CN116669746A - 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种抑制血浆前激肽释放酶(PKK)基因表达的siRNA，含有该siRNA的药物组合物和siRNA缀合物。所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，所述正义链含有核苷酸序列I，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，所述反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异。本公开提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物，可以有效治疗和/或预防血浆前激肽释放酶基因表达引起的病理状况或疾病。

Description

一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 技术领域
本公开涉及一种能够抑制血浆前激肽释放酶(PKK)基因表达的核酸和含核酸的药物组合物与siRNA缀合物。本公开还涉及这些核酸、药物组合物与siRNA缀合物的制备方法和用途。
背景技术
缓激肽(bradykinin，BK)是增强血管通透性的主要调节剂。过多的BK会增强血管的渗漏，从而加重炎症。研究表明，BK的主要天然抑制剂--C1-酯酶抑制剂(C1-INH)的遗传缺陷会导致遗传性血管性水肿(HAE)。患有HAE罕见病的患者经常遭受由未知诱因引起的疼痛性水肿的急性发作，而位于咽喉部的发作可能会危及生命。
前激肽释放酶(PKK)是血浆激肽释放酶(PK)的前体，PKK在因子XIIa(FXIIa)的活化下转化成PK，PK切割高分子激肽原(high molecular weight kininogen)向脉管中释放缓激肽。因此，通过抑制PKK基因的表达，能够在细胞水平上抑制BK过多，进而对BK过多导致的炎症等疾病或症状、特别是遗传性血管水肿进行预防和治疗。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断任何感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
开发抑制PKK基因表达和治疗遗传性血管水肿的siRNA药物的关键之一在于寻找合适的siRNA及其修饰，以及有效的递送***。
发明内容
本公开的发明人意外发现，具有本公开提供的如下siRNA及其修饰序列能够特异性地抑制PKK基因的表达，含有该siRNA的药物组合物或siRNA缀合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制肝脏中PKK基因的表达，实现炎性疾病、特别是遗传性血管性水肿的治疗或预防，从而完成了本公开。
在一些实施方式中，本公开提供了一种能够抑制PKK基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下所示序列：
所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Z 2UUGGUUUUUGGAAUUCAG-3'(SEQ ID NO:2)，
其中，Z 1为U，Z 2为A，
并且，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z 1的核苷酸Z 3，所述核苷酸 序列II中包含位置对应于Z 2的核苷酸Z 4，所述Z 4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的siRNA和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防炎性疾病、特别是遗传性血管水肿疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿疾病的方法，所述方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制细胞中PKK基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞接触。
在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利以及专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
本公开提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物具有良好的稳定性，较高的PKK mRNA抑制活性，低的脱靶效应，和/或能治疗、预防或缓解血浆前激肽释放酶基因表达引起的病理状况或疾病症状。
例如，在50nM的siRNA浓度下，本公开的siRNA在C57BL/6J小鼠肝原代细胞中对PKK mRNA抑制率可达72.3％。又例如，本公开提供的siRNA缀合物在小鼠体内对PKK mRNA显示出较高的抑制活性，在不同的给药剂量下，对PKK目标序列均显示出一定的抑制效果，对PKK mRNA的抑制率可达81.31％。再例如，本公开提供的siRNA缀合物在足肿胀模型鼠体内对PKK mRNA的抑制率可达81.43％。
又例如，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。一般认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。
又例如，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物显示出明显抑制肿胀的药效效果。本公开提供的siRNA缀合物通过抑制PKK mRNA的表达，对角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀呈现剂量依赖性地抑制作用，并且这种抑制足肿 胀的效果与阳性对照药物的抑制效果相当，甚至更优。本公开提供的siRNA缀合物在角叉菜胶诱导的足肿胀模型鼠体内对PKK mRNA显示出较高的抑制活性，在不同的给药剂量下，对PKK mRNA的抑制率可达60％以上，其中在3mg/kg剂量下，对PKK mRNA的抑制率达77.47％；给药剂量为9mg/kg时，对PKK mRNA的抑制率可达82.43％，呈现出明显的剂量依赖性抑制，然而阳性药物吲哚美辛或艾替班特对PKK mRNA的表达并无显著抑制。药效方面，注射生理盐水的足肿胀模型鼠，最大肿胀增加度达到70.6％，而注射本公开的siRNA缀合物，小鼠最大肿胀增加度大幅下降至39％以下，且到达最大肿胀程度的时间较短，仅2小时，随后肿胀程度减弱，预示着动物承受的痛苦降低。
上述结果表明，本公开提供的siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物能够抑制PKK基因的表达，有效治疗和/或预防炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状，具有良好的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1是给予不同剂量的siRNA缀合物后，在小鼠体内(in vivo)的PKK mRNA相对表达水平的散点图。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，PKK mRNA是指具有Genbank注册号为NM_008455.4、NM_001318394.1或NM_001318396.1所示序列的mRNA。进一步地，若无其它说明，本公开中所使用的术语“靶基因”是指转录上述PKK mRNA的基因，术语“靶mRNA”是指上述PKK mRNA。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如 异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基各自以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、含siRNA的组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为siRNA缀合物的总称、式(305)和式(307)所示的siRNA缀合物总称，或式(305)、式(307)、式(308)所示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)用于 指示取代基的连接点。例如：-C 1-C 10烷基-NH 2通过C 1-C 10烷基而连接。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代”的“烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。在上文或下文中，取代的基团，如取代的烷基、取代的烷氧基、取代的氨基、取代的脂族基团、取代的杂脂族基团、取代的酰基、取代的芳基或取代的杂芳基。其中，如无其他说明，“取代的”基团是指该基团中的氢原子被一个或多个取代基所替代而形成的基团。例如，“取代的烷氧基”是指烷氧基中的一个或多个氢原子被取代基所替代而形成的基团。本领域技术人员能够理解，可用于本公开应用的化合物中可以包含各种取代基，只要是该取代基的引入不会影响本公开的功能，能够实现本公开的目的，就可用于本公开。在一些实施方式中，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10杂芳基、C 1-C 10卤代烷基、-OC 1-C 10烷基、-OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10卤代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-CONH 2，-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C 1-C 10烷基、-C(O)C 1-C 10烷基苯基、-C(O)C 1-C 10卤代烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10卤代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10卤代烷基)。在一些实施方式中，所述取代基是C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、-OC 1-C 3烷基、-OC 1-C 3烷基苯基、卤素、-OH、-NH 2、氰基或硝基中的一种。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C 1-C 6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实 施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环***形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环***仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香碳环，通常具有3至7个环碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤代”指氟代、氯代、溴代或碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3-至18-元非芳香族环基，包含2-12个碳原子和1-6个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫。除非说明书中另有说明，杂环基是单环、双环、三环或四环***，可包括稠环或桥环***。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶 基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2d ed，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠、兔和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、siRNA缀合物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
siRNA
在一方面，本公开提供了一种能够抑制PKK基因表达的siRNA。
本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
本公开的siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与 SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Z 2UUGGUUUUUGGAAUUCAG-3'(SEQ ID NO:2)，
其中，Z 1为U，Z 2为A，
并且，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z 1的核苷酸Z 3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z 2的核苷酸Z 4，所述Z 4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在上文与下文中，“位置对应”是指从核苷酸序列相同端起算，处于核苷酸序列中相同的位置。例如，核苷酸序列I的3'端第1个核苷酸是位置对应于SEQ ID NO:1的3'端第1个核苷酸的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z 4位置处的差异，且Z 4选自U、C或G。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为Z 4位置处的差异，Z 4选自U、C或G。在一些实施方式中，Z 3是与Z 4互补的核苷酸。具有上述核苷酸差异的siRNA具有较高的靶mRNA抑制能力，而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 3-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Z 4UUGGUUUUUGGAAUUCAG-3'(SEQ ID NO:4)，
其中，所述Z 4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z 3选自A、U、G或C，并且Z 4是与Z 3互补的核苷酸；在一些实施方式中，Z 3为U，Z 4为A；
并且，所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸。这样，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、 23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV长度各自为1-4个核苷酸；所述核苷酸序列Ⅲ和所述核苷酸序列Ⅳ长度相等并且实质上反向互补或者完全反向互补；所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端。在一些实施方式中，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或者完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与由SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，按照5'-3'的方向，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为1个核苷酸，核苷酸序列III的碱基为A，核苷酸序列IV的碱基为U；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UA，核苷酸序列IV的碱基组成为UA；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AUA，核苷酸序列IV的碱基组成为UAU；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UAUA，核苷酸序列IV的碱基组成为UAUA；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UA，核苷酸序列IV的碱基组成为UA；此时，正义链和反义链的长度比为21/21。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基，核苷酸序列IV的碱基也就确定了。
在一些实施方式中，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端。由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸，由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/21、21/23或23/25。
所述核苷酸序列V中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸，为了便于合成并节约合成成本，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)或连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，为了提高siRNA反义链与靶mRNA的亲和力，核苷酸序列V与靶mRNA的相应位置的核苷酸互补。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比 为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的靶mRNA沉默活性。
靶mRNA的相应位置的核苷酸是指与靶mRNA的一段核苷酸序列在5'末端相邻的核苷酸或核苷酸序列。该段靶mRNA的核苷酸序列是与核苷酸序列II实质上反向互补或完全反向互补，或者与核苷酸序列II和核苷酸序列IV构成的核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补的那段核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 3-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Z 4UUGGUUUUUGGAAUUCAGUA-3'(SEQ ID NO:6)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
5'-UACUGAAUUCCAAAAACCAAZ 3-3'(SEQ ID NO:7)；
5'-Z 4UUGGUUUUUGGAAUUCAGUAUA-3'(SEQ ID NO:8)；
其中，所述Z 4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z 3选自A、U、G或C，并且Z 4是与Z 3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开所述siRNA为表1中列出的siPKKa1和siPKKa2。
如前所述，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA中的每个核苷酸均为未经修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制PKK基因表达的功能明显削弱或丧失。
在一些实施方式中，本公开的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov.Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。
在一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
本公开的发明人惊奇地发现，本公开所述的siRNA在动物实验中获得了血浆中稳定性和基因沉默效率的高度平衡。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，所述核苷酸序列I中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH 2)如式(10)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(11)所示：
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷 酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：
上述式(15)和式(16)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示：
上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧 基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1中列出的siPKKa1-M1、siPKKa1-M2、siPKKa1-M3、siPKKa2-M1、siPKKa2-M2、siPKKa2-M3中的任意一种。
具有上述修饰的siRNA不仅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，上述修饰的siRNA具有较高的抑制靶mRNA的活性。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。 在一些实施方式中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(1)所示结构的硫代磷酸酯基：
这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1中列出的siPKKa1-M1S、siPKKa1-M2S、siPKKa1-M3S、siPKKa2-M1S、siPKKa2-M2S、siPKKa2-M3S中的任意一种。
在一些实施方式中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构：
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238- 48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(2)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(3)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(5)所示。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1中列出的siPKKa1-M1P1、siPKKa1-M2P1、siPKKa1-M3P1、siPKKa2-M1P1、siPKKa2-M2P1、siPKKa2-M3P1、siPKKa1-M1SP1、siPKKa1-M2SP1、siPKKa1-M3SP1、siPKKa2-M1SP1、siPKKa2-M2SP1、siPKKa2-M3SP1中的任意一种。
本公开的发明人意外发现，本公开提供的siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还具有较高的靶mRNA抑制活性。
本公开提供的siRNA可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe 3O 4或Fe 2O 3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，在一些实施方式中，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方式中，所述药物组合物用于静脉注射给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于中国专利申请CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机胺可为CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
每个X 101或X 102各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C 1-C 20烃链；
每个Y 101或Z 101各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO 2；
每个R 101、R 102、R 103、R 104、R 105、R 106或R 107各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R 102是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R 103和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。
在一些实施方式中，R 103是多胺。在其它实施方式中，R 103是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R 101和R 102中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R 103可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：
其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R 103与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。
其中，式(201)所示化合物可以根据CN103380113A中的描述制备。
在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)，例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的siRNA替代现有siRNA即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1:(2-5)，例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流***、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
siRNA缀合物
在又一方面，本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团和任选的接头(linker)，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使 siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
在一些实施方式中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用一般是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的siRNA递送至靶细胞。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的任意一种配体。在一些实施方式中，每个配体独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)或去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些实施方式中，所述配体为糖或糖的衍生物。
在一些实施方式中，至少一个配体是糖。在一些实施方式中，每个配体均是糖。在一些实施方式中，至少一个配体是单糖、多糖、修饰的单糖、修饰的多糖或糖衍生物。在一些实施方式中，至少一个所述配体可以是单糖，双糖或三糖。在一些实施方式中，至少有一个配体是修饰的糖。在一些实施方式中，每一个配体均为修饰的糖。在一些实施方式中，每个配体均独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖、修饰的单糖、多糖衍生物或单糖衍生物。在一些实施方式中，每一个或至少一个配体选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物，***糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸。
在一些实施方式中，每个所述配体可独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃 甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。所述配体的其它选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中，所述siRNA缀合物中药学上可接受的靶向基团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价。应当理解的是，这里所述的一价、二价、三价、四价分别指siRNA分子与含有作为靶向基团的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的缀合基团形成siRNA缀合物后，该siRNA缀合物中siRNA分子与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的摩尔比为1:1、1:2、1:3或1:4。在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团是N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方式中，当本公开所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价或四价。在一些实施方式中，当本公开所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价。
靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式，可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本文。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的接头具有如式(301)所示的结构：
其中，k为1-3的整数；
L A具有如式(302)所示的包含酰胺键的结构，L B具有如式(303)所示的包含N-酰基吡咯烷的结构，含有羰基和氧原子，L C为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团；
其中，n 302、q 302和p 302各自独立地为2-6的整数，可选地，n 302、q 302和p 302各自独立地为2或3；n 303为4-16的整数，可选地，n 303为8-12的整数， 表示基团共价连接的位点。
所述接头中，每个L A分别与一个所述靶向基团通过醚键连接，并通过L C部分中羟基的氧原子与L C部分形成醚键而连接；L B通过式(303)中的羰基与L C部分中氨基的氮原子形成酰胺键而连接，并通过式(303)中的氧原子与所述siRNA通过氧原子形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键相连接。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA缀合物具有如式(305)所示的结构：
其中，Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的接头具有式(306)所示的结构：
其中，n 306为0-3的整数，每个p 306独立地为1-6的整数， 表示基团共价连接的位点；所述连接基团通过由*标出的氧原子与所述靶向基团形成醚键连接；所述连接基团由#标出的氧原子中的至少一个与所述siRNA形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键而连接，其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基，或者与C 1-C 3烷基连接形成C 1-C 3烷氧基；
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物具有如式(307)所示的结构：
其中，Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中，所述siRNA缀合物具有如式(308)所示的结构：
其中：
n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
m1、m2或m3独立地为选自2-10的整数；
R 10、R 11、R 12、R 13、R 14或R 15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C 1-C 10烷基、C 1-C 10卤代烷基以及C 1-C 10烷氧基；
R 3为式A59所示结构的基团：
其中，E 1为OH、SH或BH 2，Nu为本公开的siRNA；
R 2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O) 2、C 2-C 10亚烯基、C 2-C 10亚炔基、C 6-C 10亚芳基、C 3-C 18亚杂环基和C 5-C 10亚杂芳基；并且其中，R 2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10杂芳基、C 1-C 10卤代烷基、-OC 1-C 10烷基、-OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10卤代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、-CONH 2，-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C 1-C 10烷基、-C(O)C 1-C 10烷基苯基、-C(O)C 1-C 10卤烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10卤代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10卤代烷基)；
每个L 1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O) 2、C 2-C 10亚烯基、C 2-C 10亚炔基、C 6-C 10亚芳基、C 3-C 18亚杂环基和C 5-C 10亚杂芳基；并且其中，L 1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10杂芳基、C 1-C 10卤代烷基、-OC 1-C 10烷基、-OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10卤代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、-CONH 2，-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C 1-C 10烷基、-C(O)C 1-C 10烷基苯基、-C(O)C 1-C 10卤烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、- SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10卤代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10卤代烷基)。
在一些实施方式中，L 1可选自于由A1-A26基团或其任意组合所组成的组，其中A1-A26的结构和定义如下所示：
其中，每个j1独立地为1-20的整数；每个j2独立地为1-20的整数；R'为C 1-C 10烷基；
Ra选自式A27-A45基团或其任意组合所组成的组：
Rb为C 1-C 10烷基；
表示基团共价连接的位点。
技术人员会理解的是，尽管为了方便起见，L 1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或取代而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L 1的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
M 1表示靶向基团，其定义和可选择的范围与上述靶向基团相同。在一些实施方式中，每个M 1独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。
当M 1为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时，在一些实施方式中，n1可以是1-3的整数，n3可以是0-4的整数，保证所述siRNA缀合物中M 1靶向基团的个数至少为2；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得M 1靶向基团的个数至少为3，从而使得M 1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述siRNA缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M 1靶向基团的个数大于3个时，M 1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
在一些实施方式中，m1、m2或m3独立地选自2-10的整数时，可以使多个M 1靶向基团之间的空间位置适合M 1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的siRNA缀合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，在一些实施方式中，m1、m2或m3各自独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，m1＝m2＝m3。
本领域技术人员可以理解，当R 10、R 11、R 12、R 13、R 14或R 15各自独立地选自H、C 1-C 10烷基、C 1-C 10卤代烷基、以及C 1-C 10烷氧基中的一种时，不会改变本公开的siRNA缀合物的性质，均可以实现本公开的目的。在一些实施方 式中，R 10、R 11、R 12、R 13、R 14或R 15各自独立地选自H、甲基和乙基。在一些实施方式中，R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15均为H。
R 3为式A59所示结构的基团，其中，E 1为OH、SH或BH 2，基于制备原料易获取性的考虑，在一些实施方式中，E 1为OH或SH。
R 2的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子与A59的连接。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15的碳原子与N原子互相连接的链状结构。因此，R 2可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N原子的连接基团。在一些实施方式中，在通过固相合成的工艺制备式(308)所示的siRNA缀合物的情况下，R 2基团中需要同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R 3中的P相连接的连接位点。在一些实施方式中，R 2中所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与N形成酰胺键，所述与R 3上的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键；在一些实施方式中，R 2可以是B5、B6、B5'或B6'：
其中， 表示基团共价连接的位点。
q 2的取值范围可以是1-10的整数，在一些实施方式中，q 2为1-5的整数。
L 1的作用是将M 1靶向基团与含氮骨架上的N连接，为式(308)所示的siRNA缀合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L 1选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L 1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L 1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，L 1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中，L 1的长度可以为3-25个原子，3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中，L 1的长度为3个、4个、5个、6个、 7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。
在一些实施方式中，每个j1独立地为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，每个j2独立地为2-10的整数，在一些实施方式中，每个j2独立地为3-5的整数。R'为C 1-C 4烷基，在一些实施方式中，R'为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C 1-C 5烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R'、Ra、Rb进行选择，以实现M 1靶向基团与含氮骨架上的N原子连接，并使M 1靶向基团之间的空间位置更适合M 1靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
在一些实施方式中，该siRNA缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P原子可以连接到siRNA正义链或反义链的任何一个核苷酸上；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的端部；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的端部。所述端部指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的3'末端。在连接至siRNA的正义链的上述位置的情况下，式(308)所示的siRNA缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的siRNA反义链，以阻断PKK mRNA翻译蛋白质的过程，抑制PKK基因表达。
在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷 酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P原子可通过形成磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接在siRNA正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，式A59中的P原子也可以看作是siRNA中含有的磷酸基团中的P原子)，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
本公开的发明人意外发现，本公开的siRNA在具有显著提高的血浆中稳定性、低脱靶效应的同时，还表现出较高的PKK mRNA沉默活性，含有这些siRNA的siRNA缀合物表现出更高的PKK mRNA沉默活性。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA可以为表1中示出的siRNA中的一种。
表1本公开的siRNA序列
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
本公开所述siRNA或siRNA缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH 4 +，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一些实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K +和/或Na +，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述siRNA或siRNA缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一些实施方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述siRNA或siRNA缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
本公开siRNA缀合物的制备
上述siRNA缀合物可以通过现有技术中已经详细描述的方法进行合成。例如，WO2015006740A2中详细描述了多种siRNA缀合物的制备方法。通过本领域技术人员熟知的方式，获得本公开的siRNA缀合物。如WO2014025805A1中记载了式(305)所示结构的制备方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015,16,903-908中描述了式(307)所示结构的制备方法。中国专利申请CN110959011A也详细公开了制备式(308)所示的siRNA缀合物的方法。以引用的方式将上述文献内容整体并入本文。
本公开的siRNA缀合物也可以与药学上可接受的其它辅料联用，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种，详情可参见上文关于本公开的药物组合物的描述。
本公开的siRNA、药物组合物及siRNA缀合物的应用
在又一方面，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状的药物中的用途。
在又一方面，本公开提供了一种预防和/或治疗炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者。
通过将本公开的siRNA活性成分给予有需要的受试者，可以通过RNA干扰的机制达到预防和/或治疗炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状的目的。因此，本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物可用于预防和/或治疗炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状，或用于制备用于预防和/或治疗炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状的药物。
在一些实施方式中，所述炎性疾病可以为慢性炎性疾病或急性炎性疾病。在一些实施方式中，所述炎性疾病包括但不限于遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑的血管性水肿、眼水肿、黄斑水肿或脑水肿。在一些实施方式中，所述血栓栓塞疾病包括但不限于血栓、血栓栓塞、深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞、中风或梗塞。
所述疾病可共同具有一个或多个风险因素、成因或结果。
发展炎性疾病的某些风险因素和成因包括对炎性疾病的遗传素质和环境因素。在一些实施方式中，受试者具有突变的补体1酯酶抑制剂(C1-INH)基因或突变的因子12(FXII)基因。在一些实施方式中，受试者携带或具有紧张素-转换酶抑制剂(ACE抑制剂)或紧张素II受体阻滞剂(ARB)。在一些实施方式中，受试者已具有过敏反应，导致血管性水肿。在一些实施方式中，受试者具有I型HAE。在一些实施方式中，受试者具有II型HAE。在一些实施方式中，受试者具有III型HAE。某些与炎性疾病的发展相关的结果包括各种身体部分的水肿/肿胀，所述各种身体部分包括肢端(即手、脚、手臂、腿)、肠(腹腔)、面、生殖器、喉(即喉头)；血管渗透性；血管泄漏；全身炎症；腹痛；气胀；呕吐；腹泻；瘙痒的皮肤；呼吸(哮喘性)反应；鼻炎；过敏反应；支气管收缩；低血压；昏迷以及死亡。
发展血栓栓塞疾病的某些风险因素和成因包括对血栓栓塞的遗传素质、外科手术(具体地讲矫形手术)、恶性肿瘤、妊娠、年纪大、口服避孕药的使用、心房颤动、先前的血栓栓塞病状、慢性炎性疾病以及遗传性或获得性预防血栓剂凝血病症。某些与血栓栓塞病状的发展相关的结果包括通过受影响的血管的血液流降低、组织死亡和死亡。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的 方法或途径，将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多siRNA缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至受试者的基本体循环。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿及其相关症状的手段，在一些实施方式中采用能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月、每两个月、每季度、每半年或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD 50(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED 50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的siRNA、药物组合物、和/或siRNA缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以siRNA的量计：(i)对于siRNA缀合物，其siRNA用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-15mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-10mg/kg体重；(ii)对于siRNA与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-10mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-5mg/kg体重，在一些实施方式中为0.1-3mg/kg体重。
另外，通过将本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物导入细胞，还可以通过RNA干扰的机制达到抑制细胞中PKK基因表达这一目的。
采用本公开提供的方法抑制PKK基因在细胞中表达，所提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA用量一般是这样的量：其足以减少靶mRNA的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送途径(局部还是全身)等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
在又一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本公开 的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物的至少一种。
在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供siRNA。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述siRNA的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物，和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或siRNA缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))所记载的方法进行。
C57BL/6J小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，以下简称为C57小鼠；
本公开合成的针对PKK基因的siRNA、siRNA缀合物或作为阴性对照的siRNA、siRNA缀合物转染细胞时，使用Lipofectamine TM2000(Invitrogen)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
制备例1
siRNA缀合物1的制备
本制备例合成了siRNA缀合物1。该siRNA缀合物为L-9缀合分子与编号为siPKKa1M1S的siRNA缀合后形成的siRNA缀合物。该siRNA缀合物中所缀合的siRNA的序列参见表2。
按照CN110959011A制备例14所述的制备缀合物16的方法，制备获得了以下表2中的siRNA缀合物1，区别仅在于，siRNA缀合物1中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表2中所示；按照以下表2中编号为L10-siPKKa1M1S 的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将siRNA缀合物1稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。具体地，
siRNA缀合物1的分子量，正义链理论值为7507.51，实测值为7506.73，反义链理论值为6987.64，实测值为6987.56。
实测值与理论值一致，说明所合成的siRNA缀合物1是目标设计的双链核酸序列。siRNA缀合物1具有式(403)所示的结构，并且该siRNA缀合物包含的siRNA具有表2中siRNA缀合物1所对应的siRNA序列。
表2siRNA缀合物
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
制备例2-5
本公开提供的siRNA的合成
通过常规固相合成方法分别得到表3中所列的本公开提供的siRNA序列的正义链或反义链，使用DEPC水，分别溶解等摩尔表3中相互互补的正义链和反义链，随后分别退火，得到本公开提供的siRNA，分别记为siPKKa1M1S，siPKKa2M4、siPKKa和siPKKa3，序列如表3所示。
对比制备例1
参比siRNA的合成
通过固相合成方法分别合成了表3中siRNA编号为NC的siRNA对应的正义链和反义链。使用DEPC水，分别溶解得到的等摩尔的正义链和反义链，随后退火得到参比siRNA，编号为NC。NC siRNA为不靶向任何已知的人、小鼠、大鼠基因的双链寡核苷酸链。
表3siRNA序列
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
按照制备例1的方法分别对上述siRNA的分子量进行检测，
制备例2的分子量，正义链理论值为6259.23，实测值为6259.01，反义链理论值为6987.64，实测值为6987.56；
制备例3的分子量，正义链理论值为6764.30，实测值为6764.12，反义链理论值为7418.50，实测值为7418.96；
制备例4的分子量，正义链理论值为5996.70，实测值为5996.33，反义链理论值为6041.59，实测值为6041.22；
制备例5的分子量，正义链理论值为6655.12，实测值为6655.02，反义链理论值为7289.30，实测值为7289.11。
实测值与理论值一致，确认所获得的siRNA分别具有对应于表3中所示的各个siRNA的序列。
在上述本公开的siRNA或缀合物制备完成后，冻干为固体粉末保存备用。
实验例1
本公开提供的siRNA在小鼠肝原代细胞中PKK mRNA的抑制率测定
从C57BL/6J小鼠新鲜肝组织提取获得小鼠肝原代细胞，在I型胶原蛋白包被的组织培养皿中接种小鼠肝原代细胞，在含有1×双抗和10％FBS的RPMI1640培养基中，于37℃在含5％CO 2/95％空气的培养箱中培养30min。
弃去培养基，以opti-MEM调整小鼠肝原代细胞密度至2×10 5细胞/mL，得 到小鼠肝原代细胞悬液。随后在12孔板的不同培养孔中分别加入得到的小鼠肝原代细胞悬液，将小鼠肝原代细胞接种到培养孔中。加入小鼠肝原代细胞悬液的体积为1mL/孔，小鼠肝原代细胞数量为2×10 5细胞/孔。
用DEPC化水将制备例2-5和对比制备例1得到的siRNA分别配制成50μM的siRNA工作液。
配制1A溶液，对于每一个siRNA，分别配制1A1-1A3溶液，每份1A1-1A3溶液依次含有上述siRNA工作液1.1μl和Opti-MEM培养基50μl。
配制1B溶液，每份1B溶液含有1μl Lipofectamine TM 2000和50μl Opti-MEM培养基。
分别将一份1B溶液与得到的每个siRNA的1A溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA的转染复合物1X。
将一份1B溶液与Opti-MEM培养基50μl混合，室温下孵育20min，得到转染复合物1X’。
在培养孔中，分别加入每一个siRNA的转染复合物1X，均匀混合，加入量为100μl/孔，得到每个siRNA终浓度分别约为50nM的转染复合物，每个siRNA的转染复合物1X分别转染3个培养孔，得到含siRNA的转染混合物，记为测试组。
在另外3个培养孔中，分别加入转染复合物1X’，加入量为100μl/孔，得到不含siRNA的转染混合物，记为空白对照组。
将含siRNA的转染混合物和不含siRNA的转染混合物在培养孔中转染4h后，每孔补加1ml含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将12孔板置于CO 2培养箱在37℃下继续培养24h。
随后，使用RNAVzol(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号N002)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。
对于每孔细胞，分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒Goldenstar TM RT6cDNA Synthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取Goldenstar TM Oligo(dT) 17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μl，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后在85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μl做模板，使用 SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因PKK和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表4所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪上， 使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共35次后，得到含有扩增了目标基因PKK和内参基因GAPDH的产物W1。产物W1随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W1中目标基因PKK和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因PKK和内参基因GAPDH的Ct值。
表4引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因PKK进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组三个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组PKK mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组PKK mRNA表达水平为100％，
测试组PKK mRNA相对表达水平＝2 -ΔΔCt(测试组)×100％
测试组PKK mRNA抑制率＝(1-测试组PKK mRNA相对表达水平)×100％
各siRNA对PKK mRNA的抑制率总结于表5中。对于同一测试组siRNA，PKK mRNA抑制率是三个培养孔测定的测试组PKK mRNA抑制率的算术平均值。
表5小鼠肝原代细胞中PKK mRNA的抑制
由表5的结果可见，本公开提供的siRNA在不同长度、反义链与mRNA存在错配或siRNA含有不同修饰的情况下，在小鼠肝原代细胞中均显示出较高的PKK mRNA抑制活性，在50nM的siRNA浓度下，制备例2-5对PKK mRNA抑制率均高于60.0％，其中，制备例2对PKK mRNA抑制率达到72.3％。
实验例2
本公开提供的siRNA缀合物在C57BL/6J小鼠体内(in vivo)活性的测定
将C57BL/6J小鼠随机分组，每组5只(均为雄性)，分别向每组小鼠给予不同剂量的siRNA缀合物1。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药；将siRNA缀合物1以0.1mg/ml和0.3mg/ml的0.9wt％氯化钠水溶液形式给予，给药体积为10ml/kg小鼠体重，即，siRNA缀合物1的给药剂量分别为1mg/kg和3mg/kg。另外将10只雄性C57BL/6J小鼠作为对照组，给予saline，所述saline为0.9wt％氯化钠水溶液，给药体积为10ml/kg小鼠体重。给药后第8天，处死小鼠，收集血浆，以抗凝剂与血浆的体积比1:9(v/v)的比例加入3.2wt％(0.109mol/L)二水合柠檬酸钠水溶液防止凝血，离心分离血浆。
取肝脏左大叶约100mg/鼠，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；随后对于每只小鼠的肝脏组织，分别用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据说明书描述的操作步骤提取得到每只小鼠的肝组织总RNA。使用ImProm-II TM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA进行反转录。反转录的条件为：将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测肝组织中PKK mRNA的表达量。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μl做模板，使用 SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因PKK和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表6所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后在95℃变性30s，在60℃退火30s，在72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因PKK和内参基因GAPDH的产物W2。产物W2随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，通过实时荧光定量PCR仪分别测定获得产物W2中目标基因PKK和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因PKK和内参基因GAPDH的Ct值。
表6检测引物的序列
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组和对照组中目标基因PKK的表达量进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组10只小鼠各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一测试小鼠均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组PKK mRNA的表达水平进行归一化，定义saline对照组PKK mRNA表达水平为100％，
测试组PKK mRNA相对表达水平＝2- ΔΔCt(测试组)×100％。
对于同一测试组siRNA，每一浓度下的测试组PKK mRNA相对表达水平平均值为该浓度5只小鼠的相对表达水平的算术平均值。数据分析采用Graphpad prism 6.0统计分析软件。对照组的PKK mRNA表达量记为100％，相应地，PKK mRNA表达量抑制率记为0％，测试结果以对照组的PKK mRNA表达量进行标准化，结果示于表7中。表7中，给药剂量以siRNA计算，对照组未给予siRNA，对应的给药剂量一栏标记为“-”，PKK mRNA抑制率为给与相对应的siRNA缀合物的一组小鼠PKK mRNA抑制率的平均值：
PKK mRNA抑制率＝(1-PKK mRNA相对表达水平)×100％。
表7本公开的siRNA缀合物在小鼠体内对PKK mRNA的抑制率
给予不同剂量的siRNA缀合物后，在小鼠体内(in vivo)的PKK mRNA相对表达水平的结果示于图1中。
由表7和图1结果可见，在C57BL/6J小鼠中，上述本公开的siRNA缀合物1显示出了较好的小鼠体内PKK mRNA抑制效果，相对于对照组saline而言，在siRNA缀合物1给药剂量为3mg/kg时，对PKK mRNA的抑制率可达81.31％。
实验例3
本公开提供的siRNA缀合物对角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀模型的药效研究
角叉菜胶是来自红藻细胞壁的粘多糖，有多种类型，其中，λ-角叉菜胶在室温下可以是非凝胶状态，皮下注射后可引起炎症反应，如水肿、毛细血管通透性增加、痛觉过敏和红斑等，被用于诱导啮齿动物足肿胀模型。本实验例，给予小鼠不同剂量的siRNA缀合物1及阳性对照品吲哚美辛、艾替班特，随 后使用λ-角叉菜胶诱导小鼠足肿胀，通过排水法测定本公开提供的siRNA缀合物抑制足肿胀增加的程度，通过荧光定量PCR检测小鼠体内PKK mRNA的表达水平。
本实验例中，生理盐水saline为0.9wt％氯化钠水溶液，购自江西科伦药业有限公司(批号C19070906)。给药前，用生理盐水将制备例1中siRNA缀合物1分别配制成0.2mg/ml、0.6mg/ml、1.8mg/ml的水溶液。阳性对照品吲哚美辛购自Sigma-Aldrich公司(货号I7378，批号WXBC4210V)，使用0.5wt％CMC-Na(羧甲基纤维素钠，购自国药集团化学试剂有效公司，货号30036358，批号20180412)配制成2mg/ml的溶液。阳性对照品醋酸艾替班特购自MedChemExpress公司(货号HY-108896，批号81711)，使用生理盐水配制成1.2mg/ml的溶液。吲哚美辛属于非甾体抗炎药，可缓解关节、软组织的肿胀疼痛；醋酸艾替班特是一种强效选择性的缓激肽2型(B2)受体的竞争性拮抗剂，用于治疗成人、青少年和≥2岁儿童的遗传性血管水肿(HAE)急性发作。
将30只雄性ICR小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司)根据体重随机分为6组，每组5只，分别标记为G1-G6组。所有动物根据体重计算药量，皮下注射或灌胃施药的小鼠给药体积均为5ml/kg小鼠体重。各组小鼠给药方案如下：
G1组小鼠，在注射λ-角叉菜胶溶液前7天(记为D-7)，皮下注射saline，给药体积为5ml/kg小鼠体重。
G2组小鼠，在注射λ-角叉菜胶溶液前1小时，灌胃吲哚美辛，给药剂量为10mg/kg小鼠体重。
G3组小鼠，在注射λ-角叉菜胶溶液前1小时，皮下注射艾替班特，给药剂量为6mg/kg小鼠体重。
G4-G6组小鼠，在注射λ-角叉菜胶溶液前7天，分别皮下注射不同剂量的siRNA缀合物1，给药剂量分别为1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg小鼠体重。
对上述各组注射了不同药物的小鼠右后肢脚垫皮下注射λ-角叉菜胶溶液，诱导小鼠足肿胀。其中，λ-角叉菜胶，购自Sigma-Aldrich公司(货号22049)，使用生理盐水配制成1wt％浓度的溶液，注射体积40μL/只小鼠。注射λ-角叉菜胶溶液当天视为试验第1天(记为D1)。
在注射前1小时，注射后2小时、4小时和6小时，通过排水法分别测定各个动物后肢足趾肿胀程度，测定方法如下：在100ml烧杯内注入70ml的蒸馏水，并在电子天平上进行校零。测试前，在鼠足踝关节处标记测量标线。固定小鼠，将小鼠后肢足趾放入烧杯内，当水平面与鼠足踝关节处的测量标线重叠时，读取天平显示屏结果。读数克(g)为小鼠足趾浸入水后的排水体积(ml)，以此表示小鼠足肿胀程度。同一只鼠每次测量时，后肢足趾浸入烧杯蒸馏水的位置相同，即将足踝关节处标记的测量标线与水平面重叠。每次测量后重新校零。
各组动物足肿胀程度、最大肿胀增加度和到达最大肿胀程度的时间见表8。 表8中，某组的最大肿胀增加度＝(该组最大肿胀程度-该组注射前1h肿胀程度)/该组注射前1h肿胀程度×100％；某组到达最大肿胀程度的时间指注射λ-角叉菜胶溶液后到达最大肿胀程度的时间，最大肿胀程度指某组中动物肿胀程度的最大值。
最后一次测定足肿胀结束后，使动物吸入浓度为2-5v/v％的异氟烷(购自深圳瑞沃德科技有限公司，批号：20120301)进行麻醉。随后通过吸入过量二氧化碳，采用脱颈椎对动物实施安乐死。对于每只小鼠，取肝脏左大叶100mg，切成2×2mm小块，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存。采用与实验例2相同的方法，检测肝组织中PKK mRNA的表达量。在角叉菜胶诱导的足肿胀模型鼠中PKK mRNA的抑制率见表9。
整个试验期间，动物无任何外观或行为异常表现，各组间无显著差异。
表8各组动物足肿胀程度(克，g)
从表8可以看出，注射λ-角叉菜胶溶液后2小时、4小时和6小时，G1-G6各组相对于自身未注射前，小鼠均产生了不同程度的足肿胀。注射生理盐水的G1组，最大肿胀增加度达到70.6％，而注射不同药物的G2-G6组，最大肿胀增加度大幅降低到39％以下。另一方面，注射不同剂量本公开siRNA缀合物1的G4-G6组的小鼠到达最大肿胀程度的时间均较短，都是2小时，随后肿胀程度减弱，对肿胀的抑制程度也明显与剂量相关，这说明本公开提供的siRNA缀合物对于抑制小鼠肿胀作用明显且见效快。
与另外两种阳性对照药物(G2-G3组)相比，本公开提供的siRNA缀合物具有相近或更好的效果。
表9各组动物体内PKK mRNA的抑制率
由表9可见，在角叉菜胶诱导的足肿胀模型鼠中，本公开的siRNA缀合物1显示出了较好的小鼠体内PKK mRNA抑制效果，相对于G1saline组而言，siRNA缀合物1对PKK mRNA的抑制率可达60％以上，其中给药剂量为3mg/kg时，对PKK mRNA的抑制率可达77.47％；给药剂量为9mg/kg时，对PKK mRNA的抑制率可达82.43％，呈现出明显的剂量依赖性抑制。而阳性对照品G2-G3组，对PKK mRNA的表达水平并无显著性抑制。可见，本公开的siRNA缀合物1通过抑制PKK mRNA的表达水平，显著抑制了足肿胀增加的程度，具有良好的应用前景。
以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (26)

  1. 一种siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
    5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 1-3'(SEQ ID NO:1)；
    5'-Z 2UUGGUUUUUGGAAUUCAG-3'(SEQ ID NO:2)，
    其中，Z 1为U，Z 2为A，
    所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z 1的核苷酸Z 3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z 2的核苷酸Z 4，所述Z 4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
  2. 如权利要求1所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
    优选地，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z 4位置处的差异，且Z 4选自U、C或G；
    优选地，Z 3是与Z 4互补的核苷酸。
  3. 如权利要求1或2所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
  4. 如权利要求1-3中任一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
    5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 3-3'(SEQ ID NO:3)；
    5'-Z 4UUGGUUUUUGGAAUUCAG-3'(SEQ ID NO:4)，
    其中，Z 3选自A、U、G或C，Z 4是与Z 3互补的核苷酸；
    优选地，Z 3为U，Z 4为A。
  5. 如权利要求1-4中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
  6. 如权利要求5所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为A；
    或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UA；
    或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AUA；
    或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UAUA。
  7. 如权利要求1-6中任一项所述的siRNA，其中，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端；
    或者，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸；
    或者，所述核苷酸序列V为连续的两个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸或连续的两个尿嘧啶核糖核苷酸，或者所述核苷酸序列V与靶mRNA相应位置的核苷酸互补。
  8. 如权利要求1-7中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA的正 义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
    5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAZ 3-3'(SEQ ID NO:5)；
    5'-Z 4UUGGUUUUUGGAAUUCAGUA-3'(SEQ ID NO:6)；
    或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
    5'-UACUGAAUUCCAAAAACCAAZ 3-3'(SEQ ID NO:7)；
    5'-Z 4UUGGUUUUUGGAAUUCAGUAUA-3'(SEQ ID NO:8)；
    其中，所述Z 4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z 3选自A、U、G或C，并且Z 4是与Z 3互补的核苷酸；
    优选地，所述siRNA为siPKKa1或siPKKa2：
    siPKKa1
    正义链：5'-CUGAAUUCCAAAAACCAAU-3'(SEQ ID NO:9)
    反义链：5'-AUUGGUUUUUGGAAUUCAGUA-3'(SEQ ID NO:10)
    siPKKa2
    正义链：5'-UACUGAAUUCCAAAAACCAAU-3'(SEQ ID NO:11)
    反义链：5'-AUUGGUUUUUGGAAUUCAGUAUA-3'(SEQ ID NO:12)。
  9. 如权利要求1-8中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。
  10. 如权利要求1-9中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
  11. 如权利要求10所述的siRNA，其中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；
    优选地，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸 序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
  12. 如权利要求10或11所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
  13. 如权利要求12所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
  14. 如权利要求9所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基，所述硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：
    所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
    所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
  15. 如权利要求1-14中任一项所述的siRNA，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
  16. 如权利要求1-15中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为 siPKKa1-M1、siPKKa1-M2、siPKKa1-M3、siPKKa2-M1、siPKKa2-M2、siPKKa2-M3、siPKKa1-M1S、siPKKa1-M2S、siPKKa1-M3S、siPKKa2-M1S、siPKKa2-M2S、siPKKa2-M3S、siPKKa1-M1P1、siPKKa1-M2P1、siPKKa1-M3P1、siPKKa2-M1P1、siPKKa2-M2P1、siPKKa2-M3P1、siPKKa1-M1SP1、siPKKa1-M2SP1、siPKKa1-M3SP1、siPKKa2-M1SP1、siPKKa2-M2SP1、siPKKa2-M3SP1中的任意一种。
  17. 一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-16中任意一项所述的siRNA和药学上可接受的载体。
  18. 如权利要求17所述的药物组合物，其中，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)；
    优选地，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-50)。
  19. 一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有权利要求1-16中任意一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
  20. 如权利要求19所述的siRNA缀合物，其中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。
  21. 如权利要求19或20所述的siRNA缀合物，其中，该siRNA缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构。
  22. 权利要求1-16中任意一项所述的siRNA、权利要求17-18中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求19-21中任意一项所述的siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防由血浆前激肽释放酶基因表达引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
  23. 如权利要求22所述的用途，其中，所述由血浆前激肽释放酶基 因表达引起的病理状况或疾病选自炎性疾病或栓塞性疾病或生理状况、特别是遗传性血管水肿。
  24. 一种治疗和/或预防血浆前激肽释放酶基因表达引起的病理状况或疾病的方法，其中，所述方法包括将有效量的权利要求1-16中任意一项所述的siRNA、权利要求17-18中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求19-21中任意一项所述的siRNA缀合物给予有需要的受试者。
  25. 一种抑制血浆前激肽释放酶基因表达的方法，该方法包括将有效量的权利要求1-16中任意一项所述的siRNA、权利要求17-18中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求19-21中任意一项所述的siRNA缀合物与所述细胞接触。
  26. 一种试剂盒，其中，该试剂盒含有权利要求1-16任意一项所述的siRNA、权利要求17-18中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求19-21中任意一项所述的siRNA缀合物。
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