hz、9H)、1.99(s,9H)、1.89(s,9H)、1.77(s,9H)、1.52-1.42(m,22H)、1.21(s,13H)、1.01(s,9H)、0.98(s,9H)、0.89(s,9H)、0.12(s,3H)、0.079(s,3H)。
化合物144の合成:フッ化水素-ピリジン(約70%のHF、0.173mL、6.66mmol)を、0℃で冷却しながらピリジン(2mL)で希釈した。得られた溶液を、0℃でCH2Cl2(20mL)中の化合物143の溶液に加え、混合物を0℃で2時間撹拌した。反応溶液をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、次に、無水Na2SO4上で乾燥させた。揮発性物質を蒸発させた後、粗生成物を減圧下で乾燥させたところ、そのジオールが白色の発泡体として得られた。ピリジン(15mL)中のこの材料の溶液に、DMTrCl(691mg、2.04mmol)を加えた。反応混合物を室温で14時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣を、CH2Cl2および飽和NaHCO3水溶液で抽出し、次に、無水Na2SO4上で乾燥させた。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~10%のMeOH)によって精製したところ、化合物144(3.31g、1.20mmol、65%)が得られた。
化合物145の合成:CH2Cl2(20mL)中の化合物144(3.25g、1.18mmol)の溶液に、DMAP(432mg、3.54mmol)および無水コハク酸(236mg、2.36mmol)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。濃縮後、粗材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中8%のMeOH/8%のEt3N)によって精製したところ、化合物145(3.03g、1.78mmol、87%)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.22(brs、1H)、11.41(s,1H)、7.94(brs、1H)、7.85-7.81(m,6H)、7.75-7.72(m,4H)、7.66(s,1H)、7.41-7.38(m,2H)、7.32-7.19(m,9H)、6.98(s,1H)、6.89-6.87(m,4H)、5.21(d,J=3.4Hz、3H)、5.07(t,J=5.1Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2、3.4Hz、3H)、4.55(t,J=5.2Hz、1H)、4.56-4.44(m,4H)、4.05-3.97(m,10H)、3.91-3.83(m,3H)、3.73(s,6H)、3.71-3.64(m,4H)、3.56-3.52(m,14H)、3.43-3.38(m,3H)、3.23-3.14(m,2H)、3.06-3.00(m,16H)、2.46-2.38(m,4H)、2.27(t,J=6.4Hz、6H)、2.10(s,9H)、2.06-2.01(m,9H)、1.99(s,9H)、1.89(s,9H)、1.77(s,9H)、1.52-1.43(m,22H)、1.21(s,13H)、0.95(t,J=7.2Hz、1H)、0.80(s,9H)、-0.013(s,3H)、-0.046(s,3H)。
化合物146の合成:CH3CN(5mL)中の化合物145(103mg、0.0347mmol)の溶液に、HBTU(26mg、0.0694mmol)、iPr2NEt(0.026mL、0.149mmol)およびCPG-NH2(Prime Synthesis CPG-500、80μmol/gであると考えられるNH2充填量)(450mg、0.036mmol)を加えた。混合物を24時間にわたって振とうし、次にろ過し、CH2Cl2で洗浄し、減圧下で乾燥させた。残りのアミノ基を、ピリジン(7.5mL)、無水酢酸(2.5mL)およびトリエチルアミン(0.5mL)を用いて1時間振とうすることによってキャッピングした。ろ過し、CH2Cl2(100mL)、次に50%のMeOH/CH2Cl2(100mL)で洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、化合物146が得られた。充填量:49μmol/g。
実施例61:三本鎖および1+1+1リガンド設計のための初代肝細胞結合
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート43527におけるものと同じであった。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート43527におけるものと同じであった。
図13は、siRNA-リガンドコンジュゲート61696、61695、61692、61694、61697、61693、43527および61698のための初代肝細胞結合親和性を示し、それらの構造が以下に示される。結合親和性Ki値が、以下の表に示される。
実施例62:高親和性リガンドを有するSiRNA GalNACコンジュゲート
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート57727におけるものと同じであった。L224、L223、L221、L96およびL227の構造が以下に示される。
siRNA-リガンドコンジュゲートを調製した。各コンジュゲート中のsiRNAは同じであり、TTRを標的にしていた。以下のリガンドを、各siRNAのセンス鎖の3’末端に結合した。コンジュゲートにおけるリガンドの構造は、以下に示される糖基の置換を除いて、コンジュゲート57727におけるものと同じであった。L224、L223、L221、L96およびL227の構造が以下に示される。
図3Aおよび3Bは、実施例33におけるプロトコルにしたがった、マウスへのコンジュゲート57727、63189、63192、63190および63191の単回の皮下投与の72時間後(図3A)および144時間後(図3B)の血中血清mTTR SiRNAレベルを示す。
2’-および3’-O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジン(2A、2B)。2’,3’-O-ジブチルスタンニレン-5-メチルウリジン(2.0g、4.1mmol)を、DMF(10mL)に懸濁させた。6-ブロモヘキシルフタルイミド(2.5g、8.2mmol)およびNaI(120mg、0.82mmol)を懸濁液に加えた。試薬を、100℃で3.5時間マイクロ波にかけたところ、暗褐色の均一混合物が得られた。DMFを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルに吸着させた。シリカゲルを、シリカゲルクロマトグラフィー用のカートリッジ中に充填した。O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジンの2’-および3’-異性体が、分離できない混合物として溶離して、890mgの2Aおよび2B(1.8mmol、45%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.29(s,1H、D2O交換可能)、7.88-7.80(m,4H)、7.78-7.76(m,1H)、7.73-7.70(m,0H)、5.81(d,J=5.3Hz、1H)、5.72(d,J=5.6Hz、1H)、5.25(d,J=6.2Hz、1H、D2O交換可能)、5.12(t,J=5.0Hz、1H、D2O交換可能)、5.00(d,J=5.9Hz、1H、D2O交換可能)、4.14(q,J=5.6Hz、1H)、4.07(q,J=5.0Hz、1H)、3.90-3.79(m,2H)、3.74(t,J=4.6Hz、0H)、3.67-3.58(m,1H)、3.58-3.49(m,4H)、3.46-3.37(m,1H)、1.75(d,J=3.7Hz、3H)、1.62-1.42(m,4H)、1.37-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ168.00、167.97、163.78、163.73、150.79、150.57、136.23、136.07、134.44、134.40、131.60、131.56、123.02、109.38、109.26、87.73、85.89、85.07、82.71、80.82、77.49、72.43、69.69、69.51、68.38、60.86、60.62、29.23、28.96、27.93、26.15、26.07、25.16、24.96、12.26.C24H29N3O8についてのMS計算値487.1955、実測値m/z 488.0(M+1)+、510.2(M+23)Na+、486.2(M-1)-、522.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.26。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.29(s,1H、D2O交換可能)、7.88-7.80(m,4H)、7.78-7.76(m,1H)、7.73-7.70(m,0H)、5.81(d,J=5.3Hz、1H)、5.72(d,J=5.6Hz、1H)、5.25(d,J=6.2Hz、1H、D2O交換可能)、5.12(t,J=5.0Hz、1H、D2O交換可能)、5.00(d,J=5.9Hz、1H、D2O交換可能)、4.14(q,J=5.6Hz、1H)、4.07(q,J=5.0Hz、1H)、3.90-3.79(m,2H)、3.74(t,J=4.6Hz、0H)、3.67-3.58(m,1H)、3.58-3.49(m,4H)、3.46-3.37(m,1H)、1.75(d,J=3.7Hz、3H)、1.62-1.42(m,4H)、1.37-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ168.00、167.97、163.78、163.73、150.79、150.57、136.23、136.07、134.44、134.40、131.60、131.56、123.02、109.38、109.26、87.73、85.89、85.07、82.71、80.82、77.49、72.43、69.69、69.51、68.38、60.86、60.62、29.23、28.96、27.93、26.15、26.07、25.16、24.96、12.26.C24H29N3O8についてのMS計算値487.1955、実測値m/z 488.0(M+1)+、510.2(M+23)Na+、486.2(M-1)-、522.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.26。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジン(3A)。2Aおよび2Bの混合物(890mg、1.83mmol)を、ピリジンと同時蒸発させ、次に、アルゴン雰囲気下でピリジン(10mL)に溶解させ、氷浴中で0℃に冷却した。この混合物に、DMTrCl(690mg、2.04mmol)を加え、反応物を、室温に温めながら、一晩撹拌した。さらなる0.55当量のDMTrClを加え、反応物をさらに2時間撹拌した。反応をMeOHでクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗製の2’および3’異性体(3Aおよび3B)をDCMに溶解させ、有機層を塩水で2回洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、減圧下で濃縮したところ、510mgの3A(0.65mmol、35%)が得られた。2’-O-アルキル化異性体を、D2O交換、続いてCOSYによる3’-OHの同定によって特性評価した。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H、D2O交換可能)、7.88-7.77(m,4H)、7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.4Hz、2H)、7.33-7.19(m,7H)、6.89(d,J=8.0Hz、4H)、5.82(d,J=4.8Hz、1H)、5.10(d,J=6.3Hz、1H、D2O交換可能)、4.18(q,J=5.5Hz、1H)、3.96(q,J=4.8、4.4Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.62-3.46(m,4H)、3.27-3.14(m,2H)、1.59-1.45(m,4H)、1.38(s,3H)、1.34-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.91、163.61、158.19、158.16、150.41、144.66、135.45、135.31、135.11、134.33、131.58、129.74、127.93、127.65、126.84、122.97、113.27、109.60、86.46、85.91、83.09、80.53、69.63、68.76、63.19、55.06、37.31、28.89、27.91、26.07、24.95、11.66.C45H47N3O10についてのMS計算値789.3261、実測値m/z 812.3(M+23)Na+、788.3(M-1)-、824.3(M+35)Cl- Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.35。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H、D2O交換可能)、7.88-7.77(m,4H)、7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.4Hz、2H)、7.33-7.19(m,7H)、6.89(d,J=8.0Hz、4H)、5.82(d,J=4.8Hz、1H)、5.10(d,J=6.3Hz、1H、D2O交換可能)、4.18(q,J=5.5Hz、1H)、3.96(q,J=4.8、4.4Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.62-3.46(m,4H)、3.27-3.14(m,2H)、1.59-1.45(m,4H)、1.38(s,3H)、1.34-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.91、163.61、158.19、158.16、150.41、144.66、135.45、135.31、135.11、134.33、131.58、129.74、127.93、127.65、126.84、122.97、113.27、109.60、86.46、85.91、83.09、80.53、69.63、68.76、63.19、55.06、37.31、28.89、27.91、26.07、24.95、11.66.C45H47N3O10についてのMS計算値789.3261、実測値m/z 812.3(M+23)Na+、788.3(M-1)-、824.3(M+35)Cl- Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.35。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-フタルイミドヘキシル-5-メチルウリジン(3B)。3’-異性体(3B)を、シリカゲルクロマトグラフィー中に2’-異性体(3A)から分離し、減圧下で濃縮したところ、420mgの3B(29%、0.53mmol)が得られた。3’-O-アルキル化異性体を、D2O交換による2’-OHの同定を除いて、同じように特性評価した。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.34(s,1H、D2O交換可能)、7.87-7.79(m,4H)、7.49(s,1H)、7.36(d,J=7.4Hz、2H)、7.29(t,J=7.6Hz、2H)、7.26-7.19(m,5H)、6.94-6.81(m,4H)、5.71(d,J=4.6Hz、1H)、5.36(d,J=6.0Hz、1H、D2O交換可能)、4.27(q,J=5.2Hz、1H)、3.99-3.95(m,1H)、3.90(t,J=5.3Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.63-3.47(m,3H)、3.36(t,J=6.8Hz、1H)、3.26-3.15(m,2H)、1.59-1.39(m,7H)、1.28-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.93、163.69、158.17、158.15、150.57、144.63、135.72、135.30、135.17、134.35、131.58、129.71、127.91、127.63、126.82、122.97、113.24、109.37、88.69、85.91、80.60、77.27、72.18、69.67、55.03、39.50、37.33、29.09、27.88、26.08、25.08、11.74.C45H47N3O10についてのMS計算値789.3261、実測値m/z 812.0(M+23)Na+、788.3(M-1)-、824.3(M+35)Cl- Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.18。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.34(s,1H、D2O交換可能)、7.87-7.79(m,4H)、7.49(s,1H)、7.36(d,J=7.4Hz、2H)、7.29(t,J=7.6Hz、2H)、7.26-7.19(m,5H)、6.94-6.81(m,4H)、5.71(d,J=4.6Hz、1H)、5.36(d,J=6.0Hz、1H、D2O交換可能)、4.27(q,J=5.2Hz、1H)、3.99-3.95(m,1H)、3.90(t,J=5.3Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.63-3.47(m,3H)、3.36(t,J=6.8Hz、1H)、3.26-3.15(m,2H)、1.59-1.39(m,7H)、1.28-1.20(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.93、163.69、158.17、158.15、150.57、144.63、135.72、135.30、135.17、134.35、131.58、129.71、127.91、127.63、126.82、122.97、113.24、109.37、88.69、85.91、80.60、77.27、72.18、69.67、55.03、39.50、37.33、29.09、27.88、26.08、25.08、11.74.C45H47N3O10についてのMS計算値789.3261、実測値m/z 812.0(M+23)Na+、788.3(M-1)-、824.3(M+35)Cl- Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.18。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-5-メチルウリジン(4A*)。MeOH(190mL)中の3A(RI Chemicalsから入手した、ロット#H1010-04、15.0g、18.99mmol)の溶液に、ヒドラジン(3.04g、94.52mmol)を加え、不均一混合物を、3.5時間にわたって加熱還流させた。混合物を室温に冷まし、減圧下で蒸発させたところ、白色の粉末が得られた。生成物をDCMに溶解させ、水酸化アンモニウムで洗浄した。エマルジョンの除去を助けるように塩水を加えた。有機層をMgSO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、11.80gの粗生成物が得られ、それを精製せずに次の工程に使用した。
C37H45N3O8についてのMS計算値659.3207、実測値m/z 660.2(M+1)+、682.1(M+23)Na+、658.1(M-1)-、694.1(M+35)Cl-。Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.02。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.5Hz、2H)、7.30(t,J=7.5Hz、2H)、7.24(d,J=8.9Hz、5H)、6.89(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(s,1H)、4.19(t,J=5.0Hz、1H)、3.97(t,J=4.9Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.27-3.15(m,3H)、1.48(d,J=6.4Hz、2H)、1.38(s,3H)、1.34-1.18(m,6H)。
C37H45N3O8についてのMS計算値659.3207、実測値m/z 660.2(M+1)+、682.1(M+23)Na+、658.1(M-1)-、694.1(M+35)Cl-。Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.02。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.48(s,1H)、7.38(d,J=7.5Hz、2H)、7.30(t,J=7.5Hz、2H)、7.24(d,J=8.9Hz、5H)、6.89(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(s,1H)、4.19(t,J=5.0Hz、1H)、3.97(t,J=4.9Hz、2H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.27-3.15(m,3H)、1.48(d,J=6.4Hz、2H)、1.38(s,3H)、1.34-1.18(m,6H)。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-5-メチルウリジン(4A)。DCM(250mL)中の粗製の4A*(6.00g、9.09mmol)の溶液に、トリエチルアミン(3.8mL、27.30mmol)を加え、混合物を10分間撹拌させた。GalNAc-C5-NHSエステル(7.31g、10.00mmol)を加え、反応混合物を2時間撹拌した。反応混合物を飽和重炭酸塩で洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥させ、次に、減圧下で蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、9.56gの4A(7.49mmol、82%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H、D2O交換可能)、7.97(d,J=9.3Hz、1H、D2O交換可能)、7.91(t,J=6.8Hz、4H)、7.73-7.45(m,11H)、7.41-7.19(m,11H)、6.88(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=4.7Hz、1H)、5.74(d,J=3.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.12(d,J=6.3Hz、1H、D2O交換可能)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.8、7.6Hz、2H)、4.39-4.15(m,3H)、3.96(t,J=4.7Hz、2H)、3.79(dd,J=9.4、3.8Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.28-3.16(m,2H)、2.99(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.43(m,6H)、1.36(d,J=17.6Hz、5H)、1.24(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.73、169.40、165.20、165.16、164.86、163.62、158.18、158.15、150.41、144.64、135.47、135.31、135.10、133.77、133.49、129.73、129.20、129.16、129.03、129.00、128.97、128.70、128.59、127.91、127.64、126.82、113.26、109.59、100.89、86.47、85.91、83.09、80.60、71.85、69.97、69.74、68.77、67.92、63.19、62.03、55.04、49.74、38.34、35.03、29.17、29.04、28.59、26.25、25.12、22.69、21.85、11.66.C71H78N4O18についてのMS計算値1274.5311、実測値m/z 1298.3(M+23)Na+、1309.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.36。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H、D2O交換可能)、7.97(d,J=9.3Hz、1H、D2O交換可能)、7.91(t,J=6.8Hz、4H)、7.73-7.45(m,11H)、7.41-7.19(m,11H)、6.88(d,J=8.4Hz、4H)、5.84(d,J=4.7Hz、1H)、5.74(d,J=3.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.12(d,J=6.3Hz、1H、D2O交換可能)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.8、7.6Hz、2H)、4.39-4.15(m,3H)、3.96(t,J=4.7Hz、2H)、3.79(dd,J=9.4、3.8Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.63-3.45(m,3H)、3.28-3.16(m,2H)、2.99(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.43(m,6H)、1.36(d,J=17.6Hz、5H)、1.24(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.73、169.40、165.20、165.16、164.86、163.62、158.18、158.15、150.41、144.64、135.47、135.31、135.10、133.77、133.49、129.73、129.20、129.16、129.03、129.00、128.97、128.70、128.59、127.91、127.64、126.82、113.26、109.59、100.89、86.47、85.91、83.09、80.60、71.85、69.97、69.74、68.77、67.92、63.19、62.03、55.04、49.74、38.34、35.03、29.17、29.04、28.59、26.25、25.12、22.69、21.85、11.66.C71H78N4O18についてのMS計算値1274.5311、実測値m/z 1298.3(M+23)Na+、1309.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.36。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-3’-O-スクシネート-5-メチルウリジン(5A)。DCM(50mL)中の4A(2.00g、1.57mmol)の溶液に、DMAP(574mg、4.70mmol)および無水コハク酸(313mg、3.14mmol)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー(φ=4.2cm×15cm、DCM中2%のTEAで前処理された)によって精製した。生成物を、DCM中0~5%のMeOHおよび2~5%のEt3N(v/v)で溶離し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、2.11g(1.43mmol、91%)の6aがEt3N塩として得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.44(s,1H)、8.05(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.8Hz、4H)、7.74-7.45(m,11H)、7.40-7.27(m,6H)、7.23(d,J=8.7Hz、5H)、6.89(d,J=8.1Hz、4H)、5.84(d,J=6.1Hz、1H)、5.74(d,J=3.5Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.27-5.22(m,1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.40(m,2H)、4.38-4.22(m,3H)、4.13(q,J=3.5Hz、1H)、3.78(d,J=9.7Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.54-3.28(m,5H)、3.25-3.19(m,1H)、2.97(q,J=6.5Hz、2H)、2.57-2.51(m,2H)、2.44(t,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.57-1.27(m,11H)、1.18(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.40、171.76、171.63、169.39、165.20、165.15、164.86、163.50、158.22、150.50、144.48、135.45、135.12、134.95、133.76、133.48、129.70、129.17、129.03、129.00、128.97、128.70、128.58、127.95、127.61、113.30、110.16、100.91、86.13、80.75、78.22、71.89、70.67、70.23、69.97、68.73、67.91、62.04、55.04、52.01、49.73、38.33、34.98、29.13、28.92、28.55、26.19、25.08、22.68、21.82、11.69、10.48.C75H81N4O21 -についてのMS計算値1374.5472、実測値m/z 1397.4(M+23)Na+、1373.4(M-1)-、1409.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.44(s,1H)、8.05(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.8Hz、4H)、7.74-7.45(m,11H)、7.40-7.27(m,6H)、7.23(d,J=8.7Hz、5H)、6.89(d,J=8.1Hz、4H)、5.84(d,J=6.1Hz、1H)、5.74(d,J=3.5Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.27-5.22(m,1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.40(m,2H)、4.38-4.22(m,3H)、4.13(q,J=3.5Hz、1H)、3.78(d,J=9.7Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.54-3.28(m,5H)、3.25-3.19(m,1H)、2.97(q,J=6.5Hz、2H)、2.57-2.51(m,2H)、2.44(t,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.57-1.27(m,11H)、1.18(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.40、171.76、171.63、169.39、165.20、165.15、164.86、163.50、158.22、150.50、144.48、135.45、135.12、134.95、133.76、133.48、129.70、129.17、129.03、129.00、128.97、128.70、128.58、127.95、127.61、113.30、110.16、100.91、86.13、80.75、78.22、71.89、70.67、70.23、69.97、68.73、67.91、62.04、55.04、52.01、49.73、38.33、34.98、29.13、28.92、28.55、26.19、25.08、22.68、21.82、11.69、10.48.C75H81N4O21 -についてのMS計算値1374.5472、実測値m/z 1397.4(M+23)Na+、1373.4(M-1)-、1409.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.41。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-3’-O-CPG-5-メチルウリジン(6A)。アセトニトリル(100mL)中の5A(2.01g、1.36mmol)の溶液に、HBTU(1.03g、2.72mmol)およびDIEA(528mg、4.08mmol)を加えた。混合物を5分間にわたって振とうしてから、CPG(16.00g、130μmol/g、540Å)を加えた。混合物を24時間にわたって振とうした。CPGをろ過し、DCM、DCM中20%のMeOH(v/v)、次にエーテルで洗浄した。CPGを減圧下で蒸発させ、次に、ピリジン(75mL)およびEt3N(1mL)中の無水酢酸(25mL)で処理し、1時間にわたって振とうした。CPGをろ過し、上述されるのと同じ溶媒で洗浄した。平均充填量を、2つの試料のトリチル吸光度分光法測定によって測定し、計算したところ、73μmol/gであった。
5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-3’-O-(N,N-ジイソプロピル)-β-シアノエチルホスホロアミダイト-5-メチルウリジン(7A)。4A(2.90g、2.27mmol)を、無水アセトニトリルと2回同時蒸発させ、次に、完全なアルゴン雰囲気下に保った。0℃で無水DCM(35mL)中の4Aの溶液に、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.37g、4.55mmol)、続いてDCI(268mg、2.27mmol)を加えた。混合物を0℃で20分間、次に室温で17時間撹拌した。生成物を飽和重炭酸塩で洗浄し、DCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。シリカゲルクロマトグラフィー(φ=4.2cm×19cm、ヘキサン中50%のEtOAcおよび1%のTEAで前処理された)を行った。カラムを、ヘキサン中80%のEtOAc(8CV)、続いて100%のEtOAc(8CV)、次に、DCM中3%のMeOH(5CV)で洗浄した。生成物7Aが、100%のEtOAcおよび再度3%のMeOHで溶離した。7Aを含有する画分を組み合わせて、減圧下で蒸発させたところ、3.20gの7A(2.17mmol、95%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.39(s,1H)、7.98(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.2Hz、4H)、7.72-7.45(m,11H)、7.38(t,J=6.8Hz、4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.88(t,J=5.4Hz、4H)、5.82(d,J=4.3Hz、1H)、5.75(s,1H)、5.35(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.31(m,4H)、4.15-4.04(m,2H)、3.71(s,8H)、3.58-3.45(m,5H)、3.28-3.20(m,2H)、3.03-2.93(m,2H)、2.76(t,J=5.8Hz、1H)、2.57(q,J=5.3Hz、1H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.42-1.29(m,5H)、1.27-1.15(m,5H)、1.14-1.03(m,10H)、0.94(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.60、169.26、165.07、165.03、164.73、163.48、158.10、158.08、158.07、150.24、150.22、144.39、144.34、134.99、134.97、134.87、134.80、133.63、133.37、133.34、129.65、129.62、129.60、129.07、129.05、129.03、128.90、128.88、128.87、128.83、128.56、128.45、127.75、127.56、127.50、126.74、118.72、118.57、113.10、113.08、109.63、109.54、100.76、85.92、85.90、71.72、69.84、68.61、67.78、61.89、54.91、49.60、45.53、42.53、42.42、42.31、38.23、38.21、34.88、29.05、29.02、28.96、28.45、26.17、25.08、25.04、24.18、24.13、24.09、24.03、22.55、21.71、19.71、19.66、19.62、11.51、11.49.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.01、153.65。
C80H95N6O19PについてのMS計算値1474.6390、実測値m/z 1497.4(M+23)Na+、1509.4(M+35)Cl-。Rf=100%のEtOAc中の0.39。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.39(s,1H)、7.98(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.2Hz、4H)、7.72-7.45(m,11H)、7.38(t,J=6.8Hz、4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.88(t,J=5.4Hz、4H)、5.82(d,J=4.3Hz、1H)、5.75(s,1H)、5.35(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.31(m,4H)、4.15-4.04(m,2H)、3.71(s,8H)、3.58-3.45(m,5H)、3.28-3.20(m,2H)、3.03-2.93(m,2H)、2.76(t,J=5.8Hz、1H)、2.57(q,J=5.3Hz、1H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.42-1.29(m,5H)、1.27-1.15(m,5H)、1.14-1.03(m,10H)、0.94(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.60、169.26、165.07、165.03、164.73、163.48、158.10、158.08、158.07、150.24、150.22、144.39、144.34、134.99、134.97、134.87、134.80、133.63、133.37、133.34、129.65、129.62、129.60、129.07、129.05、129.03、128.90、128.88、128.87、128.83、128.56、128.45、127.75、127.56、127.50、126.74、118.72、118.57、113.10、113.08、109.63、109.54、100.76、85.92、85.90、71.72、69.84、68.61、67.78、61.89、54.91、49.60、45.53、42.53、42.42、42.31、38.23、38.21、34.88、29.05、29.02、28.96、28.45、26.17、25.08、25.04、24.18、24.13、24.09、24.03、22.55、21.71、19.71、19.66、19.62、11.51、11.49.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.01、153.65。
C80H95N6O19PについてのMS計算値1474.6390、実測値m/z 1497.4(M+23)Na+、1509.4(M+35)Cl-。Rf=100%のEtOAc中の0.39。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-5-メチルウリジン(4B*)。MeOH(46ml)中の3B(3.64g、4.61mmol 約1g)の溶液に、ヒドラジン(738mg、23.04mmol)を加え、反応混合物を5.5時間にわたって還流させた。4A*について記載される後処理手順を用いて、粗製の4B*を単離した。アセトニトリルとの同時蒸発により、2.93gの粗製の4B*が得られた。
C37H45N3O8についてのMS計算値659.3207、実測値m/z 660.2(M+1)+、682.1(M+23)Na+、658.1(M-1)-、694.1(M+35)Cl-。Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.02。
粗製の4B*のNMR:
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.50(s,1H)、7.43-7.16(m,9H)、6.88(d,J=8.7Hz、4H)、5.73(d,J=4.6Hz、1H)、4.29(t,J=4.8Hz、1H)、4.02-3.89(m,3H)、3.46-3.15(m,5H)、2.24-2.16(m,1H)、2.05(s,1H)、1.58-1.10(m,13H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ163.73、158.04、158.02、150.58、144.49、135.54、135.18、135.06、129.56、127.78、127.50、126.69、113.11、109.23、88.49、85.78、80.47、77.20、72.02、69.62、62.85、54.91、54.90、41.44、33.12、29.17、26.11、25.31、11.62。
C37H45N3O8についてのMS計算値659.3207、実測値m/z 660.2(M+1)+、682.1(M+23)Na+、658.1(M-1)-、694.1(M+35)Cl-。Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.02。
粗製の4B*のNMR:
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.50(s,1H)、7.43-7.16(m,9H)、6.88(d,J=8.7Hz、4H)、5.73(d,J=4.6Hz、1H)、4.29(t,J=4.8Hz、1H)、4.02-3.89(m,3H)、3.46-3.15(m,5H)、2.24-2.16(m,1H)、2.05(s,1H)、1.58-1.10(m,13H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ163.73、158.04、158.02、150.58、144.49、135.54、135.18、135.06、129.56、127.78、127.50、126.69、113.11、109.23、88.49、85.78、80.47、77.20、72.02、69.62、62.85、54.91、54.90、41.44、33.12、29.17、26.11、25.31、11.62。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-5-メチルウリジン(4B)。TEA(1.8mL)で処理されたDCM(45mL)中の4B*(2.85g、4.32mmol)の溶液に、GalNAc-NHSエステル(3.47g、4.75mmol)を加えた。反応物を2時間撹拌してから、さらなる0.2当量のGalNAc-NHSエステルを加えた。1時間後、生成物を、5Aについて記載されるのと同じように単離した。シリカカラム精製により、3.62gの4B(2.84mmol)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、8.00-7.89(m,5H)、7.73-7.45(m,11H)、7.40-7.35(m,4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.88(d,J=8.8Hz、4H)、5.74(d,J=10.1Hz、2H)、5.42-5.33(m,2H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.41(m,2H)、4.38-4.23(m,3H)、3.99(d,J=4.7Hz、1H)、3.91(t,J=5.1Hz、1H)、3.82-3.76(m,1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.47(m,2H)、3.41-3.36(m,1H)、3.27-3.17(m,2H)、2.99(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(t,J=6.4Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.28(m,11H)、1.28-1.15(m,4H).13C NMR(75MHz、DMSO-d6)δ171.72、169.38、165.19、165.14、164.85、163.64、162.25、158.14、150.55、144.57、135.68、135.30、135.16、133.73、133.45、129.66、129.18、129.14、129.00、128.93、128.66、128.55、127.88、127.61、126.80、113.22、109.36、100.88、88.57、85.90、80.63、77.35、72.16、71.83、69.97、69.73、68.73、67.91、62.97、62.02、55.01、54.84、49.75、38.34、35.73、35.02、30.73、29.23、29.11、28.57、26.25、25.21、22.66、21.84、11.68.C71H78N4O18についてのMS計算値1274.5311、実測値m/z 1297.4(M+23)Na+、1309.4(M+35)Cl-.Rf=DCM中5%のMeOH中の0.24)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、8.00-7.89(m,5H)、7.73-7.45(m,11H)、7.40-7.35(m,4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.88(d,J=8.8Hz、4H)、5.74(d,J=10.1Hz、2H)、5.42-5.33(m,2H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.41(m,2H)、4.38-4.23(m,3H)、3.99(d,J=4.7Hz、1H)、3.91(t,J=5.1Hz、1H)、3.82-3.76(m,1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.47(m,2H)、3.41-3.36(m,1H)、3.27-3.17(m,2H)、2.99(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(t,J=6.4Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.28(m,11H)、1.28-1.15(m,4H).13C NMR(75MHz、DMSO-d6)δ171.72、169.38、165.19、165.14、164.85、163.64、162.25、158.14、150.55、144.57、135.68、135.30、135.16、133.73、133.45、129.66、129.18、129.14、129.00、128.93、128.66、128.55、127.88、127.61、126.80、113.22、109.36、100.88、88.57、85.90、80.63、77.35、72.16、71.83、69.97、69.73、68.73、67.91、62.97、62.02、55.01、54.84、49.75、38.34、35.73、35.02、30.73、29.23、29.11、28.57、26.25、25.21、22.66、21.84、11.68.C71H78N4O18についてのMS計算値1274.5311、実測値m/z 1297.4(M+23)Na+、1309.4(M+35)Cl-.Rf=DCM中5%のMeOH中の0.24)。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-2’-O-スクシネート-5-メチルウリジン(5B)。DCM(20mL)およびDMAP(315mg、2.58mmol)中の4B(1.10g、0.86mmol)の溶液に、無水コハク酸(172mg、1.73mmol)を加えた。反応混合物を23時間撹拌し、次に、5Aについて記載される手順を用いて精製し、減圧下でアセトニトリルと同時蒸発させたところ、1.03gの5B(0.70mmol、81%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.73-7.51(m,9H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.40-7.19(m,12H)、6.87(d,J=8.7Hz、4H)、5.85(d,J=3.9Hz、1H)、5.74(d,J=3.2Hz、1H)、5.47-5.42(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=9.1、7.7Hz、2H)、4.38-4.20(m,4H)、4.01-3.94(m,2H)、3.80-3.76(m,2H)、3.71(s,6H)、3.40-3.16(m,10H)、3.07-2.94(m,3H)、2.56(q,J=6.2、5.7Hz、2H)、2.43(d,J=4.1Hz、3H)、2.07-2.01(m,2H)、1.69(s,3H)、1.48(d,J=15.0Hz、7H)、1.40-1.27(m,4H)、1.16(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.63、173.45、172.79、171.92、171.52、169.54、168.92、165.29、165.24、164.94、163.78、158.23、150.33、144.57、136.18、135.27、135.18、133.84、133.57、129.77、129.24、129.09、129.06、129.04、128.77、128.65、127.96、127.70、126.90、113.29、109.73、100.97、85.97、80.75、75.82、73.31、71.96、70.48、62.59、62.40、55.10、55.07、52.06、51.40、51.36、45.45、38.42、35.04、33.35、29.20、29.09、28.95、28.77、22.70、21.90、11.81、10.08、7.26、7.17.C75H81N4O21 -についてのMS計算値1374.5472、実測値m/z 1397.4(M+23)Na+、1373.4(M-1)-.Rf=DCM中5%のMeOH中の0.18)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.73-7.51(m,9H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.40-7.19(m,12H)、6.87(d,J=8.7Hz、4H)、5.85(d,J=3.9Hz、1H)、5.74(d,J=3.2Hz、1H)、5.47-5.42(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=9.1、7.7Hz、2H)、4.38-4.20(m,4H)、4.01-3.94(m,2H)、3.80-3.76(m,2H)、3.71(s,6H)、3.40-3.16(m,10H)、3.07-2.94(m,3H)、2.56(q,J=6.2、5.7Hz、2H)、2.43(d,J=4.1Hz、3H)、2.07-2.01(m,2H)、1.69(s,3H)、1.48(d,J=15.0Hz、7H)、1.40-1.27(m,4H)、1.16(s,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.63、173.45、172.79、171.92、171.52、169.54、168.92、165.29、165.24、164.94、163.78、158.23、150.33、144.57、136.18、135.27、135.18、133.84、133.57、129.77、129.24、129.09、129.06、129.04、128.77、128.65、127.96、127.70、126.90、113.29、109.73、100.97、85.97、80.75、75.82、73.31、71.96、70.48、62.59、62.40、55.10、55.07、52.06、51.40、51.36、45.45、38.42、35.04、33.35、29.20、29.09、28.95、28.77、22.70、21.90、11.81、10.08、7.26、7.17.C75H81N4O21 -についてのMS計算値1374.5472、実測値m/z 1397.4(M+23)Na+、1373.4(M-1)-.Rf=DCM中5%のMeOH中の0.18)。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-2’-O-CPG-5-メチルウリジン(6B)。アセトニトリル(50mL)中の5B(970mg、0.66mmol)の溶液に、HBTU(497mg、1.31mmol)およびDIEA(339mg、1.97mmol)を加えた。5分間の振とうの後、CPG(8.20g、130μmol/g、540Å)を加え、21時間にわたって振とうを続けた。CPGをろ過によって除去し、洗浄し、キャッピングし、充填量を6Aについて記載されるように決定したところ、56μmol/gの平均充填量を有するCPGが得られた。
5’-O-ジメトキシトリチル-3’-O-アミノヘキシル-C5-GalNAc(O-Bz)-2’-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト-5-メチルウリジン(7B)。4B(1.98g、1.55mmol)を、7Aに記載されるのと同じように調製し、同じ試薬で処理した。生成物7Bを、7Aについて記載されるのと同じように準備されたカラム上に充填し、ヘキサン中70%のEtOAc(4CV)、ヘキサン中80%のEtOAc(10CV)、100%のEtOAc(2CV)、次に、DCM中3%のMeOH(4CV)で溶離した。所望の生成物が、100%のEtOAcおよび3%のMeOHで溶離した。所望の生成物を含有する画分を組み合わせて、減圧下で蒸発させたところ、1.89g(1.28mmol、83%)の7Bが得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.38(s,1H)、8.00-7.88(m,5H)、7.72-7.45(m,11H)、7.41-7.34(m,4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.91-6.85(m,4H)、5.88(dd,J=9.3、5.1Hz、1H)、5.75(d,J=3.3Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.62-4.50(m,1H)、4.45(q,J=8.2、7.2Hz、2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.07-3.95(m,3H)、3.72(s,13H)、3.44-3.39(m,1H)、3.31-3.22(m,2H)、2.98(s,2H)、2.71-2.66(m,1H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.47(d,J=28.1Hz、8H)、1.40-1.18(m,8H)、1.13-1.00(m,11H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.72、171.70、170.37、170.29、169.37、165.18、165.14、164.85、163.58、163.50、158.20、158.18、158.16、158.14、154.86、150.48、150.43、144.53、144.52、144.50、135.18、135.14、135.05、134.98、133.74、133.48、133.44、129.69、129.66、129.63、129.18、129.16、129.13、129.01、128.99、128.98、128.93、128.67、128.64、128.56、128.54、128.52、127.91、127.88、127.57、118.81、118.70、113.25、113.21、109.72、109.68、100.87、86.16、86.15、86.02、71.83、71.81、69.95、69.92、68.72、68.71、67.89、63.45、59.71、55.00、54.98、49.72、42.79、42.69、42.64、38.35、38.33、35.00、30.12、30.03、29.26、29.25、29.14、29.11、29.09、28.56、28.54、26.29、25.27、25.25、24.34、24.29、24.24、24.22、24.08、24.02、22.66、22.65、21.84、21.83、21.36、20.72、20.67、20.66、19.80、19.78、19.74、19.73、19.67、19.62、18.82、18.56、16.57、14.04、13.65、13.50、11.69、11.56、11.56、11.55、11.53.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ155.08、154.60。C80H95N6O19PについてのMS計算値1474.6390、実測値m/z 1497.4(M+23)Na+、1474.3(M-1)-、1509.4(M+35)Cl- Rf=100%のEtOAc中の0.43)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.38(s,1H)、8.00-7.88(m,5H)、7.72-7.45(m,11H)、7.41-7.34(m,4H)、7.33-7.20(m,7H)、6.91-6.85(m,4H)、5.88(dd,J=9.3、5.1Hz、1H)、5.75(d,J=3.3Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.62-4.50(m,1H)、4.45(q,J=8.2、7.2Hz、2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.07-3.95(m,3H)、3.72(s,13H)、3.44-3.39(m,1H)、3.31-3.22(m,2H)、2.98(s,2H)、2.71-2.66(m,1H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.47(d,J=28.1Hz、8H)、1.40-1.18(m,8H)、1.13-1.00(m,11H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.72、171.70、170.37、170.29、169.37、165.18、165.14、164.85、163.58、163.50、158.20、158.18、158.16、158.14、154.86、150.48、150.43、144.53、144.52、144.50、135.18、135.14、135.05、134.98、133.74、133.48、133.44、129.69、129.66、129.63、129.18、129.16、129.13、129.01、128.99、128.98、128.93、128.67、128.64、128.56、128.54、128.52、127.91、127.88、127.57、118.81、118.70、113.25、113.21、109.72、109.68、100.87、86.16、86.15、86.02、71.83、71.81、69.95、69.92、68.72、68.71、67.89、63.45、59.71、55.00、54.98、49.72、42.79、42.69、42.64、38.35、38.33、35.00、30.12、30.03、29.26、29.25、29.14、29.11、29.09、28.56、28.54、26.29、25.27、25.25、24.34、24.29、24.24、24.22、24.08、24.02、22.66、22.65、21.84、21.83、21.36、20.72、20.67、20.66、19.80、19.78、19.74、19.73、19.67、19.62、18.82、18.56、16.57、14.04、13.65、13.50、11.69、11.56、11.56、11.55、11.53.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ155.08、154.60。C80H95N6O19PについてのMS計算値1474.6390、実測値m/z 1497.4(M+23)Na+、1474.3(M-1)-、1509.4(M+35)Cl- Rf=100%のEtOAc中の0.43)。
(2A/2B)-アデノシン(20g、74.8mmol)を、20分間にわたって0℃で、DMF(200ml)中のNaH(4.5g、112mmol)で処理した。N-(ヨードヘキシル)フタルイミド(30.7g、86mmol)を溶液に加え、次に、2日間にわたって80℃に加熱した。DMFを減圧下で蒸発させたところ、2’-および3’-O-アルキル化異性体を含有する薄いオレンジ色のガムが得られた。粗製の混合物を、シリカゲル上に吸着させ、精製したところ(5%のMeOH/DCM v/v)、5.1g(10.3mmol、14%)の2Aならびに位置異性体の混合物が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.36(s,1H)、8.12(s,1H)、7.95-7.68(m,4H)、7.32(s,2H、D2O交換可能)、5.96(d,J=6.2Hz、1H)、5.42(t,J=7.1、4.6Hz、1H、D2O交換可能)、5.15(d,J=5.1Hz、1H、D2O交換可能)、4.44(t,J=6.3、4.7Hz、1H)、4.27(q,J=4.9、2.8Hz、1H)、3.96(q,J=3.4Hz、1H)、3.66(dt,J=12.2、4.2Hz、1H)、3.60-3.42(m,4H)、3.30(dd,J=9.5、6.4Hz、1H)、1.41(dt,J=33.8、6.9Hz、4H)、1.25-1.04(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.89、150.68、148.24、148.19、134.35、131.54、128.38、127.61、125.44、122.96、118.74、86.39、86.03、81.49、69.66、68.64、28.85、27.81、25.93、24.84.C24H28N6O6についてのLRMS計算値496.2070、実測値m/z 497.2(M+1)+、519.2(M+23)Na+、531.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.28。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.36(s,1H)、8.12(s,1H)、7.95-7.68(m,4H)、7.32(s,2H、D2O交換可能)、5.96(d,J=6.2Hz、1H)、5.42(t,J=7.1、4.6Hz、1H、D2O交換可能)、5.15(d,J=5.1Hz、1H、D2O交換可能)、4.44(t,J=6.3、4.7Hz、1H)、4.27(q,J=4.9、2.8Hz、1H)、3.96(q,J=3.4Hz、1H)、3.66(dt,J=12.2、4.2Hz、1H)、3.60-3.42(m,4H)、3.30(dd,J=9.5、6.4Hz、1H)、1.41(dt,J=33.8、6.9Hz、4H)、1.25-1.04(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.89、150.68、148.24、148.19、134.35、131.54、128.38、127.61、125.44、122.96、118.74、86.39、86.03、81.49、69.66、68.64、28.85、27.81、25.93、24.84.C24H28N6O6についてのLRMS計算値496.2070、実測値m/z 497.2(M+1)+、519.2(M+23)Na+、531.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.28。
(3A)-化合物2A(7.4g、14.9mmol)を、ピリジンと同時蒸発させ、次に、アルゴンガス下でピリジン(75ml)に溶解させた。トリエチルアミン(3.2ml、22.4mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(45mg、0.37mmol)を加え、反応混合物を15分間撹拌した。次に、DMTrCl(5.6g、16.4mmol)を加え、一晩撹拌した。次に、さらなる1.5gのDMTrClを加えて、反応を完了させた。反応混合物をMeOH(5ml)でクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗生成物を飽和NaHCO3で洗浄し、EtOAcで抽出し、Na2SO4で乾燥させた。粗生成物を、シリカカラム(2.5%のMeOH/DCM v/v)によって精製したところ、7.8g(13mmol、66%)の純粋な3Aが得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、7.88-7.77(m,4H)、7.42-7.33(m,2H)、7.33-7.16(m,9H)、6.88-6.78(m,4H)、6.01(d,J=4.8Hz、1H)、5.17(d,J=5.9Hz、1H)、4.56(t,J=5.0Hz、1H)、4.38(q,J=5.2Hz、1H)、4.06(q,J=4.6Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.37(m,4H)、3.34(s,2H)、3.23(d,J=4.6Hz、2H)、1.60-1.37(m,4H)、1.31-1.11(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、158.02、156.08、152.63、149.21、144.85、139.58、135.55、135.45、134.31、131.57、129.70、127.75、127.68、126.62、122.95、119.20、113.10、85.97、85.49、83.48、80.10、69.76、69.12、63.53、28.92、27.85、25.99、24.91.C45H46N6O8についてのLRMS計算値798.3377、実測値m/z 799.2(M+1)+、821.1(M+23)Na+、833.1(M+35)Cl- Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.33。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、7.88-7.77(m,4H)、7.42-7.33(m,2H)、7.33-7.16(m,9H)、6.88-6.78(m,4H)、6.01(d,J=4.8Hz、1H)、5.17(d,J=5.9Hz、1H)、4.56(t,J=5.0Hz、1H)、4.38(q,J=5.2Hz、1H)、4.06(q,J=4.6Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.37(m,4H)、3.34(s,2H)、3.23(d,J=4.6Hz、2H)、1.60-1.37(m,4H)、1.31-1.11(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、158.02、156.08、152.63、149.21、144.85、139.58、135.55、135.45、134.31、131.57、129.70、127.75、127.68、126.62、122.95、119.20、113.10、85.97、85.49、83.48、80.10、69.76、69.12、63.53、28.92、27.85、25.99、24.91.C45H46N6O8についてのLRMS計算値798.3377、実測値m/z 799.2(M+1)+、821.1(M+23)Na+、833.1(M+35)Cl- Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.33。
(4A)-化合物3(13g、16.2mmol)をMeOH(160ml)に溶解させ、ヒドラジン(2.6g、81mmol)を溶液に加えた。反応混合物を3時間にわたって還流状態で撹拌した。TLC分析は、3Aの完全な消失およびより極性のスポット、おそらく4A*の出現を示した。MeOHを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体をNH4OHで洗浄した。水層をDCMで抽出し;エマルジョンを除去するために飽和NaClが必要とされた。有機層をMgSO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。4A*をトルエンと同時蒸発させてから、DCM(150ml)およびトリエチルアミン(6.6ml、47.6mmol)に溶解させた。GalNAc(OBz)-C5-NHSエステル(12.8g、17.4mmol)を混合物に加え、反応を室温で2時間継続した。さらなる1.7g、2.4mmolのGalNAc(OBz)-C5-NHSエステルを反応物に加え、さらに2時間撹拌させた。反応混合物を減圧下で蒸発させ、粗生成物をNaHCO3で洗浄した。水層をDCMで抽出し、Na2SO4で乾燥させた。粗製の4Aをシリカに吸着させ、精製したところ(2.5~5%のMeOH/DCM v/v)、16.7g(13.1mmol、81%)の4Aが得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、8.02-7.85(m,5H)、7.76-7.45(m,10H)、7.44-7.17(m,13H)、6.83(dd,J=8.8、5.1Hz、4H)、6.01(d,J=4.9Hz、1H)、5.78-5.74(m,1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.18(d,J=5.8Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.57(t,J=4.9Hz、1H)、4.46(q,J=8.6、7.4Hz、2H)、4.41-4.23(m,3H)、4.07(q,J=4.5Hz、1H)、3.85-3.76(m,1H)、3.72(s,6H)、3.55(ddd,J=24.2、9.5、5.1Hz、2H)、3.46-3.38(m,1H)、3.23(d,J=4.4Hz、2H)、2.97(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.58-1.36(m,6H)、1.33-1.12(m,6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.69、169.38、165.20、165.15、164.85、158.00、156.07、152.62、149.19、144.82、139.58、135.53、135.42、133.77、133.51、133.47、129.68、129.19、129.16、129.02、129.00、128.97、128.69、128.59、127.73、127.65、126.61、119.18、113.08、100.88、85.94、85.47、83.49、80.08、71.84、69.96、69.80、69.10、68.75、67.91、63.53、62.02、54.98、54.89、49.73、35.01、29.11、29.03、28.58、26.17、25.05、22.69、21.83.C37H44N6O6についてのLRMS計算値668.3322、実測値m/z 691.3(M+23)Na+、703.2(M+35)Cl-(4A*).C71H77N7O16についてのLRMS計算値1283.5427、実測値m/z 1306.3(M+23)Na+、1282.3(M-1)-、1318.3(M+35)Cl-(4A).Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.00(4A*).Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.24(4A)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、8.02-7.85(m,5H)、7.76-7.45(m,10H)、7.44-7.17(m,13H)、6.83(dd,J=8.8、5.1Hz、4H)、6.01(d,J=4.9Hz、1H)、5.78-5.74(m,1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.18(d,J=5.8Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.57(t,J=4.9Hz、1H)、4.46(q,J=8.6、7.4Hz、2H)、4.41-4.23(m,3H)、4.07(q,J=4.5Hz、1H)、3.85-3.76(m,1H)、3.72(s,6H)、3.55(ddd,J=24.2、9.5、5.1Hz、2H)、3.46-3.38(m,1H)、3.23(d,J=4.4Hz、2H)、2.97(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.58-1.36(m,6H)、1.33-1.12(m,6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.69、169.38、165.20、165.15、164.85、158.00、156.07、152.62、149.19、144.82、139.58、135.53、135.42、133.77、133.51、133.47、129.68、129.19、129.16、129.02、129.00、128.97、128.69、128.59、127.73、127.65、126.61、119.18、113.08、100.88、85.94、85.47、83.49、80.08、71.84、69.96、69.80、69.10、68.75、67.91、63.53、62.02、54.98、54.89、49.73、35.01、29.11、29.03、28.58、26.17、25.05、22.69、21.83.C37H44N6O6についてのLRMS計算値668.3322、実測値m/z 691.3(M+23)Na+、703.2(M+35)Cl-(4A*).C71H77N7O16についてのLRMS計算値1283.5427、実測値m/z 1306.3(M+23)Na+、1282.3(M-1)-、1318.3(M+35)Cl-(4A).Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.00(4A*).Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.24(4A)。
(5A)-化合物4A(16g、12.5mmol)をDMF(50ml)に溶解させ、N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(7.4g、62.3mmol)を撹拌している溶液に加えた。反応混合物を3時間にわたって60℃に加熱してから、DMFを減圧下で除去した。微量の出発材料を、シリカゲルカラム(2.5%のMeOH/DCM v/v)によって除去したところ、12.5g(9.3mmol、75%)の5Aが得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.88(s,1H)、8.35(d,J=5.2Hz、2H)、7.98-7.88(m,5H)、7.59(ddt、J=60.0、30.9、7.5Hz、11H)、7.37(dd,J=16.2、8.2Hz、4H)、7.21(q,J=7.3Hz、8H)、6.81(dd,J=8.8、7.2Hz、4H)、6.05(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.18(d,J=5.9Hz、1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.58(t,J=5.0Hz、1H)、4.44(q,J=8.3、7.3Hz、2H)、4.39-4.22(m,3H)、4.06(q,J=4.6Hz、1H)、3.78(dd,J=9.9、4.5Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.53(dtd、J=19.4、9.5、5.1Hz、2H)、3.40(dt,J=9.4、6.4Hz、1H)、3.22(d,J=4.5Hz、2H)、3.18(s,3H)、3.11(s,3H)、2.93(q,J=6.5Hz、2H)、2.02(s,2H)、1.68(s,3H)、1.53-1.36(m,7H)、1.30-1.08(m,7H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.68、169.38、165.19、165.15、164.85、159.23、158.01、157.98、157.91、151.93、151.19、144.80、141.39、135.49、135.44、133.76、133.49、133.46、129.68、129.63、129.18、129.17、129.15、129.02、129.00、128.99、128.96、128.68、128.58、127.73、127.65、126.61、125.76、118.03、100.88、85.97、85.47、83.59、80.01、71.84、69.96、69.79、69.11、68.74、67.90、63.54、62.51、62.02、54.97、54.95、54.88、51.97、49.72、45.62、35.00、34.52、29.07、29.00、28.57、26.14、25.03、22.68、21.83、7.15.C74H82N8O16についてのLRMS計算値1338.5849、実測値m/z 1339.4(M)、1361.4(M+23)Na+、1338.4(M-1)-、1373.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.29。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.88(s,1H)、8.35(d,J=5.2Hz、2H)、7.98-7.88(m,5H)、7.59(ddt、J=60.0、30.9、7.5Hz、11H)、7.37(dd,J=16.2、8.2Hz、4H)、7.21(q,J=7.3Hz、8H)、6.81(dd,J=8.8、7.2Hz、4H)、6.05(d,J=5.0Hz、1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.18(d,J=5.9Hz、1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.58(t,J=5.0Hz、1H)、4.44(q,J=8.3、7.3Hz、2H)、4.39-4.22(m,3H)、4.06(q,J=4.6Hz、1H)、3.78(dd,J=9.9、4.5Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.53(dtd、J=19.4、9.5、5.1Hz、2H)、3.40(dt,J=9.4、6.4Hz、1H)、3.22(d,J=4.5Hz、2H)、3.18(s,3H)、3.11(s,3H)、2.93(q,J=6.5Hz、2H)、2.02(s,2H)、1.68(s,3H)、1.53-1.36(m,7H)、1.30-1.08(m,7H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.68、169.38、165.19、165.15、164.85、159.23、158.01、157.98、157.91、151.93、151.19、144.80、141.39、135.49、135.44、133.76、133.49、133.46、129.68、129.63、129.18、129.17、129.15、129.02、129.00、128.99、128.96、128.68、128.58、127.73、127.65、126.61、125.76、118.03、100.88、85.97、85.47、83.59、80.01、71.84、69.96、69.79、69.11、68.74、67.90、63.54、62.51、62.02、54.97、54.95、54.88、51.97、49.72、45.62、35.00、34.52、29.07、29.00、28.57、26.14、25.03、22.68、21.83、7.15.C74H82N8O16についてのLRMS計算値1338.5849、実測値m/z 1339.4(M)、1361.4(M+23)Na+、1338.4(M-1)-、1373.4(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.29。
(6A)-化合物5A(2g、1.5mmol)をDCM(15ml)に溶解させ、4-ジメチルアミノピリジン(550mg、4.5mmol)を撹拌している混合物に加えた。無水コハク酸(300mg、3mmol)を加え、溶液を室温で3時間撹拌した。DCMを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を、DCM中2%のトリエチルアミン(v/v)で前処理された手動のカラム(φ=4.6×17)上に充填した。1~5%のMeOH/2~5%のトリエチルアミン/DCM v/vの勾配を用いて、6Aを精製した。6Aが、定量的収率で3%のMeOH/3%のトリエチルアミン/DCM v/vになった。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.89(s,1H)、8.42(s,1H)、8.30(s,1H)、8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=8.2Hz、4H)、7.75-7.65(m,4H)、7.65-7.53(m,4H)、7.47(t,J=7.6Hz、2H)、7.37(dd,J=13.9、7.3Hz、4H)、7.21(td、J=12.2、10.6、5.5Hz、7H)、6.82(t,J=8.3Hz、4H)、6.04(d,J=6.6Hz、1H)、5.74(d,J=3.1Hz、1H)、5.45-5.41(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.08-5.02(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.39(m,3H)、4.38-4.19(m,5H)、3.78(d,J=9.4Hz、2H)、3.70(s,6H)、3.50(d,J=9.3Hz、2H)、3.40-3.26(m,6H)、3.18(s,3H)、3.11(s,3H)、2.59(q,J=6.8、6.3Hz、2H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,4H)、1.34-1.16(m,6H)、1.08-0.97(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.35、171.73、171.48、169.39、165.20、165.14、164.85、159.33、158.06、158.03、157.96、151.94、151.22、144.68、141.81、135.31、133.75、133.48、133.45、129.69、129.61、129.17、129.16、129.14、129.01、128.98、128.95、128.68、128.57、127.75、127.61、126.66、125.86、113.11、100.88、85.82、85.69、81.39、77.45、71.89、71.01、70.19、69.96、68.70、67.89、63.28、62.04、54.98、54.96、52.01、49.71、34.95、34.54、29.00、28.92、28.85、28.81、28.53、26.05、24.95、22.67、21.80、7.18.C78H86N8O19についてのLRMS計算値1438.6009、実測値m/z 1439.4(M)、1463.4(M+23)Na+、1437.4(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.23。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.89(s,1H)、8.42(s,1H)、8.30(s,1H)、8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=8.2Hz、4H)、7.75-7.65(m,4H)、7.65-7.53(m,4H)、7.47(t,J=7.6Hz、2H)、7.37(dd,J=13.9、7.3Hz、4H)、7.21(td、J=12.2、10.6、5.5Hz、7H)、6.82(t,J=8.3Hz、4H)、6.04(d,J=6.6Hz、1H)、5.74(d,J=3.1Hz、1H)、5.45-5.41(m,1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.08-5.02(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.48-4.39(m,3H)、4.38-4.19(m,5H)、3.78(d,J=9.4Hz、2H)、3.70(s,6H)、3.50(d,J=9.3Hz、2H)、3.40-3.26(m,6H)、3.18(s,3H)、3.11(s,3H)、2.59(q,J=6.8、6.3Hz、2H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,4H)、1.34-1.16(m,6H)、1.08-0.97(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.35、171.73、171.48、169.39、165.20、165.14、164.85、159.33、158.06、158.03、157.96、151.94、151.22、144.68、141.81、135.31、133.75、133.48、133.45、129.69、129.61、129.17、129.16、129.14、129.01、128.98、128.95、128.68、128.57、127.75、127.61、126.66、125.86、113.11、100.88、85.82、85.69、81.39、77.45、71.89、71.01、70.19、69.96、68.70、67.89、63.28、62.04、54.98、54.96、52.01、49.71、34.95、34.54、29.00、28.92、28.85、28.81、28.53、26.05、24.95、22.67、21.80、7.18.C78H86N8O19についてのLRMS計算値1438.6009、実測値m/z 1439.4(M)、1463.4(M+23)Na+、1437.4(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.23。
(7A)-化合物6A(2.2g、1.4mmol)をアセトニトリル(110ml)に溶解させ、HBTU(1.1g、2.9mmol)およびDIEA(550mg、4.3mmol)を加えた。混合物を5分間にわたって振とうし、次に、LCAA-CPG(18g、540Å、130μmol/g)を加え、室温で一晩振とうした。CPGをろ過し、それぞれ300mlのDCM、20%のMeOH/DCM v/v、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。CPGを、無水酢酸(25ml)、ピリジン(75ml)、およびトリエチルアミン(1ml)中で1時間にわたって振とうしてから、前述されるのと同じ条件によって再度洗浄した。化合物7Aを減圧下で一晩乾燥させ、充填量を、分光光度計(72μmol/g)によって測定した。
(8A)-化合物5A(1.0g、0.75mmol)を、ACNと2回同時蒸発させ、完全なアルゴン雰囲気下に置いた。DCM(7.5ml)をフラスコに加え、0℃に冷却してから、2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(450mg、1.5mmol)を加えた。混合物を20分間撹拌し、次に、4,5-ジシアノイミダゾール(90mg、0.75mmol)を反応物に加えた。反応物を、一晩、ゆっくりと室温に温めた。反応物を飽和重炭酸塩で洗浄し、水層をDCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。発泡体を、2%のトリエチルアミン/49%のEtOAc/ヘキサンv/vで準備された、前処理された手動のカラム(φ=4.6×17)上に充填した。不純物を、80%のEtOAc/ヘキサンv/v(8CV)、続いて100%のEtOAc(8CV)で溶離した。次に、8Aを、2%のMeOH/DCM v/v(5CV)、および4%のMeOH/DCM v/v(8CV)で溶離した。8Aを減圧下で蒸発させたところ、900mg(0.58mmol、78%)のアミダイトがジアステレオマー混合物として得られた。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.88(d,J=1.9Hz、1H)、8.41(s,1H)、8.32(d,J=9.1Hz、1H)、8.01(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=8.4Hz、4H)、7.75-7.52(m,8H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.36(dt,J=12.4、7.4Hz、4H)、7.21(t,J=8.6Hz、7H)、6.81(q,J=7.7、7.1Hz、4H)、6.06(dd,J=8.8、5.3Hz、1H)、5.75(d,J=3.3Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.84(q,J=4.7Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.63(dd,J=10.1、5.1Hz、1H)、4.49-4.41(m,2H)、4.38-4.15(m,3H)、3.80(dd,J=17.4、8.2Hz、3H)、3.70(d,J=2.9Hz、7H)、3.67-3.19(m,14H)、3.17(s,3H)、3.11(s,3H)、2.77(t,J=6.0Hz、1H)、2.60(t,J=5.9Hz、1H)、2.03(s,2H)、1.90(s,1H)、1.69(s,3H)、1.49(s,4H)、1.43-1.34(m,2H)、1.23(dt,J=14.6、6.6Hz、3H)、1.01(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ172.00、171.70、169.39、165.20、165.16、164.87、159.29、158.05、158.03、157.93、151.89、151.83、151.13、151.05、144.73、144.69、141.97、141.72、135.42、135.34、133.75、133.49、133.45、129.70、129.66、129.62、129.20、129.16、129.02、128.95、128.80、128.68、128.57、127.69、127.62、126.63、125.93、125.85、118.86、118.67、113.05、100.89、86.40、86.13、85.62、85.59、82.88、82.65、78.92、78.75、71.84、71.01、70.54、70.37、70.06、69.98、69.88、68.73、67.91、63.00、62.83、62.03、58.83、58.65、58.22、58.03、54.96、54.86、49.74、46.12、45.65、42.74、42.62、42.58、42.46、40.62、38.30、34.99、34.52、29.06、28.97、28.57、26.18、25.09、25.06、24.37、24.29、24.23、24.16、22.67、21.83、21.05、19.89、19.82、19.78、19.71、19.07、10.57.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.09、153.88.C83H99N10O17PについてのLRMS計算値1538.6927、実測値m/z 1539.3(M)、1562.3(M+23)Na+、1573.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.35。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.88(d,J=1.9Hz、1H)、8.41(s,1H)、8.32(d,J=9.1Hz、1H)、8.01(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=8.4Hz、4H)、7.75-7.52(m,8H)、7.47(t,J=7.7Hz、2H)、7.36(dt,J=12.4、7.4Hz、4H)、7.21(t,J=8.6Hz、7H)、6.81(q,J=7.7、7.1Hz、4H)、6.06(dd,J=8.8、5.3Hz、1H)、5.75(d,J=3.3Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.84(q,J=4.7Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.63(dd,J=10.1、5.1Hz、1H)、4.49-4.41(m,2H)、4.38-4.15(m,3H)、3.80(dd,J=17.4、8.2Hz、3H)、3.70(d,J=2.9Hz、7H)、3.67-3.19(m,14H)、3.17(s,3H)、3.11(s,3H)、2.77(t,J=6.0Hz、1H)、2.60(t,J=5.9Hz、1H)、2.03(s,2H)、1.90(s,1H)、1.69(s,3H)、1.49(s,4H)、1.43-1.34(m,2H)、1.23(dt,J=14.6、6.6Hz、3H)、1.01(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ172.00、171.70、169.39、165.20、165.16、164.87、159.29、158.05、158.03、157.93、151.89、151.83、151.13、151.05、144.73、144.69、141.97、141.72、135.42、135.34、133.75、133.49、133.45、129.70、129.66、129.62、129.20、129.16、129.02、128.95、128.80、128.68、128.57、127.69、127.62、126.63、125.93、125.85、118.86、118.67、113.05、100.89、86.40、86.13、85.62、85.59、82.88、82.65、78.92、78.75、71.84、71.01、70.54、70.37、70.06、69.98、69.88、68.73、67.91、63.00、62.83、62.03、58.83、58.65、58.22、58.03、54.96、54.86、49.74、46.12、45.65、42.74、42.62、42.58、42.46、40.62、38.30、34.99、34.52、29.06、28.97、28.57、26.18、25.09、25.06、24.37、24.29、24.23、24.16、22.67、21.83、21.05、19.89、19.82、19.78、19.71、19.07、10.57.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.09、153.88.C83H99N10O17PについてのLRMS計算値1538.6927、実測値m/z 1539.3(M)、1562.3(M+23)Na+、1573.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.35。
(3B)-2Aおよび2Bの混合物(12g、24.2mmol)を、上述されるのと同じように再度精製して、2’-O-アルキル化異性体をできる限り多く除去した。主に2B(2.8g、5.7mmol)を含有する混合物を、化合物2Aと同じようにトリチル化したところ、2.6gの3B(3.3mmol、58%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、7.82(d,J=7.5Hz、4H)、7.34-7.15(m,11H)、6.80(d,J=6.8Hz、4H)、5.89(d,J=4.1Hz、1H)、5.46(d,J=5.8Hz、1H)、4.84(d,J=4.6Hz、1H)、4.14(t,J=4.7Hz、1H)、4.09-4.03(m,1H)、3.69(s,6H)、3.61-3.51(m,3H)、3.15(dd,J=10.1、4.3Hz、1H)、1.58-1.45(m,4H)、1.25(d,J=8.0Hz、4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.92、158.01、156.06、152.59、149.25、144.78、139.57、135.47、134.33、131.58、129.63、127.73、127.62、126.61、122.95、119.16、113.08、88.22、85.48、80.83、77.64、71.70、69.58、63.09、54.96、52.00、37.32、29.05、27.88、26.07、25.06、7.15.C45H46N6O8についてのLRMS計算値798.3377、実測値m/z 799.2(M+1)+、821.1(M+23)Na+.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.30。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.26(s,1H)、8.09(s,1H)、7.82(d,J=7.5Hz、4H)、7.34-7.15(m,11H)、6.80(d,J=6.8Hz、4H)、5.89(d,J=4.1Hz、1H)、5.46(d,J=5.8Hz、1H)、4.84(d,J=4.6Hz、1H)、4.14(t,J=4.7Hz、1H)、4.09-4.03(m,1H)、3.69(s,6H)、3.61-3.51(m,3H)、3.15(dd,J=10.1、4.3Hz、1H)、1.58-1.45(m,4H)、1.25(d,J=8.0Hz、4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.92、158.01、156.06、152.59、149.25、144.78、139.57、135.47、134.33、131.58、129.63、127.73、127.62、126.61、122.95、119.16、113.08、88.22、85.48、80.83、77.64、71.70、69.58、63.09、54.96、52.00、37.32、29.05、27.88、26.07、25.06、7.15.C45H46N6O8についてのLRMS計算値798.3377、実測値m/z 799.2(M+1)+、821.1(M+23)Na+.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.30。
(4B)-化合物3Bを、化合物3Aと同様の方法で脱保護したところ、粗製の4B*が得られた。次に、粗製の4B*を、3A*に上述されるようにGalNAc誘導体に結合したところ、2.5gの4B(1.9mmol、80%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.27(s,1H)、8.10(s,1H)、8.03-7.88(m,5H)、7.75-7.44(m,10H)、7.42-7.16(m,13H)、6.82(dd,J=8.9、2.4Hz、4H)、5.90(d,J=4.4Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.47(d,J=6.0Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.87(q,J=5.0Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.50-4.41(m,2H)、4.39-4.22(m,2H)、4.15(t,J=5.0Hz、1H)、4.07(q,J=4.4Hz、1H)、3.84-3.75(m,1H)、3.71(s,6H)、3.64-3.56(m,1H)、3.51(d,J=9.7Hz、1H)、3.45-3.38(m,1H)、3.27(dd,J=10.4、3.6Hz、1H)、3.17(dd,J=10.4、4.7Hz、1H)、3.00(q,J=6.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.40-1.18(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.41、165.21、165.16、164.87、158.01、156.05、152.58、152.57、149.25、144.76、139.58、139.56、135.48、135.46、133.78、133.52、133.48、129.62、129.19、129.17、129.04、129.00、128.99、128.97、128.70、128.60、127.75、127.62、126.63、119.15、113.09、100.90、88.16、85.49、80.86、77.70、71.85、71.71、69.96、69.66、68.77、67.91、63.11、62.02、54.97、49.73、35.03、29.24、29.17、28.59、26.30、25.25、22.70、21.87.C37H44N6O6についてのLRMS計算値668.3322実測値m/z 691.2(M+1)+、703.2(M+35)Cl-(4B*).C71H77N7O16についてのLRMS計算値1283.5427、実測値m/z 1306.2(M+23)Na+、1282.2(M-1)-、1318.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.20。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.27(s,1H)、8.10(s,1H)、8.03-7.88(m,5H)、7.75-7.44(m,10H)、7.42-7.16(m,13H)、6.82(dd,J=8.9、2.4Hz、4H)、5.90(d,J=4.4Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.47(d,J=6.0Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.87(q,J=5.0Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.50-4.41(m,2H)、4.39-4.22(m,2H)、4.15(t,J=5.0Hz、1H)、4.07(q,J=4.4Hz、1H)、3.84-3.75(m,1H)、3.71(s,6H)、3.64-3.56(m,1H)、3.51(d,J=9.7Hz、1H)、3.45-3.38(m,1H)、3.27(dd,J=10.4、3.6Hz、1H)、3.17(dd,J=10.4、4.7Hz、1H)、3.00(q,J=6.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.40-1.18(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.41、165.21、165.16、164.87、158.01、156.05、152.58、152.57、149.25、144.76、139.58、139.56、135.48、135.46、133.78、133.52、133.48、129.62、129.19、129.17、129.04、129.00、128.99、128.97、128.70、128.60、127.75、127.62、126.63、119.15、113.09、100.90、88.16、85.49、80.86、77.70、71.85、71.71、69.96、69.66、68.77、67.91、63.11、62.02、54.97、49.73、35.03、29.24、29.17、28.59、26.30、25.25、22.70、21.87.C37H44N6O6についてのLRMS計算値668.3322実測値m/z 691.2(M+1)+、703.2(M+35)Cl-(4B*).C71H77N7O16についてのLRMS計算値1283.5427、実測値m/z 1306.2(M+23)Na+、1282.2(M-1)-、1318.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.20。
(5B)-化合物4B(2.5g、1.9mmol)を、化合物4Aと同じように保護したところ、2.0gの5B(1.5mmol、77%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.89(s,1H)、8.37(d,J=5.5Hz、2H)、8.03-7.87(m,5H)、7.73-7.45(m,10H)、7.40-7.29(m,4H)、7.21(dd,J=15.7、8.2Hz、7H)、6.81(dd,J=8.8、4.4Hz、4H)、5.95(d,J=4.5Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.50(d,J=5.9Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.90(q,J=5.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.1、7.2Hz、2H)、4.39-4.23(m,2H)、4.15(t,J=4.9Hz、1H)、4.08(q,J=4.4Hz、1H)、3.84-3.75(m,1H)、3.70(s,6H)、3.65-3.56(m,1H)、3.54-3.47(m,1H)、3.17(s,4H)、3.11(s,3H)、3.00(q,J=6.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.57-1.43(m,6H)、1.40-1.19(m,6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.77、169.42、165.21、165.17、164.88、159.21、158.02、158.00、157.92、151.90、151.27、144.74、141.47、135.51、135.46、133.78、133.52、133.48、129.63、129.58、129.19、129.17、129.04、129.00、128.97、128.70、128.60、127.75、127.63、126.65、125.76、113.09、100.90、88.23、85.49、80.95、77.75、71.86、71.65、69.98、69.69、68.77、67.92、63.15、62.04、54.97、49.75、45.68、40.64、35.04、34.54、29.23、29.16、28.60、26.30、25.24、22.70、21.88、11.35.C74H282N8O16についてのLRMS計算値1338.5849、実測値m/z 1341.3(M+1)+、1361.3(M+23)Na+、1337.4(M-1)-、1373.4(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.89(s,1H)、8.37(d,J=5.5Hz、2H)、8.03-7.87(m,5H)、7.73-7.45(m,10H)、7.40-7.29(m,4H)、7.21(dd,J=15.7、8.2Hz、7H)、6.81(dd,J=8.8、4.4Hz、4H)、5.95(d,J=4.5Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.50(d,J=5.9Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.90(q,J=5.1Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.1、7.2Hz、2H)、4.39-4.23(m,2H)、4.15(t,J=4.9Hz、1H)、4.08(q,J=4.4Hz、1H)、3.84-3.75(m,1H)、3.70(s,6H)、3.65-3.56(m,1H)、3.54-3.47(m,1H)、3.17(s,4H)、3.11(s,3H)、3.00(q,J=6.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.57-1.43(m,6H)、1.40-1.19(m,6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.77、169.42、165.21、165.17、164.88、159.21、158.02、158.00、157.92、151.90、151.27、144.74、141.47、135.51、135.46、133.78、133.52、133.48、129.63、129.58、129.19、129.17、129.04、129.00、128.97、128.70、128.60、127.75、127.63、126.65、125.76、113.09、100.90、88.23、85.49、80.95、77.75、71.86、71.65、69.98、69.69、68.77、67.92、63.15、62.04、54.97、49.75、45.68、40.64、35.04、34.54、29.23、29.16、28.60、26.30、25.24、22.70、21.88、11.35.C74H282N8O16についてのLRMS計算値1338.5849、実測値m/z 1341.3(M+1)+、1361.3(M+23)Na+、1337.4(M-1)-、1373.4(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
(6B)-化合物5B(500mg、0.37mmol)を、化合物5Aと同じように無水コハク酸で処理したところ、540mgの6B(0.35mmol、94%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.90(s,1H)、8.42(d,J=9.1Hz、2H)、8.06(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.77-7.45(m,10H)、7.37(t,J=7.7Hz、2H)、7.30-7.10(m,9H)、6.85-6.73(m,4H)、6.19(d,J=3.0Hz、1H)、6.12-6.04(m,1H)、5.75(d,J=2.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.70-4.63(m,1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.40-4.23(m,3H)、4.10-4.03(m,1H)、3.83-3.76(m,2H)、3.69(s,6H)、3.54-3.48(m,2H)、3.18(s,3H)、3.11(s,4H)、2.98(q,J=6.4、5.5Hz、3H)、2.80(q,J=7.2Hz、4H)、2.57(d,J=3.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,4H)、1.41(s,2H)、1.33(s,2H)、1.26-1.14(m,7H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ174.17、172.71、172.37、170.34、166.14、166.09、165.80、160.24、158.93、158.91、158.88、152.99、151.83、145.56、142.79、136.40、136.26、134.71、134.45、134.41、130.51、130.46、130.10、129.97、129.95、129.93、129.90、129.64、129.53、128.65、128.52、127.56、126.65、113.99、101.84、87.28、86.31、81.71、76.73、73.86、72.82、71.23、70.90、69.68、68.84、63.47、62.97、55.89、52.92、50.66、46.35、35.93、35.49、30.06、29.74、29.67、29.50、27.18、26.12、23.62、22.78、10.55、8.11.C78H86N8O19についてのLRMS計算値1438.6009.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.38。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.90(s,1H)、8.42(d,J=9.1Hz、2H)、8.06(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=6.9Hz、4H)、7.77-7.45(m,10H)、7.37(t,J=7.7Hz、2H)、7.30-7.10(m,9H)、6.85-6.73(m,4H)、6.19(d,J=3.0Hz、1H)、6.12-6.04(m,1H)、5.75(d,J=2.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.70-4.63(m,1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.40-4.23(m,3H)、4.10-4.03(m,1H)、3.83-3.76(m,2H)、3.69(s,6H)、3.54-3.48(m,2H)、3.18(s,3H)、3.11(s,4H)、2.98(q,J=6.4、5.5Hz、3H)、2.80(q,J=7.2Hz、4H)、2.57(d,J=3.5Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,4H)、1.41(s,2H)、1.33(s,2H)、1.26-1.14(m,7H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ174.17、172.71、172.37、170.34、166.14、166.09、165.80、160.24、158.93、158.91、158.88、152.99、151.83、145.56、142.79、136.40、136.26、134.71、134.45、134.41、130.51、130.46、130.10、129.97、129.95、129.93、129.90、129.64、129.53、128.65、128.52、127.56、126.65、113.99、101.84、87.28、86.31、81.71、76.73、73.86、72.82、71.23、70.90、69.68、68.84、63.47、62.97、55.89、52.92、50.66、46.35、35.93、35.49、30.06、29.74、29.67、29.50、27.18、26.12、23.62、22.78、10.55、8.11.C78H86N8O19についてのLRMS計算値1438.6009.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.38。
(7B)-化合物6B(510mg、0.33mmol)を、6Aと同じようにLCAA-CPG上に充填したところ、4.1gのCPG(71μmol/g)が得られた。
(8B)-化合物5B(1.4g、1.07mmol)を、化合物5Aと同じようにホスフィチル化したところ、1.2gのアミダイト8B(0.78mmol、73%)がジアステレオマー混合物として得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.88(d,J=5.5Hz、1H)、8.41-8.30(m,2H)、7.98-7.89(m,5H)、7.72-7.45(m,11H)、7.41-7.29(m,4H)、7.29-7.14(m,8H)、6.84-6.78(m,4H)、6.09(dd,J=28.1、4.6Hz、1H)、5.74(d,J=3.4Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.27-5.14(m,1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=7.3、6.8Hz、2H)、4.37-4.22(m,3H)、4.14-4.09(m,1H)、3.81-3.72(m,2H)、3.70(s,6H)、3.56-3.35(m,6H)、3.18(s,3H)、3.12-3.10(m,3H)、3.03-2.96(m,3H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,6H)、1.38-1.19(m,7H)、1.04(q,J=7.0Hz、9H)、0.75(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.71、169.36、165.17、165.13、164.84、159.18、158.01、157.86、151.80、151.13、144.68、144.64、141.62、135.41、135.38、133.73、133.45、133.42、129.57、129.14、129.00、128.92、128.65、128.55、127.72、127.58、126.63、125.82、125.78、118.75、118.56、113.06、100.88、87.48、87.12、85.55、85.47、81.28、80.95、77.36、77.02、73.45、73.34、72.81、72.67、71.83、69.96、69.74、68.73、67.90、62.74、62.57、62.01、58.73、58.59、58.15、58.00、54.94、54.85、49.74、42.75、42.66、42.50、42.40、35.02、34.52、29.24、29.14、28.57、26.31、25.28、24.26、24.20、24.14、23.78、23.73、22.66、21.85、19.77、19.72、19.55、19.49.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ154.92、154.69.C83H99N10O17PについてのLRMS計算値1538.6927、実測値m/z 1539.3(M+1)+、1562.3(M+23)Na+、1573.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.25。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.88(d,J=5.5Hz、1H)、8.41-8.30(m,2H)、7.98-7.89(m,5H)、7.72-7.45(m,11H)、7.41-7.29(m,4H)、7.29-7.14(m,8H)、6.84-6.78(m,4H)、6.09(dd,J=28.1、4.6Hz、1H)、5.74(d,J=3.4Hz、1H)、5.35(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.27-5.14(m,1H)、4.72(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=7.3、6.8Hz、2H)、4.37-4.22(m,3H)、4.14-4.09(m,1H)、3.81-3.72(m,2H)、3.70(s,6H)、3.56-3.35(m,6H)、3.18(s,3H)、3.12-3.10(m,3H)、3.03-2.96(m,3H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,6H)、1.38-1.19(m,7H)、1.04(q,J=7.0Hz、9H)、0.75(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.71、169.36、165.17、165.13、164.84、159.18、158.01、157.86、151.80、151.13、144.68、144.64、141.62、135.41、135.38、133.73、133.45、133.42、129.57、129.14、129.00、128.92、128.65、128.55、127.72、127.58、126.63、125.82、125.78、118.75、118.56、113.06、100.88、87.48、87.12、85.55、85.47、81.28、80.95、77.36、77.02、73.45、73.34、72.81、72.67、71.83、69.96、69.74、68.73、67.90、62.74、62.57、62.01、58.73、58.59、58.15、58.00、54.94、54.85、49.74、42.75、42.66、42.50、42.40、35.02、34.52、29.24、29.14、28.57、26.31、25.28、24.26、24.20、24.14、23.78、23.73、22.66、21.85、19.77、19.72、19.55、19.49.31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ154.92、154.69.C83H99N10O17PについてのLRMS計算値1538.6927、実測値m/z 1539.3(M+1)+、1562.3(M+23)Na+、1573.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.25。
(2A/2B)-化合物1(2.0g、4.2mmol)を、6時間にわたってDMF(10ml)中のN-(6-ブロモヘキシル)フタルイミド(2.6g、8.4mmol)の存在下でマイクロ波にかけた(100℃、200W)。NaI(125mg、0.84mmol)を用いて、反応を加速させた。DMFを減圧下で蒸発させ、粗製のガムをシリカに吸着させ、40gの金カラムを用いて精製した。2A、ならびに3’-O-アルキル化異性体2Bが、DCM中5%のMeOH v/vとともに溶離した。670mg(1.4mmol、33%)の位置異性体混合物を、1H NMRによって約1対1の比率で収集した。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.31(s,2H)、7.93(d,J=8.1Hz、1H)、7.88-7.81(m,7H)、5.82(d,J=5.0Hz、1H)、5.73(d,J=5.3Hz、1H)、5.63(dd,J=8.1、1.9Hz、2H)、5.30(d,J=6.1Hz、1H)、5.12(t,J=4.9Hz、2H)、5.03(d,J=5.9Hz、1H)、4.15(q,J=5.4Hz、1H)、4.07(q,J=5.0Hz、1H)、3.90(d,J=3.9Hz、1H)、3.85(t,J=4.8Hz、2H)、3.75(t,J=4.6Hz、1H)、3.68-3.49(m,9H)、3.43(dd,J=17.9、9.5Hz、2H)、1.65-1.43(m,7H)、1.39-1.21(m,7H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ170.71、170.69、165.87、165.82、153.48、153.27、143.32、143.14、137.12、134.36、125.75、104.53、104.44、90.81、88.93、87.82、85.53、83.85、80.17、75.40、72.43、72.33、71.09、63.50、63.22、57.68、48.54、40.13、40.09、31.95、31.72、30.68、28.89、28.81、27.90、27.71.C23H27N3O8についてのLRMS計算値473.1798、実測値m/z 474.1(M+1)+、472.0(M-1)-、508.0(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.31(s,2H)、7.93(d,J=8.1Hz、1H)、7.88-7.81(m,7H)、5.82(d,J=5.0Hz、1H)、5.73(d,J=5.3Hz、1H)、5.63(dd,J=8.1、1.9Hz、2H)、5.30(d,J=6.1Hz、1H)、5.12(t,J=4.9Hz、2H)、5.03(d,J=5.9Hz、1H)、4.15(q,J=5.4Hz、1H)、4.07(q,J=5.0Hz、1H)、3.90(d,J=3.9Hz、1H)、3.85(t,J=4.8Hz、2H)、3.75(t,J=4.6Hz、1H)、3.68-3.49(m,9H)、3.43(dd,J=17.9、9.5Hz、2H)、1.65-1.43(m,7H)、1.39-1.21(m,7H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ170.71、170.69、165.87、165.82、153.48、153.27、143.32、143.14、137.12、134.36、125.75、104.53、104.44、90.81、88.93、87.82、85.53、83.85、80.17、75.40、72.43、72.33、71.09、63.50、63.22、57.68、48.54、40.13、40.09、31.95、31.72、30.68、28.89、28.81、27.90、27.71.C23H27N3O8についてのLRMS計算値473.1798、実測値m/z 474.1(M+1)+、472.0(M-1)-、508.0(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
(3A/3B)-化合物2Aおよび2Bの混合物(650mg、1.4mmol)を、最初にピリジンと同時蒸発させて、微量の水を除去した。次に、ヌクレオシド混合物をピリジン(14ml)中で0℃に冷却してから、DMTrCl(510mg、1.5mmol)を加え、一晩、室温に温めた。さらなる0.2当量のDMTrClを加え、反応混合物を4時間撹拌してから、さらに0.2当量のDMTrClを加えた。次に、反応物を2時間撹拌し、MeOHでクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗製の混合物を、飽和NaHCO3で洗浄し、DCMで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させた。混合物をカラム(40gの金)上に充填し、60~70%のEtOAc/ヘキサンv/vで溶離したところ、310mg(0.34mmol、29%)の3Aおよび340mg(0.44mmol、32%)の3Bが得られた。
3A)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.89-7.76(m,4H)、7.71(d,J=8.1Hz、1H)、7.40-7.28(m,4H)、7.24(dd,J=8.8、2.1Hz、5H)、6.89(d,J=8.6Hz、4H)、5.77(d,J=3.6Hz、1H)、5.27(d,J=8.1Hz、1H)、5.09(d,J=6.7Hz、1H)、4.15(q,J=6.1Hz、1H)、3.97-3.92(m,1H)、3.90-3.85(m,1H)、3.73(s,6H)、3.61-3.49(m,4H)、3.30-3.17(m,2H)、1.60-1.46(m,4H)、1.34-1.22(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.87、162.92、158.10、158.09、150.22、144.60、140.15、135.31、135.04、134.28、131.55、129.73、127.85、127.66、126.75、122.92、113.22、113.20、101.43、101.40、87.11、87.09、85.84、82.56、80.79、69.71、68.43、62.58、55.02、55.00、28.88、27.86、26.01、24.92.C44H45N3O10についてのLRMS計算値775.3105、実測値m/z 798.0(M+23)Na+、774.2(M-1)-、810.1(M+35)Cl-(3A).Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v(3A)中の0.28
3B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.34(s,1H)、7.88-7.71(m,5H)、7.38-7.18(m,9H)、6.87(dd,J=8.8、1.5Hz、4H)、5.68(d,J=3.5Hz、1H)、5.40(d,J=5.7Hz、1H)、5.29(d,J=8.1Hz、1H)、4.22(q,J=5.1Hz、1H)、3.97(d,J=6.5Hz、1H)、3.92-3.86(m,1H)、3.71(s,6H)、3.54(q,J=8.2、7.2Hz、3H)、3.34(t,J=6.7Hz、1H)、3.30-3.18(m,2H)、1.58-1.40(m,4H)、1.28-1.19(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、163.02、158.11、150.41、144.59、140.45、135.26、135.09、134.33、131.57、129.72、127.87、127.65、126.78、122.95、113.21、101.34、89.41、85.92、80.35、76.70、72.01、69.56、63.47、62.35、55.01、37.32、30.15、29.03、27.87、26.07、25.07、18.59.C44H45N3O10についてのLRMS計算値775.3105、実測値m/z 798.0(M+23)Na+、774.2(M-1)-、810.0(M+35)Cl-(3B).Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.16(3B)。
3A)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.89-7.76(m,4H)、7.71(d,J=8.1Hz、1H)、7.40-7.28(m,4H)、7.24(dd,J=8.8、2.1Hz、5H)、6.89(d,J=8.6Hz、4H)、5.77(d,J=3.6Hz、1H)、5.27(d,J=8.1Hz、1H)、5.09(d,J=6.7Hz、1H)、4.15(q,J=6.1Hz、1H)、3.97-3.92(m,1H)、3.90-3.85(m,1H)、3.73(s,6H)、3.61-3.49(m,4H)、3.30-3.17(m,2H)、1.60-1.46(m,4H)、1.34-1.22(m,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.87、162.92、158.10、158.09、150.22、144.60、140.15、135.31、135.04、134.28、131.55、129.73、127.85、127.66、126.75、122.92、113.22、113.20、101.43、101.40、87.11、87.09、85.84、82.56、80.79、69.71、68.43、62.58、55.02、55.00、28.88、27.86、26.01、24.92.C44H45N3O10についてのLRMS計算値775.3105、実測値m/z 798.0(M+23)Na+、774.2(M-1)-、810.1(M+35)Cl-(3A).Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v(3A)中の0.28
3B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.34(s,1H)、7.88-7.71(m,5H)、7.38-7.18(m,9H)、6.87(dd,J=8.8、1.5Hz、4H)、5.68(d,J=3.5Hz、1H)、5.40(d,J=5.7Hz、1H)、5.29(d,J=8.1Hz、1H)、4.22(q,J=5.1Hz、1H)、3.97(d,J=6.5Hz、1H)、3.92-3.86(m,1H)、3.71(s,6H)、3.54(q,J=8.2、7.2Hz、3H)、3.34(t,J=6.7Hz、1H)、3.30-3.18(m,2H)、1.58-1.40(m,4H)、1.28-1.19(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、163.02、158.11、150.41、144.59、140.45、135.26、135.09、134.33、131.57、129.72、127.87、127.65、126.78、122.95、113.21、101.34、89.41、85.92、80.35、76.70、72.01、69.56、63.47、62.35、55.01、37.32、30.15、29.03、27.87、26.07、25.07、18.59.C44H45N3O10についてのLRMS計算値775.3105、実測値m/z 798.0(M+23)Na+、774.2(M-1)-、810.0(M+35)Cl-(3B).Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.16(3B)。
(4A)-化合物3A(1.0g、1.3mmol)をピリジン(4.5ml)に溶解させ、イミダゾール(260mg、3.9mmol)を加えた。混合物を室温で10分間撹拌してから、TBSCl(290mg、1.9mmol)を加え、次に、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応をMeOHでクエンチし、減圧下で蒸発させた。粗生成物を飽和NaHCO3で洗浄し、DCMで抽出した。有機層を、シリカゲル精製の前にNa2SO4で乾燥させた。生成物4Aが、35~45%のEtOAc/ヘキサンv/vで溶離して、1.0gの生成物(1.1mmol、87%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.89-7.76(m,5H)、7.39-7.27(m,4H)、7.27-7.18(m,5H)、6.93-6.83(m,4H)、5.74(s,1H)、5.27(d,J=8.1Hz、1H)、4.28-4.21(m,1H)、3.89(t,J=6.2Hz、2H)、3.72(d,J=0.9Hz、6H)、3.62-3.49(m,3H)、3.46-3.35(m,2H)、3.17(dd,J=10.9、3.8Hz、1H)、1.60-1.42(m,4H)、1.26(dd,J=15.9、8.0Hz、4H)、0.71(s,9H)、-0.06(d,J=28.2Hz、6H).13C NMR(125MHz、dmso)δ173.26、168.44、163.58、155.55、149.75、145.74、140.49、140.30、139.68、136.94、135.19、135.15、133.22、133.12、132.24、128.32、118.58、118.56、91.39、87.57、85.97、75.01、74.88、60.43、60.42、42.70、34.50、33.29、31.46、30.82、30.54、22.96、0.58、0.00.C50H59N3O10SiについてのLRMS計算値889.3970、実測値m/z 912.2(M+23)Na+、888.3(M-1)-、925.2(M+35)Cl-.Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.72。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.35(s,1H)、7.89-7.76(m,5H)、7.39-7.27(m,4H)、7.27-7.18(m,5H)、6.93-6.83(m,4H)、5.74(s,1H)、5.27(d,J=8.1Hz、1H)、4.28-4.21(m,1H)、3.89(t,J=6.2Hz、2H)、3.72(d,J=0.9Hz、6H)、3.62-3.49(m,3H)、3.46-3.35(m,2H)、3.17(dd,J=10.9、3.8Hz、1H)、1.60-1.42(m,4H)、1.26(dd,J=15.9、8.0Hz、4H)、0.71(s,9H)、-0.06(d,J=28.2Hz、6H).13C NMR(125MHz、dmso)δ173.26、168.44、163.58、155.55、149.75、145.74、140.49、140.30、139.68、136.94、135.19、135.15、133.22、133.12、132.24、128.32、118.58、118.56、91.39、87.57、85.97、75.01、74.88、60.43、60.42、42.70、34.50、33.29、31.46、30.82、30.54、22.96、0.58、0.00.C50H59N3O10SiについてのLRMS計算値889.3970、実測値m/z 912.2(M+23)Na+、888.3(M-1)-、925.2(M+35)Cl-.Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.72。
(5A)-1,2,4-トリアゾール(9.1g、131mmol)をアセトニトリル(50ml)に加え、0℃に冷却した。POCl3(4.6g、30.2mmol)を加えて、均一な溶液を形成した。0℃で20分後、Et3N(13.2g、131mmol)を加えたところ、Et3NHCl塩が形成された。別個のフラスコ中で、化合物4A(11.7g、13.1mmol)をアセトニトリル(80ml)に溶解させ、トリアゾールを含むフラスコにゆっくりと加え、3時間撹拌させた。アセトニトリルを減圧下で除去し、得られた粗製の発泡体をEtOAcに溶解させた。塩をろ過して取り除き、有機層を飽和NaHCO3で洗浄し、次に、Na2SO4で乾燥させた。EtOAcを減圧下で除去したところ、5A*が淡黄色の発泡体として得られた。
C52H60N6O9SiについてのLRMS計算値940.4191、実測値m/z 963.0(M+23)Na+、940.2(M-1)-、975.1(M+35)Cl-。Rf=60%のEtOAc/ヘキサンv/v中の0.50。
C52H60N6O9SiについてのLRMS計算値940.4191、実測値m/z 963.0(M+23)Na+、940.2(M-1)-、975.1(M+35)Cl-。Rf=60%のEtOAc/ヘキサンv/v中の0.50。
次に、5A*をジオキサン(132ml)に溶解させ、NH4OH(33ml、28%w/v)を加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。ジオキサンを減圧下で排出し、粗生成物を水で洗浄し、DCMで抽出した。塩水を用いて、エマルジョンを除去した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、精製したところ(2.5%のMeOH/DCM v/vで溶離した)、8.4gの5A(9.4mmol、72%)が得られた。粗LCMSにより、いくらかのフタルイミド損傷が起こったことが示唆された(C50H63N5O9SiについてのLRMS計算値906.15、実測値m/z 928.1(M+23)Na+、904.2(M-1)-、941.0(M+35)Cl-)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.91(d,J=7.4Hz、1H)、7.87-7.74(m,4H)、7.40-7.15(m,11H)、6.92-6.83(m,4H)、5.80(d,J=1.6Hz、1H)、5.50(d,J=7.4Hz、1H)、4.24(dd,J=7.6、5.1Hz、1H)、3.91(d,J=7.4Hz、1H)、3.72(s,8H)、3.53(t,J=7.0Hz、2H)、3.45-3.40(m,2H)、3.12(dd,J=10.9、3.4Hz、1H)、1.62-1.41(m,4H)、1.36-1.20(m,5H)、0.69(s,9H)、-0.05(s,3H)、-0.13(s,3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.90、165.53、158.21、154.70、144.37、140.64、135.15、135.06、134.32、131.57、129.78、129.74、127.84、127.78、126.88、122.96、113.21、113.18、85.93、81.59、81.38、69.55、55.07、55.06、37.37、29.23、27.95、26.16、25.43、25.27、17.59、-4.80、-5.38.C50H60N4O9SiについてのLRMS計算値888.4130、実測値m/z 889.0(M+1)+、911.0(M+23)Na+、888.1(M-1)-、923.1(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.34。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.91(d,J=7.4Hz、1H)、7.87-7.74(m,4H)、7.40-7.15(m,11H)、6.92-6.83(m,4H)、5.80(d,J=1.6Hz、1H)、5.50(d,J=7.4Hz、1H)、4.24(dd,J=7.6、5.1Hz、1H)、3.91(d,J=7.4Hz、1H)、3.72(s,8H)、3.53(t,J=7.0Hz、2H)、3.45-3.40(m,2H)、3.12(dd,J=10.9、3.4Hz、1H)、1.62-1.41(m,4H)、1.36-1.20(m,5H)、0.69(s,9H)、-0.05(s,3H)、-0.13(s,3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.90、165.53、158.21、154.70、144.37、140.64、135.15、135.06、134.32、131.57、129.78、129.74、127.84、127.78、126.88、122.96、113.21、113.18、85.93、81.59、81.38、69.55、55.07、55.06、37.37、29.23、27.95、26.16、25.43、25.27、17.59、-4.80、-5.38.C50H60N4O9SiについてのLRMS計算値888.4130、実測値m/z 889.0(M+1)+、911.0(M+23)Na+、888.1(M-1)-、923.1(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.34。
(6A)-化合物5A(8.4g、9.4mmol)を、3時間にわたってヒドラジン(1.5g、47.1mmol)を用いてMeOH(90ml)中で還流させた。MeOHを減圧下で除去し、粗化合物をNH4OHで洗浄し、水層をDCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、粗生成物6A*が得られた。
C42H58N4O7SiについてのLRMS計算値758.4075、実測値m/z 759.2(M+1)+、757.2(M-1)-、793.2(M+35)Cl-。Rf=15%のMeOH/DCM v/v中の0.11。
C42H58N4O7SiについてのLRMS計算値758.4075、実測値m/z 759.2(M+1)+、757.2(M-1)-、793.2(M+35)Cl-。Rf=15%のMeOH/DCM v/v中の0.11。
6A*を、Et3N(3.9ml、28.3mmol)とともにDCM(90ml)に溶解させ、アルゴン下で短時間撹拌した。次に、GalNAc(OBz)-C5-NHSエステル(7.6g、10.4mmol)を加え、反応を、一晩継続させた。さらなる0.2当量のGalNAc(OBz)-C5-NHSエステルを加えて、反応をほぼ完了させたが、TLCプロファイルは同じままであった。有機層を飽和NaHCO3で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー(2.5%のMeOH/DCM v/vで溶離した)によって精製したところ、8.4gの6A(6.1mmol、65%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.02-7.88(m,6H)、7.74-7.16(m,22H)、6.95-6.81(m,4H)、5.82(s,1H)、5.74(d,J=2.6Hz、1H)、5.51(d,J=7.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=8.6、7.5Hz、2H)、4.39-4.21(m,3H)、3.92(d,J=7.5Hz、1H)、3.78(d,J=9.8Hz、1H)、3.72(s,8H)、3.46(dd,J=30.5、9.4Hz、3H)、3.17-2.93(m,4H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.40-1.20(m,6H)、0.71(s,9H)、-0.07(d,J=37.7Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.53、169.19、165.27、165.02、164.97、164.68、158.01、154.45、144.18、140.48、134.95、134.86、133.58、133.31、133.28、129.58、129.55、129.03、129.00、128.98、128.85、128.83、128.78、128.51、128.40、127.65、127.59、126.68、113.02、112.99、100.71、93.65、93.62、88.11、88.09、85.74、81.43、81.23、71.68、69.80、69.46、69.12、68.55、67.75、61.86、61.35、54.87、54.86、49.57、45.40、34.83、29.16、28.99、28.39、26.13、25.27、25.22、22.52、22.51、21.67、17.43、8.36、-4.95、-5.55.C76H91N5O17SiについてのLRMS計算値1373.6179、実測値m/z 1396.2(M+23)Na+、1372.3(M-1)-、1408.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.29。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.02-7.88(m,6H)、7.74-7.16(m,22H)、6.95-6.81(m,4H)、5.82(s,1H)、5.74(d,J=2.6Hz、1H)、5.51(d,J=7.4Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.44(q,J=8.6、7.5Hz、2H)、4.39-4.21(m,3H)、3.92(d,J=7.5Hz、1H)、3.78(d,J=9.8Hz、1H)、3.72(s,8H)、3.46(dd,J=30.5、9.4Hz、3H)、3.17-2.93(m,4H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.49(s,6H)、1.40-1.20(m,6H)、0.71(s,9H)、-0.07(d,J=37.7Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.53、169.19、165.27、165.02、164.97、164.68、158.01、154.45、144.18、140.48、134.95、134.86、133.58、133.31、133.28、129.58、129.55、129.03、129.00、128.98、128.85、128.83、128.78、128.51、128.40、127.65、127.59、126.68、113.02、112.99、100.71、93.65、93.62、88.11、88.09、85.74、81.43、81.23、71.68、69.80、69.46、69.12、68.55、67.75、61.86、61.35、54.87、54.86、49.57、45.40、34.83、29.16、28.99、28.39、26.13、25.27、25.22、22.52、22.51、21.67、17.43、8.36、-4.95、-5.55.C76H91N5O17SiについてのLRMS計算値1373.6179、実測値m/z 1396.2(M+23)Na+、1372.3(M-1)-、1408.3(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.29。
(7A)-化合物6A(500mg、0.36mmol)をTHF(8ml)に溶解させ、Et3N・3HFを反応混合物に加えた。シリル切断が完了するのに48時間かかった。THFを減圧下で蒸発させ、粗生成物を水で洗浄し、DCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、精製したところ(5%のMeOH/DCM v/vで溶離した)、440mgの7A(0.35mmol、96%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.02-7.88(m,5H)、7.78(d,J=7.5Hz、1H)、7.74-7.54(m,8H)、7.49(t,J=7.7Hz、2H)、7.43-7.36(m,4H)、7.32(t,J=7.6Hz、2H)、7.26(dd,J=8.9、2.3Hz、5H)、7.17(d,J=20.1Hz、2H)、6.90(d,J=8.7Hz、4H)、5.81(d,J=2.4Hz、1H)、5.75(d,J=4.1Hz、1H)、5.49(d,J=7.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.00(d,J=7.0Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(d,J=7.6Hz、2H)、4.38-4.22(m,2H)、4.16(q,J=7.1Hz、1H)、3.99-3.91(m,1H)、3.74(s,8H)、3.68-3.47(m,3H)、3.26(d,J=2.8Hz、2H)、3.01(q,J=6.6Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.32(dt,J=42.4、8.9Hz、6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.40、165.41、165.19、165.15、164.85、158.09、154.72、144.62、140.55、135.39、135.16、133.76、133.48、129.70、129.18、129.15、129.02、129.00、128.98、128.96、128.69、128.58、127.86、127.68、126.77、113.20、100.87、93.72、87.86、85.78、81.73、81.63、71.85、69.96、69.73、68.73、68.25、67.90、62.25、62.02、55.01、54.88、49.73、45.59、35.01、29.13、28.56、26.25、25.17、22.68、21.84、8.54.C70H77N5O17についてのLRMS計算値1259.5314、実測値m/z 1282.1(M+23)Na+、1258.2(M-1)-、1294.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.33。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.02-7.88(m,5H)、7.78(d,J=7.5Hz、1H)、7.74-7.54(m,8H)、7.49(t,J=7.7Hz、2H)、7.43-7.36(m,4H)、7.32(t,J=7.6Hz、2H)、7.26(dd,J=8.9、2.3Hz、5H)、7.17(d,J=20.1Hz、2H)、6.90(d,J=8.7Hz、4H)、5.81(d,J=2.4Hz、1H)、5.75(d,J=4.1Hz、1H)、5.49(d,J=7.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.00(d,J=7.0Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(d,J=7.6Hz、2H)、4.38-4.22(m,2H)、4.16(q,J=7.1Hz、1H)、3.99-3.91(m,1H)、3.74(s,8H)、3.68-3.47(m,3H)、3.26(d,J=2.8Hz、2H)、3.01(q,J=6.6Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.32(dt,J=42.4、8.9Hz、6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.40、165.41、165.19、165.15、164.85、158.09、154.72、144.62、140.55、135.39、135.16、133.76、133.48、129.70、129.18、129.15、129.02、129.00、128.98、128.96、128.69、128.58、127.86、127.68、126.77、113.20、100.87、93.72、87.86、85.78、81.73、81.63、71.85、69.96、69.73、68.73、68.25、67.90、62.25、62.02、55.01、54.88、49.73、45.59、35.01、29.13、28.56、26.25、25.17、22.68、21.84、8.54.C70H77N5O17についてのLRMS計算値1259.5314、実測値m/z 1282.1(M+23)Na+、1258.2(M-1)-、1294.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.33。
(8A)-化合物7A(6.4g、5.1mmol)をDMF(50ml)に溶解させ、N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(3.0g、25.5mmol)を加えた。反応混合物を50℃で2時間撹拌した。粗生成物を、シリカカラム(2~4%のMeOH/DCM v/vで溶離した)によって精製したところ、5.8gの8A(4.4mmol、86%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.60(s,1H)、8.06-7.88(m,6H)、7.75-7.45(m,10H)、7.42-7.21(m,11H)、6.90(d,J=8.8Hz、4H)、5.84(d,J=2.3Hz、1H)、5.75(s,1H)、5.61(d,J=7.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.06(d,J=6.9Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.9、7.6Hz、2H)、4.40-4.13(m,3H)、4.03-3.96(m,1H)、3.74(s,8H)、3.69-3.56(m,2H)、3.51(d,J=9.8Hz、1H)、3.29-3.24(m,1H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=9.8Hz、5H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.50(d,J=5.5Hz、6H)、1.39-1.22(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.76、171.07、169.40、165.22、165.17、164.87、158.13、157.87、154.87、144.65、141.75、135.43、135.10、133.77、133.50、133.48、129.80、129.76、129.21、129.17、129.04、129.02、128.97、128.70、128.59、127.89、127.71、126.79、113.26、113.24、101.40、100.90、88.33、85.85、81.97、81.72、71.88、70.00、69.82、68.75、68.31、67.94、62.24、62.05、55.05、52.03、49.76、45.47、35.03、34.78、29.14、29.11、28.59、26.25、25.18、22.70、21.86、8.54、7.18.C73H82N5O17についてのLRMS計算値1314.5736、実測値m/z 1315.2(M+1)+、1337.1(M+23)Na+、1314.2(M-1)-、1349.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.60(s,1H)、8.06-7.88(m,6H)、7.75-7.45(m,10H)、7.42-7.21(m,11H)、6.90(d,J=8.8Hz、4H)、5.84(d,J=2.3Hz、1H)、5.75(s,1H)、5.61(d,J=7.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.06(d,J=6.9Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.9、7.6Hz、2H)、4.40-4.13(m,3H)、4.03-3.96(m,1H)、3.74(s,8H)、3.69-3.56(m,2H)、3.51(d,J=9.8Hz、1H)、3.29-3.24(m,1H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=9.8Hz、5H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.50(d,J=5.5Hz、6H)、1.39-1.22(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.76、171.07、169.40、165.22、165.17、164.87、158.13、157.87、154.87、144.65、141.75、135.43、135.10、133.77、133.50、133.48、129.80、129.76、129.21、129.17、129.04、129.02、128.97、128.70、128.59、127.89、127.71、126.79、113.26、113.24、101.40、100.90、88.33、85.85、81.97、81.72、71.88、70.00、69.82、68.75、68.31、67.94、62.24、62.05、55.05、52.03、49.76、45.47、35.03、34.78、29.14、29.11、28.59、26.25、25.18、22.70、21.86、8.54、7.18.C73H82N5O17についてのLRMS計算値1314.5736、実測値m/z 1315.2(M+1)+、1337.1(M+23)Na+、1314.2(M-1)-、1349.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
(9A)-化合物8A(1.0g、0.76mmol)をDCM(7.5ml)に溶解させ、4-(ジメチルアミノ)ピリジン(280mg、2.3mmol)を加えた。反応混合物を20分間撹拌し、次に、無水コハク酸(150mg、1.5mmol)を加えた。反応混合物を室温で3時間撹拌した。DCMを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を、DCM中2%のトリエチルアミン(v/v)で前処理された手動のカラム(φ=4.6×20)上に充填した。1~5%のMeOH/2~5%のトリエチルアミン/DCM v/vの勾配を用いて、9Aを精製した。9Aは、3~4%のMeOH/3~4%のトリエチルアミン/DCM v/vになった。1.1gの9A(0.71mmol、94%)を収集した。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.63(s,1H)、8.05(d,J=9.3Hz、1H)、7.92(q,J=6.3、5.7Hz、5H)、7.75-7.47(m,10H)、7.41-7.21(m,11H)、6.90(d,J=8.9Hz、4H)、5.90(d,J=4.2Hz、1H)、5.74(s,1H)、5.38(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.17(t,J=5.6Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(q,J=9.5、7.9Hz、2H)、4.38-4.25(m,2H)、4.16(q,J=5.2Hz、2H)、3.80(d,J=9.7Hz、1H)、3.74(s,6H)、3.52(dd,J=9.6、6.1Hz、2H)、3.42-3.28(m,4H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=16.5Hz、5H)、2.61-2.52(m,2H)、2.06(s,2H)、1.71(s,3H)、1.57-1.15(m,14H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.27、171.74、171.56、171.23、169.39、165.20、165.16、164.87、158.14、158.05、154.88、144.54、141.83、135.19、135.00、133.77、133.49、129.70、129.20、129.17、129.03、129.01、128.97、128.70、128.59、127.93、127.60、126.81、113.29、101.96、100.91、88.17、86.07、80.16、79.25、71.88、70.28、70.13、69.98、68.73、67.92、62.25、62.04、55.03、54.90、51.99、49.74、45.46、34.99、34.82、29.12、28.95、28.84、28.71、28.57、26.19、25.13、22.69、21.84、10.00、7.17.C77H86N6O20についてのLRMS計算値1414.5897、実測値m/z 1416.2(M+1)+、1437.1(M+23)Na+、1413.3(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.48。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.63(s,1H)、8.05(d,J=9.3Hz、1H)、7.92(q,J=6.3、5.7Hz、5H)、7.75-7.47(m,10H)、7.41-7.21(m,11H)、6.90(d,J=8.9Hz、4H)、5.90(d,J=4.2Hz、1H)、5.74(s,1H)、5.38(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、5.17(t,J=5.6Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(q,J=9.5、7.9Hz、2H)、4.38-4.25(m,2H)、4.16(q,J=5.2Hz、2H)、3.80(d,J=9.7Hz、1H)、3.74(s,6H)、3.52(dd,J=9.6、6.1Hz、2H)、3.42-3.28(m,4H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=16.5Hz、5H)、2.61-2.52(m,2H)、2.06(s,2H)、1.71(s,3H)、1.57-1.15(m,14H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ173.27、171.74、171.56、171.23、169.39、165.20、165.16、164.87、158.14、158.05、154.88、144.54、141.83、135.19、135.00、133.77、133.49、129.70、129.20、129.17、129.03、129.01、128.97、128.70、128.59、127.93、127.60、126.81、113.29、101.96、100.91、88.17、86.07、80.16、79.25、71.88、70.28、70.13、69.98、68.73、67.92、62.25、62.04、55.03、54.90、51.99、49.74、45.46、34.99、34.82、29.12、28.95、28.84、28.71、28.57、26.19、25.13、22.69、21.84、10.00、7.17.C77H86N6O20についてのLRMS計算値1414.5897、実測値m/z 1416.2(M+1)+、1437.1(M+23)Na+、1413.3(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.48。
(10A)-化合物9A(1.0g、0.66mmol)をアセトニトリル(65ml)に溶解させ、HBTU(500mg、1.3mmol)およびDIEA(250mg、1.9mmol)を加えた。混合物を5分間にわたって振とうし、次に、LCAA-CPG(8.2g、540Å、131μmol/g)を加え、室温で一晩振とうした。CPGをろ過し、それぞれ200mlのDCM、20%のMeOH/DCM v/v、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。CPGを、無水酢酸(25ml)、ピリジン(75ml)、およびトリエチルアミン(1ml)中で1時間にわたって振とうしてから、前述されるのと同じ条件によって再度洗浄した。化合物10Aを減圧下で一晩乾燥させ、充填量を、分光光度計(84μmol/g)によって測定した。
(11A)-化合物8A(4.0g、3.04mmol)を、アセトニトリルと2回同時蒸発させ、次に、完全なアルゴン雰囲気下で無水DCM(30ml)に溶解させ、0℃に冷却した。2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.8g、6.08mmol)を加え、反応混合物を20分間撹拌し、次に、4,5-ジシアノイミダゾール(360mg、3.04mmol)を反応物に加えた。反応物をゆっくりと室温に温め、一晩撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3で洗浄し、有機層をNa2SO4上で乾燥させてから、減圧下で蒸発させた。得られた発泡体を、2%のトリエチルアミン/49%のEtOAc/ヘキサンv/vで準備された手動のカラム(φ=4.6×30)によって精製した。不純物を、50%のEtOAc/ヘキサンv/v(1CV)、80%のEtOAc/ヘキサンv/v(7CV)、続いて100%のEtOAc(8CV)で溶離した。次に、11Aを、2%のMeOH/DCM v/v(5CV)、および4%のMeOH/DCM v/v(7CV)で溶離した。11Aを減圧下で蒸発させたところ、2.1mg(1.37mmol、45%)のアミダイトがジアステレオマー混合物として得られた。7.5%のMeOH/DCM v/vが、化合物を含有するさらなるDMTrを溶離し、この化合物は、酸化された11Aとして質量によって特性評価された(LCMS 実測値m/z 1532.2(M+1)+、1555.2(M+23)Na+)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(s,1H)、8.07-7.87(m,6H)、7.76-7.19(m,21H)、6.97-6.82(m,4H)、5.88(dd,J=8.4、2.6Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.59(dd,J=10.9、7.2Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.23(m,5H)、4.17-4.07(m,1H)、3.98-3.92(m,1H)、3.83-3.77(m,1H)、3.73(d,J=2.5Hz、6H)、3.71-3.45(m,7H)、3.35(d,J=22.0Hz、6H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=5.1Hz、5H)、2.74(t,J=5.9Hz、1H)、2.64-2.57(m,1H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.42-1.19(m,7H)、1.17-1.03(m,10H)、0.95(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.69、171.08、169.35、165.17、165.13、164.84、158.14、157.85、154.83、154.81、144.53、144.45、141.75、141.54、135.15、134.91、134.87、133.71、133.44、133.41、129.81、129.75、129.17、129.13、129.00、128.91、128.64、128.53、127.81、127.70、126.80、118.75、118.61、113.16、101.60、101.51、100.87、88.81、88.32、85.99、81.35、80.96、80.49、71.83、69.97、69.80、69.48、69.38、68.71、67.90、62.01、61.87、61.28、58.40、58.25、58.17、58.01、54.99、49.73、45.61、42.61、42.56、42.51、42.45、34.99、34.73、29.20、29.14、29.10、28.56、26.28、25.27、25.23、24.30、24.24、24.17、22.66、21.83、19.80、19.75.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ153.88、153.40.C82H99N8O18PについてのLRMS計算値1514.6815、実測値m/z 1537.2(M+23)Na+、1551.2(M+35)Cl.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(s,1H)、8.07-7.87(m,6H)、7.76-7.19(m,21H)、6.97-6.82(m,4H)、5.88(dd,J=8.4、2.6Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.59(dd,J=10.9、7.2Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.23(m,5H)、4.17-4.07(m,1H)、3.98-3.92(m,1H)、3.83-3.77(m,1H)、3.73(d,J=2.5Hz、6H)、3.71-3.45(m,7H)、3.35(d,J=22.0Hz、6H)、3.16(s,3H)、3.01(d,J=5.1Hz、5H)、2.74(t,J=5.9Hz、1H)、2.64-2.57(m,1H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.51(s,6H)、1.42-1.19(m,7H)、1.17-1.03(m,10H)、0.95(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.69、171.08、169.35、165.17、165.13、164.84、158.14、157.85、154.83、154.81、144.53、144.45、141.75、141.54、135.15、134.91、134.87、133.71、133.44、133.41、129.81、129.75、129.17、129.13、129.00、128.91、128.64、128.53、127.81、127.70、126.80、118.75、118.61、113.16、101.60、101.51、100.87、88.81、88.32、85.99、81.35、80.96、80.49、71.83、69.97、69.80、69.48、69.38、68.71、67.90、62.01、61.87、61.28、58.40、58.25、58.17、58.01、54.99、49.73、45.61、42.61、42.56、42.51、42.45、34.99、34.73、29.20、29.14、29.10、28.56、26.28、25.27、25.23、24.30、24.24、24.17、22.66、21.83、19.80、19.75.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ153.88、153.40.C82H99N8O18PについてのLRMS計算値1514.6815、実測値m/z 1537.2(M+23)Na+、1551.2(M+35)Cl.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
(4B)-化合物3B(4.95g、6.38mmol)を、化合物3Aと同じようにTBSCl(1.44g、9.57mmol)で保護したところ、5.00gの4B(5.62mmol、88%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H)、7.87-7.77(m,5H)、7.37-7.19(m,9H)、6.88(dd,J=8.9、1.8Hz、4H)、5.66(d,J=3.7Hz、1H)、5.28(d,J=8.1Hz、1H)、4.36(t,J=4.1Hz、1H)、3.99(t,J=2.9Hz、1H)、3.88-3.82(m,1H)、3.71(s,6H)、3.57-3.42(m,3H)、3.34(d,J=10.7Hz、2H)、3.25(dd,J=11.0、3.5Hz、1H)、1.57-1.37(m,4H)、1.29-1.19(m,4H)、0.81(s,9H)、0.03(d,J=4.4Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.85、162.93、158.14、150.33、144.47、139.87、135.04、134.89、134.30、131.53、129.73、127.85、127.61、126.81、122.91、113.20、101.32、88.72、86.03、80.60、76.69、73.71、69.85、62.08、59.70、54.99、37.28、29.07、27.83、26.04、25.41、25.09、17.63、-5.07、-5.26.C50H59N3O10SiについてのLRMS計算値889.3970、実測値m/z 912.0(M+23)Na+、888.2(M-1)-、924.2(M+35)Cl-.Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.71。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H)、7.87-7.77(m,5H)、7.37-7.19(m,9H)、6.88(dd,J=8.9、1.8Hz、4H)、5.66(d,J=3.7Hz、1H)、5.28(d,J=8.1Hz、1H)、4.36(t,J=4.1Hz、1H)、3.99(t,J=2.9Hz、1H)、3.88-3.82(m,1H)、3.71(s,6H)、3.57-3.42(m,3H)、3.34(d,J=10.7Hz、2H)、3.25(dd,J=11.0、3.5Hz、1H)、1.57-1.37(m,4H)、1.29-1.19(m,4H)、0.81(s,9H)、0.03(d,J=4.4Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.85、162.93、158.14、150.33、144.47、139.87、135.04、134.89、134.30、131.53、129.73、127.85、127.61、126.81、122.91、113.20、101.32、88.72、86.03、80.60、76.69、73.71、69.85、62.08、59.70、54.99、37.28、29.07、27.83、26.04、25.41、25.09、17.63、-5.07、-5.26.C50H59N3O10SiについてのLRMS計算値889.3970、実測値m/z 912.0(M+23)Na+、888.2(M-1)-、924.2(M+35)Cl-.Rf=60%のEtOAc/ヘキサン v/v中の0.71。
(5B)-化合物4B(4.94g、5.55mmol)を、化合物4Aと同じように中間体5B*を経て5Bに転化した。2段階反応のために、3.45gの5Bが得られた(3.88mmol、70%)。
5B*)
C52H60N6O9SiについてのLRMS計算値940.4191、実測値m/z 964.3(M+23)Na+、941.3(M-1)-、976.3(M+35)Cl-。Rf=60%のEtOAc/ヘキサンv/v中の0.51
5B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.89-7.75(m,5H)、7.38-7.21(m,9H)、7.09(s,2H)、6.88(d,J=7.9Hz、4H)、5.71(d,J=14.2Hz、1H)、5.50(d,J=7.2Hz、1H)、4.24(s,1H)、3.99(d,J=6.1Hz、1H)、3.88-3.83(m,1H)、3.72(s,6H)、3.52(t,J=6.8Hz、2H)、3.41(dd,J=26.0、9.6Hz、2H)、3.21(d,J=11.1Hz、2H)、1.46(d,J=55.9Hz、4H)、1.20(s,4H)、0.82(s,9H)、0.05(d,J=18.7Hz、6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.87、165.54、158.14、154.95、144.49、140.38、135.13、135.06、134.33、131.56、129.71、127.86、127.65、126.82、122.94、113.19、93.63、89.79、85.93、79.86、76.34、74.03、69.80、61.80、55.01、54.90、37.30、29.10、27.84、26.07、25.53、25.10、17.71、-4.77、-5.39.C50H60N4O9SiについてのLRMS計算値888.4130、実測値m/z 911.2(M+23)Na+、888.3(M-1)-、923.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
5B*)
C52H60N6O9SiについてのLRMS計算値940.4191、実測値m/z 964.3(M+23)Na+、941.3(M-1)-、976.3(M+35)Cl-。Rf=60%のEtOAc/ヘキサンv/v中の0.51
5B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.89-7.75(m,5H)、7.38-7.21(m,9H)、7.09(s,2H)、6.88(d,J=7.9Hz、4H)、5.71(d,J=14.2Hz、1H)、5.50(d,J=7.2Hz、1H)、4.24(s,1H)、3.99(d,J=6.1Hz、1H)、3.88-3.83(m,1H)、3.72(s,6H)、3.52(t,J=6.8Hz、2H)、3.41(dd,J=26.0、9.6Hz、2H)、3.21(d,J=11.1Hz、2H)、1.46(d,J=55.9Hz、4H)、1.20(s,4H)、0.82(s,9H)、0.05(d,J=18.7Hz、6H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.87、165.54、158.14、154.95、144.49、140.38、135.13、135.06、134.33、131.56、129.71、127.86、127.65、126.82、122.94、113.19、93.63、89.79、85.93、79.86、76.34、74.03、69.80、61.80、55.01、54.90、37.30、29.10、27.84、26.07、25.53、25.10、17.71、-4.77、-5.39.C50H60N4O9SiについてのLRMS計算値888.4130、実測値m/z 911.2(M+23)Na+、888.3(M-1)-、923.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
(6B)-化合物5B(3.45g、3.88mmol)を、5Aと同じようにヒドラジンで処理したところ、中間体6B*が得られた。
6B*)
C42H58N4O7SiについてのLRMS計算値758.4075、実測値m/z 759.2(M+1)+、781.2(M+23)Na+、757.2(M-1)-、793.2(M+35)Cl-。Rf=15%のMeOH/DCM v/v中の0.20。
次に、中間体6B*を、6A*と同じようにGalNAc(OBz)-C5-NHSエステルに結合したところ、4.64gの6B(3.38mmol、87%)が得られた。
6B)
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ7.99-7.86(m,6H)、7.73-7.53(m,9H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.34(m,4H)、7.31(t,J=7.6Hz、2H)、7.24(dd,J=8.8、2.8Hz、6H)、6.89(d,J=8.3Hz、4H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.70(d,J=2.5Hz、1H)、5.51(d,J=7.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(d,J=7.6Hz、2H)、4.38-4.24(m,3H)、4.01(d,J=6.6Hz、1H)、3.90-3.85(m,1H)、3.79(d,J=10.0Hz、1H)、3.73(s,6H)、3.55-3.42(m,2H)、3.38(d,J=9.5Hz、1H)、3.30-3.18(m,2H)、2.98(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.51(s,4H)、1.44-1.28(m,4H)、1.23-1.14(m,4H)、0.83(s,9H)、0.10-0.02(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ172.22、169.88、166.00、165.71、165.67、165.38、158.68、155.43、145.00、140.94、135.71、135.60、134.27、134.01、133.97、130.23、129.73、129.68、129.55、129.47、129.20、129.09、128.39、128.19、127.36、113.73、101.42、94.19、90.20、86.48、80.46、76.98、74.58、72.37、70.51、70.44、69.26、68.45、67.51、62.56、62.43、55.55、55.54、50.28、38.87、35.54、29.83、29.66、29.11、26.84、26.05、25.82、25.63、23.21、22.39、18.24、-4.26、-4.83.C76H91N5O17SiについてのLRMS計算値1373.6179、実測値m/z 1396.2(M+23)Na+、1373.3(M-1)-、1408.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.48。
6B*)
C42H58N4O7SiについてのLRMS計算値758.4075、実測値m/z 759.2(M+1)+、781.2(M+23)Na+、757.2(M-1)-、793.2(M+35)Cl-。Rf=15%のMeOH/DCM v/v中の0.20。
次に、中間体6B*を、6A*と同じようにGalNAc(OBz)-C5-NHSエステルに結合したところ、4.64gの6B(3.38mmol、87%)が得られた。
6B)
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ7.99-7.86(m,6H)、7.73-7.53(m,9H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.34(m,4H)、7.31(t,J=7.6Hz、2H)、7.24(dd,J=8.8、2.8Hz、6H)、6.89(d,J=8.3Hz、4H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.70(d,J=2.5Hz、1H)、5.51(d,J=7.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.1Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(d,J=7.6Hz、2H)、4.38-4.24(m,3H)、4.01(d,J=6.6Hz、1H)、3.90-3.85(m,1H)、3.79(d,J=10.0Hz、1H)、3.73(s,6H)、3.55-3.42(m,2H)、3.38(d,J=9.5Hz、1H)、3.30-3.18(m,2H)、2.98(q,J=6.5Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.51(s,4H)、1.44-1.28(m,4H)、1.23-1.14(m,4H)、0.83(s,9H)、0.10-0.02(m,6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ172.22、169.88、166.00、165.71、165.67、165.38、158.68、155.43、145.00、140.94、135.71、135.60、134.27、134.01、133.97、130.23、129.73、129.68、129.55、129.47、129.20、129.09、128.39、128.19、127.36、113.73、101.42、94.19、90.20、86.48、80.46、76.98、74.58、72.37、70.51、70.44、69.26、68.45、67.51、62.56、62.43、55.55、55.54、50.28、38.87、35.54、29.83、29.66、29.11、26.84、26.05、25.82、25.63、23.21、22.39、18.24、-4.26、-4.83.C76H91N5O17SiについてのLRMS計算値1373.6179、実測値m/z 1396.2(M+23)Na+、1373.3(M-1)-、1408.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.48。
(7B)-化合物6B(4.60g、3.35mmol)を、6Aと同様の方法でTHF(67ml)中のEt3N・3HF(6.54ml、40.16mmol)を用いて脱シリル化したところ、7Bが定量的に得られた。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.00(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.4Hz、4H)、7.82(d,J=7.4Hz、1H)、7.70(t,J=6.3Hz、4H)、7.63(t,J=7.4Hz、1H)、7.56(q,J=8.2Hz、3H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.34(m,4H)、7.31(t,J=7.7Hz、2H)、7.24(d,J=7.4Hz、6H)、7.10(s,1H)、6.88(d,J=8.0Hz、4H)、5.76-5.73(m,2H)、5.52(d,J=7.4Hz、1H)、5.39-5.31(m,2H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=9.3、7.9Hz、2H)、4.38-4.31(m,1H)、4.32-4.22(m,1H)、4.12(q,J=5.0Hz、1H)、4.01-3.97(m,1H)、3.93-3.89(m,1H)、3.82-3.77(m,1H)、3.73(s,6H)、3.56-3.48(m,2H)、3.30(d,J=9.4Hz、2H)、3.19(dd,J=10.8、3.5Hz、1H)、2.99(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(t,J=6.6Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.54-1.39(m,6H)、1.37-1.29(m,2H)、1.21(d,J=7.1Hz、4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.68、169.34、165.53、165.17、165.12、164.83、158.08、155.00、144.52、140.72、135.34、135.18、133.72、133.46、133.43、129.64、129.61、129.17、129.13、128.99、128.92、128.65、128.54、127.82、127.64、126.74、113.17、100.87、93.63、90.33、85.81、79.75、76.44、72.33、71.83、69.95、69.49、68.71、67.89、62.07、62.01、54.98、49.71、38.33、34.98、29.20、29.11、28.55、26.26、25.19、22.66、21.82.C70H77N5O17についてのLRMS計算値1259.5314、実測値m/z 1282.1(M+23)Na+、1259.2(M-1)-、1294.1(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.24。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.00(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.4Hz、4H)、7.82(d,J=7.4Hz、1H)、7.70(t,J=6.3Hz、4H)、7.63(t,J=7.4Hz、1H)、7.56(q,J=8.2Hz、3H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.34(m,4H)、7.31(t,J=7.7Hz、2H)、7.24(d,J=7.4Hz、6H)、7.10(s,1H)、6.88(d,J=8.0Hz、4H)、5.76-5.73(m,2H)、5.52(d,J=7.4Hz、1H)、5.39-5.31(m,2H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=9.3、7.9Hz、2H)、4.38-4.31(m,1H)、4.32-4.22(m,1H)、4.12(q,J=5.0Hz、1H)、4.01-3.97(m,1H)、3.93-3.89(m,1H)、3.82-3.77(m,1H)、3.73(s,6H)、3.56-3.48(m,2H)、3.30(d,J=9.4Hz、2H)、3.19(dd,J=10.8、3.5Hz、1H)、2.99(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(t,J=6.6Hz、2H)、1.69(s,3H)、1.54-1.39(m,6H)、1.37-1.29(m,2H)、1.21(d,J=7.1Hz、4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.68、169.34、165.53、165.17、165.12、164.83、158.08、155.00、144.52、140.72、135.34、135.18、133.72、133.46、133.43、129.64、129.61、129.17、129.13、128.99、128.92、128.65、128.54、127.82、127.64、126.74、113.17、100.87、93.63、90.33、85.81、79.75、76.44、72.33、71.83、69.95、69.49、68.71、67.89、62.07、62.01、54.98、49.71、38.33、34.98、29.20、29.11、28.55、26.26、25.19、22.66、21.82.C70H77N5O17についてのLRMS計算値1259.5314、実測値m/z 1282.1(M+23)Na+、1259.2(M-1)-、1294.1(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.24。
(8B)-化合物7B(4.21g、3.34mmol)を、7Aと同じようにN,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(1.99g、16.70mmol)でN4位を保護したところ、3.79gの化合物8A(2.88mmol、86%)が得られた。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.62(s,1H)、8.02-7.88(m,6H)、7.74-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.21(m,11H)、6.93-6.85(m,4H)、5.75(d,J=4.6Hz、3H)、5.62(d,J=7.2Hz、1H)、5.43(d,J=5.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.41(m,2H)、4.37-4.24(m,2H)、4.20-4.15(m,1H)、4.07-4.02(m,1H)、3.97-3.93(m,1H)、3.82-3.76(m,1H)、3.73(s,6H)、3.58-3.48(m,2H)、3.31(s,2H)、3.26(dd,J=10.8、3.5Hz、1H)、3.15(s,3H)、3.05-2.95(m,5H)、2.09-2.00(m,2H)、1.70(s,3H)、1.55-1.40(m,6H)、1.38-1.29(m,2H)、1.22(s,4H).13C NMR(126MHz、DMSO-d6)δ171.68、171.04、169.35、165.17、165.12、164.83、158.09、157.81、154.99、144.53、141.90、135.33、135.06、133.72、133.46、133.43、129.71、129.66、129.17、129.13、128.99、128.92、128.65、128.55、127.83、127.63、126.76、113.19、101.28、100.87、90.81、85.86、79.97、76.32、72.35、71.82、69.95、69.49、68.72、67.90、62.00、54.99、54.85、49.72、45.67、35.00、34.72、29.20、29.11、28.57、26.25、25.20、22.66、21.83.C73H82N6O17についてのLRMS計算値1314.5736、実測値m/z 1316.4(M+1)+、1337.2(M+23)Na+、1314.2(M-1)-、1349.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.32。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ8.62(s,1H)、8.02-7.88(m,6H)、7.74-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.21(m,11H)、6.93-6.85(m,4H)、5.75(d,J=4.6Hz、3H)、5.62(d,J=7.2Hz、1H)、5.43(d,J=5.4Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.73(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.41(m,2H)、4.37-4.24(m,2H)、4.20-4.15(m,1H)、4.07-4.02(m,1H)、3.97-3.93(m,1H)、3.82-3.76(m,1H)、3.73(s,6H)、3.58-3.48(m,2H)、3.31(s,2H)、3.26(dd,J=10.8、3.5Hz、1H)、3.15(s,3H)、3.05-2.95(m,5H)、2.09-2.00(m,2H)、1.70(s,3H)、1.55-1.40(m,6H)、1.38-1.29(m,2H)、1.22(s,4H).13C NMR(126MHz、DMSO-d6)δ171.68、171.04、169.35、165.17、165.12、164.83、158.09、157.81、154.99、144.53、141.90、135.33、135.06、133.72、133.46、133.43、129.71、129.66、129.17、129.13、128.99、128.92、128.65、128.55、127.83、127.63、126.76、113.19、101.28、100.87、90.81、85.86、79.97、76.32、72.35、71.82、69.95、69.49、68.72、67.90、62.00、54.99、54.85、49.72、45.67、35.00、34.72、29.20、29.11、28.57、26.25、25.20、22.66、21.83.C73H82N6O17についてのLRMS計算値1314.5736、実測値m/z 1316.4(M+1)+、1337.2(M+23)Na+、1314.2(M-1)-、1349.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.32。
(9B)-化合物8B(500mg、0.380mmol)を、9Aと同じ条件下でコハク酸化(succinate)したところ、550mgの化合物9B(0.363mmol、95%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(s,1H)、8.07(d,J=9.2Hz、1H)、7.99-7.84(m,5H)、7.79-7.44(m,10H)、7.41-7.20(m,11H)、6.88(d,J=8.5Hz、4H)、5.86(d,J=2.0Hz、1H)、5.75(d,J=3.4Hz、1H)、5.70(d,J=7.2Hz、1H)、5.43-5.33(m,2H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.37-4.21(m,3H)、4.02-3.96(m,1H)、3.72(s,7H)、3.59-3.45(m,2H)、3.43-3.20(m,6H)、3.15(s,3H)、3.04-2.93(m,5H)、2.46-2.38(m,2H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,4H)、1.41-1.27(m,4H)、1.16(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.26、171.72、171.32、171.10、169.35、165.17、165.13、164.83、158.10、157.92、154.67、144.47、142.44、135.23、135.05、133.72、133.43、129.69、129.18、129.13、129.00、128.92、128.65、128.54、127.83、127.65、126.76、113.18、101.67、100.89、88.99、85.87、80.36、75.39、73.66、71.87、70.48、69.95、68.69、67.90、62.53、62.02、61.80、54.98、54.86、51.98、51.26、49.72、40.84、38.32、34.95、34.77、29.10、29.06、28.97、28.88、28.67、28.53、26.21、25.16、22.65、21.80、10.64、7.14.C77H86N6O20についてのLRMS計算値1414.5897、実測値m/z 1438.9(M+23)Na+、1413.2(M-1)-。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(s,1H)、8.07(d,J=9.2Hz、1H)、7.99-7.84(m,5H)、7.79-7.44(m,10H)、7.41-7.20(m,11H)、6.88(d,J=8.5Hz、4H)、5.86(d,J=2.0Hz、1H)、5.75(d,J=3.4Hz、1H)、5.70(d,J=7.2Hz、1H)、5.43-5.33(m,2H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.37-4.21(m,3H)、4.02-3.96(m,1H)、3.72(s,7H)、3.59-3.45(m,2H)、3.43-3.20(m,6H)、3.15(s,3H)、3.04-2.93(m,5H)、2.46-2.38(m,2H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.50(s,4H)、1.41-1.27(m,4H)、1.16(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.26、171.72、171.32、171.10、169.35、165.17、165.13、164.83、158.10、157.92、154.67、144.47、142.44、135.23、135.05、133.72、133.43、129.69、129.18、129.13、129.00、128.92、128.65、128.54、127.83、127.65、126.76、113.18、101.67、100.89、88.99、85.87、80.36、75.39、73.66、71.87、70.48、69.95、68.69、67.90、62.53、62.02、61.80、54.98、54.86、51.98、51.26、49.72、40.84、38.32、34.95、34.77、29.10、29.06、28.97、28.88、28.67、28.53、26.21、25.16、22.65、21.80、10.64、7.14.C77H86N6O20についてのLRMS計算値1414.5897、実測値m/z 1438.9(M+23)Na+、1413.2(M-1)-。
(10B)-化合物9B(500mg、0.329mmol)を、化合物10Aと同じようにコハク酸化するために充填したところ、79μmol/gの充填量で4.11gの10Bが得られた。
(2A/2B)-化合物1(40g、113.2mmol)をDMF(950ml)に溶解させた。NaH(油中60%;11.32g、283mmol)を加え、反応混合物を、ガスの発生が停止するまで、約3時間撹拌した。次に、N-(ブロモヘキシル)フタルイミド(52.7g、169.8mmol)を加え、反応物を室温で3時間撹拌した。反応混合物を50℃に加熱し、72時間保った。DMFを減圧下で除去し、得られたガムを、シリカゲルカラム精製用のシリカに吸着させた。2Aおよび2Bの混合物が、4~6%のMeOH/DCM v/vで溶離して、29.85gの生成物(51.2mmol、45%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.05(d,J=9.9Hz、1H、D2O交換可能)、11.65(d,J=8.8Hz、1H、D2O交換可能)、8.26(d,J=9.5Hz、1H)、7.82(p,J=4.3Hz、4H)、5.87(d,J=6.5Hz、1H)、5.78(d,J=6.0Hz、0H、D2O交換可能)、5.39(d,J=6.2Hz、0H、D2O交換可能)、5.12(d,J=4.6Hz、1H、D2O交換可能)、5.04(t,J=5.4Hz、1H、D2O交換可能)、4.56-4.51(m,0H)、4.33-4.27(m,1H)、4.24(q,J=4.5Hz、1H)、3.94-3.87(m,1H)、3.64-3.42(m,6H)、2.74(p,J=6.8Hz、1H)、1.43(dt,J=27.1、6.5Hz、4H)、1.23-1.12(m,4H)、1.09(dd,J=6.6、4.9Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ180.03、167.91、167.89、167.81、154.72、148.83、148.19、137.43、137.41、134.30、131.55、131.52、122.92、122.86、119.99、86.24、84.46、84.44、81.41、69.59、68.89、68.88、61.25、37.16、34.70、28.87、27.84、27.78、25.90、24.79、18.82、18.79、18.75.C28H34N6O8についてのLRMS計算値582.2438、実測値m/z 583.2(M+1)+、581.1(M-1)-、617.1(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.30。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.05(d,J=9.9Hz、1H、D2O交換可能)、11.65(d,J=8.8Hz、1H、D2O交換可能)、8.26(d,J=9.5Hz、1H)、7.82(p,J=4.3Hz、4H)、5.87(d,J=6.5Hz、1H)、5.78(d,J=6.0Hz、0H、D2O交換可能)、5.39(d,J=6.2Hz、0H、D2O交換可能)、5.12(d,J=4.6Hz、1H、D2O交換可能)、5.04(t,J=5.4Hz、1H、D2O交換可能)、4.56-4.51(m,0H)、4.33-4.27(m,1H)、4.24(q,J=4.5Hz、1H)、3.94-3.87(m,1H)、3.64-3.42(m,6H)、2.74(p,J=6.8Hz、1H)、1.43(dt,J=27.1、6.5Hz、4H)、1.23-1.12(m,4H)、1.09(dd,J=6.6、4.9Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ180.03、167.91、167.89、167.81、154.72、148.83、148.19、137.43、137.41、134.30、131.55、131.52、122.92、122.86、119.99、86.24、84.46、84.44、81.41、69.59、68.89、68.88、61.25、37.16、34.70、28.87、27.84、27.78、25.90、24.79、18.82、18.79、18.75.C28H34N6O8についてのLRMS計算値582.2438、実測値m/z 583.2(M+1)+、581.1(M-1)-、617.1(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.30。
(3A/3B)-化合物2A/2B(14.1g、24.2mmol)を、完全なアルゴン雰囲気下で無水ピリジン(240ml)に溶解させ、0℃に冷却した。次に、DMTrCl(9.0g、26.6mmol)を加え、反応物を室温に温め、72時間撹拌させた。反応をMeOHでクエンチし、ピリジンを減圧下で除去した。粗生成物を飽和NaHCO3で洗浄し、DCMで抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、13.82g(15.62mmol、65%)の3Aおよび2.06g(2.33mmol、10%)の3Bが得られた。
3A)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.06(s,1H)、11.59(s,1H)、8.12(s,1H)、7.81(p,J=4.4Hz、4H)、7.33(d,J=7.3Hz、2H)、7.27-7.16(m,7H)、6.82(dd,J=8.7、7.1Hz、4H)、5.92(d,J=5.5Hz、1H)、5.14(d,J=5.6Hz、1H)、4.39(t,J=5.2Hz、1H)、4.27(q,J=4.8Hz、1H)、4.03(q,J=3.9Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.57(dd,J=11.2、4.7Hz、1H)、3.51-3.38(m,3H)、3.27(dd,J=10.4、6.1Hz、1H)、3.15(dd,J=10.3、3.0Hz、1H)、2.74(p,J=6.8Hz、1H)、1.47(dt,J=21.2、6.6Hz、4H)、1.28-1.15(m,4H)、1.10(dd,J=6.6、5.1Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ180.04、167.83、158.02、158.00、154.74、148.76、148.16、144.74、137.44、135.44、135.35、134.30、131.52、129.68、129.65、127.72、127.65、126.62、122.92、120.29、113.06、85.52、85.02、84.06、80.59、69.78、69.12、63.93、63.45、37.19、34.72、28.89、27.79、25.94、24.83、18.80、18.78.C49H52N6O10についてのLRMS計算値884.3745、実測値m/z 885.2(M+1)+、907.0(M+23)Na+、883.2(M-1)-、919.2(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.52
3B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.08(s,1H、D2O交換可能)、11.67(s,1H、D2O交換可能)、8.14(s,1H)、7.86-7.76(m,4H)、7.37-7.14(m,9H)、6.81(dd,J=8.8、4.0Hz、4H)、5.81(d,J=4.7Hz、1H)、5.51(d,J=5.7Hz、1H、D2O交換可能)、4.67(d,J=4.7Hz、1H)、4.05-3.91(m,2H)、3.70(s,6H)、3.55(dt,J=14.2、8.2Hz、3H)、3.39(d,J=9.4Hz、1H)、3.26-3.14(m,2H)、2.76(p,J=6.8Hz、1H)、1.50(dt,J=35.7、6.6Hz、4H)、1.32-1.19(m,4H)、1.11(d,J=6.8Hz、6H).13C NMR(126MHz、D2O)δ180.10、167.90、158.02、154.81、148.81、148.16、144.70、137.29、135.39、135.36、134.33、131.55、129.64、129.61、127.74、127.61、126.64、122.94、120.28、113.07、87.17、85.57、81.14、77.71、72.22、69.63、63.31、59.72、54.94、37.30、34.73、29.08、27.86、26.05、25.03、18.87、18.78、14.05.C49H52N6O10についてのLRMS計算値884.3745、実測値m/z 885.1(M+1)+、883.0(M-1)-、919.0(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.32。
3A)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.06(s,1H)、11.59(s,1H)、8.12(s,1H)、7.81(p,J=4.4Hz、4H)、7.33(d,J=7.3Hz、2H)、7.27-7.16(m,7H)、6.82(dd,J=8.7、7.1Hz、4H)、5.92(d,J=5.5Hz、1H)、5.14(d,J=5.6Hz、1H)、4.39(t,J=5.2Hz、1H)、4.27(q,J=4.8Hz、1H)、4.03(q,J=3.9Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.57(dd,J=11.2、4.7Hz、1H)、3.51-3.38(m,3H)、3.27(dd,J=10.4、6.1Hz、1H)、3.15(dd,J=10.3、3.0Hz、1H)、2.74(p,J=6.8Hz、1H)、1.47(dt,J=21.2、6.6Hz、4H)、1.28-1.15(m,4H)、1.10(dd,J=6.6、5.1Hz、6H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ180.04、167.83、158.02、158.00、154.74、148.76、148.16、144.74、137.44、135.44、135.35、134.30、131.52、129.68、129.65、127.72、127.65、126.62、122.92、120.29、113.06、85.52、85.02、84.06、80.59、69.78、69.12、63.93、63.45、37.19、34.72、28.89、27.79、25.94、24.83、18.80、18.78.C49H52N6O10についてのLRMS計算値884.3745、実測値m/z 885.2(M+1)+、907.0(M+23)Na+、883.2(M-1)-、919.2(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.52
3B)
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.08(s,1H、D2O交換可能)、11.67(s,1H、D2O交換可能)、8.14(s,1H)、7.86-7.76(m,4H)、7.37-7.14(m,9H)、6.81(dd,J=8.8、4.0Hz、4H)、5.81(d,J=4.7Hz、1H)、5.51(d,J=5.7Hz、1H、D2O交換可能)、4.67(d,J=4.7Hz、1H)、4.05-3.91(m,2H)、3.70(s,6H)、3.55(dt,J=14.2、8.2Hz、3H)、3.39(d,J=9.4Hz、1H)、3.26-3.14(m,2H)、2.76(p,J=6.8Hz、1H)、1.50(dt,J=35.7、6.6Hz、4H)、1.32-1.19(m,4H)、1.11(d,J=6.8Hz、6H).13C NMR(126MHz、D2O)δ180.10、167.90、158.02、154.81、148.81、148.16、144.70、137.29、135.39、135.36、134.33、131.55、129.64、129.61、127.74、127.61、126.64、122.94、120.28、113.07、87.17、85.57、81.14、77.71、72.22、69.63、63.31、59.72、54.94、37.30、34.73、29.08、27.86、26.05、25.03、18.87、18.78、14.05.C49H52N6O10についてのLRMS計算値884.3745、実測値m/z 885.1(M+1)+、883.0(M-1)-、919.0(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.32。
(4A)-化合物3A(5.0g、5.65mmol)を、3時間にわたって還流しているMeOH(56ml)中のヒドラジン(900mg、28mmol)で処理した。フタルイミドおよびイソブチリル保護基の両方が、反応中に切断された。MeOHを減圧下で除去し、粗生成物をNH4OHで洗浄した。水層をDCMで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させた。DCMを減圧下で除去したところ、4A*が粗製の発泡体として得られた。
C37H44N6O7についてのLRMS計算値684.3271、実測値m/z 685.2(M+1)+、683.1(M-1)-、719.1(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.00。
C37H44N6O7についてのLRMS計算値684.3271、実測値m/z 685.2(M+1)+、683.1(M-1)-、719.1(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.00。
次に、4A*を、完全なアルゴン雰囲気下で無水DCM(56ml)に溶解させ、Et3N(2.4ml、17mmol)を加えた。次に、GalNAc(OBz)-C5-NHSエステル(4.5g、6.22mmol)を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。DCMを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を飽和NaHCO3で洗浄し、次に、水層をDCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、次に、減圧下で除去した。粗製の発泡体を、シリカゲルクロマトグラフィー(2.5~5%のMeOH/DCM v/vで溶離した)によって精製したところ、7.0g(5.41mmol、96%)の4Aが得られた。アセトニトリルとの同時蒸発は、1H NMRに見られるトリエチルアミンピークを低下させなかった。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ10.73(s,1H)、9.90(s,1H)、8.02(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.0Hz、4H)、7.79(s,1H)、7.74-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(dd,J=13.9、7.4Hz、4H)、7.30-7.16(m,7H)、6.84(dd,J=8.9、2.7Hz、4H)、6.53(s,2H)、5.81(d,J=5.4Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.13(d,J=5.7Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.39-4.19(m,4H)、3.99(q,J=4.2Hz、1H)、3.78(d,J=9.6Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.61-3.46(m,2H)、3.46-3.37(m,1H)、3.24-3.12(m,2H)、2.97(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.56-1.37(m,6H)、1.36-1.25(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.72、169.38、165.19、165.14、164.84、158.02、156.66、153.81、151.30、144.77、135.47、135.37、134.89、133.75、133.47、129.67、129.18、129.16、129.14、129.01、128.98、128.95、128.68、128.57、127.77、127.65、126.64、116.64、113.12、100.88、85.53、84.44、83.53、80.61、71.86、69.96、69.78、69.08、68.73、67.90、63.84、62.02、54.98、49.72、45.42、38.30、34.99、29.12、29.06、28.56、26.17、25.06、22.68、21.82、8.47.C71H77N7O17についてのLRMS計算値1299.5376、実測値m/z 1301.1(M+1)+、1322.1(M+23)Na+、1298.2(M-1)-、1336.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.37。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ10.73(s,1H)、9.90(s,1H)、8.02(d,J=9.3Hz、1H)、7.91(t,J=7.0Hz、4H)、7.79(s,1H)、7.74-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(dd,J=13.9、7.4Hz、4H)、7.30-7.16(m,7H)、6.84(dd,J=8.9、2.7Hz、4H)、6.53(s,2H)、5.81(d,J=5.4Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.13(d,J=5.7Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.49-4.40(m,2H)、4.39-4.19(m,4H)、3.99(q,J=4.2Hz、1H)、3.78(d,J=9.6Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.61-3.46(m,2H)、3.46-3.37(m,1H)、3.24-3.12(m,2H)、2.97(q,J=6.6Hz、2H)、2.04(s,2H)、1.69(s,3H)、1.56-1.37(m,6H)、1.36-1.25(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.72、169.38、165.19、165.14、164.84、158.02、156.66、153.81、151.30、144.77、135.47、135.37、134.89、133.75、133.47、129.67、129.18、129.16、129.14、129.01、128.98、128.95、128.68、128.57、127.77、127.65、126.64、116.64、113.12、100.88、85.53、84.44、83.53、80.61、71.86、69.96、69.78、69.08、68.73、67.90、63.84、62.02、54.98、49.72、45.42、38.30、34.99、29.12、29.06、28.56、26.17、25.06、22.68、21.82、8.47.C71H77N7O17についてのLRMS計算値1299.5376、実測値m/z 1301.1(M+1)+、1322.1(M+23)Na+、1298.2(M-1)-、1336.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.37。
(5A)-化合物4A(6.8g、5.23mmol)をDMFに溶解させた。N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(1.9g、15.7mmol)を反応混合物に加え、1.5時間にわたって60℃に加熱した。DMFを減圧下で除去し、粗生成物をシリカに吸着させた。シリカゲルクロマトグラフィー(2.5~5%のMeOH/DCM v/vで溶離した)によって精製を行ったところ、5.63gの5A(4.15mmol、79%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.38(s,1H)、9.94(s,1H)、8.48(s,1H)、8.03(d,J=9.3Hz、1H)、7.97-7.87(m,5H)、7.75-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(dd,J=14.6、7.4Hz、4H)、7.29-7.16(m,7H)、6.83(dd,J=8.7、4.6Hz、4H)、5.93(d,J=4.9Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.21(d,J=5.7Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.3、7.3Hz、2H)、4.39-4.23(m,4H)、4.02(q,J=4.7Hz、1H)、3.78(d,J=9.5Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.52(ddt、J=40.7、16.1、7.9Hz、4H)、3.25(dd,J=10.3、5.9Hz、1H)、3.15(d,J=7.7Hz、1H)、3.07(s,3H)、3.01-2.92(m,5H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.55-1.38(m,6H)、1.35-1.24(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.40、165.20、165.15、164.85、158.03、158.01、157.79、157.58、157.28、149.86、144.76、136.33、135.47、135.38、133.75、133.48、133.45、129.66、129.62、129.15、129.14、129.01、128.99、128.94、128.67、128.56、127.76、127.63、126.64、119.78、113.11、100.88、85.50、85.06、83.46、80.78、71.87、69.97、69.83、69.04、68.72、67.91、63.80、62.03、54.98、49.73、45.45、45.43、34.99、34.63、29.10、29.06、28.55、26.16、25.07、22.67、21.82、8.48.C74H82N8O17についてのLRMS計算値1354.5798、実測値m/z 1356.1(M+1)+、1377.2(M+23)Na+、1353.3(M-1)-、1389.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.38(s,1H)、9.94(s,1H)、8.48(s,1H)、8.03(d,J=9.3Hz、1H)、7.97-7.87(m,5H)、7.75-7.52(m,8H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(dd,J=14.6、7.4Hz、4H)、7.29-7.16(m,7H)、6.83(dd,J=8.7、4.6Hz、4H)、5.93(d,J=4.9Hz、1H)、5.75(d,J=3.1Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.21(d,J=5.7Hz、1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.45(q,J=8.3、7.3Hz、2H)、4.39-4.23(m,4H)、4.02(q,J=4.7Hz、1H)、3.78(d,J=9.5Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.52(ddt、J=40.7、16.1、7.9Hz、4H)、3.25(dd,J=10.3、5.9Hz、1H)、3.15(d,J=7.7Hz、1H)、3.07(s,3H)、3.01-2.92(m,5H)、2.04(s,2H)、1.70(s,3H)、1.55-1.38(m,6H)、1.35-1.24(m,2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.40、165.20、165.15、164.85、158.03、158.01、157.79、157.58、157.28、149.86、144.76、136.33、135.47、135.38、133.75、133.48、133.45、129.66、129.62、129.15、129.14、129.01、128.99、128.94、128.67、128.56、127.76、127.63、126.64、119.78、113.11、100.88、85.50、85.06、83.46、80.78、71.87、69.97、69.83、69.04、68.72、67.91、63.80、62.03、54.98、49.73、45.45、45.43、34.99、34.63、29.10、29.06、28.55、26.16、25.07、22.67、21.82、8.48.C74H82N8O17についてのLRMS計算値1354.5798、実測値m/z 1356.1(M+1)+、1377.2(M+23)Na+、1353.3(M-1)-、1389.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.40。
(6A)-化合物5A(1.0g、0.74mmol)をDCM(7ml)に溶解させ、4-ジメチルアミノピリジン(270mg、2.21mmol)を反応混合物に加え、5分間撹拌した。次に、無水コハク酸(150mg、1.48mmol)を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。DCMを減圧下で蒸発させ、粗製の発泡体を、DCM中2%のトリエチルアミン(v/v)で前処理された手動のカラム(φ=4.6×17)上に充填した。1~5%のMeOH/2~5%のトリエチルアミン/DCM v/vの勾配を用いて、6Aを精製した。6Aは、定量的収率で4~5%のMeOH/4~5%のトリエチルアミン/DCM v/vになった。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.43(s,1H)、8.62(s,1H)、8.08-7.98(m,2H)、7.92(t,J=8.0Hz、4H)、7.71(dd,J=12.7、7.3Hz、4H)、7.64(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=7.7、7.1Hz、3H)、7.50(d,J=7.7Hz、2H)、7.39(t,J=7.8Hz、2H)、7.30-7.14(m,9H)、6.81(dd,J=8.8、4.9Hz、4H)、5.94(d,J=4.4Hz、1H)、5.76(s,1H)、5.63(t,J=5.5Hz、1H)、5.38(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.90(t,J=4.9Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(q,J=9.9、8.2Hz、2H)、4.39-4.24(m,2H)、4.15(q,J=4.9Hz、1H)、3.82-3.77(m,1H)、3.72(s,6H)、3.53-3.43(m,2H)、3.37(q,J=7.2Hz、3H)、3.27(dd,J=10.5、5.2Hz、1H)、3.22-3.15(m,1H)、3.03(s,3H)、3.01-2.94(m,5H)、2.79(q,J=7.0Hz、2H)、2.59(q,J=6.4、5.9Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.46(m,4H)、1.38(s,2H)、1.33-1.26(m,2H)、1.15(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.21、171.83、171.69、169.34、165.16、165.11、164.81、158.00、157.99、157.96、157.55、157.24、149.59、144.58、137.75、135.32、135.29、133.71、133.43、129.52、129.41、129.16、129.13、129.11、128.98、128.91、128.64、128.53、127.71、127.49、126.58、120.16、113.06、100.86、86.36、85.38、80.12、78.06、71.84、70.27、69.94、68.68、67.89、62.00、54.94、54.93、54.84、51.98、49.70、45.44、34.94、34.60、29.05、28.97、28.68、28.63、28.52、26.09、25.03、22.64、21.78、9.74、7.13.C78H86N8O20についてのLRMS計算値1454.5958、実測値m/z 1455.2(M+1)+、1478.1(M+23)Na+、1453.2(M-1)-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.32。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.43(s,1H)、8.62(s,1H)、8.08-7.98(m,2H)、7.92(t,J=8.0Hz、4H)、7.71(dd,J=12.7、7.3Hz、4H)、7.64(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=7.7、7.1Hz、3H)、7.50(d,J=7.7Hz、2H)、7.39(t,J=7.8Hz、2H)、7.30-7.14(m,9H)、6.81(dd,J=8.8、4.9Hz、4H)、5.94(d,J=4.4Hz、1H)、5.76(s,1H)、5.63(t,J=5.5Hz、1H)、5.38(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.90(t,J=4.9Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.46(q,J=9.9、8.2Hz、2H)、4.39-4.24(m,2H)、4.15(q,J=4.9Hz、1H)、3.82-3.77(m,1H)、3.72(s,6H)、3.53-3.43(m,2H)、3.37(q,J=7.2Hz、3H)、3.27(dd,J=10.5、5.2Hz、1H)、3.22-3.15(m,1H)、3.03(s,3H)、3.01-2.94(m,5H)、2.79(q,J=7.0Hz、2H)、2.59(q,J=6.4、5.9Hz、2H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.46(m,4H)、1.38(s,2H)、1.33-1.26(m,2H)、1.15(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.21、171.83、171.69、169.34、165.16、165.11、164.81、158.00、157.99、157.96、157.55、157.24、149.59、144.58、137.75、135.32、135.29、133.71、133.43、129.52、129.41、129.16、129.13、129.11、128.98、128.91、128.64、128.53、127.71、127.49、126.58、120.16、113.06、100.86、86.36、85.38、80.12、78.06、71.84、70.27、69.94、68.68、67.89、62.00、54.94、54.93、54.84、51.98、49.70、45.44、34.94、34.60、29.05、28.97、28.68、28.63、28.52、26.09、25.03、22.64、21.78、9.74、7.13.C78H86N8O20についてのLRMS計算値1454.5958、実測値m/z 1455.2(M+1)+、1478.1(M+23)Na+、1453.2(M-1)-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.32。
(7A)-化合物6A(1.0g、0.69mmol)をアセトニトリル(70ml)に溶解させ、HBTU(520mg、1.37mmol)およびDIEA(270mg、2.06mmol)を加えた。混合物を5分間にわたって振とうし、次に、LCAA-CPG(8.6g、510Å、131μmol/g)を加え、室温で一晩振とうした。CPGをろ過し、それぞれ200mlのDCM、20%のMeOH/DCM v/v、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。CPGを、無水酢酸(12.5ml)、ピリジン(37.5ml)、およびトリエチルアミン(0.5ml)中で1時間にわたって振とうしてから、前述されるのと同じ条件によって再度洗浄した。化合物7Aを減圧下で一晩乾燥させ、充填量を、分光光度計によって測定した(73μmol/g)。
(8A)-化合物5A(2.0g、1.48mmol)を、ピリジンと2回同時蒸発させ、完全なアルゴン雰囲気下に置いた。DCM(15ml)をフラスコに加え、0℃に冷却してから、2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(890mg、2.95mmol)を加えた。混合物を20分間撹拌し、次に、4,5-ジシアノイミダゾール(175mg、1.48mmol)を反応物に加えた。反応物を、一晩、ゆっくりと室温に温めた。反応物を飽和重炭酸塩で洗浄し、水層をDCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の発泡体が得られた。発泡体を、2%のトリエチルアミン/49%のEtOAc/ヘキサンv/vで準備された、前処理された手動のカラム(φ=4.6×19)上に充填した。不純物を、80%のEtOAc/ヘキサンv/v(8CV)、続いて100%のEtOAc(8CV)で溶離した。次に、EtOAcを100%のDCM(1CV)でパージした。8Aを3%のMeOH/DCM v/v(5CV)、および6%のMeOH/DCM v/v(5CV)で溶離した。8Aを減圧下で蒸発させたところ、1.65g(1.06mmol、72%)のアミダイトがジアステレオマー混合物として得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.40(s,1H)、8.42(s,1H)、8.05-7.85(m,6H)、7.74-7.44(m,10H)、7.43-7.15(m,11H)、6.81(q,J=8.8Hz、4H)、5.95(t,J=3.7Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.57-4.40(m,4H)、4.30(dq、J=29.0、9.1Hz、2H)、4.21-4.06(m,1H)、3.82-3.68(m,8H)、3.64-3.43(m,7H)、3.30-3.19(m,4H)、3.04(d,J=2.6Hz、3H)、3.00(s,3H)、2.97-2.86(m,5H)、2.74(t,J=5.6Hz、1H)、2.54(t,J=5.9Hz、1H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.56-1.36(m,6H)、1.34-1.04(m,19H)、0.95(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.85、169.52、165.35、165.30、165.01、158.23、158.19、157.72、157.41、157.39、149.96、149.93、144.86、144.83、136.91、136.66、135.50、135.49、135.44、135.40、133.91、133.64、133.61、129.84、129.80、129.77、129.71、129.34、129.32、129.30、129.17、129.15、129.11、128.84、128.73、127.91、127.89、127.79、127.71、126.83、126.80、120.20、119.00、118.79、113.25、101.04、85.79、85.75、85.26、82.88、82.63、80.07、79.65、72.01、70.12、68.88、68.07、63.50、63.37、62.18、58.78、58.65、58.21、58.06、55.15、55.14、55.12、49.88、45.74、35.15、34.77、29.30、29.27、29.24、28.72、26.39、25.30、25.28、24.47、24.44、24.42、24.38、24.34、24.28、22.83、21.98、21.21、19.96、19.91、19.88、19.83、18.96、9.56.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.02、153.99.C83H99N10O18PについてのLRMS計算値1554.6876、実測値m/z 1555.3(M+1)+、1578.3(M+23)Na+、1555.4(M-1)-、1590.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.40(s,1H)、8.42(s,1H)、8.05-7.85(m,6H)、7.74-7.44(m,10H)、7.43-7.15(m,11H)、6.81(q,J=8.8Hz、4H)、5.95(t,J=3.7Hz、1H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、4.74(d,J=8.5Hz、1H)、4.57-4.40(m,4H)、4.30(dq、J=29.0、9.1Hz、2H)、4.21-4.06(m,1H)、3.82-3.68(m,8H)、3.64-3.43(m,7H)、3.30-3.19(m,4H)、3.04(d,J=2.6Hz、3H)、3.00(s,3H)、2.97-2.86(m,5H)、2.74(t,J=5.6Hz、1H)、2.54(t,J=5.9Hz、1H)、2.03(s,2H)、1.69(s,3H)、1.56-1.36(m,6H)、1.34-1.04(m,19H)、0.95(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.85、169.52、165.35、165.30、165.01、158.23、158.19、157.72、157.41、157.39、149.96、149.93、144.86、144.83、136.91、136.66、135.50、135.49、135.44、135.40、133.91、133.64、133.61、129.84、129.80、129.77、129.71、129.34、129.32、129.30、129.17、129.15、129.11、128.84、128.73、127.91、127.89、127.79、127.71、126.83、126.80、120.20、119.00、118.79、113.25、101.04、85.79、85.75、85.26、82.88、82.63、80.07、79.65、72.01、70.12、68.88、68.07、63.50、63.37、62.18、58.78、58.65、58.21、58.06、55.15、55.14、55.12、49.88、45.74、35.15、34.77、29.30、29.27、29.24、28.72、26.39、25.30、25.28、24.47、24.44、24.42、24.38、24.34、24.28、22.83、21.98、21.21、19.96、19.91、19.88、19.83、18.96、9.56.31P NMR(160MHz、DMSO-d6)δ154.02、153.99.C83H99N10O18PについてのLRMS計算値1554.6876、実測値m/z 1555.3(M+1)+、1578.3(M+23)Na+、1555.4(M-1)-、1590.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
(4B)-化合物3B(4.2g、4.75mmol)を、3Aと同じ条件を用いて脱保護したところ、化合物3B*が得られた。
C37H44N6O7についてのLRMS計算値684.3271、実測値m/z 685.2(M+1)+、707.2(M+23)Na+、683.3(M-1)-、719.3(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.00。
C37H44N6O7についてのLRMS計算値684.3271、実測値m/z 685.2(M+1)+、707.2(M+23)Na+、683.3(M-1)-、719.3(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.00。
次に、化合物3B*を、化合物3A*と同じようにGalNAc(OBz)-C5-NHSエステル(3.8g、5.22mmol)で処理した。4.5gの化合物4B(3.43mmol、72%)が得られた。
C71H77N7O17についてのLRMS計算値1299.5376、実測値m/z 1300.1(M+1)+、1322.1(M+23)Na+、1298.2(M-1)-、1334.2(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.29。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ10.91(s,1H)、10.65(s,1H)、8.13(d,J=9.3Hz、1H)、7.92(t,J=6.5Hz、4H)、7.82(d,J=7.5Hz、2H)、7.76-7.67(m,3H)、7.64(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=8.0Hz、3H)、7.49(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.31(m,4H)、7.27(t,J=7.6Hz、2H)、7.21(d,J=8.5Hz、5H)、6.89-6.81(m,4H)、6.75(s,2H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.71(d,J=4.7Hz、1H)、5.50(d,J=6.0Hz、1H)、5.36(s,6H)、4.78(d,J=8.5Hz、1H)、4.60(q,J=4.9Hz、1H)、4.45(q,J=10.0、8.2Hz、2H)、4.38-4.24(m,2H)、4.03-3.95(m,2H)、3.79(d,J=9.6Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.47(m,2H)、3.18(ddd,J=44.2、10.5、3.7Hz、2H)、3.01-2.95(m,2H)、2.06(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.41(m,6H)、1.35(q,J=6.6、6.1Hz、2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.35、165.18、165.12、164.83、158.00、156.60、153.94、151.24、144.70、135.43、134.92、133.74、133.45、129.61、129.17、129.15、129.13、129.00、128.98、128.94、128.68、128.56、127.75、127.63、126.63、116.62、113.10、100.88、86.80、85.54、80.71、77.77、72.13、71.91、69.96、69.62、68.69、67.88、63.34、62.61、62.04、54.97、54.90、49.69、34.95、29.24、29.12、28.52、26.27、25.21、22.67、21.81、8.43。
C71H77N7O17についてのLRMS計算値1299.5376、実測値m/z 1300.1(M+1)+、1322.1(M+23)Na+、1298.2(M-1)-、1334.2(M+35)Cl-。Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.29。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ10.91(s,1H)、10.65(s,1H)、8.13(d,J=9.3Hz、1H)、7.92(t,J=6.5Hz、4H)、7.82(d,J=7.5Hz、2H)、7.76-7.67(m,3H)、7.64(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=8.0Hz、3H)、7.49(t,J=7.7Hz、2H)、7.41-7.31(m,4H)、7.27(t,J=7.6Hz、2H)、7.21(d,J=8.5Hz、5H)、6.89-6.81(m,4H)、6.75(s,2H)、5.75(d,J=3.2Hz、1H)、5.71(d,J=4.7Hz、1H)、5.50(d,J=6.0Hz、1H)、5.36(s,6H)、4.78(d,J=8.5Hz、1H)、4.60(q,J=4.9Hz、1H)、4.45(q,J=10.0、8.2Hz、2H)、4.38-4.24(m,2H)、4.03-3.95(m,2H)、3.79(d,J=9.6Hz、1H)、3.72(s,6H)、3.62-3.47(m,2H)、3.18(ddd,J=44.2、10.5、3.7Hz、2H)、3.01-2.95(m,2H)、2.06(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.41(m,6H)、1.35(q,J=6.6、6.1Hz、2H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.74、169.35、165.18、165.12、164.83、158.00、156.60、153.94、151.24、144.70、135.43、134.92、133.74、133.45、129.61、129.17、129.15、129.13、129.00、128.98、128.94、128.68、128.56、127.75、127.63、126.63、116.62、113.10、100.88、86.80、85.54、80.71、77.77、72.13、71.91、69.96、69.62、68.69、67.88、63.34、62.61、62.04、54.97、54.90、49.69、34.95、29.24、29.12、28.52、26.27、25.21、22.67、21.81、8.43。
(5B)-化合物4B(4.3g、3.31mmol)を、化合物4Aと同じように保護したところ、3.0gの化合物5B(2.21mmol、67%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H)、10.46(s,1H)、8.51(s,1H)、8.08(d,J=9.3Hz、1H)、7.99-7.87(m,5H)、7.77(t,J=5.5Hz、1H)、7.73-7.52(m,7H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(t,J=7.8Hz、2H)、7.31(d,J=7.3Hz、2H)、7.21(dd,J=19.7、8.2Hz、7H)、6.81(dd,J=8.9、2.4Hz、4H)、5.82(d,J=4.1Hz、1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.52(d,J=5.8Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.81-4.67(m,2H)、4.44(q,J=8.7、7.5Hz、2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.10(t,J=5.3Hz、1H)、3.99(q,J=4.8Hz、1H)、3.78(d,J=9.6Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.64-3.56(m,1H)、3.50(d,J=9.7Hz、1H)、3.24-3.12(m,2H)、3.03(d,J=7.3Hz、10H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.29(m,8H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.73、169.36、165.19、165.13、164.84、158.00、157.99、157.80、157.57、157.22、149.83、144.70、136.79、135.46、135.43、133.74、133.47、133.45、129.58、129.55、129.17、129.15、129.14、129.00、128.98、128.94、128.68、128.56、127.73、127.60、126.63、119.77、113.08、100.89、87.65、85.46、80.73、77.67、72.05、71.90、69.96、69.75、68.71、67.90、63.22、62.04、54.99、54.97、49.71、34.98、34.63、29.22、29.13、28.54、26.26、25.20、22.67、21.83、8.38.C74H82N8O17についてのLRMS計算値1354.5798、実測値m/z 1355.3(M+1)+、1377.2(M+23)Na+、1389.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.37。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.37(s,1H)、10.46(s,1H)、8.51(s,1H)、8.08(d,J=9.3Hz、1H)、7.99-7.87(m,5H)、7.77(t,J=5.5Hz、1H)、7.73-7.52(m,7H)、7.48(t,J=7.7Hz、2H)、7.37(t,J=7.8Hz、2H)、7.31(d,J=7.3Hz、2H)、7.21(dd,J=19.7、8.2Hz、7H)、6.81(dd,J=8.9、2.4Hz、4H)、5.82(d,J=4.1Hz、1H)、5.74(d,J=3.3Hz、1H)、5.52(d,J=5.8Hz、1H)、5.36(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.81-4.67(m,2H)、4.44(q,J=8.7、7.5Hz、2H)、4.38-4.23(m,2H)、4.10(t,J=5.3Hz、1H)、3.99(q,J=4.8Hz、1H)、3.78(d,J=9.6Hz、1H)、3.71(s,6H)、3.64-3.56(m,1H)、3.50(d,J=9.7Hz、1H)、3.24-3.12(m,2H)、3.03(d,J=7.3Hz、10H)、2.05(s,2H)、1.69(s,3H)、1.55-1.29(m,8H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.73、169.36、165.19、165.13、164.84、158.00、157.99、157.80、157.57、157.22、149.83、144.70、136.79、135.46、135.43、133.74、133.47、133.45、129.58、129.55、129.17、129.15、129.14、129.00、128.98、128.94、128.68、128.56、127.73、127.60、126.63、119.77、113.08、100.89、87.65、85.46、80.73、77.67、72.05、71.90、69.96、69.75、68.71、67.90、63.22、62.04、54.99、54.97、49.71、34.98、34.63、29.22、29.13、28.54、26.26、25.20、22.67、21.83、8.38.C74H82N8O17についてのLRMS計算値1354.5798、実測値m/z 1355.3(M+1)+、1377.2(M+23)Na+、1389.3(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.37。
(6B)-化合物5B(150mg、0.11mmol)を、化合物5Aと同じように無水コハク酸(22mg、0.22mmol)で処理したところ、120mgの化合物6B(0.082mmol、75%)が得られた。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.47(s,1H)、8.51(s,1H)、8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.99(s,1H)、7.92(t,J=7.1Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.74-7.67(m,3H)、7.63(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=8.2Hz、3H)、7.49(t,J=7.8Hz、2H)、7.38(t,J=7.8Hz、2H)、7.29(d,J=7.3Hz、2H)、7.27-7.14(m,7H)、6.81(d,J=7.9Hz、4H)、6.03(d,J=2.7Hz、1H)、6.00-5.97(m,1H)、5.76(d,J=3.2Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.55-4.49(m,1H)、4.45(q,J=9.9、8.2Hz、2H)、4.38-4.25(m,2H)、4.04-3.99(m,1H)、3.83-3.76(m,1H)、3.71(s,6H)、3.54-3.41(m,2H)、3.40-3.26(m,6H)、3.14(dd,J=10.7、4.1Hz、1H)、3.05(s,3H)、3.04-2.97(m,6H)、2.62-2.56(m,2H)、2.06(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.45(m,4H)、1.34(dd,J=19.5、13.0Hz、4H)、1.17(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.26、172.01、171.73、171.46、169.36、168.68、165.18、165.13、164.84、158.00、157.90、157.54、157.36、149.37、144.55、137.17、135.38、135.31、133.74、133.48、133.45、129.54、129.51、129.18、129.15、129.14、129.01、128.99、128.94、128.68、128.56、127.73、127.57、126.63、119.94、113.06、100.90、86.10、85.41、80.53、75.77、72.98、71.88、70.43、69.96、68.70、67.90、62.55、62.02、54.96、51.99、49.71、45.43、34.97、34.62、33.24、29.14、29.10、28.94、28.84、28.54、26.20、25.18、22.66、22.59、21.82、21.13、14.72、10.03、7.16.C78H86N8O20についてのLRMS計算値1454.5958、実測値m/z 1455.3(M+1)+、1453.2(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.43。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.47(s,1H)、8.51(s,1H)、8.09(d,J=9.3Hz、1H)、7.99(s,1H)、7.92(t,J=7.1Hz、4H)、7.76(t,J=5.4Hz、1H)、7.74-7.67(m,3H)、7.63(t,J=7.4Hz、1H)、7.57(q,J=8.2Hz、3H)、7.49(t,J=7.8Hz、2H)、7.38(t,J=7.8Hz、2H)、7.29(d,J=7.3Hz、2H)、7.27-7.14(m,7H)、6.81(d,J=7.9Hz、4H)、6.03(d,J=2.7Hz、1H)、6.00-5.97(m,1H)、5.76(d,J=3.2Hz、1H)、5.37(dd,J=11.1、3.3Hz、1H)、4.76(d,J=8.5Hz、1H)、4.55-4.49(m,1H)、4.45(q,J=9.9、8.2Hz、2H)、4.38-4.25(m,2H)、4.04-3.99(m,1H)、3.83-3.76(m,1H)、3.71(s,6H)、3.54-3.41(m,2H)、3.40-3.26(m,6H)、3.14(dd,J=10.7、4.1Hz、1H)、3.05(s,3H)、3.04-2.97(m,6H)、2.62-2.56(m,2H)、2.06(s,2H)、1.70(s,3H)、1.56-1.45(m,4H)、1.34(dd,J=19.5、13.0Hz、4H)、1.17(s,4H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ173.26、172.01、171.73、171.46、169.36、168.68、165.18、165.13、164.84、158.00、157.90、157.54、157.36、149.37、144.55、137.17、135.38、135.31、133.74、133.48、133.45、129.54、129.51、129.18、129.15、129.14、129.01、128.99、128.94、128.68、128.56、127.73、127.57、126.63、119.94、113.06、100.90、86.10、85.41、80.53、75.77、72.98、71.88、70.43、69.96、68.70、67.90、62.55、62.02、54.96、51.99、49.71、45.43、34.97、34.62、33.24、29.14、29.10、28.94、28.84、28.54、26.20、25.18、22.66、22.59、21.82、21.13、14.72、10.03、7.16.C78H86N8O20についてのLRMS計算値1454.5958、実測値m/z 1455.3(M+1)+、1453.2(M-1)-.Rf=5%のMeOH/5%のEt3N/DCM v/v中の0.43。
(7B)-化合物6B(80mg、0.051mmol)を、6Aと同じようにLCAA-CPG上に充填したところ、640mgのCPG(69μmol/g)が得られた。
(8B)-化合物5B(200mg、0.148mmol)を、ACNおよび次にピリジンと同時蒸発させた。次に、5Bを、5Aと同様の方法でホスフィチル化したところ、80mgの8Bがジアステレオマー混合物(0.051mmol、34.7%)として得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.41(s,1H)、8.47(d,J=11.9Hz、1H)、8.06-7.86(m,6H)、7.77-7.43(m,10H)、7.42-7.12(m,11H)、6.81(dd,J=5.9、2.7Hz、4H)、5.98(dd,J=21.6、3.6Hz、1H)、5.76(d,J=3.2Hz、1H)、5.38(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.07-4.92(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.53-4.20(m,5H)、4.07-3.98(m,1H)、3.86-3.45(m,14H)、3.41-3.13(m,8H)、3.02(dd,J=10.2、3.3Hz、8H)、2.74(dd,J=12.3、6.3Hz、1H)、2.57(t,J=5.9Hz、1H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.48(d,J=27.8Hz、6H)、1.39-1.30(m,2H)、1.26-1.04(m,15H)、0.89(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.89、169.54、165.36、165.31、165.03、158.21、158.19、157.82、157.75、157.71、157.40、149.88、149.85、144.82、137.15、137.02、135.57、135.52、135.50、133.92、133.65、133.61、129.74、129.35、129.33、129.32、129.19、129.17、129.16、129.11、128.84、128.73、127.92、127.76、126.83、120.14、120.01、118.98、118.80、113.25、101.07、85.74、85.64、72.02、70.13、68.92、68.08、62.19、55.13、55.11、49.90、46.32、45.78、42.96、42.86、35.19、34.78、29.47、29.41、29.33、29.31、28.75、26.48、25.44、24.48、24.43、24.39、24.37、24.34、24.05、23.99、22.84、22.04.31P NMR(162MHz、DMSO)δ151.33、150.99.C83H99N10O18PについてのLRMS計算値1554.6876、実測値m/z 1555.3(M+1)+、1577.3(M+23)Na+、1555.4(M-1)-、1591.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.41(s,1H)、8.47(d,J=11.9Hz、1H)、8.06-7.86(m,6H)、7.77-7.43(m,10H)、7.42-7.12(m,11H)、6.81(dd,J=5.9、2.7Hz、4H)、5.98(dd,J=21.6、3.6Hz、1H)、5.76(d,J=3.2Hz、1H)、5.38(dd,J=11.1、3.2Hz、1H)、5.07-4.92(m,1H)、4.75(d,J=8.5Hz、1H)、4.53-4.20(m,5H)、4.07-3.98(m,1H)、3.86-3.45(m,14H)、3.41-3.13(m,8H)、3.02(dd,J=10.2、3.3Hz、8H)、2.74(dd,J=12.3、6.3Hz、1H)、2.57(t,J=5.9Hz、1H)、2.05(s,2H)、1.70(s,3H)、1.48(d,J=27.8Hz、6H)、1.39-1.30(m,2H)、1.26-1.04(m,15H)、0.89(d,J=6.7Hz、3H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ171.89、169.54、165.36、165.31、165.03、158.21、158.19、157.82、157.75、157.71、157.40、149.88、149.85、144.82、137.15、137.02、135.57、135.52、135.50、133.92、133.65、133.61、129.74、129.35、129.33、129.32、129.19、129.17、129.16、129.11、128.84、128.73、127.92、127.76、126.83、120.14、120.01、118.98、118.80、113.25、101.07、85.74、85.64、72.02、70.13、68.92、68.08、62.19、55.13、55.11、49.90、46.32、45.78、42.96、42.86、35.19、34.78、29.47、29.41、29.33、29.31、28.75、26.48、25.44、24.48、24.43、24.39、24.37、24.34、24.05、23.99、22.84、22.04.31P NMR(162MHz、DMSO)δ151.33、150.99.C83H99N10O18PについてのLRMS計算値1554.6876、実測値m/z 1555.3(M+1)+、1577.3(M+23)Na+、1555.4(M-1)-、1591.2(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.46。
(2)-化合物1(30.0g、106mmol)をDMF(300ml)に溶解させ、氷浴中で冷却した。NaH(3.86g、159mmol)を加え、混合物を1時間撹拌した。次に、N-(ブロモヘキシル)フタルイミド(37.8g、122mmol)を加え、反応物を一晩、70℃に加熱した。DMFを、褐色のガムになるまで減圧下で蒸発させた。褐色のガムを、シリカゲルへの吸着のために、DCMとMeOHとの1対1の混合物に溶解させた。溶媒混合物を減圧下で除去し、粗生成物を精製したところ、8.10gの2(15.83mmol、14.9%)ならびに2およびその3’-O-アルキル化位置異性体の混合物(23.45g、45.84mmol、43.2%)が得られた。2および位置異性体の全収率は58%であった。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.95(s,1H)、7.89-7.77(m,4H)、6.78(s,2H、D2O交換可能)、5.81(d,J=6.7Hz、1H)、5.74(s,2H、D2O交換可能)、5.51-5.43(m,1H、D2O交換可能)、5.08(d,J=4.9Hz、1H、D2O交換可能)、4.37(dd,J=6.6、5.0Hz、1H)、4.27-4.21(m,1H)、3.92(q,J=3.3Hz、1H)、3.67-3.59(m,1H)、3.52(q,J=7.9、7.0Hz、4H)、3.34-3.30(m,1H)、1.45(dt,J=38.0、6.6Hz、4H)、1.24-1.12(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、160.03、156.21、151.36、136.06、134.31、131.55、122.95、113.48、86.18、85.11、80.52、69.50、69.12、61.68、54.88、28.94、27.84、26.00、24.86.C24H29N7O6についてのLRMS計算値511.5304、実測値m/z 512.2(M+1)+、534.2(M+23)Na+、546.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.50。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ7.95(s,1H)、7.89-7.77(m,4H)、6.78(s,2H、D2O交換可能)、5.81(d,J=6.7Hz、1H)、5.74(s,2H、D2O交換可能)、5.51-5.43(m,1H、D2O交換可能)、5.08(d,J=4.9Hz、1H、D2O交換可能)、4.37(dd,J=6.6、5.0Hz、1H)、4.27-4.21(m,1H)、3.92(q,J=3.3Hz、1H)、3.67-3.59(m,1H)、3.52(q,J=7.9、7.0Hz、4H)、3.34-3.30(m,1H)、1.45(dt,J=38.0、6.6Hz、4H)、1.24-1.12(m,4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.90、160.03、156.21、151.36、136.06、134.31、131.55、122.95、113.48、86.18、85.11、80.52、69.50、69.12、61.68、54.88、28.94、27.84、26.00、24.86.C24H29N7O6についてのLRMS計算値511.5304、実測値m/z 512.2(M+1)+、534.2(M+23)Na+、546.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.50。
(3)-化合物2(100mg、0.195mmol)を、ピリジン(1ml)中の1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン(90mg、1.5当量)で処理した。室温で3日後、反応物をMeOHでクエンチし、飽和重炭酸塩で洗浄し、DCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、120mgの3(0.159mmol、82%)が得られた。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ7.83(dtd、J=8.7、6.2、3.4Hz、4H)、7.73(s,1H)、6.76(s,2H)、5.73(d,J=10.5Hz、3H)、4.52(dd,J=8.6、4.9Hz、1H)、4.18(d,J=4.8Hz、1H)、4.03(dd,J=12.9、2.1Hz、1H)、3.96-3.85(m,2H)、3.78-3.70(m,1H)、3.66-3.58(m,1H)、3.53(t,J=7.0Hz、2H)、1.53(dp、J=20.7、6.8Hz、4H)、1.30(ddt、J=44.2、14.5、7.2Hz、4H)、1.07-0.95(m,28H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.89、160.32、156.12、150.97、134.39、134.33、131.55、122.95、113.27、86.56、80.81、80.63、70.46、69.75、60.23、29.19、27.95、26.09、25.25、17.30、17.18、17.13、17.08、16.96、16.85、16.81、16.74、12.75、12.37、12.23、12.07.C36H55N7O7Si2についてのLRMS計算値754.0356、実測値m/z 754.3(M+1)+、776.3(M+23)Na+、753.3(M-1)-、788.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.31。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ7.83(dtd、J=8.7、6.2、3.4Hz、4H)、7.73(s,1H)、6.76(s,2H)、5.73(d,J=10.5Hz、3H)、4.52(dd,J=8.6、4.9Hz、1H)、4.18(d,J=4.8Hz、1H)、4.03(dd,J=12.9、2.1Hz、1H)、3.96-3.85(m,2H)、3.78-3.70(m,1H)、3.66-3.58(m,1H)、3.53(t,J=7.0Hz、2H)、1.53(dp、J=20.7、6.8Hz、4H)、1.30(ddt、J=44.2、14.5、7.2Hz、4H)、1.07-0.95(m,28H).13C NMR(125MHz、DMSO-d6)δ167.89、160.32、156.12、150.97、134.39、134.33、131.55、122.95、113.27、86.56、80.81、80.63、70.46、69.75、60.23、29.19、27.95、26.09、25.25、17.30、17.18、17.13、17.08、16.96、16.85、16.81、16.74、12.75、12.37、12.23、12.07.C36H55N7O7Si2についてのLRMS計算値754.0356、実測値m/z 754.3(M+1)+、776.3(M+23)Na+、753.3(M-1)-、788.2(M+35)Cl-.Rf=5%のMeOH/DCM v/v中の0.31。
(4)-化合物3(10g、13.26mmol)をピリジン(265ml)に溶解させ、EtOH氷浴中で冷却した。塩化イソブチリル(1.55g、14.59mmol)を滴下して加えた。反応混合物を、-10℃で2時間、次に、室温で1時間撹拌した。反応をMeOHでクエンチし、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を飽和重炭酸塩で洗浄し、DCMで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(EtoAc/ヘキサンで溶離した)によって精製した。いくらかのN2およびN6ビス保護が起こった。7.21gの純粋な4(8.75mmol、66%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ9.73(s,1H)、8.02(s,1H)、7.83(d,J=3.7Hz、4H)、7.19(s,2H)、5.83(s,1H)、4.65(dd,J=8.3、5.2Hz、1H)、4.32(d,J=4.5Hz、1H)、4.15-4.07(m,1H)、3.97-3.85(m,2H)、3.81-3.72(m,1H)、3.68-3.59(m,1H)、3.53(t,J=6.9Hz、2H)、2.91-2.80(m,1H)、1.62-1.45(m,4H)、1.41-1.21(m,4H)、1.20-1.07(m,3H)、1.06-0.83(m,31H).13C NMR(101MHz、DMSO-d6)δ174.75、167.82、156.01、152.89、149.44、137.57、134.27、131.52、122.89、116.27、87.34、81.19、80.98、70.49、70.30、60.83、37.31、34.01、29.19、27.92、26.08、25.16、19.24、19.19、17.28、17.13、16.97、16.91、16.88、16.82、12.53、12.35、12.12、12.04.C40H61N7O8Si2についてのLRMS計算値823.4120、実測値m/z 824.2(M+1)+、846.2(M+23)Na+、822.2(M-1)-、858.2(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.54。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ9.73(s,1H)、8.02(s,1H)、7.83(d,J=3.7Hz、4H)、7.19(s,2H)、5.83(s,1H)、4.65(dd,J=8.3、5.2Hz、1H)、4.32(d,J=4.5Hz、1H)、4.15-4.07(m,1H)、3.97-3.85(m,2H)、3.81-3.72(m,1H)、3.68-3.59(m,1H)、3.53(t,J=6.9Hz、2H)、2.91-2.80(m,1H)、1.62-1.45(m,4H)、1.41-1.21(m,4H)、1.20-1.07(m,3H)、1.06-0.83(m,31H).13C NMR(101MHz、DMSO-d6)δ174.75、167.82、156.01、152.89、149.44、137.57、134.27、131.52、122.89、116.27、87.34、81.19、80.98、70.49、70.30、60.83、37.31、34.01、29.19、27.92、26.08、25.16、19.24、19.19、17.28、17.13、16.97、16.91、16.88、16.82、12.53、12.35、12.12、12.04.C40H61N7O8Si2についてのLRMS計算値823.4120、実測値m/z 824.2(M+1)+、846.2(M+23)Na+、822.2(M-1)-、858.2(M+35)Cl-.Rf=100%のEtOAc中の0.54。
(5)-化合物2(500mg、0.977mmol)を、DMSO(14ml)、PBS(0.1M、0.4ml)、およびトリス(0.1M、12ml)に溶解させた。0.1MのHClを用いてpHを7.33に低下させてから、アデノシンデアミナーゼ(250単位、大腸菌(E.coli)中のサーモフィラス菌(S.thermophilus)組み換え体、CAS:9026-93-1、SKU:52544)を加えた。酵素の添加の直後に白色の沈殿物が形成された。反応は3日間継続し、次に、さらに2日間そのままにしておいたが、さらなる脱アミノ化は起こらなかった。酵素の添加は、反応を促進しなかった。反応物のpHを監視し、6.40~7.80の間に収まるように調整した。白色の沈殿物を遠心分離し、上清をデカントした。沈殿物を、ピリジンを入れたフラスコに移し、減圧下で蒸発させてから、シリカに吸着させ、手動のカラム(φ=4.6×13.5)によって精製した。DMSOを、100%のEtOAc(2CV)、DCM中4%のMeOH(v/v)(1CV)、次に、DCM中6%のMeOH(v/v)(2CV)で溶離した。次に、生成物5を、DCM中8%のMeOH(v/v)(2.8CV)、DCM中9%のMeOH(v/v)(1.2CV)、および最後にDCM中10%のMeOH(v/v)(2.8CV)で溶離したところ、290mgの5(0.566mmol、58%)が得られた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ10.61(s,1H、D2O交換可能)、7.95(s,1H)、7.88-7.78(m,4H)、6.44(s,2H、D2O交換可能)、5.76(d,J=6.1Hz、1H)、5.06(s,2H、D2O交換可能)、4.28-4.17(m,2H)、3.63-3.46(m,5H)、3.38-3.28(m,3H)、1.46(dt,J=37.2、6.7Hz、4H)、1.19(d,J=5.6Hz、4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.88、156.61、153.74、151.18、135.36、134.32、131.55、122.95、116.57、85.85、84.42、81.07、69.56、68.88、61.30、37.26、28.95、27.83、25.99、24.86.C24H28N6O7についてのLRMS計算値512.2019、実測値m/z 513.1(M+1)+、511.0(M-1)-、547.0(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.19。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ10.61(s,1H、D2O交換可能)、7.95(s,1H)、7.88-7.78(m,4H)、6.44(s,2H、D2O交換可能)、5.76(d,J=6.1Hz、1H)、5.06(s,2H、D2O交換可能)、4.28-4.17(m,2H)、3.63-3.46(m,5H)、3.38-3.28(m,3H)、1.46(dt,J=37.2、6.7Hz、4H)、1.19(d,J=5.6Hz、4H).13C NMR(100MHz、DMSO-d6)δ167.88、156.61、153.74、151.18、135.36、134.32、131.55、122.95、116.57、85.85、84.42、81.07、69.56、68.88、61.30、37.26、28.95、27.83、25.99、24.86.C24H28N6O7についてのLRMS計算値512.2019、実測値m/z 513.1(M+1)+、511.0(M-1)-、547.0(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.19。
(6)-化合物4(6.20g、7.52mmol)を、水(45ml)および氷酢酸(105ml)に溶解させた。次に、NaNO2(4.15g、60.19mmol)を、撹拌している混合物に加えた。約40分後、さらなる4.15gのNaNO2を加え、室温で2日間撹拌した。さらなる2.1gのNaNO2を加え、さらに2日間撹拌した。TLCによれば、出発材料は、完全に消費された。しかしながら、疑われるシリル損傷に相当する多数のスポットが観察された。次に、反応物を水で希釈し、DCMで抽出した。有機層を飽和重炭酸塩で洗浄し、次に、Na2SO4で乾燥させた。生成物6を、粗材料のまま次の脱シリル化工程に使用した。
(7)-化合物6(7.52mmol)を、一晩、Et3N・3HF(14.6g、90.28mmol)を用いてTHF(150ml)中で脱シリル化した。THFを減圧下で除去し、粗生成物をシリカに吸着させ、次に、シリカゲルクロマトグラフィー(5%のMeOH/DCM v/vで溶離した)によって精製したところ、定量的収率が得られた。NMRは約95%の純度を示し、約5%はジアミノヌクレオシドに関連していた。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.04(s,1H)、11.64(s,1H)、8.27(s,1H)、7.82(p,J=4.4Hz、4H)、5.88(d,J=6.6Hz、1H)、5.13(d,J=4.7Hz、1H)、5.05(t,J=5.4Hz、1H)、4.28(ddd,J=23.5、6.8、4.7Hz、2H)、3.92(q,J=4.0Hz、1H)、3.63-3.50(m,3H)、3.46(t,J=7.2Hz、2H)、3.35(d,J=6.5Hz、1H)、2.74(p,J=6.9Hz、1H)、1.43(dt,J=27.1、6.5Hz、4H)、1.25-1.13(m,4H)、1.09(dd,J=6.7、4.8Hz、6H).C28H34N6O8についてのLRMS計算値582.2438、実測値m/z 582.2(M+1)+、581.1(M-1)-、616.0(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.04(s,1H)、11.64(s,1H)、8.27(s,1H)、7.82(p,J=4.4Hz、4H)、5.88(d,J=6.6Hz、1H)、5.13(d,J=4.7Hz、1H)、5.05(t,J=5.4Hz、1H)、4.28(ddd,J=23.5、6.8、4.7Hz、2H)、3.92(q,J=4.0Hz、1H)、3.63-3.50(m,3H)、3.46(t,J=7.2Hz、2H)、3.35(d,J=6.5Hz、1H)、2.74(p,J=6.9Hz、1H)、1.43(dt,J=27.1、6.5Hz、4H)、1.25-1.13(m,4H)、1.09(dd,J=6.7、4.8Hz、6H).C28H34N6O8についてのLRMS計算値582.2438、実測値m/z 582.2(M+1)+、581.1(M-1)-、616.0(M+35)Cl-.Rf=7%のMeOH/DCM v/v中の0.41。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
[実施態様1]
式Iを有するコンジュゲート:
式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり;および
前記リガンドが糖に由来し、(i)前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、かつ(ii)前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、
少なくとも1個のリンカーが、表1(ここで、DMTr基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である)または表1Aに記載のものから選択される、および/または
少なくとも1個のリガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサであり、
R3が、表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、かつnが、1~5(好ましくは、1~3)であり、各R3は、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、
kが、1~6である)、
(c)以下の構造の1つを有するリガンド、
(式中、
矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し(すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される);
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
であり;
Q1が、H、C1~C4アルキル、
であり;
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である)
および
(d)表4または4A中のリガンド
から選択される。
[実施態様1]
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり;および
前記リガンドが糖に由来し、(i)前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、かつ(ii)前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、
少なくとも1個のリンカーが、表1(ここで、DMTr基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である)または表1Aに記載のものから選択される、および/または
少なくとも1個のリガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサであり、
R3が、表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、かつnが、1~5(好ましくは、1~3)であり、各R3は、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、
kが、1~6である)、
(c)以下の構造の1つを有するリガンド、
矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し(すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される);
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
Q1が、H、C1~C4アルキル、
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である)
および
(d)表4または4A中のリガンド
から選択される。
[実施態様2]
前記オリゴヌクレオチドが、(i)前記オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの1つ以上の塩基部分、を介して前記リンカーに結合する、実施形態1に記載のコンジュゲート。
前記オリゴヌクレオチドが、(i)前記オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの1つ以上の塩基部分、を介して前記リンカーに結合する、実施形態1に記載のコンジュゲート。
[実施態様3]
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
式中、
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、該核酸塩基に結合した窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子に結合し;および
各R8が、独立して、実施形態1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは実施形態1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、該核酸塩基に結合した窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子に結合し;および
各R8が、独立して、実施形態1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは実施形態1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
[実施態様4]
R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたウラシルであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、実施形態3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたウラシルであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、実施形態3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
[実施態様5]
R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたシトシンであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、実施形態3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたシトシンであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、実施形態3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
[実施態様6]
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
式中、
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、実施形態1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは実施形態1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、実施形態1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは実施形態1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
[実施態様7]
前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合する、実施形態3~6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合する、実施形態3~6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
[実施態様8]
式Iを有するコンジュゲート:
式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、実施形態1の表1または表1Aに記載のものから選択され;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し;および
各リガンドが、1~6個の標的化モノマーを含む。
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、実施形態1の表1または表1Aに記載のものから選択され;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し;および
各リガンドが、1~6個の標的化モノマーを含む。
[実施態様9]
前記リガンドが肝臓を標的にする、実施形態8に記載のコンジュゲート。
前記リガンドが肝臓を標的にする、実施形態8に記載のコンジュゲート。
[実施態様10]
前記リガンドがASGPRを標的にする、実施形態8または9に記載のコンジュゲート。
前記リガンドがASGPRを標的にする、実施形態8または9に記載のコンジュゲート。
[実施態様11]
各リガンドが糖含有基を含む、実施形態8~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
各リガンドが糖含有基を含む、実施形態8~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
[実施態様12]
式Iを有するコンジュゲート:
式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、実施形態1の表2、2A、4、または4Aに記載のものから選択される。
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、実施形態1の表2、2A、4、または4Aに記載のものから選択される。
[実施態様13]
式Iを有するコンジュゲート:
式中、
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、式-R2-(R3)kのものであり、式中、R2がスペーサであり、R3が、実施形態1の表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、およびkが1~6であり、各R3は、R2中の窒素原子に結合し、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、式-R2-(R3)kのものであり、式中、R2がスペーサであり、R3が、実施形態1の表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、およびkが1~6であり、各R3は、R2中の窒素原子に結合し、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
Claims (13)
- 式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり;および
前記リガンドが糖に由来し、ここで、(i)前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、かつ(ii)前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、
少なくとも1個のリンカーが、表1(ここで、DMTr基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である)または表1Aに記載のものから選択される、および/または
少なくとも1個のリガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)-R2-(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサであり、
R3が、表3または表3Aに記載のものから選択される標的化モノマーであり、かつnが、1~5(好ましくは、1~3)であり、各R3は、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく、
kが、1~6である)、
(c)以下の構造の1つを有するリガンド、
矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し(すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される);
R6が、HまたはAcであり;
R7が、-OHまたは-NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、
Q1が、H、C1~C4アルキル、
Q2が、HまたはC1~C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1~8(例えば、1~4)である)
および
(d)表4または4A中のリガンド
から選択される。
- 前記オリゴヌクレオチドが、(i)前記オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの1つ以上の塩基部分、を介して前記リンカーに結合する、請求項1に記載のコンジュゲート。
- オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、該核酸塩基に結合した窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子に結合し;および
各R8が、独立して、請求項1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは請求項1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。 - R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたウラシルであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、請求項3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
- R6が、5位においてアミド基-C(O)NH-で置換されたシトシンであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合する、請求項3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
- オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが次式を有する、オリゴヌクレオチドコンジュゲート:
5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合し;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、請求項1に記載の-R2-R3から選択されるリガンドまたは請求項1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、各R8は、前記リンカーR7中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。 - 前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合する、請求項3~6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
- 前記リガンドが肝臓を標的にする、請求項8に記載のコンジュゲート。
- 前記リガンドがASGPRを標的にする、請求項8または9に記載のコンジュゲート。
- 各リガンドが糖含有基を含む、請求項8~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 式Iを有するコンジュゲート:
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;
前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
前記リンカーが、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質と結合する化学基であり;
前記コンジュゲートが、1~12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドは、前記リンカー中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよく;および
各リガンドが、式-R2-(R3)kのものであり、式中、R2がスペーサであり、R3が、請求項1の表3に記載のものから選択される標的化モノマーであり、およびkが1~6であり、各R3は、R2中の窒素原子に結合し、R2中の同じ原子に結合してもまたは異なる原子に結合してもよい。
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