WO2017131236A1 - 核酸複合体 - Google Patents

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WO2017131236A1
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compound
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nucleic acid
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上原　啓嗣
康裕 鈴木
宏徒 岩井
正一 本間
裕一 福田
達人 木内
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協和発酵キリン株式会社
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid complex and a pharmaceutical composition containing the nucleic acid complex.
  • nucleic acid drugs As nucleic acid drugs, aptamers, antisenses, decoy nucleic acids, ribozymes, siRNA, miRNA, antimiRNA and the like are known. Nucleic acid drugs are expected to be clinically applied to various diseases that have been difficult to treat because of their versatility that can control all genes in cells. Nucleic acid drugs are expected as next-generation drugs after antibodies and low-molecular-weight drugs because of their high target selectivity and activity in cells. However, it is a problem that nucleic acid drugs are difficult to deliver to target tissues.
  • nucleic acid complex conjuggate of a targeting compound and a nucleic acid is used as one of effective methods for delivering a nucleic acid drug in vivo.
  • Targeting compounds include ligands that can bind to receptors expressed extracellularly.
  • GalNAc N-acetyl-D-galactosamine
  • ASGPR asialoglycoprotein receptor
  • Patent Documents 1 and 2 disclose the following nucleic acid complexes.
  • Ac represents an acetyl group.
  • Patent Document 3 discloses a nucleic acid complex having the following structure having the same sugar ligand-tether unit as Patent Documents 1 and 2.
  • Patent Document 4 discloses a nucleic acid complex having the following structure as a sugar ligand-tether unit.
  • An object of the present invention is to provide a novel nucleic acid complex.
  • the present invention relates to the following (1) to (22).
  • Formula 1 (In Formula 1, X is an oligonucleotide; L1 and L2 are each independently a sugar ligand; S1, S2 and S3 are each independently a linker. )
  • the nucleic acid complex according to (1) which has a structure represented by the following formula 2.
  • Formula 2 (In Formula 2, X, L1, L2 and S3 are as defined above, P1, P2, P3, P4, P5 and P6, and T1 and T2 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—.
  • -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- Q1, Q2, Q3 and Q4 are each independently absent, substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons or — (CH 2 CH 2 O) n —CH 2 CH 2 —.
  • N is an integer from 0 to 99
  • B1 and B2 are each independently a bond or any structure represented by the following formula 2-1, and the terminal black dot in each structure is P2, P3, or P5, respectively.
  • Formula 4-1 Formula 4-2: Formula 4-3: Formula 4-4: Formula 4-5: Formula 4-6: Formula 4-7: Formula 4-8: Formula 4-9: (In formulas 4-1 to 4-9, X, L1, L2, S3, P3, P6, T1, T2, Q2, Q4, q2, and q4 are as defined above. )
  • Formula 4-9 (In formulas 4-1 to 4-9, X, L1, L2, S3, P3, P6, T1, T2, Q2, Q4, q2, and q4 are as defined above. )
  • Formula 5 (In Formula 5, X, S3, P1, P2, P3, Q1, Q2, B1, T1, L1, p1, q1, and q2 are as defined above. )
  • Formula 7-1 Formula 7-2: Formula 7-3: Formula 7-4: Formula 7-5: Formula 7-6: Formula 7-7: Formula 7-8: Formula 7-9: (10) The nucleic acid complex according to any one of (1) to (9), which has a structure represented by the following formula 11.
  • Formula 11 (In Formula 11, X, L1, L2, S1 and S2 are as defined above, P7 and P8 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- Q5, Q6 and Q7 are each independently absent, substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons or — (CH 2 CH 2 O) n8 —CH 2 CH 2 —, and n8 Is an integer from 0 to 99, B3 is any structure represented by the following formula 11-1, and means a bond with Q5 and Q6, respectively, in a broken line, Formula 11-1: q5 and q6 are each independently an integer of 0 to 10.
  • (14) (1) A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid complex according to any one of (13). (15) The pharmaceutical composition according to (14) for introduction into a cell. (16) The pharmaceutical composition according to (15), wherein the cell is a hepatocyte. (17) The pharmaceutical composition according to any one of (14) to (16), which is administered intravenously or subcutaneously. (18) (1) to (13) a nucleic acid complex according to any one of (14) to (17) or a pharmaceutical composition according to any one of (14) to (17), which is administered to a patient in need thereof. Treatment or prevention methods.
  • R1 and R2 are each independently a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, —CO—R4, or —CO—B4-[(P9-Q8 ) Q7- T3-L3] p3 , P9 and T3 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- Q8 is absent or is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms or — (CH 2 CH 2 O) n1 —CH 2 CH 2 —, and n1 is an integer of 0
  • B4 is each independently a bond or a structure represented by the following formula 8-1.
  • the black dot at the end of each structure is a bond to a carbonyl group or P9, respectively.
  • M7, m8, m9 and m10 are each independently an integer of 0 to 10,
  • Formula 8-1: p3 is an integer of 1, 2 or 3; q7 is an integer of 0 to 10, L3 is a sugar ligand;
  • Y is —O— (CH 2 ) m11 —NH— and —NH—CO— (CH 2 ) m12 —NH—, each of m11 and m12 is independently an integer of 1 to 10,
  • R3 represents a hydrogen atom, a t-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, —CO—R4, —CO— (CH 2 CH 2 O) n2 —CH 2 CH 2 —N 3 or
  • R5 and R6 are each independently a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, —CO—R4 ′, or —CO—Q11— (P11—Q11).
  • q9 is an integer from 0 to 10
  • L4 is a sugar ligand
  • Y ' is -O- (CH 2)
  • m12 ' is -NH-
  • R3 ′ represents a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group
  • R7 and R8 are each independently a hydroxy group, a t-butoxy group, a benzyloxy group, —NH—R10, or —NH—Q12- (P12-Q12 ′) q10- T5-L5;
  • L5 is a sugar ligand;
  • a pharmaceutical composition containing the nucleic acid complex of the present invention can be administered to a mammal to treat various related diseases in vivo.
  • the nucleic acid complex of the present invention is a nucleic acid complex represented by the following formula 1.
  • Formula 1 In Formula 1, X is an oligonucleotide; L1 and L2 are each independently a sugar ligand; S1, S2 and S3 are each independently a linker.
  • S1 and S2 can be bonded to the benzene ring at the ortho position, the meta position, and the para position, respectively, with respect to the substitution position on the benzene ring of S3.
  • the body is preferred.
  • the bond of S1 and S2 to the benzene ring in Formula 1 means that it can be at any position other than the substitution position of S3 on the benzene ring.
  • Formula 1-1 In Formula 1-1, X, L1, L2, S1, S2, and S3 are as defined above. In the present specification, the same meaning as described above will be described by exemplifying the inside of Formula 1-1. For each of X, L1, L2, S1, and S2 in Formula 1-1, X, L1, This means that it can be the same group as defined for L2, S1 and S2.
  • X is an oligonucleotide, and an oligonucleotide known to be used as a nucleic acid drug can be used.
  • the nucleic acid drug means nucleotides used as aptamers, antisenses, decoy nucleic acids, ribozymes, siRNA, miRNA, antimiRNA and the like.
  • S3 and oligonucleotide not only bind to S3 via the 3′-position or 5′-position of the sugar moiety constituting the nucleotide, but also bind to S3 via the base moiety constituting the nucleotide. May be.
  • the oligonucleotide may be understood as a group having a structure that binds S3 and the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide is represented by —OP (Z) (Z ′) O— (wherein Z And Z ′ are each independently an oxygen atom or a sulfur atom.)
  • Z And Z ′ are each independently an oxygen atom or a sulfur atom.
  • the oligonucleotide as X is —O—P (Z) (Z ′) O It may be understood as an oligonucleotide.
  • the oligonucleotide may be a single-stranded or double-stranded oligonucleotide.
  • the linker of S3 and the oligonucleotide of X are bonded at the 3 ′ end or 5 ′ end of the oligonucleotide.
  • the S3 linker is preferably bonded to the 3 ′ end or 5 ′ end of the sense strand constituting the double-stranded nucleic acid, but is limited to this bond. It is not a thing.
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the target mRNA is called an antisense nucleotide
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the antisense nucleotide is also called a sense nucleotide.
  • the oligonucleotide constituting the nucleic acid complex used in the present invention may have any shape as long as it has the ability to control the expression of a target gene when introduced into a mammalian cell. Double-stranded oligonucleotides are preferably used.
  • the oligonucleotide may be any molecule as long as it is a nucleotide or a polymer of molecules having functions equivalent to nucleotides, such as DNA that is a polymer of deoxyribonucleotides, RNA that is a polymer of ribonucleotides, DNA, A chimeric nucleic acid which is a polymer of RNA is exemplified.
  • a nucleotide polymer in which at least one nucleotide such as deoxyribonucleotide or ribonucleotide is substituted with a molecule having a function equivalent to nucleotide may be used.
  • uracil (U) in RNA is uniquely read as thymine (T) in DNA.
  • molecules having functions equivalent to nucleotides include nucleotide derivatives modified with nucleotides.
  • deoxyribonucleotides or molecules modified with ribonucleotides are preferably used.
  • nucleotide derivative examples include sugar-modified nucleotides, phosphodiester bond-modified nucleotides, base-modified nucleotides and the like, and nucleotides modified with at least one of the sugar moiety, phosphodiester bond and base.
  • the sugar moiety-modified nucleotide may be any nucleotide as long as it is a part or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide, modified or substituted with any substituent, or substituted with any atom.
  • '-Modified nucleotides are preferably used.
  • the 2′-OH group of ribose is OR, R, R′OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br and I.
  • Examples include modified nucleotides.
  • a crosslinked nucleic acid (BNA) having two cyclic structures by introducing a crosslinked structure into the sugar moiety is also preferably used.
  • a locked artificial nucleic acid (LNA) in which a 2′-position oxygen atom and a 4′-position carbon atom are bridged via methylene [Tetrahedron Letters, 38, 8735 (1997) and Tetrahedron, 54 , 3607 (1998)]
  • Ethylene bridged nucleic acid (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]
  • Constrained Ethyl (cEt) 75 The J15.
  • the phosphodiester bond-modified nucleotide is any nucleotide that has been modified or substituted with an arbitrary substituent for a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, or with any atom.
  • nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorothioate bond examples include nucleotides in which a diester bond is substituted with a phosphoramidate bond, and preferably nucleotides in which a phosphodiester bond is substituted with a phosphorothioate bond.
  • any or all of the nucleotide base chemical structure modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom may be used.
  • oxygen atoms are substituted with sulfur atoms
  • hydrogen atoms are substituted with alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms
  • halogen groups methyl groups are hydrogen atoms, hydroxymethyl groups, alkyl with 2 to 6 carbon atoms
  • an amino group is substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms, an oxo group, a hydroxy group, or the like.
  • 5-methylcytosine is used as a base-modified nucleotide instead of cytosine (C).
  • the nucleotide derivative include a peptide, protein, sugar, lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, a nucleotide derivative in which at least one of nucleotide or sugar moiety, phosphodiester bond or base is modified. Examples include those obtained by adding another chemical substance such as fluorescein, rhodamine, coumarin, dye, etc. directly or through a linker.
  • 5′-polyamine-added nucleotide derivatives examples include the body.
  • the nucleotide derivative may form a crosslinked structure such as an alkylene structure, a peptide structure, a nucleotide structure, an ether structure, an ester structure, and a structure obtained by combining at least one of these with other nucleotides or nucleotide derivatives in the nucleic acid.
  • Oligonucleotides include those in which some or all of the atoms in the molecule are replaced with atoms (isotopes) having different mass numbers.
  • complementary refers to base pairing between two bases via a loose hydrogen bond, such as the relationship between adenine and thymine or uracil, and the relationship between guanine and cytosine. Means a relationship.
  • “complementary” includes not only a case where two nucleotide sequences are completely complementary, but also having 0-30%, 0-20% or 0-10% mismatch bases between nucleotide sequences.
  • an antisense oligonucleotide complementary to a target mRNA means that one or more base substitutions may be included in the base sequence that is completely complementary to the partial base sequence of the target mRNA.
  • the antisense oligonucleotide has 1 to 8, preferably 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, particularly 2 or 1 mismatch bases with respect to the target sequence of the target gene. You may have.
  • the term “complementary” includes a case where one nucleotide sequence is a sequence in which one or more bases are added and / or deleted in a base sequence that is completely complementary to the other nucleotide sequence.
  • the target mRNA and antisense oligonucleotide may have one or two bulge bases in the antisense strand and / or target mRNA region due to base addition and / or deletion in the antisense oligonucleotide. Good.
  • the term “complementary” includes the meaning of “complementary”.
  • the antisense oligonucleotide used in the present invention is an oligonucleotide complementary to DNA encoding a target gene, mRNA precursor transcribed from DNA encoding the target gene, mRNA, microRNA precursor, or microRNA.
  • the anti-sense oligonucleotide suppresses the action of DNA, mRNA precursor, mRNA, microRNA precursor or microRNA by forming a double strand with the DNA, mRNA precursor or mRNA targeted.
  • Antisense oligonucleotides include not only those that are completely complementary to the target DNA, mRNA precursor, mRNA, microRNA precursor or microRNA, but also DNA, mRNA precursor, mRNA, microRNA precursor or microRNA and a stream.
  • the antisense oligonucleotide is a nucleic acid that hybridizes to the target gene, it may be introduced into the form of a hairpin oligomer or circular oligomer, and may contain structural elements such as an internal or terminal bulge or loop. .
  • the length of the antisense oligonucleotide is 8 to 80 bases, preferably 8 to 30 bases.
  • it can be 8 to 20 bases, 10 to 20 bases, 13 to 20 bases, 13 to 16 bases, 13 bases, 14 bases, 15 bases, 16 bases, 17 bases, 18 bases, 19 bases, 20 bases.
  • an antisense oligonucleotide When an antisense oligonucleotide is introduced into a cell, it can sterically inhibit the binding to a complementary mRNA precursor or mRNA and translation into a protein, thereby suppressing the expression of a target gene.
  • antisense oligonucleotides can bind to a complementary microRNA precursor or microRNA in a cell and sterically inhibit the function of the microRNA.
  • Antisense oligonucleotides may also bind to complementary mRNA and mRNA precursor in the cell and cleave the mRNA and mRNA precursor.
  • RNase H an action via RNase H, which is an endonuclease that cleaves RNA strands of double strands of RNA and DNA.
  • RNase H an endonuclease that cleaves RNA strands of double strands of RNA and DNA.
  • the antisense oligonucleotide preferably has 0 to 80% sugar-modified nucleotides, more preferably 10 to 60%, and even more preferably 20 to 50%.
  • the continuous DNA region having a sugar-modified nucleotide is more preferably 4 to 20, more preferably 4 to 15, and most preferably 5 to 10.
  • the position of the sugar-modified nucleotide in the antisense oligonucleotide is preferably arranged near the 5 ′ end and / or near the 3 ′ end, and / or within a position within 25% of the total length from the 5 ′ end and / or More preferably, it is arranged at a position within 25% of the total length from the 3 ′ end.
  • Antisense oligonucleotides can also induce the suppression of target gene expression by forming a double strand with a complementary oligonucleic acid and introducing it into a cell as a double-stranded nucleic acid (WO 2005/113571). See).
  • the position at which the double-stranded nucleic acid is modified with a ligand is preferably the 5 ′ end or 3 ′ end of a complementary oligonucleic acid.
  • the antisense oligonucleotide used in the present invention can enhance the expression of the target gene by using a base sequence complementary to the promoter sequence of the target gene (International Publication No. 2013/173601 and International See published 2013/173637).
  • the method for producing the antisense oligonucleotide is not particularly limited, and examples thereof include a method using a known chemical synthesis or an enzymatic transcription method.
  • known chemical synthesis methods include phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, CEM method [Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)], and the like, for example, ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesis Can be synthesized by a machine (Applied Biosystems). After the synthesis is completed, elimination from the solid phase, deprotection of the protecting group, purification of the target product, and the like are performed.
  • an antisense oligonucleotide having a purity of 90% or more, preferably 95% or more by purification is desirable to obtain an antisense oligonucleotide having a purity of 90% or more, preferably 95% or more by purification.
  • a transcription method using a phage RNA polymerase for example, T7, T3, or SP6 RNA polymerase, using a plasmid or DNA having a target base sequence as a template.
  • the double-stranded oligonucleotide used in the present invention includes a nucleic acid containing a base sequence complementary to a part of the base sequence of the target mRNA and / or a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid. As long as it is a nucleic acid, it may be comprised from any oligonucleotide or its derivative (s). In the double-stranded oligonucleotide used in the present invention, a nucleic acid containing a base sequence complementary to a target mRNA sequence and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid are duplexed.
  • the double-stranded oligonucleotide that suppresses the expression of the target protein used in the present invention is a nucleic acid that includes a base sequence complementary to the target mRNA sequence and that suppresses the expression of the target protein.
  • a nucleic acid comprising a strand nucleic acid or a nucleic acid containing a base sequence complementary to the target mRNA sequence and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid, and two which suppress the expression of the target protein A strand nucleic acid is preferably used.
  • a double-stranded oligonucleotide uses a molecule consisting of a nucleic acid containing a base sequence complementary to the promoter sequence of the target gene and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid, Target gene expression can also be enhanced [Nucleic Acid Research, 41, 10086 (2013), Hepatology, 59, 216 (2014)].
  • a double-stranded oligonucleotide refers to a nucleotide in which two oligonucleotides are paired and have a double-stranded region.
  • a double-stranded region refers to a portion where nucleotides constituting a double strand or derivatives thereof constitute a base pair to form a double strand.
  • the double-stranded region is usually 11 to 27 base pairs, preferably 15 to 25 base pairs, more preferably 15 to 23 base pairs, and further preferably 17 to 21 base pairs.
  • the single-stranded oligonucleotide constituting the double-stranded oligonucleotide usually comprises 11 to 30 bases, preferably 15 to 29 bases, more preferably 15 to 27 bases, and more preferably 15 to 25 bases. More preferably, it consists of a base, particularly preferably 17-23 bases.
  • a double-stranded oligonucleotide has an additional nucleotide or nucleotide derivative that does not form a duplex on the 3 ′ side or 5 ′ side following the double-stranded region, this is called an overhang.
  • the nucleotide constituting the overhang may be ribonucleotide, deoxyribonucleotide or a derivative thereof.
  • the double-stranded oligonucleotide having an overhang one having an overhang of 1 to 6 bases, usually 1 to 3 bases at the 3 ′ end or 5 ′ end of at least one strand is used.
  • protrusion part which consists of bases is used preferably, For example, what has the protrusion part which consists of dTdT or UU is mentioned.
  • Overhangs can be present in antisense oligonucleotides only, sense oligonucleotides only, and both antisense and sense oligonucleotides, but double-stranded oligonucleotides with overhangs in antisense oligonucleotides are preferred Used.
  • the antisense oligonucleotide includes a double-stranded region followed by a protruding portion.
  • a nucleic acid having the same sequence as the base sequence of the target gene or its complementary strand may be used, but the 5 ′ end or 3 ′ end of at least one strand of the nucleic acid may be used.
  • a double-stranded nucleic acid comprising a nucleic acid from which 1 to 4 bases have been deleted and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid may be used.
  • Double-stranded oligonucleotides are double-stranded RNA (dsRNA) in which RNA forms a double strand, double-stranded DNA (dsDNA) in which DNA forms a double strand, or RNA and DNA are double-stranded. It may be a hybrid nucleic acid that forms Alternatively, one or both of the double strands may be a chimeric nucleic acid of DNA and RNA. Preferred is double-stranded RNA (dsRNA).
  • the second nucleotide from the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide is preferably complementary to the second deoxyribonucleotide from the 3 ′ end of the target mRNA sequence, and the second to seventh positions from the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide. More preferably, the nucleotide is completely complementary to the 2-7th deoxyribonucleotide from the 3 ′ end of the target mRNA sequence, and the 2-11th nucleotide from the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide is More preferably, it is completely complementary to the 2-11th deoxyribonucleotide from the 3 ′ end.
  • the 11th nucleotide from the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide is preferably complementary to the 11th deoxyribonucleotide from the 3 ′ end of the target mRNA sequence, and 9-13 from the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide. More preferably, the 9th nucleotide is completely complementary to the 9th to 13th deoxyribonucleotides from the 3 ′ end of the target mRNA sequence, and the 7th to 15th nucleotides from the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide are the target mRNA. More preferably, it is completely complementary to the 7th to 15th deoxyribonucleotides from the 3 ′ end of the sequence.
  • the modified nucleotide is preferably contained in an amount of 50 to 100%, more preferably 70 to 100%, and still more preferably 90 to 100% with respect to the nucleotide in the double-stranded nucleic acid region.
  • Double-stranded oligonucleotides can be synthesized chemically and can generally be synthesized by using solid phase oligonucleotide synthesis methods (see, eg, Usman et al., US Pat. No. 5,804,683). Description: US Pat. No. 5,831,071; US Pat. No. 5,998,203; US Pat. No. 6,117,657; US Pat. No. 6,353,098 U.S. Patent 6,362,323; U.S. Patent 6,437,117; U.S. Patent 6,469,158; Scaringe et al., U.S. Patent 6,111,086. No. specification; US Pat. No. 6,008,400; see US Pat. No. 6,111,086).
  • RNA may be produced enzymatically or by partial / total organic synthesis, and modified ribonucleotides can be introduced in vitro by enzymatic or organic synthesis.
  • each chain is prepared chemically. Methods for chemically synthesizing RNA molecules are known in the art [see Nucleic Acids Research, 32, 936 (1998)].
  • RNA used in the present invention includes a sequence of 15 to 30 bases, preferably 17 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases of mRNA of the target gene (hereinafter referred to as sequence X) and complementary to sequence X.
  • RNA containing a typical base sequence hereinafter referred to as complementary sequence X ′
  • complementary sequence X ′ RNA containing a typical base sequence
  • Examples include RNA having a hairpin structure in which strand RNA, the sense oligonucleotide and the antisense oligonucleotide are connected by a spacer oligonucleotide.
  • sequence X chain RNA containing only sequence X as a base
  • sequence X chain 1 to 6 at the 3 ′ end or 5 ′ end or both ends of sequence X chain, preferably Includes RNA having 2 to 4 nucleotides added identically or differently.
  • Antisense oligonucleotides containing complementary sequence X ′ include RNA containing only complementary sequence X ′ as a base (hereinafter referred to as complementary sequence X ′ strand), 3 ′ end of complementary sequence X ′ strand Alternatively, double-stranded RNA or the like in which 1 to 6, preferably 2 to 4 nucleotides are added to the 5 ′ end or both ends, the same or different, can be mentioned.
  • a spacer oligonucleotide of RNA having a hairpin structure in which a sense oligonucleotide containing the sequence X and an antisense oligonucleotide containing the complementary sequence X ′ are connected by a spacer oligonucleotide a nucleotide having 6 to 12 bases is preferable.
  • the 5 ′ end sequence is preferably 2 U's.
  • An example of the spacer oligonucleotide is an oligonucleotide composed of the base sequence of UUCAGAGA.
  • Either of the two RNAs connected by the spacer oligonucleotide may be on the 5 ′ side, and the sense strand containing the sequence X is preferably on the 5 ′ side.
  • the nucleotide added to the sequence X chain and the complementary sequence X ′ chain, and the base of the spacer oligonucleotide may be any one or more of guanine, adenine, cytosine, thymine and uracil, and bind to each base.
  • the sugar to be added may be ribose, deoxyribose, or ribose in which the hydroxyl group at the 2 ′ position is substituted with a modifying group. 1 type or 2 types are more preferable.
  • nucleotide base sequence added to the 3 ′ end of the sequence X chain may be the same base sequence as the nucleotide base sequence adjacent to the sequence X in the mRNA of the target gene.
  • nucleotide base sequence added to the 3 ′ end of the complementary sequence X ′ chain may be a base sequence complementary to the nucleotide base sequence adjacent to the sequence X in the mRNA of the target gene.
  • RNA used in the present invention include, for example, (a) a double-stranded RNA comprising a sense oligonucleotide containing the sequence X and an antisense oligonucleotide containing the complementary sequence X ′, and the sequence X is the target A sequence consisting of 19 to 21 bases of mRNA of a gene, comprising a sense oligonucleotide comprising 2 to 4 identically or differently added nucleotides at the 3 ′ end of the sequence X strand and the sequence X strand, and antisense A double-stranded RNA comprising an oligonucleotide having 2 to 4 identically or differently added nucleotides to the complementary sequence X ′ strand and the 3 ′ end of the complementary sequence X ′ strand; (b) a sense oligo comprising the sequence X A double-stranded RNA consisting of an antisense oligonucleotide comprising a nucleo
  • RNA used in the present invention preferably includes RNA having an action of suppressing the expression of the target gene using RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • oligonucleotides Single-stranded oligonucleotides were synthesized using the solid phase phosphoramidite method [see Nucleic Acids Research, 30, 2435 (1993)], deprotected, and NAP-5 columns (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway). , NJ).
  • the oligomer is an Amersham Source 15Q column -1.0 cm using a 15 minute linear gradient. height. Purify using ion exchange high performance liquid chromatography (IE-HPLC) at 25 cm (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). The gradient changes from 90:10 buffer A: B to 52:48 buffer A: B, buffer A is 100 mmol / L Tris pH 8.5, and buffer B is 100 mmol / L.
  • each single-stranded oligonucleotide is determined by capillary electrophoresis (CE) on a Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif.).
  • CE capillaries have an inner diameter of 100 ⁇ m and contain ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
  • Typically, about 0.6 nmole of oligonucleotide is injected into the capillary and run in an electric field of 444 V / cm and detected by UV absorbance at 260 nm.
  • Denatured tris-borate-7 mol / L-urea running buffer is purchased from Beckman-Coulter.
  • Single-stranded oligonucleotides are obtained that are at least 90% pure as assessed by CE for use in the experiments described below. Compound identity is determined according to the manufacturer's recommended protocol according to Voyager DE. TM. Verified by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectroscopy on a Biospectrometry workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). The relative molecular mass of a single stranded oligonucleotide can be obtained within 0.2% of the expected molecular mass.
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight
  • Single-stranded oligonucleotides are resuspended at a concentration of 100 ⁇ mol / L in a buffer consisting of 100 mmol / L potassium acetate, 30 mmol / L HEPES, pH 7.5. Complementary sense and antisense strands are mixed in equal molar amounts to obtain a final solution of 50 ⁇ mol / L double stranded oligonucleotide. The sample is heated to 95 ° C. for 5 minutes and allowed to cool to room temperature before use. Double-stranded nucleic acids are stored at ⁇ 20 ° C. Single-stranded oligonucleotides are lyophilized or stored at ⁇ 80 ° C. in nuclease-free water.
  • L1 and L2 are each independently a sugar ligand.
  • the sugar ligand means a group derived from a saccharide (monosaccharide, disaccharide, trisaccharide, polysaccharide, etc.) capable of binding to a receptor expressed in a target cell.
  • the portion excluding the hydroxyl group involved in the binding of the sugar constituting the sugar ligand is the group derived from the sugar.
  • a sugar ligand to be a target cell for the oligonucleotide may be selected.
  • monosaccharides include allose, altose, arabinose, cladinose, erythrose, erythrulose, fructose, D-fucitol, L-fucitol, fucosamine, fucose, fucose, galactosamine, D-galactosaminitol, N-acetyl-galactosamine, Galactose, glucosamine, N-acetyl-glucosamine, glucosaminitol, glucose, glucose-6-phosphate, gulose, glyceraldehyde, L-glycero-D-manno-heptose, glycerol, glycerone, gulose, idose, lyxose, mannosamine , Mannose, mannose-6-phosphate, psicose, quinobose, quinovosamine, rhamnitol, rhamnosamine, rhamnose,
  • disaccharides examples include, for example, Abekuose, acraboose, amycetose, amylopectin, amylose, apiose, alkanose, ascarylose, ascorbic acid, boyvinose, cellobiose, cellotriose, cellulose, cacotriose, carcose, chitin, coritose, Cyclodextrin, simarose, dextrin, 2-deoxyribose, 2-deoxyglucose, digitonose, digitalose, digitoxose, everose, evermitrose, fructooligosaccharide, galto-oligosaccharide, gentianose, gentiobiose, glucan, glycogen, glycogen , Hamamelose, heparin, inulin, isolevoglucosenone, isoma Toose, isomalto
  • Each monosaccharide in the saccharide may be D-form or L-form, or may be a mixture of D-form and L-form in an arbitrary ratio.
  • amino sugars galactosamine, glucosamine, mannosamine, fucosamine, quinovosamine, neuraminic acid, muramic acid, lactose diamine, acosamine, basilosamine, daunosamine, desosamine, forosamine, galosamine, canosamine, kansosamine (kansamine) Micaminose, mycosamine, perosamine, punoimosamine, purpurosamine, rhodosamine and the like.
  • the amino group of the amino sugar may be substituted with an acetyl group or the like.
  • sialic acid-containing sugar chain examples include a sugar chain containing NeuAc at the non-reducing end of the sugar chain, such as a sugar chain containing NeuAc-Gal-GlcNAc, Neu5Ac ⁇ (2-6) Gal ⁇ (1-3) GlcNAc, etc. Is mentioned.
  • Each monosaccharide in the saccharide may be substituted with a substituent as long as it can bind to the receptor expressed in the target cell.
  • each monosaccharide may be substituted with a hydroxyl group.
  • one or more hydrogen atoms may be substituted with an azide and / or optionally substituted aryl group.
  • the sugar ligand it is preferable to select a sugar ligand that binds to a receptor expressed on the surface of the target cell corresponding to each target organ.
  • a sugar ligand for the expressed receptor is preferred, and a sugar ligand for the asialoglycoprotein receptor (ASGPR) is more preferred.
  • sugar ligand for ASGPR mannose or N-acetylgalactosamine is preferable, and N-acetylgalactosamine is more preferable.
  • sugar ligands having higher affinity for ASGPR for example, sugar derivatives described in Bioorganic Medicinal Chemistry, 17, 7254 (2009), and Journal of American Chemical Society, 134, 1978 (2012) are known. These may be used.
  • S1, S2 and S3 are linkers.
  • S1 and S2 are not particularly limited as long as they are structures that link sugar ligands L1 and L2 and a benzene ring, and known structures used in nucleic acid complexes may be adopted.
  • S1 and S2 may be the same or different.
  • the sugar ligands L1 and L2 are preferably linked to S1 and S2 by a glycosidic bond, and S1 and S2 are connected to a benzene ring, for example, —CO—, —NH—, —O—, —S—. , —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH— may be connected to each other.
  • S3 is not particularly limited as long as it is a structure linking an oligonucleotide X and a benzene ring, and a known structure used in a nucleic acid complex may be adopted.
  • X that is an oligonucleotide is preferably linked to S3 by a phosphodiester bond, and S3 is linked to a benzene ring, for example, —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO. They may be linked by a —, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH— bond.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formula 2.
  • Formula 2 In Equation 2, X, L1, L2 and S3 are as defined above, P1, P2, P3, P4, P5 and P6, and T1 and T2 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—.
  • -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- Q1, Q2, Q3 and Q4 are each independently absent, substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons or — (CH 2 CH 2 O) n —CH 2 CH 2 —.
  • N is an integer from 0 to 99
  • B1 and B2 are each independently a bond or any structure represented by the following formula 2-1, and the terminal black dot in each structure is P2, P3, or P5, respectively.
  • P1 and P4 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH—, preferably —O—, —O—CO—, —NH—CO— or —CO—NH—, More preferred is —, —NH—CO— or —CO—NH—, and more preferred is —NH—CO—.
  • P1 or P4 is, for example, —NH—CO—, it has a partial structure of —NH—CO—benzene ring.
  • Q1, Q2, Q3 and Q4 are each independently absent, substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons or — (CH 2 CH 2 O) n —CH 2 CH 2 —.
  • N is an integer of 0 to 99, preferably a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons, more preferably an unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons, and unsubstituted More preferred is alkylene having 1 to 6 carbon atoms, and still more preferred is unsubstituted alkylene having 1 to 4 carbon atoms.
  • P2 and P5 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH—, preferably absent, —CO—O— or —CO—NH—, absent, —CO—NH -Is more preferable.
  • P2 and P5 are, for example, —CO—NH—, they have partial structures of B1-CO—NH-Q1 and B2-CO—NH-Q3.
  • Formula 3-1 Formula 3-2 Formula 3-3: In formulas 3-1 to 3-3, m5 and m6 are each independently an integer of 0 to 10, and the terminal black dot in the structure of Formula 3-1 to Formula 3-3 is the point of attachment to B1 or B2 or P1 or P4, respectively. is there.
  • B1 and B2 are each independently a bond or any structure represented by the following formula, and the terminal black dot in each structure is P2 or P3 or P5 or P6, respectively.
  • m1, m2, m3 and m4 are each independently an integer of 0 to 10.
  • B1 and B2 are preferably groups derived from amino acids containing unnatural amino acids such as glutamic acid, aspartic acid, lysine and iminodiacetic acid, or amino alcohols such as 1,3-propanediol, and B1 and B2 are glutamic acids.
  • an aspartic acid-derived group the amino groups of glutamic acid and aspartic acid are bonded to each other, and P2 and P5 are preferably —NH—CO— bonds, and B1 and B2 are groups derived from lysine. In this case, the carboxyl group of lysine is bonded to each other, and P2 and P5 are preferably —CO—NH— bonds.
  • B1 and B2 are groups derived from iminodiacetic acid, Each amino group is bonded to form a —CO— bond as P2 and P5. It is preferred.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formulas 4-1 to 4-9.
  • Formula 4-1 Formula 4-2: Formula 4-3: Formula 4-4: Formula 4-5: Formula 4-6: Formula 4-7: Formula 4-8: Formula 4-9: In formulas 4-1 to 4-9, X, L1, L2, S3, P3, P6, T1, T2, Q2, Q4, q2, and q4 are as defined above.
  • P3 and P6 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH— is preferred, but —O—CO— or —NH—CO— is preferred, and —NH—CO— is more preferred.
  • P3 and P6 are, for example, —NH—CO—, they have partial structures of B1-NH—CO—Q2 and B2-NH—CO—Q4, respectively.
  • T1 and T2 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH— is preferred, but —O— or —S— is preferred, and —O— is more preferred.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formula 5.
  • P1 and P4 in Formula 2 P2 and P5, P3 and P6, Q1 and Q3, Q2 and Q4, B1 and B2, T1 and T2, L1 and L2, p1 and p2, q1 and q3, and q2 and q4 are the same.
  • Formula 5 In Formula 5, X, S3, P1, P2, P3, Q1, Q2, B1, T1, L1, p1, q1, and q2 are as defined above.
  • X, S3, P1, P2, P3, Q1, Q2, B1, T1, L1, p1, q1 and q2 in Formula 5 may each be a suitable group as described above, but P1 may be —CO—. NH—, —NH—CO— or —O— is preferable.
  • -(P2-Q1) q1 -in Formula 5 preferably does not exist or has any structure represented by Formula 3-1 to Formula 3-3.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formulas 6-1 to 6-9.
  • Formula 6-1 Formula 6-2: Formula 6-3: Formula 6-4: Formula 6-5: Formula 6-6: Formula 6-7: Formula 6-8: Formula 6-9: In Formula 6-1 to Formula 6-9, X, S3, P3, Q2, T1, and L1 are as defined above.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by any one of the following formulas 7-1 to 7-9.
  • X, L1, L2, and S3 are as defined above.
  • L1 and L2 may be the same or different and are preferably the same.
  • each alkylene group moiety is introduced with an alkylene chain having a different chain length, and the amide bond or the like is substituted with another bond, thereby replacing Formula 7-1 to Formula 7 with each other.
  • Nucleic acid derivatives other than the nucleic acid complex having the structure represented by ⁇ 9 can also be produced.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formula 11.
  • Formula 11 In Formula 11, L1, L2, S1 and S2 are as defined above, P7 and P8 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- Q5, Q6 and Q7 are each independently absent, substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons or — (CH 2 CH 2 O) n8 —CH 2 CH 2 —, and n8 Is an integer from 0 to 99, B3 is referred to as a blanker unit in the present specification, and is any structure represented by the following formula 11-1, and means a bond with Q5 and Q6, respectively, in broken lines, Formula 11-1: q5 and q6 are each independently an integer of 0 to 10.
  • P7 is absent, or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, — CO—S— or —CO—NH—, preferably —O—, —NH—CO— or —CO—NH—, more preferably —O— or —NH—CO—.
  • P7 when P7 is —O—, it has a partial structure of benzene ring —O—.
  • P8 is absent, or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—, — CO—S— or —CO—NH—, but when present, is preferably —CO—O— or —CO—NH—, more preferably —CO—NH—.
  • P8 is, for example, —CO—NH—, it has a partial structure of Q6-CO—NH—.
  • Q5, Q6 and Q7 are each independently absent, substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbons or — (CH 2 CH 2 O) n8 —CH 2 CH 2 —, and n8 Is an integer of 0 to 99, preferably a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, more preferably an unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, and an unsubstituted carbon number. It is more preferably 1 to 6 alkylene, and even more preferably unsubstituted alkylene having 1 to 4 carbon atoms.
  • q5 — is —O— (CH 2 ) m15 —NH— and —NH—CO— (CH 2 ) m16 —NH—, and each of m15 and m16 is independently 1 to An integer of 10 is preferred.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by any of the following formulas 12-1 to 12-12.
  • Formula 12-1 Formula 12-2: Formula 12-3: Formula 12-4: Formula 12-5: Formula 12-6: Formula 12-7: Formula 12-8: Formula 12-9: Formula 12-10: Formula 12-11: Formula 12-12: In formulas 12-1 to 12-12, X, L1, L2, S1 and S2 are as defined above, and n1 ′ to n12 ′ are each independently an integer of 1 to 10.
  • the nucleic acid complex of the present invention is preferably a nucleic acid complex having both the structures of Formula 2 and Formula 11 in the nucleic acid complex represented by Formula 1, and the nucleic acid complex has the structure of Formula 11
  • Formula 2 may be Formula 4-1 to Formula 4-9, Formula 6-1 to Formula 6-9, Formula 7-1 to Formula 7-9, or Well, when Formula 2 is Formula 4-1 to Formula 4-9, Formula 6-1 to Formula 6-9, or Formula 7-1 to Formula 7-9, Formula 11 is replaced with Formula 12-1 to Formula 12-9. Equation 12-12 may also be used.
  • the nucleic acid complex of the present invention is a nucleic acid complex represented by formula 1, wherein any one structure of formula 4-1 to formula 4-9 and any one structure of formula 12-1 to formula 12-12 are used.
  • the nucleic acid complex of the present invention may form a salt with a pharmaceutically acceptable anion when a hydrogen ion is coordinated to a lone electron pair on any nitrogen atom.
  • examples of the pharmaceutically acceptable anion include inorganic ions such as chloride ion, bromide ion, nitrate ion, sulfate ion and phosphate ion, acetate ion, oxalate ion, maleate ion, and fumarate ion.
  • organic acid ions such as citrate ion, benzoate ion, and methanesulfonate ion.
  • a method for producing the nucleic acid complex of the present invention will be described.
  • introduction and removal of a protective group commonly used in organic synthetic chemistry Methods e.g., Protective Groups in Organic Synthesis, third edition, by TW Greene, John Wiley & Sons Inc. (1999), etc.] can be used to produce the target compound.
  • the order of reaction steps such as introduction of substituents can be changed as necessary.
  • the nucleic acid polymer represented by Formula 1 can also be synthesized by solid phase synthesis.
  • the nucleic acid polymer represented by Formula 1 can be synthesized with reference to a synthesis method of a linker structure known as a nucleic acid complex.
  • the synthesis of the L1-benzene ring unit with S1 as the linker and the L2-benzene ring unit with S2 as the linker in the nucleic acid complex represented by formula 1 is exemplified by the nucleic acid complex represented by formula 2 as an example. explain.
  • the L1-benzene ring unit and the L2-benzene ring unit in the nucleic acid complex represented by Formula 2 are linked by P1, P2, P3, P4, P5, and P6, and T1 and T2.
  • P1, P2, P3, P4, P5, and P6 and T1 and T2 —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO— , —CO—O—, —CO—S— or —CO—NH— bond may be selected from, for example, 4th edition experimental chemistry course 19 “Synthesis of organic compounds I” Maruzen (1992), 4th edition experimental chemistry course 20 With reference to the method of coupling reaction described in “Synthesis of Organic Compounds II”, Maruzen (1992)), etc., synthesis is appropriately performed by selecting an appropriate raw material for forming the structure represented by Formula 2. be able to.
  • a partial structure of the L1-benzene ring unit can be produced by bonding a compound having Q1 as a partial structure and a compound having B1 as a partial structure in this order from the benzene ring.
  • a compound having L1 and Q2 as a partial structure is separately synthesized, and a compound having L1 and Q2 as a partial structure is combined with a compound having a partial structure of an L1-benzene ring unit having Q1 and B1 as partial structures.
  • an L1-benzene ring unit structure can be produced.
  • a partial structure of the L2-benzene ring unit can be produced by combining a compound having Q3 as a partial structure and a compound having B2 as a partial structure, sequentially from the benzene ring. .
  • a compound having L2 and Q4 as a partial structure is separately synthesized, and a compound having L2 and Q4 as a partial structure is combined with a compound having a partial structure of an L2-benzene ring unit having Q3 and B2 as partial structures.
  • an L2-benzene ring unit structure can be produced.
  • a compound having Q1 as a partial structure and a compound having Q3 as a partial structure include a hydroxyl group and a carboxyl group at both ends of alkylene having 1 to 10 carbon atoms or — (CH 2 CH 2 O) n —CH 2 CH 2 —. , An amino group, and a compound having a thiol group.
  • the compound having B1 as a partial structure and the compound having B2 as a partial structure have any structure represented by the following formula 2-1, and at the terminal black dot in each structure, a hydroxyl group and a carboxyl group, respectively. , An amino group, or a compound having a thiol group.
  • Formula 2-1 Specific examples of the compound having B1 as a partial structure and the compound having B2 as a partial structure include glycol, glutamic acid, aspartic acid, lysine, Tris, iminodiacetic acid, 2-amino-1,3-propanediol and the like. Glutamic acid, aspartic acid, lysine and iminodiacetic acid are preferred.
  • An L1-benzene ring unit structure may be produced by synthesizing a compound having L1, Q2 and B1 as a partial structure, and then combining with Q1 and a compound having a benzene ring.
  • An L2-benzene ring unit structure may be produced by synthesizing a compound having L2, Q4, and B2 as a partial structure and then combining Q3 with a compound having a benzene ring.
  • [L1-T1- (Q2- P3) q2 -] p1 -B1- and substructure is (P2-Q1) q1 a -P1-, [L2-T2- (Q3 -P6) q4 -] p2 -B2- (P5-Q3)
  • the partial structure which is q3- P2- may be the same or different, but is preferably the same.
  • L3-T1-Q2-COOH As a unit corresponding to L1-T1-Q2 sugar ligand, for example, L3-T1-Q2-COOH , L3-T1- (Q2-P3) q2-1 -Q2-NH 2 and the like. Specific examples thereof include L3-O—alkylene-COOH having 1 to 12 carbon atoms, L3-alkylene-CO—NH having 1 to 12 carbon atoms, and alkylene-NH 2 having 2 to 12 carbon atoms.
  • L3 is not particularly limited as long as it is a sugar ligand derivative that becomes L1 by deprotection.
  • the substituent of the sugar ligand is not particularly limited as long as it is a substituent that is widely used in the field of carbohydrate chemistry, but an Ac group is preferable.
  • the terminal amino group and terminal carboxyl group may be represented by —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, —CO—O—.
  • —CO—S— or —CO—NH— can be synthesized by using a compound converted into a group capable of forming a bond.
  • mannose or N-acetylgalactosamine is exemplified for the L1 sugar ligand, but the sugar ligand can be changed to other sugar ligands.
  • the synthesis of the X-benzene ring unit using S3 as a linker in the nucleic acid complex represented by Formula 1 will be described using, for example, the nucleic acid complex represented by Formula 11 as an example.
  • the X-benzene ring unit in the nucleic acid complex represented by Formula 11 has bonds represented by P7 and P8 in addition to the oligonucleotide bond.
  • —CO—NH— bond is, for example, 4th edition experimental chemistry course 19 “Synthesis of organic compounds I” Maruzen (1992), 4th edition experimental chemistry course 20 “Organic compounds synthesis II”, Maruzen (1992). ) Can be synthesized as appropriate by selecting an appropriate raw material for forming the structure represented by Formula 11 with reference to the method of the coupling reaction described in (1).
  • a partial structure of the X-benzene ring unit can be produced by sequentially bonding a compound having Q5 as a partial structure and a compound having B3 as a partial structure from the benzene ring.
  • a compound having X and Q7 as a partial structure, or a compound having X and Q6 as a partial structure are separately synthesized, and a compound having X and Q7 as a partial structure or a compound having X and Q6 as a partial structure is combined with a benzene ring and Q5.
  • An X-benzene ring unit structure can be produced by constructing the B3 moiety by bonding with a compound having a partial structure of the X-benzene ring unit as a partial structure.
  • an end-binding functional group as disclosed in the Examples is taken as an example.
  • An X-benzene ring unit structure can be produced by reacting the conjugated oligonucleotide to form a triazole ring by cycloaddition to form a B3 moiety.
  • the compound having Q5 as a partial structure, the compound having Q6 as a partial structure, and the compound having Q7 as a partial structure are alkylene having 1 to 10 carbon atoms or — (CH 2 CH 2 O) n8 —CH 2 CH 2 —.
  • a compound having a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, or a thiol group at both ends can be mentioned.
  • the L1-benzene ring unit structure, the L2-benzene ring unit structure, and the X-benzene ring unit structure can be produced sequentially, but the L1-benzene ring unit structure and the L2-benzene ring unit structure are synthesized. Then, it is preferable to bond the X-benzene ring unit structure.
  • X having an oligonucleotide moiety is preferably introduced into the compound near the final step of the sugar ligand complex synthesis.
  • R1 and R2 are each independently a hydrogen atom, a t-butoxycarbonyl group (Boc group), a benzyloxycarbonyl group (Z group), a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc group), —CO—R4 Or -CO-B4-[(P9-Q8) q7- T3-L3] p3 , P9 and T3 are each independently absent or —CO—, —NH—, —O—, —S—, —O—CO—, —S—CO—, —NH—CO—, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- Q8 is absent or is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms or — (CH 2 CH 2 O) n1 —CH 2 CH 2 —, and
  • B4 is each independently a bond or a structure represented by the following formula 8-1.
  • the black dot at the end of each structure is a bond to a carbonyl group or P9, respectively.
  • M7, m8, m9 and m10 are each independently an integer of 0 to 10,
  • Formula 8-1: p3 is an integer of 1, 2 or 3; q7 is an integer of 0 to 10, L3 is a sugar ligand;
  • Y is —O— (CH 2 ) m11 —NH— and —NH—CO— (CH 2 ) m12 —NH—, each of m11 and m12 is independently an integer of 1 to 10,
  • R3 represents a hydrogen atom, a t-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, —CO—R4, —CO— (CH 2 CH 2 O) n2 —CH 2 CH 2 —N 3 or
  • R5 and R6 are each independently a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, —CO—R4 ′, or —CO—Q11— (P11—Q11).
  • q9 is an integer from 0 to 10
  • L4 is a sugar ligand
  • Y ' is -O- (CH 2)
  • m12 ' is -NH-
  • R3 ′ represents a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group
  • R7 and R8 are each independently a hydroxy group, a t-butoxy group, a benzyloxy group, —NH—R10, or —NH—Q12- (P12-Q12 ′) q10- T4-L4;
  • L4 is a sugar ligand
  • Y2 is —O— (CH 2 )
  • P1 is a protecting group deprotectable by a base such as Fmoc
  • DMTr represents a p, p′-dimethoxytrityl group
  • R represents a sugar ligand-tether unit
  • R ′ represents (Each hydroxyl group of a sugar ligand represents a group protected with a protecting group that can be deprotected with a base such as an acetyl group
  • Polymer represents a solid phase carrier
  • Q ′ represents —CO—.
  • Compound (IB) is obtained by mixing compound (IA) and p, p′-dimethoxytrityl chloride at a temperature between 0 ° C. and 100 ° C. in a solvent such as pyridine, if necessary, in the presence of a cosolvent. And can be produced by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • a cosolvent include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide (DMF). , N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like, and these may be used alone or in combination.
  • Process 2 Compound (IC) is obtained by reacting Compound (IB) without solvent or in the presence of 1 to 1000 equivalents of a secondary amine at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • the solvent include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide (DMF), N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
  • secondary amines include diethylamine and piperidine.
  • Compound (1-E) comprises compound (IC) and compound (ID), without solvent or in a solvent, 1 to 30 equivalents of a base, a condensing agent, and optionally 0.01 to 30 equivalents.
  • a base examples include those exemplified in Step 2.
  • the solvent include those exemplified in Step 2.
  • the base include cesium carbonate, potassium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, potassium tert-butoxide, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.
  • DBU 1,3-dicyclohexanecarbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • carbonyldiimidazole benzotriazol-1-yloxytris (Dimethylamino) phosphonium hexafulholophosphate, (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N '-Tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium he
  • additive examples include 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and the like.
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • ID can be obtained by a known method (see, for example, Journal of American Chemical Society, 136, 16958, (2014)) or a method analogous thereto.
  • Process 4 Compound (IF) is obtained by reacting Compound (IE) and succinic anhydride in a solvent in the presence of 1 to 30 equivalents of a base at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours. Can be manufactured.
  • Examples of the solvent include those exemplified in Step 2.
  • Examples of the base include those exemplified in Step 3.
  • Compound (IG) comprises compound (IF) and a solid phase carrier aminated at the end, in the absence of a solvent or in a solvent, 1 to 30 equivalents of a base, a condensing agent, and 0. After reacting for 5 minutes to 100 hours at a temperature between room temperature and 200 ° C. in the presence of 01 to 30 equivalents of additive, the acetic anhydride / pyridine solution and the temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours It can be produced by reacting.
  • the solvent include those exemplified in Step 2.
  • Examples of the base, the condensing agent, and the additive include those exemplified in Step 3.
  • Examples of the aminated solid phase carrier include long-chain alkylamine porous glass (LCAA-CPG) and the like, and these can be obtained as commercial products.
  • Step 6 A nucleic acid complex having a sugar ligand-tether-brancher unit represented by the formula (I ′) is prepared by using the compound (IG) and extending the corresponding nucleotide chain by a known oligonucleotide chemical synthesis method. It can be produced by desorption from the solid phase, deprotection of the protecting group and purification.
  • oligonucleotide chemical synthesis methods include the phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, CEM method (see Nucleic Acids Research, 35, 3287 (2007)), and the like, for example, ABI3900 high It can be synthesized by a throughput nucleic acid synthesizer (Applied Biosystems).
  • Desorption from the solid phase and deprotection can be produced by treating with a base for 10 seconds to 72 hours at a temperature between ⁇ 80 ° C. and 200 ° C. in a solvent or without solvent after oligonucleotide oligonucleotide synthesis. it can.
  • Examples of the base include ammonia, methylamine, dimethylamine, ethylamine, diethylamine, isopropylamine, diisopropylamine, piperidine, triethylamine, ethylenediamine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU), carbonic acid. Potassium etc. are mentioned.
  • Examples of the solvent include water, methanol, ethanol, THF and the like.
  • Oligonucleotides can be purified by a C18 reverse phase column or an anion exchange column, preferably a combination of the above two techniques.
  • the purity of the nucleic acid complex after purification is 90% or more, preferably 95% or more.
  • the compound (ID) can be divided into two units, if necessary, and condensed in two steps with the compound (IC). Specifically, for example, when RQ ′ is R—NH—CO—Q4′—CO— (Q4 ′ is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms), (IC) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q4′—CO—OH (Q4 ′ is as defined above) are condensed in the same manner as in Step 3, and the ethyl ester of the resulting compound is obtained.
  • the method for producing the nucleic acid derivative of the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (II ′).
  • TBDMS represents a t-butyldimethylsilyl group
  • Fmoc represents a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
  • Step 7 Compound (II-A) is compound (IA), t-butyldimethylsilyl chloride and dimethylaminopyridine in a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF), preferably in the presence of 2 equivalents of a base. And reacting at a temperature between 0 ° C. and 100 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF)
  • a base include those exemplified in Step 3 of Production Method 1.
  • Process 8 Compound (II-B) can be produced using compound (II-A) under the same conditions as in Step 1 of Production Method 1.
  • Step 9 Compound (II-C) is produced by reacting compound (II-B) and n-tetrabutylammonium fluoride (TBAF) in a solvent at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours. can do.
  • TBAF n-tetrabutylammonium fluoride
  • Examples of the solvent include those exemplified in Step 2.
  • Step 10 Compound (II-D) can be produced using compound (II-C) under the same conditions as in Step 2 of Production Method 1.
  • Step 11 Compound (II-E) can be produced using compound (II-D) and compound (ID) under the same conditions as in Step 3 of Production Method 1.
  • Process 12-14 Compound (II ′) can be produced using compound (II-E) under the same conditions as in Steps 4 to 6 of Production Method 1.
  • Step 11 the compound (ID) can be divided into two units, if necessary, and condensed in two steps with the compound (II-C).
  • RQ ′ is —NH—CO—Q4′—CO—
  • Q4 ′ is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms
  • the compound (II— C) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q4′—CO—OH are condensed in the same manner as in Step 11, and the ethyl ester of the resulting compound is added to ethanol or
  • the target compound can be obtained by hydrolysis with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as water and further condensation with R′—NH 2 (R ′ is as defined above).
  • the method for producing the nucleic acid derivative of the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (III ′).
  • Compound (III ′) can be produced under the same conditions as in Step 1 to Step 6 of Production Method 1 using Compound (III-A).
  • Compound (III-A) can be obtained as a commercial product.
  • Step 15 Compound (III-B) can be produced using compound (III-A) under the same conditions as in Step 1 of Production Method 1.
  • Compound (III-A) can be purchased as a commercial product.
  • Step 16 Compound (III-C) can be produced using compound (III-B) under the same conditions as in Step 2 of Production Method 1.
  • Step 17 Compound (III-E) can be produced using compound (III-C) under the same conditions as in Step 3 of Production Method 1.
  • compound (ID) can be divided into two units and condensed with compound (III-C) in two stages, if necessary.
  • RQ ′ is —NH—CO—Q4′—CO—
  • Q4 ′ is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms
  • compound (III- C) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q4′—CO—OH are condensed in the same manner as in Step 17, and the ethyl ester of the resulting compound is added to ethanol or
  • the target compound can be obtained by hydrolysis with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as water and further condensation with R′—NH 2 (R ′ is as defined above).
  • Manufacturing method 4 The method for producing the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (IV ′).
  • Compound (IV ′) can be produced using Compound (IV-A) under the same conditions as in Step 1 to Step 6 of Production Method 1.
  • Compound (IV-A) can be obtained as a commercial product.
  • step 23 if necessary, compound (ID) can be divided into two units and condensed in two steps with compound (IV-C). Specifically, for example, when R′—Q ′ is —NH—CO—Q4′—CO— (Q4 ′ is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms), (IV-C) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q4′—CO—OH (Q4 ′ is as defined above) are condensed in the same manner as in Step 23, and the ethyl ester of the resulting compound is obtained.
  • the method for producing the nucleic acid derivative of the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (V ′).
  • Compound (V ′) can be produced using compound (IV-A) under the same conditions as in Step 1 to Step 7 of Production Method 2.
  • Compound (IV-A) can be obtained as a commercial product.
  • step 31 the compound (ID) can be divided into two units and condensed with the compound (VD) in two stages, if necessary. Specifically, for example, when R′—Q ′ is —NH—CO—Q4′—CO— (Q4 ′ is a substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms), (VD) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q4′—CO—OH (Q4 ′ is as defined above) are condensed in the same manner as in Step 31, and the ethyl ester of the resulting compound is obtained.
  • Q is —CO—
  • a method similar to the above or a known method can be obtained by appropriately changing the structure of Q—OH.
  • it can be prepared by combining these and appropriately changing the reaction conditions.
  • Manufacturing method 6 A method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is bound to the 5 ′ end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Step 35 Compound (IH) comprises compound (II-E) and 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropylphosphodiamidite in the absence of a solvent or in a solvent in the presence of a base and a reaction accelerator. It can be produced by reacting at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • the solvent include those exemplified in Step 2 of Production Method 1.
  • Examples of the base include those exemplified in Step 3 of Production Method 1.
  • the reaction accelerator include 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzylthiotetrazole and the like, which can be purchased as commercial products.
  • Step 36 Extend the oligonucleotide chain, and finally use compound (IH) to modify the 5 'end of the oligonucleotide with a sugar ligand-tether-brancher unit, and then remove from the solid phase and deprotect the protecting group.
  • compound (I ′′) By performing purification, compound (I ′′) can be produced.
  • desorption from the solid phase, deprotection of the protecting group, and purification can be respectively performed in the same manner as in Step 7 of Production Method 1.
  • Manufacturing method 7 A method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is bound to the 5 ′ end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 8 A method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is bound to the 5 ′ end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 9 A method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is bound to the 5 ′ end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 10 A method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is bound to the 5 ′ end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • a sense strand having a sugar ligand-tether-brancher unit at the 3 'end or 5' end of the sense strand constituting the double-stranded nucleic acid and the antisense strand constituting the double-stranded nucleic acid are mixed with water or an appropriate buffer.
  • a nucleic acid complex having a double-stranded nucleic acid can be obtained by dissolving and mixing each in a liquid.
  • the buffer solution include acetate buffer solution, Tris buffer solution, citrate buffer solution, phosphate buffer solution, water and the like, and these can be used alone or in combination.
  • the mixing ratio of the sense strand to the antisense strand is preferably 0.5 to 2 equivalents, more preferably 0.9 to 1.1 equivalents, and 0.95 equivalents to 1 equivalents for 1 equivalent of the sense strand. 0.05 equivalents are more preferred.
  • an annealing treatment may be appropriately performed.
  • the annealing treatment is performed by heating the mixture of the sense strand and the antisense strand to preferably 50 to 100 ° C., more preferably 60 to 100 ° C., and still more preferably 80 to 100 ° C., and then gradually cooling to room temperature. Can do.
  • the antisense strand can be obtained according to the above-described known oligonucleotide synthesis method.
  • the method for producing the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (VI ′).
  • VI ′ a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (VI ′).
  • DMTr, R, R ′, X, Q ′, Polymer, TBS and Fmoc are as defined above, and R0 and Rx are the same or different and represent a hydrogen atom, C1-C10 alkylene or C3-C8.
  • W is C1-C10 alkylene, C3-C8 cycloalkylene, or may be combined with R0 to form a C4-C8 nitrogen-containing heterocycle.
  • Step 45 Compound (VI-B) can be produced using compound (VI-A) under the same conditions as in Step 1 of Production Method 1.
  • Compound (VI-A) can be obtained as a commercially available product, or can be obtained by a known method (for example, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 11, pages 383-386) or a method analogous thereto.
  • Step 46 Compound (VI-C) can be produced using compound (VI-B) under the same conditions as in Step 2 of Production Method 1.
  • Step 47 Compound (VI-D) can be produced using compound (VI-C) under the same conditions as in Step 3 of Production Method 1.
  • Step 48 Compound (VI-E) can be produced using compound (VI-D) under the same conditions as in Step 2 of Production Method 1.
  • Step 49 Compound (VI-G) can be produced using Compound (VI-E) and Compound (VI-F) under the same conditions as in Step 3 of Production Method 1.
  • Step 50 Compound (VI-H) can be produced using compound (VI-G) under the same conditions as in Step 9 of Production Method 2.
  • Step 51-53 Compound (VI ′) can be produced using compound (VI-H), compound (VI-I) and compound (VI-J) under the same conditions as in Steps 4 to 6 of Production Method 1.
  • Steps 45 to 53 can also be carried out by a known method (for example, the method described in International Publication No. 2015/105083) or a method analogous thereto.
  • Compound (VI-F) is obtained by a known method (for example, the method described in Journal of American Chemical Society, Vol. 136, 16958, Mitsugu, 2014) or a method analogous thereto. I can do things.
  • a sugar ligand-tether unit in which P1 and P4 in formula 2 are —NH—CO—, —O—CO— or —S—CO— can be produced by the following method.
  • Q1, Q2, Q3, Q4, Q5, P2, P3, P5, P6, P7, T1, T2, L1, L2, q1, q2, q3 and q4 are as defined above, respectively, and q1 ′ is q1 represents an integer smaller than q1, q2 ′ represents an integer smaller than q2, and P1 ′ and P4 ′ each independently represent —CO—O—, —CO—NH—, or —CO—S—.
  • B1 ′ and B2 ′ are any of the structures of the following formulae 1 and PG1, PG2, PG3, PG4, PG5, PG6 and PG7 each represents a suitable protecting group.) formula: m1, m2, m3 or m4 each independently represents an integer of 0 to 10.
  • Step 54 Compound (VII-C) was prepared by adding compound (VII-A) and compound (VII-B) to a triphenylphosphine polymer carrier in a solvent such as tetrohydrofuran, and diisopropyl azodicarboxylate toluene under ice cooling. It can be produced by reacting the solution. Examples of the solvent include those exemplified in Step 2 of Production Step 1. Compound (VII-A) can be obtained as a commercial product.
  • Step 55 Compound (VII-D) can be produced by reacting compound (VII-C) in a solvent such as methanol in the presence of a base under ice-cooling.
  • a solvent such as methanol
  • a base those exemplified in Process 3 of Production Process 1 can be mentioned.
  • Step 56 Compound (VII-F) can be produced using compound (VII-D) and compound (VII-E) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Step 57 Compound (VII-H) can be produced using compound (VII-F) and compound (VII-G) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Step 58 Compound (VII-J) can be produced using compound (VII-H) and compound (VII-I) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Step 59 Compound (VII-L) can be produced using compound (VII-J) and compound (VII-K) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Step 60 Compound (VII-N) can be produced using compound (VII-L) and compound (VII-M) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Steps 61-63 Compound (VII ′) can be produced using compound (VII-O), compound (VII-P) and compound (VII-Q) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Process DP Methods commonly used in organic synthetic chemistry eg, Protective Groups in Organic Synthesis, third edition, by John Wiley & Sons Inc., by TW Greene]. (1999) and the like] can be used appropriately.
  • Compound (VII-B), Compound (VII-E), Compound (VII-G), Compound (VII-I), Compound (VII-K), Compound (VII-M), Compound (VII-O), Compound (VII-P) and Compound (VII-Q) are commercially available, or “Experimental Chemistry Course 4th Edition Organic Synthesis, p. 258, Maruzen (1992)”, “March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Machinery” , can be obtained by and Structure, 7 th Edition "combining methods described, or analogous thereto method.
  • a unit in which P7 in formula 4 is —O— can be produced by the following method.
  • Q5, Q6, P8, q5 have the same meanings as defined above
  • Z2 represents H, OH, an NH 2 or SH
  • PG9 and PG10 each represents a suitable protecting group
  • LC sugar ligand - tether Unit represents E represents carboxylic acid or maleimide.
  • Step 64 Compound (VIII-C) can be produced using compound (VIII-A) and compound (VIII-B) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Compound (VIII-B) is commercially or "Jikken Kagaku Koza fourth edition Organic Synthesis, p 258, Maruzen (1992).", "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7 th It can be obtained by combining the methods described in “Edition” or a method according thereto.
  • Step 65 Compound (VIII ′) can be produced using compound (VIII-C) and compound (VIII-D) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Compound (VIII-D) are commercially or "Jikken Kagaku Koza fourth edition Organic Synthesis, p 258, Maruzen (1992).", "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7 th It can be obtained by combining the methods described in “Edition” or a method according thereto.
  • a sugar ligand-tether unit in which P1 and P4 in Formula 2 are —O— can be produced by the following method.
  • Q1, Q2, Q3, Q4, P2, P3, P5, P6, T1, T2, L1, L2, q1, q2, q3, q4, Z, B1 ′ or B2 ′ are as defined above.
  • Q1 ′ represents an integer smaller than q1
  • q2 ′ represents an integer smaller than q2, and PG8, PG9, PG10, PG11, PG12, PG13, and PG14 each represent an appropriate protecting group
  • formula: m1, m2, m3 and m4 are as defined above.
  • Step 66 Compound (IX-C) is prepared by dissolving compound (IX-A) and compound (IX-B) in a solvent such as N, N′-dimethylformamide and adding a base such as potassium hydrogen carbonate to room temperature to 200 ° C. Can be produced by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent what was illustrated to the process 2 of the manufacturing process 1 is mentioned.
  • the base those exemplified in Process 3 of Production Process 1 can be mentioned.
  • Step 67 Compound (IX-E) is prepared by dissolving compound Compound (IX-C) and Compound (IX-D) in a solvent such as N, N′-dimethylformamide, and adding a base such as potassium hydrogen carbonate to room temperature to 200 ° C. It can be produced by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent what was illustrated at the process 2 of the manufacturing process 1 is mentioned.
  • the base those exemplified in Process 3 of Production Process 1 can be mentioned.
  • Compound (IX-A) can be obtained as a commercial product.
  • Step 68 Compound (IX-G) can be produced using compound (IX-E) and compound (IX-F) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Step 69 Compound (IX-I) can be produced using compound (IX-G) and compound (IX-H) under the same conditions as in production step 1, step 3.
  • Step 70 Compound (IX-K) can be produced using compound (IX-I) and compound (IX-J) under the same conditions as in production step 1, step 3.
  • Step 71 Compound (IX-M) can be produced using compound (IX-K) and compound (IX-L) under the same conditions as in step 3 of production step 1.
  • Step 72-74 Compound (IX ′) can be produced using Compound (IX-M), Compound (IX-N), Compound (IX-O) and Compound (IX-P) under the same conditions as in Step 3 of Production Step 1. Can do.
  • Compound (IX′-B), Compound (IX′-D), Compound (IX′-F), Compound (IX′-H), Compound (IX′-J), Compound (IX′-L), Compound ( IX′-N), Compound (IX′-O) and Compound (IX′-P) are commercially available or “Experimental Chemistry Course 4th Edition Organic Synthesis, p. 258, Maruzen (1992)”, “March 's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7 th Edition "by combining the methods described, or can be obtained by a method analogous thereto.
  • Manufacturing method 16 As a method for producing the nucleic acid complex of Formulas 1 to 7, the following method can also be used. (Wherein LC, Q5, P8 and Q6 are as defined above, and X1-SH represents an oligonucleotide having a structure containing a C1-C10 alkyl group substituted with SH at the end)
  • Step 75 Compound (XB) can be produced by reacting compound (VIII ′′) and compound (XA) in a solvent at 0 ° C. to 100 ° C. for 10 seconds to 100 hours.
  • the solvent include water, phosphate buffer, sodium acetate buffer, dimethyl sulfoxide and the like, and these can be used alone or in combination.
  • Compound (VIII ′) can be obtained by using Production Method 14.
  • Compound (XB) can be obtained by a known method (for example, Bioconjugate Chemistry, Vol. 21, pp. 187-202, 2010, or Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (Current Protocols). in Nucleic Acid Chemistry), 2010, September; CHAPTER: Unit 4.41) or a similar method.
  • Step 76 Compound (X ′) can be produced by reacting Compound (XB) for 5 minutes to 100 hours at a temperature between room temperature and 200 ° C. under conditions of pH 8 or higher such as aqueous sodium carbonate or ammonia water. Can do.
  • Manufacturing method 17 As a method for producing the nucleic acid complex of Formulas 1 to 7, the following method can also be used. (Wherein LC, Q5, P8 and Q6 are as defined above, and X2-NH 2 represents an oligonucleotide having a structure containing a C1-C10 alkyl group substituted with NH 2 at the end)
  • Step 77 Compound (XI-A) is obtained using compound (VIII ′ ′′) by a known method (for example, the method described in Bioconjugate Chemistry, Vol. 26, pages 1451-1455, 2015) or It can be obtained in a similar way.
  • Compound (VIII ′ ′′) can be obtained by using Production Method 14.
  • Step 78 Compound (XI ′) can be obtained by using compound (XI-B) by a known method (for example, the method described in Bioconjugate Chemistry, Vol. 26, pages 1451-1455, 2015) or It can be obtained by a similar method.
  • Step 79 As another method, compound (XI ′) can be obtained by a known method (see, for example, Bioconjugate Chemistry, Vol. 22, 1723-1728, 2011) or a method analogous thereto, It can be obtained directly from (XI-A).
  • nucleic acid complex in the present specification can also be obtained as salts such as acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts, and the like.
  • Examples of the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, and phosphate, and organic acid salts such as acetate, maleate, fumarate, citrate, and methanesulfonate.
  • Examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt, zinc salt and the like.
  • Examples of ammonium salts include ammonium and tetramethyl. Examples thereof include salts such as ammonium.
  • Examples of organic amine addition salts include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • Examples of amino acid addition salts include addition salts such as lysine, glycine and phenylalanine.
  • a salt of the nucleic acid complex of the present specification When it is desired to prepare a salt of the nucleic acid complex of the present specification, it can be purified as it is when the complex is obtained in a desired salt form, and when it is obtained in a free form, the complex Is dissolved or suspended in a suitable solvent, and the corresponding acid or base is added, followed by isolation and purification.
  • the complex salt When converting the counter ion forming the complex salt into a different counter ion, the complex salt is dissolved or suspended in a suitable solvent, and then acid, base and / or salt (sodium chloride, chloride). Isolation and purification may be performed by adding several equivalents to a large excess of an inorganic salt such as ammonium).
  • nucleic acid complexes of the present specification may have stereoisomers such as geometric isomers and optical isomers, tautomers, etc., but all possible isomers and mixtures thereof are also included. Included in the present invention.
  • nucleic acid complex of the present specification may exist in the form of an adduct with water or various solvents, and these adducts are also included in the present invention.
  • nucleic acid complex of the present invention includes those in which some or all of the atoms in the molecule are replaced with atoms (isotopes) having different mass numbers (for example, deuterium atoms).
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a nucleic acid complex represented by Formula 1.
  • the nucleic acid complex of the present invention has L1 and L2 sugar ligands and is recognized by the target cell and introduced into the cell.
  • the nucleic acid complex of the present invention can be administered to a mammal and suppressed by reducing or stopping the expression of the target gene in vivo, and can be used for treatment of a disease associated with the target gene.
  • the nucleic acid complex of the present invention is used as a therapeutic agent or prophylactic agent, it is desirable to use the administration route that is most effective in the treatment and is not particularly limited. Administration, subcutaneous administration, intramuscular administration and the like can be mentioned, and intravenous administration is preferred.
  • the dose varies depending on the disease state, age, route of administration, etc. of the administration subject, but it may be administered so that the daily dose converted to a double-stranded oligonucleotide is 0.1 ⁇ g to 1000 mg. More preferably, the dose is 1 to 100 mg.
  • preparations suitable for intravenous administration or intramuscular administration include injections, and the prepared liquid can be used as it is, for example, in the form of injections, but from the liquid, for example, filtration, centrifugation, etc. Can be used after removing the solvent by lyophilizing the solution and / or lyophilizing a solution to which an excipient such as mannitol, lactose, trehalose, maltose or glycine is added. You can also.
  • an injection can be prepared by adding an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA, or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
  • an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA
  • an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
  • it can also be cryopreserved by adding a cryopreservation agent such as glycerin.
  • Mobile phase A 0.1% formic acid-containing aqueous solution, B; Acetonitrile solution gradient: 10% -90% linear gradient of mobile phase B (3 minutes)
  • Synthesis process 1 of compound 2 Compound 1 (0.8755 g, 1.9567 mmol) synthesized by the method described in Journal of American Chemical Society, Vol. 136, pp. 16958-16961, 2014 was tetrahydrofuran (10 mL). ), And 1,3-dicyclohexanecarbodiimide (DCC, 0.4247 g, 2.0584 mmol) and N-hydroxysuccinimide (0.2412 g, 2.0958 mmol) were stirred overnight at room temperature. The precipitated solid was removed from the reaction mixture, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • DCC 1,3-dicyclohexanecarbodiimide
  • N-hydroxysuccinimide (0.2412 g, 2.0958 mmol
  • Process 4 (9H-Fluoren-9-yl) methyl ((2R, 3R) -1,3-dihydroxybutan-2-yl) carbamate (Compound 5, manufactured by Chem-Impex International, Inc., 1.50 g, 4.58 mmol)
  • Compound 5 manufactured by Chem-Impex International, Inc., 1.50 g, 4.58 mmol
  • 4,4′-dimethoxytrityl chloride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1.71 g, 5.04 mmol
  • Process 7 Compound 9 (5.3071 g, 15.02 mmol) synthesized in Step 6 was dissolved in methanol (25 mL), and 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, 13 mL) was added under ice-cooling at room temperature. For 4 hours. The reaction mixture was ice-cooled, 10% aqueous citric acid solution was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine, and dried over anhydrous magnesium sulfate. Compound 10 was quantitatively obtained by distilling off the solvent under reduced pressure. ESI-MS m / z: 324 (M-H) -
  • Process 8 Compound 10 (1.9296 g, 5.93 mmol) synthesized in Step 7 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (70 mL), and N-1- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl) -ethylenediamine hydrochloride ( 3.3493 g, 11.86 mmol), diisopropylethylamine (5.18 mL, 29.7 mmol), and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (4.5168 g, 11.88 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours.
  • Step 9 Compound 11 (1.6087 g, 1.884 mmol) synthesized in Step 8 was dissolved in dichloromethane (20 mL), trifluoroacetic acid (5 mL, 64.9 mmol) was added under ice cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure of the reaction solution to quantitatively obtain Compound 12 (2.4079 g).
  • Step 11 Compound 13 (108 mg, 0.122 mmol) synthesized in Step 10 was dissolved in dichloromethane (5 mL), diethylamine (0.5 mL, 4.8 mmol) was added at room temperature, and the mixture was stirred for 1 hour. The solvent was distilled off under reduced pressure to quantitatively obtain Compound 14 (54.9 mg).
  • Process 12 Compound 14 synthesized in Step 11 (180 mg, 0.406 mmol), N ⁇ , N ⁇ -bis (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine (Novabiochem, 295 mg, 0.852 mmol), diisopropylethylamine (0.354 mL, 2.029 mmol) ), And 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (324 mg, 0.852 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature overnight. . The reaction mixture was ice-cooled, 10% aqueous citric acid solution was added, and the mixture was extracted with chloroform.
  • Process 14 Compound 12 synthesized in Step 9 (0.5716 g, 0.7582 mmol), dodecanoic acid monobenzyl ester synthesized by the method described in Bioconjugate Chemistry, Vol. 22, 690-699, 2011 ( 0.4859 mg, 1.5164 mmol), diisopropylethylamine (0.662 mL, 3.79 mmol), and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.5766 g, 1.516 mmol) was dissolved in N, N dimethylformamide (12 mL) and stirred at room temperature for 1 hour.
  • Process 15 Compound 17 (0.7545 g, 0.714 mmol) synthesized in Step 14 was dissolved in dichloromethane tetrahydrofuran (20 mL), diethylamine (5 mL, 47.9 mmol) was added at room temperature, and the mixture was stirred overnight. Compound 18 was quantitatively obtained by distilling off the solvent under reduced pressure. ESI-MS m / z: 612 (M + H) +
  • Step 16 Compound 18 synthesized in Step 15 (0.437 g, 0.7143 mmol), N ⁇ , N ⁇ -bis (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine (Novabiochem, 0.5483 g, 1.583 mmol), diisopropylethylamine (0.624 mL, 3.57 mmol) ), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.5703 g, 1.5 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. . A 10% aqueous citric acid solution was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate. The crude product of compound 19 was obtained by distilling off the solvent under reduced pressure. ESI-MS m / z: 1269 (M + H) +
  • Step 17 Compound 19 (0.906 g, 0.7143 mmol) synthesized in Step 16 was dissolved in dichloromethane (12 mL), trifluoroacetic acid (3 mL, 38.9 mmol) was added under ice cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure to give a crude product of compound 20.
  • Process 18 Compound 15 (100 mg, 0.091 mmol) synthesized in Step 12 was dissolved in methanol (3 mL), acetic acid (2 ⁇ L) was added, and catalytic hydrogen reduction with palladium / carbon was performed. Compound 21 was quantitatively obtained by evaporating the solvent of the obtained solution fraction under reduced pressure.
  • Step 19 Compound 21 (50 mg, 0.052 mmol) synthesized in Step 18 and N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (48 mg, 0.155 mmol) were dissolved in tetrahydrofuran (2 mL), and diisopropylethylamine (0.045 mL, 0.259) was dissolved. mmol) was added and stirred at room temperature overnight. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform / methanol) to obtain Compound 22 (18 mg, yield 30%).
  • Step 21 Using compound 10 (0.9372 g, 2.8809 mmol) synthesized in step 7 and ⁇ -alanine methyl ester hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 0.8082 g, 5.7902 mmol), in the same manner as in step 8 of Example 1. Compound 24 was obtained quantitatively.
  • Step 22 Compound 25 was quantitatively obtained in the same manner as in Step 9 of Example 1 using Compound 24 (0.9622 g, 1.952 mmol) synthesized in Step 21.
  • Step 23 Compound 25 (0.1146 g, 0.290 mmol) synthesized in Step 22 and N-succinimidyl 15-azido-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid (N3-PEG4-NHS, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 0.0750 g , 0.1931 mmol), and compound 26 was quantitatively obtained in the same manner as in Step 19 of Example 3.
  • Step 25 Using compound 27 (0.1252 g, 0.193 mmol) synthesized in Step 24 and L-glutamic acid di-tert-butyl ester (Watanabe Chemical Co., Ltd., 0.1180 g, 0.399 mmol), the same method as in Step 8 of Example 1 Gave compound 28 (0.0521 g, 24% yield).
  • Step 26 Using compound 28 (0.0521 g, 0.0464 mmol) synthesized in step 25, compound 29 (36 mg, yield 86%) was obtained in the same manner as in step 9 of Example 1.
  • Step 27 Compound 16 (0.2586 g, 0.3695 mmol) synthesized in Step 13 and synthesized by the method described in Journal of American Chemical Society, Vol. 136, pp. 16958-16961, 2014 Compound 30 (0.5272 g, 61% yield) was obtained in the same manner as in Step 8 of Example 1 using Compound 1 (0.8559 g, 1.7927 mmol).
  • Step 28 Compound 31 (0.1524 g, 61% yield) was obtained in the same manner as in Step 21 of Example 3, using Compound 30 (0.2653 g, 0.1097 mmol) synthesized in Step 27.
  • Step 33 Compound 20 synthesized in Step 17 (0.1952 g, 0.225 mmol) and synthesized by the method described in Journal of American Chemical Society, Vol. 136, pages 16958-16961, 2014 Compound 36 (334.8 mg, Yield 58%) was obtained in the same manner as in Step 8 of Example 1 using Compound 1 (0.4162 g, 0.93 mmol).
  • Step 34 Compound 37 (112 mg, 80% yield) was obtained in the same manner as in Step 18 of Example 3 using Compound 36 (0.1459 g, 0.056 mmol) synthesized in Step 33.
  • Step 35 Using compound 37 (0.1091 g, 0.044 mmol) synthesized in step 34 and compound 7 (0.0748 g, 0.184 mmol) prepared in step 5 of Reference Example 2, compound 38 was prepared in the same manner as in step 8 of Example 1. Obtained as a crude product.
  • Step 36 Compound 38 (0.161 g, 0.05586 mmol) synthesized in Step 35 was dissolved in dichloromethane (5 mL), and succinic anhydride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 0.1182 g, 1.181 mmol), N, N-dimethylaminopyridine ( 0.0224 g, 0.183 mmol) and triethylamine (0.55 mL, 3.95 mmol) were added and stirred overnight at room temperature. The reaction mixture was ice-cooled, water was added, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine, and dried over anhydrous magnesium sulfate. The crude product of compound 39 was obtained by distilling off the solvent under reduced pressure. ESI-MS m / z: 1342 (M + 2H) 2+ , detected as de-DMTr form
  • Step 37 Compound 39 synthesized in Step 36 (0.0816 g, 0.02734 mmol), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.0221 g, 0.05827 mmol) and diisopropylethylamine (0.02 mL, 0.1094 mmol) were dissolved in N, N-dimethylformamide (4 mL), LCAA-CPG (Chem Gene, 0.4882 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate 0.0221 g, 0.05827 mmol
  • diisopropylethylamine 0.02 mL, 0.1094 mmol
  • the mixture was separated by filtration, washed successively with dichloromethane, 10% methanol in dichloromethane and diethyl ether, and then reacted with acetic anhydride / pyridine solution to obtain compound 40 (49.5 ⁇ mol / g, yield 89%).
  • the yield was calculated from the introduction rate into the solid phase carrier that can be calculated from the absorption derived from the DMTr group by adding a 1% trifluoroacetic acid / dichloromethane solution to the solid phase carrier.
  • Synthesis step 38 of nucleic acid complex 41 Compound 32 synthesized in Step 29 and an oligonucleotide synthesized with the method described in Molecules, Vol. 17, pp. 13825-13843, 2012, with the end modified with a mercapto group were added at room temperature. It was left for 4 hours. Sodium carbonate was added to the reaction mixture, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • n is DNA
  • N (M) is 2'-O-methyl modified RNA
  • N (F) is 2'-fluorine modified RNA
  • N (L) is LNA
  • 5 (L) is LNAmC
  • ss represents the sense strand, as represents the antisense strand
  • the underlined number represents the modifying group corresponding to the compound number in the Examples. The same applies to each table below.
  • Synthesis step 39 of nucleic acid complex 42 The single-stranded nucleic acid complex 41_3'-AT3-ssRNA synthesized in Step 38 is mixed buffer (100 mmol / L potassium acetate, 30 mmol / L 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1- [Il] ethanesulfonic acid, HEPES) -KOH (pH 7.4), 2 mmol / L magnesium acetate) to adjust the concentration (50 ⁇ mol / L).
  • the aforementioned sense strand and antisense strand (50 ⁇ mol / L) were mixed in equal amounts and allowed to stand at 80 ° C. for 10 minutes.
  • the antisense strand sequence is as described in Table 2. The temperature was gradually lowered and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to obtain a double-stranded nucleic acid complex 42.
  • the sequence of the nucleic acid complex synthesized by this example is shown in Table 2.
  • Synthesis step 40 of nucleic acid complex 43 Using compound 35 synthesized in step 32 and oligonucleotide synthesized by the method described in ACS Nano, Vol. 9, pages 9652-9664, 2015, the same as step 38 in Example 9 A single-stranded nucleic acid complex 43 was obtained under the reaction conditions and procedure.
  • Table 3 shows the sequences and mass spectrometry results of the nucleic acid complexes synthesized in this example.
  • Synthesis step 41 of nucleic acid complex 44 A double-stranded nucleic acid complex 44 was obtained in the same manner as in Step 39 of Example 9. The sequence of the nucleic acid complex synthesized according to this example is shown in Table 4.
  • Synthesis step 42 of nucleic acid complex 45 Compound 23 (648 nmol) synthesized in Step 20 and Oligonucleotide modified with a mercapto group (216 nmol) synthesized by the method described in Molecules, Vol. 17, pp. 13825-13843, 2012 was used to obtain a nucleic acid complex 45 in the same manner as in Step 38 of Example 9.
  • Step 43 of synthesizing nucleic acid complex 46 Add dimethyl sulfoxide solution of N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (6.3 mg, 20 ⁇ mol) to compound 45 (100 nmol) synthesized in step 42, and allow to stand at room temperature for 4 hours in phosphate buffer. did. Dithiothreitol (15.4 mg, 100 ⁇ mol) was added to the reaction solution and allowed to stand overnight at room temperature. The mixture was subjected to gel filtration (Nap column, manufactured by GE Healthcare, elution solvent: 20 mmol / L acetic acid / sodium acetate buffer (pH 5.0)) and ultrafiltration to obtain nucleic acid complex 46.
  • Synthesis step 44 of nucleic acid complex 47 Using compound 46 synthesized in step 43 and compound 2 synthesized in step 1 of Reference Example 1, single-stranded nucleic acid complex 47 was obtained in the same manner as in step 38 of Example 9.
  • Step 45 of synthesizing nucleic acid complex 48 Using the compound 46 synthesized in step 43 and the mannose maleimide adduct synthesized by the method described in Bioconjugate Chemistry, Vol. 14, pp. 232-238, 2003, step 38 of Example 9 In the same manner as above, a single-stranded nucleic acid complex 48 was obtained.
  • Table 5 shows the sequences and mass spectrometry results of the nucleic acid complexes synthesized according to this example.
  • Step 46 Synthesis of oligonucleotide conjugates (G-CH1179-s, G-CH0099-s, and G-CH1180-s, respectively) having a GalNAc group at the 3 'end of the antisense strand Using a parallel synthesizer (Ultra Fast Parallel Syntheizer, manufactured by Sigma, hereinafter UFPS), the measurement was performed at a 0.2 ⁇ mol scale.
  • Compound 40 synthesized in Step 37 was used as the solid phase carrier.
  • Dimethoxytrityl dT phosphoramidite (SAFC-PROLIGO) was adjusted to 0.06 mol / L with acetonitrile.
  • a 5-benzylthio-1H-tetrazole (SAFC-PROLIGO) and 0.06 mol / L dT phosphoramidite in acetonitrile were used as phosphoramidite activators, and the condensation reaction was carried out for 10 minutes each. After the reaction, it was immersed in a 28% ammonia solution and left at 55 ° C. for 4 hours. After concentration under reduced pressure, 1-butanol was added to stop the reaction.
  • Step 47 of synthesizing nucleic acid complex 52 Using compound 50 (0.0796 g, 0.044 mmol) synthesized by the method described in Journal of American Chemical Society, Vol. 136, pp. 16958-16961, 2014 Compound 51 (0.014 g, yield 19%) was obtained in the same manner as in Step 29 of 6.
  • Step 48 Using compound 51 synthesized in step 47, three types of single-stranded nucleic acid complexes 52 having different oligonucleotides were obtained in the same manner as in step 38 of Example 9. Table 7 shows the sequences and mass spectrometry results of the nucleic acid complexes synthesized in this example.
  • Synthesis step 49 of nucleic acid complex 53 Using the compound 52_3′-AT3-ssRNA synthesized in Step 48, a double-stranded nucleic acid complex 53 was obtained in the same manner as in Step 39 of Example 9.
  • Table 8 shows the sequences of the nucleic acid complexes synthesized according to this example.
  • Test Example 1 In Vitro Activity of Nucleic Acid Complexes on Primary Mouse Hepatocytes Among the nucleic acid complexes synthesized in Example 9, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, ApoBASO (test sample 1), nucleic acid complex 54 (test sample) Specimen 2), 52_3'-ApoBASO (Test 3), 52_5'-ApoBASO (Test 4), 41_3'-ApoBASO (Test 5), 41_5'-ApoBASO (Test 6) Each was introduced into CD1 (CD-1) -derived mouse primary hepatocytes (manufactured by Life Technology, catalog number MSCP10) by the following methods.
  • the obtained cDNA was used as a template, a Tackman (registered trademark) Gene Expression Assays probe (Applied Biosystems) was used as a probe, and a Quant Studio 12 Kaflex Real-Time PC System (ABI) was used.
  • Apolipoprotein B also known as Apolipoprotein-B100 / Apolipoprotein-B48, hereinafter referred to as apob
  • apob Apolipoprotein B gene and constitutively expressed gene glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by PCR reaction according to the method described in the instruction manual
  • the gene D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hereinafter referred to as gapdh
  • gapdh D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • the expression rate of apob mRNA was determined from the semiquantitative value of apob mRNA, with the semiquantitative value of apob mRNA in the negative control measured in the same manner as 1.
  • the results of the expression rate of the obtained apob mRNA are shown in Tables 9 and 10 as the inhibition rate with respect to the apob mRNA expression rate of the negative control. Each table shows the results of independent tests.
  • nucleic acid complex of the present invention suppressed the expression of apob gene mRNA after introduction into mouse primary hepatocytes.
  • Test Example 2 In Vivo Activity of Nucleic Acid Complex in Mice Among the nucleic acid complexes synthesized in Example 9, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, ApoBASO (Test 1), Nucleic acid complex 54 (Test 2) ), 52_3'-ApoBASO (Test 3), 52_5'-ApoBASO (Test 4), 41_3'-ApoBASO (Test 5), 41_5'-ApoBASO (Test 6) An in vivo evaluation test was performed by the method. Each nucleic acid complex was diluted with phosphate buffered saline (DPBS) (Nacalai Tesque) according to the test.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • mice (BALB / cA, obtained from Clea Japan) were acclimated and bred, and each nucleic acid complex was administered subcutaneously to mice at 0.75 mg / kg or 0.25 mg / kg.
  • DPBS subcutaneously administered to mice.
  • Serum was collected from the superficial temporal vein 3 days after administration. Thereafter, the animals were euthanized, the liver was collected and stored frozen in liquid nitrogen. Liver frozen sample using Trizol (registered trademark) RN Isolation Regents (Life Technologies, catalog number 15596026) and NR Easy Mini Kit (QIAGEN, catalog number 74106) In accordance with the method described in the instructions attached to the product, total RNA was collected.
  • RNA obtained as a template was prepared by photoreaction.
  • the obtained cDNA was used as a template, a Tackman (registered trademark) Gene Expression Assays probe (Applied Biosystems) was used as a probe, and a Quant Studio 12 Kaflex Real-Time PC System (ABI) was used.
  • PCR reaction was performed according to the method described in the instruction manual, the apob gene and the gapdh gene were subjected to PCR reaction to measure the amount of mRNA amplification, and the amount of amplification of gapdh mRNA was used as an internal control, and the semi-quantitative value of apob mRNA.
  • the expression rate of apob mRNA was determined from the semiquantitative value of apob mRNA, with the semiquantitative value of apob mRNA in the control group measured in the same manner as 1.
  • the total cholesterol concentration in serum was measured according to the method described in the attached instruction manual using a lab assay cholesterol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number 294-65801). Tables 11 and 12 show the inhibition rate of the obtained apob mRNA expression and the total serum cholesterol concentration.
  • the nucleic acid complex of the present invention reduces the expression of apob gene and decreases the total cholesterol concentration in blood in vivo. It was.
  • Test Example 3 In Vitro Activity of Nucleic Acid Complex against Primary Mouse Hepatocytes Among the nucleic acid complexes obtained in Example 9 and Comparative Example 1, 53_3′-AT3-siRNA (test object 7), 42_3′-AT3 -SiRNA (test object 8) was introduced into CD1 (CD-1) -derived primary mouse hepatocytes (Life Technologies, catalog number MSCP10) by the following methods. Dispense 20 ⁇ L of each nucleic acid complex diluted with Optimem (Opti-MEM, GIBCO, 31985) to a final concentration of 300, 100, or 30 nmol / L in a 96-well culture plate.
  • Optimem Opti-MEM, GIBCO, 31945
  • William's E Medium (Life Technology, catalog number A12176), including Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements (Life Technology, catalog number CM3000).
  • -01 inoculate the mouse primary hepatocytes in a cell number of 12500/80 ⁇ L / well, and incubate at 37 ° C under 5% CO 2 for 6 hours.
  • Williams Emede including Primary Hepatocyte Maintenance Supplements (Life Technology, catalog number CM4000) It was added Umm.
  • As a negative control group cells not treated were seeded. Cells into which each preparation was introduced were cultured for 18 hours in a 37 ° C.
  • Amplification of phosphate dehydrogenase (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hereinafter referred to as gapdh) gene was carried out by PCR reaction to measure the amount of mRNA amplification, and the amount of gapdh mRNA amplification was used as an internal control for semi-quantification of AT3 mRNA. The value was calculated.
  • the AT3 mRNA expression rate was determined from the AT3 mRNA quasi-quantitative value, with the AT3 mRNA quasi-quantitative value measured as 1.
  • the results of the expression rate of the obtained AT3 mRNA are shown in Table 13 as the suppression rate with respect to the AT3 mRNA expression rate of the negative control.
  • test object 8 suppressed the expression of mRNA of AT3 gene after introduction into mouse primary hepatocytes.
  • Test Example 4 In Vivo Activity of Nucleic Acid Complexes in Mice Among the nucleic acid complexes obtained in Example 9 and Comparative Example 1, 53_3′-AT3-siRNA (Test 7), 42_3′-AT3-siRNA ( An in vivo evaluation test was performed on each of the specimens 8) by the following method. Each nucleic acid complex was diluted with phosphate buffered saline (DPBS) (Nacalai Tesque) according to the test. Mice (BALB / cA, obtained from Clea Japan) were acclimated and bred, and each nucleic acid complex was administered subcutaneously to the mice at 1.5 mg / kg or 0.5 mg / kg.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • mice were subcutaneously administered to mice.
  • blood was collected from the posterior vena cava under isoflurane anesthesia.
  • the collected blood was mixed with an anticoagulant solution containing 3.2 M sodium citrate and 5 mmol / L D-glucose at a volume ratio of 9: 1, and the supernatant after centrifugation was collected to obtain plasma.
  • the animals were euthanized after blood collection, the liver was collected and stored frozen in liquid nitrogen.
  • the AT3 mRNA expression rate was determined from the AT3 mRNA quasi-quantitative value in the same manner as the AT3 mRNA quasi-quantitative value measured in the control group.
  • the AT3 protein concentration in plasma was measured using an antithrombin three mouse ELISA kit (manufactured by Abcam, catalog number ab108800) according to the method described in the attached instruction manual. The resulting AT3 mRNA expression suppression rate and plasma AT3 protein concentration are shown in Table 14.
  • the nucleic acid complex of the present invention decreased the expression of AT3 gene and decreased the concentration of AT3 protein in the blood in vivo.
  • Step 51 Compound 56 (1.050 g, yield) was obtained from compound 55 (1.200 g, 3.640 mmol) by the method described in Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 59, pp. 2718-2733, 2016. 50%) was synthesized.
  • Step 52 Compound 55 (4.000 g, 10.27 mmol) was dissolved in dichloromethane (60 mL), benzyl-2- (2-hydroxyethoxy) ethyl carbamate (2.700 g, 11.30 mmol), and trifluoromethanesulfonic acid (0.1360 mL, 1.541 mmol). ) was added and stirred overnight under reflux conditions. A 10 wt% aqueous potassium carbonate solution was added to the reaction mixture, and the mixture was separated from dichloromethane. The organic phase was washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the mixture was concentrated to 2-methyltetrahydrofuran. The residue was added dropwise to heptane, and the obtained crystals were filtered to obtain Compound 57 (5.130 g, yield 88%). ESI-MS m / z: 570 (M + H) +
  • Step 53 Compound 1 (898.0 mg, 2.007 mmol) described in Step 1 was dissolved in dichloromethane (15 mL), and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (338.0 mg, 2.208 mmol), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-Ethylcarbodiimide hydrochloride (343 mg, 2.208 mmol) and N-1-Z-1,3-diaminopropane hydrochloride (0.4910 mL, 2.208 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was partitioned with dichloromethane.
  • Step 54 Compound 1 (3.00 g, 6.70 mmol) described in Step 1 was dissolved in dichloromethane (60 mL), and L-lysine benzyl ester di-p-toluenesulfonate (1.75 g, 3.02 mmol), triethylamine (0.935) at room temperature. mL, 6.70 mmol), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (1.29 g, 6.70 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (103 mg, 0.670 mmol) and 2.5 Stir for hours.
  • Step 55 Compound 59 (2.30 g, 2.10 mmol) synthesized in step 54 was dissolved in tetrahydrofuran (46 mL), 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 424 mg) was added at room temperature, and under hydrogen atmosphere overnight Stir. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 60 quantitatively.
  • Step 56 Iminodiacetic acid (Tokyo Chemical Industry, 1.5 g, 6.43 mmol) was dissolved in methylene chloride (30 mL), pentafluorotrifluoroacetic acid (Tokyo Chemical Industry, 2.75 mL, 16.08 mmol), triethylamine (4.48). mL, 32.2 mmol) was added and stirred for 4 hours. A 10% aqueous citric acid solution was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with chloroform. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • the compound 56 (2 g, 3.45 mmol) synthesized in Step 51 was dissolved in a mixed solution of ethyl acetate (10 mL) and acetonitrile (10 mL), and catalytic hydrogen reduction with palladium / carbon was performed.
  • the crude solution of Compound 61 was obtained by distilling off the solvent under reduced pressure from the obtained solution portion.
  • Step 57 Using compound 61 (1.5 g, 1.37 mmol) synthesized in step 56, compound 62 was quantitatively obtained in the same manner as in step 3 of Reference Example 1.
  • Step 58 Using N- (t-butoxycarbonyl) -L-glutamic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and using compound 56 (1.855 g, 3.19 mmol) synthesized in step 51, the same method as in step 56 of Reference Example 3 Gave a crude product of compound 63.
  • Step 59 Compound 64 was quantitatively obtained in the same manner as in Step 3 of Reference Example 1 using Compound 63 (1.421 g, 1.2866 mmol) synthesized in Step 58.
  • Step 60 Compound 65 (90 mg, 0.173 mmol), synthesized by the method described in Journal of Organic Chemistry, Volume 74, pages 6837-6842, 2009, is dissolved in tetrahydrofuran (1 mL). Then, triphenylphosphine and polymer supported (manufactured by Sigma-Aldrich, 63 mg, 0.189 mmol) were added, and the mixture was stirred for 3 hours under heating reflux. The reaction solution was filtered and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 66 (70 mg, Yield 82%).
  • Step 61 Using Compound 67 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 0.500 g, 3.73 mmoL), a crude product (1.5 g) of Compound 68 was obtained in the same manner as in Step 4 of Reference Example 2.
  • Step 62 Compound 69 was prepared in the same manner as in Step 8 of Example 1 using the crude product (1.5 g) of Compound 68 synthesized in Step 61 and 1,4-Diaminobutane (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 3.29 g, 37.3 mmol). (0.18 g, 10% yield over 2 steps).
  • Step 63 Compound 65 (110 mg, 0.212 mmol) synthesized by the method described in Journal of Organic Chemistry, 74, 6837-6842, 2009 was dissolved in tetrahydrofuran (2 mL). N- (1R, 8S, 9s) -Bicyclo [6.1.0] non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 72 mg, 0.222 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with chloroform. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • Step 64 Compound 72 (AstaTech, 100 mg, 1.148 mmol) and Fmoc-Ser (tBuMe2Si) -OH (Watanabe Chemical, 532 mg, 1.205 mmol) were used in the same manner as in Step 8 of Example 1. 73 (410 mg, yield 70%) was obtained.
  • Step 65 Using a compound 73 (410 mg, 0.803 mmol) synthesized in Step 64, a crude product (680 mg) of Compound 74 was obtained in the same manner as in Step 4 of Reference Example 2.
  • Step 66 Compound 75 (330 mg, two-stage yield 70%) was obtained in the same manner as in Step 5 of Reference Example 2 using the crude product (680 mg) of Compound 74 synthesized in Step 65.
  • Step 67 N- (Tert-butoxycarbonyl) -1,3-diaminopropane (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., 1.788 g, 10.26 mmol) was dissolved in dichloromethane (22.8 mL), triethylamine (1.907 mL, 13.68 mmol) was added, and room temperature was added. For 15 minutes. To the reaction solution was added dropwise a dichloromethane solution (5 mL) of compound 76 (1.126 g, 6.84 mmol) synthesized by the method described in Organic Letter, Vol. 16, 6318-6321, 2014, Stir at room temperature for 2 hours. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with chloroform.
  • Step 68 Compound 78 (1.10 g, 100% yield) was obtained in the same manner as in Step 3 of Reference Example 1 using Compound 77 (1.65 g, 5.46 mmol) synthesized in Step 67.
  • Step 69 A crude product of Compound 79 was obtained in the same manner as in Step 4 of Reference Example 2 using Compound 79 (Tokyo Kasei Co., Ltd., 1.2 g, 4.24 mmol).
  • Step 70 Compound 81 (1.34 g, 2-step yield 52%) was obtained by the method described in Step 5 of Reference Example 2 or Step 11 of Example 1 using the crude product of Compound 80 synthesized in Step 69.
  • Step 71 Using compound 81 (1.15 g, 3.16 mmol) synthesized in Step 70 and Fmoc-Ser (tBuMe2Si) -OH (Watanabe Chemical Co., Ltd., 1.677 g, 3.8 mmol) in the same manner as in Step 8 of Example 1. Compound 82 (560 mg, yield 31%) was obtained.
  • Step 72 Compound 95 was obtained in the same manner as in Step 5 of Reference Example 2 using Compound 82 (2.487 g, 3.16 mmol) synthesized in Step 71 (1.2 g, yield 67%).
  • Step 73 Compound 103 (2.00 g, 9.47 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (40 mL) and iminodiacetic acid di-tert-butyl ester (5.11 g, 20.84 mmol), 1- (3- Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (4.00 g, 20.84 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (145 mg, 0.947 mmol) were added and stirred for 2 hours. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Step 74 Compound 104 (2.66 g, 4.00 mmol) synthesized in Step 73 is dissolved in tetrahydrofuran (53 mL), 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 490 mg) is added at room temperature, and 3% under hydrogen atmosphere. Stir for hours. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 105 (2.86 g, yield 113%). ESI-MS m / z: 634 (M-H) -
  • Step 75 Compound 105 (871.0 mg, 1.370 mmol) synthesized in Step 74 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (17 mL), and O- (7-azabenzotriazole-1-yne) -N, N, N ' , N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (625.0 mg, 1.644 mmol), diisopropylethylamine (0.5730 mL, 3.290 mmol), and dodecanedioic acid monobenzyl ester (527.0 mg, 1.644 mmol) at room temperature Stir overnight. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Step 76 Compound 106 (1.030 g, 1.098 mmol) synthesized in Step 75 was dissolved in dichloromethane (10 mL), trifluoroacetic acid (10.00 mL, 130.0 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product of Compound 107.
  • Step 77 Compound 108 (2.000 g, 12.98 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (30 mL), potassium hydrogen carbonate (1.559 g, 15.57 mmol) and benzyl chloride (2.328 mL, 19.47 mmol) were added, and room temperature was added. For 4 hours. Saturated ammonium chloride was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Step 78 Compound 109 (2.500 g, 10.24 mmol) synthesized in Step 77 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (30 mL), and potassium carbonate (5.660 g, 40.90 mmol) and tert-butylbromoacetic acid (3.300 mL, 22.52 mmol) were dissolved. ) And stirred at 90 ° C. for 4 hours. Saturated ammonium chloride was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Step 79 Compound 110 (1.000 g, 2.116 mmol) synthesized in step 78 was dissolved in dichloromethane (10 mL), trifluoroacetic acid (10.00 mL, 130.0 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product of compound 111.
  • Process 80 Compound 111 (350.0 mg, 0.9710 mmol) synthesized in Step 79 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (7 mL), and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (327.0 mg, 2.137 mmol), 1- ( 3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (410.0 mg, 2.137 mmol) and iminodiacetic acid di-tert-butyl ester (524.0 mg, 2.137 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Step 81 Compound 112 (610.0 mg, 0.7490 mmol) synthesized in Step 80 was dissolved in dichloromethane (6 mL), trifluoroacetic acid (6 mL, 78.00 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product of Compound 113.
  • Step 82 Compound 114 (474 mg, 0.744 mmol) synthesized in Step 74 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL) and was collected at room temperature in Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 54 , 2433-2446, 2011, trans-cyclohexane-1,4-dicarboxylic acid monobenzyl ester (0.234 mg, 0.893 mmol), diisopropylethylamine (0.312 mL, 1.79 mmol), O- ( 7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (339 mg, 0.893 mmol) was added and stirred for 6 hours.
  • Step 83 Compound 115 (341 mg, 0.387 mmol) synthesized in Step 82 was dissolved in dichloromethane (3.4 mL), trifluoroacetic acid (3.4 mL) was added at room temperature, and the mixture was stirred overnight. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, azeotroped with ethyl acetate, and purified by slurry with heptane to give compound 116 (254 mg, yield 100%).
  • Step 84 Compound 117 (500 mg, 2.75 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL) and iminodiacetic acid di-tert-butyl ester (1.48 g, 6.04 mmol), 1- (3-dimethyl) was dissolved at room temperature. Aminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (1.16 g, 6.04 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (42.0 mg, 0.275 mmol) were added and stirred for 4 hours. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Step 85 Compound 118 (323 mg, 0.507 mmol) synthesized in step 84 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (6.5 mL), and potassium carbonate (84.0 mg, 0.609 mmol), benzyl bromoacetate (139 mg, 0.609 mmol) was added and stirred for 3 hours. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Step 86 Compound 119 (312 mg, 0.398 mmol) synthesized in Step 85 was dissolved in dichloromethane (3.1 mL), trifluoroacetic acid (3.1 mL) was added at room temperature, and the mixture was stirred overnight. The reaction solution was concentrated under reduced pressure and azeotroped with ethyl acetate to obtain Compound 120 (252 mg, yield 113%).
  • Step 88 Compound 121 (500 mg, 1.40 mmol) synthesized in step 87 was suspended in acetonitrile (10 mL), and tert-butyl acrylate (3.59 g, 28.0 mmol), benzyltrimethylammonium hydroxide (40% aqueous solution) at room temperature. 1.76 mL, 702 mmol) was added and stirred overnight. The solvent was distilled off under reduced pressure, water was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Step 90 Compound 123 (232 mg, 0.276 mmol) synthesized in Step 89 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (4.6 mL), and dodecanoic acid monobenzyl ester (0.133 mg, 0.414 mmol), diisopropylethylamine (0.145 mL, 0.829 mmol), O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (158 mg, 0.414 mmol) and stirred overnight did. Water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Step 91 Compound 124 (273 mg, 0.239 mmol) synthesized in Step 90 was dissolved in dichloromethane (2.7 mL), trifluoroacetic acid (2.7 mL) was added at room temperature, and the mixture was stirred overnight. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure and azeotroped with ethyl acetate to obtain Compound 125 (231 mg, yield 105%).
  • Step 92 4-Nitroisophthalic acid 103 (500 mg, 2.37 mmol) and N-Boc-ethylenediamine (808 mg, 5.21 mmol) were dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL) and triethylamine (0.90 mL, 0.9 mL, 7.11 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (703 mg, 5.21 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (1.36 g, 7.11 mmol) were added and stirred for 16 hours. did. The reaction mixture was worked up, and the crude product was purified by silica gel column chromatography to give compound 126 (650 mg, yield 55%).
  • Step 93 Compound 126 (500 mg, 1.01 mmol) synthesized in Step 92 and zinc dust (330 mg, 5.05 mmol) were suspended in methanol (3.5 mL) and tetrahydrofuran (3.5 mL), and ammonium chloride (378 mg, 7.07 mmol) aqueous solution was added dropwise and stirred at room temperature for 24 hours. The reaction mixture was worked up, and the crude product was purified by silica gel column chromatography to give compound 127 (160 mg, yield 34%).
  • Step 94 Compound 127 (200 mg, 0.430 mmol) synthesized in Step 93 and N-Cbz-glycine (90.0 mg, 0.430 mmol) were dissolved in N, N'-dimethylformamide (2.0 mL), and diisopropylethylamine (0.220) was dissolved at room temperature. mL, 1.29 mmol), O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (245 mg, 0.645 mmol) was added for 16 hours. Stir. The reaction mixture was worked up, and the crude product was purified by silica gel column chromatography to give compound 128 (180 mg, yield 64%). ESI-MS m / z: 657 (M + H) +
  • Step 95 3,5-Dinitrobenzoic acid 128 (500 mg, 2.36 mmol) and N-Cbz-ethylenediamine (588 mg, 2.83 mmol) were dissolved in N, N'-dimethylformamide (5.0 mL), and triethylamine (0.65 mL, 4.72 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (380 mg, 2.83 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (675 mg, 3.54 mmol). Stir for hours. The reaction mixture was worked up, and the crude product was purified by silica gel column chromatography to give compound 129 (445 mg, yield 48%).
  • Step 96 Compound 129 (200 mg, 0.515 mmol) synthesized in step 95 was dissolved in ethanol (5.0 mL), tin (II) chloride (584 mg, 3.09 mmol) and concentrated hydrochloric acid (0.2 mL) were added at room temperature, and 80 Stir at 16 ° C. for 16 hours. The reaction solution was post-treated to obtain Compound 130 (180 mg, yield 106%).
  • Step 97 Compound 131 was obtained in the same manner as in Step 9 of Example 1 using Compound 9 (8.17 g, 23.12 mmol) synthesized in Step 6 of Example 1 (3.7 g, yield 63%).
  • Step 98 Compound 132 was obtained in the same manner as in Step 10 of Example 1 using Compound 131 (3.7 g, 14.63 mmol) obtained in Step 97 (3.82 g, yield 67%).
  • Step 99 Compound 133 was obtained in the same manner as in Step 7 of Example 1 using Compound 132 (3.82 g, 9.86 mmol) obtained in Step 98 (3.08 g, yield 87%).
  • Step 101 Using compound 134 synthesized in step 100, compound 135 was obtained in the same manner as in steps 7-9 and 14-17 of Example 1 (1.579 g, yield 21%).
  • Step 102 Compound 56 (1.015 g, 1.748 mmol) synthesized in Step 51 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (12 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 187 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 6 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. Compound 107 (250.0 mg, 0.350 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (26.80 mg, 0.1750 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide synthesized in Step 76 were used in the filtrate.
  • Step 104 Compound 57 (500 mg, 0.879 mmol) synthesized in step 52 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (6.5 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 94 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 4 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. Compound 107 (126.0 mg, 0.176 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (13.47 mg, 0.088 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide synthesized in Step 76 were used in the filtrate.
  • Step 105 Compound 138 (0.242 g, 0.102 mmol) synthesized in Step 104 was dissolved in tetrahydrofuran (3.6 mL) and water (1.2 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 45 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 4 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 139 (216 mg, yield 93%).
  • Step 106 Compound 58 (430 mg, 0.674 mmol) synthesized in Step 53 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (6 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 79 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 4 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. Compound 107 (105.0 mg, 0.148 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (11.31 mg, 0.074 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (170.0. 0 mg, 0.887 mmol) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • Step 107 Compound 140 (0.210 g, 0.079 mmol) synthesized in step 106 was dissolved in tetrahydrofuran (3.1 mL) and water (1.0 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 39 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 4 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 141 (192.7 mg, yield 95%).
  • Step 108 Compound 57 (450 mg, 0.791 mmol) synthesized in step 52 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (6 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 85 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 5 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. Compound 113 (94 mg, 0.158 mmol) synthesized in Step 81, 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (133.0 mg, 0.871 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide in the filtrate Hydrochloric acid salt (182.0 mg, 0.950 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • Step 109 Compound 142 (80 mg, 0.035 mmol) synthesized in step 108 was dissolved in tetrahydrofuran (1.7 mL) and water (0.85 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 26 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 2 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 143 (57.5 mg, yield 75%).
  • Step 110 Compound 58 (418 mg, 0.655 mmol) synthesized in Step 53 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (6 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 77 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 5 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. Compound 113 (85 mg, 0.144 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (121.0 mg, 0.791 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide synthesized in Step 81 were used in the filtrate. Hydrochloride (165.0 mg, 0.863 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • Step 111 Compound 144 (186 mg, 0.073 mmol) synthesized in Step 110 was dissolved in tetrahydrofuran (2.8 mL) and water (0.93 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 40 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 2 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 145 (156.7 mg, yield 87%).
  • Step 112 Compound 143 (171 mg, 0.079 mmol) synthesized in Step 109 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (3.4 mL), glycine benzyl p-toluenesulfonate (32.0 mg, 0.095 mmol), 1-hydroxybenzo Triazole monohydrate (12.09 mg, 0.079 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (18.16 mg, 0.095 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • Step 113 Compound 146 (54 mg, 0.023 mmol) synthesized in step 112 was dissolved in tetrahydrofuran (0.83 mL) and water (0.28 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 18 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 2 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 147 (50.1 mg, yield 97%).
  • Step 114 Compound 56 (500 mg, 0.861 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL), 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 92.1 mg) was added at room temperature, and hydrogen atmosphere was added. Stir for 2 hours.
  • Compound 116 113 mg, 0.172 mmol
  • 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride 198 mg, 1.03 mmol
  • 1-hydroxybenzotriazole monohydrate at room temperature under argon atmosphere (13.2 mg, 0.086 mmol) was added and stirred overnight.
  • Step 115 Compound 148 (194 mg, 0.082 mmol) synthesized in step 114 was dissolved in tetrahydrofuran (2.9 mg) and water (1.0 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 35.7 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 8 hours under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 149 (183 mg, yield 98%).
  • Step 116 Compound 56 (500 mg, 0.861 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL), 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 92.1 mg) was added at room temperature, and hydrogen atmosphere was added. Stir for 2 hours.
  • Compound 120 (97.0 mg, 0.172 mmol), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (198 mg, 1.03 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate at room temperature under argon atmosphere (13.2 mg, 0.086 mmol) was added and stirred overnight.
  • Step 117 Compound 150 (175 mg, 0.077 mmol) synthesized in step 116 was dissolved in tetrahydrofuran (2.6 mg) and water (0.9 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 32.4 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 1 hour under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 151 (160 mg, yield 95%).
  • Step 118 Compound 58 (500 mg, 0.784 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL), 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 92.1 mg) was added at room temperature, and hydrogen atmosphere was added. Stir for 2 hours.
  • Compound 125 144 mg, 0.157 mmol
  • 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride 180 mg, 0.941 mmol
  • 1-hydroxybenzotriazole monohydrate at room temperature under argon atmosphere (12.0 mg, 0.078 mmol) was added and stirred overnight.
  • Step 119 Compound 152 (186 mg, 0.065 mmol) synthesized in step 118 was dissolved in tetrahydrofuran (2.8 mg) and water (0.9 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 34.3 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 1 hour under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 153 (174 mg, yield 97%).
  • Step 120 Compound 128 (150 mg, 0.228 mmol) was dissolved in dichloromethane (1.5 mL), trifluoroacetic acid (1.5 mL) was added at room temperature, and the mixture was stirred for 4 hours. The reaction was concentrated under reduced pressure and azeotroped with ethyl acetate.
  • Step 121 Compound 154 (242 mg, 0.100 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran / water (4/1; 12 mL), 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 44.6 mg) was added at room temperature, and hydrogen atmosphere was added. Stir for 2 hours. 6-maleimidohexanoic acid (23.2 mg, 0.110 mmol), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (at room temperature under argon atmosphere) 55.2 mg, 0.199 mmol) was added and stirred overnight.
  • Step 122 Compound 130 (75.0 mg, 0.228 mmol) synthesized in Step 96 was dissolved in N, N'-dimethylformamide (3.0 mL) and compound 60 (574 mg, 0.571 mmol), diisopropylethylamine synthesized in Step 55 at room temperature. (0.199 mL, 1.14 mmol), O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (217 mg, 0.571 mmol) was added. Stir overnight.
  • Process 123 Compound 156 (196 mg, 0.085 mmol) synthesized in step 122 was dissolved in tetrahydrofuran / water (4/1; 10 mL), and 10% palladium carbon powder (hydrated product, 54.29%; 36.1 mg) was added at room temperature. The mixture was stirred for 2 hours under a hydrogen atmosphere. 6-maleimidohexanoic acid (19.8 mg, 0.094 mmol), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (at room temperature under argon atmosphere) 47.0 mg, 0.170 mmol) was added and stirred overnight.
  • Step 124 Compound 158 (2.2 g, yield 58%) was obtained in the same manner as in Steps 33 and 34 of Example 8 using Compound 135 synthesized in Step 101.
  • Step 125 Using Compound 133 (0.101 g, 0.282 mmol) synthesized in Step 99 of Example 13 and Compound 62 (0.607 g, 0.613 mmol) synthesized in Step 57 of Reference Example 3, and Step 8 of Example 1 and In a similar manner, compound 159 (0.25 g, yield 39%) was obtained.
  • Step 126 Using the compound 159 (0.255 g, 0.111 mmol) synthesized in Step 125, Compound 160 (0.15 g, yield 63%) was obtained in the same manner as in Step 18 of Example 3. ESI-MS m / z: 2170 (M + H) +
  • Step 127 Using compound 160 (20.8 mg, 9.59 ⁇ mol) synthesized in step 126, compound 161 (5.5 mg, yield 24%) was obtained in the same manner as in step 19 of Example 3.
  • Step 128 Using Compound 133 (0.099 g, 0.277 mmol) synthesized in Step 99 of Example 13 and Compound 64 (0.618 g, 0.615 mmol) synthesized in Step 59 of Reference Example 3, and Step 8 of Example 1 and In the same manner, Compound 162 (0.343 g, yield 53%) was obtained.
  • Step 129 Compound 163 (6.9 mg, yield 28%) was obtained in the same manner as in Steps 18 and 19 of Example 3 using Compound 162 synthesized in Step 128.
  • Step 130 Similar to Step 29 of Example 5 using Compound 31 (0.048 g, 0.021 mmol) synthesized in Step 28 of Example 5 and N-succinimidyl 3-maleimidopropionate (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 0.017 g, 0.064 mmol) Compound 164 (0.040 g, yield 78%) was obtained by the method described above.
  • Step 132 Using hexanoic acid monobenzyl ester synthesized in the same manner as in Step 14 of Example 2 using Compound 31 (0.122 g, 0.054 mmol) synthesized in Step 28 of Example 5, compound was obtained by the method described in the same step. 166 (0.076 g, 56% yield) was obtained. ESI-MS m / z: 2503 (M + H) +
  • Step 133 Compound 167 (0.030 g, 40% yield) was obtained in the same manner as in Step 18 of Example 3 using Compound 166 (0.076 g, 0.03 mmol) synthesized in Step 132.
  • Step 134 The same method as in Step 12 of Example 1 using Compound 27 (4.36 mg, 0.006 mmol) synthesized in Step 24 of Example 4 and Compound 4 (10 mg, 0.02 mmol) synthesized in Step 3 of Reference Example 1 Gave compound 168 (7 mg, 65% yield).
  • Step 135 Using compound 158 (0.2011 g, 0.079 mmol) synthesized in step 124, compound 169 was obtained using step 35 in Example 8 (0.129 g, yield 55%).
  • Step 136 Using the compound 169 (0.129 g, 0.044 mmol) synthesized in Step 135, the crude product of Compound 170 was obtained using Step 36 in Example 8.
  • Step 138 Using compound 37 (100 mg, 0.040 mmol) synthesized in step 35 of Example 8 and compound 66 synthesized in step 60 of Reference Example 4, compound 172 (90 mg, 90 mg, Yield 76%) was obtained.
  • Step 139 Using the compound 172 (90 mg, 0.030 mmol) synthesized in Step 138, a crude product of Compound 173 was obtained in the same manner as in Step 36 of Example 8. ESI-MS m / z: 1558 (M + HCOOH-2H) 2-
  • Step 140 Using the crude product of compound 173 synthesized in step 139, compound 174 (21.5 ⁇ mol / g, two-stage yield 32%) was obtained in the same manner as in step 37 of Example 8.
  • Step 141 Using compound 158 (100 mg, 0.039 mmol) synthesized in step 124 of Example 14 and compound 66 synthesized in step 60 of Reference Example 4, compound 175 (90 mg, 90 mg, Yield 76%) was obtained.
  • Step 142 Using the compound 175 (90 mg, 0.030 mmol) synthesized in Step 141, a crude product of Compound 176 was obtained in the same manner as in Step 36 of Example 8.
  • Step 143 Using the crude product of Compound 176 synthesized in Step 142, Compound 177 (17.0 ⁇ mol / g, 2-step yield 26%) was obtained in the same manner as in Step 37 of Example 8.
  • Step 144 Using compound 158 (100 mg, 0.039 mmol) synthesized in step 124 of Example 14 and compound 69 synthesized in step 62 of Reference Example 4, compound 178 (50 mg, Yield 42%).
  • Step 145 Using a compound 178 (50 mg, 0.017 mmol) synthesized in Step 144, a crude product of Compound 179 was obtained in the same manner as in Step 36 of Example 8. ESI-MS m / z: 1587 (M + HCOOH-2H) 2-
  • Step 146 Using the crude product of Compound 179 synthesized in Step 145, Compound 180 (0.5 ⁇ mol / g, 2-step yield 1%) was obtained in the same manner as in Step 37 of Example 8.
  • Step 147 Using compound 158 (100 mg, 0.039 mmol) synthesized in step 124 of Example 14 and compound 71 synthesized in step 63 of Reference Example 4, compound 181 (40 mg, Yield 30%).
  • Step 148 Using the compound 181 (40 mg, 0.012 mmol) synthesized in Step 147, a crude product of Compound 182 was obtained in the same manner as in Step 36 of Example 8.
  • Step 149 Using the crude product of compound 182 synthesized in step 148, compound 183 (0.2 ⁇ mol / g, 2-step yield 1%) was obtained in the same manner as in step 37 of Example 8.
  • Step 151 Compound 184 (58 mg, 0.022 mmol) synthesized in step 150 was dissolved in methanol (0.15 mL) and described in Journal of Organic Chemistry, 74, 6837-6842, 2009. Compound 65 (16.9 mg, 0.032 mmol) synthesized by the method, 1 mol / L SODIUM L-ASCORBATE aqueous solution (0.022 mL, 0.022 mmol), 20 mmol / L copper sulfate (II) aqueous solution (0.011 mL, 0.22 ⁇ mol), and 10 mmol / L Tris (2-benzimidazolylmethyl) amine / DMSO solution (0.022 mL, 0.22 ⁇ mol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • Step 152 Using a compound 185 (10 mg, 3.13 ⁇ mol) synthesized in Step 151, a crude product of Compound 186 was obtained in the same manner as in Step 36 of Example 8.
  • Step 153 Compound 187 (8.4 ⁇ mol / g, yield 27%) was obtained in the same manner as in Step 37 of Example 8 using the crude product of Compound 186 synthesized in Step 152.
  • Step 154 Similar to Step 8 of Example 1 using Compound 158 (74.1 mg, 0.029 mmol) synthesized in Step 124 of Example 14 and Compound 95 (15 mg, 0.027 mmol) synthesized in Step 72 of Example 4
  • the crude organism of compound 188 was obtained by the method described in the method or bioconjugate chemistry, Vol. 26, pages 1451-1455, 2015. ESI-MS m / z: 1392 (M + H) + , detected as de-DMTr form
  • Step 155 Using the compound 188 (0.083 g, 0.027 mmol) synthesized in step 154, a crude product of compound 189 was obtained by the method described in Patent Document WO2015105083. ESI-MS m / z: 2669 (M + H) + , detected as de-DMTr form
  • Step 156 Using the compound 189 (0.08 g, 0.027 mmol) synthesized in Step 155, a crude product of Compound 190 was obtained in the same manner as in Step 36 of Example 8.
  • Step 157 Using compound 190 (g, mmol) synthesized in step 156, compound 200 was obtained in the same manner as in step 37 of Example 8 (10.0 ⁇ mol / g).
  • Example 15 Synthesis of nucleic acid complex Synthesis of nucleic acid complexes 210 to 218 Single-stranded nucleic acids described in Tables 27 and 28 using the compounds described in Table 26 in the same manner as in Step 38 of Example 9. A complex was obtained.
  • Table 29 shows the sequences and mass spectrometry results of the nucleic acid complexes synthesized in this example.
  • Step 158 Using the compound 168 synthesized in Step 134, a single-stranded nucleic acid complex 219 described in Table 30 was obtained in the same manner as in Step 40 of Example 10.
  • Table 30 shows the sequence and mass spectrometry results of the nucleic acid complex synthesized according to this example.
  • Step 160 Using the compound 200 synthesized in Step 157 of Example 14, a single-stranded nucleic acid complex 234 was obtained in the same manner as in Step 46 of Example 12.
  • nucleic acid complexes 251 to 287 Double-stranded nucleic acid complexes 251 to 287 were synthesized using single-stranded nucleic acid complexes (ssRNA) 210 to 233 and 235 to 247 in the same manner as in Step 39 of Example 9. Obtained.
  • the sequences of the nucleic acid complexes synthesized according to this example are shown in Tables 42, 43, 45, 47-54.
  • Step 160 Compound 288 was obtained as a crude product in the same manner as in Step 25 of Example 4 using Compound 133 (0.5 g, 1.365 mmol) synthesized in Step 99 of Example 13.
  • Step 161 Compound 289 was obtained as a crude product in the same manner as in Step 26 of Example 4 using Compound 288 (0.296 g, 0.247 mmol) synthesized in Step 160 of Example 16.
  • Step 162 Compound 289 (0.153 g, 0.247 mmol) synthesized in Step 161 of Example 16 and Inorganic Chemistry, Vol. 83, pages 1000-1007, 1- (synthesized by the method described in 2011. Compound 290 was obtained in the same manner as in Step 8 of Example 1 using 2-azidoethyl) -r-D-mannopyranoside (0.221 g, 0.989 mmol) (0.110 g, yield 31%).
  • Step 163 Compound 291 was obtained in the same manner as in Step 28 of Example 5 using Compound 290 (0.110 g, 0.077 mmol) synthesized in Step 162 of Example 16 (0.077 g, yield 77%).
  • Step 164 Compound 291 (20 mg, 0.016 mmol) synthesized in Step 163 of Example 16, 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 6-azidohexanoic acid (10 mg, 0.032 mmol) dissolved in tetrahydrofuran (2 mL) Diisopropylethylamine (0.027 mL, 0.078 mmol) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • Step 165 Compound 291 (20 mg, 0.016 mmol), N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (9.6 mg, 0.031 mmol) synthesized in Step 163 of Example 16 was dissolved in tetrahydrofuran (2 mL), and diisopropylethylamine ( 0.027 mL, 0.078 mmol) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • Step 166 A single-stranded nucleic acid complex 294 was obtained in the same manner as in Step 40 of Example 10 using Compound 292 synthesized in Step 164 of Example 16.
  • Step 167 A single-stranded nucleic acid complex 295 was obtained in the same manner as in Step 38 of Example 9 using Compound 293 synthesized in Step 165 of Example 16.
  • Test Example 5 In vitro activity of the nucleic acid complex on mouse primary hepatocytes of the nucleic acid complexes obtained in Examples and Comparative Examples, Table 59 was derived from CD-1 (CD-1) by the following methods. It was introduced into mouse primary hepatocytes (Life Technologies, catalog number MSCP10). Distribute 20 ⁇ L of each nucleic acid complex diluted with Optimem (Opti-MEM, GIBCO, 31985) to a final concentration of 30, 10 or 3 nmol / L in a 96-well culture plate. After that, William's E Medium (Life Technology, catalog number A12176), including Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements (Life Technology, catalog number CM3000).
  • Amplification of phosphate dehydrogenase (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hereinafter referred to as gapdh) gene was carried out by PCR reaction to measure the amount of mRNA amplification, and the amount of gapdh mRNA amplification was used as an internal control for semi-quantification of AT3 mRNA. The value was calculated.
  • the AT3 mRNA expression rate was determined from the AT3 mRNA quasi-quantitative value, with the AT3 mRNA quasi-quantitative value measured as 1.
  • the results of the expression rate of the obtained AT3 mRNA are shown in Tables 60-66 as the suppression rate with respect to the AT3 mRNA expression rate of the negative control.
  • the nucleic acid complex of the present invention suppressed the expression of mRNA of the AT3 gene after introduction into primary mouse hepatocytes.
  • Test Example 6 In Vivo Activity of Nucleic Acid Complexes in Mice Among the nucleic acid complexes obtained in Examples and Comparative Examples, Table 59 was subjected to an in vivo evaluation test by the following method. Each nucleic acid complex was diluted with phosphate buffered saline (DPBS) (Nacalai Tesque) according to the test. Mice (BALB / cA, obtained from Clea Japan) were acclimated and bred, and each nucleic acid complex was administered subcutaneously to the mice at 1.5 mg / kg or 0.5 mg / kg. In addition, as a control group, only PBS was subcutaneously administered to mice.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • the AT3 mRNA expression rate was determined from the AT3 mRNA quasi-quantitative value in the same manner as the AT3 mRNA quasi-quantitative value measured in the control group.
  • the AT3 protein concentration in plasma was measured using an antithrombin three mouse ELISA kit (manufactured by Abcam, catalog number ab108800) according to the method described in the attached instruction manual. The resulting AT3 mRNA expression suppression rate and plasma AT3 protein concentration are shown in Tables 67-69.
  • the nucleic acid complex of the present invention reduces the expression of the AT3 gene in the living body, AT3 protein concentration was decreased.
  • Test Example 7 In vitro activity of nucleic acid complex on human primary hepatocytes for B2M-siRNA (test object 39) and 260_3'-B2M-siRNA (test object 40) obtained in Example 15, the following methods were used respectively.
  • human primary hepatocytes manufactured by Biopredic international, catalog number HEP187.
  • B2M beta-2 microglobulin
  • gapdh D-glyceraldehyde-3- Phosphate dehydrogenase
  • the B2M mRNA expression rate was determined from the B2M mRNA semi-quantitative value, with the B2M mRNA semi-quantitative value in the negative control measured as 1.
  • the results of the expression rate of the obtained B2M mRNA are shown in Table 70 as the suppression rate with respect to the B2M mRNA expression rate of the negative control.
  • Test Example 8 Evaluation of mRNA knockdown activity of nucleic acid complex on human monocyte-derived macrophage cells RMP1640 medium containing 10% fetal bovine serum (RPMI1640 medium, manufactured by Nacalai Tesque, 30264-56) (hereinafter 10% FBS Using RPMI1640 medium) and DNase I solution (DNase I Solution, StemCell Technology, 07900), thaw human CD14-positive monocyte cells (Untouched Frozen NPB-CD14 + Monocytes, Allcells, PB011F) according to the attached protocol. did.
  • RPMI1640 medium 10% fetal bovine serum
  • DNase I solution DNase I Solution, StemCell Technology, 07900
  • GM-CSF granulocyte monocyte colony-stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte monocyte colony-stimulating factor
  • the cells were seeded on a multiplate (SUMILON, MS-8196F5) at a density of 10 6 cells / mL, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • test samples included Beta-2 Microglobulin (hereinafter referred to as B2M) and HPRT-1 target nucleic acid complex 296_3'-B2M-siRNA (test sample 41), and controls corresponding to these nucleic acid complexes, respectively.
  • nucleic acid complex solution was performed according to the following procedure.
  • the mRNA amplification amount was measured by PCR reaction of the HPRT-1 gene as B2M and the control, respectively, and the mRNA amplification amount of HPRT-1 was used as the internal control, and the B2M mRNA quasi level was measured. A quantitative value was calculated.
  • the B2M gene was measured using a Taqman probe Hs00187842_m1 (Applied Biosystems) and TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542) as a reaction reagent according to the attached protocol.
  • the target mRNA amount of the nucleic acid was calculated as a relative ratio when the B2M mRNA amount in the negative control group (nucleic acid non-introduced group) was 1.
  • Table 71 shows the results of expressing the relative proportion of the mRNA amount as mean ⁇ standard deviation.
  • test object 41 exhibits a significant knockdown effect in human monocyte-derived macrophages compared to the control B2M-siRNA (test object 42). confirmed.
  • the nucleic acid complex of the present invention can be administered to a mammal and used to treat various related diseases in vivo.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of ApoBASO.
  • SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of AT3-ssRNA.
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of AT3-asRNA.
  • SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of B2M-ssRNA.
  • SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of B2M-asRNA.
  • Sequence number 6 shows the nucleotide sequence of CD45ASO.
  • SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of 3′-dT10.
  • SEQ ID NO: 8 shows the base sequence of Hprt1-ssRNA.
  • SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of Hprt1-asRNA.

Abstract

本発明は、下記式１で表される核酸複合体に関する。 式１：（式１中、Ｘは、オリゴヌクレオチドであり、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）

Description

核酸複合体
　本発明は、核酸複合体および該核酸複合体を含む医薬組成物等に関する。
　核酸医薬として、アプタマー、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡ等が知られている。核酸医薬は、細胞内のあらゆる遺伝子を制御できる汎用性の高さから、今まで治療困難とされてきたさまざまな疾患への臨床応用が期待されている。
　また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから抗体、低分子医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。
　しかしながら、核酸医薬は、標的組織への送達が困難であることが問題点として挙げられる。
　インビボにおける効果的な核酸医薬の送達法の１つとして、標的化化合物と核酸との核酸複合体（コンジュゲート）を用いることが報告されている。標的化化合物としては、細胞外に発現する受容体に結合可能なリガンドが挙げられる。その中でも特に、肝細胞に極めて高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能であるリガンドとしてＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等を利用した核酸複合体が複数報告されている。近年では、これらのリガンドとｓｉＲＮＡ類とを結合した核酸複合体が肝細胞に効率的に送達されることが報告されている（非特許文献１）。
　標的化化合物とオリゴヌクレオチドの複合体として、特許文献１および２には、例えば、以下に示す核酸複合体が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 （式中、Ａｃはアセチル基を表す。以下、本明細書において同様である。）
　また、特許文献３には、特許文献１および２と同様の糖リガンド－テザーユニットを有する以下の構造を有する核酸複合体が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　また、特許文献４には、糖リガンド－テザーユニットとして、以下に示す構造を有する核酸複合体が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
国際公開第２００９／０７３８０９号 国際公開第２０１３／０７５０３５号 国際公開第２０１５／１０５０８３号 国際公開第２０１４／１７９６２０号
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ），２０１４年，第１３６巻，ｐ１６９５８-１６９６１
　本発明の目的は、新規核酸複合体を提供することにある。
　本発明は、以下の（１）～（２２）に関する。
（１）
　下記式１で表される核酸複合体。
式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 （式１中、
　Ｘは、オリゴヌクレオチドであり、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
（２）
　下記式２で表される構造を有する、（１）に記載の核酸複合体。
式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 （式２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であり、
　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
式２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
　ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
　ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。）
（３）
　Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である請求項２に記載の核酸複合体。
（４）
　－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－および－（Ｐ５－Ｑ３）ｑ３－がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造である、（２）および（３）に記載の核酸複合体。
式３－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 式３－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 式３－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 （式３－１～式３－３中、
　ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、式３－１～式３－３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
（５）
　下記式４－１～式４－９で表されるいずれかの構造を有する、（２）～（４）のいずれか一項に記載の核酸複合体。
式４－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 式４－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 式４－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 式４－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 式４－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 式４－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 式４－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 式４－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 式４－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 （式４－１～４－９中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
（６）
　下記式５で表される構造を有する、（１）に記載の核酸複合体。
式５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 （式５中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
（７）
　Ｐ１が－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である（６）に記載の核酸複合体。
（８）
　下記式６－１～式６－９で表されるいずれかの構造を有する、（６）または（７）に記載の核酸複合体。
式６－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 式６－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 式６－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 式６－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 式６－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 式６－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 式６－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 式６－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 式６－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 （式６－１～６－９中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
（９）
　下記式７－１～式７－９で表されるいずれかの構造を有する、（２）～（８）に記載の核酸複合体。
式７－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 式７－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 式７－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 式７－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 式７－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 式７－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 式７－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 式７－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 式７－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 （１０）
　下記式１１で表される構造を有する、（１）～（９）のいずれかに記載の核酸複合体。
式１１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 （式１１中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ７およびＰ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ８は０～９９の整数であり、
　Ｂ３は、下記式１１－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ５およびＱ６との結合手を意味し、
式１１－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 　ｑ５およびｑ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数である。）
（１１）
　下記式１２－１～式１２－１２で表されるいずれかの構造を有する、（１）～（１０）のいずれかに記載の核酸複合体。
式１２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 式１２－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 式１２－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 式１２－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 式１２－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 式１２－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 式１２－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 式１２－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 式１２－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 式１２－１０：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 式１２－１１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
 式１２－１２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
 （式１２－１～１２－１２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、ｎ１’～ｎ１２’はそれぞれ独立して、１～１０の整数である。）
（１２）
　前記糖リガンドが、マンノースまたはＮ－アセチルガラクトサミンである、（１）～（１１）のいずれかに記載の核酸複合体。
（１３）
　前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、（１）～（１２）のいずれかに記載の核酸複合体。
（１４）
　（１）～（１３）のいずれかに記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
（１５）
　細胞内に導入するための、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）
　前記細胞が肝細胞である、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）
　静脈内投与または皮下投与される、（１４）～（１６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１８）
　（１）～（１３）のいずれかに記載の核酸複合体または（１４）～（１７）のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
（１９）
　前記患者が哺乳動物である、（１８）に記載の治療または予防方法。
（２０）
　下記式８で表される化合物。
式８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 （式８中、
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４、または－ＣＯ－Ｂ４－［（Ｐ９－Ｑ８）ｑ７－Ｔ３－Ｌ３］ｐ３であり、
　Ｐ９およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ８は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ１は０～９９の整数であり、
　Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式８－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ７、ｍ８、ｍ９およびｍ１０は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
式８－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 　ｐ３は、１、２または３の整数であり、
　ｑ７は、０～１０の整数であり、
　Ｌ３は、糖リガンドであり、
　Ｙは－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２－ＮＨ－であり、ｍ１１およびｍ１２は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　Ｒ３は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９－Ｂ５－（Ｑ１０－Ｐ１０）ｑ８－Ｘ１であり、
　Ｐ１０は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、ｎ２は０～９９の整数であり、
　Ｑ９およびＱ１０は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３は０～９９の整数であり、
　Ｂ５は、下記式８－２で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９およびＱ１０との結合手を意味し、
式８－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
 　ｑ８は、０～１０の整数であり、
　Ｘ１は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ４は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
（２１）
　下記式９で表される化合物。
式９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 （式９中、
　Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、または－ＣＯ－Ｑ１１－（Ｐ１１－Ｑ１１’）ｑ９－Ｔ４－Ｌ４であり、
　Ｐ１１およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１１およびＱ１１’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ４－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ４は０～９９の整数であり、
　ｑ９は、０～１０の整数であり、
　Ｌ４は、糖リガンドであり、
　Ｙ’は－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１’－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２’－ＮＨ－であり、ｍ１１’およびｍ１２’は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　Ｒ３’は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２’－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９’－Ｂ５’－（Ｑ１０’－Ｐ１０’）ｑ８’－Ｘ１’であり、ｎ２’は０～９９の整数であり、
　Ｐ１０’は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ９’およびＱ１０’は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３’－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３’は０～９９の整数であり、
　Ｂ５’は、下記式９－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９’およびＱ１０’との結合手を意味し、
式９－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 　ｑ８'は、０～１０の整数であり、
　Ｘ１’は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ４’は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
（２２）
　下記式１０で表される化合物。
式１０：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
 （式１０中、
　Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、－ＮＨ－Ｒ１０、または－ＮＨ－Ｑ１２－（Ｐ１２－Ｑ１２’）ｑ10－Ｔ５－Ｌ５であり、
　Ｐ１２およびＴ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１２およびＱ１２‘は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ５－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ５は０～９９の整数であり、
　Ｌ５は、糖リガンドであり、
　Ｙ２は－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１３－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１４－ＮＨ－であり、ｍ１３およびｍ１４は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　ｑ１０は、０～１０の整数であり、
　Ｒ９は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ１０、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ６－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ１３－Ｂ６－（Ｑ１４－Ｐ１３）ｑ１１－Ｘ２であり、ｎ６は０～９９の整数であり、
　Ｐ１０は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１３およびＱ１４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ７－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ７は０～９９の整数であり、
　Ｂ６は、下記式１０－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ１３およびＱ１４との結合手を意味し、
式１０－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 　ｑ１１は、０～１０の整数であり、
　Ｘ２は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ１０は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　例えば本発明の核酸複合体を含む医薬組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療することができる。
　本発明の核酸複合体は、下記式１で表される核酸複合体である。
式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 　式１中、
　Ｘは、オリゴヌクレオチドであり、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。
　本発明において、Ｓ１およびＳ２は、Ｓ３のベンゼン環上の置換位置に対して、それぞれオルト位、メタ位、パラ位でベンゼン環と結合し得るが、下記式１－１で表される核酸複合体であることが好適である。式１におけるＳ１およびＳ２のベンゼン環への結合手は、ベンゼン環上のＳ３の置換位置以外で任意の位置であり得ることを意味する。
式１－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 　式１－１中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。
　本明細書において、前記と同義とは、式１－１中を例示して説明すると、式１－１中のＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについて、式１において前記するＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
　本発明において、Ｘは、オリゴヌクレオチドであり、核酸医薬として用いることが知られたオリゴヌクレオチドを用いることができる。本発明において、核酸医薬とは、アプタマー、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡ等として用いられるヌクレオチドを意味する。
　本発明においては、Ｓ３とオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成する糖部分の３’位または５’位を介してＳ３と結合するだけでなく、ヌクレオチドを構成する塩基部分を介してＳ３と結合していてもよい。本発明においては、オリゴヌクレオチドは、Ｓ３とオリゴヌクレオチドを結合する構造を有する基として理解されてよく、例えば、オリゴヌクレオチドが、－Ｏ－Ｐ（Ｚ）（Ｚ’）Ｏ－（式中、ＺおよびＺ’は、それぞれ独立して、酸素原子またはイオウ原子である。）を介してＳ３と結合している場合、Ｘとしてのオリゴヌクレオチドとしては、－Ｏ－Ｐ（Ｚ）（Ｚ’）Ｏ－オリゴヌクレオチドとして理解されてもよい。
　また、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。
　Ｓ３のリンカーとＸのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端で結合する。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合には、Ｓ３のリンカーは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の３’末端または５’末端と結合していることが好ましいが、当該結合に限定されるものではない。
　本発明において、標的ｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンスヌクレオチドと称し、アンチセンスヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンスヌクレオチドとも称する。
　本発明で用いられる核酸複合体を構成するオリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を制御する能力を有するものであればいかなる形状でもよく、一本鎖のオリゴヌクレオチドまたは二本鎖のオリゴヌクレオチドが好適に用いられる。
　オリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチドまたはヌクレオチドと同等の機能を有する分子の重合体であればいかなる分子であってもよく、例えばデオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの重合体であるキメラ核酸が挙げられる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびキメラ核酸において、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチド等のヌクレオチドがヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体であってもよい。なお、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）は、ＤＮＡにおいてはチミン（Ｔ）に一義的に読み替えられる。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えば、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体等が挙げられ、例えばＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等、糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、２’－修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
　２’－修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの２’－ＯＨ基がＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群（Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１～６のアルキレンである）から選択される置換基で置換された２’－修飾ヌクレオチドが挙げられ、２’－修飾としては、好ましくはＦ、メトキシ基およびエトキシ基での置換が挙げられる。また、２－（ｍｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ基、３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ基、２－［（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ基、３－（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｏｘｙ基、２－［２－（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ基、２－（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｏｘｙ基、２－（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ基および２－ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙ　基からなる群から選択される置換基で置換された２’－修飾ヌクレオチド等も挙げられる。
　また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）（ＢＮＡ）も好適に用いられる。具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）　［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３８，　８７３５　（１９９７）およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，　５４，　３６０７　（１９９８）］、エチレン架橋構造型人工核酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）（ＥＮＡ）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３２，　ｅ１７５　（２００４）］、Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　Ｅｔｈｙｌ　（ｃＥｔ）［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７５，　１５６９　（２０１０）］、Ａｍｉｄｏ－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　（ＡｍＮＡ）［Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　Ｃｈｅｍ　１３，　２５１３　（２０１２）］および２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　（ｓｃｐＢＮＡ）［Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　５１，　９７３７　（２０１５）］等が挙げられる。
　さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Ａｃｃ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．，　３２，　６２４　（１９９９）］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１２３，　４６５３　（２００１）］、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１２２，　６９００　（２０００）］等も糖部修飾ヌクレオチドとして挙げられる。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。
　塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数１～６のアルキル基、ハロゲン基で置換されたもの、メチル基が水素原子、ヒドロキシメチル基、炭素数２～６のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン（Ｃ）の代わりに５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。
　ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、５’－ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Ｃｙ５付加ヌクレオチド誘導体、Ｃｙ３付加ヌクレオチド誘導体、６－ＦＡＭ付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
　ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
　オリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。
　本明細書において「相補」とは、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように、緩やかな水素結合を介して2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味する。
　本明細書において「相補的」とは、２つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、ヌクレオチド配列間で０～３０％、０～２０％または０～１０％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、標的ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の標的配列に対して１～８個、好ましくは１～６個、１～４個、１～３個、特に２個または１個のミスマッチ塩基を有していてもよい。
　また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基が付加および／または欠失した配列である場合を包含する。例えば、標的ｍＲＮＡとアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける塩基の付加および／または欠失により、アンチセンス鎖および／または標的ｍＲＮＡ領域に１個または２個のバルジ塩基を有してもよい。
　ただし、以下、「相補的」と記載する箇所において、「相補」の意味も包含する形で記載する。
　本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子をコードするＤＮＡ、標的遺伝子をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡと二本鎖を形成することによりＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡの働きを抑制する。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡと完全に相補的であるもののみならず、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡとストリジェントな条件でハイブリダイズできる限り、１もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子にハイブリダイズする核酸であれば、ヘアピンオリゴマー、環状オリゴマーの形態中に導入されてもよく、内部または末端のバルジまたはループ等の構造要素を含有してもよい。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、８～８０塩基であり、８～３０塩基が好ましい。例えば、８～２０塩基、１０～２０塩基、１３～２０塩基、１３～１６塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基であり得る。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に導入されると、相補的なｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡと結合し蛋白質に翻訳されるのを立体的に阻害して、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
　またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体またはｍｉｃｒｏＲＮＡと結合し、ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能を立体的に阻害することもできる。
　またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体と結合し、ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体を切断することもある。このような例として、ＲＮＡとＤＮＡの二重鎖のＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＨを介した作用が知られている。本発明の細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体と二重鎖を形成するとＲＮａｓｅＨに認識され、相補的なｍＲＮＡ鎖を酵素的に分解することができる。
　ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体の切断を誘導するには、４～８０個の連続したＤＮＡ領域を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは０～８０％の糖部修飾ヌクレオチドを持つことが好ましく、１０～６０％がより好ましく、２０～５０％がさらに好ましい。また、糖部修飾ヌクレオチドを持つ場合の連続したＤＮＡ領域は、４～２０個がより好ましく、４～１５個がさらに好ましく、５～１０個が最も好ましい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部修飾ヌクレオチドの位置は、５’末端近傍および／または３’末端近傍に配置することが好ましく、５’端から全長の長さの２５％以内の位置および／または３’端から全長の長さの２５％以内の位置に配置することがより好ましい。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴ核酸と二重鎖を形成させ、二重鎖核酸として細胞内に導入することで標的遺伝子の発現抑制を誘導することもできる（国際公開第２００５／１１３５７１号を参照）。この場合の二重鎖核酸をリガンドで修飾する位置は、相補的なオリゴ核酸の５’末端または３’末端が好ましい。
　本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のプロモーター配列等に対して相補的な塩基配列を用いることで、標的遺伝子の発現を亢進させることもできる（国際公開第２０１３／１７３６０１号および国際公開第２０１３／１７３６３７号を参照）。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等が挙げられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３５，　３２８７　（２００７）］等を挙げることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度９０％以上、好ましくは９５％以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを得るのが望ましい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはＤＮＡを鋳型としてファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写による方法が挙げられる。
　本発明で用いられる二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのオリゴヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。
　本発明で用いられる二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常１１～３５塩基であり、１５～３０塩基が好ましく、１７～２５塩基がより好ましく、１７～２３塩基がさらに好ましく、１９～２３塩基が特に好ましい。
　本発明で用いられる、標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつ標的タンパク質の発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつ標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のプロモーター配列等に相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる分子を用いることで、標的遺伝子の発現を亢進させることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　４１，　１００８６　（２０１３）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，　５９，　２１６　（２０１４）］。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドとは、二本のオリゴヌクレオチドが対合し二重鎖領域を有するヌクレオチドをいう。二重鎖領域とは、二本鎖を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖領域は、通常１１～２７塩基対であり、１５～２５塩基対が好ましく、１５～２３塩基対がより好ましく、１７～２１塩基対がさらに好ましい。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドを構成する一本鎖のオリゴヌクレオチドは、通常１１～３０塩基からなるが、１５～２９塩基からなることが好ましく、１５～２７塩基からなることがより好ましく、１５～２５塩基からなることがさらに好ましく、１７～２３塩基からなることが特に好ましい。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドにおいて、二重鎖領域に続く３’側または５’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部（オーバーハング）と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
　突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１～６塩基、通常は１～３塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、２塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばｄＴｄＴまたはＵＵからなる突出部を有するものが挙げられる。突出部は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのみ、センスオリゴヌクレオチドのみ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとセンスオリゴヌクレオチドの両方に有することができるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の５’末端または３’末端が１～４塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ同士が二重鎖を形成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＮＡ同士が二重鎖を形成した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはＲＮＡとＤＮＡが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がＤＮＡとＲＮＡとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から２番目のヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から２番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から２～７番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から２～７番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から２～１１番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から２～１１番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から１１番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から１１番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から９～１３番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から９～１３番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から７～１５番目のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡ配列の３’末端から７～１５番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
　二本鎖核酸領域内のヌクレオチドに対して、修飾ヌクレオチドは、５０～１００％含まれることが好ましく、７０～１００％含まれることがより好ましく、９０～１００％含まれることがさらに好ましい。
　二本鎖のオリゴヌクレオチドは化学的に合成することができ、一般に固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる（たとえば、Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許第５，８０４，６８３号明細書；米国特許第５，８３１，０７１号明細書；米国特許第５，９９８，２０３号明細書；米国特許第６，１１７，６５７号明細書；米国特許第６，３５３，０９８号明細書；米国特許第６，３６２，３２３号明細書；米国特許第６，４３７，１１７号明細書；米国特許第６，４６９，１５８号明細書；Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許第６，１１１，０８６号明細書；米国特許第６，００８，４００号明細書；米国特許第６，１１１，０８６号明細書を参照）。
　ＲＮＡは、酵素的または部分／全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。ＲＮＡ分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３２，　９３６　（１９９８）を参照］。
　本発明で用いられるＲＮＡとしては、標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１５～３０塩基、好ましくは１７～２５塩基、より好ましくは１９～２３塩基の配列（以下、配列Ｘとする）および配列Ｘと相補的な塩基の配列（以下、相補的配列Ｘ’とする）を含んでいるＲＮＡがあげられ、例えば、配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡ、該センスオリゴヌクレオチドと該アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するＲＮＡが挙げられる。
　配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として配列Ｘのみを含んでいるＲＮＡ（以下、配列Ｘ鎖とする）、配列Ｘ鎖の３’端もしくは５’端または両端に１～６個、好ましくは２～４個のヌクレオチドが同一または異なって付加されたＲＮＡが挙げられる。
　相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として相補的配列Ｘ’のみを含んでいるＲＮＡ（以下、相補的配列Ｘ’鎖とする）、相補的配列Ｘ’鎖の３’端もしくは５’端または両端に１～６個、好ましくは２～４個のヌクレオチドが同一または異なって付加された、二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。
　配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドと相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれたヘアピン構造を有するＲＮＡのスペーサーオリゴヌクレオチドとしては、６～１２塩基のヌクレオチドが好ましく、その５’端の配列は２個のＵであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる２つのＲＮＡの順番はどちらが５’側になってもよく、配列Ｘを含むセンス鎖が５’側になることが好ましい。
　配列Ｘ鎖および相補的配列Ｘ’鎖に付加されるヌクレオチド、ならびにスペーサーオリゴヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか１種または複数種でもよく、またそれぞれの塩基に結合する糖が、リボース、デオキシリボースまたは２’位の水酸基が修飾基で置換されたリボースのいずれでもよいが、付加されるヌクレオチドとしては、ウリジル酸（Ｕ）およびデオキシチミジル酸（ｄＴ）のいずれか１種または２種がより好ましい。また、配列Ｘ鎖の３’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と同じ塩基配列としてもよい。また、相補的配列Ｘ’鎖の３’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列としてもよい。
　本発明で用いられるＲＮＡのより好ましい例としては、例えば、（ａ）配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡであり、配列Ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する１９～２１塩基の配列であって、センスオリゴヌクレオチドが配列Ｘ鎖および配列Ｘ鎖の３’端に２～４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的配列Ｘ’鎖および相補的配列Ｘ’鎖の３’端に２～４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡ、（ｂ）配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡであり、配列Ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する２３～２５塩基の配列であって、センスオリゴヌクレオチドが配列Ｘ鎖であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的配列Ｘ’鎖である二本鎖ＲＮＡ、（ｃ）配列Ｘを含むセンスオリゴヌクレオチドおよび相補的配列Ｘ’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡであり、配列Ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡの連続する２３～２７塩基の配列であって、センスオリゴヌクレオチドが配列Ｘ鎖および配列Ｘ鎖の３’端に２～４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的配列Ｘ’鎖および相補的配列Ｘ’鎖の３’端に２～４個の同一または異なって付加されたヌクレオチドからなり、相補的配列Ｘ’鎖の３’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列が、標的遺伝子のｍＲＮＡ内で配列Ｘと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列である、二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。
　また、本発明で用いられるＲＮＡとしては、好ましくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡが挙げられる。
　一本鎖のオリゴヌクレオチドは、固相ホスホロアミダイト法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３０，２４３５　（１９９３）を参照］を使用して合成され、脱保護され、およびＮＡＰ－５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で脱塩される。オリゴマーは、１５分工程のリニア勾配を使用するＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｓｏｕｒｃｅ　１５Ｑカラム－１．０ｃｍ。高さ．２５　ｃｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を使用して精製する。勾配は、９０：１０の緩衝液Ａ：Ｂから５２：４８の緩衝液Ａ：Ｂに変化し、緩衝液Ａは１００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８．５であり、および緩衝液Ｂは、１００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８．５（１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）である。試料は、２６０ｎｍにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、ＮＡＰ－５カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
　各一本鎖のオリゴヌクレオチドの純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＰＡＣＥ　５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．，　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，　Ｃａｌｉｆ）でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定される。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ　１００Ｒ　Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含む。典型的には、約０．６ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、４４４Ｖ／ｃｍの電界において実行して、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって検出される。変性トリス－ホウ酸－７ｍｏｌ／Ｌ－尿素泳動緩衝液は、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入する。以下に記述した実験に使用するための、ＣＥによって評価すると少なくとも９０％純粋である一本鎖のオリゴヌクレオチドが得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ　ＤＥ．ＴＭ．Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，、Ｃａｌｉｆ．）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分光法によって検証される。一本鎖のオリゴヌクレオチドの相対的な分子質量は、予想される分子質量の０．２％以内で得ることができる。
　一本鎖のオリゴヌクレオチドは、１００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸カリウム、３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ　７．５からなる緩衝液中に１００μｍｏｌ／Ｌ濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、５０μｍｏｌ／Ｌ二本鎖のオリゴヌクレオチドの最終溶液を得る。試料を９５℃まで５分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、－２０℃にて保存する。一本鎖のオリゴヌクレオチドは、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、－８０℃で貯蔵する。
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドである。
　本発明において、糖リガンドとしては、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類（単糖、二糖、三糖および多糖等）に由来する基を意味する。本発明においては、糖リガンドがＯ－結合によりＳ１およびＳ２のリンカーに結合している場合には、糖リガンドを構成する糖類の結合に関与する水酸基を除いた部分が糖類に由来する基としての糖リガンドを意味する。
　本発明においては、オリゴヌクレオチドの標的細胞となる糖リガンドを選択すればよい。
　単糖としては、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ－フシトール、Ｌ－フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ－ガラクトサミニトール、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース－６－リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース－６－リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられる。
　二糖、三糖、多糖としては、例えば、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２－デオキシリボース、２－デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β－マルトース、マルトリオース、マンナン－オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、シアル酸含有糖鎖、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α－トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロース等が挙げられる。
　糖類における各単糖は、Ｄ体またはＬ体であってもよく、Ｄ体とＬ体の任意割合による混合物であってもよい。
　糖類は、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ－置換単糖（非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等を含んでいてもよい。
　アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミン等が挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基等で置換されていてもよい。
　シアル酸含有糖鎖としては、ＮｅｕＡｃを糖鎖非還元末端に含有する糖鎖が挙げられ、ＮｅｕＡｃ－Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃを含有する糖鎖や、Ｎｅｕ５Ａｃα（２－６）Ｇａｌβ（１－３）ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
　糖類における各単糖は、標的細胞に発現している受容体に結合可能であることを限度として、置換基で置換されていてもよく、例えば、水酸基が置換されていてもよく、各単糖における水素原子がアジドおよび／または置換されていてもよいアリール基で１～複数置換されていてもよい。
　糖リガンドとしては、標的とする各臓器に対応して標的細胞の表面に発現する受容体に結合する糖リガンドを選択することが好ましく、例えば、標的細胞が肝細胞である場合、肝細胞表面に発現する受容体に対する糖リガンドが好ましく、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する糖リガンドがより好ましい。
　ＡＳＧＰＲに対する糖リガンドとしては、マンノースまたはＮ－アセチルガラクトサミンが好ましく、Ｎ－アセチルガラクトサミンがより好ましい。
　ＡＳＧＰＲに対してより親和性の高い糖リガンドとして、例えばＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７，７２５４　（２００９）、およびＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３４，　１９７８　（２０１２）等に記載の糖誘導体が知られており、これらを用いてもよい。
　本発明において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、リンカーである。
　Ｓ１とＳ２は、糖リガンドであるＬ１とＬ２と、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してもよい。Ｓ１とＳ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　糖リガンドであるＬ１とＬ２は、Ｓ１およびＳ２とグリコシド結合により連結していることが好ましく、Ｓ１およびＳ２は、ベンゼン環と、例えば、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－結合によりそれぞれ連結していてもよい。
　Ｓ３は、オリゴヌクレオチドであるＸと、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してよい。
　オリゴヌクレオチドであるＸは、Ｓ３とホスホジエステル結合により連結していることが好ましく、Ｓ３は、ベンゼン環と、例えば、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－結合により連結していてもよい。
　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３のリンカーとしては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号に開示される構造を採用してもよい。
　本発明において、核酸複合体は、下記式２で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 　式２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であり、
　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
式２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
 　ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
　ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
　ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。
　Ｐ１およびＰ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることがより好ましく、－ＮＨ－ＣＯ－であることがさらに好ましい。
　Ｐ１またはＰ４が、例えば、－ＮＨ－ＣＯ－である場合、－ＮＨ－ＣＯ－ベンゼン環という部分構造を有する。
　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１～６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１～４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
　Ｐ２およびＰ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、存在しないか、－ＣＯ－Ｏ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、存在しないか、－ＣＯ－ＮＨ－であることがより好ましい。Ｐ２およびＰ５が、例えば、－ＣＯ－ＮＨ－である場合、Ｂ１－ＣＯ－ＮＨ－Ｑ１およびＢ２－ＣＯ－ＮＨ－Ｑ３という部分構造を有する。
　－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－および－（Ｐ５－Ｑ３）ｑ３－がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式３－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
 式３－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 式３－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
 　式３－１～３－３中、
　ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、式３－１～式３－３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。
　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
 　Ｂ１およびＢ２は、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸等の非天然アミノ酸を含むアミノ酸、または1，3－プロパンジオール等のアミノアルコールに由来する基であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がグルタミン酸およびアスパラギン酸に由来する基である場合、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、－ＮＨ－ＣＯ－結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がリジンに由来する基である場合、リジンのカルボキシル基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、－ＣＯ－ＮＨ－結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がイミノ二酢酸に由来する基である場合、イミノ二酢酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、－ＣＯ－結合となることが好ましい。
　本発明において、核酸複合体は、下記式４－１～４－９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式４－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
 式４－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
 式４－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
 式４－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
 式４－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
 式４－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
 式４－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
 式４－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
 式４－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
 　式４－１～４－９中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。
　Ｐ３およびＰ６は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－ＣＯ－または－ＮＨ－ＣＯ－であることが好ましく、－ＮＨ－ＣＯ－であることがより好ましい。Ｐ３およびＰ６が、例えば、－ＮＨ－ＣＯ－である場合、それぞれ、Ｂ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ２およびＢ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４という部分構造を有する。
　Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－または－Ｓ－であることが好ましく、－Ｏ－であることがより好ましい。
　本発明において、核酸複合体は、下記式５で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
　式５では、式２におけるＰ１とＰ４、Ｐ２とＰ５、Ｐ３とＰ６、Ｑ１とＱ３、Ｑ２とＱ４、Ｂ１とＢ２、Ｔ１とＴ２、Ｌ１とＬ２、ｐ１とｐ２、ｑ１とｑ３ならびにｑ２とｑ４がそれぞれ同一である。
式５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
 　式５中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。
　また、式５におけるＸ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２は、各々、上述した好適な基であって良いが、Ｐ１が－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－であることが好ましい。
　式５における－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－は、存在しないか、または上記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
　本発明において、核酸複合体は、下記式６－１～６－９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式６－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
 式６－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
 式６－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000120
 式６－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
 式６－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
 式６－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
 式６－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
 式６－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
 式６－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000126
 　式６－１～式６－９中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、およびＬ１は、それぞれ前記と同義である。
　本発明において、核酸複合体は、下記式７－１～式７－９のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式７－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000127
 式７－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
 式７－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
 式７－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
 式７－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
 式７－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
 式７－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
 式７－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000134
 式７－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000135
 　式７－１～式７－９中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。Ｌ１とＬ２は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
　式７－１～式７－９において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式７－１～式７－９で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
　本発明において、核酸複合体は、下記式１１で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000136
 　式１１中、
　Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ７およびＰ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ８は０～９９の整数であり、
　Ｂ３は、本明細書中ではブランチャーユニットと呼ばれ、下記式１１－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ５およびＱ６との結合手を意味し、
式１１－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000137
 　ｑ５およびｑ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数である。
　Ｐ７は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－または-ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、－Ｏ－または－ＮＨ－ＣＯ－であることがより好ましい。Ｐ７が、例えば、－Ｏ－である場合、ベンゼン環－Ｏ－という部分構造を有する。
　Ｐ８は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、存在する場合、－ＣＯ－Ｏ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、－ＣＯ－ＮＨ－であることがより好ましい。Ｐ８が、例えば、－ＣＯ－ＮＨ－である場合、Ｑ６－ＣＯ－ＮＨ－という部分構造を有する。
　Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ８は０～９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１～６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１～４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
　－（Ｐ７－Ｑ５）ｑ５－は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１５－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１６－ＮＨ－であり、ｍ１５およびｍ１６は、それぞれ独立して、１～１０の整数であることが好適である。
　本発明において、核酸複合体は、下記式１２－１～式１２－１２のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000138
 式１２－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000139
 式１２－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000140
 式１２－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000141
 式１２－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000142
 式１２－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000143
 式１２－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000144
 式１２－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000145
 式１２－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000146
 式１２－１０：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000147
 式１２－１１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000148
 式１２－１２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000149
 　式１２－１～１２－１２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、ｎ１’～ｎ１２’はそれぞれ独立して、１～１０の整数である。
　本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、式２および式１１の構造を併せて持つ核酸複合体であることが好ましく、該核酸複合体において、式１１の構造であって、式２が、式４－１～式４－９であってもよく、式６－１～式６－９であってもよく、式７－１～式７－９であってもよく、式２が、式４－１～式４－９、式６－１～式６－９、あるいは式７－１～式７－９である場合に、式１１が、式１２－１～式１２－１２であってもよい。本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、式４－１～式４－９のいずれか１つの構造および式１２－１～式１２－１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体、式６－１～式６－９のいずれか１つの構造および式１２－１～式１２－１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体、式７－１～式７－９のいずれか１つの構造および式１２－１～式１２－１２のいずれか１つの構造を併せて持つ核酸複合体であることがより好適である。
　本発明の核酸複合体は、いずれかの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位した場合に、製薬上許容し得る陰イオンと塩を形成していてもよい。
　本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
　本発明の核酸複合体の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法］等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　式１で表される核酸重合体は、固相合成によっても合成することができる。
　式１で表される核酸重合体は、核酸複合体として公知のリンカー構造の合成方法を参考にして合成することができる。
　式１で表される核酸複合体における、Ｓ１をリンカーとしたＬ１－ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２－ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式２で表される核酸複合体を例として説明する。
　式２で表される核酸複合体におけるＬ１－ベンゼン環ユニットやＬ２－ベンゼン環ユニットは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２により連結している。
　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２の－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－または－ＣＯ－ＮＨ－結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））等に記載の結合反応の方法を参考にして、式２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
　また、ベンゼン環から順次、Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｂ１を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ１－ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
　Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ１およびＢ１を部分構造として有するＬ１－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　Ｌ２－ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Ｑ３を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ２－ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
　Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ３およびＢ２を部分構造として有するＬ２－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ２－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｑ３を部分構造として有する化合物としては、炭素数１～１０のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
　Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物としては、下記式２－１で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000150
 　Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物の具体例としては、グリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、Ｔｒｉｓ、イミノ二酢酸、２－アミノ－１，３－プロパンジオール等が挙げられ、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸が好ましい。
　Ｌ１、Ｑ２およびＢ１を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ１とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
　Ｌ２、Ｑ４およびＢ２を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ３とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ２－ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
　本発明においては、［Ｌ１－Ｔ１－（Ｑ２－Ｐ３）ｑ２－］ｐ１－Ｂ１－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－Ｐ１－である部分構造と、［Ｌ２－Ｔ２－（Ｑ３－Ｐ６）ｑ４－］ｐ２－Ｂ２－（Ｐ５－Ｑ３）ｑ３－Ｐ２－である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
　糖リガンドのＬ１－Ｔ１－Ｑ２に相当するユニットとして、例えば、Ｌ３－Ｔ１－Ｑ２－ＣＯＯＨ、Ｌ３－Ｔ１－（Ｑ２－Ｐ３）ｑ２－１－Ｑ２－ＮＨ２等が挙げられる。具体的には、Ｌ３－Ｏ―炭素数１～１２のアルキレン―ＣＯＯＨや、Ｌ３－炭素数１～１２のアルキレン－ＣＯ－ＮＨ－炭素数２～１２のアルキレン－ＮＨ２等が挙げられる。
　Ｌ３は、脱保護することにより、Ｌ１となる糖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ａｃ基が好ましい。
　Ｓ１をリンカーとしたＬ１－ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２－ベンゼン環ユニットの合成は、具体的には実施例に記載の方法を参考にして、アルキレン鎖の炭素数を適宜増減し、また、末端アミノ基や末端カルボキシル基を、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－または－ＣＯ－ＮＨ－結合を形成し得る基に変換した化合物を用いることにより、合成することができる。また、Ｌ１の糖リガンドについても、実施例においては、マンノースまたはＮ－アセチルガラクトサミンを例示しているが、他の糖リガンドに変更して実施することができる。
　式１で表される核酸複合体における、Ｓ３をリンカーとしたＸ－ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式１１で表される核酸複合体を例として説明する。
　式１１で表される核酸複合体におけるＸ－ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、Ｐ７およびＰ８により表される結合を有する。
　Ｐ７およびＰ８の－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－または－ＣＯ－ＮＨ－結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））に記載の結合反応の方法を参考にして、式１１で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
　また、ベンゼン環から順次、Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｂ３を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｘ－ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
　ＸとＱ７を部分構造として有する化合物や、ＸとＱ６を部分構造として有する化合物を別途合成し、ＸとＱ７を部分構造として有する化合物やＸとＱ６を部分構造として有する化合物をベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　具体的には、ベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｑ６を部分構造として有する化合物、Ｑ７を部分構造として有する化合物としては、炭素数１～１０のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
　Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造、Ｌ２－ベンゼン環ユニット構造と、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造とは、それぞれ順次製造していくことができるが、Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造およびＬ２－ベンゼン環ユニット構造を合成してから、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造を結合させることが好ましい。特に、オリゴヌクレオチド部分を有するＸについては、糖リガンド複合体合成の最終工程近くで化合物内に導入することが好ましい。
　本発明においては、下記式８～式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000151
 （式８中、
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、－ＣＯ－Ｒ４、または－ＣＯ－Ｂ４－［（Ｐ９－Ｑ８）ｑ７－Ｔ３－Ｌ３］ｐ３であり、
　Ｐ９およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ８は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ１は０～９９の整数であり、
　Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式８－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ７、ｍ８、ｍ９およびｍ１０は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
式８－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000152
 　ｐ３は、１、２または３の整数であり、
　ｑ７は、０～１０の整数であり、
　Ｌ３は、糖リガンドであり、
　Ｙは－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２－ＮＨ－であり、ｍ１１およびｍ１２は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　Ｒ３は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９－Ｂ５－（Ｑ１０－Ｐ１０）ｑ８－Ｘ１あり、ｎ２は０～９９の整数であり、
　Ｐ１０は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ９およびＱ１０は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３は０～９９の整数であり、
　Ｂ５は、下記式８－２で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９およびＱ１０との結合手を意味し、
式８－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000153
 　ｑ８は、０～１０の整数であり、
　Ｘ１は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ４は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　本発明においては、下記式９で表される化合物が合成中間体として得られる。
式９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000154
（式９中、
　Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、または－ＣＯ－Ｑ１１－（Ｐ１１－Ｑ１１’）ｑ９－Ｔ４－Ｌ４であり、
　Ｐ１１およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１１およびＱ１１’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ４－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ４は０～９９の整数であり、
　ｑ９は、０～１０の整数であり、
　Ｌ４は、糖リガンドであり、
　Ｙ’は－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１’－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２’－ＮＨ－であり、ｍ１１’およびｍ１２’は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　Ｒ３’は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２’－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９’－Ｂ５’－（Ｑ１０’－Ｐ１０’）ｑ８’－Ｘ１’であり、ｎ２’は０～９９の整数であり、
　Ｐ１０’は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ９’およびＱ１０’は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３’－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３’は０～９９の整数であり、
　Ｂ５’は、下記式９－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９’およびＱ１０’との結合手を意味し、
式９－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000155
 　ｑ８'は、０～１０の整数であり、
Ｘ１’は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ４’は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　本発明においては、下記式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式１０：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000156
 　式１０中、
　Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、－ＮＨ－Ｒ１０、または－ＮＨ－Ｑ１２－（Ｐ１２－Ｑ１２’）ｑ10－Ｔ４－Ｌ４であり、
　Ｐ１２およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１２およびＱ１２’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ2－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ2は０～９９の整数であり、
　Ｌ４は、糖リガンドであり、
　Ｙ２は－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ９－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１０－ＮＨ－であり、ｍ９、ｍ１０は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　ｑ１０は、０～１０の整数であり、
　Ｒ９は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ１０、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ６－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ１３－Ｂ６－（Ｑ１４－Ｐ１３）ｑ１１－Ｘ２であり、ｎ６は０～９９の整数であり、
　Ｐ１３は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１３およびＱ１４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ７－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ７は０～９９の整数であり、
　Ｂ６は、下記式１０－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ１３およびＱ１４との結合手を意味し、
式１０－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000157
 　ｑ１１は、０～１０の整数であり、
　Ｘ２は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ１０は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　以下、本発明に関連して、製造方法を一例として示す。なお、以下の製造方法１～製造方法１７に関する記載において、本発明の核酸誘導体等における式１～式１２で表される化合物とで、基を表す記号として同一の記号が用いられているものがあるが、両者は切り離して理解されるものであり、製造方法１～製造方法１２に対して記載される基の説明により、本発明が限定的に解釈されるものではない。また、本発明における核酸誘導体に関し、オリゴヌクレオチドを表すＸを、製造方法１～製造方法１７では、－Ｏ－Ｘとして記載する。
　　製造方法１
　本発明における核酸誘導体は、式（Ｉ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000158
 （式中、Ｐ１はＦｍｏｃ等の塩基により脱保護可能な保護基であり、ＤＭＴｒはｐ，ｐ’－ジメトキシトリチル基を表し、Ｒは糖リガンド-テザーユニットを表し、Ｒ’は、Ｒ中の糖リガンドの各水酸基がアセチル基等の塩基で脱保護可能な保護基で保護された基を表し、Ｐｏｌｙｍｅｒは固相担体を表し、Ｑ’は－ＣＯ－である。）
工程１
　化合物（Ｉ－Ｂ）は、化合物（Ｉ－Ａ）とｐ，ｐ’－ジメトキシトリチルクロリドを、ピリジン等の溶媒中、必要に応じて共溶媒の存在下、０℃と１００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　共溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
工程２
　化合物（Ｉ－Ｃ）は、化合物（Ｉ－Ｂ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１～１０００当量の２級アミン存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　２級アミンとしては、例えばジエチルアミン、ピペリジン等が挙げられる。
工程３
　化合物（１－Ｅ）は、化合物（Ｉ－Ｃ）と化合物（Ｉ－Ｄ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１～３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１～３０当量の添加剤の存在下、室温と２００　℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
　縮合剤としては、例えば１，３－ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム　ヘキサフルオロホスファート、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ヨウ化　２－クロロ－１－メチルピリジニウム等が挙げられる。
　添加剤としては、例えば１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
　化合物（Ｉ－Ｄ）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８，　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程４
　化合物（Ｉ－Ｆ）は、化合物（Ｉ－Ｅ）とコハク酸無水物を、溶媒中、１～３０当量の塩基存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、工程３で例示したものが挙げられる。
工程５
　化合物（Ｉ－Ｇ）は、化合物（Ｉ－Ｆ）と末端がアミノ化された固相担体とを、無溶媒でまたは溶媒中、１～３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１～３０当量の添加剤の存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応した後、無水酢酸／ピリジン溶液と室温と２００℃の間の温度で５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基、縮合剤および添加剤としては、それぞれ工程３で例示したものが挙げられる。
　アミノ化された固相担体としては、例えば長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ－ＣＰＧ）等　があげられ、これらは市販品として得ることができる。
工程６
　式（Ｉ’）で表される糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットを有する核酸複合体は、化合物（Ｉ－Ｇ）を用い、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法で対応するヌクレオチド鎖を伸長した後に、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことで製造することができる。
　公知のオリゴヌクレオチド化学合成法としては、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３５，　３２８７　（２００７）を参照）等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。
　固相からの脱離、脱保護は、オリゴヌクレオチド化学合成後、溶媒または無溶媒中、－８０　℃から２００　℃の間の温度で、１０秒間から７２時間塩基で処理することにより製造することができる。
　塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、炭酸カリウム等が挙げられる。
　溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ＴＨＦ等が挙げられる。
　オリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ１８逆相カラムあるいは陰イオン交換カラム、好ましくは前述２つの手法を組み合わせにより可能である。精製後の核酸複合体純度は、９０％以上、好ましくは９５％以上とするのが望ましい。
　また、上記工程３において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｉ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ－Ｑ’がＲ－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンである）、工程３において、化合物（Ｉ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Ｑ４’において、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法２
　本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000159
 （式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、およびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。ＴＢＤＭＳはｔ－ブチルジメチルシリル基、Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表す）
工程７
　化合物（ＩＩ－Ａ）は、化合物（Ｉ－Ａ）、ｔ－ブチルジメチルシリルクロリドおよびジメチルアミノピリジンをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中、好ましくは２等量の塩基の存在下、０℃～１００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。
工程８
　化合物（ＩＩ－Ｂ）は、化合物（ＩＩ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
工程９
　化合物（ＩＩ－Ｃ）は、化合物（ＩＩ－Ｂ）とフッ化ｎ－テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を、溶媒中、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
工程１０
　化合物（ＩＩ－Ｄ）は、化合物（ＩＩ－Ｃ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
工程１１
　化合物（ＩＩ－Ｅ）は、化合物（ＩＩ－Ｄ）および化合物（Ｉ－Ｄ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
工程１２～１４
　化合物（ＩＩ’）は、化合物（ＩＩ－Ｅ）を用い、製造方法１の工程４～工程６と同様の条件にて製造することができる。
　また、上記工程１１において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレン）、工程１１において、化合物（ＩＩ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程１１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法３
　本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000160
 （式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
　化合物（ＩＩＩ’）は、化合物（ＩＩＩ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造する事ができる。なお、化合物（ＩＩＩ－Ａ）は市販品として得ることができる。
工程１５
　化合物（ＩＩＩ－Ｂ）は、化合物（ＩＩＩ－Ａ）を用い、製造法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
　化合物（ＩＩＩ－Ａ）は市販品として購入することができる。
工程１６
　化合物（ＩＩＩ－Ｃ）は、化合物（ＩＩＩ－Ｂ）を用い、製造法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
工程１７
　化合物（ＩＩＩ－Ｅ）は、化合物（ＩＩＩ－Ｃ）を用い、製造法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
工程１８～２０
　化合物（ＩＩＩ’）は、化合物（ＩＩＩ－Ｅ）を用い、製造方法１の工程４～工程６と同様の条件にて製造することができる。
　また、上記工程１７において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩＩ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレン）、工程１７において、化合物（ＩＩＩ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程１７と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法４
　本発明における核酸誘導体は、式（ＩＶ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000161
 （式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
　化合物（ＩＶ’）は、化合物（ＩＶ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造する事ができる。なお、化合物（ＩＶ－Ａ）は市販品として得ることができる。
　また、上記工程２３において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＶ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ’－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンである）、工程２３において、化合物（ＩＶ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程２３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法５
　本発明における核酸誘導体は、式（Ｖ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000162
 （式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、ＴＢＤＭＳ、ＦｍｏｃおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。）
　化合物（Ｖ’）は、化合物（ＩＶ－Ａ）を用い、製造方法２の工程１から工程７と同様の条件にて製造する事ができる。なお、化合物（ＩＶ－Ａ）は市販品として得ることができる。
　また、上記工程３１において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｖ－Ｄ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ’－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンである）、工程３１において、化合物（Ｖ－Ｄ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程３１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑ－ＯＨの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法６
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000163
 （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
工程３５
　化合物（Ｉ－Ｈ）は、化合物（ＩＩ－Ｅ）と２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホジアミダイトを、無溶媒でまたは溶媒中、塩基および反応促進剤共存下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、製造方法１の工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。
　反応促進剤としては、例えば、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、５－エチルチオテトラゾール、５－ベンジルチオテトラゾール等があげられ、市販品として購入できる。
工程３６
　オリゴヌクレオチド鎖を伸長し、最後に化合物（Ｉ－Ｈ）を用い、オリゴヌクレオチドの５’末端を糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットで修飾した後、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことにより、化合物(I’’)を製造することができる。ここで、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製は、それぞれ製造方法１の工程７と同様にして製造できる。
　　製造方法７
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000164
 （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法８
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000165
 （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法９
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000166
 （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法１０
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000167
 （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法１１
　二本鎖核酸を構成するセンス鎖の３末端’または５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットを有するセンス鎖と、二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖とを、水または適当な緩衝液にそれぞれ溶解し、混合することにより二本鎖核酸を有する核酸複合体を得ることができる。
　緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
　センス鎖とアンチセンス鎖の混合比としては、センス鎖１当量に対してアンチセンス鎖が０．５～２当量が好ましく、０．９～１．１当量がより好ましく、０．９５当量～１．０５当量がさらに好ましい。
　また、該センス鎖と該アンチセンス鎖を混合後、適宜アニーリング処理を行ってもよい。アニーリング処理は、センス鎖とアンチセンス鎖の混合物を、好ましくは５０～１００℃、より好ましくは６０～１００℃、さらに好ましくは８０～１００℃に加熱した後に、室温まで徐冷することにより行うことができる。
　アンチセンス鎖は、上記の公知オリゴヌクレオチド合成法に準じて得ることができる。
　　製造方法１２
　本発明における核酸誘導体は、式（ＶＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示する事ができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000168
 (式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、Ｐｏｌｙｍｅｒ、ＴＢＳおよびＦｍｏｃは前記と同義であり、Ｒ０およびＲｘは、同一または異なって、水素原子、Ｃ１～Ｃ１０のアルキレンまたはＣ３－Ｃ８のシクロアルキレンを表し、ＷはＣ１～Ｃ１０のアルキレン、Ｃ３－Ｃ８のシクロアルキレンであるか、Ｒ０と一緒になって、Ｃ４－Ｃ８の含窒素複素環を形成してもよい。)
工程４５
　化合物（ＶＩ－Ｂ）は化合物（ＶＩ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造する事ができる。
　化合物（ＶＩ－Ａ）は市販品として、または公知の方法（例えばバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ，第１１巻，３８３－３８６頁）もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
工程４６
　化合物（ＶＩ－Ｃ）は化合物（ＶＩ－Ｂ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造する事ができる。
工程４７
　化合物（ＶＩ－Ｄ）は化合物（ＶＩ－Ｃ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造する事ができる。
工程４８
　化合物（ＶＩ－Ｅ）は化合物（ＶＩ－Ｄ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造する事ができる。
工程４９
　化合物（ＶＩ－Ｇ）は化合物（ＶＩ－Ｅ）と化合物（ＶＩ－Ｆ）とを用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造する事ができる。
工程５０
　化合物（ＶＩ－Ｈ）は化合物（ＶＩ－Ｇ）を用い、製造方法２の工程９と同様の条件にて製造する事ができる。
工程５１～５３
　化合物（ＶＩ’）は化合物（ＶＩ－Ｈ）、化合物（ＶＩ－Ｉ）および化合物（ＶＩ－Ｊ）を用い、製造方法１の工程４～６と同様の条件にて製造する事ができる。
　工程４５～５３は公知の方法（例えば国際公開第２０１５／１０５０８３号記載の方法）、またはそれに準じた方法でも実施する事ができる。
　化合物（ＶＩ－Ｆ）は公知の方法（例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ），　１３６巻，　１６９５８貢，　２０１４年記載の方法）、またはそれに準じた方法で得る事ができる。
　　製造方法１３
　式２においてＰ１およびＰ４が－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｏ－ＣＯ－または－Ｓ－ＣＯ－である、糖リガンド－テザーーユニットは以下の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000169
 （式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｔ１、Ｔ２、L１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４はそれぞれ前記と同義であり、ｑ１’はｑ１より１小さい整数を表し、ｑ２’はｑ２より１小さい整数を表し、Ｐ１’およびＰ４’は、それぞれ独立して、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ‐ＮＨ‐または－ＣＯ－Ｓ－を表し、ＺはＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシまたはカルボン酸を表し、Ｂ１’およびＢ２’は下記式の構造体のいずれか１つを表し、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ５、ＰＧ６およびＰＧ７はそれぞれ適切な保護基を表す。）
式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000170
 ｍ１、ｍ２、ｍ３またはｍ４はそれぞれ独立して、０～１０の整数を表す。
工程５４
　化合物（ＶＩＩ－Ｃ）は、化合物（ＶＩＩ－Ａ）と化合物（ＶＩＩ－Ｂ）を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させる事により製造する事ができる。
　溶媒としては製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
　化合物（ＶＩＩ－Ａ）は市販品として得る事ができる。
工程５５
　化合物（ＶＩＩ－Ｄ）は化合物（ＶＩＩ－Ｃ）を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させる事により製造する事ができる。
　溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
工程５６
　化合物（ＶＩＩ－Ｆ）は化合物（ＶＩＩ－Ｄ）および化合物（ＶＩＩ－Ｅ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程５７
　化合物（ＶＩＩ－Ｈ）は化合物（ＶＩＩ－Ｆ）および化合物（ＶＩＩ－Ｇ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程５８
　化合物（ＶＩＩ－Ｊ）は化合物（ＶＩＩ－Ｈ）および化合物（ＶＩＩ－Ｉ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程５９
　化合物（ＶＩＩ－Ｌ）は化合物（ＶＩＩ－Ｊ）および化合物（ＶＩＩ－Ｋ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程６０
　化合物（ＶＩＩ－Ｎ）は化合物（ＶＩＩ－Ｌ）および化合物（ＶＩＩ－Ｍ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程６１～６３
　化合物（ＶＩＩ’）は化合物（ＶＩＩ－Ｏ）、化合物（ＶＩＩ－Ｐ）および化合物　（ＶＩＩ－Ｑ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程ＤＰ
　有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
　化合物（ＶＩＩ－Ｂ）、化合物（ＶＩＩ－Ｅ）、化合物（ＶＩＩ－Ｇ）、化合物（ＶＩＩ－Ｉ）、化合物（ＶＩＩ－Ｋ）、化合物（ＶＩＩ－Ｍ）、化合物（ＶＩＩ－Ｏ）、化合物（ＶＩＩ－Ｐ）および化合物（ＶＩＩ－Ｑ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
　　製造方法１４
　式４においてＰ７が－Ｏ－である、ユニットは以下の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000171
 （式中、Ｑ５、Ｑ６、Ｐ８、ｑ５はそれぞれ前記と同義であり、Ｚ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ２またはＳＨを表し、ＰＧ９およびＰＧ１０はそれぞれ適切な保護基を表し、ＬＣは糖リガンド－テザーユニットを表し、Ｅはカルボン酸またはマレイミドを表す。）
工程６４
　化合物（ＶＩＩＩ－Ｃ）は化合物（ＶＩＩＩ－Ａ）および化合物（ＶＩＩＩ－Ｂ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
　化合物（ＶＩＩＩ－Ｂ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
工程６５
　化合物（ＶＩＩＩ’）は化合物（ＶＩＩＩ－Ｃ）および化合物（ＶＩＩＩ－Ｄ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
　化合物（ＶＩＩＩ－Ｄ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
工程ＤＰ
　有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
　　製造方法１５
　式２においてＰ１およびＰ４が－Ｏ－である、糖リガンド－テザーユニットは以下の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000172
 （式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｌ１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、Ｚ、Ｂ１’またはＢ２’はそれぞれ前記と同義であり、ｑ１’はｑ１より１小さい整数を表し、ｑ２’はｑ２より１小さい整数を表し、ＰＧ８、ＰＧ９、ＰＧ１０、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３およびＰＧ１４はそれぞれ適切な保護基を表す）
式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000173
 　ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は前記と同義である。
工程６６
　化合物（ＩＸ－Ｃ）は化合物（ＩＸ－Ａ）と化合物（ＩＸ－Ｂ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温～２００℃にて５分間～１００時間反応させる事により製造する事ができる。
　溶媒としては、製造工程１の工程２に例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
工程６７
　化合物（ＩＸ－Ｅ）は化合物化合物（ＩＸ－Ｃ）と化合物（ＩＸ－Ｄ）をＮ，　Ｎ’－ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温～２００℃で５分間～１００時間反応させる事により製造する事ができる。
　溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
　化合物（ＩＸ－Ａ）は市販品として得る事ができる。
工程６８
　化合物（ＩＸ－Ｇ）は化合物（ＩＸ－Ｅ）および化合物（ＩＸ－Ｆ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程６９
　化合物（ＩＸ－Ｉ）は化合物（ＩＸ－Ｇ）および化合物（ＩＸ－Ｈ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程７０
　化合物（ＩＸ－Ｋ）は化合物（ＩＸ－Ｉ）および化合物（ＩＸ－Ｊ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程７１
　化合物（ＩＸ－Ｍ）は化合物（ＩＸ－Ｋ）および化合物（ＩＸ－Ｌ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程７２－７４
　化合物（ＩＸ’）は化合物（ＩＸ－Ｍ）、化合物（ＩＸ－Ｎ）、化合物（ＩＸ－Ｏ）および化合物（ＩＸ－Ｐ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造する事ができる。
工程ＤＰ
　有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
　化合物（ＩＸ’－Ｂ）、化合物（ＩＸ’－Ｄ）、化合物（ＩＸ’－Ｆ）、化合物（ＩＸ’－Ｈ）、化合物（ＩＸ’－Ｊ）、化合物（ＩＸ’－Ｌ）、化合物（ＩＸ’－Ｎ）、化合物（ＩＸ’－Ｏ）および化合物（ＩＸ’－Ｐ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
　　製造方法１６
　式１～式７の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いる事ができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000174
 （式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｐ８、Ｑ６、は前記と同義であり、Ｘ１－ＳＨはＳＨで置換されたＣ１～Ｃ１０アルキル基を含む構造を末端に有するオリゴヌクレオチドを表す）
工程７５
　化合物（Ｘ－Ｂ）は化合物（ＶＩＩＩ’’）と化合物（Ｘ－Ａ）を溶媒中、０℃～１００℃で１０秒間～１００時間反応させる事により製造する事ができる。
　溶媒としては水、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　化合物（ＶＩＩＩ’）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
　化合物（Ｘ－Ｂ）は公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２１巻，　１８７－２０２頁，　２０１０年、またはカレント・プロトコールズ・イン・ヌクレイック・アシッド・ケミストリー　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　２０１０年，　９月；　ＣＨＡＰＴＥＲ：　Ｕｎｉｔ　４．４１）もしくはそれに準じた方法で得る事もできる。
工程７６
　化合物（Ｘ’）は化合物（Ｘ－Ｂ）を用いて炭酸ナトリウム水溶液またはアンモニア水中等ｐＨ８以上の条件下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させる事により製造する事ができる。
　　製造方法１７
　式１～式７の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いる事ができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000175
 （式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｐ８、Ｑ６、は前記と同義であり、Ｘ２－ＮＨ２はＮＨ２で置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル基を含む構造を末端に有するオリゴヌクレオチドを表す）
工程７７
　化合物（ＸＩ－Ａ）は化合物（ＶＩＩＩ’’’）を用いて、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２６巻，　１４５１－１４５５頁，　２０１５年に記載の方法）またはそれに準じた方法で得る事ができる。
　化合物（ＶＩＩＩ’’’）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
工程７８
　化合物（ＸＩ’）は化合物（ＸＩ－Ｂ）を用いて、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２６巻，　１４５１－１４５５頁，　２０１５年に記載の方法）またははそれに準じた方法で得る事ができる。
工程７９
　また別の方法として、化合物（ＸＩ’）は、公知の方法（例えばバイオコンジュゲートケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２２巻，１７２３－１７２８頁，　２０１１年を参照）あるいははそれに準じた方法で、化合物（ＸＩ－Ａ）から直接得る事ができる。
　本明細書における核酸複合体は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
　酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
　本明細書の核酸複合体の塩を調製したい場合には、該複合体が所望の塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、該複合体を適当な溶媒に溶解または懸濁し、対応する酸または塩基を加え、単離・精製すればよい。また、該複合体塩を形成する対イオンを異なる対イオンに変換する際には、該複合体塩を適当な溶媒に溶解または懸濁した後、酸、塩基および／または塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の無機塩等）を数当量～大過剰量加えて単離、精製すればよい。
　本明細書の核酸複合体の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、全ての可能な異性体およびそれらの混合物も本発明に包含される。
　また、本明細書の核酸複合体は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもああり、これらの付加物も本発明に包含される。
　さらに、本発明の核酸複合体は、分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）（例えば、重水素原子等）で置換されたものも包含される。
　本発明の医薬組成物は、式１で表される核酸複合体を含む。本発明の核酸複合体は、Ｌ１およびＬ２の糖リガンドを有することにより、標的細胞に認識され、細胞内に導入される。
　本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
　本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。
　投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖のオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg～1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1～100 mgとなるように投与することがより好ましい。
　静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、調製した液剤をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該液剤から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該液剤を凍結乾燥して使用する、および/または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた液剤を凍結乾燥して使用することもできる。
　注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
　次に、参考例、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。また、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとはbroadを意味し、見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
　UPLC分析は以下の条件を用いた。
移動相A：　0.1%ギ酸含有水溶液、B;　アセトニトリル溶液
グラジエント：　移動相Bが10%-90%のリニアグラジエント（3分間）
カラム：　Waters社製ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm、内経 2.1 x 50 mm)
流速：　0.8 mL/min
PDA検出波長：　254 nm (検出範囲190-800 nm)
参考例1　糖リガンドユニットの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000176
化合物2の合成
工程１
　ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物1 (0.8755 g, 1.9567 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、1, 3－ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC, 0.4247 g, 2.0584 mmol)とN-ヒドロキシスクシミド (0.2412 g, 2.0958 mmol)を室温にて一晩撹拌した。反応混合物から析出した固体を除き、減圧下、溶媒を留去した。得られた混合物をN, N’-ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解し、2-アミノエチルマレイミド臭酸塩 (0.6479 g, 2.5491 mmol)とジイソプロピルエチルアミン (1.7 mL, 9.7835 mmol)を加えた後、室温で一晩撹拌した。減圧下、反応液の溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物2 (0.8502 g, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.45-1.56 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.97 (2H, t, J= 7.0 Hz), 2.00 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.18-3.19 (2H, m), 3.38-3.45 (3H, m), 3.64-3.71 (1H, m), 3.85-3.89 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.48 (1H, d, J= 8.6 Hz), 4.95-4.98 (1H, m), 5.21 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.81-7.87 (2H, m).
化合物4の合成
工程2
　工程1に記載の化合物1 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン （シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物3の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
工程3
　工程2で合成した化合物3 (1.2654 g, 2.1460 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物4 (0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).
参考例2　ブランチャーユニットの合成
化合物７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000177
工程4
　(9H-フルオレン-9-イル)メチル((2R,3R)-1,3-ジヒドロキシブタン-2-イル)カルバマート (化合物5, Chem-Impex International, Inc社製, 1.50 g, 4.58 mmol)をピリジン (20 mL)に溶解し、氷冷下、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド (東京化成工業社製, 1.71 g, 5.04 mmol)を加えた後、室温にて2時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物6 (1.07 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 630 (M + H)+
工程5
　工程4で合成した化合物6 (1.07 g, 1.699 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてピペリジン (0.336 mL, 3.40 mmol)を加えて3時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物7 (0.59 g, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 408 (M + H)+
実施例1　テザーユニットの合成1
化合物16の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000178
工程6
　5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル(化合物8, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン (和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール (東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol）、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体 （シグマアルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol）を加えた後、氷冷下、40％ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5～80/20)で精製することにより、化合物9 (5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出
工程7
　工程6で合成した化合物9 (5.3071 g, 15.02 mmol)をメタノール (25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液 (和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物10を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-
工程8
　工程7で合成した化合物10 (1.9296 g, 5.93 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (70 mL)に溶解し、N-1-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル)-エチレンジアミン塩酸塩 (3.3493 g, 11.86mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (5.18 mL, 29.7 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (4.5168 g,  11.88 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物11 (3.4407 g, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 898 (M + HCOO)-
工程9
　工程8で合成した化合物11 (1.6087 g, 1.884 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5mL, 64.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物12 (2.4079 g)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 798(M + HCOO)-
工程10
　工程9で合成した化合物12 (386 mg, 0.512 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (175 mg, 1.024mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物13 (373 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 888(M + H)+
工程11
　工程10で合成した化合物13 (108 mg, 0.122 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (0.5 mL,4.8 mmol)を加えて1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物14 (54.9 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 444(M + H)+
工程12
　工程11で合成した化合物14 (180 mg, 0.406 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 295 mg, 0.852 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.354 mL,2.029 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (324 mg, 0.852 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物15 (450 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1101(M + H)+
工程13
　工程12で合成した化合物15 (2.1558 g, 1.9593 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5 mL)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物16を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 700(M + H)+
実施例2　テザーユニットの合成2
化合物20の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000179
工程14
　工程9で合成した化合物12 (0.5716 g, 0.7582 mmol)、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690-699頁, 2011年に記載された方法で合成したドデカン酸モノベンジルエステル (0.4859 mg, 1.5164 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.662 mL, 3.79 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5766 g, 1.516 mmol)をN,Nジメチルホルムアミド(12 mL)に溶解し、室温にて1時間攪拌した。反応液を氷冷し、飽和クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物17 (0.88 g, 収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 1057(M + H)+
工程15
　工程14で合成した化合物17 (0.7545 g, 0.714 mmol)をジクロロメタンテトラヒドロフラン(20 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (5 mL,47.9 mmol)を加えて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物18を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 612(M + H)+
工程16
　工程15で合成した化合物18 (0.437 g, 0.7143 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 0.5483 g, 1.583 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.624 mL, 3.57 mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5703 g, 1.5 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物19の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1269(M + H)+
工程17
　工程16で合成した化合物19 (0.906 g, 0.7143 mmol)をジクロロメタン (12 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (3mL, 38.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物20の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 869(M + H)+
実施例3　テザーユニットの合成3
化合物23の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000180
工程18
　工程12で合成した化合物15 (100 mg, 0.091 mmol)をメタノール (3 mL)に溶解し、酢酸 (2 μL)を添加した後、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物21を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 967 (M + H)+
工程19
　工程18で合成した化合物21 (50 mg, 0.052 mmol)およびN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (48 mg, 0.155 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.045 mL, 0.259  mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物22 (18 mg, 収率30%)を得た。
ESI-MS m/z: 1160 (M + H)+
工程20
　工程19で合成した化合物22 (18 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (0.2 mL, 2.6 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、ジエチルエーテルにて晶析した後、化合物23 (7.5 mg, 収率64%)を白色固体として得た。
ESI-MS m/z: 759 (M + H)+
実施例4　テザーユニットの合成4
化合物29の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000181
工程21
　工程7で合成した化合物10 (0.9372 g, 2.8809 mmol)、β-アラニンメチルエステル塩酸塩 (東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物24を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 495 (M + H)+
工程22
　工程21で合成した化合物24 (0.9622 g, 1.952 mmol)を用い、実施例1の工程9と同様の方法で化合物25を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+
工程23
　工程22で合成した化合物25 (0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS， 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)を用い、実施例3の工程19と同様の方法で化合物26を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+
工程24
　工程23で合成した化合物26 (0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物27を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+
工程25
　工程24で合成した化合物27 (0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル  (渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物28 (0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+
工程26
　工程25で合成した化合物28 (0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い 、実施例1の工程9と同様の方法で化合物29 (36 mg, 収率86%)を得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+
実施例5　糖リガンド－ベンゼン環ユニットの合成1
化合物31の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000182
工程27
　工程13で合成した化合物16 (0.2586 g, 0.3695 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物1 (0.8559 g, 1.7927 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物30 (0.5272 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2418 (M + H)+
工程28
　工程27で合成した化合物30 (0.2653 g, 0.1097 mmol)を用い、実施例3の工程21と同様の方法で化合物31 (0.1524 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2284 (M + H)+
実施例6　糖リガンド－テザーユニットの合成2
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000183
化合物32の合成
工程29
　工程28で合成した化合物31 (0.0152 g, 0.006657 mmol)を用い、実施例3の工程19と同様の方法で化合物32 (0.0077 g, 収率47%)を得た。
ESI-MS m/z: 1239(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (34H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (10H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (14H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
化合物33の合成
工程30
　工程28で合成した化合物31 (0.0150 g, 0.00657 mmol)を用い、実施例4の工程23と同様の方法で化合物33 (0.0062 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 1279(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (30H, m), 1.77 (12H, s), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (8H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.33-2.38 (2H, m), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.58-3.63 (16H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
実施例7　糖リガンド－テザーユニットの合成3
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000184
化合物34の合成
工程31
　工程24で合成した化合物27 (0.00436 g, 0.00681 mmol)および参考例1の工程3で合成した化合物4 (0.010 g, 0.020 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物34の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1584(M + H)+
化合物35の合成
工程32
　工程26で合成した化合物29 (0.0100 g, 0.01112 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物35 (0.0223 g, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 1393(M + 2H)2+
実施例8　糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットの合成
化合物40の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000185
工程33
　工程17で合成した化合物20 (0.1952 g, 0.225 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁、2014年に記載された方法で合成した化合物1(0.4162 g, 0.93 mmol)を用い、実施例１の工程8と同様の方法で化合物36 (334.8 mg, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 1294 (M + 2H)2+
工程34
　工程33で合成した化合物36 (0.1459 g, 0.056 mmol)を用い、実施例3の工程18と同様の方法で化合物37 (112 mg, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 1249 (M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (44H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.20 (12H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (10H, m), 3.58-3.64 (4H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
工程35
　工程34で合成した化合物37 (0.1091 g, 0.044 mmol)および参考例2の工程5で製造した化合物7 (0.0748 g, 0.184 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物38を粗生成物として得た。
ESI-MS m/z: 1292 (M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
工程36
　工程35で合成した化合物38 (0.161 g, 0.05586 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、コハク酸無水物 (東京化成工業社製, 0.1182 g, 1.181 mmol）、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0224 g,0.183 mmol)、およびトリエチルアミン(0.55 mL, 3.95 mmol)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液を氷冷し、水を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物39の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1342(M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
工程37
　工程36で合成した化合物39 (0.0816 g, 0.02734 mmol)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (0.0221 g, 0.05827 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（0.02 mL, 0.1094 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド(4 mL)に溶解し、LCAA-CPG (Chem Gene社製, 0.4882 g)を加え、室温にて終夜攪拌した。混合物を濾別し、ジクロロメタン、10%メタノールジクロロメタン溶液、およびジエチルエーテルで順次洗浄した後、無水酢酸/ピリジン溶液と作用させることにより、化合物40 （49.5 μmol/g, 収率89%）を得た。なお、収率は1%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液を固相担持体に添加し、DMTr基に由来する吸収から計算できる固相担体への導入率より算出した。
実施例9　核酸複合体の合成1
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000186
核酸複合体41の合成
工程38
　工程29で合成した化合物32と、モレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825-13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端がメルカプト基で修飾されたオリゴヌクレオチドを加えて、室温にて4時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー (GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液： 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1 mol/L NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1 mol/L酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製することにより、オリゴヌクレオチドが異なる3種類の1本鎖の核酸複合体41を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第1表に示す。
第1表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000187
　表中、nはDNAを、N(M)は2’-O-メチル修飾RNAを、N(F)は2’-フッ素修飾RNAを、N(L)はLNAを、5(L)はLNAmCを、^はホスホロチオエート修飾を、ssはセンス鎖を、asはアンチセンス鎖を、下線が付いた番号は実施例中の化合物番号に相当する修飾基をそれぞれ示す。以下、各表において同様である。
核酸複合体42の合成
工程39
　工程38で合成した1本鎖の核酸複合体41_3’-AT3-ssRNAは、混合緩衝液（100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム）にて濃度調整（50 μmol/L）した。前述センス鎖とアンチセンス鎖（50 μmol/L）を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。アンチセンス鎖配列は、第2表に記載されている通りである。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖の核酸複合体42を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列を第2表に示す。
第2表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000188
実施例10　核酸複合体の合成2
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000189
核酸複合体43の合成
工程40
　工程32で合成した化合物35とエーシーエス・ナノ(ACS Nano), 第9巻, 9652-9664頁, 2015年に記載された方法で合成したオリゴヌクレオチドを用い、実施例9の工程38と同様の反応条件、手順にて1本鎖の核酸複合体43を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第3表に示す。
第3表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000190
核酸複合体44の合成
工程41
　実施例9の工程39と同様の方法で2本鎖の核酸複合体44を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列を第4表に示す。
第4表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000191
実施例11　核酸複合体の合成3
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000192
核酸複合体45の合成
工程42
　工程20で合成した化合物23 (648 nmol)とモレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825-13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端がメルカプト基で修飾されたオリゴヌクレオチド (216 nmol)を用い、実施例9の工程38と同様の方法で核酸複合体45を得た。
核酸複合体46の合成
工程43
　工程42で合成した化合物45 (100 nmol)にN-スクシイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(6.3 mg, 20 μmol)のジメチルスルホキシド溶液を加え、リン酸緩衝液中で室温、4時間静置した。反応溶液にジチオトレイトール (15.4 mg, 100 μmol)を添加し、室温で一晩静置した。混合物をゲルろ過処理 （Napカラム、GE ヘルスケア社製、溶出溶媒：　20 mmol/L 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ５．０)）および限外濾過を行うことで核酸複合体46を得た。
核酸複合体47の合成
工程44
　工程43で合成した化合物46と参考例1の工程1で合成した化合物2を用い、実施例9の工程38と同様の方法で1本鎖の核酸複合体47を得た。
核酸複合体48の合成
工程45
　工程43で合成した化合物46とバイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第14巻, 232-238頁, 2003年に記載された方法で合成したマンノースマレイミド付加体を用い、実施例9の工程38と同様の方法で1本鎖の核酸複合体48を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第5表に示す。
第5表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000193
実施例12　核酸複合体の合成4
核酸複合体49の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000194
工程46
　アンチセンス鎖の3’末端にGalNAc基を有する、オリゴヌクレオチド複合体の合成 （それぞれG-CH1179-s、G-CH0099-s、およびG-CH1180-sと呼ぶ）を、核酸合成装置 (ウルトラ　ファスト　パラレル　シンセサイザー（Ultra Fast Parallel Syntheizer）、シグマ社製、以下UFPS)を用いて、0.2μmolスケールで行った。固相担体には、工程37で合成した化合物40を用いた。ジメトキシトリチルdTホスホアミダイト （SAFC-PROLIGO社)はアセトニトリルにて0.06 mol/Lに調整した。ホスホロアミダイトのアクチベーターとして5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール (SAFC-PROLIGO社)、および0.06 mol/L dTホスホアミダイトのアセトニトリル溶液を用いて、時間は各10分間とし縮合反応を行った。反応後、28%アンモニア溶液に浸し、55 ℃で4時間放置した。減圧下濃縮し、1-ブタノールを加えて反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー (資生堂, CAPSELL PAK C18, SG300, 6.0 mm x 75 mm, 5%アセトニトリル/0.1%酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:50%アセトニトリル/水によるグラジエント)を用いて精製することにより、1本鎖の核酸複合体49を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第6表に示す。
第6表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000195
　比較例1　核酸複合体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000196
核酸複合体52の合成
工程47
　ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物50 (0.0796 g, 0.044 mmol)を用い、実施例6の工程29と同様の方法で化合物51 (0.014 g, 収率19%)を得た。
ESI-MS m/z: 994 (M + 2H)2+
工程48
　工程47で合成した化合物51を用い、実施例9の工程38と同様の方法で、オリゴヌクレオチドが異なる3種類の1本鎖の核酸複合体52を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第7表に示した。
第7表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000197
核酸複合体53の合成
工程49
　工程48で合成した化合物52_3’-AT3-ssRNAを用い、実施例9の工程39と同様の方法で2本鎖の核酸複合体53を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列を第8表に示す。
第8表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000198
比較例2　核酸複合体の合成
核酸複合体54の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000199
 　ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で、ApoBASO（第1表を参照）を有する1本鎖の核酸複合体54を得た。
試験例1　核酸複合体のマウス初代肝細胞に対するin vitro活性
　実施例9、比較例1および比較例2で合成した各核酸複合体のうち、ApoBASO(被検物1)、核酸複合体54(被検物2)、52_3’-ApoBASO(被検物3)、52_5’-ApoBASO(被検物4)、41_3’-ApoBASO(被検物5)、41_5’-ApoBASO(被検物6)について、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞 (ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
　最終濃度が30, 10または3 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント （Primary Hepatocyte Maintenance Supplements） (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
　各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。
　得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Apolipoprotein B (別名Apolipoprotein-B100/Apolipoprotein-B48、以下apobと表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apobのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるapobのmRNAの準定量値を1として、apobのmRNAの準定量値から、apobのmRNAの発現率を求めた。得られたapobのmRNAの発現率の結果を、陰性対照のapob mRNA発現率に対する抑制率として第9表および第10表に示す。なお、各表は、それぞれ独立した試験の結果を示している。
第9表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000200
第10表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000201
　第9表および第10表から明らかなように、本発明の核酸複合体は、マウス初代肝細胞に導入後のapob遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
試験例2　核酸複合体のマウスにおけるin vivo活性
　実施例9、比較例1及び比較例2で合成した各核酸複合体のうち、ApoBASO(被検物1)、核酸複合体54 (被検物2)、52_3’-ApoBASO(被検物3)、52_5’-ApoBASO(被検物4)、41_3’-ApoBASO(被検物5)、41_5’-ApoBASO(被検物6)について、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水 (DPBS) (ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス (BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を0.75 mg/kgまたは0.25 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはDPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後に浅側頭静脈より血清を採取した。その後に動物を安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール (登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット (キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。
　得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、apob遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apobのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したコントロール群におけるapobのmRNAの準定量値を1として、apobのmRNAの準定量値から、apobのmRNAの発現率を求めた。また、血清中の総コレステロール濃度を、ラボアッセイコレステロール (和光純薬工業社製、カタログ番号294-65801)を用い添付された使用説明書に記載された方法に従って測定した。得られたapobのmRNAの発現抑制率および血清中総コレステロール濃度を第11表および第12表に示す。
第11表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000202
第12表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000203
　第11表および第12表から明らかなように、本発明の核酸複合体（被検物5および6）は、生体内において、apob遺伝子の発現を低下させ、血中の総コレステロール濃度を減少させた。
試験例3　核酸複合体のマウス初代肝細胞に対するin vitro活性
　実施例9および比較例1で得られた各核酸複合体のうち、53_3’-AT3-siRNA(被検物7)、42_3’-AT3-siRNA(被検物8)について、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞 (ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
　最終濃度が300, 100または30 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント （Primary Hepatocyte Maintenance Supplements） (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
　各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
　得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Serpin peptidase inhibitor, clade C (antithrombin), member 1 (別名antithrombin III、以下AT3と表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。得られたAT3のmRNAの発現率の結果を、陰性対照のAT3 mRNA発現率に対する抑制率として第13表に示す。
第13表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000204
　第13表から明らかなように、本発明の核酸複合体（被検物8）は、マウス初代肝細胞に導入後のAT3遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
試験例4　核酸複合体のマウスにおけるin vivo活性
　実施例9および比較例1で得られた各核酸複合体のうち、53_3’-AT3-siRNA(被検物7)、42_3’-AT3-siRNA(被検物8)について、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス(BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を1.5 mg/kgまたは0.5 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後にイソフルラン麻酔下で後大静脈後部静脈より採血した。採血した血液を3.2 Mクエン酸ナトリウムおよび5 mmol/L D-グルコースを含む抗凝固液と体積比9:1で混合し、遠心後の上清を回収することで血漿を得た。動物は採血後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット(キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。
　得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、AT3遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、AT3のmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したコントロール群におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。また、血漿中のAT3タンパク質濃度を、アンチトロンビンスリーマウスエライザキット(アブカム社製、カタログ番号ab108800)を用い添付された使用説明書に記載された方法に従って測定した。得られたAT3のmRNAの発現抑制率および血漿中AT3タンパク質濃度を第14表に示す。
第14表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000205
　第14表から明らかなように、本発明の核酸複合体（被検物8）は、生体内において、AT3遺伝子の発現を低下させ、血中のAT3タンパク質濃度を減少させた。
参考例3　糖リガンドユニットの合成
化合物56の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000206
工程51
　化合物55（1.200 g, 3.640 mmol）から、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry）, 第59巻, 2718-2733頁, 2016年に記載された方法で化合物56（1.050 g, 収率50%）を合成した。
ESI-MS m/z: 582 (M + H)+
化合物57の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000207
工程52
　化合物55（4.000g, 10.27 mmol）をジクロロメタン（60 mL）に溶解し、ベンジル-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルカーバメイト（2.700 g, 11.30 mmol）、およびトリフルオロメタンスルホン酸（0.1360 mL, 1.541 mmol）を加えて、還流条件下で終夜攪拌した。反応液に10 wt% 炭酸カリウム水溶液を加え、ジクロロメタンと分液した後、有機相を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、2-メチルテトラヒドロフランへと置換濃縮した。残渣をへプタンに滴下し、得られた結晶をろ過することにより、化合物57（5.130 g, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+
化合物58の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000208
工程53
　工程1に記載の化合物1（898.0 mg, 2.007 mmol）をジクロロメタン（15 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（338.0 mg, 2.208 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（343 mg, 2.208 mmol）、およびN-1-Z-1, 3-ジアミノプロパン塩酸塩（0.4910 mL, 2.208 mmol）を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで分液した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=90/10）で精製することにより、化合物58（873.0 mg, 収率68%）を得た。
ESI-MS m/z: 639 (M + H)+
化合物60の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000209
工程54
　工程1に記載の化合物1 (3.00 g, 6.70 mmol)をジクロロメタン (60 mL)に溶解し、室温にてL-リジンベンジルエステル二p-トルエンスルホン酸塩 (1.75 g, 3.02 mmol)、トリエチルアミン(0.935 mL, 6.70 mmol), 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.29 g, 6.70 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (103 mg, 0.670 mmol)を加えて2.5時間撹拌した。反応液を水と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物59を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1096 (M + H)+
工程55
　工程54で合成した化合物59 (2.30 g, 2.10 mmol)をテトラヒドロフラン (46 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 424 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物60を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1006 (M + H)+
化合物62の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000210
工程56
　イミノ二酢酸 (東京化成工業社製, 1.5 g, 6.43 mmol,)を塩化メチレン(30 mL)に溶解し、ペンタフルオロトリフルオロ酢酸(東京化成工業社製, 2.75 mL, 16.08 mmol)、トリエチルアミン(4.48 mL, 32.2 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そこに、工程51で合成した化合物56(2 g, 3.45 mmol)を酢酸エチル(10 mL)とアセトニトリル(10 mL)との混合液に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液部分を減圧下、溶媒を留去する事により、化合物61の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1091(M+H)+
工程57
　工程56で合成した化合物61(1.5 g,1.37 mmol)を用い、参考例1の工程3と同様の方法で化合物62を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 990(M+H)+
化合物64の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000211
工程58
　N-(t-ブトキシカルボニル)-L-グルタミン酸 (東京化成工業社製)を用いて、工程51で合成した化合物56(1.855 g, 3.19 mmol)を用い、参考例3の工程56と同様の方法で化合物63の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 1105(M+H)+
工程59
　工程58で合成した化合物63(1.421 g, 1.2866 mmol)を用い、参考例1の工程3と同様の方法で化合物64を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1004(M+H)+
参考例4　ブランチャーユニットの合成
化合物66の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000212
工程60
　ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物65 (90 mg, 0.173 mmol) をテトラヒドロフラン (1 mL) に溶解し、トリフェニルホスフィン、ポリマー担持 (シグマアルドリッチ社製, 63 mg, 0.189 mmol) を加えて、加熱環流下3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物66 (70 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 516 (M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.89 (3H, s), 1.42-1.48 (2H, m), 1.52-1.61 (2H, m), 1.85 (1H, br s), 2.68 (2H, t, J= 7.2 Hz), 3.06-3.07 (2H, m), 3.39-3.44 (3H, m), 3.51-3.55 (3H, m), 3.78 (6H, s), 6.80-6.85 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.41-7.43 (2H, m).
化合物69の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000213
工程61
　化合物67 (東京化成工業社製, 0.500 g, 3.73 mmoL)を用いて参考例2の工程4と同様の方法で化合物68の粗生成物 (1.5 g) を得た。
ESI-MS m/z: 435 (M-H)-
工程62
　工程61で合成した化合物68の粗生成物(1.5 g) と1,4-Diaminobutane (東京化成工業社製, 3.29 g, 37.3 mmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物69 (0.18 g, 2 段階収率10%)を得た。
ESI-MS m/z: 551 (M+HCOO)-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.09 (3H, s), 1.45-1.52 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.91 (2H, s), 3.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.12-3.16 (4H, m), 3.24 (1H, s), 3.43 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.62-3.66 (7H, m), 6.71-6.76 (4H, m), 7.05-7.11 (1H, m), 7.12-7.20 (6H, m), 7.28-7.32 (2H, m).
化合物71の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000214
工程63
　ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物65 (110 mg, 0.212 mmol) をテトラヒドロフラン (2 mL) に溶解し、N-(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (東京化成工業社製, 72 mg, 0.222 mmol) を加えて、室温にて1時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物71 (160 mg, 収率90 %)を得た。ESI-MS m/z: 845 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.88 (3H, s), 0.91-1.09 (3H, m), 1.20-1.25 (1H, m), 1.52-1.59 (4H, m), 1.80-1.85 (2H, m), 2.19-2.25 (4H, m), 2.59-2.68 (1H, m), 2.84-2.90 (4H, m), 3.02-3.11 (3H, m), 3.35-3.44 (5H, m), 3.49-3.53 (5H, m), 3.54-3.58 (2H, m), 3.62 (5H, s), 3.78 (6H, s), 4.13 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.21 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.21 (1H, m), 7.24-7.27 (2H, m), 7.28-7.32 (4H, m), 7.39-7.44 (2H, m).
化合物75の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000215
工程64
　化合物72(AstaTech社製, 100 mg, 1.148 mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH (渡辺化学工業社製, 532 mg, 1.205 mmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物73(410 mg, 収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 511 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 0.06 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.76-2.85 (1H, m), 3.65-3.86 (5H, m), 4.02-4.23 (3H, m), 4.32-4.40 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J= 7.6 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.6 Hz).
工程65
　工程64で合成した化合物73(410 mg, 0.803 mmol)を用いて参考例2の工程4と同様の方法で化合物74の粗生成物(680 mg)を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M+H)+
工程66
　工程65で合成した化合物74の粗生成物(680 mg)を用いて参考例2の工程5と同様の方法で化合物75(330 mg, 2段階収率70％)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.02-0.09 (6H, m), 0.89 (9H, d, J = 28.8 Hz), 2.84-2.94 (1H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.46 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.52-3.68 (2H, m), 3.75-3.80 (1H, m), 3.82 (6H, d, J= 2.4 Hz), 3.89-3.96 (1H, m), 4.05-4.17 (1H, m), 4.27-4.37 (1H, m), 6.82-6.89 (4H, m), 7.22-7.27 (1H, m), 7.29-7.34 (6H, m), 7.41-7.45 (2H, m).
化合物78の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000216
工程67
　N-(Tert-ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノプロパン（東京化成工業社製，1.788 g, 10.26 mmol）をジクロロメタン（22.8 mL）に溶解し、トリエチルアミン（1.907 mL, 13.68 mmol)を加え、室温で15分撹拌した。反応液に、オーガニックレター（Organic Letter）, 第16巻, 6318-6321頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物76（1.126 g, 6.84 mmol）のジクロロメタン溶液（5 mL)を滴下し、室温で2時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル＝35/65）で精製することにより、化合物77（1.65 ｇ，収率80％）を得た。
ESI-MS m/z: 303 (M+H)+
工程68
　工程67で合成した化合物77(1.65 g, 5.46 mmol)を用いて参考例1の工程3と同様の方法で化合物78(1.10 g, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 203 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.74 (2H, dt, J = 12.0, 6.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.18 (1H, s), 3.60 (2H, td, J= 6.0, 5.2 Hz), 7.54 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.76 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.97 (1H, br s).
化合物82の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000217
工程69
　化合物79 (東京化成社製, 1.2 g, 4.24mmol)を用いて参考例2の工程4と同様の方法で化合物79の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 608(M+Na)+
工程70
　工程69で合成した化合物80の粗生成物を用いて参考例2の工程5もしくは実施例1の工程11に記載された方法で化合物81 (1.34 g, 2段階収率52%) を得た。
ESI-MS m/z: 386(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ3.34 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 6.78-6.84 (4H, m), 7.17-7.21 (1H, m), 7.27-7.35 (6H, m), 7.42-7.46 (2H, m).
工程71
　工程70で合成した化合物81(1.15 g,3.16  mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡辺化学工業社製, 1.677 g, 3.8  mmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物82(560 mg, 収率31%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.00-0.07 (6H, m), 0.83-0.89 (9H, m), 3.18-3.26 (2H, m), 3.39-3.46 (2H, m), 3.61-3.68 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.89 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.15-4.20 (1H, m), 4.22-4.28 (1H, m), 4.32-4.40 (2H, m), 5.65-5.88 (1H, m), 6.76-6.85 (4H, m), 7.16-7.23 (1H, m), 7.25-7.34 (8H, m), 7.36-7.44 (4H, m), 7.50-7.64 (2H, m), 7.72-7.79 (2H, m).
化合物88-94の合成
　第15表に記載された化合物およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH , Fmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、工程69～71と同様の方法により第16表に記載した化合物を得た。
　本実施例により合成した化合物のNMR分析データを第17表に示す。
第15表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000218
第16表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000219
第17表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000220
化合物95の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000221
工程72
　工程71で合成した化合物82(2.487 g, 3.16  mmol)を用いて参考例2の工程5と同様の方法で化合物95を得た(1.2 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 587(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ-0.01-0.07 (6H, m), 0.86-0.90 (9H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.41-3.48 (3H, m), 3.72 (1H, dd, J= 10.0, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.84 (1H, dd, J = 10.0, 4.8 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.40-7.44 (2H, m), 7.72-7.75 (1H, br m).
化合物96～102の合成
　第16表に記載した化合物を用いて工程72と同様の方法により第18表に記載した化合物を得た。
　本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第19表に示す。   
第18表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000222
第19表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000223
実施例13　テザーユニットの合成
化合物107の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000224
工程73
　化合物103 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にてイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (5.11 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製した。さらにメタノールでスラリー精製することにより、化合物104 (4.07 g, 収率65 %)を得た。
ESI-MS m/z: 664 (M - H)-
工程74
　工程73で合成した化合物104 (2.66 g, 4.00 mmol)をテトラヒドロフラン (53 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 490 mg)を加え、水素雰囲気下で3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物105 (2.86 g, 収率113%)を得た。
ESI-MS m/z: 634 (M - H)-
工程75
　工程74で合成した化合物105（871.0 mg, 1.370 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（17 mL）に溶解し、O-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イン)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（625.0 mg, 1.644 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（0.5730 mL, 3.290 mmol）、およびドデカン二酸モノベンジルエステル（527.0 mg, 1.644 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物106（1.030 g, 収率80%）を得た。
ESI-MS m/z: 939 (M + H)+
工程76
　工程75で合成した化合物106（1.030 g, 1.098 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物107の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 713 (M - H)-
化合物113の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000225
工程77
　化合物108（2.000 g, 12.98 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸水素カリウム（1.559 g, 15.57 mmol）および塩化ベンジル（2.328 mL, 19.47 mmol）を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=50/50）で精製することにより、化合物109（2.850 g, 収率90%）を得た。
ESI-MS m/z: 243 (M - H)-
工程78
　工程77で合成した化合物109（2.500 g, 10.24 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸カリウム（5.660 g, 40.90 mmol）およびtert-ブチルブロモ酢酸（3.300 mL, 22.52 mmol）を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=75/25）で精製することにより、化合物110（4.300 g, 収率89%）を得た。
ESI-MS m/z: 472 (M - H)-
工程79
　工程78で合成した化合物110（1.000 g, 2.116 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で6時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物111の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)-
工程80
　工程79で合成した化合物111（350.0 mg, 0.9710 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（7 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（327.0 mg, 2.137 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（410.0 mg, 2.137 mmol）、およびイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル（524.0 mg, 2.137 mmol）を加え、室温で5時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物112（617.0 mg, 収率78%）を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M - H)-
工程81
　工程80で合成した化合物112（610.0 mg, 0.7490 mmol）をジクロロメタン（6 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（6 mL, 78.00 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物113の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
化合物116の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000226
工程82
　工程74で合成した化合物114 (474 mg, 0.744 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 第54巻, 2433-2446頁, 2011年に記載された方法で合成したtrans-シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸モノベンジルエステル (0.234 mg, 0.893 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.312 mL, 1.79 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (339 mg, 0.893 mmol)を加えて6時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物115 (448 mg, 収率68 %)を得た。
ESI-MS m/z: 879 (M - H)-
工程83
　工程82で合成した化合物115 (341 mg, 0.387 mmol)をジクロロメタン (3.4 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.4 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸し、ヘプタンでスラリー精製することにより、化合物116 (254 mg, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 656 (M + H)+
化合物120の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000227
工程84
　化合物117 (500 mg, 2.75 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル (1.48 g, 6.04 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.16 g, 6.04 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (42.0 mg, 0.275 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物118 (329 mg, 収率19 %)を得た。
ESI-MS m/z: 635 (M - H)-
工程85
　工程84で合成した化合物118 (323 mg, 0.507 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて炭酸カリウム (84.0 mg, 0.609 mmol)、ブロモ酢酸ベンジル (139 mg, 0.609 mmol)を加えて3時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物119 (313 mg, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 783 (M - H)-
工程86
　工程85で合成した化合物119 (312 mg, 0.398 mmol)をジクロロメタン (3.1 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.1 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物120 (252 mg, 収率113%)を得た。
ESI-MS m/z: 561 (M + H)+
化合物125の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000228
工程87
　化合物103 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にて2-アミノ-1,3-プロパンジオール (1.90 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/メタノール=70/30)で精製した。さらに酢酸エチルでスラリー精製することにより、化合物121 (2.68 g, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 356 (M - H)-
工程88
　工程87で合成した化合物121 (500 mg, 1.40 mmol)をアセトニトリル (10 mL)に懸濁し、室温にてアクリル酸tert-ブチルエステル (3.59 g, 28.0 mmol)、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド (40%水溶液; 1.76 mL, 702 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物122 (300 mg, 収率24 %)を得た。
ESI-MS m/z: 871 (M + H)+
工程89
　工程88で合成した化合物122 (340 mg, 0391 mmol)をテトラヒドロフラン (6.8 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 31.3 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物123 (235 mg, 収率72 %)を得た。
ESI-MS m/z: 841 (M + H)+
工程90
　工程89で合成した化合物123 (232 mg, 0.276 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (4.6 mL)に溶解し、室温にてドデカン酸モノベンジルエステル (0.133 mg, 0.414 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.145 mL, 0.829 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (158 mg, 0.414 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物124 (274 mg, 収率87 %)を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M - H)-
工程91
　工程90で合成した化合物124 (273 mg, 0.239 mmol)をジクロロメタン (2.7 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (2.7 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物125 (231 mg, 収率105%)を得た。
ESI-MS m/z: 919 (M + H)+
化合物128の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000229
工程92
　4-ニトロイソフタル酸103 (500 mg, 2.37 mmol)およびN-Boc-エチレンジアミン (808 mg, 5.21 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.90 mL, 7.11 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（703 mg, 5.21 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.36 g, 7.11 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物126 (650 mg, 収率55 %)を得た。
工程93
　工程92で合成した化合物126 (500 mg, 1.01 mmol)および亜鉛末 (330 mg, 5.05 mmol)をメタノール (3.5 mL)およびテトラヒドロフラン (3.5 mL)に懸濁し、0℃にて塩化アンモニウム (378 mg, 7.07 mmol)の水溶液を滴下し、室温にて24時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物127 (160 mg, 収率34 %)を得た。
工程94
　工程93で合成した化合物127 (200 mg, 0.430 mmol)およびN-Cbz-グリシン (90.0 mg, 0.430 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (2.0 mL)に溶解し、室温にてジイソプロピルエチルアミン (0.220 mL, 1.29 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (245 mg, 0.645 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物128 (180 mg, 収率64 %)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+
化合物130の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000230
工程95
　3,5-ジニトロ安息香酸128 (500 mg, 2.36 mmol)およびN-Cbz-エチレンジアミン (588 mg, 2.83 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (5.0 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.65 mL, 4.72 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（380 mg, 2.83 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（675 mg, 3.54 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物129 (445 mg, 収率48 %)を得た。
工程96
　工程95で合成した化合物129 (200 mg, 0.515 mmol)をエタノール (5.0 mL)に溶解し、室温にて塩化スズ(II) (584 mg, 3.09 mmol)および濃塩酸 (0.2 mL)を加え、80℃で16時間撹拌した。反応液を後処理し、化合物130 (180 mg,収率106%)を得た。
ESI-MS m/z: 329 (M + H)+
化合物133の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000231
工程97
　実施例1の工程6で合成した化合物9(8.17 g, 23.12 mmol)を用いて実施例1の工程9と同様の方法で化合物131を得た(3.7 g, 収率63%)。
ESI-MS m/z: 254(M+H)+
工程98
　工程97で得られた化合物131(3.7 g, 14.63 mmol)を用いて実施例1の工程10と同様の方法で化合物132を得た(3.82 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 432(M+HCOO)-
工程99
　工程98で得られた化合物132(3.82 g, 9.86 mmol)を用いて実施例1の工程7と同様の方法で化合物133を得た(3.08 g, 収率87%)。
ESI-MS m/z: 360(M+H)+
化合物135の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000232
工程100
　化合物8(2g, 9.53mmol)とert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-ペンタノール (東京化成社製,,2g,10mmol)を用い、実施例1の工程6と同様の方法で化合物134を得た(2.40 g, 収率63%)。
ESI-MS m/z: 296(M+H)+, 脱Boc体として検出
工程101
　工程100で合成した化合物134を用いて、実施例1の工程7-9, 14-17と同様の方法で化合物135を得た(1.579g,収率21%) 。
ESI-MS m/z: 910 (M+H)+
実施例14　糖リガンド－テザーユニットの合成
化合物137の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000233
工程102
　工程51で合成した化合物56 (1.015 g, 1.748 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 187 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程76で合成した化合物107（250.0 mg, 0.350 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（26.80 mg, 0.1750 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（402.0 mg, 2.099 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物136（617.0 mg, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 1215 (M + 2H) 2+
工程103
　工程102で合成した化合物136 (0.7380 g, 0.3040 mmol)をテトラヒドロフラン (7 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 135.90 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物137（581 mg, 収率82%）を得た。
ESI-MS m/z: 1170 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.12-2.36 (106H, m), 2.91-3.19 (8H, m), 3.23-3.55 (14H, m), 3.60-3.76 (4H, m), 3.78-3.94 (8H, m), 3.95-4.10 (16H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.92-5.01 (4H, m), 5.17-5.24 (4H, m), 6.98 (1H, s), 7.64 (2H, s), 7.81-7.95 (4H, m), 8.28-8.38 (2H, m), 8.44-8.56 (2H, m), 10.13 (1H, s).
化合物139の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000234
工程104
　工程52で合成した化合物57 (500 mg, 0.879 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 94 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程76で合成した化合物107（126.0 mg, 0.176 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（13.47 mg, 0.088 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（202.0 mg, 1.055 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物138（249.7 mg, 収率60%）を得た。
ESI-MS m/z: 1191 (M + 2H) 2+
工程105
　工程104で合成した化合物138 (0.242 g, 0.102 mmol)をテトラヒドロフラン (3.6 mL)および水（1.2 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 45 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物139（216 mg, 収率93%）を得た。
ESI-MS m/z: 1146 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.15-1.65 (20H, m), 1.68-2.15 (52H, m), 3.13-3.29 (6H, m), 3.40-3.67 (16H, m), 3.71-3.96 (11H, m), 3.98-4.14 (16H, m), 4.55 (4H, t, J = 8.8 Hz), 4.93-5.06 (4H, m), 5.12-5.28 (4H, m), 6.56 (1H, s), 6.98 (1H. s), 7.64 (2H, s), 7.77-7.93 (4H, m), 8.26-8.49 (3H, m), 10.10 (1H, s).
化合物141の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000235
工程106
　工程53で合成した化合物58 (430 mg, 0.674 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 79 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に化合物107（105.0 mg, 0.148 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（11.31 mg, 0.074 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（170.0.0 mg, 0.887 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物140（218.1 mg, 収率56%）を得た。
ESI-MS m/z: 1329 (M + 2H) 2+
工程107
　工程106で合成した化合物140 (0.210 g, 0.079 mmol)をテトラヒドロフラン (3.1 mL)および水（1.0 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 39 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物141（192.7 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1284 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.17-1.65 (42H, m), 1.69-2.13 (61H, m), 2.95-3.17 (16H, m), 3.65-3.77 (3H, m), 3.79-3.94 (6H, m), 3.96-4.10 (16H, m), 4.48 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 2.4, 11.2 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (1H, s), 7.64-7.92 (11H, m), 8.26-8.48 (4H, m), 10.14 (1H, s).
化合物143の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000236
工程108
　工程52で合成した化合物57 (450 mg, 0.791 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 85 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程81で合成した化合物113（94 mg, 0.158 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（133.0 mg, 0.871 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（182.0 mg, 0.950 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物142（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1129 (M + 2H) 2+
工程109
　工程108で合成した化合物142 (80 mg, 0.035 mmol)をテトラヒドロフラン (1.7 mL)および水（0.85 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 26 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物143（57.5 mg, 収率75%）を得た。
ESI-MS m/z: 1084 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.69-2.21 (46H, m), 3.14-3.65 (28H, m), 3.67-4.22 (27H, m), 4.43-4.66 (4H, m), 4.69-4.88 (4H, m), 4.89-5.08 (4H, m), 5.12-5.32 (4H, m), 6.54-6.68 (1H, br), 7.01 (2H, s), 7.78-8.09 (3H, m), 8.13-8.31 (2H, m), 8.58-8.75 (2H, m).
化合物145の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000237
工程110
　工程53で合成した化合物58 (418 mg, 0.655 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 77 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程81で合成した化合物113（85 mg, 0.144 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（121.0 mg, 0.791 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（165.0 mg, 0.863 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物144（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1268 (M + 2H) 2+
工程111
　工程110で合成した化合物144 (186 mg, 0.073 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mL)および水（0.93 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 40 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物145（156.7 mg, 収率87%）を得た。
ESI-MS m/z: 1222 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.36-1.62 (27H, m), 1.67-2.17 (64H, m), 2.92-3.21 (15H, m), 3.58-3.77 (2H, m), 3.80-3.95 (7H, m), 3.97-4.13 (15H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.88-5.02 (7H, m), 5.10-5.24 (3H, m), 6.95-7.00 (1H, m), 7.26-7.31 (2H, m), 7.72-7.88 (8H, m), 8.10-8.20 (2H, m), 8.51-8.60 (2H, m).
化合物147の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000238
工程112
　工程109で合成した化合物143 (171 mg, 0.079 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (3.4 mL)に溶解し、グリシンベンジル p-トルエンスルホン酸塩（32.0 mg, 0.095 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（12.09 mg, 0.079 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（18.16 mg, 0.095 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物146（55.7 mg, 収率31%）を得た。
ESI-MS m/z: 1158 (M + 2H)2+
工程113
　工程112で合成した化合物146 (54 mg, 0.023 mmol)をテトラヒドロフラン (0.83 mL)および水（0.28 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 18 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物147（50.1 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1112 (M + 2H)2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 0.96-1.06 (3H, m), 1.71-2.20 (54H, m), 3.41-3.64 (15H, m), 3.68-4.20 (32H), 4.55 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.81 (4H, s), 4.94-5.02 (4H, m), 5.17-5.25 (4H, m), 6.63-6.76 (2H, m), 6.93-7.02 (2H, m), 7.84-8.00 (3H, m), 8.17-8.30 (2H, m), 8.58-8.70 (2H, m).
化合物149の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000239
工程114
　化合物56 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて化合物116 (113 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物148 (195 mg, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1186 (M + 2H) 2+
工程115
　工程114で合成した化合物148 (194 mg, 0.082 mmol)をテトラヒドロフラン (2.9 mg)および水 (1.0 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 35.7 mg)を加え、水素雰囲気下で8時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物149（183 mg, 収率98%）を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.21-1.45 (m, 40H), 1.76-2.18 (m, 50H), 3.00-3.09 (m, 8H), 3.40-4.20 (m, 32H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.98 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.31 (brs, 1H), 8.44 (brs, 1H), 10.11 (s, 1H).
化合物151の合成
工程116
　化合物56 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて化合物120 (97.0 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=85/15)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物150 (179 mg, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 1138 (M + 2H) 2+
工程117
　工程116で合成した化合物150 (175 mg, 0.077 mmol)をテトラヒドロフラン (2.6 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 32.4 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物151（160 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1093 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.23-1.45 (m, 32H), 1.77 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 3.01-3.11 (m, 8H), 3.69-4.02 (m, 34H), 4.47-4.50 (m, 4H), 4.94-4.98 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.33 (brs, 2H), 8.50 (brs, 2H).
化合物153の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000241
工程118
　化合物58 (500 mg, 0.784 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて化合物125 (144 mg, 0.157 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (180 mg, 0.941 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (12.0 mg, 0.078 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=80/20)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物152 (191 mg, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1431 (M + 2H) 2+
工程119
　工程118で合成した化合物152 (186 mg, 0.065 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 34.3 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物153（174 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1386 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.25-4.02 (m, 164H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.47 (d, J= 8.1 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.74-7.91 (m, 13H), 8.18 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 10.27 (brs, 1H).
化合物155の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000242
工程120
　化合物128 (150 mg, 0.228 mmol)をジクロロメタン (1.5 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (1.5 mL)を加えて4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸するした。残渣をN, N’-ジメチルホルムアミド (3 mL)に溶解し、室温にて化合物7 (574 mg, 0.571 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (109 mg, 0.571 mmol)、トリエチルアミン (0.159 mL, 1.14 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物(3.50 mg, 0.023 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物154 (242 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 1216 (M + 2H) 2+
工程121
　化合物154 (242 mg, 0.100 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 44.6 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (23.2 mg, 0.110 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (55.2 mg, 0.199 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物155 (97.4 mg, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 1245 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.14-2.16 (100H, m), 2.96-2.98 (4H, m), 3.24-3.41 (18H, m), 3.69-3.73 (4H, m), 3.83-3.91 (6H, m), 4.14-4.16 (2H, m), 4.47 (4H, d, J= 8.6 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 3.6, 11.3 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (2H, s), 7.73-7.75 (2H, m), 7.83-7.94 (7H, m), 8.05-8.08 (2H, m), 8.14-8.20 (3H, m), 8.55-8.56 (2H, m), 10.24 (1H, brs).
化合物157の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000243
工程122
　工程96で合成した化合物130 (75.0 mg, 0.228 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (3.0 mL)に溶解し、室温にて工程55で合成した化合物60 (574 mg, 0.571 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.199 mL, 1.14 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (217 mg, 0.571 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物156 (202 mg, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 1152 (M + 2H) 2+
工程123
　工程122で合成した化合物156 (196 mg, 0.085 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 36.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (19.8 mg, 0.094 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (47.0 mg, 0.170 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物157 (42.4 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182 (M + 2H) 2+
化合物158の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000244
工程124
　工程101で合成した化合物135を用い、実施例8の工程33および34と同様の方法で化合物158 (2.2 g, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 2437(M+H)+
化合物161の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000245
工程125
　実施例13の工程99で合成した化合物133(0.101 g, 0.282 mmol)を用いて、参考例3の工程57で合成した化合物62(0.607 g, 0.613 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法によって化合物159 (0.25 g, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 2304(M+H)+
工程126
　工程125で合成した化合物159(0.255 g, 0.111 mmol)を用いて、実施例3の工程18と同様の方法によって化合物160 (0.15 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 2170(M+H)+
工程127
　工程126で合成した化合物160(20.8 mg, 9.59 μmol)を用いて、実施例3の工程19と同様の方法によって化合物161 (5.5 mg, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182(M+2H)2+
化合物163の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000246
工程128
　実施例13の工程99で合成した化合物133(0.099g, 0.277 mmol)を用いて、参考例3の工程59で合成した化合物64(0.618 g, 0.615 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法によって化合物162 (0.343 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 2333(M+H)+
工程129
　工程128で合成した化合物162を用いて、実施例3の工程18および19と同様の方法で化合物163 (6.9 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 2392(M+H)+
化合物164の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000247
工程130
　実施例5の工程28で合成した化合物31(0.048 g, 0.021 mmol)と3-マレイミドプロピオン酸 N-スクシンイミジル (東京化成社製, 0.017 g, 0.064 mmol)を用いて実施例5の工程29と同様の方法で化合物164 (0.040 g, 収率78%)を得た。
ESI-MS m/z: 2480(M+HCOO)-
化合物165の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000248
工程131
　実施例8の工程34で合成した化合物37(23.6 mg, 9.46 μmol)とN-(2-アミノエチル)マレイミド トリフルオロ酢酸塩 (シグマアルドリッチ社製, 7.21 mg, 0.028 μmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物165 (9.1 mg, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 1310(M+2H)2+
化合物167の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000249
工程132
　実施例5の工程28で合成した化合物31(0.122 g, 0.054 mmol)を用いて実施例2の工程14と同様の方法で合成したヘキサン酸モノベンジルエステルを用い、同工程記載の方法にて化合物166 (0.076 g, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 2503(M+H)+
工程133
　工程132で合成した化合物166(0.076 g, 0.03 mmol)を用いて実施例3の工程18と同様の方法にて化合物167 (0.030 g, 収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2412(M+H)+
化合物168の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000250
工程134
　実施例4の工程24で合成した化合物27 (4.36 mg, 0.006mmol)、参考例1の工程3で合成した化合物4 (10 mg, 0.02 mmol) を用い、実施例1の工程12と同様の方法で化合物168 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-
化合物171の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000251
工程135
　工程124で合成した化合物158(0.2011 g, 0.079 mmol)を用いて、実施例8の工程35を用いて化合物169を得た(0.129 g, 収率55%)。
ESI-MS m/z: 2972 (M+HCOO)-
工程136
　工程135で合成した化合物169(0.129 g, 0.044 mmol)を用いて、実施例8の工程36を用いて化合物170の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1535 (M+HCOOH-2H)2-
工程137
　工程136で合成した化合物170(0.0467 g, 0.013 mmol)を用いて、実施例8の工程37を用いて化合物171を得た(19.4 μmol/g, 収率35%)。
化合物174の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000252
工程138
　実施例8の工程35で合成した化合物37 (100 mg, 0.040mmol) および参考例4の工程60で合成した化合物66を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物172 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1335 (M-DMTr+2H)2+
工程139
　工程138で合成した化合物172 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物173の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1558 (M+HCOOH-2H)2-
工程140
　工程139で合成した化合物173の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物174 (21.5 μmol/g, 2段階収率32%) を得た。
化合物177の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000253
工程141
　実施例14の工程124で合成した化合物158 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例4の工程60で合成した化合物66を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物175 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1356 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
工程142
　工程141で合成した化合物175 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物176の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1579 (M+HCOOH-2H)2-
工程143
　工程142で合成した化合物176の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物177 (17.0 μmol/g, 2段階収率26%) を得た。
化合物180の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000254
工程144
　実施例14の工程124で合成した化合物158 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例4の工程62で合成した化合物69を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物178 (50 mg, 収率42%) を得た。
ESI-MS m/z: 1363 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
工程145
　工程144で合成した化合物178 (50 mg, 0.017 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物179の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1587 (M+HCOOH-2H)2-
工程146
　工程145で合成した化合物179の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物180 (0.5 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
化合物183の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000255
工程147
　実施例14の工程124で合成した化合物158 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例4の工程63で合成した化合物71を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物181 (40 mg, 収率30%) を得た。
ESI-MS m/z: 1532 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
工程148
　工程147で合成した化合物181 (40 mg, 0.012 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物182の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1582 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
工程149
　工程148で合成した化合物182の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物183 (0.2 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
化合物187の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000256
工程150
　実施例8の工程34で合成した化合物158 (70 mg, 0.028 mmol) および参考例4の工程68で合成した化合物78を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物184 (58 mg, 収率77%) を得た。
ESI-MS m/z: 1341 (M+2H)2+
工程151
　工程150で合成した化合物184 (58 mg, 0.022 mmol) をメタノール (0.15  mL) に溶解し、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物65 (16.9 mg, 0.032 mmol)、1 mol /L SODIUM L-ASCORBATE水溶液 (0.022 mL, 0.022 mmol)、20 mmol/L 硫酸銅(ＩＩ)水溶液 (0.011 mL, 0.22 μmol)、及び10 mmol/L Tris(2-benzimidazolylmethyl)amine / DMSO溶液 (0.022 mL, 0.22μmol)を加え、室温にて3時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム／メタノール=80/20）にて精製し、化合物185 (7 mg, 収率10%) を得た。
ESI-MS m/z: 1450 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
工程152
　工程151で合成した化合物185 (10 mg, 3.13 μmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物186の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1500 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
工程153
　工程152で合成した化合物186の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物187 (8.4 μmol/g,収率27%) を得た。
化合物190の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000257
工程154
　実施例14の工程124で合成した化合物158(74.1 mg, 0.029 mmol)と実施例4の工程72で合成した化合物95(15 mg, 0.027 mmol)を用いて、実施例1の工程8と同様の方法、またはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて化合物188の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1392(M +H)+, 脱DMTr体として検出
工程155
　工程154で合成した化合物188(0.083 g, 0.027 mmol)を用いて、特許文献WO2015105083に記載の方法により化合物189の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 2669(M+H)+ , 脱DMTr体として検出
工程156
　工程155で合成した化合物189(0.08 g, 0.027 mmol)を用いて、実施例8の工程36と同様の方法で化合物190の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1556(M+HOOH-2H)2-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.45-1.86 (48H, m), 1.93 (12H, s), 1.94 (12H, s), 2.02 (12H, s), 2.13 (12H, s), 2.16-2.28 (17H, m), 2.48 (4H, s), 3.10-3.16 (6H, m), 3.36-3.56 (19H, m), 3.77 (6H, s), 3.80-3.89 (6H, m), 3.98-4.35 (30H, m), 4.53-4.59 (4H, m), 4.66-4.72 (1H, m), 5.04-5.10 (4H, m), 5.31-5.36 (4H, m), 6.81-6.88 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.26-7.32 (6H, m), 7.38-7.44 (2H, m), 7.54 (2H, br s), 7.90 (1H, br s).
化合物191～199の合成
　実施例8の工程34で合成した化合物37または実施例14の工程124で合成した化合物158と第18表記載の構造、または参考例4の工程66で合成した化合物75を用い、工程154,155と同様の方法にて第20表および第21表に記載した化合物を得た。
　本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第22表に示す。
第20表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000258
第21表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000259
第22表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000260
化合物200の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000261
工程157
　工程156で合成した化合物190(g, mmol)を用いて、実施例8の工程37と同様の方法で化合物200を得た(10.0 μmol/g)。
化合物201～209の合成
　第20表および第21表に記載した化合物を用いて、工程157と同様の方法で第23表および第24表記載の化合物を得た。
　本実施例により合成した化合物の担持量を第25表に示す。
第23表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000262
第24表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000263
第25表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000264
実施例15　核酸複合体の合成
核酸複合体210～218の合成
　実施例9の工程38と同様の方法で第26表記載の化合物を用いて第27表および第28表記載の一本鎖の核酸複合体を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第29表に示す。
第26表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000265
第27表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000266
第28表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000267
第29表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000268
核酸複合体219の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000269
工程158
　工程134で合成した化合物168を用いて実施例10の工程40と同様の方法で第30表記載の一本鎖の核酸複合体219を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第30表に示す。
第30表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000270
核酸複合体223の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000271
 工程159
　実施例8の工程34で合成した化合物37とモレキュールズ(Molecules)、第17巻、13825-13843頁、2012年に記載された方法で合成した末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを加えて、バイオコンジュゲートケミストリー, 第22巻,1723-1728頁, 2011年もしくはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて反応させた。実施例9の工程38中に記載した方法で精製することにより、一本鎖の核酸複合体223を得た。
核酸複合体220～233の合成
　実施例15の工程159と同様の方法で第31表および第32表記載の化合物を用いて第33表～第35表記載の一本鎖の核酸複合体を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第36表に示す。
第31表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000272
第32表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000273
第33表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000274
第34表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000275
第35表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000276
第36表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000277
核酸複合体234の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000278
工程160
　実施例14の工程157で合成した化合物200を用いて実施例12の工程46と同様の方法で一本鎖の核酸複合体234を得た。
核酸複合体235～250の合成
　工程160と同様の方法で化合物171,174,177,180,183,187,200および第23表および第24表記載の化合物を用いてそれぞれ対応する第37表～第40表記載の一本鎖の核酸複合体を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第41表に示す。
第37表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000279
第38表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000280
第39表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000281
第40表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000282
第41表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000283
核酸複合体251～287の合成
　　実施例9の工程39と同様の方法で一本鎖の核酸複合体(ssRNA)210～233, 235～247を用いて2本鎖の核酸複合体251～287を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列を第42, 43, 45, 47～54表に示す。
第42表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000284
第43表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000285
第44表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000286
第45表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000287
第46表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000288
第47表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000289
第48表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000290
第49表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000291
第50表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000292
第51表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000293
第52表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000294
第53表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000295
第54表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000296
第55表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000297
実施例16　糖リガンド-テザーユニットの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000298
工程160
　実施例13の工程99で合成した化合物133 (0.5 g, 1.365 mmol)を用いて、実施例4の工程25と同様の方法で化合物288を粗生成物として得た。
工程161
　実施例16の工程160で合成した化合物288(0.296 g, 0.247 mmol)を用いて、実施例4の工程26と同様の方法で化合物289を粗生成物として得た。
工程162
　実施例16の工程161で合成した化合物289(0.153 g, 0.247 mmol)およびインオーガニック・ケミストリー (Inorganic Chemistry), 第83巻, 1000-1007頁, 2011年に記載された方法で合成した1-(2-アジドエチル)－r－D-マンノピラノシド (0.221g, 0.989 mmol)を用いて、実施例1の工程8と同様の方法で化合物290を得た(0.110 g, 収率31%)。
ESI-MS m/z： 720 (M + H)+
工程163
　実施例16の工程162で合成した化合物290(0.110 g, 0.077 mmol)を用いて、実施例5の工程28と同様の方法で化合物291を得た(0.077 g, 収率77%)。
ESI-MS m/z： 1305 (M + H)+
工程164
　実施例16の工程163で合成した化合物291(20 mg, 0.016 mmol)、2, 5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-アジドヘキサン酸(10 mg, 0.032 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.027 mL, 0.078  mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。混合物を逆相高速液体クロマトグラフィー(ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.01%トリフルオロ酢酸水溶液, B液:アセトニトリルによるグラジエント）によって精製し、化合物292を得た(1.7 mg, 収率8%)。
ESI-MS m/z： 1444 (M + H)+
工程165
　実施例16の工程163で合成した化合物291(20 mg, 0.016 mmol)、N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (9.6 mg, 0.031 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.027 mL, 0.078  mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。混合物を逆相高速液体クロマトグラフィー(ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.01%トリフルオロ酢酸水溶液, B液:アセトニトリルによるグラジエント）によって精製し、化合物293を得た(1.8 mg, 収率8%)。
ESI-MS m/z： 1498 (M + H)+
実施例17　核酸複合体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000299
工程166
　実施例16の工程164で合成した化合物292を用いて実施例10の工程40と同様の方法で一本鎖の核酸複合体294を得た。
工程167
　実施例16の工程165で合成した化合物293を用いて実施例9の工程38と同様の方法で一本鎖の核酸複合体295を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第56表に示す。
第56表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000300
　実施例9の工程39と同様の方法で第56表記載の一本鎖の核酸複合体を用いて第57表記載の2本鎖の核酸複合体を得た。
　本実施例により合成した核酸複合体の配列を第58表に示す。
第57表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000301
第58表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000302
試験例5核酸複合体のマウス初代肝細胞に対するin vitro活性
　実施例および比較例で得られた各核酸複合体のうち、第59表について、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞 (ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
　最終濃度が30, 10または3 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント （Primary Hepatocyte Maintenance Supplements） (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
　各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
　得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Serpin peptidase inhibitor, clade C (antithrombin), member 1 (別名antithrombin III、以下AT3と表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。得られたAT3のmRNAの発現率の結果を、陰性対照のAT3 mRNA発現率に対する抑制率として第60-66表に示す。
第59表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000303
第60表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000304
第61表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000305
第62表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000306
第63表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000307
第64表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000308
第65表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000309
第66表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000310
　第60～第66表から明らかなように、本発明の核酸複合体（被検物番号3～38）は、マウス初代肝細胞に導入後のAT3遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
試験例6　核酸複合体のマウスにおけるin vivo活性
　実施例および比較例で得られた各核酸複合体のうち、第59表について、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス(BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を1.5 mg/kgまたは0.5 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後にイソフルラン麻酔下で後大静脈後部静脈より採血した。採血した血液を3.2 Mクエン酸ナトリウムおよび5 mmol/L D-グルコースを含む抗凝固液と体積比9:1で混合し、遠心後の上清を回収することで血漿を得た。動物は採血後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット(キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、AT3遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、AT3のmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したコントロール群におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。また、血漿中のAT3タンパク質濃度を、アンチトロンビンスリーマウスエライザキット(アブカム社製、カタログ番号ab108800)を用い添付された使用説明書に記載された方法に従って測定した。得られたAT3のmRNAの発現抑制率および血漿中AT3タンパク質濃度を表67-69に示す。
第67表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000311
第68表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000312
第69表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000313
　表67～69から明らかなように、本発明の核酸複合体(被検物番号3～22、24、25、27～33)は、生体内において、AT3遺伝子の発現を低下させ、血中のAT3タンパク質濃度を減少させた。
試験例7　核酸複合体のヒト初代肝細胞に対するin vitro活性
　実施例15で得られたB2M-siRNA(被検物39)、260_3’-B2M-siRNA(被検物40)について、それぞれ以下の方法により、ヒト初代肝細胞 (Biopredic international社製、カタログ番号HEP187)に導入した。
　最終濃度が300, 100, 30, 10, 3, 1 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、カタログ番号31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、Plating medium(Biopredic international社製、カタログ番号LV0304-2)に1.25×105cells/mLとなるように懸濁させたヒト初代肝細胞を、細胞数80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、Incubation medium(Biopredic international社製、カタログ番号LV0304-2)を添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
　各製剤を導入した細胞を37 ℃の5% CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
　得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Beta-2 microglobulin (以下B2Mと表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、B2MのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるB2MのmRNAの準定量値を1として、B2MのmRNAの準定量値から、B2MのmRNAの発現率を求めた。得られたB2MのmRNAの発現率の結果を、陰性対照のB2M mRNA発現率に対する抑制率として表70に示す。
第70表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000314
試験例8　核酸複合体のヒト単球由来マクロファージ細胞に対するmRNAノックダウン活性の評価
　10%ウシ胎児血清を含むアールピーエムアイ1640培地 (RPMI1640培地, ナカライテスク社製, 30264-56)(以下10%FBS RPMI1640培地と記載)及びDNase I溶液 (DNase I Solution , StemCell Technology社製, 07900)を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
　その後、組み換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子 (Recombinant Human GM-CSF Protein CF, R&D System社製, 215-GM-050/CF) (以下GM-CSFと記載)を最終濃度100 ng/mLとなるように添加し、106 cells/mLの密度でマルチプレート (SUMILON社製, MS-8196F5)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
　培養開始から6日後に培養上清を除去し、GM-CSF 100 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地を80uLずつ各ウェルに添加した。
　被験サンプルとしては、Beta-2 Microglobulin(以下B2Mと記載)およびHPRT-1を標的とする核酸複合体296_3’-B2M-siRNA（被検物41）、またこれらの核酸複合体にそれぞれ対応するコントロールとしてB2M-siRNA(被検物42)を用いた。被験サンプルの最終濃度は1 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/Lの3点を設定し、N=3で実施した。
　核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液 (20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)で調製された核酸溶液をオプティメム (Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium, Life technologies社製, 31985-070)を用いて希釈した。希釈した核酸溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には核酸非含有のクエン酸緩衝液/オプティメム混合溶液を20 μL添加し、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
　RNAを含む細胞溶解液の調製にはスーパープレップセルライシスキット (SuperPrep■ Cell Lysis & RT Kit for qPCR, TOYOBO社製, SCQ-101)を用い、同キット付属のアールティーキット (RT Kit for qPCR)を用いてキットに添付された説明書に従って逆転写反応を行い、cDNAを作成した。
　このcDNAをPCR反応の鋳型とし、QuantStudio 12K Flex リアルタイムPCRシステム (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、タックマンプローブ (Taqman probe)法により下記の通り実施した。B2M遺伝子のノックダウン効果を定量する場合、B2M及び対照としてHPRT-1の遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、HPRT-1のmRNA増幅量を内部対照として、B2MのmRNAの準定量値を算出した。
　B2M遺伝子の測定にはタックマンプローブHs00187842_m1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製, 4369542)を用いて添付のプロトコルに従って実施した。核酸の標的mRNA量は、陰性対照群（核酸未導入群）におけるB2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を表71に示す。
第71表
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000315
　これらの結果より、本発明の核酸複合体（被検物41）がコントロールであるB2M-siRNA（被検物42）と比較して、ヒト単球由来マクロファージにおいて有意なノックダウン効果を示す事を確認した。
　本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療するために用いることができる。
　配列番号１は、ApoBASOの塩基配列を示す。
　配列番号２は、AT3-ssRNAの塩基配列を示す。
　配列番号３は、AT3-asRNAの塩基配列を示す。
　配列番号４は、B2M-ssRNAの塩基配列を示す。
　配列番号５は、B2M-asRNAの塩基配列を示す。
　配列場号６は、CD45ASOの塩基配列を示す。
　配列番号７は、3'-dT10の塩基配列を示す。
　配列番号８は、Hprt1-ssRNAの塩基配列を示す。
　配列番号９は、Hprt1-asRNAの塩基配列を示す。

Claims (19)

  1. 　下記式１で表される核酸複合体。
    式１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式１中、
    　Ｘは、オリゴヌクレオチドであり、
    　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
    　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
  2. 　下記式２で表される構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
    式２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式２中、
    　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
    　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であり、
    　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
    式２－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
    　ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
    　ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。）
  3. 　Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である請求項２に記載の核酸複合体。
  4. 　－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－および－（Ｐ５－Ｑ３）ｑ３－がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造である、請求項２および３に記載の核酸複合体。
    式３－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     式３－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式３－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式３－１～式３－３中、
    　ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、式３－１～式３－３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
  5. 　下記式４－１～式４－９で表されるいずれかの構造を有する、請求項２～４のいずれか一項に記載の核酸複合体。
    式４－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     式４－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     式４－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     式４－４：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     式４－５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     式４－６：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     式４－７：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     式４－８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     式４－９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     （式４－１～４－９中、
    　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
  6. 　下記式５で表される構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
    式５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     （式５中、
    　Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
  7. 　Ｐ１が－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である請求項６に記載の核酸複合体。
  8. 　下記式６－１～式６－９で表されるいずれかの構造を有する、請求項６または７に記載の核酸複合体。
    式６－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     式６－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     式６－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     式６－４：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     式６－５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     式６－６：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     式６－７：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     式６－８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     式６－９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     （式６－１～６－９中、
    　Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
  9. 下記式７－１～式７－９で表されるいずれかの構造を有する、請求項２～５に記載の核酸複合体
    式７－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     式７－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
     式７－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     式７－４：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
     式７－５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
     式７－６：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
     式７－７：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
     式７－８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
     式７－９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
     （式７－１～７－９中、
    　Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
  10. 　前記糖リガンドが、マンノースまたはＮ－アセチルガラクトサミンである、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  11. 　前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
  13. 　細胞内に導入するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　前記細胞が肝細胞である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　静脈内投与または皮下投与される、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１２～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
  17. 　下記式８で表される化合物。
    式８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
     （式８中、
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４、または－ＣＯ－Ｂ４－［（Ｐ９－Ｑ８）ｑ７－Ｔ３－Ｌ３］ｐ３であり、
    　Ｐ９およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ８は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ１は０～９９の整数であり、
    　Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式８－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ７、ｍ８、ｍ９およびｍ１０は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
    式８－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
     　ｐ３は、１、２または３の整数であり、
    　ｑ７は、０～１０の整数であり、
    　Ｌ３は、糖リガンドであり、
    　Ｙは-Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２－ＮＨ－であり、ｍ１１およびｍ１２は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
    　Ｒ３は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９－Ｂ５－（Ｑ１０－Ｐ１０）ｑ８－Ｘ１であり、ｎ２は０～９９の整数であり、
    　Ｐ１０は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ９およびＱ１０は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３は０～９９の整数であり、
    　Ｂ５は、下記式８－２で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９およびＱ１０との結合手を意味し、
    式８－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
     　ｑ８は、０～１０の整数であり、
    　Ｘ１は、水素原子または固相担体であり、
    　Ｒ４は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
  18. 　下記式９で表される化合物。
    式９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
     （式９中、
    　Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、または－ＣＯ－Ｑ１１－（Ｐ１１－Ｑ１１’）ｑ９－Ｔ４－Ｌ４であり、
    　Ｐ１１およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ１１およびＱ１１’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ４－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ４は０～９９の整数であり、
    　ｑ９は、０～１０の整数であり、
    　Ｌ４は、糖リガンドであり、
    　Ｙ’は－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１’－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２’－ＮＨ－であり、ｍ１１’およびｍ１２’は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
    　Ｒ３’は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２’－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９’－Ｂ５’－（Ｑ１０’－Ｐ１０’）ｑ８’－Ｘ１’であり、ｎ２’は０～９９の整数であり、
    　Ｐ１０’は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ９’およびＱ１０’は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３’－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３’は０～９９の整数であり、
    　Ｂ５’は、下記式９－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９’およびＱ１０’との結合手を意味し、
    式９－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
     　ｑ８'は、０～１０の整数であり、
    　Ｘ１’は、水素原子または固相担体であり、
    　Ｒ４’は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
  19. 　下記式１０で表される化合物。
    式１０：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
     （式１０中、
    　Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、－ＮＨ－Ｒ１０、または－ＮＨ－Ｑ１２－（Ｐ１２－Ｑ１２’）ｑ１０－Ｔ５－Ｌ５であり、
    　Ｐ１２およびＴ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ１２およびＱ１２'は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ５－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ５は０～９９の整数であり、
    　Ｌ５は、糖リガンドであり、
    　Ｙ２は－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１３－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１４－ＮＨ－であり、ｍ１３およびｍ１４は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
    　ｑ１０は、０～１０の整数であり、
    　Ｒ９は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ１０、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ６－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ１３－Ｂ６－（Ｑ１４－Ｐ１３）ｑ１１－Ｘ２であり、ｎ６は０～９９の整数であり、
    　Ｐ１３は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ１３およびＱ１４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ７－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ７は０～９９の整数であり、
    　Ｂ６は、下記式１０－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ１３およびＱ１４との結合手を意味し、
    式１０－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
     　ｑ１１は、０～１０の整数であり、
    　Ｘ２は、水素原子または固相担体であり、
    　Ｒ１０は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
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