TW201909925A

TW201909925A - 核酸複合體

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Publication number: TW201909925A
Application number: TW107126969A
Authority: TW
Inventors: 山田陽史; 牧野麻奈; 長谷川尚; 岩井宏徒; 上原啓嗣; 鈴木康裕
Original assignee: 日商協和醱酵麒麟有限公司
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2019-03-16
Also published as: WO2019027015A1

Abstract

本發明提供一種下述式1所表示之能夠抑制補體B因子(CFB)之表現之核酸複合體。式1： [化1]

Description

核酸複合體

本發明係關於一種核酸複合體及包含該核酸複合體之醫藥組合物等。

作為核酸醫藥，已知有適體、反義核酸、陷阱(Decoy)核酸、核糖核酸酵素、siRNA(small interfering RNA，短小干擾核糖核酸)、miRNA(micro RNA，微小核糖核酸)及antimiRNA(anti-micro RNA，抗微小核糖核酸)等。核酸醫藥因其能夠控制細胞內所有基因之高通用性，而期待臨床應用於迄今為止認為難以治療之各種疾病。又，核酸醫藥因其於細胞內之靶選擇性與活性較高，而有望成為繼抗體、低分子醫藥後之下一代醫藥。然而，核酸醫藥存在難以傳遞至靶組織之問題。

作為於體內有效之核酸醫藥之傳遞法之一，報告有使用靶向化合物與核酸之核酸複合體(conjugate)。作為靶向化合物，可列舉能夠與在細胞外表現之受體結合之配體。其中尤其是已數次報告有利用N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNAc)等作為能夠與在肝細胞中極高地表現之脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合之配體的核酸複合體。近年來，報告有由該等配體與siRNA類結合而成之核酸複合體可有效率地傳遞至肝細胞(非專利文獻1)。

作為靶向化合物與寡核苷酸之複合體，專利文獻1及2中揭示有例如以下所示之核酸複合體。

[化1](式中，Ac表示乙醯基；以下於本說明書中相同)

又，專利文獻3中揭示有具有包含與專利文獻1及2相同之糖配體-拴繫單元(tether unit)之以下結構之核酸複合體。

[化2]

又，專利文獻4中，揭示有具有以下所示之結構作為糖配體-拴繫單元之核酸複合體。

[化3]

補體係一組介導免疫反應之血中蛋白，作為補體之作用，可列舉：促進吞噬細胞對病原菌之吞噬作用或損傷具有外膜之病毒而使之失去感染力等。血清中存在量最多之補體為C3，於補體第二途徑中藉由補體B因子(complement factor B：CFB)等而活化，藉此控制其作用(非專利文獻2)。

已知若由於與補體第二途徑有關之控制因子之異常、或C3轉換酶因其自身抗體引起之穩定化等而導致C3持續活化，則可能導致非典型溶血性***症候群(aHUS)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、老年性黃斑變性症(AMD)、膜性增生性絲球體腎炎(MPGN)、C3腎炎、膜性腎病、急性絲球體腎炎(RPGN)、急性腎損傷(AKI)、ANCA相關血管炎、狼瘡性腎炎、哮喘、自體免疫疾病(例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、視神經脊髓炎、重症肌無力症等)等疾病之發作(非專利文獻3、4)。藉由特異性地抑制補體B因子之作用，可期待能夠預防或治療上述疾病，但補體B因子於血中以300 μg/mL相對高濃度存在 (非專利文獻5)，例如利用一般之抗體醫藥持續抑制該等全部之補體B因子並不容易。先前技術文獻專利文獻

專利文獻1：國際公開第2009/073809號專利文獻2：國際公開第2013/075035號專利文獻3：國際公開第2015/105083號專利文獻4：國際公開第2014/179620號非專利文獻

非專利文獻1：美國化學會誌(Journal of American Chemical Society)，2014年，第136卷，p16958-16961 非專利文獻2：美國科學院院報(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)，1997年，第94卷，p8720-8725 非專利文獻3：免疫學評論(Immunological Reviews)，2008年，第223卷，p300-316 非專利文獻4：Journal of the American Society of Nephrology，2015年，第26卷，p2917-2929 非專利文獻5：Introduction to Complement，2011年，MEDICAL VIEW社，p18

[發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種能夠抑制補體B因子(CFB)之表現之核酸複合體。 [解決問題之技術手段]

本發明係關於以下。 [1] 一種核酸複合體，其係以下述式1表示。式1： [化4](式1中， X為包含正義股及反義股且包含至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙股核酸，該雙股核酸於該反義股中之鏈長為17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈與表1-1～表1-3中所記載之靶CFB mRNA序列之任一者互補，該正義股之3'末端或5'末端鍵結於S3， L1及L2分別獨立為糖配體， S1、S2及S3分別獨立為連接子) [2] 如[1]記載之核酸複合體，其具有下述式2所表示之結構。式2： [化5](式2中， X、L1、L2及S3分別與上述含義相同， P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q1、Q2、Q3及Q4分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n -CH₂ CH₂ -，n為0～99之整數， B1及B2分別獨立為鍵結鍵，或為下述式2-1所表示之任一結構，各結構中之末端之黑色圓點分別為與P2或P3、或者與P5或P6之鍵結點，m1、m2、m3及m4分別獨立為0～10之整數，式2-1： [化6]p1及p2分別獨立為1、2或3之整數， q1、q2、q3及q4分別獨立為0～10之整數，其中，於p1及p2分別為2或3之整數時，各P3及P6、Q2及Q4、T1及T2以及L1及L2可相同或不同，於q1～q4為2～10時，各-[P2-Q1]-、-[Q2-P3]-、-[P5-Q3]-、-[Q4-P6]-之組合可相同或不同) [3] 如[2]記載之核酸複合體，其中P1及P4分別獨立為-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。 [4] 如[2]或[3]記載之核酸複合體，其中-[P2-Q1]_q1 -及-[P5-Q3]_q3 -分別獨立，或不存在，或為下述式3-1～式3-3所表示之任一結構。式3-1： [化7]式3-2： [化8]式3-3： [化9](式3-1～式3-3中， m5及m6分別獨立為0～10之整數，式3-1～式3-3之結構中之末端之黑色圓點分別為與B1或B2、或者與P1或P4之鍵結點) [5] 如[2]至[4]中任一項記載之核酸複合體，其具有下述式4-1～式4-9所表示之任一結構。式4-1： [化10]式4-2： [化11]式4-3： [化12]式4-4： [化13]式4-5： [化14]式4-6： [化15]式4-7： [化16]式4-8： [化17]式4-9： [化18](式4-1～4-9中， X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2及q4分別與上述含義相同) [6] 如[1]記載之核酸複合體，其具有下述式5所表示之結構。式5： [化19](式5中， X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2分別與上述含義相同) [7] 如[6]記載之核酸複合體，其中P1為-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。 [8] 如[6]或[7]記載之核酸複合體，其具有下述式6-1～式6-9所表示之任一結構。式6-1： [化20]式6-2： [化21]式6-3： [化22]式6-4： [化23]式6-5： [化24]式6-6： [化25]式6-7： [化26]式6-8： [化27]式6-9： [化28](式6-1～6-9中， X、S3、P3、Q2、T1、L1及q2分別與上述含義相同) [9] 如[2]至[5]中任一項記載之核酸複合體，其具有下述式7-1～式7-9所表示之任一結構。式7-1： [化29]式7-2： [化30]式7-3： [化31]式7-4： [化32]式7-5： [化33]式7-6： [化34]式7-7： [化35]式7-8： [化36]式7-9： [化37](式7-1～7-9中， X、S3、L1及L2分別與上述含義相同) [10] 如[1]至[9]中任一項記載之核酸複合體，其中上述糖配體為N-乙醯基半乳胺糖。 [11] 如[1]至[10]中任一項記載之核酸複合體，其中上述雙股核酸包含修飾核苷酸。 [12] 如[1]至[11]中任一項記載之核酸複合體，其中正義股之3'末端及反義股之5'末端形成平滑末端。 [13] 如[11]記載之核酸複合體，其中上述雙股核酸包含糖部分修飾核苷酸。 [14] 如[1]至[13]中任一項記載之核酸複合體，其具有下述式7-8-1所表示之結構。式7-8-1： [化38](式7-8-1中，X與上述含義相同) [15] 如[1]至[14]中任一項記載之核酸複合體，其中X為選自由表1-1～表1-3中所記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股。 [16] 如[1]至[14]中任一項記載之核酸複合體，其中X為選自由表M1-1～表M1-3中所記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股。 [17] 如[1]至[14]中任一項記載之核酸複合體，其中X為選自由表M1-4中所記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股。 [18] 如[17]記載之核酸複合體，其中X為表M1-4中所記載之EB0125所表示之1對正義股/反義股。 [19] 一種醫藥組合物，其包含如[1]至[18]中任一項記載之核酸複合體。 [20] 如[19]記載之醫藥組合物，其係用於導入至細胞內。 [21] 如[19]或[20]記載之醫藥組合物，其係供靜脈內投予或皮下投予。 [22] 一種疾病之治療或預防方法，其包括將如[1]至[18]中任一項記載之核酸複合體或如[19]至[21]中任一項記載之醫藥組合物對需要其之患者進行投予。 [23] 一種抑制CFB基因之表現之方法，其包括使用如[1]至[18]中任一項記載之核酸複合體或如[19]至[21]中任一項記載之醫藥組合物向細胞內導入雙股核酸。 [24] 一種CFB相關疾病之治療方法，其包括將如[1]至[18]中任一項記載之核酸複合體或如[19]至[21]中任一項記載之醫藥組合物對哺乳動物進行投予。 [25] 一種用於治療CFB相關疾病之醫藥，其包含如[1]至[18]中任一項記載之核酸複合體或如[19]至[21]中任一項記載之醫藥組合物。 [26] 一種CFB相關疾病之治療劑，其包含如[1]至[18]中任一項記載之核酸複合體或如[19]至[21]中任一項記載之醫藥組合物。 [27] 如[24]記載之治療方法，其中CFB相關疾病為非典型溶血性***症候群、陣發性夜間血紅素尿症、老年性黃斑變性症、膜性增生性絲球體腎炎、C3腎炎、膜性腎病、急性絲球體腎炎(RPGN)、急性腎損傷(AKI)、ANCA相關血管炎、狼瘡性腎炎、哮喘、全身性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、視神經脊髓炎或重症肌無力症。 [28] 如[25]記載之醫藥，其中CFB相關疾病為非典型溶血性***症候群、陣發性夜間血紅素尿症、老年性黃斑變性症、膜性增生性絲球體腎炎、C3腎炎、膜性腎病、急性絲球體腎炎(RPGN)、急性腎損傷(AKI)、ANCA相關血管炎、狼瘡性腎炎、哮喘、全身性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、視神經脊髓炎或重症肌無力症。 [29] 如[26]記載之治療劑，其中CFB相關疾病為非典型溶血性***症候群、陣發性夜間血紅素尿症、老年性黃斑變性症、膜性增生性絲球體腎炎、C3腎炎、膜性腎病、急性絲球體腎炎(RPGN)、急性腎損傷(AKI)、ANCA相關血管炎、狼瘡性腎炎、哮喘、全身性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、視神經脊髓炎或重症肌無力症。 [發明之效果]

例如可對哺乳動物投予包含本發明之核酸複合體之醫藥組合物，於生物體內治療各種相關疾病。

本發明之核酸複合體係下述式1所表示之核酸複合體。式1：

[化39]

於式1中， X為包含正義股及反義股且包含至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙股核酸，該雙股核酸於該反義股中之鏈長為17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈與表1-1～表1-3中所記載之靶CFB mRNA序列之任一者互補，該正義股之3'末端或5'末端鍵結於S3， L1及L2分別獨立為糖配體， S1、S2及S3分別獨立為連接子。

於本發明中，相對於S3於苯環上之取代位置，S1及S2分別可於鄰位、間位、對位與苯環鍵結，但宜為下述式1-1所表示之核酸複合體。意味著式1中之S1及S2於苯環上之鍵結鍵可為苯環上之S3之取代位置以外之任意位置。式1-1：

[化40]

於式1-1中， X、L1、L2、S1、S2及S3分別與上述含義相同。於本說明書中，所謂“與上述含義相同”，以式1-1中為例進行說明，意指關於式1-1中之X、L1、L2、S1及S2各者，可以為與上文記述之式1中之X、L1、L2、S1及S2各者之相關定義相同之基。

於本發明中，X為包含正義股及反義股且包含至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙股核酸。又，該雙股核酸於該反義股中之鏈長為17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈與下文記述之表1-1～表1-3中所記載之靶CFB mRNA序列之任一者互補。此外，該正義股之3'末端或5'末端鍵結於S3。

L1及L2分別獨立為糖配體。於本發明中，作為糖配體，意指源自能夠與於靶細胞表現之受體結合之糖類(單糖、二糖、三糖及多糖等)之基。於本發明中，於糖配體藉由O-鍵結而與S1及S2之連接子鍵結之情形時，構成糖配體之糖類之與鍵結有關之羥基經去除之部分意指作為源自糖類之基的糖配體。於本發明中，只要選擇作為寡核苷酸之靶向細胞的糖配體即可。作為單糖，例如可列舉：阿洛糖、醛糖、***糖、克拉定糖(cladinose)、赤藻糖、赤蘚酮糖、果糖、D-岩藻糖醇(fucitol)、L-岩藻糖醇、墨角藻糖胺(fucosamine)、岩藻糖、墨角藻糖(fuculose)、半乳胺糖、D-半乳糖胺醇(galactosaminitol)、N-乙醯基-半乳胺糖、半乳糖、葡萄胺、N-乙醯基-葡糖胺、葡糖胺醇(glucosaminitol)、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、古洛糖、甘油醛、L-甘油-D-甘露庚糖、甘油、甘油酮(glycerone)、古洛糖、艾杜糖、來蘇糖、甘露胺糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、阿洛酮糖、異鼠李糖、異鼠李糖胺、鼠李糖醇、鼠李糖胺、鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、山梨糖、塔格糖、塔羅糖、酒石酸、蘇糖、木糖、及木酮糖等。作為二糖、三糖、多糖，例如可列舉：阿比可糖(abequose)、阿卡波糖(acarbose)、amicetose、支鏈澱粉、直鏈澱粉、芹菜糖、arcanose、蛔糖(ascarylose)、抗壞血酸、2-脫氧-6-鼠李糖(boivinose)、纖維雙糖、纖維三糖、纖維素、卡茄三糖(chacotriose)、查耳糖(chalcose)、甲殼素、可立糖(colitose)、環糊精、麻糖(cymarose)、糊精、2-脫氧核糖(deoxyribose)、2-脫氧葡萄糖、2-脫氧毛地黃糖(diginose)、毛地黃糖(digitalose)、洋地黃毒糖(digitoxose)、evalose、evemitrose、果寡醣、galto-oligosaccharide、龍膽三糖、龍膽二糖、聚糖(glycan)、肝糖(glycogen)、肝糖(glycogen)、金縷梅糖(hamamelose)、肝素、菊糖、左旋葡萄糖酮(isolevoglucosenone)、異麥芽糖、異麥芽三糖(isomaltotriose)、isopanose、曲二糖(kojibiose)、乳糖、乳糖胺(lactosamine)、乳糖二胺(lactosediamine)、昆布二糖(laminarabiose)、左旋葡聚糖(levoglucosan)、左旋葡萄糖酮(levoglucosenone)、β-麥芽糖、麥芽三糖、甘露-寡醣、甘露三糖(manninotriose)、蜜三糖、蜜二糖、胞壁酸、micarose(麥卡糖)、mycinose、神經胺酸(neuraminic acid)、含唾液酸之糖鏈、黑麯黴糖、野尻黴素(nojirimycin)、諾維糖(noviose)、夾竹桃糖(oleandrose)、潘糖、泊雷糖(paratose)、車前糖、櫻草糖(primeverose)、棉子糖、阿克拉黴酮(rhodinose)、芸香糖、沙門糖(sarmentose)、景天庚酮糖、景天庚酮聚糖(sedoheptulosan)、茄三糖(solatriose)、槐糖(sophorose)、水蘇糖、鏈黴糖(streptose)、蔗糖、α,α-海藻糖、trahalosamine、松二糖、泰威糖(tyvelose)、木二糖(xylobiose)、傘形糖等。

糖類中之各單糖可為D體或L體，亦可為D體與L體之任意比率之混合物。糖類亦可包括脫氧糖(將醇羥基取代為氫原子而成者)、胺基糖(將醇羥基取代為胺基而成者)、硫代糖(將醇羥基取代為硫醇基而成者、或將C=O取代為C=S而成者、或將環氧取代為硫而成者)、硒糖(seleno sugar)、碲糖(telluro sugar)、氮雜糖(將環碳取代為氮而成者)、亞胺基糖(將環氧取代為氮而成者)、膦糖(phosphano sugar)(將環氧取代為磷而成者)、磷糖(phospha sugar)(將環碳取代為磷而成者)、C-取代單糖(將非末端碳原子上之氫原子取代為碳原子而成者)、不飽和單糖、醛糖醇(將羰基取代為CHOH基而成者)、醛糖酸(將醛基取代為羧基而成者)、酮醛糖酸(Ketoaldonic acid)、糖醛酸、醛糖二酸等。關於胺基糖，作為糖類中之胺基單糖，可列舉：半乳胺糖、葡糖胺、甘露胺糖、墨角藻糖胺、異鼠李糖胺、神經胺糖酸、胞壁酸、乳糖二胺、acosamine、bacillosamine、柔紅糖胺(daunosamine)、德糖胺(desosamine)、福樂糖胺(forosamine)、加拉糖胺(Garosamine)、卡糖胺(Kanosamine)、kansosamine、碳黴糖(mycaminose)、海藻糖胺(mycosamine)、perosamine、pneumosamine、絳紅糖胺(purpurosamine)、紫紅黴胺(rhodosamine)等。又，胺基糖之胺基可經乙醯基等取代。作為含唾液酸之糖鏈，可列舉於糖鏈非還原末端含有NeuAc之糖鏈，可列舉：含有NeuAc-Gal-GlcNAc之糖鏈、或Neu5Acα(2-6)Galβ(1-3)GlcNAc等。糖類中之各單糖只要能夠與於靶細胞表現之受體結合，則亦可經取代基取代，例如羥基可以受到取代，各單糖中之氫原子可以被1～複數取代為疊氮基及/或可經取代之芳基。

作為糖配體，較佳為對應於設為靶之各器官而選擇會與在靶細胞之表面表現之受體結合之糖配體，例如於靶細胞為肝細胞之情形時，較佳為對應於在肝細胞表面表現之受體之糖配體，更佳為對應於脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)之糖配體。

作為對應於ASGPR之糖配體，較佳為甘露糖或N-乙醯基半乳胺糖，更佳為N-乙醯基半乳胺糖。作為對ASGPR之親和性更高之糖配體，例如已知《生物有機化學與醫藥化學》(Bioorganic Medicinal Chemistry)，第17卷，第7254頁(2009)及《美國化學會誌》(Journal of American Chemical Society)，第134卷，第1978頁(2012)等中記載之糖衍生物，可以使用該等。

於本發明中，S1、S2及S3為連接子。 S1與S2只要為將作為糖配體之L1與L2和苯環加以連結之結構，則並無特別限定，可以採用核酸複合體中所使用之公知結構。S1與S2可相同亦可不同。作為糖配體之L1與L2較佳為藉由糖苷鍵和S1及S2連結，S1及S2分別可以藉由例如-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵和苯環連結。

S3只要為將作為雙股核酸之X與苯環加以連結之結構，則並無特別限定，可以採用核酸複合體中所使用之公知結構。作為寡核苷酸之X較佳為藉由磷酸二酯鍵與S3連結，S3可以藉由例如-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵與苯環連結。

作為S1、S2及S3之連接子，例如可以採用國際公開第2009/073809號、國際公開第2013/075035號、國際公開第2015/105083號、國際公開第2014/179620號、國際公開第2015/006740號中所揭示之結構。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式2所表示之結構之核酸複合體。式2：

[化41]

式2中， X、L1、L2及S3分別與上述含義相同， P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q1、Q2、Q3及Q4分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n -CH₂ CH₂ -，n為0～99之整數。

P1及P4分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-、-O-CO-、-NH-CO-或-CO-NH-，更佳為-O-、-NH-CO-或-CO-NH-，進而較佳為-NH-CO-。於P1或P4例如為-NH-CO-之情形時，具有-NH-CO-苯環之部分結構。

Q1、Q2、Q3及Q4分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n -CH₂ CH₂ -，n為0～99之整數，較佳為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基，更佳為未經取代之碳數1～12之伸烷基，進而較佳為未經取代之碳數1～6之伸烷基，進而更佳為未經取代之碳數1～4之伸烷基。

P2及P5分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為或不存在或為-CO-O-或-CO-NH-，更佳為或不存在或為-CO-NH-。於P2及P5例如為-CO-NH-之情形時，具有B1-CO-NH-Q1及B2-CO-NH-Q3之部分結構。

-[P2-Q1]_q1 -及-[P5-Q3]_q3 -分別獨立，宜不存在或為下述式3-1～式3-3所表示之任一結構。式3-1：

[化42]式3-2：

[化43]式3-3：

[化44]

式3-1～3-3中， m5及m6分別獨立為0～10之整數，式3-1～式3-3之結構中之末端之黑色圓點分別為與B1或B2、或者與P1或P4之鍵結點。

B1及B2分別獨立為鍵結鍵，或為下述式所表示之任一結構，各結構中之末端之黑色圓點分別為與P2或P3、或者與P5或P6之鍵結點，m1、m2、m3及m4分別獨立為0～10之整數。

[化45]

B1及B2較佳為源自麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、亞胺基二乙酸等包含非天然胺基酸之胺基酸、或源自2-胺基-1,3-丙二醇等胺基醇之基，於B1及B2為源自麩胺酸及天冬胺酸之基之情形時，麩胺酸及天冬胺酸之胺基分別鍵結，作為P2及P5，較佳為-NH-CO-鍵，於B1及B2為源自離胺酸之基之情形時，離胺酸之羧基分別鍵結，作為P2及P5，較佳為-CO-NH-鍵，於B1及B2為源自亞胺基二乙酸之基之情形時，亞胺基二乙酸之胺基分別鍵結，作為P2及P5，較佳為-CO-鍵。B1及B2具體而言較佳為具有以下之結構。

[化46]

於p1及p2分別為2或3之整數時，各P3及P6、Q2及Q4、T1及T2以及L1及L2可相同或不同。於q1～q4為2～10時，各-[P2-Q1]-、-[Q2-P3]-、-[P5-Q3]-、-[Q4-P6]-之組合可相同或不同。所謂各-[P2-Q1]-、-[Q2-P3]-、-[P5-Q3]-及-[Q4-P6]-之組合相同或不同，意指-[P2-Q1]-、-[Q2-P3]-、-[P5-Q3]-及-[Q4-P6]-所表示之各2～10個單元有相同之情況亦有不同之情況。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式4-1～4-9所表示之結構之核酸複合體。式4-1：

[化47]式4-2：

[化48]式4-3：

[化49]式4-4：

[化50]式4-5：

[化51]式4-6：

[化52]式4-7：

[化53]式4-8：

[化54]式4-9：

[化55]

式4-1～4-9中， X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2及q4分別與上述含義相同。

P3及P6分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-CO-或-NH-CO-，更佳為-NH-CO-。於P3及P6例如為-NH-CO-之情形時，分別具有B1-NH-CO-Q2及B2-NH-CO-Q4之部分結構。

T1及T2分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-或-S-，更佳為-O-。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式5所表示之結構之核酸複合體。於式5中，式2中之P1與P4、P2與P5、P3與P6、Q1與Q3、Q2與Q4、B1與B2、T1與T2、L1與L2、p1與p2、q1與q3以及q2與q4分別相同。式5：

[化56]

式5中， X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2分別與上述含義相同。又，式5中之X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2分別可為上文記述之適宜之基，P1較佳為-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。式5中之-(P2-Q1)_q1 -宜不存在或為上述式3-1～式3-3所表示之任一結構。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式6-1～6-9所表示之結構之核酸複合體。式6-1：

[化57]式6-2：

[化58]式6-3：

[化59]式6-4：

[化60]式6-5：

[化61]式6-6：

[化62]式6-7：

[化63]式6-8：

[化64]式6-9：

[化65]

式6-1～式6-9中， X、S3、P3、Q2、T1及L1分別與上述含義相同。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式7-1～式7-9之任一者所表示之結構之核酸複合體。式7-1：

[化66]式7-2：

[化67]式7-3：

[化68]式7-4：

[化69]式7-5：

[化70]式7-6：

[化71]式7-7：

[化72]式7-8：

[化73]式7-9：

[化74]

式7-1～式7-9中， X、L1、L2及S3分別與上述含義相同。L1與L2可相同亦可不同，宜為相同。於式7-1～式7-9中，藉由於各伸烷基部分導入鏈長不同之伸烷基鏈，又，藉由將醯胺鍵等取代為其他鍵，亦可製造具有式7-1～式7-9所表示之結構之核酸複合體以外之核酸衍生物。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式11所表示之結構之核酸複合體。式11：

[化75]

式11中， L1、L2、S1及S2分別與上述含義相同， P7及P8分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q5、Q6及Q7分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n8 -CH₂ CH₂ -，n8為0～99之整數， B3於本說明書中稱為分支(brancher)單元，為下述式11-1所表示之任一結構，曲線處分別表示與Q5及Q6之鍵結鍵，式11-1：

[化76]

式11-1中，具有***環之基中之取代係該***環之1位及3位之氮原子之任一者。 q5及q6分別獨立為0～10之整數。

P7或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，較佳為-O-、-NH-CO-或-CO-NH-，更佳為-O-或-NH-CO-。於P7例如為-O-之情形時，具有苯環-O-之部分結構。

P8或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，於存在之情形時，較佳為-CO-O-或-CO-NH-，更佳為-CO-NH-。於P8例如為-CO-NH-之情形時，具有Q6-CO-NH-之部分結構。

Q5、Q6及Q7分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n8 -CH₂ CH₂ -，n8為0～99之整數，較佳為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基，更佳為未經取代之碳數1～12之伸烷基，進而較佳為未經取代之碳數1～6之伸烷基，進而更佳為未經取代之碳數1～4之伸烷基。

-(P7-Q5)_q5 -宜為-O-(CH₂ )_m15 -NH-及-NH-CO-(CH₂ )_m16 -NH，m15及m16分別獨立為1～10之整數。

於本發明中，核酸複合體宜為具有下述式12-1～式12-12之任一者所表示之結構之核酸複合體。式12-1：

[化77]式12-2：

[化78]式12-3：

[化79]式12-4：

[化80]式12-5：

[化81]式12-6：

[化82]式12-7：

[化83]式12-8：

[化84]式12-9：

[化85]式12-10：

[化86]式12-11：

[化87]式12-12：

[化88]

式12-1～12-12中， X、L1、L2、S1及S2分別與上述含義相同，n1'～n12'分別獨立為1～10之整數。

本發明之核酸複合體較佳為於式1所表示之核酸複合體中組合有對應於S1及S2之式2記載之結構與對應於S3之式11記載之結構的核酸複合體。式2可為式4-1～式4-9，亦可為式6-1～式6-9，亦可為式7-1～式7-9，於式2為式4-1～式4-9、式6-1～式6-9或式7-1～式7-9之情形時，式11可為式12-1～式12-12。本發明之核酸複合體更適宜為於式1所表示之核酸複合體中組合有對應於S1及S2之式4-1～式4-9記載之任一結構與對應於S3之式12-1～式12-12記載之任一結構的核酸複合體、組合有對應於S1及S2之式6-1～式6-9記載之任一結構與對應於S3之式12-1～式12-12記載之任一結構的核酸複合體、組合有對應於S1及S2之式7-1～式7-9記載之任一結構與對應於S3之式12-1～式12-12記載之任一結構的核酸複合體。

式1中之X為包含正義股及反義股且包含至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙股核酸，該雙股核酸於該反義股中之鏈長為17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈與表1-1～表1-3中所記載之靶CFB mRNA序列之任一者互補。由於正義股之3'末端或5'末端鍵結於S3，故於式1中，與S3鍵結之X為構成雙股核酸之正義股，即下文記述之表1-1～表1-3或表M1-1～表M1-3中之正義股序列所表示之正義股。

於本發明中，將包含與CFB mRNA呈互補性之鹼基序列之核酸稱為反義股核酸，包含與反義股核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列之核酸亦稱為正義股核酸。

本發明中所使用之構成核酸複合體之雙股核酸係於向哺乳動物細胞導入之情形時具有使CFB基因之表現減弱或停止之能力的雙股核酸，為具有正義股及反義股之雙股核酸。又，該正義股與該反義股具有至少11個鹼基對，該反義股中之至少17個核苷酸且至多30個、即鏈長為17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈與選自表1-1～表1-3中所記載之群中之靶CFB mRNA序列互補。

作為本發明中所使用之構成核酸複合體之雙股核酸，只要為使核苷酸或與該核苷酸具有同等功能之分子聚合而成之分子，則可為任意分子，例如可列舉：作為核糖核苷酸之聚合物之RNA、作為脫氧核糖核苷酸之聚合物之DNA、包含RNA與DNA之嵌合核酸、及該等核酸之至少一個核苷酸被與該核苷酸具有同等功能之分子取代之核苷酸聚合物。又，本發明中所使用之作為藥物之雙股核酸亦包括該等核酸內包含至少一個與核苷酸具有同等功能之分子之衍生物。又，尿嘧啶(U)可被替換為胸腺嘧啶(T)。

作為與核苷酸具有同等功能之分子，例如可列舉核苷酸衍生物等。作為核苷酸衍生物，只要為對核苷酸實施修飾所獲得之分子，則可為任意分子，例如為了相較於RNA或DNA而增強或穩固核酸酶耐性，為了提高與互補股核酸之親和性，為了提高細胞透過性，或者為了實現可視化，適宜使用對核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸實施修飾所獲得之分子等。

作為對核苷酸實施修飾所獲得之分子，例如可列舉：糖部分修飾核苷酸、磷酸二酯鍵修飾核苷酸、鹼基修飾核苷酸、以及糖部分、磷酸二酯鍵及鹼基之至少一者經修飾之核苷酸等。

作為糖部分修飾核苷酸，只要為核苷酸之糖之化學結構之局部或整體經任意取代基修飾或取代者、或者經任意原子取代者，則可為任意者，可較佳地使用2'-修飾核苷酸。

作為2'-修飾核苷酸，例如核糖之2'-OH基被選自由H、OR、R、R'OR、SH、SR、NH₂ 、NHR、NR₂ 、N₃ 、CN、F、Cl、Br及I所組成之群(R為烷基或芳基，較佳為碳數1～6之烷基，R'為伸烷基，較佳為碳數1～6之伸烷基)中之取代基取代的核苷酸，更佳為2'-OH基被H、F或甲氧基取代之核苷酸，進而較佳為2'-OH基被F或甲氧基取代之核苷酸。又，亦可列舉2'-OH基被選自由2-(甲氧基)乙氧基(2-(methoxy)ethoxy基)、3-胺基丙氧基(3-aminopropoxy基)、2-[(N,N-二甲基胺基)氧基]乙氧基(2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基)、3-(N,N-二甲基胺基)丙氧基(3-(N,N-dimethylamino)propoxy基)、2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙氧基(2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基)、2-(甲基胺基)-2-側氧基乙氧基(2-(methylamino)-2-oxoethoxy基)、2-(N-甲基胺甲醯基)乙氧基(2-(N-methylcarbamoyl)ethoxy基)及2-氰基乙氧基(2-cyanoethoxy基)所組成之群中之取代基取代的核苷酸等。相對於雙股核酸區域內之核苷酸，較佳為包含50%～100%之2'-修飾核苷酸，更佳為包含70%～100%，進而較佳為包含90%～100%。又，相對於正義股之核苷酸，較佳為包含20%～100%之2'-修飾核苷酸，更佳為包含40%～100%，進而較佳為包含60%～100%。又，相對於反義股之核苷酸，較佳為包含20%～100%之2'-修飾核苷酸，更佳為包含40%～100%，進而較佳為包含60%～100%。

作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸，只要為核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之局部或整體經任意取代基修飾或取代者、或者經任意原子取代者，則可為任意者，例如可列舉：磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵被二硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵被烷基膦酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵被胺基磷酸酯鍵取代之核苷酸等。

作為鹼基修飾核苷酸，只要為核苷酸之鹼基之化學結構之局部或整體經任意取代基修飾或取代者、或者經任意原子取代者，則可為任意者，例如可列舉：鹼基內之氧原子被硫原子取代者，氫原子被碳數1～6之烷基、鹵基取代者，甲基被氫原子、羥基甲基、碳數2～6之烷基取代者，胺基被碳數1～6之烷基、碳數1～6之烷醯基、側氧基、羥基等取代者。

作為核苷酸衍生物，亦可列舉對核苷酸或者糖部分、磷酸二酯鍵或鹼基之至少一者經修飾之核苷酸衍生物直接或經由連接子加成肽、蛋白質、糖、脂質、磷脂質、啡𠯤、葉酸酯、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明、香豆素、色素等其他化學物質而成者，具體而言，可列舉：5'-聚胺加成核苷酸衍生物、膽固醇加成核苷酸衍生物、類固醇加成核苷酸衍生物、膽汁酸加成核苷酸衍生物、維生素加成核苷酸衍生物、Cy5加成核苷酸衍生物、Cy3加成核苷酸衍生物、6-FAM加成核苷酸衍生物、及生物素加成核苷酸衍生物等核苷酸衍生物亦可與核酸內之其他核苷酸或核苷酸衍生物形成伸烷基結構、肽結構、核苷酸結構、醚結構、酯結構、及組合有該等中之至少一者之結構等橋接結構。

本說明書中，所謂「互補」意指於2個鹼基間能夠進行鹼基配對之關係，例如，如腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶之關係、以及鳥嘌呤與胞嘧啶之關係般，經由鬆弛之氫鍵而雙鏈區域整體上形成雙重螺旋結構。

本說明書中，所謂「互補性」並非僅指2個核苷酸序列完全互補之情形，該核苷酸序列間亦可具有0～30%、0～20%或0～10%之失配鹼基，例如，意味著與CFB mRNA呈互補性之反義股可於與該mRNA之部分鹼基序列完全互補之鹼基序列中包含1個或複數個鹼基之置換。具體而言，反義股相對於靶基因之靶序列，可具有1～8個、較佳為1～6個、1～4個、1～3個、尤其2個或1個失配鹼基。例如於反義股之鹼基長度為21個之情形時，相對於靶基因之靶序列，可有6個、5個、4個、3個、2個或1個失配鹼基，該失配之位置可為各序列之5'末端或3'末端。又，所謂「互補性」包括一核苷酸序列為於與另一核苷酸序列完全互補之鹼基序列中附加及/或缺失了1個或複數個鹼基之序列的情況。例如CFB mRNA與本發明之反義股核酸可因反義股中之鹼基之附加及/或缺失而於反義股及/或靶CFB mRNA區域具有1個或2個凸起鹼基。

本發明中所使用之作為藥物之雙股核酸只要為包含與CFB mRNA之一部分鹼基序列呈互補性之鹼基序列之核酸及/或包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列之核酸，則可由任意之核苷酸或其衍生物構成。本發明之雙股核酸只要包含與靶CFB mRNA序列呈互補性之鹼基序列之核酸與包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列之核酸能夠形成至少11個鹼基對之雙股，則可為任意長度，能夠形成雙股之序列之長度通常為11～27個鹼基，較佳為15～25個鹼基，更佳為15～23個鹼基，進而較佳為17～21個鹼基。

作為本發明之核酸複合體之反義股，使用包含與靶CFB mRNA序列呈互補性之鹼基序列之核酸，亦可使用該核酸中之1～3個鹼基、較佳為1～2個鹼基、更佳為1個鹼基缺失、經置換或附加者。

作為抑制CFB之表現之核酸，宜使用：包含與靶CFB mRNA序列呈互補性之鹼基序列、且抑制CFB之表現的單股核酸，或者含有包含與靶CFB mRNA序列呈互補性之鹼基序列之核酸及包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列之核酸、且抑制CFB之表現的雙股核酸。

構成雙股核酸之單股之反義股核酸及正義股核酸分別相同或不同，通常包含11～30個鹼基，較佳為分別相同或不同，包含17～27個鹼基，更佳為包含17～25個鹼基，進而較佳為包含19～25個鹼基，進而更佳為包含21～23個鹼基。

於本發明中所使用之作為藥物之雙股核酸在與雙鏈區域相連之3'側或5'側具有未形成雙股之追加之核苷酸或核苷酸衍生物之情形時，將其稱為突出部(懸突)。於具有突出部之情形時，構成突出部之核苷酸可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或該等之衍生物。

作為具有突出部之雙股核酸，使用於至少單股之3'末端或5'末端具有包含1～6鹼基、通常1～3鹼基之突出部者，較佳使用具有包含2個鹼基之突出部者，例如可列舉具有包含dTdT(dT表示脫氧胸苷)或UU(U表示尿苷)之突出部者。可於僅反義股、僅正義股、或反義股與正義股兩者具有突出部，於本發明中，較佳為使用於反義股具有突出部之雙股核酸。再者，反義股於包含雙鏈區域及與其相連之突出部的包含17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈中，與選自表1-1～表1-3中記載之靶CFB mRNA之任一者序列充分互補。進而，作為本發明之雙股核酸，亦可使用例如Dicer等藉由核糖核酸酶之作用而生成雙股核酸之核酸分子(WO2005/089287)、或者無3'末端或5'末端之突出部而形成平滑末端之雙股核酸、僅正義股突出之雙股核酸(US2012/0040459)等。

作為本發明中所使用之構成核酸複合體之雙股核酸，可使用包含與靶基因之鹼基序列或其互補股之鹼基序列相同之序列的核酸，亦可使用含有該核酸之至少單股之5'末端或3'末端被削除1～4個鹼基之核酸、及包含與該核酸之鹼基序列呈互補性之鹼基序列之核酸的雙股核酸。

本發明中所使用之構成核酸複合體之雙股核酸可為RNA彼此形成雙股之雙股RNA(dsRNA)、DNA彼此形成雙股之雙股DNA(dsDNA)、或RNA與DNA形成雙股之雜交(hybrid)核酸。又，雙股中之一或兩股可為DNA與RNA之嵌合核酸。較佳為雙股RNA(dsRNA)。

本發明之核酸複合體之反義股之自5'末端起第2個核苷酸較佳為與靶CFB mRNA序列之自3'末端起第2個脫氧核糖核苷酸互補，更佳為反義股之自5'末端起第2～7個核苷酸與靶CFB mRNA序列之自3'末端起第2～7個脫氧核糖核苷酸完全互補，進而較佳為反義股之自5'末端起第2～11個核苷酸與靶CFB mRNA序列之自3'末端起第2～11個脫氧核糖核苷酸完全互補。又，較佳為本發明之核酸中之反義股之自5'末端起第11個核苷酸與靶CFB mRNA序列之自3'末端起第11個脫氧核糖核苷酸互補，更佳為反義股之自5'末端起第9～13個核苷酸與靶CFB mRNA序列之自3'末端起第9～13個脫氧核糖核苷酸完全互補，進而較佳為反義股之自5'末端起第7～15個核苷酸與靶CFB mRNA序列之自3'末端起第7～15個脫氧核糖核苷酸完全互補。

本發明之核酸複合體之反義股及正義股可基於例如作為Genbank Accession No.NM_000042登錄之人CFB之全長mRNA之cDNA(正義股)之鹼基序列(序列編號3541)而進行設計。

雙股核酸可設計為與CFB基因序列內之靶序列相互作用。

雙股核酸中之一股序列與上述靶部位序列互補。雙股核酸可使用本說明書中記述之方法進行化學合成。

RNA可藉由酶性或部分/全部有機合成而生成，或可於體外(in vitro)藉由酶性或有機合成而導入經修飾之核糖核苷酸。於一態樣中，各股係藉由化學方式製備。化學合成RNA分子之方法於該技術領域中為公知[參照Nucleic Acids Research，1998年，第32卷，p.936-948]。一般而言，雙股核酸可藉由使用固相寡核苷酸合成法合成(例如參照Usman et al., 美國專利第5,804,683號說明書；美國專利第5,831,071號說明書；美國專利第5,998,203號說明書；美國專利第6,117,657號說明書；美國專利第6,353,098號說明書；美國專利第6,362,323號說明書；美國專利第6,437,117號說明書；美國專利第6,469,158號說明書；Scaringe et al., 美國專利第6,111,086號說明書；美國專利第6,008,400號說明書；美國專利第6,111,086號說明書)。

關於單股核酸，採用固相亞磷醯胺法[參考Nucleic Acids Research，1993年，第30卷，p.2435-2443]合成，進行去保護，並於NAP-5管柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上進行脫鹽。寡聚物係採用時長15分鐘之線性梯度之Amersham Source 15Q管柱-1.0 cm。使用利用高度25 cm(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)之離子交換高性能液相層析儀(IE-HPLC)進行精製。梯度係自90：10之緩衝液A：B變為52：48之緩衝液A：B，緩衝液A為100 mmol/L Tris pH值8.5，緩衝液B為100 mmol/L Tris pH值8.5(1 mol/L之NaCl)。於260 nm下監測試樣，收集對應於全長寡核苷酸種之波峰，加以混合(pool)，利用NAP-5管柱進行脫鹽並冷凍乾燥。

各單股核酸之純度係藉由利用Beckman PACE 5000(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif)之毛細管電泳(CE)而確定。CE毛細管其內徑為100 μm，內含ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)。典型而言，將約0.6 nmole之寡核苷酸注射至毛細管內，於444 V/cm之電場下實施電泳，藉由260 nm下之UV吸光度進行檢測。改性Tris-硼酸-7 mol/L-尿素電泳緩衝液係自Beckman-Coulter購入。獲得用於以下記述之實驗的藉由CE評價時純度至少達90%之單股核酸。化合物同一性係根據製造業者之推薦操作說明，藉由利用Voyager DE.TM.Biospectometry Workstation(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)之基質輔助雷射脫附電離-飛行時間型(MALDI-TOF)質譜法進行驗證。單股核酸之相對分子質量可於預測之分子質量之0.2%以內獲得。

使單股核酸以100 μmol/L濃度再懸浮於包含100 mmol/L乙酸鉀、30 mmol/L HEPES(pH值7.5)之緩衝液中。將呈互補性之正義股與反義股以同等莫耳量進行混合，獲得50 μmol/L雙股核酸之最終溶液。歷時5分鐘將試樣加熱至95℃，於使用前冷卻至室溫。雙股核酸係於-20℃下保存。單股核酸係進行冷凍乾燥、或於不含核酸酶之水中以-80℃貯藏。

作為本發明中之包含正義股及反義股且包含至少11個鹼基對之雙鏈區域、並且於該反義股中之鏈長為11個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈部分與選自表1-1～表1-3中所記載之群中之靶CFB mRNA序列互補的雙股核酸，可使用：包含選自由表1-1～表1-3中記載之反義股所組成之群中之序列的雙股核酸、或者包含選自由表M1-1～表M1-3、以及下文記述之表1-1～表1-3中記載之正義股所組成之群中之序列的雙股核酸、或者包含選自由表M1-1～表M1-3、以及下文記述之表1-1～表1-3中記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股之序列的雙股核酸。即，本發明中所使用之構成核酸複合體之雙股核酸之具體例為包含表M1-1～表M1-3、以及下文記述之表1-1～表1-3中之正義股及反義股的雙股核酸。再者，於表M1-1～表M1-3中，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-氟修飾RNA，^表示硫代磷酸酯。又，表1-1～表1-3及表M1-1～表M1-3中記載之反義股序列之5'末端核苷酸可於5'末端經磷酸化，亦可未經磷酸化，較佳為經磷酸化。包含下文記述之表1-1～表1-3中記載之正義股/反義股之序列的雙股核酸較理想為於其減弱(knock down)活性之測定中，CFB之相對表現量為0.40以下者。

[表1] 表M1-1

[表2] 表M1-2

[表3] 表M1-3

[表4]

對本發明之核酸複合體之製造法進行說明。再者，以下所示之製造法中，於所定義之基會於該製造法之條件下變化或不適於實施該製造法之情形時，可藉由使用有機合成化學中常用之保護基之導入及去除方法[例如《有機合成中之保護基》第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)，T.W.Greene著，John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等中記載之方法]等而製造目標化合物。又，視需要亦可改變取代基導入等反應步驟之順序。式1所表示之核酸聚合物亦可藉由固相合成而合成。

式1所表示之核酸聚合物可參考作為核酸複合體所公知之連接子結構之合成方法進行合成。關於式1所表示之核酸複合體中之以S1作為連接子之L1-苯環單元或以S2作為連接子之L2-苯環單元之合成，例如以式2所表示之核酸複合體為例進行說明。式2所表示之核酸複合體中之L1-苯環單元或L2-苯環單元藉由P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2而連結。 P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2之-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵例如可藉由參考第4版實驗化學講座19「有機化合物之合成I」丸善(1992年)、第4版實驗化學講座20「有機化合物之合成II」丸善(1992年)等中記載之鍵結反應之方法，選擇適於形成式2所表示之結構之原料而適當合成。又，於苯環上依序鍵結具有Q1作為部分結構之化合物、具有B1作為部分結構之化合物，藉此可製造L1-苯環單元之部分結構。另行合成具有L1與Q2作為部分結構之化合物，使具有L1與Q2作為部分結構之化合物與具有苯環、Q1及B1作為部分結構的具有L1-苯環單元之部分結構之化合物進行鍵結，藉此可製造L1-苯環單元結構。關於L2-苯環單元亦同樣地，於苯環上依序鍵結具有Q3作為部分結構之化合物、具有B2作為部分結構之化合物，藉此可製造L2-苯環單元之部分結構。另行合成具有L2與Q4作為部分結構之化合物，使具有L2與Q4作為部分結構之化合物與具有苯環、Q3及B2作為部分結構的具有L2-苯環單元之部分結構之化合物進行鍵結，藉此可製造L2-苯環單元結構。

關於具有Q1作為部分結構之化合物、具有Q3作為部分結構之化合物，可列舉於碳數1～10之伸烷基或-(CH₂ CH₂ O)_n -CH₂ CH₂ -之兩末端具有羥基、羧基、胺基、硫醇基之化合物。關於具有B1作為部分結構之化合物、具有B2作為部分結構之化合物，可列舉具有下述式2-1所表示之任一結構、且各結構中之末端之黑色圓點處分別具有羥基、羧基、胺基或硫醇基的化合物。式2-1：

[化89]

關於具有B1作為部分結構之化合物、具有B2作為部分結構之化合物之具體例，可列舉：二醇、麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基胺基甲烷)、亞胺基二乙酸、2-胺基-1,3-丙二醇等，較佳為麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸、亞胺基二乙酸。具體而言，B1及B2較佳為以下之結構。

[化90]

亦可藉由合成具有L1、Q2及B1作為部分結構之化合物後，使之與具有Q1與苯環之化合物進行鍵結，而製造L1-苯環單元結構。亦可藉由合成具有L2、Q4及B2作為部分結構之化合物後，使之與具有Q3與苯環之化合物進行鍵結，而製造L2-苯環單元結構。本發明中，作為[L1-T1-(Q2-P3)_q2 -]_p1 -B1-(P2-Q1)_q1 -P1-之部分結構與作為[L2-T2-(Q3-P6)_q4 -]_p2 -B2-(P5-Q3)_q3 -P2-之部分結構可相同或不同，但較佳為相同。

作為相當於糖配體之L1-T1-Q2的單元，例如可列舉：L3-T1-Q2-COOH、L3-T1-(Q2-P3)_q2 _－ ₁ -Q2-NH₂ 等。具體而言，可列舉：L3-O-碳數1～12之伸烷基-COOH、或L3-碳數1～12之伸烷基-CO-NH-碳數2～12之伸烷基-NH₂ 等。 L3只要為藉由去保護而成為L1之糖配體衍生物，則並無特別限定。作為糖配體之取代基，只要為糖質化學領域中通用之取代基，則並無特別限定，較佳為Ac基。

關於以S1作為連接子之L1-苯環單元或以S2作為連接子之L2-苯環單元之合成，具體而言，以實施例記載之方法作為參考，使用適當增減伸烷基鏈之碳數、並將末端胺基或末端羧基替換成能夠形成-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵之基的化合物，藉此可合成。又，關於L1之糖配體，實施例中例示了甘露糖或N-乙醯基半乳胺糖，但亦可變更為其他糖配體而實施。

關於式1所表示之核酸複合體中之以S3作為連接子之X-苯環單元之合成，例如以式12所表示之核酸複合體為例進行說明。式12所表示之核酸複合體中之X-苯環單元除具有寡核苷酸之鍵以外，亦具有P7及P8所表示之鍵。 P7及P8之-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-鍵例如可藉由參考第4版實驗化學講座19「有機化合物之合成I」丸善(1992年)、第4版實驗化學講座20「有機化合物之合成II」丸善(1992年)中記載之鍵結反應之方法，選擇適於形成式12所表示之結構之原料而適當合成。又，於苯環上依序鍵結具有Q5作為部分結構之化合物、具有B3作為部分結構之化合物，藉此可製造X-苯環單元之部分結構。

另行合成具有X與Q7作為部分結構之化合物或具有X與Q6作為部分結構之化合物，使具有X與Q7作為部分結構之化合物或具有X與Q6作為部分結構之化合物與具有苯環及Q5作為部分結構的具有X-苯環單元之部分結構之化合物進行鍵結，而構建B3部分，藉此可製造X-苯環單元結構。具體而言，若以於具有苯環及Q5作為部分結構的具有X-苯環單元之部分結構之化合物之末端具有疊氮基之情形為例，則藉由與如實施例中揭示之經末端鍵結性官能基化之寡核苷酸進行反應而使之環化加成，形成***環，從而構建B3部分，藉此可製造X-苯環單元結構。

關於具有Q5作為部分結構之化合物、具有Q6作為部分結構之化合物、具有Q7作為部分結構之化合物，可列舉於碳數1～10之伸烷基或-(CH₂ CH₂ O)_n8 -CH₂ CH₂ -之兩末端具有羥基、羧基、胺基、硫醇基之化合物。

L1-苯環單元結構、L2-苯環單元結構與X-苯環單元結構可分別依序製造，較佳為合成L1-苯環單元結構及L2-苯環單元結構後再鍵結X-苯環單元結構。尤其關於具有寡核苷酸部分之X，較佳為於接近糖配體複合體合成之最終步驟時導入化合物內。

於本發明中，獲得作為合成中間物之下述式8～式10所表示之化合物。式8：

[化91]

(式8中， R1及R2分別獨立為氫原子、第三丁氧基羰基(Boc基)、苄氧基羰基(Z基)、9-茀基甲氧基羰基(Fmoc基)、-CO-R4、或-CO-B4-[(P9-Q8)_q7 -T3-L3]_p3 ， P9及T3分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q8或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n1 -CH₂ CH₂ -，n1為0～99之整數， B4分別獨立為鍵結鍵，或為下述式8-1所表示之任一結構，各結構中之末端之黑色圓點分別為與羰基或P9之鍵結點，m7、m8、m9及m10分別獨立為0～10之整數，式8-1：

[化92]

p3為1、2或3之整數， q7為0～10之整數， L3為糖配體， Y為-O-(CH₂ )_m11 -NH-及-NH-CO-(CH₂ )_m12 -NH，m11及m12分別獨立為1～10之整數， R3為氫原子、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基、-CO-R4、-CO-(CH₂ CH₂ O)_n2 -CH₂ CH₂ -N₃ 、或-CO-Q9-B5-(Q10-P10)_q8 -X1，n2為0～99之整數， P10或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q9及Q10分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n3 -CH₂ CH₂ -，n3為0～99之整數， B5為下述式8-2所表示之任一結構，曲線處分別表示與Q9及Q10之鍵結鍵，式8-2：

[化93]

式8-2中，具有***環之基中之取代係該***環之1位及3位之氮原子之任一者。 q8為0～10之整數， X1為氫原子或固相載體， R4為經選自由經第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基取代或未經取代之胺基、羧基、順丁烯二醯亞胺基、及芳烷氧基羰基所組成之群中之1或2個取代基取代的碳數2～10之烷基)

於本發明中，獲得作為合成中間物之下述式9所表示之化合物。式9：

[化94]

(式9中， R5及R6分別獨立為氫原子、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基、-CO-R4'、或-CO-Q11-(P11-Q11')_q9 -T4-L4， P11及T4分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q11及Q11'或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n4 -CH₂ CH₂ -，n4為0～99之整數， q9為0～10之整數， L4為糖配體， Y'為-O-(CH2)_m11' -NH-及-NH-CO-(CH₂ )_m12' -NH，m11'及m12'分別獨立為1～10之整數， R3'為氫原子、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基、-CO-R4'、-CO-(CH₂ CH₂ O)_n2' -CH₂ CH₂ -N₃ 、或-CO-Q9'-B5'-(Q10'-P10')_q8' -X1'，n2'為0～99之整數， P10'或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q9'及Q10'分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n3' -CH₂ CH₂ -，n3'為0～99之整數， B5'為下述式9-1所表示之任一結構，曲線處分別表示與Q9'及Q10'之鍵結鍵，式9-1：

[化95]

式9-1中，具有***環之基中之取代係該***環之1位及3位之氮原子之任一者。 q8'為0～10之整數， X1'為氫原子或固相載體， R4'為經選自由經第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基取代或未經取代之胺基、羧基、順丁烯二醯亞胺基、及芳烷氧基羰基所組成之群中之1或2個取代基取代的碳數2～10之烷基)

於本發明中，獲得作為合成中間物之下述式10所表示之化合物。式10：

[化96]

式10中， R7及R8分別獨立為羥基、第三丁氧基、苄氧基、-NH-R10、或-NH-Q12-(P12-Q12')_q10 -T4-L4， P12及T4分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q12及Q12'或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n2 -CH₂ CH₂ -，n2為0～99之整數， L4為糖配體， Y2為-O-(CH₂ )_m9 -NH-及-NH-CO-(CH₂ )_m10 -NH，m9、m10分別獨立為1～10之整數， q10為0～10之整數， R9為氫原子、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基、-CO-R10、-CO-(CH₂ CH₂ O)_n6 -CH₂ CH₂ -N₃ 、或-CO-Q13-B6-(Q14-P13)_q11 -X2，n6為0～99之整數， P13或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q13及Q14分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n7 -CH₂ CH₂ -，n7為0～99之整數， B6為下述式10-1所表示之任一結構，曲線處分別表示與Q13及Q14之鍵結鍵，式10-1：

[化97]

式10-1中，具有***環之基中之取代係該***環之1位及3位之氮原子之任一者。 q11為0～10之整數， X2為氫原子或固相載體， R10為經選自由經第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基取代或未經取代之胺基、羧基、順丁烯二醯亞胺基、及芳烷氧基羰基所組成之群中之1或2個取代基取代的碳數2～10之烷基)

以下，關於本發明，例示製造方法之一例。再者，於以下之製造方法1～製造方法17之相關記載中，於本發明之核酸衍生物等中之式1～式12所表示之化合物中，表示基之符號有採用相同符號者，但應將兩者分開理解，本發明不受製造方法1～製造方法12所記載之基之説明之限定性解釋。又，關於本發明中之核酸衍生物，表示寡核苷酸之X於製造方法1～製造方法17中記載為-O-X。

製造方法1 本發明中之核酸衍生物作為具有式(I')所表示之部分結構之化合物之製造方法，可例示其製造方法。

[化98]

(式中，P1為Fmoc等能夠藉由鹼而去保護之保護基，DMTr表示p,p'-二甲氧基三苯甲基，R表示糖配體-拴繫單元，R'表示R中之糖配體之各羥基經乙醯基等能夠藉由鹼而去保護之保護基保護之基，聚合物表示固相載體，Q'為-CO-)

步驟1 化合物(I-B)可藉由使化合物(I-A)與p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷於吡啶等溶劑中，視需要於共溶劑之存在下，於0℃與100℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時而製造。作為共溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二***、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、吡啶、水等，該等可單獨或混合使用。

步驟2 化合物(I-C)可藉由使化合物(I-B)於無溶劑之條件下或於溶劑中，於1～1000當量之二級胺存在下，於室溫與200℃之間之溫度下，反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二***、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、吡啶、水等，該等可單獨或混合使用。作為二級胺，例如可列舉：二乙胺、哌啶等。

步驟3 化合物(1-E)可藉由使化合物(I-C)與化合物(I-D)於無溶劑之條件下或於溶劑中，於1～30當量之鹼、縮合劑及視需要0.01～30當量之添加劑之存在下，於室溫與200℃之間之溫度下，反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，可列舉步驟2中所例示者。作為鹼，例如可列舉：碳酸銫、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基𠰌啉、吡啶、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)等。作為縮合劑，例如可列舉：1,3-二環己烷碳二醯亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺・鹽酸鹽(EDC)、羰基二咪唑、六氟磷酸苯并***-1-基氧基三(二甲基胺基)鏻、六氟磷酸(苯并***-1-基氧基)三吡咯啶基鏻、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(HATU)、六氟磷酸O-(苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(HBTU)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓等。作為添加劑，例如可列舉：1-羥基苯并***(HOBt)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)等。化合物(I-D)可藉由公知方法(例如參照《美國化學會誌》，第136卷，第16958頁，(2014))或依據其之方法獲得。

步驟4 化合物(I-F)可藉由使化合物(I-E)與琥珀酸酐於溶劑中，於1～30當量之鹼存在下，於室溫與200℃之間之溫度下，反應5分鐘～100小時而製造。

作為溶劑，可列舉步驟2中所例示者。

作為鹼，可列舉步驟3中所例示者。

步驟5 化合物(I-G)可藉由使化合物(I-F)與末端經胺基化之固相載體於無溶劑之條件下或於溶劑中，於1～30當量之鹼、縮合劑及視需要0.01～30當量之添加劑之存在下，於室溫與200℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時後，於乙酸酐/吡啶溶液中，於室溫與200℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，可列舉步驟2中所例示者。作為鹼、縮合劑及添加劑，分別可列舉步驟3中所例示者。作為經胺基化之固相載體，例如可列舉長鏈烷基胺細孔性玻璃(LCAA-CPG)等，該等可作為市售品獲得。

步驟6 具有式(I')所表示之糖配體-拴繫-分支單元之核酸複合體可藉由如下方式製造：使用化合物(I-G)，藉由公知之寡核苷酸化學合成法將對應之核苷酸鏈伸長後，進行自固相之脫離、保護基之去保護及精製。

作為公知之寡核苷酸化學合成法，可列舉：亞磷醯胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、CEM(Cation Exchange Membrane，陽離子交換膜)法(參照Nucleic Acids Research，35，3287(2007))等，例如可藉由ABI3900高通量核酸合成儀(Applied Biosystems公司製造)合成。

自固相之脫離、去保護可藉由於寡核苷酸化學合成後，於溶劑中或無溶劑條件下，於-80℃至200℃之間之溫度下，利用鹼處理10秒至72小時而進行。

作為鹼，例如可列舉：氨、甲基胺、二甲胺、乙基胺、二乙胺、異丙胺、二異丙胺、哌啶、三乙胺、乙二胺、1,8-二氮雜環雙[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、碳酸鉀等。

作為溶劑，可列舉：水、甲醇、乙醇、THF等。

寡核苷酸之精製可藉由利用C18逆相管柱或陰離子交換管柱之方法、較佳為組合上述2種方法而進行。精製後之核酸複合體純度較理想為90%以上，較佳為95%以上。

又，於上述步驟3中，視需要亦可藉由將化合物(I-D)分成兩個單元，分2個階段與化合物(I-C)縮合而進行。具體而言，例如於R-Q'為R-NH-CO-Q4'-CO-之情形(Q4'為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基)時，於步驟3中，藉由與步驟3相同之方法使化合物(I-C)與CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)縮合，將所獲得之化合物之乙酯於乙醇或水等溶劑中利用氫氧化鋰等鹼進行水解後，進而與R'-NH₂ (R'與上述含義相同)縮合，藉此可獲得目標化合物。再者，CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)及R'-NH₂ (R'與上述含義相同)可藉由公知方法(例如參照《美國化學會誌》，第136卷，第16958頁(2014))或依據其之方法獲得。此處，於Q4'中，經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基中之取代基及伸烷基部分與上述相同。

例示了Q為-CO-之情形，但關於Q並非-CO-之情形時之化合物，亦可藉由適當變更Q之結構，藉由與上述相同之方法、公知方法或該等方法之組合、適當變更反應條件而製備。

製造方法2 本發明中之核酸衍生物作為具有式(II')所表示之部分結構之化合物之製造方法，可例示其製造方法。

[化99]

(式中，DMTr、R、R'、X、Q'及聚合物與上述含義相同。TBDMS表示第三丁基二甲基矽烷基，Fmoc表示9-茀基甲氧基羰基)

步驟7 化合物(II-A)可藉由使化合物(I-A)、第三丁基二甲基氯矽烷及二甲胺基吡啶於N,N-二甲基甲醯胺(DMF)等溶劑中，較佳為於2當量之鹼基之存在下，於0℃～100℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時而製造。作為鹼，可列舉製造方法1之步驟3中所例示者。

步驟8 化合物(II-B)可使用化合物(II-A)，於與製造方法1之步驟1相同之條件下製造。

步驟9 化合物(II-C)可藉由使化合物(II-B)與氟化正四丁基銨(TBAF)於溶劑中，於室溫與200℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，可列舉步驟2中所例示者。

步驟10 化合物(II-D)可使用化合物(II-C)，於與製造方法1之步驟2相同之條件下製造。

步驟11 化合物(II-E)可使用化合物(II-D)及化合物(I-D)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。

步驟12～14 化合物(II')可使用化合物(II-E)，於與製造方法1之步驟4～步驟6相同之條件下製造。

又，於上述步驟11中，視需要亦可藉由將化合物(I-D)分成兩個單元，分2個階段與化合物(II-C)縮合而進行。具體而言，例如於R-Q'為-NH-CO-Q4'-CO-之情形(Q4'為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基)時，於步驟11中，藉由與步驟11相同之方法使化合物(II-C)與CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)縮合，將所獲得之化合物之乙酯於乙醇或水等溶劑中利用氫氧化鋰等鹼進行水解後，進而與R'-NH₂ (R'與上述含義相同)縮合，藉此可獲得目標化合物。再者，CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)及R'-NH₂ (R'與上述含義相同)可藉由公知方法(例如參照《美國化學會誌》，第136卷，第16958頁(2014))或依據其之方法獲得。

製造方法3 本發明中之核酸衍生物作為具有式(III')所表示之部分結構之化合物之製造方法，可例示其製造方法。

[化100]

(式中，DMTr、Fmoc、R、R'、Q'、X及聚合物與上述含義相同)

化合物(III')可使用化合物(III-A)，於與製造方法1之步驟1至步驟6相同之條件下製造。再者，化合物(III-A)可作為市售品獲得。

步驟15 化合物(III-B)可使用化合物(III-A)，於與製造法1之步驟1相同之條件下製造。化合物(III-A)可作為市售品購入。

步驟16 化合物(III-C)可使用化合物(III-B)，於與製造法1之步驟2相同之條件下製造。

步驟17 化合物(III-E)可使用化合物(III-C)，於與製造法1之步驟3相同之條件下製造。

步驟18～20 化合物(III')可使用化合物(III-E)，於與製造方法1之步驟4～步驟6相同之條件下製造。

又，於上述步驟17中，視需要亦可藉由將化合物(I-D)分成兩個單元，分2個階段與化合物(III-C)縮合而進行。具體而言，例如於R-Q'為-NH-CO-Q4'-CO-之情形(Q4'為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基)時，於步驟17中，藉由與步驟17相同之方法使化合物(III-C)與CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)縮合，將所獲得之化合物之乙酯於乙醇或水等溶劑中利用氫氧化鋰等鹼進行水解後，進而與R'-NH₂ (R'與上述含義相同)縮合，藉此可獲得目標化合物。再者，CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)及R'-NH₂ (R'與上述含義相同)可藉由公知方法(例如參照《美國化學會誌》，第136卷，第16958頁(2014))或依據其之方法獲得。

製造方法4 本發明中之核酸衍生物作為具有式(IV')所表示之部分結構之化合物之製造方法，可例示其製造方法。

[化101]

(式中，DMTr、Fmoc、R、R'、Q'、X及聚合物與上述含義相同)

化合物(IV')可使用化合物(IV-A)，於與製造方法1之步驟1至步驟6相同之條件下製造。再者，化合物(IV-A)可作為市售品獲得。

又，於上述步驟23中，視需要亦可藉由將化合物(I-D)分成兩個單元，分2個階段與化合物(IV-C)縮合而進行。具體而言，例如於R'-Q'為-NH-CO-Q4'-CO-之情形(Q4'為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基)時，於步驟23中，藉由與步驟23相同之方法使化合物(IV-C)與CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)縮合，將所獲得之化合物之乙酯於乙醇或水等溶劑中利用氫氧化鋰等鹼進行水解後，進而與R'-NH₂ (R'與上述含義相同)縮合，藉此可獲得目標化合物。再者，CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)及R'-NH₂ (R'與上述含義相同)可藉由公知方法(例如參照《美國化學會誌》，第136卷，第16958頁(2014))或依據其之方法獲得。

製造方法5 本發明中之核酸衍生物作為具有式(V')所表示之部分結構之化合物之製造方法，可例示其製造方法。

[化102]

(式中，DMTr、R、R'、X、Q'、TBDMS、Fmoc及聚合物與上述含義相同)

化合物(V')可使用化合物(IV-A)，於與製造方法2之步驟1至步驟7相同之條件下製造。再者，化合物(IV-A)可作為市售品獲得。

又，於上述步驟31中，視需要亦可藉由將化合物(I-D)分成兩個單元，分2個階段與化合物(V-D)縮合而進行。具體而言，例如於R'-Q'為-NH-CO-Q4'-CO-之情形(Q4'為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基)時，於步驟31中，藉由與步驟31相同之方法使化合物(V-D)與CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)縮合，將所獲得之化合物之乙酯於乙醇或水等溶劑中利用氫氧化鋰等鹼進行水解後，進而與R'-NH₂ (R'與上述含義相同)縮合，藉此可獲得目標化合物。再者，CH₃ CH₂ -O-CO-Q4'-CO-OH(Q4'與上述含義相同)及R'-NH₂ (R'與上述含義相同)可藉由公知方法(例如參照《美國化學會誌》，第136卷，第16958頁(2014))或依據其之方法獲得。

例示了Q為-CO-之情形，但關於Q並非-CO-之情形時之化合物，亦可藉由適當變更Q-OH之結構，藉由與上述相同之方法、公知方法或該等方法之組合、適當變更反應條件而製備。

製造方法6 以下例示於寡核苷酸之5'末端鍵結有糖配體-拴繫-分支單元之本發明之核酸複合體之製造方法。

[化103](式中，R、R'、Q'、DMTr及X與上述含義相同)

步驟35 化合物(I-H)可藉由使化合物(II-E)與2-氰基乙基-N,N,N',N'-四異丙基亞磷醯胺於無溶劑之條件下或於溶劑中，於鹼及反應促進劑共存下，於室溫與200℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，可列舉製造方法1之步驟2中所例示者。作為鹼，可列舉製造方法1之步驟3中所例示者。作為反應促進劑，例如可列舉：1H-四唑、4,5-二氰基咪唑、5-乙基硫代四唑、5-苄基硫代四唑等，可作為市售品購入。

步驟36 將寡核苷酸鏈伸長，最後使用化合物(I-H)，利用糖配體-拴繫-分支單元修飾寡核苷酸之5'末端後，進行自固相之脫離、保護基之去保護及精製，藉此可製造化合物(I'')。此處，自固相之脫離、保護基之去保護及精製分別可藉由與製造方法1之步驟7相同之方式進行。

製造方法7 以下例示於寡核苷酸之5'末端鍵結有糖配體-拴繫-分支單元之本發明之核酸複合體之製造方法。

可於與製造方法6之步驟35及36相同之條件下製造。

[化104]

(式中，R、R'、Q'、DMTr及X與上述含義相同)

製造方法8 以下例示於寡核苷酸之5'末端鍵結有糖配體-拴繫-分支單元之本發明之核酸複合體之製造方法。

可於與製造方法6之步驟35及36相同之條件下製造。

[化105]

(式中，R、R'、Q'、DMTr及X與上述含義相同)

製造方法9 以下例示於寡核苷酸之5'末端鍵結有糖配體-拴繫-分支單元之本發明之核酸複合體之製造方法。

可於與製造方法6之步驟35及36相同之條件下製造。

[化106]

(式中，R、R'、Q'、DMTr及X與上述含義相同)

製造方法10 以下例示於寡核苷酸之5'末端鍵結有糖配體-拴繫-分支單元之本發明之核酸複合體之製造方法。

可於與製造方法6之步驟35及36相同之條件下製造。

[化107]

(式中，R、R'、Q'、DMTr及X與上述含義相同)

製造方法11 使於構成雙股核酸之正義股之3末端'或5'末端具有糖配體-拴繫-分支單元之正義股、與構成雙股核酸之反義股分別溶解於水或適宜之緩衝液中，加以混合，藉此可獲得具有雙股核酸之核酸複合體。作為緩衝液，例如可列舉：乙酸緩衝液、Tris緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、水等，該等可單獨或混合使用。

作為正義股與反義股之混合比，相對於正義股1當量，反義股較佳為0.5～2當量，更佳為0.9～1.1當量，進而較佳為0.95當量～1.05當量。

又，將該正義股與該反義股加以混合後，可適當進行退火處理。退火處理可藉由將正義股與反義股之混合物加熱至較佳為50～100℃、更佳為60～100℃、進而較佳為80～100℃後，緩慢冷卻至室溫而進行。

反義股可依據上述公知寡核苷酸合成法獲得。

製造方法12 本發明中之核酸衍生物作為具有式(VI')所表示之部分結構之化合物之製造方法，可例示其製造方法。

[化108]

(式中，DMTr、R、R'、X、Q'、聚合物及Fmoc與上述含義相同，TBS表示第三丁基二甲基矽烷基，R0及Rx相同或不同，表示氫原子、C1～C10之伸烷基或C3-C8之伸環烷基，W為C1～C10之伸烷基、C3-C8之伸環烷基，或者可與R0一起形成C4-C8之含氮雜環)

步驟45 化合物(VI-B)可使用化合物(VI-A)，於與製造方法1之步驟1相同之條件下製造。化合物(VI-A)可作為市售品獲得，或藉由公知方法(例如《生物有機化學與醫藥化學通訊》(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters)，第11卷，第383-386頁)或依據其之方法獲得。

步驟46 化合物(VI-C)可使用化合物(VI-B)，於與製造方法1之步驟2相同之條件下製造。

步驟47 化合物(VI-D)可使用化合物(VI-C)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。

步驟48 化合物(VI-E)可使用化合物(VI-D)，於與製造方法1之步驟2相同之條件下製造。

步驟49 化合物(VI-G)可使用化合物(VI-E)與化合物(VI-F)，於與製造方法1之步驟3相同之條件下製造。

步驟50 化合物(VI-H)可使用化合物(VI-G)，於與製造方法2之步驟9相同之條件下製造。

步驟51～53 化合物(VI')可使用化合物(VI-H)、化合物(VI-I)及化合物(VI-J)，於與製造方法1之步驟4～6相同之條件下製造。

步驟45～53亦可藉由公知方法(例如國際公開第2015/105083號記載之方法)或依據其之方法實施。化合物(VI-F)可藉由公知方法(例如《美國化學會誌》，136卷，第16958頁，2014年記載之方法)或依據其之方法獲得。

製造方法13 可藉由以下之方法製造式2中P1及P4為-NH-CO-、-O-CO-或-S-CO-之糖配體-拴繫單元。

[化109]

(式中，Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、P2、P3、P5、P6、P7、T1、T2、L1、L2、q1、q2、q3及q4分別與上述含義相同，q2'表示比q2小1之整數，q4'表示比q4小1之整數，P1'及P4'分別獨立地表示-NH-CO-、-O-CO-或-S-CO-，Z表示H、OH、NH₂ 、SH、氯原子、溴原子、碘原子、甲磺醯氧基、對甲苯磺醯氧基或羧酸，B1'及B2'表示下述式之結構體中之任一者，PG1、PG2、PG3、PG4、PG5、PG6及PG7分別表示適宜之保護基) 式：

[化110]

m1、m2、m3或m4分別獨立地表示0～10之整數。

步驟54 化合物(VII-C)可藉由使化合物(VII-A)與化合物(VII-B)於四氫呋喃等溶劑中，添加三苯膦聚合物擔載體，於冰浴冷卻下，與偶氮二甲酸二異丙酯甲苯溶液反應而製造。作為溶劑，可列舉製造步驟1之步驟2中所例示者。化合物(VII-A)可作為市售品獲得。

步驟55 化合物(VII-D)可藉由使用化合物(VII-C)，於甲醇等溶劑中，於冰浴冷卻下，於鹼之存在下反應而製造。作為溶劑，可列舉製造步驟1之步驟2中所例示者。作為鹼，可列舉製造步驟1之步驟3中所例示者。

步驟56 化合物(VII-F)可使用化合物(VII-D)及化合物(VII-E)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟57 化合物(VII-H)可使用化合物(VII-F)及化合物(VII-G)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟58 化合物(VII-J)可使用化合物(VII-H)及化合物(VII-I)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。又，藉由反覆進行DP步驟與步驟58，可製造具有理想之q1值之化合物(VII-J)。

步驟59 化合物(VII-L)可使用化合物(VII-J)及化合物(VII-K)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟60 化合物(VII-N)可使用化合物(VII-L)及化合物(VII-M)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟61～63 化合物(VII')可使用化合物(VII-O)、化合物(VII-P)及化合物(VII-Q)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。又，藉由反覆進行DP步驟與步驟61，可製造具有理想之q3值之化合物(VII')。

步驟DP 可藉由適當採用有機合成化學中常用之方法[例如《有機合成中之保護基》第3版，T.W.Greene著，John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等中記載之方法等]而製造。化合物(VII-B)、化合物(VII-E)、化合物(VII-G)、化合物(VII-I)、化合物(VII-K)、化合物(VII-M)、化合物(VII-O)、化合物(VII-P)及化合物(VII-Q)可作為市售品獲得，或者藉由「實驗化學講座第4版有機合成，p.258，丸善(1992年)」、「March高等有機化學：反應、機理與結構(March's Advanced Organic Chemistry : Reactions, Mechanisms, and Structure)第7版」中記載之方法之組合或依據其之方法獲得。

製造方法14 可藉由以下之方法製造式4中P7為-O-之單元。

[化111]

(式中，Q5、P7、q5分別與上述含義相同，q5''表示比q5小2之整數，q5'表示比q5小1之整數，Z2表示H、OH、NH₂ 或SH，PG8及PG9分別表示適宜之保護基，LC表示糖配體-拴繫單元，E表示羧酸或順丁烯二醯亞胺)

步驟64 化合物(VIII-C)可使用化合物(VIII-A)及化合物(VIII-B)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。又，藉由反覆進行DP步驟與步驟64，可製造具有理想之q5''值之化合物(VIII-C)。化合物(VIII-B)可作為市售品獲得，或者藉由「實驗化學講座第4版有機合成，p.258，丸善(1992年)」、「March高等有機化學：反應、機理與結構第7版」中記載之方法之組合或依據其之方法獲得。

步驟65 化合物(VIII')可使用化合物(VIII-C)及化合物(VIII-D)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。化合物(VIII-D)可作為市售品獲得，或者藉由「實驗化學講座第4版有機合成，p.258，丸善(1992年)」、「March高等有機化學：反應、機理與結構第7版」中記載之方法之組合或依據其之方法獲得。

步驟DP 可藉由適當採用有機合成化學中常用之方法[例如《有機合成中之保護基》第3版，T.W.Greene著，John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等中記載之方法等]而製造。

製造方法15 可藉由以下之方法製造式2中P1及P4為-O-之糖配體-拴繫單元。

[化112]

(式中，Q1、Q2、Q3、Q4、P2、P3、P5、P6、T1、T2、L1、L2、q1、q2、q3、q4、q2'、q4'、Z、B1'、B2'分別與上述含義相同，PG10、PG11、PG12、PG13、PG14及PG15分別表示適宜之保護基) 式：

[化113]

m1、m2、m3及m4與上述含義相同。

步驟66 化合物(IX-C)可藉由使化合物(IX-A)與化合物(IX-B)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺等溶劑中，添加碳酸氫鉀等鹼，於室溫～200℃下反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，可列舉製造步驟1之步驟2中所例示者。作為鹼，可列舉製造步驟1之步驟3中所例示者。

步驟67 化合物(IX-E)可藉由使化合物(IX-C)與化合物(IX-D)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺等溶劑中，添加碳酸氫鉀等鹼，於室溫～200℃下反應5分鐘～100小時而製造。作為溶劑，可列舉製造步驟1之步驟2中所例示者。作為鹼，可列舉製造步驟1之步驟3中所例示者。化合物(IX-A)可作為市售品獲得。

步驟68 化合物(IX-G)可使用化合物(IX-E)及化合物(IX-F)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟69 化合物(IX-I)可使用化合物(IX-G)及化合物(IX-H)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。又，藉由反覆進行DP步驟與步驟69，可製造具有理想之q1值之化合物(VII-J)。

步驟70 化合物(IX-K)可使用化合物(IX-I)及化合物(IX-J)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟71 化合物(IX-M)可使用化合物(IX-K)及化合物(IX-L)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。

步驟72-74 化合物(IX')可使用化合物(IX-M)、化合物(IX-N)、化合物(IX-O)及化合物(IX-P)，於與製造步驟1之步驟3相同之條件下製造。又，藉由反覆進行DP步驟與步驟72，可製造具有理想之q3值之化合物(IX')。

化合物(IX'-B)、化合物(IX'-D)、化合物(IX'-F)、化合物(IX'-H)、化合物(IX'-J)、化合物(IX'-L)、化合物(IX'-N)、化合物(IX'-O)及化合物(IX'-P)可作為市售品獲得，或者藉由「實驗化學講座第4版有機合成，p.258，丸善(1992年)」、「March高等有機化學：反應、機理與結構第7版」中記載之方法之組合或依據其之方法獲得。

製造方法16 作為式1～式8之核酸複合體之製造方法，亦可採用以下之方法。

[化114]

(式中，LC、Q5、Q6、Q7、P7、P8、q5'、q6及X與上述含義相同)

步驟75 化合物(X-B)可藉由使化合物(XIII'')與化合物(X-A)於溶劑中，於0℃～100℃下反應10秒～100小時而製造。作為溶劑，可列舉：水、磷酸緩衝液、乙酸鈉緩衝液、二甲基亞碸等，該等可單獨或混合使用。化合物(VIII')可藉由採用製造法14獲得。

化合物(X-A)可藉由公知方法(例如《生物共軛化學》(Bioconjugate Chemistry)，第21卷，第187-202頁，2010年或者Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，2010年，9月；CHAPTER：Unit 4.41)或依據其之方法獲得。

步驟76 化合物(X')可藉由使用化合物(X-B)，於碳酸鈉水溶液或氨水中等pH值8以上之條件下，於室溫與200℃之間之溫度下反應5分鐘～100小時而製造。

製造方法17 作為式1～式8之核酸複合體之製造方法，亦可採用以下之方法。

[化115]

(式中，LC、Q5、Q6、Q7、P7、P8、q5'、q6及X與上述含義相同)

步驟77 化合物(XI-A)可使用化合物(VIII'')，藉由公知方法(例如《生物共軛化學》，第26卷，第1451-1455頁，2015年記載之方法)或依據其之方法獲得。化合物(VIII''')藉由採用製造法14獲得。

步驟78 化合物(XI')可使用化合物(XI-A)與化合物(XI-B)，藉由公知方法(例如《生物共軛化學》，第26卷，第1451-1455頁，2015年記載之方法)或依據其之方法獲得。化合物(XI-B)可藉由《生物共軛化學》，第26卷，第1451-1455頁，2015年記載之方法或依據其之方法獲得。

步驟79 又，作為其他方法，化合物(XI')可藉由公知方法(例如參照《生物共軛化學》，第22卷，第1723-1728頁，2011年)或依據其之方法，由化合物(XI-A)直接獲得。

本說明書中之核酸複合體亦可例如以酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽之形式而獲得。

作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽，乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽等有機酸鹽；作為金屬鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽，例如可列舉：銨、四甲基銨等鹽；作為有機胺加成鹽，例如可列舉：𠰌啉、哌啶等加成鹽，作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、***酸等加成鹽。

於欲製備本說明書之核酸複合體之鹽之情形時，於該複合體係以所需鹽之形態獲得時直接進行精製即可，又，於以游離之形態獲得時使該複合體溶解或懸浮於適宜溶劑，添加對應之酸或鹼，進行單離、精製即可。又，於將形成該複合體鹽之抗衡離子替換為不同之抗衡離子時，使該複合體鹽溶解或懸浮於適宜溶劑後，添加數當量～遠過量之酸、鹼及/或鹽(氯化鈉、氯化銨等無機鹽等)，進行單離、精製即可。

本說明書之核酸複合體中亦有可能存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等，所有可能之異構物及該等之混合物均包含於本發明中。

又，本說明書之核酸複合體有時亦會以與水或各種溶劑之加成物之形態存在，該等加成物亦包含於本發明中。

進而，本發明之核酸複合體亦包括分子中之一部分或全部原子經質量數不同之原子(同位素)(例如氘原子等)取代者。

本發明之醫藥組合物包含式1所表示之核酸複合體。本發明之核酸複合體藉由具有L1及L2之糖配體，而被靶細胞識別並導入細胞內。本發明之核酸複合體藉由對哺乳動物進行投予而使生物體內靶基因之表現降低或停止而抑制靶基因表現，從而可用於治療靶基因相關疾病。於使用本發明之核酸複合體作為治療劑或預防劑之情形時，作為投予路徑，較理想為採用對於治療最有效之投予路徑，並無特別限定，例如可列舉：靜脈內投予、皮下投予及肌內投予等，較佳為皮下投予。投予量根據投予對象之病狀或年齡、投予路徑等而異，例如以換算為雙股寡核苷酸之1日投予量成為0.1 μg～1000 mg之方式投予即可，更佳為以1日投予量成為1～100 mg之方式投予。

作為適於靜脈內投予或肌內投予之製劑，例如可列舉注射劑，可將所製備之液劑直接以例如注射劑等形態使用，亦可藉由例如過濾、離心分離等自該液劑去除溶劑後再使用，將該液劑冷凍乾燥後再使用，及/或將添加有例如甘露醇、乳糖、海藻糖(trehalose)、麥芽糖或甘胺酸等賦形劑之液劑冷凍乾燥後再使用。於注射劑之情形時，較佳為對液劑或者去除溶劑或冷凍乾燥之組合物混合例如水、酸、鹼、各種緩衝液、生理鹽水或胺基酸輸液等而製備注射劑。又，亦可添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱胺酸或EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，四乙酸乙二胺)等之抗氧化劑、或者甘油、葡萄糖或氯化鈉等之等張劑等而製備注射劑。又，亦可添加例如甘油等之冷凍保存劑而冷凍保存。

藉由對哺乳動物之細胞投予本發明之組合物，可將本發明之組合物中之雙股核酸導入至細胞內。

關於本發明之核酸複合體於體內向哺乳動物之細胞之導入方法，只要依據可於體內進行之公知之轉染程序進行即可。藉由對包括人在內之哺乳動物靜脈內投予本發明之組合物，可向肝臟傳遞，而將本發明之組合物中之雙股核酸導入至肝臟或肝細胞內。

如於肝臟或肝細胞內導入本發明之組合物中之雙股核酸，則可使該肝細胞內之CFB基因之表現降低，而治療或預防由補體第二途徑之異常所介導之損傷。作為CFB相關疾病，可列舉：非典型溶血性***症候群(aHUS)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、老年性黃斑變性症(AMD)、膜性增生性絲球體腎炎(MPGN)、C3腎炎、膜性腎病、哮喘、自體免疫疾病(例如、全身性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、視神經脊髓炎、重症肌無力症等)等。投予對象為哺乳動物，較佳為人。

投予量根據投予對象之病狀或年齡、投予路徑等而異，例如以換算為雙股核酸之1日投予量成為0.1 μg～1000 mg之方式投予即可，較佳為以1日投予量成為1～100 mg之方式投予。

又，本發明提供：用於疾病治療之核酸複合體；用於疾病治療之醫藥組合物；用於疾病治療之核酸複合體之用途；疾病治療用醫藥之製造中之核酸複合體之用途；用於製造疾病治療用醫藥之核酸複合體；包括對需要其之對象投予有效量之核酸複合體的疾病之治療或預防方法。 [實施例]

其次，藉由參考例、實施例及試驗例而具體地說明本發明。但本發明並不限定於該等實施例及試驗例。再者，實施例及參考例所示之質子核磁共振譜(¹ H NMR)係於270 MHz、300 MHz或400 MHz下所測得者，根據化合物及測定條件而存在未清楚觀測到交換性質子之情況。又，訊號之多重性之表示係使用通常所用者，br係broad，指外觀上為寬幅之訊號。 UPLC分析係採用以下之條件。流動相A：含0.1%甲酸之水溶液、B：乙腈溶液梯度：流動相B為10%～90%之線性梯度(3分鐘) 管柱：Waters公司製造之ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm、內徑2.1×50 mm) 流速：0.8 mL/min PDA檢測波長：254 nm(檢測範圍190～800 nm)

表X-1～表X-4中揭示參考例化合物。

[表5] 表X-1：化合物A1~A7

[表6] 接表X-1

[表7] 表X-2：化合物B1~B3

[表8] 表X-3：化合物C1~C17

[表9] 接表X-3

[表10] 接表X-3

[表11] 接表X-3

[表12] 接表X-3

[表13] 表X-4：化合物D1~D11

[表14] 接表X-4

參考例1

[化116]

化合物RE1-2之合成使藉由《美國化學會誌》，第136卷，第16958-16961頁，2014年記載之方法所合成之化合物RE1-1(0.8755 g，1.9567 mmol)溶解於四氫呋喃(10 mL)，將1,3-二環己烷碳二醯亞胺(DCC，0.4247 g，2.0584 mmol)與N-羥基琥胺(hydroxy suximide)(0.2412 g，2.0958 mmol)於室溫下攪拌一晩。去除自反應混合物析出之固體，於減壓下，蒸餾去除溶劑。使所獲得之混合物溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(DMF)，添加2-胺基乙基順丁烯二醯亞胺氫溴酸鹽(0.6479 g，2.5491 mmol)與二異丙基乙基胺(1.7 mL，9.7835 mmol)後，於室溫下攪拌一晩。於減壓下，將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由逆相管柱層析法(水/甲醇＝80/20)使之溶出，藉此獲得化合物RE1-2(0.8502 g，產率76%)。 ESI-MS m/z: 570 (M + H)⁺ ;¹ H-NMR (DMSO-D₆ ) δ: 1.45-1.56 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.97 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.00 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.18-3.19 (2H, m), 3.38-3.45 (3H, m), 3.64-3.71 (1H, m), 3.85-3.89 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.48 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.95-4.98 (1H, m), 5.21 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.81-7.87 (2H, m).

化合物RE1-4之合成步驟1 使化合物RE1-1(0.9602 g，2.1460 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，添加N-Boc-乙二胺(Sigma-Aldrich公司製造，0.6877 g，4.292 mmol)、二異丙基乙基胺(1.90 mL，10.87 mmol)、及六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(和光純藥工業公司製造，1.6437 g，4.3229 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。於反應液中添加水，利用氯仿進行2次萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物RE1-3之粗精製物。 ESI-MS m/z: 590 (M + H)⁺

步驟2 使化合物RE1-4之合成步驟1中所合成之化合物RE1-3(1.2654 g，2.1460 mmol)溶解於二氯甲烷(15 mL)，添加三氟乙酸(4 mL)，於室溫下攪拌一晩。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/甲醇＝80/20)使之溶出，藉此獲得化合物RE1-4(0.3879 g，產率37%)。 ESI-MS m/z: 490 (M + H)⁺ ;¹ H-NMR (DMSO-D₆ ) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).

參考例2

[化117]

參考例2步驟1 使(9H-茀-9-基)甲基((2R,3R)-1,3-二羥基丁烷-2-基)胺基甲酸酯(化合物RE2-1，Chem-Impex International, Inc公司製造，1.50 g，4.58 mmol)溶解於吡啶(20 mL)，於冰浴冷卻下，添加4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(東京化成工業公司製造，1.71 g，5.04 mmol)後，於室溫下攪拌2小時。將反應液冰浴冷卻，添加10%檸檬酸水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(己烷/乙酸乙酯＝90/10)精製殘渣，藉此獲得化合物RE2-2(1.07 g，產率37%)。 ESI-MS m/z: 630 (M + H)⁺

參考例2步驟2 使參考例2之步驟1中所合成之化合物RE2-2(1.07 g，1.699 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加哌啶(0.336 mL，3.40 mmol)並攪拌3小時。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由胺基矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，藉此獲得化合物RE2-3(0.59 g，產率85%)。 ESI-MS m/z: 408 (M + H)⁺

參考例3

[化118]

參考例3步驟1 使5-羥基間苯二甲酸二甲酯(化合物RE3-1，和光純藥工業公司製造，5.0443 g，24 mmol)溶解於四氫呋喃(和光純藥工業公司製造，25 mL)，添加2-(第三丁氧基羰基胺基)-1-乙醇(東京化成工業公司製造，4.0343 g，25.03 mmol)、及三苯膦聚合物擔載體(Sigma-Aldrich公司製造，6.61 g，25.2 mmol)後，於冰浴冷卻下，添加40%偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)甲苯溶液(東京化成工業公司製造，13.26 mL，25.2 mmol)，於室溫下攪拌一晩。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除濾液後，藉由胺基矽膠管柱層析法(己烷/乙酸乙酯＝95/5～80/20)精製殘渣，藉此獲得化合物RE3-2(5.3071 g，產率63%)。 ESI-MS m/z: 254 (M + H)⁺ ，作為脫Boc體被檢測出

參考例3步驟2 使參考例3步驟1中所合成之化合物RE3-2(5.3071 g，15.02 mmol)溶解於甲醇(25 mL)，於冰浴冷卻下，添加2 mol/L氫氧化鈉水溶液(和光純藥工業公司製造，13 mL)，於室溫下攪拌4小時。將反應液冰浴冷卻，添加10%檸檬酸水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物RE3-3。 ESI-MS m/z: 324 (M - H)^-

參考例3步驟3 使參考例3步驟2中所合成之化合物RE3-3(1.9296 g，5.93 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(70 mL)，添加N-1-(9H-茀-9-基甲氧基羰基)-乙二胺鹽酸鹽(3.3493 g，11.86mmol)、二異丙基乙基胺(5.18 mL，29.7 mmol)、及六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(4.5168 g，11.88 mmol)，於室溫下攪拌4小時。將反應液冰浴冷卻，添加10%檸檬酸水溶液，利用氯仿進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)精製殘渣，藉此獲得化合物RE3-4(3.4407 g，產率68%)。 ESI-MS m/z: 898 (M + HCOO)^-

參考例3步驟4 使參考例3步驟3中所合成之化合物RE3-4(1.6087 g，1.884 mmol)溶解於二氯甲烷(20 mL)，於冰浴冷卻下，添加三氟乙酸(5 mL，64.9 mmol)，於室溫下攪拌4小時。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物RE3-5(2.4079 g)。 ESI-MS m/z: 798(M + HCOO)^-

參考例3步驟5 使參考例3步驟4中所合成之化合物RE3-5(386 mg，0.512 mmol)溶解於四氫呋喃(10 mL)，於冰浴冷卻下，添加苯甲醯氯(175 mg，1.024 mmol)，於室溫下攪拌1小時。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)精製殘渣，藉此獲得化合物RE3-6(373 mg，產率82%)。 ESI-MS m/z: 888(M + H)⁺

參考例3步驟6 使參考例3步驟5中所合成之化合物RE3-6(108 mg，0.122 mmol)溶解於二氯甲烷(5 mL)，於室溫下添加二乙胺(0.5 mL，4.8 mmol)並攪拌1小時。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物RE3-7(54.9 mg)。 ESI-MS m/z: 444(M + H)⁺

參考例3步驟7 添加參考例3步驟6中所合成之化合物RE3-7(180 mg，0.406 mmol)、Nα,Nε-雙(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(Nova Biochem公司製造，295 mg，0.852 mmol)、二異丙基乙基胺(0.354 mL，2.029 mmol)、及六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(324 mg，0.852 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液冰浴冷卻，添加10%檸檬酸水溶液，利用氯仿進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由胺基矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)精製殘渣，藉此定量地獲得化合物RE3-8(450 mg)。 ESI-MS m/z: 1101(M + H)⁺

參考例3步驟8 使參考例3步驟7中所合成之化合物RE3-8(2.1558 g，1.9593 mmol)溶解於二氯甲烷(20 mL)，於冰浴冷卻下，添加三氟乙酸(5 mL)，於室溫下攪拌4小時。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物RE3-9。 ESI-MS m/z: 700(M + H)⁺

參考例4

[化119](圖中，Bn表示苄基)

參考例4步驟1 使藉由參考例3記載之方法所合成之化合物RE4-1(參考例3中之化合物RE3-5，0.5716 g，0.7582 mmol)、藉由《生物共軛化學》，第22卷，第690-699頁，2011年記載之方法所合成之十二酸單苄酯(0.4859 g，1.5164 mmol)、二異丙基乙基胺(0.662 mL，3.79 mmol)、及六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(0.5766 g，1.516 mmol)溶解於N,N二甲基甲醯胺(12 mL)，於室溫下攪拌1小時。將反應液冰浴冷卻，添加飽和檸檬酸水溶液，利用氯仿進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)精製殘渣，藉此獲得化合物RE4-2(0.88 g，產率84%)。 ESI-MS m/z: 1057(M + H)⁺

參考例4步驟2 使參考例4步驟1中所合成之化合物RE4-2(0.7545 g，0.714 mmol)溶解於二氯甲烷四氫呋喃(20 mL)，於室溫下添加二乙胺(5 mL，47.9 mmol)並徹夜攪拌。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物RE4-3。 ESI-MS m/z: 612(M + H)⁺

參考例4步驟3 添加參考例4步驟2中所合成之化合物RE4-3(0.437 g，0.7143 mmol)、Nα,Nε-雙(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(Nova Biochem公司製造，0.5483 g，1.583 mmol)、二異丙基乙基胺(0.624 mL，3.57 mmol)、六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(0.5703 g，1.5 mmol)，於室溫下攪拌2小時。於反應液中添加10%檸檬酸水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物RE4-4之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1269(M + H)⁺

參考例4步驟4 使參考例4步驟3中所合成之化合物RE4-4(0.906 g，0.7143 mmol)溶解於二氯甲烷(12 mL)，於冰浴冷卻下，添加三氟乙酸(3 mL，38.9 mmol)，於室溫下攪拌4小時。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物RE4-5之粗生成物。 ESI-MS m/z: 869(M + H)⁺

參考例5

[化120]

參考例5步驟1 使藉由參考例3記載之方法所合成之化合物RE5-1(參考例3中之RE3-8，100 mg，0.091 mmol)溶解於甲醇(3 mL)，添加乙酸(2 μL)後，進行利用鈀/碳之催化氫還原。將所獲得之溶液餾分於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此定量地獲得化合物RE5-2。 ESI-MS m/z: 967 (M + H)⁺

參考例5步驟2 使化合物RE5-2(50 mg，0.052 mmol)及N-(6-順丁烯二醯亞胺己醯氧基)琥胺(48 mg，0.155 mmol)溶解於四氫呋喃(2 mL)，添加二異丙基乙基胺(0.045 mL，0.259 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)精製殘渣，藉此獲得化合物RE5-3(18 mg，產率30%)。 ESI-MS m/z: 1160 (M + H)⁺

參考例5步驟3 使參考例5步驟2中所合成之化合物RE5-3(18 mg，0.016 mmol)溶解於二氯甲烷(2 mL)，於冰浴冷卻下，添加三氟乙酸(0.2 mL，2.6 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，利用二***進行晶析後，獲得作為白色固體之化合物RE5-4(7.5 mg，產率64%)。 ESI-MS m/z: 759 (M + H)⁺

參考例6

[化121]

參考例6步驟1 使用藉由參考例3記載之方法所合成之化合物RE6-1(參考例3中之化合物RE3-2，0.9372 g，2.8809 mmol)、β-丙胺酸甲酯鹽酸鹽(東京化成工業股份有限公司製造，0.8082 g，5.7902 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法定量地獲得化合物RE6-2。 ESI-MS m/z: 495 (M + H)⁺

參考例6步驟2 使用參考例6步驟1中所合成之化合物RE6-2(0.9622 g，1.952 mmol)，藉由與參考例3之步驟4相同之方法定量地獲得化合物RE6-3。 ESI-MS m/z: 396 (M + H)⁺

參考例6步驟3 使用參考例6步驟2中所合成之化合物RE6-3(0.1146 g，0.290 mmol)及N-丁二醯亞胺基15-疊氮基-4,7,10,13-四氧雜十五酸(N3-PEG4-NHS，東京化成工業股份有限公司製造，0.0750 g，0.1931 mmol)，藉由與參考例5之步驟2相同之方法定量地獲得化合物RE6-4。 ESI-MS m/z: 669 (M + H)⁺

參考例6步驟4 使用參考例6步驟3中所合成之化合物RE6-4(0.1291 g，0.193 mmol)，藉由與參考例3之步驟2相同之方法定量地獲得化合物RE6-5。 ESI-MS m/z: 641 (M + H)⁺

參考例6步驟5 使用參考例6步驟4中所合成之化合物RE6-5(0.1252 g，0.193 mmol)及L-麩胺酸二第三丁酯(渡邊化學股份有限公司製造，0.1180 g，0.399 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE6-6(0.0521 g，產率24%)。 ESI-MS m/z: 1124 (M + H)⁺

參考例6步驟6 使用參考例6步驟5中所合成之化合物RE6-6(0.0521 g，0.0464 mmol)，藉由與參考例3之步驟4相同之方法獲得化合物RE6-7(36 mg，產率86%)。 ESI-MS m/z: 899 (M + H)⁺

參考例7

[化122]

參考例7步驟1 使用藉由參考例3記載之方法所合成之化合物RE7-1(參考例3中之RE3-9，0.2586 g，0.3695 mmol)與藉由《美國化學會誌》，第136卷，第16958-16961頁，2014年記載之方法所合成之參考例1中記載之化合物RE-1(0.8559 g，1.7927 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE7-2(0.5272 g，產率61%)。 ESI-MS m/z: 2418 (M + H)⁺

參考例7步驟2 使用參考例7步驟1中所合成之化合物RE7-2(0.2653 g，0.1097 mmol)，藉由與參考例5之步驟1相同之方法獲得化合物RE7-3(0.1524 g，產率61%)。 ESI-MS m/z: 2284 (M + H)⁺

參考例8：化合物A1及B1之合成

[化123]

化合物A1之合成使用藉由參考例7記載之方法所合成之化合物RE8-1(參考例7中之化合物RE7-3，0.0152 g，0.006657 mmol)，藉由與參考例5之步驟2相同之方法獲得化合物A1(0.0077 g，產率47%)。 ESI-MS m/z: 1239(M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (DMSO-D₆ ) δ: 1.11-1.66 (34H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (10H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (14H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, brs), 8.01-8.08 (3H, brm), 8.54-8.60 (2H, brm).

化合物B1之合成使用化合物RE8-1(參考例7中之化合物RE7-3，0.0150 g，0.00657 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物B1(0.0062 g，產率37%)。 ESI-MS m/z: 1279(M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (DMSO-D₆ ) δ: 1.11-1.66 (30H, m), 1.77 (12H, s), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (8H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.33-2.38 (2H, m), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.58-3.63 (16H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, brs), 8.01-8.08 (3H, brm), 8.54-8.60 (2H, brm).

參考例9：化合物B2及B3之合成

[化124]

化合物B2之合成使用藉由參考例6記載之方法所合成之化合物RE9-1(參考例6中之化合物RE6-5，0.00436 g，0.00681 mmol)及參考例1之化合物RE1-4(0.010 g，0.020 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物B2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1584(M + H)⁺

化合物B3之合成使用藉由參考例6記載之方法所合成之化合物RE9-2(參考例6中之化合物RE6-7，0.0100 g，0.01112 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物B3(0.0223 g，產率72%)。 ESI-MS m/z: 1393(M + 2H)²⁺

參考例10：化合物C1及D1之合成

[化125]

參考例10步驟1 使用藉由參考例4記載之方法所合成之化合物RE10-1(參考例4中之化合物RE4-5，0.1952 g，0.225 mmol)與藉由《美國化學會誌》，第136卷，第16958-16961頁，2014年記載之方法所合成之參考例1之化合物RE1-1(0.4162 g，0.93 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE10-2(334.8 mg，產率58%)。 ESI-MS m/z: 1294 (M + 2H)²⁺

參考例10步驟2 使用參考例10步驟1中所合成之化合物RE10-2(0.1459 g，0.056 mmol)，藉由與參考例5之步驟1相同之方法獲得化合物D1(112 mg，產率80%)。 ESI-MS m/z: 1249 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (DMSO-D₆ ) δ: 1.11-1.66 (44H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.20 (12H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (10H, m), 3.58-3.64 (4H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, brs), 8.01-8.08 (3H, brm), 8.54-8.60 (2H, brm).

參考例10步驟3 使用參考例10步驟2中所合成之化合物D1(0.1091 g，0.044 mmol)及參考例2之化合物RE2-3(0.0748 g，0.184 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得作為粗生成物之化合物RE10-3。 ESI-MS m/z: 1292 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例10步驟4 使參考例10步驟3中所合成之化合物RE10-3(0.161 g，0.05586 mmol)溶解於二氯甲烷(5 mL)，添加琥珀酸酐(東京化成工業公司製造，0.1182 g，1.181 mmol)、N,N-二甲基胺基吡啶(0.0224 g，0.183 mmol)、及三乙胺(0.55 mL，3.95 mmol)，於室溫下攪拌一晩。將反應液冰浴冷卻，添加水，利用乙酸乙酯進行2次萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物RE10-4之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1342(M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例10步驟5 使參考例10步驟4中所合成之化合物RE10-4(0.0816 g，0.02734 mmol)、六氟磷酸O-(苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(0.0221 g，0.05827 mmol)、及二異丙基乙基胺(0.02 mL，0.1094 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(4 mL)，添加LCAΑ-CPG(Chem Gene公司製造，0.4882 g)，於室溫下徹夜攪拌。對混合物進行過濾分離，依序利用二氯甲烷、10%甲醇二氯甲烷溶液及二***洗淨後，使之與乙酸酐/吡啶溶液作用，藉此獲得化合物C1(49.5 μmol/g，產率89%)。再者，產率係對固相擔載體添加1%三氟乙酸/二氯甲烷溶液，根據可由源於DMTr基之吸收計算之向固相載體之導入率而算出。

參考例11

[化126]

藉由《醫藥化學雜誌》(Journal of Medicinal Chemistry)，第59卷，第2718-2733頁，2016年記載之方法，由化合物RE11-1(1.200 g，3.640 mmol)合成化合物RE11-2(1.050 g，產率50%)。 ESI-MS m/z: 582 (M + H)⁺

參考例12

[化127]

使化合物RE12-1(4.000 g，10.27 mmol)溶解於二氯甲烷(60 mL)，添加2-(2-羥基乙氧基)乙基胺基甲酸苄酯(2.700 g，11.30 mmol)及三氟甲磺酸(0.1360 mL，1.541 mmol)，於回流條件下徹夜攪拌。於反應液中添加10 wt%碳酸鉀水溶液，與二氯甲烷分液後，利用水洗淨有機相，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，向2-甲基四氫呋喃進行置換濃縮。將殘渣滴至庚烷中，過濾所獲得之結晶，而獲得化合物RE12-2(5.130 g，產率88%)。 ESI-MS m/z: 570 (M + H)⁺

參考例13

[化128]

使化合物RE13-1(參考例1中之化合物RE1-1，898.0 mg，2.007 mmol)溶解於二氯甲烷(15 mL)，添加1-羥基苯并***一水合物(338.0 mg，2.208 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(343 mg，2.208 mmol)、及N-1-Z-1,3-二胺基丙烷鹽酸鹽(0.4910 mL，2.208 mmol)，於室溫下攪拌3小時。於反應液中添加水，利用二氯甲烷分液後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，藉此獲得化合物RE13-2(873.0 mg，產率68%)。 ESI-MS m/z: 639 (M + H)⁺

參考例14

[化129]

參考例14步驟1 使化合物RE14-1(參考例1中之化合物RE1-1，3.00 g，6.70 mmol)溶解於二氯甲烷(60 mL)，於室溫下添加L-離胺酸苄酯二對甲苯磺酸鹽(1.75 g，3.02 mmol)、三乙胺(0.935 mL，6.70 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(1.29 g，6.70 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(103 mg，0.670 mmol)並攪拌2.5小時。利用水與飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨反應液，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，藉此定量地獲得化合物RE14-2。 ESI-MS m/z: 1096 (M + H)⁺

參考例14步驟2 使化合物RE14-2(2.30 g，2.10 mmol)溶解於四氫呋喃(46 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，424 mg)，於氫氣氛圍下徹夜攪拌。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此化合物定量地獲得RE14-3。 ESI-MS m/z: 1006 (M + H)⁺

參考例15

[化130]

參考例15步驟1 使亞胺基二乙酸(東京化成工業公司製造，1.5 g，6.43 mmol)溶解於二氯甲烷(30 mL)，添加五氟三氟乙酸(東京化成工業公司製造，2.75 mL，16.08 mmol)、三乙胺(4.48 mL，32.2 mmol)並攪拌4小時。於反應液中添加10%檸檬酸水溶液，利用氯仿進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於其中，使藉由參考例11記載之方法所合成之化合物RE15-1(參考例11中之化合物RE11-2，2 g，3.45 mmol)溶解於乙酸乙酯(10 mL)與乙腈(10 mL)之混合液，進行利用鈀/碳之催化氫還原。將所獲得之溶液部分於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物RE15-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1091(M + H)⁺

參考例15步驟2 使用化合物RE15-2(1.5 g，1.37 mmol)，藉由與參考例1化合物RE1-4之合成之步驟2相同之方法定量地獲得化合物RE15-3。 ESI-MS m/z: 990(M + H)⁺

參考例16

[化131]

參考例16步驟1 使用N-(第三丁氧基羰基)-L-麩胺酸(東京化成工業公司製造)，使用藉由參考例11記載之方法所合成之化合物RE16-1(1.855 g，3.19 mmol)，藉由與參考例15之步驟1相同之方法獲得化合物RE16-2之粗精製物。 ESI-MS m/z: 1105(M + H)⁺

參考例16步驟2 使用化合物RE16-2(1.421 g，1.2866 mmol)，藉由與參考例1化合物RE1-4之合成之步驟2相同之方法定量地獲得化合物RE16-3。 ESI-MS m/z: 1004(M + H)⁺

參考例17

[化132]

使藉由《有機化學》(Journal of Organic Chemistry)，第74卷，第6837-6842頁，2009年記載之方法所合成之化合物RE17-1(90 mg，0.173 mmol)溶解於四氫呋喃(1 mL)，添加三苯膦聚合物擔載體(Sigma-Aldrich公司製造，63 mg，0.189 mmol)，於加熱環流下攪拌3小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物RE17-2(70 mg，產率82%)。 ESI-MS m/z: 516 (M+Na)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): δ 0.89 (3H, s), 1.42-1.48 (2H, m), 1.52-1.61 (2H, m), 1.85 (1H, brs), 2.68 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.06-3.07 (2H, m), 3.39-3.44 (3H, m), 3.51-3.55 (3H, m), 3.78 (6H, s), 6.80-6.85 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.41-7.43 (2H, m).

參考例18

[化133]

參考例18步驟1 使用化合物RE18-1(東京化成工業公司製造，0.500 g，3.73 mmoL)，藉由與參考例2之步驟1相同之方法獲得化合物RE18-2之粗生成物(1.5 g)。 ESI-MS m/z: 435 (M-H)^-

參考例18步驟2 使用化合物RE18-2之粗生成物(1.5 g)與1,4-二胺基丁烷(1,4-Diaminobutane)(東京化成工業公司製造，3.29 g，37.3 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE18-3(0.18 g，兩階段產率10%)。 ESI-MS m/z: 551 (M + HCOO)^- ¹ H-NMR (400 MHz, MeOD) δ: 1.09 (3H, s), 1.45-1.52 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.91 (2H, s), 3.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.12-3.16 (4H, m), 3.24 (1H, s), 3.43 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.62-3.66 (7H, m), 6.71-6.76 (4H, m), 7.05-7.11 (1H, m), 7.12-7.20 (6H, m), 7.28-7.32 (2H, m).

參考例19

[化134]

使藉由《有機化學》，第74卷，第6837-6842頁，2009年記載之方法所合成之化合物RE19-1(110 mg，0.212 mmol)溶解於四氫呋喃(2 mL)，添加N-(1R,8S,9S)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基-1,8-二胺基-3,6-二氧辛烷(N-(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane)(東京化成工業公司製造，72 mg，0.222 mmol)，於室溫下攪拌1小時。於反應液中添加水，利用氯仿進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由胺基矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，藉此獲得化合物RE19-2(160 mg，產率90%)。 ESI-MS m/z: 845 (M + H)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ: 0.88 (3H, s), 0.91-1.09 (3H, m), 1.20-1.25 (1H, m), 1.52-1.59 (4H, m), 1.80-1.85 (2H, m), 2.19-2.25 (4H, m), 2.59-2.68 (1H, m), 2.84-2.90 (4H, m), 3.02-3.11 (3H, m), 3.35-3.44 (5H, m), 3.49-3.53 (5H, m), 3.54-3.58 (2H, m), 3.62 (5H, s), 3.78 (6H, s), 4.13 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.21 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.21 (1H, m), 7.24-7.27 (2H, m), 7.28-7.32 (4H, m), 7.39-7.44 (2H, m).

參考例20

[化135]

參考例20步驟1 使用化合物RE20-1(AstaTech公司製造，100 mg，1.148 mmol)及Fmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡邊化學工業公司製造，532 mg，1.205 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE20-2(410 mg，產率70%)。 ESI-MS m/z: 511 (M + H)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ: 0.06 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.76-2.85 (1H, m), 3.65-3.86 (5H, m), 4.02-4.23 (3H, m), 4.32-4.40 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.6 Hz).

參考例20步驟2 使用化合物RE20-2(410 mg，0.803 mmol)，藉由與參考例2之步驟1相同之方法獲得化合物RE20-3之粗生成物(680 mg)。 ESI-MS m/z: 814 (M + H)⁺

參考例20步驟3 使用化合物RE20-3之粗生成物(680 mg)，藉由與參考例2之步驟5相同之方法獲得化合物RE20-4(330 mg，兩階段產率70%)。 ESI-MS m/z: 519 (M + H)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ: 0.02-0.09 (6H, m), 0.89 (9H, d, J = 28.8 Hz), 2.84-2.94 (1H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.46 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.52-3.68 (2H, m), 3.75-3.80 (1H, m), 3.82 (6H, d, J = 2.4 Hz), 3.89-3.96 (1H, m), 4.05-4.17 (1H, m), 4.27-4.37 (1H, m), 6.82-6.89 (4H, m), 7.22-7.27 (1H, m), 7.29-7.34 (6H, m), 7.41-7.45 (2H, m)

參考例21

[化136]

參考例21步驟1 使N-(第三丁氧基羰基)-1,3-二胺基丙烷(東京化成工業公司製造，1.788 g，10.26 mmol)溶解於二氯甲烷(22.8 mL)，添加三乙胺(1.907 mL，13.68 mmol)，於室溫下攪拌15分鐘。於反應液中滴加藉由Organic Letter，第16卷，第6318-6321頁，2014年記載之方法所合成之化合物RE21-1(1.126 g，6.84 mmol)之二氯甲烷溶液(5 mL)，於室溫下攪拌2小時。於反應液中添加水，利用氯仿進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝35/65)精製殘渣，藉此獲得化合物RE21-2(1.65 g，產率80%)。 ESI-MS m/z: 303 (M + H)⁺

參考例21步驟2 使用化合物RE21-2(1.65 g，5.46 mmol)，藉由與參考例1化合物RE1-4之合成之步驟2相同之方法獲得化合物RE21-3(1.10 g，產率100%)。 ESI-MS m/z: 203 (M + H)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ: 1.74 (2H, dt, J = 12.0, 6.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.18 (1H, s), 3.60 (2H, td, J = 6.0, 5.2 Hz), 7.54 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.76 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.97 (1H, brs).

參考例22

[化137]

參考例22步驟1 使用化合物RE22-1(東京化成公司製造，1.2 g，4.24 mmol)，藉由與參考例2之步驟1相同之方法獲得化合物RE22-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 608(M+Na)⁺

參考例22步驟2 使用化合物RE22-2之粗生成物，藉由參考例2之步驟5或實施例1之步驟11記載之方法獲得化合物R22-3(1.34 g，兩階段產率52%)。 ESI-MS m/z: 386(M+Na)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ: 3.34 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 6.78-6.84 (4H, m), 7.17-7.21 (1H, m), 7.27-7.35 (6H, m), 7.42-7.46 (2H, m).

參考例22步驟3 使用化合物RE22-3(1.15 g，3.16 mmol)及Fmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡邊化學工業公司製造，1.677 g，3.8 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE22-4(560 mg，產率31%)。¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ: 0.00-0.07 (6H, m), 0.83-0.89 (9H, m), 3.18-3.26 (2H, m), 3.39-3.46 (2H, m), 3.61-3.68 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.89 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.15-4.20 (1H, m), 4.22-4.28 (1H, m), 4.32-4.40 (2H, m), 5.65-5.88 (1H, m), 6.76-6.85 (4H, m), 7.16-7.23 (1H, m), 7.25-7.34 (8H, m), 7.36-7.44 (4H, m), 7.50-7.64 (2H, m), 7.72-7.79 (2H, m).

參考例23 使用第Y-1表中記載之化合物RE23-1～RE23-5及Fmoc-Ser(tBuMe₂ Si)-OH，藉由與參考例22相同之方法獲得第Y-2表中記載之化合物RE23-6～RE23-10。使用參考例22之化合物RE22-3與Fmoc-Thr(tBuMe₂ Si)-OH，藉由與參考例22相同之方法獲得第Y-2表中記載之化合物RE23-11。使用第Y-1表中記載之化合物RE23-1與Fmoc-Thr(tBuMe₂ Si)-OH，藉由與參考例22相同之方法獲得第Y-2表中記載之化合物RE23-12。將藉由本實施例所合成之化合物之NMR分析資料示於第Y-3表。

[表15] 第Y-1表

[表16] 第Y-2表

[表17] 第Y-3表

參考例24

[化138]

使用藉由參考例22記載之方法所合成之化合物RE24-1(參考例22中之化合物RE22-4，2.487 g，3.16 mmol)，藉由與參考例2步驟2相同之方法獲得化合物RE24-2(1.2 g，產率67%)。 ESI-MS m/z: 587(M+Na)⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ):δ-0.01-0.07 (6H, m), 0.86-0.90 (9H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.41-3.48 (3H, m), 3.72 (1H, dd, J = 10.0, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.84 (1H, dd, J = 10.0, 4.8 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.40-7.44 (2H, m), 7.72-7.75 (1H, brm).

參考例25 使用第Y-2表中記載之化合物RE23-6～RE23-12，藉由與參考例24相同之方法獲得第Z-1表中記載之化合物RE25-1～RE25-7。將藉由本實施例所合成之化合物之質譜分析結果示於第Z-2表。

[表18] 第Z-1表

[表19]

參考例26

[化139]

參考例26步驟1 使化合物RE26-1(2.00 g，9.47 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(40 mL)，於室溫下添加亞胺基二乙酸二第三丁酯(5.11 g，20.84 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(4.00 g，20.84 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(145 mg，0.947 mmol)並攪拌2小時。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)精製殘渣。進而利用甲醇進行漿料精製，藉此獲得化合物RE26-2(4.07 g，產率65%)。 ESI-MS m/z: 664 (M - H)^-

參考例26步驟2 使化合物RE26-2(2.66 g，4.00 mmol)溶解於四氫呋喃(53 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，490 mg)，於氫氣氛圍下攪拌3小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉此獲得化合物RE26-3(2.86 g，產率113%)。 ESI-MS m/z: 634 (M - H)^-

參考例26步驟3 使化合物RE26-3(871.0 mg，1.370 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(17 mL)，添加六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-炔)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(625.0 mg，1.644 mmol)、二異丙基乙基胺(0.5730 mL，3.290 mmol)、及十二烷二酸單苄酯(527.0 mg，1.644 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝60/40)精製殘渣，藉此獲得化合物RE26-4(1.030 g，產率80%)。 ESI-MS m/z: 939 (M + H)⁺

參考例26步驟4 使化合物RE26-4(1.030 g，1.098 mmol)溶解於二氯甲烷(10 mL)，添加三氟乙酸(10.00 mL，130.0 mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物RE26-5之粗生成物。 ESI-MS m/z: 713 (M - H)^-

參考例27

[化140]

參考例27步驟1 使化合物RE27-1(2.000 g，12.98 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(30 mL)，添加碳酸氫鉀(1.559 g，15.57 mmol)及苄基氯(2.328 mL，19.47 mmol)，於室溫下攪拌4小時。於反應液中添加飽和氯化銨，利用二氯甲烷進行萃取後，利用水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)精製殘渣，藉此獲得化合物RE27-2(2.850 g，產率90%)。 ESI-MS m/z: 243 (M - H)^-

參考例27步驟2 使化合物RE27-2(2.500 g，10.24 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(30 mL)，添加碳酸鉀(5.660 g，40.90 mmol)及溴乙酸第三丁酯(3.300 mL，22.52 mmol)，於90℃下攪拌4小時。於反應液中添加飽和氯化銨，利用二氯甲烷進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝75/25)精製殘渣，藉此獲得化合物RE27-3(4.300 g，產率89%)。 ESI-MS m/z: 472 (M - H)^-

參考例27步驟3 使化合物RE27-3(1.000 g，2.116 mmol)溶解於二氯甲烷(10 mL)，添加三氟乙酸(10.00 mL，130.0 mmol)，於室溫下攪拌6小時。於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物RE27-4之粗生成物。 ESI-MS m/z: 359 (M - H)^-

參考例27步驟4 使化合物RE27-4(350.0 mg，0.9710 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(7 mL)，添加1-羥基苯并***一水合物(327.0 mg，2.137 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(410.0 mg，2.137 mmol)、及亞胺基二乙酸二第三丁酯(524.0 mg，2.137 mmol)，於室溫下攪拌5小時。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝60/40)精製殘渣，藉此獲得化合物RE27-5(617.0 mg，產率78%)。 ESI-MS m/z: 814 (M - H)^-

參考例27步驟5 使化合物RE27-5(610.0 mg，0.7490 mmol)溶解於二氯甲烷(6 mL)，添加三氟乙酸(6 mL，78.00 mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物RE27-6之粗生成物。 ESI-MS m/z: 590 (M + H)⁺

參考例28

[化141]

參考例28步驟1 使藉由參考例26記載之方法所合成之化合物RE28-1(參考例26中之化合物RE26-3，474 mg，0.744 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加藉由《醫藥化學雜誌》，第54卷，第2433-2446頁，2011年記載之方法所合成之反式-環己烷-1,4-二羧酸單苄酯(0.234 mg，0.893 mmol)、二異丙基乙基胺(0.312 mL，1.79 mmol)、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(339 mg，0.893 mmol)並攪拌6小時。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)精製殘渣，藉此獲得化合物RE28-2(448 mg，產率68%)。 ESI-MS m/z: 879 (M - H)^-

參考例28步驟2 使化合物RE28-2(341 mg，0.387 mmol)溶解於二氯甲烷(3.4 mL)，於室溫下添加三氟乙酸(3.4 mL)並徹夜攪拌。將反應液減壓濃縮，利用乙酸乙酯進行共沸，利用庚烷進行漿料精製，藉此獲得化合物RE28-3(254 mg，產率100%)。 ESI-MS m/z: 656 (M + H)⁺

參考例29

[化142]

參考例29步驟1 使化合物RE29-1(500 mg，2.75 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加亞胺基二乙酸二第三丁酯(1.48 g，6.04 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(1.16 g，6.04 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(42.0 mg，0.275 mmol)並攪拌4小時。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)精製殘渣，藉此獲得化合物RE29-2(329 mg，產率19%)。 ESI-MS m/z: 635 (M - H)^-

參考例29步驟2 使化合物RE29-2(323 mg，0.507 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(6v5 mL)，於室溫下添加碳酸鉀(84.0 mg，0.609 mmol)、溴乙酸苄酯(139 mg，0.609 mmol)並攪拌3小時。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)精製殘渣，藉此獲得化合物RE29-3(313 mg，產率79%)。 ESI-MS m/z: 783 (M - H)^-

參考例29步驟3 使化合物RE29-3(312 mg，0.398 mmol)溶解於二氯甲烷(3.1 mL)，於室溫下添加三氟乙酸(3.1 mL)並徹夜攪拌。將反應液減壓濃縮，利用乙酸乙酯進行共沸，藉此定量地獲得化合物RE29-4(252 mg)。 ESI-MS m/z: 561 (M + H)⁺

參考例30

[化143]

參考例30步驟1 使化合物RE30-1(2.00 g，9.47 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(40 mL)，於室溫下添加2-胺基-1,3-丙二醇(1.90 g，20.84 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(4.00 g，20.84 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(145 mg，0.947 mmol)並攪拌2小時。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(乙酸乙酯/甲醇＝70/30)精製殘渣。進而利用乙酸乙酯進行漿料精製，藉此獲得化合物RE30-2(2.68 g，產率79%)。 ESI-MS m/z: 356 (M - H)^-

參考例30步驟2 使化合物RE30-2(500 mg，1.40 mmol)懸浮於乙腈(10 mL)，於室溫下添加丙烯酸第三丁酯(3.59 g，28.0 mmol)、氫氧化苄基三甲基銨(40%水溶液，1.76 mL，702 mmol)並徹夜攪拌。於減壓下，蒸餾去除溶劑，添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)精製殘渣，藉此獲得化合物RE30-3(300 mg，產率24%)。 ESI-MS m/z: 871 (M + H)⁺

參考例30步驟3 使化合物RE30-3(340 mg，0391 mmol)溶解於四氫呋喃(6.8 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，31.3 mg)，於氫氣氛圍下攪拌6小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝30/70)精製殘渣，藉此獲得化合物RE30-4(235 mg，產率72%)。 ESI-MS m/z: 841 (M + H)⁺

參考例30步驟4 使化合物RE30-4(232 mg，0.276 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(4.6 mL)，於室溫下添加十二酸單苄酯(0.133 mg，0.414 mmol)、二異丙基乙基胺(0.145 mL，0.829 mmol)、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(158 mg，0.414 mmol)並徹夜攪拌。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝30/70)精製殘渣，藉此獲得化合物RE30-5(274 mg，產率87%)。 ESI-MS m/z: 1141 (M - H)^-

參考例30步驟5 使化合物RE30-5(273 mg，0.239 mmol)溶解於二氯甲烷(2.7 mL)，於室溫下添加三氟乙酸(2.7 mL)並徹夜攪拌。將反應液減壓濃縮，利用乙酸乙酯進行共沸，藉此定量地獲得化合物RE30-6(231 mg)。 ESI-MS m/z: 919 (M + H)⁺

參考例31

[化144]

參考例31步驟1 使4-硝基間苯二甲酸RE31-1(500 mg，2.37 mmol)及N-Boc-乙二胺(808 mg，5.21 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加三乙胺(0.90 mL，7.11 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(703 mg，5.21 mmol)及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(1.36 g，7.11 mmol)並攪拌16小時。對反應液進行後處理，藉由矽膠管柱層析法精製粗生成物，藉此獲得化合物RE31-2(650 mg，產率55%)。

參考例31步驟2 使化合物RE31-2(500 mg，1.01 mmol)及鋅粉(330 mg，5.05 mmol)懸浮於甲醇(3.5 mL)及四氫呋喃(3.5 mL)，於0℃下滴加氯化銨(378 mg，7.07 mmol)之水溶液，於室溫下攪拌24小時。對反應液進行後處理，藉由矽膠管柱層析法精製粗生成物，藉此獲得化合物RE31-3(160 mg，產率34%)。

參考例31步驟3 使化合物RE31-3(200 mg，0.430 mmol)及N-苄氧基羰基甘胺酸(有時亦將苄氧基羰基記為Cbz)(90.0 mg，0.430 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(2.0 mL)，於室溫下添加二異丙基乙基胺(0.220 mL，1.29 mmol)、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(245 mg，0.645 mmol)並攪拌16小時。對反應液進行後處理，藉由矽膠管柱層析法精製粗生成物，藉此獲得化合物RE31-4(180 mg，產率64%)。 ESI-MS m/z: 657 (M + H)⁺

參考例32

[化145]

參考例32步驟1 使3,5-二硝基苯甲酸RE32-1(500 mg，2.36 mmol)及N-Cbz-乙二胺(588 mg，2.83 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(5.0 mL)，於室溫下添加三乙胺(0.65 mL，4.72 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(380 mg，2.83 mmol)及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(675 mg，3.54 mmol)並攪拌16小時。對反應液進行後處理，藉由矽膠管柱層析法精製粗生成物，藉此獲得化合物RE32-2(445 mg，產率48%)。

參考例32步驟2 使化合物RE32-2(200 mg，0.515 mmol)溶解於乙醇(5.0 mL)，於室溫下添加氯化錫(II)(584 mg，3.09 mmol)及濃鹽酸(0.2 mL)，於80℃下攪拌16小時。對反應液進行後處理，而定量地獲得化合物RE32-3(180 mg)。 ESI-MS m/z: 329 (M + H)⁺

參考例33

[化146]

參考例33步驟1 使用藉由參考例3記載之方法所合成之化合物RE33-1(參考例3中之化合物RE3-2，8.17 g，23.12 mmol)，藉由與參考例3之步驟4相同之方法獲得化合物RE33-2(3.7 g，產率63%)。 ESI-MS m/z: 254(M + H)⁺

參考例33步驟2 使用化合物RE33-2(3.7 g，14.63 mmol)，藉由與參考例3之步驟5相同之方法獲得化合物RE33-3(3.82 g，產率67%)。 ESI-MS m/z: 432(M + HCOO)^-

參考例33步驟3 使用化合物RE33-3(3.82 g，9.86 mmol)，藉由與參考例1之步驟2相同之方法獲得化合物RE33-4(3.08 g，產率87%)。 ESI-MS m/z: 360(M + H)⁺

參考例34 [化147]

參考例34步驟1 使用化合物RE34-1(2 g，9.53 mmol)與第三丁氧基羰基胺基-1-戊醇(東京化成公司製造，2 g，10 mmol)，藉由與參考例3之步驟1相同之方法獲得化合物RE34-2(2.40 g，產率63%)。 ESI-MS m/z: 296(M + H)⁺ ，作為脫Boc體被檢測出

參考例34步驟2 使用化合物RE34-2，藉由與參考例3之步驟2～4及參考例4之步驟1～4相同之方法獲得化合物RE34-3(1.579 g，產率21%)。 ESI-MS m/z: 910 (M + H)⁺

參考例35：化合物D2之合成

[化148]

參考例35步驟1 使藉由參考例11記載之方法所合成之化合物RE35-1(參考例11中之化合物RE11-2，1.015 g，1.748 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(12 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，187 mg)，於氫氣氛圍下攪拌6小時。對反應液進行過濾。於濾液中添加參考例26中所合成之化合物RE26-5(250.0 mg，0.350 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(26.80 mg，0.1750 mmol)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(402.0 mg，2.099 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。於反應液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝87/13)精製殘渣，藉此獲得化合物RE35-2(617.0 mg，產率88%)。 ESI-MS m/z: 1215 (M + 2H)²⁺

參考例35步驟2 使化合物RE35-2(0.7380 g，0.3040 mmol)溶解於四氫呋喃(7 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，135.90 mg)，於氫氣氛圍下徹夜攪拌。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝87/13)精製殘渣，藉此獲得化合物D2(581 mg，產率82%)。 ESI-MS m/z: 1170 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.12-2.36 (106H, m), 2.91-3.19 (8H, m), 3.23-3.55 (14H, m), 3.60-3.76 (4H, m), 3.78-3.94 (8H, m), 3.95-4.10 (16H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.92-5.01 (4H, m), 5.17-5.24 (4H, m), 6.98 (1H, s), 7.64 (2H, s), 7.81-7.95 (4H, m), 8.28-8.38 (2H, m), 8.44-8.56 (2H, m), 10.13 (1H, s)

參考例36：化合物D3之合成

[化149]

參考例36步驟1 使藉由參考例12記載之方法所合成之化合物RE36-1(參考例12中之化合物RE12-2，500 mg，0.879 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(6.5 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，94 mg)，於氫氣氛圍下攪拌4小時。對反應液進行過濾。於濾液中添加參考例26中之化合物RE26-5(126.0 mg，0.176 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(13.47 mg，0.088 mmol)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(202.0 mg，1.055 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/乙腈)精製殘渣，藉此獲得化合物RE36-2(249.7 mg，產率60%)。 ESI-MS m/z: 1191 (M + 2H)²⁺

參考例36步驟2 使化合物RE36-2(0.242 g，0.102 mmol)溶解於四氫呋喃(3.6 mL)及水(1.2 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，45 mg)，於氫氣氛圍下攪拌4小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D3(216 mg，產率93%)。 ESI-MS m/z: 1146 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.15-1.65 (20H, m), 1.68-2.15 (52H, m), 3.13-3.29 (6H, m), 3.40-3.67 (16H, m), 3.71-3.96 (11H, m), 3.98-4.14 (16H, m), 4.55 (4H, t, J = 8.8 Hz), 4.93-5.06 (4H, m), 5.12-5.28 (4H, m), 6.56 (1H, s), 6.98 (1H. s), 7.64 (2H, s), 7.77-7.93 (4H, m), 8.26-8.49 (3H, m), 10.10 (1H, s)

參考例37:化合物D4之合成

[化150]

參考例37步驟1 使藉由參考例13記載之方法所合成之化合物RE37-1(參考例13中之化合物RE13-2，430 mg，0.674 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(6 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，79 mg)，於氫氣氛圍下攪拌4小時。對反應液進行過濾。於濾液中添加參考例26中之化合物RE26-5(105.0 mg，0.148 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(11.31 mg，0.074 mmol)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(170.0.0 mg，0.887 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/乙腈)精製殘渣，藉此獲得化合物RE37-2(218.1 mg，產率56%)。 ESI-MS m/z: 1329 (M + 2H)²⁺

參考例37步驟2 使化合物RE37-2(0.210 g，0.079 mmol)溶解於四氫呋喃(3.1 mL)及水(1.0 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，39 mg)，於氫氣氛圍下攪拌4小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D4(192.7 mg，產率95%)。 ESI-MS m/z: 1284 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.17-1.65 (42H, m), 1.69-2.13 (61H, m), 2.95-3.17 (16H, m), 3.65-3.77 (3H, m), 3.79-3.94 (6H, m), 3.96-4.10 (16H, m), 4.48 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 2.4, 11.2 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (1H, s), 7.64-7.92 (11H, m), 8.26-8.48 (4H, m), 10.14 (1H, s)

參考例38：化合物D5之合成

[化151]

參考例38步驟1 使藉由參考例12記載之方法所合成之化合物RE38-1(參考例12中之化合物RE12-2，450 mg，0.791 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(6 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，85 mg)，於氫氣氛圍下攪拌5小時。對反應液進行過濾。於濾液中添加參考例27中之化合物RE27-6(94 mg，0.158 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(133.0 mg，0.871 mmol)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(182.0 mg，0.950 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/乙腈)精製殘渣，藉此獲得化合物RE38-2(99 mg，產率28%)。 ESI-MS m/z: 1129 (M + 2H)²⁺

參考例38步驟2 使化合物RE38-2(80 mg，0.035 mmol)溶解於四氫呋喃(1.7 mL)及水(0.85 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，26 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D5(57.5 mg，產率75%)。 ESI-MS m/z: 1084 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.69-2.21 (46H, m), 3.14-3.65 (28H, m), 3.67-4.22 (27H, m), 4.43-4.66 (4H, m), 4.69-4.88 (4H, m), 4.89-5.08 (4H, m), 5.12-5.32 (4H, m), 6.54-6.68 (1H, br), 7.01 (2H, s), 7.78-8.09 (3H, m), 8.13-8.31 (2H, m), 8.58-8.75 (2H, m)

參考例39：化合物D6之合成

[化152]

參考例39步驟1 使藉由參考例13記載之方法所合成之化合物RE39-1(參考例13中之化合物RE13-2，418 mg，0.655 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(6 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，77 mg)，於氫氣氛圍下攪拌5小時。對反應液進行過濾。於濾液中添加參考例27中所合成之化合物RE27-6(85 mg，0.144 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(121.0 mg，0.791 mmol)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(165.0 mg，0.863 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/乙腈)精製殘渣，藉此獲得化合物RE39-2(99 mg，產率28%)。 ESI-MS m/z: 1268 (M + 2H)²⁺

參考例39步驟2 使化合物RE39-2(186 mg，0.073 mmol)溶解於四氫呋喃(2.8 mL)及水(0.93 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，40 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D6(156.7 mg，產率87%)。 ESI-MS m/z: 1222 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.36-1.62 (27H, m), 1.67-2.17 (64H, m), 2.92-3.21 (15H, m), 3.58-3.77 (2H, m), 3.80-3.95 (7H, m), 3.97-4.13 (15H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.88-5.02 (7H, m), 5.10-5.24 (3H, m), 6.95-7.00 (1H, m), 7.26-7.31 (2H, m), 7.72-7.88 (8H, m), 8.10-8.20 (2H, m), 8.51-8.60 (2H, m)

參考例40

[化153]

參考例40步驟1 使藉由參考例38記載之方法所合成之化合物D5(171 mg，0.079 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(3.4 mL)，添加甘胺酸苄基對甲苯磺酸鹽(32.0 mg，0.095 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(12.09 mg，0.079 mmol)、及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(18.16 mg，0.095 mmol)，於室溫下徹夜攪拌。將反應液於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由逆相管柱層析法(水/乙腈)精製殘渣，藉此獲得化合物RE40-2(55.7 mg，產率31%)。 ESI-MS m/z: 1158 (M + 2H)²⁺

參考例40步驟2 使化合物RE40-2(54 mg，0.023 mmol)溶解於四氫呋喃(0.83 mL)及水(0.28 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，18 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物RE40-3(50.1 mg，產率97%)。 ESI-MS m/z: 1112 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 0.96-1.06 (3H, m), 1.71-2.20 (54H, m), 3.41-3.64 (15H, m), 3.68-4.20 (32H), 4.55 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.81 (4H, s), 4.94-5.02 (4H, m), 5.17-5.25 (4H, m), 6.63-6.76 (2H, m), 6.93-7.02 (2H, m), 7.84-8.00 (3H, m), 8.17-8.30 (2H, m), 8.58-8.70 (2H, m)

參考例41：化合物D7之合成

[化154]

參考例41步驟1 使化合物RE41-1(500 mg，0.861 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，92.1 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。於氬氣氛圍下，於室溫下添加參考例27中所合成之化合物RE27-3(113 mg，0.172 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(198 mg，1.03 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(13.2 mg，0.086 mmol)並徹夜攪拌。利用矽藻土過濾反應液，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，進而藉由逆相分取HPLC(乙腈/水)進行精製，藉此獲得化合物RE41-2(195 mg，產率48%)。 ESI-MS m/z: 1186 (M + 2H)²⁺

參考例41步驟2 使化合物RE41-2(194 mg，0.082 mmol)溶解於四氫呋喃(2.9 mg)及水(1.0 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，35.7 mg)，於氫氣氛圍下攪拌8小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D7(183 mg，產率98%)。 ESI-MS m/z: 1141 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.21-1.45 (m, 40H), 1.76-2.18 (m, 50H), 3.00-3.09 (m, 8H), 3.40-4.20 (m, 32H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.98 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.31 (brs, 1H), 8.44 (brs, 1H), 10.11 (s, 1H).

參考例42：化合物D8之合成

[化155]

參考例42步驟1 使藉由參考例11記載之方法所合成之化合物RE42-1(參考例11中之化合物RE11-2，500 mg，0.861 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，92.1 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。於氬氣氛圍下，於室溫下添加參考例29中所合成之化合物RE29-4(97.0 mg，0.172 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(198 mg，1.03 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(13.2 mg，0.086 mmol)並徹夜攪拌。利用矽藻土過濾反應液，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝85/15)精製殘渣，進而藉由逆相分取HPLC(乙腈/水)進行精製，藉此獲得化合物RE42-2(179 mg，產率46%)。 ESI-MS m/z: 1138 (M + 2H)²⁺

參考例42步驟2 使化合物RE42-2(175 mg，0.077 mmol)溶解於四氫呋喃(2.6 mg)及水(0.9 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，32.4 mg)，於氫氣氛圍下攪拌1小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D8(160 mg，產率95%)。 ESI-MS m/z: 1093 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.23-1.45 (m, 32H), 1.77 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 3.01-3.11 (m, 8H), 3.69-4.02 (m, 34H), 4.47-4.50 (m, 4H), 4.94-4.98 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.33 (brs, 2H), 8.50 (brs, 2H).

參考例43：化合物D9之合成

[化156]

參考例43步驟1 使藉由參考例13記載之方法所合成之化合物RE43-1(參考例13中之化合物RE13-2，500 mg，0.784 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(10 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，92.1 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。於氬氣氛圍下，於室溫下添加參考例30中所合成之化合物RE30-6(144 mg，0.157 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(180 mg，0.941 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(12.0 mg，0.078 mmol)並徹夜攪拌。利用矽藻土過濾反應液，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝80/20)精製殘渣，進而藉由逆相分取HPLC(乙腈/水)進行精製，藉此獲得化合物RE43-2(191 mg，產率43%)。 ESI-MS m/z: 1431 (M + 2H)²⁺

參考例43步驟2 使化合物RE43-2(186 mg，0.065 mmol)溶解於四氫呋喃(2.8 mg)及水(0.9 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，34.3 mg)，於氫氣氛圍下攪拌1小時。對反應液進行過濾，於減壓下，蒸餾去除溶劑，而獲得化合物D9(174 mg，產率97%)。 ESI-MS m/z: 1386 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.25-4.02 (m, 164H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.47 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.74-7.91 (m, 13H), 8.18 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 10.27 (brs, 1H).

參考例44：化合物A2之合成

[化157]

參考例44步驟1 使藉由參考例31記載之方法所合成之化合物RE44-1(參考例31中之化合物RE31-4，150 mg，0.228 mmol)溶解於二氯甲烷(1.5 mL)，於室溫下添加三氟乙酸(1.5 mL)並攪拌4小時。將反應液減壓濃縮，利用乙酸乙酯進行共沸。使殘渣溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(3 mL)，於室溫下添加參考例14之化合物RE14-3(574 mg，0.571 mmol)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(109 mg，0.571 mmol)、三乙胺(0.159 mL，1.14 mmol)、1-羥基苯并***一水合物(3.50 mg，0.023 mmol)並徹夜攪拌。將反應液減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，進而藉由逆相分取HPLC(乙腈/水)進行精製，藉此獲得化合物RE44-2(242 mg，產率44%)。 ESI-MS m/z: 1216 (M + 2H)²⁺

參考例44步驟2 使化合物RE44-2(242 mg，0.100 mmol)溶解於四氫呋喃/水(4/1；12 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，44.6 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。於氬氣氛圍下，於室溫下添加6-順丁烯二醯亞胺己酸(23.2 mg，0.110 mmol)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(55.2 mg，0.199 mmol)並徹夜攪拌。利用矽藻土過濾反應液，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由HP20樹脂(丙酮/水)精製殘渣，藉此獲得化合物A2(97.4 mg，產率39%)。 ESI-MS m/z: 1245 (M + 2H)²⁺ ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ: 1.14-2.16 (100H, m), 2.96-2.98 (4H, m), 3.24-3.41 (18H, m), 3.69-3.73 (4H, m), 3.83-3.91 (6H, m), 4.14-4.16 (2H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.6 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 3.6, 11.3 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (2H, s), 7.73-7.75 (2H, m), 7.83-7.94 (7H, m), 8.05-8.08 (2H, m), 8.14-8.20 (3H, m), 8.55-8.56 (2H, m), 10.24 (1H, brs).

參考例45：化合物A3之合成

[化158]

參考例45步驟1 使藉由參考例32記載之方法所合成之化合物RE45-1(參考例32中之化合物RE32-3，75.0 mg，0.228 mmol)溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(3.0 mL)，於室溫下添加參考例14之化合物RE14-3(574 mg，0.571 mmol)、二異丙基乙基胺(0.199 mL，1.14 mmol)、六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓(217 mg，0.571 mmol)並徹夜攪拌。於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝90/10)精製殘渣，進而藉由逆相分取HPLC(乙腈/水)進行精製，藉此獲得化合物RE45-2(202 mg，產率38%)。 ESI-MS m/z: 1152 (M + 2H)²⁺

參考例45步驟2 使化合物RE45-2(196 mg，0.085 mmol)溶解於四氫呋喃/水(4/1；10 mL)，於室溫下添加10%鈀碳粉末(含水品，54.29%，36.1 mg)，於氫氣氛圍下攪拌2小時。於氬氣氛圍下，於室溫下添加6-順丁烯二醯亞胺己酸(19.8 mg，0.094 mmol)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(47.0 mg，0.170 mmol)並徹夜攪拌。利用矽藻土過濾反應液，於減壓下，蒸餾去除溶劑，藉由HP20樹脂(丙酮/水)精製殘渣，藉此獲得化合物A3 (42.4 mg，產率21%)。 ESI-MS m/z: 1182 (M + 2H)²⁺

參考例46：化合物D10

[化159]

使用藉由參考例34記載之方法所合成之化合物RE46-1(參考例34中之化合物RE34-3)，藉由與參考例10之步驟1及2相同之方法獲得化合物D10(2.2 g，產率58%)。 ESI-MS m/z: 2437(M + H)⁺

參考例47：化合物A4之合成

[化160]

參考例47步驟1 使用藉由參考例33記載之方法所合成之化合物RE47-1(參考例33中之化合物RE33-4，0.101 g，0.282 mmol)，使用參考例15之化合物RE15-2(0.607 g，0.613 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE47-2(0.25 g，產率39%)。 ESI-MS m/z: 2304(M + H)⁺

參考例47步驟2 使用化合物RE47-2(0.255 g，0.111 mmol)，藉由與參考例3之步驟2相同之方法獲得化合物RE47-3(0.15 g，產率63%)。 ESI-MS m/z: 2170(M + H)⁺

參考例47步驟3 使用化合物RE47-3(20.8 mg，9.59 μmol)，藉由與參考例5之步驟2相同之方法獲得化合物A4(5.5 mg，產率24%)。 ESI-MS m/z: 1182(M + 2H)²⁺

參考例48：化合物A5之合成

[化161]

參考例48步驟1 使用藉由參考例33記載之方法所合成之化合物RE48-1(參考例33中之化合物RE33-4，0.099 g，0.277 mmol)，使用參考例16之步驟2中所合成之化合物RE16-3(0.618 g，0.615 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物RE48-2(0.343 g，產率53%)。 ESI-MS m/z: 2333(M + H)⁺

參考例48步驟2 使用化合物RE48-2，藉由與參考例10之步驟1及2相同之方法獲得化合物A5(6.9 mg，產率28%)。 ESI-MS m/z: 2392(M + H)⁺

參考例49：化合物A6之合成

[化162]

使用化合物RE49-1(0.048 g，0.021 mmol)與3-順丁烯二醯亞胺丙酸N-丁二醯亞胺酯(東京化成公司製造，0.017 g，0.064 mmol)，藉由與參考例8之化合物A1之合成相同之方法獲得化合物A6(0.040 g，產率78%)。 ESI-MS m/z: 2480(M + HCOO)^-

參考例50：化合物A7之合成

[化163]

步驟131 使用藉由參考例10記載之方法所合成之化合物D1(23.6 mg，9.46 μmol)與N-(2-胺基乙基)順丁烯二醯亞胺三氟乙酸鹽(Sigma-Aldrich公司製造，7.21 mg，0.028 μmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法獲得化合物A7(9.1 mg，產率36%)。 ESI-MS m/z: 1310(M + 2H)²⁺

參考例51

[化164]

參考例51步驟1 使用藉由參考例7記載之方法所合成之化合物RE51-1(0.122 g，0.054 mmol)及藉由與《生物共軛化學》，第22卷，第690-699頁，2011年記載之方法相同之方法所合成之己酸單苄酯，藉由與參考例4之步驟1相同之方法獲得化合物RE51-2(0.076 g，產率56%)。 ESI-MS m/z: 2503(M + H)⁺

參考例51步驟2 使用化合物RE51-2(0.076 g，0.03 mmol)，藉由與參考例3之步驟1相同之方法獲得化合物RE51-3(0.030 g，產率40%)。 ESI-MS m/z: 2412(M + H)⁺

參考例52

[化165]

使用藉由參考例6記載之方法所合成之化合物RE52-1(參考例6中之化合物RE6-5，4.36 mg，0.006 mmol)與參考例1之化合物RE1-4(10 mg，0.02 mmol)，藉由與參考例3之步驟7相同之方法獲得化合物RE52-2(7 mg，產率65%)。 ESI-MS m/z: 1581 (M - H)^-

參考例53：化合物C2之合成

[化166]

參考例53步驟1 使用藉由參考例46記載之方法所合成之化合物D10(0.2011 g，0.079 mmol)，採用參考例10之步驟3而獲得化合物RE53-1(0.129 g，產率55%)。 ESI-MS m/z: 2972 (M + HCOO)^-

參考例53步驟2 使用化合物RE53-1(0.129 g，0.044 mmol)，採用參考例10之步驟4而獲得化合物RE53-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1535 (M + HCOOH - 2H)^2-

參考例53步驟3 使用化合物RE53-2(0.0467 g，0.013 mmol)，採用參考例10之步驟5而獲得化合物C2(19.4 μmol/g，產率35%)。

參考例54：化合物C3之合成

[化167]

參考例54步驟1 使用藉由參考例10記載之方法所合成之化合物D1(100 mg，0.040 mmol)及參考例17之化合物RE17-2，藉由與參考例10之步驟3相同之方法獲得化合物RE54-1(90 mg，產率76%)。 ESI-MS m/z: 1335 (M - DMTr + 2H)²⁺

參考例54步驟2 使用化合物RE54-1(90 mg，0.030 mmol)，藉由與參考例10之步驟4相同之方法獲得化合物RE54-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1558 (M + HCOOH - 2H)^2-

參考例54步驟3 使用化合物RE54-2之粗生成物，藉由與參考例10之步驟5相同之方法獲得化合物C3(21.5 μmol/g，兩階段產率32%)。

參考例55：化合物C4之合成

[化168]

參考例55步驟1 使用藉由參考例46記載之方法所合成之化合物D10(100 mg，0.039 mmol)及參考例17中所合成之化合物RE17-2，藉由與參考例10之步驟3相同之方法獲得化合物RE55-1(90 mg，產率76%)。 ESI-MS m/z: 1356 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例55步驟2 使用化合物RE55-1(90 mg，0.030 mmol)，藉由與參考例10之步驟4相同之方法獲得化合物RE55-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1579 (M + HCOOH - 2H)^2-

參考例55步驟3 使用化合物RE55-2之粗生成物，藉由與參考例10之步驟5相同之方法獲得化合物C4(17.0 μmol/g，兩階段產率26%)。

參考例56：化合物C5之合成

[化169]

參考例56步驟1 使用藉由參考例46記載之方法所合成之化合物D10(100 mg，0.039 mmol)及參考例18之步驟2中所合成之化合物RE18-3，藉由與參考例10之步驟3相同之方法獲得化合物RE56-1(50 mg，產率42%)。 ESI-MS m/z: 1363 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例56步驟2 使用化合物RE56-1(50 mg，0.017 mmol)，藉由與參考例10之步驟4相同之方法獲得化合物RE56-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1587 (M + HCOOH - 2H)^2-

參考例56步驟3 使用化合物RE56-2之粗生成物，藉由與參考例10之步驟5相同之方法獲得化合物C5(0.5 μmol/g，兩階段產率1%)。

參考例57：化合物C6之合成

[化170]

參考例57步驟1 使用藉由參考例46記載之方法所合成之化合物D10(100 mg，0.039 mmol)及參考例19之化合物RE19-2，藉由與參考例10之步驟3相同之方法獲得化合物RE57-1(40 mg，產率30%)。 ESI-MS m/z: 1532 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例57步驟2 使用化合物RE57-1(40 mg，0.012 mmol)，藉由與參考例10之步驟4相同之方法獲得化合物RE57-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1582 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例57步驟3 使用化合物RE57-2之粗生成物，藉由與參考例10之步驟5相同之方法獲得化合物C6(0.2 μmol/g，兩階段產率1%)。

參考例58：化合物C7之合成

[化171]

參考例58步驟1 使用藉由參考例10記載之方法所合成之D1(70 mg，0.028 mmol)及參考例21之化合物RE21-3，藉由與參考例10之步驟3相同之方法獲得化合物RE58-1(58 mg，產率77%)。 ESI-MS m/z: 1341 (M + 2H)²⁺

參考例58步驟2 使化合物RE58-1(58 mg，0.022 mmol)溶解於甲醇(0.15 mL)，添加藉由《有機化學》，第74卷，第6837-6842頁，2009年記載之方法所合成之參考例17之化合物RE17-1(16.9 mg，0.032 mmol)、1 mol/L之SODIΜM L-ASCORBATE水溶液(0.022 mL，0.022 mmol)、20 mmol/L之硫酸銅(II)水溶液(0.011 mL，0.22 μmol)、及10 mmol/L之三(2-苯并咪唑基甲基)胺(Tris(2-benzimidazolylmethyl)amine)/DMSO溶液(0.022 mL，0.22μmol)，於室溫下攪拌3小時。藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝80/20)精製反應液，而獲得化合物RE58-2(7 mg，產率10%)。 ESI-MS m/z: 1450 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例58步驟3 使用化合物RE58-2(10 mg，3.13 μmol)，藉由與參考例10之步驟4相同之方法獲得化合物RE58-3之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1500 (M + 2H)²⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例58步驟4 使用化合物RE58-3之粗生成物，藉由與參考例10之步驟5相同之方法獲得化合物C7(8.4 μmol/g，產率27%)。

參考例59

[化172]

參考例59步驟1 使用藉由參考例46記載之方法所合成之化合物D10(74.1 mg，0.029 mmol)與參考例22之化合物RE22-2(15 mg，0.027 mmol)，藉由與參考例3之步驟3相同之方法或《生物共軛化學》，第26卷，第1451-1455頁，2015年記載之方法獲得化合物RE59-1之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1392(M +H)⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例59步驟2 使用化合物RE59-1(0.083 g，0.027 mmol)，藉由國際公開公報2015105083號記載之方法獲得化合物RE59-2之粗生成物。 ESI-MS m/z: 2669(M + H)⁺ ，作為脫DMTr體被檢測出

參考例59步驟3 使用化合物RE59-2(0.08 g，0.027 mmol)，藉由與參考例10之步驟4相同之方法獲得化合物RE59-3之粗生成物。 ESI-MS m/z: 1556(M + HOOH - 2H)^2- ¹ H-NMR (400 MHz, MeOD) δ: 1.45-1.86 (48H, m), 1.93 (12H, s), 1.94 (12H, s), 2.02 (12H, s), 2.13 (12H, s), 2.16-2.28 (17H, m), 2.48 (4H, s), 3.10-3.16 (6H, m), 3.36-3.56 (19H, m), 3.77 (6H, s), 3.80-3.89 (6H, m), 3.98-4.35 (30H, m), 4.53-4.59 (4H, m), 4.66-4.72 (1H, m), 5.04-5.10 (4H, m), 5.31-5.36 (4H, m), 6.81-6.88 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.26-7.32 (6H, m), 7.38-7.44 (2H, m), 7.54 (2H, brs), 7.90 (1H, brs).

參考例60 使用化合物D1、及第Z-1表記載之結構或參考例20之化合物RE20-4，藉由與參考例59步驟1及步驟2相同之方法獲得第P-1表及第P-2表中記載之化合物。將藉由本實施例所合成之化合物之質譜分析結果示於第P-3表。

[表20] 第P-1表

[表21] 接第P-1表

[表22] 第P-2表

[表23]

參考例61：化合物C8之合成

[化173]

使用參考例59中記載之化合物RE59-3，藉由與參考例10之步驟5相同之方法獲得化合物C8(10.0 μmol/g)。

參考例62：C9～C17之合成使用第P-1表及第P-2表記載之化合物，藉由與參考例61相同之方法獲得第Q-1表及第Q-2表記載之化合物。將藉由本實施例所合成之化合物之擔載量示於第Q-3表。

[表24] 第Q-1表

[表25] 接第Q-1表

[表26] 第Q-2表

[表27]

實施例1：化合物1-1及化合物1-2之合成

[化174]

步驟1 添加參考例化合物A1與藉由《分子學》(Molecules)，第17卷，第13825-13843頁，2012年記載之方法所合成之末端硫醇化之寡核苷酸，於室溫下靜置4小時。於反應混合物中添加碳酸鈉，於4℃下靜置一晩。藉由陰離子交換層析法(GE Healthcare，MonoQ 5/50GL，10 μm，5.0 mm×50 mm；由A液：10 mmol/L Tris緩衝液/30%乙腈與B液：10 mmol/L Tris緩衝液/30%乙腈/1 mol/L NaBr形成之梯度)或逆相液相層析法(Waters，X BridgeC18，5 μm，4.6 mm×250 mm，由0.1 mol/L乙酸三乙基銨緩衝液與B液：乙腈形成之梯度)之任一方法進行精製，藉此獲得化合物1-1。

步驟2 利用混合緩衝液(100 mmol/L乙酸鉀、30 mmol/L 2-[4-(2-羥基乙基)哌𠯤-1-基]乙磺酸(HEPES)-KOH(pH值7.4)、2 mmol/L乙酸鎂)對步驟1中所合成之化合物1-1(3'-CFB-ssRNA)進行濃度調整(50 μmol/L)。分別混合等量之上述正義股與反義股(50 μmol/L)，於80℃下靜置10分鐘。反義股序列如第R-2表中之記載。緩慢降溫，於37℃下靜置1小時，而獲得雙股之化合物1-2。

實施例2～11：化合物2-1～11-1及化合物2-2～11-2之合成使用與實施例1鹼基序列不同之寡核苷酸，藉由與實施例1相同之方式合成化合物2-1～11-1及化合物2-2～11-2。

實施例12：化合物12-1及化合物12-2之合成

[化175]

步驟1 使用參考例化合物D5，添加藉由《分子學》，第17卷，第13825-13843頁，2012年記載之方法所合成之末端經胺基修飾之寡核苷酸，藉由《生物共軛化學》，第22卷，第1723-1728頁，2011年或《生物共軛化學》，第26卷，第1451-1455頁，2015年記載之方法進行反應。藉由實施例1記載之方法進行精製，藉此獲得化合物12-1。

步驟2 藉由與實施例1之步驟2相同之方法獲得化合物12-2。

實施例13～15：化合物13-1～15-1及化合物13-2～15-2之合成使用與實施例1鹼基序列不同之寡核苷酸，藉由與實施例1相同之方式合成化合物13-1～15-1及化合物13-2～15-2。

將藉由本實施例所合成之化合物之配體-連接子結構示於以下。

[化176]

將藉由本實施例所合成之核酸複合體之序列(正義股)及質譜分析結果示於第R-1表。再者，第R-1表中，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-氟修飾RNA，^表示硫代磷酸酯。

[表28] 表R-1

將藉由本實施例所合成之核酸複合體之序列示於R-2表。再者，第R-2表中，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-氟修飾RNA，p表示5'末端之磷酸化，^表示硫代磷酸酯。

[表29] 表R-2

[表30] 接表R-2

參考試驗例1：人細胞中之CFB mRNA之減弱活性之測定於96孔培養盤中以10,000 cells/80 μL/well之方式接種作為源自人肝癌之細胞株之Huh7細胞(獲自國立研究開發法人醫藥基礎・健康・營養研究所 JCRB細胞庫)。培養基係使用包含10%胎牛血清(FBS)之DMEM培養基(Life Technologies公司製造，目錄編號08458-16)。雙股核酸係藉由基因設計將表1-1～表1-3中記載者進行合成而利用。具體而言，利用經退火之雙股核酸構成包含序列編號2～124所示之核糖核苷酸之正義股、包含序列編號125～247所示之核糖核苷酸之反義股(序列編號n(n＝2～124)所示之正義股與序列編號[n＋123]所示之反義股形成一對)。利用Opti-MEM培養基(Life Technologies公司製造，目錄編號11058-021)稀釋該表1-1～表1-3中記載之雙股核酸與RNAiMax轉染試劑(Life Technologies公司製造，目錄編號1401251)，以雙股核酸之終濃度成為1 nM或0.1 nM之方式於96孔培養盤各孔添加20 μL之siRNA/RNAiMax混合液，於37℃、5%CO₂ 條件下培養24小時。其後，將細胞利用PBS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝鹽水)洗淨，使用SuperPrep細胞分解&qPCR逆轉錄套組(Cell Lysis & RT Kit for qPCR)(東洋紡公司製造，目錄編號SCQ-101)，依據製品隨附說明書記載之方法，由各盤合成cDNA。將該cDNA 5μL添加至MicroAmp光學96孔盤(Applied Biosystems公司製造，目錄編號4326659)，進而添加10 μL之TaqMan基因表現高性能預混液(Gene Expression Master Mix)(Applied Biosystems公司製造，目錄編號4369016)、3 μL之超純蒸餾水(UltraPure Distilled Water)(Life Technologies公司製造，目錄編號10977-015)、1 μL之人CFB探針、1 μL之人β-actin探針。使用QuantStudio^TM 12K Flex即時PCR系統，進行人CFB基因及人β-actin之即時PCR。β-actin為構成性表現基因，對其進行測定作為內部對照，修正CFB表現量。將不添加siRNA而僅利用轉染試劑處理Huh7細胞時之CFB mRNA量設為1.0，算出導入有各雙股核酸時之CFB mRNA相對表現量。進行複數次本實驗，將CFB mRNA相對表現量之平均值示於表1-1～表1-3。

[表31]

[表32]

[表33]

針對實施例1～10及12～15中獲得之各核酸複合體，測定於人初代肝細胞中之體外(in vitro)減弱活性。將以最終濃度成為10或30 nmol/L之方式經Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號31985)稀釋之各核酸複合體每孔20 μL地分注至96孔培養盤後，以細胞數成為10000 cells/80 μL/well之方式接種平板培養基(plating medium)(Biopredic International公司製造，目錄編號LV0304-2)中懸浮之人初代肝細胞(Biopredic International公司製造，目錄編號HEP187)，於37℃、5%CO₂ 條件下培養6小時後，小心地去除培養上清液，添加培養基(incubation medium)(Biopredic International公司製造，目錄編號LV0304-2)，而將各核酸複合體供於人初代肝細胞。又，作為陰性對照組，接種未經任何處理之細胞。將添加有各核酸複合體之細胞於37℃之5%CO₂ 培養箱內培養18小時，利用經冰浴冷卻之磷酸緩衝化生理鹽水(DPBS)(Nacalai Tesque公司製造)洗淨，使用SuperPrep細胞分解&qPCR逆轉錄套組(東洋紡公司製造，目錄編號SCQ-201)，依據製品隨附說明書中記載之方法，回收總RNA，並利用以所獲得之總RNA作為模板之反轉錄反應而製作cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用Taqman(註冊商標)基因表現分析探針(Gene Expression Assays probe)(Thermo Fisher Scientific公司製造)作為探針，使用QuantStudio 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)，依據隨附使用說明書中記載之方法而進行PCR反應，藉此使CFB基因及作為構成性表現基因之甘油醛3-磷酸脫氫酶(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下稱為gapdh)基因進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將gapdh之mRNA擴增量作為內部對照，算出CFB之mRNA之準定量值。將同樣地測定之陰性對照中之CFB之mRNA之準定量值設為1，根據CFB之mRNA之準定量值而求出CFB之mRNA之表現率。將所獲得之CFB之mRNA之表現率之結果示於表S1。根據表S1可知，各核酸複合體於向人初代肝細胞添加後抑制CFB基因之mRNA之表現。

[表34]

試驗例2 核酸複合體對小鼠初代肝細胞之體外(in vitro)減弱試驗針對實施例10、11、14及15中獲得之各核酸複合體，測定於小鼠初代肝細胞中之體外減弱活性。將以最終濃度成為30、10、3或1 nmol/L之方式經Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號31985)稀釋之各核酸複合體每孔20 μL地分注至96孔培養盤後，以細胞數成為10000 cells/80 μL/well之方式接種包含初代肝細胞解凍與培養補充劑(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號CM3000)之威廉姆斯E培養基(William's E Medium)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號A12176-01)中懸浮之源自CD-1之小鼠初代肝細胞(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號MSCP10)，於37℃、5%CO₂ 條件下培養6小時後，小心地去除培養上清液，添加包含初代肝細胞保持補充劑(Primary Hepatocyte Maintenance Supplements)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號CM4000)之威廉姆斯E培養基，而將各核酸複合體供於小鼠初代肝細胞。又，作為陰性對照組，接種未經任何處理之細胞。將添加有各核酸複合體之細胞於37℃之5%CO₂ 培養箱內培養18小時，利用經冰浴冷卻之磷酸緩衝化生理鹽水(DPBS)(Nacalai Tesque公司製造)洗淨，使用SuperPrep細胞分解&qPCR逆轉錄套組(東洋紡公司製造，目錄編號SCQ-201)，依據製品隨附說明書中記載之方法，回收總RNA，並利用以所獲得之總RNA作為模板之反轉錄反應而製作cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用Taqman(註冊商標)基因表現分析探針(Thermo Fisher Scientific公司製造)作為探針，使用QuantStudio 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)，依據隨附使用說明書中記載之方法而進行PCR反應，藉此使CFB基因及作為構成性表現基因之甘油醛3-磷酸脫氫酶(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下稱為gapdh)基因進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將gapdh之mRNA擴增量作為內部對照，算出CFB之mRNA之準定量值。將同樣地測定之陰性對照中之CFB之mRNA之準定量值設為1，根據CFB之mRNA之準定量值而求出CFB之mRNA之表現率。將所獲得之CFB之mRNA之表現率示於表S2。

[表35]

根據表S2可知，各核酸複合體於向小鼠初代肝細胞添加後抑制CFB基因之mRNA之表現。

試驗例3 核酸複合體於小鼠中之體內(in vivo)減弱試驗針對表S3之各核酸複合體，分別藉由以下之方法實施小鼠體內減弱試驗。再者，配合試驗，將各核酸複合體利用磷酸緩衝化生理鹽水(DPBS)(Nacalai Tesque公司製造)稀釋後使用。對小鼠(BALB/cA，購自CLEA Japan公司)進行馴化飼育後，分別以30 mg/kg、10 mg/kg、3 mg/kg或0.3 mg/kg於每隻小鼠皮下注射投予各核酸複合體。又，作為對照組，僅於小鼠皮下注射投予DPBS。自投予起經過3天後實行安樂死，摘取肝臟並於液氮中冷凍保存。使用Trizol(註冊商標)RNA分離試劑(RNA Isolation Reagent)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號15596026)及MagNA Pure 96(Roche Life Science公司製造)，依據製品隨附說明書中記載之方法，對肝臟冷凍樣本回收總RNA。進而，使用轉錄子第一股cDNA合成試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit)(Roche Life Science公司製造，目錄編號04897030001)，依據製品隨附說明書中記載之方法，利用以所獲得之總RNA作為模板之反轉錄反應而製作cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用Taqman(註冊商標)基因表現分析探針(Thermo Fisher Scientific公司製造)作為探針，使用QuantStudio 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)，依據隨附使用說明書中記載之方法而進行PCR反應，藉此使CFB基因及gapdh基因進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將gapdh之mRNA擴增量作為內部對照，算出CFB之mRNA之準定量值。將同樣地測定之PBS投予群中之CFB之mRNA之準定量值設為1而求出CFB之mRNA之表現率。將所獲得之CFB之mRNA之表現率示於表S3。

[表36]

表中，N.T.表示未進行評價。

根據表S3可知，對小鼠投予本發明之核酸複合體而使肝臟中之CFB基因之表現降低。

試驗例4 核酸複合體對大鼠初代肝細胞之體外(in vitro)減弱試驗針對表S4所示之各核酸複合體，測定於大鼠初代肝細胞中之體外減弱活性。將以最終濃度成為30、10、3或1 nmol/L之方式經Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號31985)稀釋之各核酸複合體每孔20 μL地分注至96孔培養盤後，以細胞數成為10000 cells/80 μL/well之方式接種包含初代肝細胞解凍與培養補充劑(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號CM3000)之威廉姆斯E培養基(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號A12176-01)中懸浮之大鼠初代肝細胞(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號RTCP10)，於37℃、5%CO₂ 條件下培養6小時後，小心地去除培養上清液，添加包含初代肝細胞保持補充劑(Primary Hepatocyte Maintenance Supplements)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號CM4000)之威廉姆斯E培養基，而將各核酸複合體供於大鼠初代肝細胞。又，作為陰性對照組，接種未經任何處理之細胞。將添加有各核酸複合體之細胞於37℃之5%CO₂ 培養箱內培養18小時，利用經冰浴冷卻之磷酸緩衝化生理鹽水(DPBS)(Nacalai Tesque公司製造)洗淨，使用SuperPrep細胞分解&qPCR逆轉錄套組(Cell Lysis & RT Kit for qPCR)(東洋紡公司製造，目錄編號SCQ-201)，依據製品隨附說明書中記載之方法，回收總RNA，並利用以所獲得之總RNA作為模板之反轉錄反應而製作cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用Taqman(註冊商標)基因表現分析探針(Thermo Fisher Scientific公司製造)作為探針，使用QuantStudio 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)，依據隨附使用說明書中記載之方法而進行PCR反應，藉此使CFB基因及作為構成性表現基因之甘油醛3-磷酸脫氫酶(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下稱為gapdh)基因進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將gapdh之mRNA擴增量作為內部對照，算出CFB之mRNA之準定量值。將同樣地測定之陰性對照中之CFB之mRNA之準定量值設為1而求出CFB之mRNA之表現率。將所獲得之CFB之mRNA之表現率之結果示於表S4。根據表S4可知，各核酸複合體於向大鼠初代肝細胞添加後抑制CFB基因之mRNA之表現。

[表37]

試驗例5 核酸複合體於大鼠中之體內(in vivo)活性針對表S5之各核酸複合體，分別藉由以下之方法實施大鼠體內減弱試驗。再者，配合試驗，將各核酸複合體利用磷酸緩衝化生理鹽水(DPBS)(Nacalai Tesque公司製造)稀釋後使用。對大鼠(WKY，購自Charles River Japan公司)進行馴化飼育後，分別以10 mg/kg於每隻大鼠皮下注射投予各核酸複合體。又，作為對照組，僅於大鼠皮下注射投予DPBS。自投予起經過3天後實行安樂死，摘取肝臟並於液氮中冷凍保存。使用Trizol(註冊商標)RNA分離試劑(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號15596026)及MagNA Pure 96(Roche Life Science公司製造)，依據製品隨附說明書中記載之方法，對肝臟冷凍樣本回收總RNA。進而，使用轉錄子第一股cDNA合成試劑盒(Roche Life Science公司製造，目錄編號04897030001)，依據製品隨附說明書中記載之方法，利用以所獲得之總RNA作為模板之反轉錄反應而製作cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用Taqman(註冊商標)基因表現分析探針(Thermo Fisher Scientific公司製造)作為探針，使用QuantStudio 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)，依據隨附使用說明書中記載之方法而進行PCR反應，藉此使CFB基因及gapdh基因進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將CFB之mRNA擴增量作為內部對照，算出CFB之mRNA之準定量值。將同樣地測定之PBS投予群中之CFB之mRNA之準定量值設為1，根據CFB之mRNA之準定量值求出CFB之mRNA之表現率。將所獲得之CFB之mRNA之表現率示於表S5。

[表38]

根據表S5可知，對大鼠投予本發明之核酸複合體而使肝臟中之CFB基因之表現降低。 [產業上之可利用性]

本發明之核酸複合體可用於對哺乳動物進行投予而於生物體內治療CFB相關疾病。

Claims

一種核酸複合體，其係以下述式1表示，式1： [化1](式1中， X為包含正義股及反義股且包含至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙股核酸，該雙股核酸於該反義股中之鏈長為17個～30個核苷酸之寡核苷酸鏈與表1-1～表1-3中所記載之靶CFB mRNA序列之任一者互補，該正義股之3'末端或5'末端鍵結於S3， L1及L2分別獨立為糖配體， S1、S2及S3分別獨立為連接子)。
如請求項1之核酸複合體，其具有下述式2所表示之結構，式2： [化2](式2中， X、L1、L2及S3分別與上述含義相同， P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2分別獨立，或不存在，或為-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-， Q1、Q2、Q3及Q4分別獨立，或不存在，或為經取代或未經取代之碳數1～12之伸烷基或者-(CH₂ CH₂ O)_n -CH₂ CH₂ -，n為0～99之整數， B1及B2分別獨立為鍵結鍵，或為下述式2-1所表示之任一結構，各結構中之末端之黑色圓點分別為與P2或P3、或者與P5或P6之鍵結點，m1、m2、m3及m4分別獨立為0～10之整數，式2-1： [化3]p1及p2分別獨立為1、2或3之整數， q1、q2、q3及q4分別獨立為0～10之整數，其中，於p1及p2分別為2或3之整數時，各P3及P6、Q2及Q4、T1及T2以及L1及L2可相同或不同，於q1～q4為2～10時，各-[P2-Q1]-、-[Q2-P3]-、-[P5-Q3]-、-[Q4-P6]-之組合可相同或不同)。
如請求項2之核酸複合體，其中P1及P4分別獨立為-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。
如請求項2或3之核酸複合體，其中-[P2-Q1]_q1 -及-[P5-Q3]_q3 -分別獨立，或不存在，或為下述式3-1～式3-3所表示之任一結構，式3-1： [化4]式3-2： [化5]式3-3： [化6](式3-1～式3-3中， m5及m6分別獨立為0～10之整數，式3-1～式3-3之結構中之末端之黑色圓點分別為與B1或B2、或者與P1或P4之鍵結點)。
如請求項2至4中任一項之核酸複合體，其具有下述式4-1～式4-9所表示之任一結構，式4-1： [化7]式4-2： [化8]式4-3： [化9]式4-4： [化10]式4-5： [化11]式4-6： [化12]式4-7： [化13]式4-8： [化14]式4-9： [化15](式4-1～4-9中， X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2及q4分別與上述含義相同)。
如請求項1之核酸複合體，其具有下述式5所表示之結構，式5： [化16](式5中， X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2分別與上述含義相同)。
如請求項6之核酸複合體，其中P1為-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。
如請求項6或7之核酸複合體，其具有下述式6-1～式6-9所表示之任一結構，式6-1： [化17]式6-2： [化18]式6-3： [化19]式6-4： [化20]式6-5： [化21]式6-6： [化22]式6-7： [化23]式6-8： [化24]式6-9： [化25](式6-1～6-9中， X、S3、P3、Q2、T1、L1及q2分別與上述含義相同)。
如請求項2至5中任一項之核酸複合體，其具有下述式7-1～式7-9所表示之任一結構，式7-1： [化26]式7-2： [化27]式7-3： [化28]式7-4： [化29]式7-5： [化30]式7-6： [化31]式7-7： [化32]式7-8： [化33]式7-9： [化34](式7-1～7-9中， X、S3、L1及L2分別與上述含義相同)。
如請求項1至9中任一項之核酸複合體，其中上述糖配體為N-乙醯基半乳胺糖。
如請求項1至10中任一項之核酸複合體，其中上述雙股核酸包含修飾核苷酸。
如請求項1至11中任一項之核酸複合體，其中正義股之3'末端及反義股之5'末端形成平滑末端。
如請求項11之核酸複合體，其中上述雙股核酸包含糖部分修飾核苷酸。
如請求項1至13中任一項之核酸複合體，其具有下述式7-8-1所表示之結構，式7-8-1： [化35](式7-8-1中，X與上述含義相同)。
如請求項1至14中任一項之核酸複合體，其中X為選自由表1-1～表1-3中所記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股。
如請求項1至14中任一項之核酸複合體，其中X為選自由表M1-1～表M1-3中所記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股。
如請求項1至14中任一項之核酸複合體，其中X為選自由表M1-4中所記載之正義股/反義股所組成之群中之1對正義股/反義股。
如請求項17之核酸複合體，其中X為表M1-4中所記載之EB0125所表示之1對正義股/反義股。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之核酸複合體。
如請求項19之醫藥組合物，其係用於導入至細胞內。
如請求項19或20之醫藥組合物，其係供靜脈內投予或皮下投予。
一種疾病之治療或預防方法，其包括將如請求項1至18中任一項之核酸複合體或如請求項19至21中任一項之醫藥組合物對需要其之患者進行投予。
一種抑制CFB基因之表現之方法，其包括使用如請求項1至18中任一項之核酸複合體或如請求項19至21中任一項之醫藥組合物向細胞內導入雙股核酸。
一種CFB相關疾病之治療方法，其包括將如請求項1至18中任一項之核酸複合體或如請求項19至21中任一項之醫藥組合物對哺乳動物進行投予。
一種用於治療CFB相關疾病之醫藥，其包含如請求項1至18中任一項之核酸複合體或如請求項19至21中任一項之醫藥組合物。
一種CFB相關疾病之治療劑，其包含如請求項1至18中任一項之核酸複合體或如請求項19至21中任一項之醫藥組合物。