JP2022525223A - ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合タンパク質を用いたがんの治療 - Google Patents

Abstract

対象のがんを治療するための組成物及び方法が提供され、その対象に治療有効量のＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤を投与することが含まれる。さまざまな実施形態では、その方法はさらに治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤の投与を可能にする。本発明者らは、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害剤とチェックポイント阻害剤の併用の相乗効果は、Ｔ細胞を活性化すること、並びにＴ細胞及びＮＫ細胞の腫瘍への輸送を促進することによって、免疫細胞（例えば、ＣＤ３及びＣＤ８）の腫瘍への遊走を介して、さまざまながんの患者に優れた無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び客観的奏効率（ＯＲＲ）をもたらすこと示している。【選択図】 図７

Description

関連特許出願
本出願は、２０１９年３月１７日に出願された米国仮出願第６２／８１９，６４２号及び２０１９年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／８１９，７２５号の優先権を主張するものであり、各仮出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、「ハードコピー（ｐａｐｅｒ ｃｏｐｙ）」形式の配列表（ＰＤＦファイル）、及びコンピューター読取可能形式の参照配列（配列番号１～２）を含むファイル（ＳＴ２５形式テキストファイル）を含み、それらは本明細書において提出される。配列表は、米国特許法施行規則第１．８２２条で定められている通り、アミノ酸の標準的な３文字表記を使用して示されている。

今日、進歩した診断法及び治療法が数多く開発されているにもかかわらず、がんは依然として世界的に主要な死因である。臨床腫瘍学における根治治療プロトコールは、外科的切除、放射線照射、細胞傷害性化学療法の組み合わせに頼っている状態のままである。がんの治療や予防の成功に対する主要な障壁は、いまだに多くのがんが現在の化学療法及び免疫療法による介入に反応せず、多くの人が積極的な治療のあとでさえも再発や死亡に苦しんでいるという事実にある。これらの短所に対処するために、がんにおいて調節不全のシグナル伝達軸を調節できる標的療法を開発することが創薬におけるトレンドになっている。現在、数多くの臨床的に妥当な標的を治療的に操作できるＦＤＡ承認の抗体及び低分子が多数存在する。

がん免疫療法は、免疫系を用いてがんを攻撃するがん治療法に与えられた名称である。全身免疫療法とは、全身を治療するのに用いられる免疫療法であり、体の１つの「局所的」部分を治療するのに用いられる局所免疫療法よりも一般的であり、特にがんが転移したときに用いられる。がん細胞は病原体よりも免疫原性が低いが、免疫系は明らかに腫瘍細胞を認識して排除することができ、がん免疫療法は、免疫系の優れた能力と特異性を、悪性腫瘍の治療に生かそうとする。残念なことに、腫瘍は免疫応答の発生と機能を妨げることが多く、例えば、定着腫瘍内に存在する抑制的な環境は、効果的な免疫応答を阻害する。最終的には、免疫療法の目的は、免疫系の腫瘍に対する警戒を再確立し、腫瘍及び腫瘍微小環境の免疫抑制作用を阻害することである。したがって、免疫療法の課題は、細胞免疫学及び分子免疫学の進歩を用いて、局所腫瘍環境を操作して、炎症誘発性環境を促進し、樹状細胞の活性化を促進し、抗腫瘍反応を効果的かつ安全に増大させる戦略を開発することである。

共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を用いた免疫療法は、広範囲の研究及び臨床評価の領域である。免疫チェックポイントタンパク質としては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、及びＴＩＭ－３並びに他のいくつかのものが挙げられる（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，８：２３９－４５，２００７）。正常な生理状態の下では、免疫チェックポイントは、自己（免疫）寛容の維持（すなわち自己免疫の予防）に決定的に重要であり、免疫系が病原性の感染に応答しているとき、組織を損傷から守る。さらに現在では、腫瘍は免疫耐性の主要な機序として、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対して、ある特定の免疫チェックポイント経路を利用することが明らかになっている（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２：２５２－６４，２０１２）。したがって、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）、ＰＤ－１（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ）及びＰＤ－Ｌ１（ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＬＤ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）（例えば、Ｐｈｉｌｉｐｓ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７（１）；３９－４６，Ｏｃｔ ２０１４を参照）、並びにＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、及びＶＩＳＴＡ（例えば、Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，３３（９）：４３４－４４４，Ｓｅｐ ２０１４、Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１０、Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６６：２４４３－５４を参照）を含む免疫チェックポイント分子に対する抗体を利用する治療は、がんなどの増殖性疾患を有する患者、特に難治性及び／又は再発性のがんの患者を治療するための新たな代替免疫療法として評価されている。

ＣＴＬＡ－４抗体は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認を獲得したこのクラスの「チェックポイント阻害剤」免疫療法薬の最初のものであった。がんにおける抗腫瘍免疫を増強するための新規治療戦略として、イピリムマブ及びトレメリムマブを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体の臨床開発が進行中である。イピリムマブとトレメリムマブはともにメラノーマで広範に評価されており、特にイピリムマブは、メラノーマの治療のための単剤療法として最近承認された。トレメリムマブは、現在、メラノーマ及び悪性中皮腫の単剤療法として第ＩＩ相試験で評価されており、一方、イピリムマブは、メラノーマ、前立腺がん、肺がんを含むさまざまな種類の腫瘍において、単剤療法として、及び化学療法や放射線などの他の治療方法とともに、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相試験で臨床的検討が行われている最中である（Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．１３，ｐｇ５，２２ Ｊａｎ ２０１３）。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用の阻害は、前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を媒介し（米国特許第８，００８，４４９号及び同第７，９４３，７４３号）、がんの治療に向けたＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用のＡｂ阻害剤の使用が治験にはっている（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２０７－２１２，２０１２、Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６６（２６）：２４５５－６５，２０１２、Ｇａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７２：２０１８－２０２８，２０１５、Ｐｈｉｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７（１）：３９－４６，２０１５を参照）。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ヒトの肺がん、卵巣がん、大腸がん及びさまざまな骨髄腫を含むいくつかのマウス及びヒトのがんで見られ、例えば、ブリストル・マイヤーズスクイブ（ＢＭＳ－９３６５５９）、メディミューン（ＭＥＤＩ４７３６）、ジェネンテック（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、メルク／ファイザー（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）によって開発された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、臨床的に評価されているか、又は現在評価されている最中である。

今やチェックポイント阻害剤療法は、多くのがんの好ましい第２又は第３選択の治療法になってきており、ＰＤ１／ＰＤＬ１抗体は、いくつかのがんに対する治療パラダイムを変えている。これらの著しい進歩にもかかわらず、現在の最先端を改善することがいまだに大いに求められている。例えば、チェックポイント阻害剤療法は、重篤な副作用の恐れに対する懸念、及び多くの腫瘍が標的抗原を欠いており、治療を回避することになるという事実によって、依然として限定的である。一般的に、さまざまながんの患者のうち約２０％が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体又はＣＴＬＡ－４抗体に反応し、ほとんどの症例では、全生存期間は１年未満のままであり、客観的奏効率は高くはなく、これらの患者の約７０～８０％にとってアンメットニーズが高いことがはっきりと示されている。

フロントラインの状況における化学療法と免疫療法の併用の革新的な試験が進行中である。アテゾリズマブと白金製剤をベースとした化学療法を併用した最初のそのような試験の結果は、２０１９年９月３０日にＥＳＭＯで発表されたが、コプライマリーエンドポイントであるＯＳは達成されず、ＰＦＳ評価項目は満たしていた。注目すべきことに、ＯＲＲは４９％（化学療法単独では４４％）、ＰＦＳは８．２か月（化学療法単独では６．３か月）、ＯＳは１６か月（化学療法単独では１３．４か月）であった。これらのデータは、標準治療は変更されず、この状況では化学療法と免疫療法の相乗効果はなく、バイオマーカー、すなわちＰＤ－Ｌ１発現の予測値もないようであることを示している。

腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の免疫療法に対する抵抗性に関与する要因を理解するための共同の取り組みは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）を、腫瘍増殖及び治療反応の重要な調節因子として同定することにつながった（Ｍｅｓｓｅｎｈｅｉｍｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２３：６１６５－７７，２０１７）。研究では、Ｔｒｅｇ／ＴＡＭ浸潤が高いことと、生存転帰が不良であること（Ｐｉｔｔ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，２７：１４８２－９２，２０１６）及び／又は化学療法剤への反応が悪いこととの相関関係が示されている。さまざまな腫瘍モデルにおいて、Ｔｒｅｇ又はＴＡＭの標的除去は、化学療法及びチェックポイント阻害剤に対する反応を改善することが報告されている（Ａｒｃｅ Ｖａｒｇａｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４６：５７７－８６，２０１７）。しかし、治験のデータは、抗ＣＴＬＡ－４などのＴｒｅｇを標的とした免疫療法による治療の後に有効性がないことを示唆している（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７２：２５２１－３２，２０１５）。したがって、ＴＭＥ内の免疫抑制細胞集団を標的することと治療効果を高めることとがともに可能な代替的なアプローチがアンメットニーズとして存在する。

参照による援用
特許文献米国特許第７，３８１，４１０号、米国特許第７，８６２，８１６号、米国特許第７，９７７，４６３号、米国特許第８，０６３，１８３号、米国特許第８，２７３，８５８号、米国特許第８，９７５，３７７号、米国特許第８，９８１，０６２号、米国特許第９，５３３，０２６号、及び本明細書に開示のすべての参考文献は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載のように、本発明者らは、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１標的療法の成功を踏まえて、免疫細胞を腫瘍に動員する薬剤を評価することによって、免疫細胞がほとんど又はまったくない状態で（コールド腫瘍）、免疫療法に反応しそうにない腫瘍に取り組んできた。具体的には、エフリンＢ２及びその高親和性同族受容体であるＥｐｈＢ４は、腫瘍血管で誘導され、免疫細胞輸送を調節する膜貫通型タンパク質である。アルブミンに融合したＥｐｈＢ４の可溶性細胞外断片（ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ）は、エフリンＢ２とＥｐｈＢ４の間の相互作用を遮断し、双方向シグナル伝達を遮断し、したがって免疫細胞輸送を促進する。本発明者らは、さまざまながんにおいて、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２の相互作用の阻害が抗腫瘍免疫応答を誘導できることを明らかにした。本発明者らは、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単独の有効性及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的抗体とＣＴＬＡ－４標的抗体の併用の有効性を、さまざまながんのフロントライン治療として、又は代替的に、白金製剤をベースとした化学療法、放射線療法、又はチェックポイント阻害剤療法の少なくとも１つのラインを受けた後に疾患が進行した患者の治療について評価した。本発明者らは、併用の相乗効果が、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の腫瘍への輸送を促進することによって、免疫細胞（例えばＣＤ３及びＣＤ８）の腫瘍への遊走を介して、さまざまながんの患者に、優れた無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び客観的奏効率（ＯＲＲ）をもたらすことを示した。

１つの態様では、本発明は、単独又は免疫チェックポイント阻害剤と併用してがんの治療に使用する医薬品を調製する際のＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用に関する。さまざまな実施形態では、がんは、これらに限定されないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、大腸がん、転移性尿路上皮がん、乳がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、中皮腫、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、カポジ肉腫、及び白血病からなる群より選択される。さまざまな実施形態では、がん腫瘍はエフリンＢ２を発現する。さまざまな実施形態では、がん腫瘍はＰＤ－Ｌ１を発現する。さまざまな実施形態では、がん腫瘍はエフリンＢ２及びＰＤ－Ｌ１を発現する。

さまざまな実施形態では、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤は、ＥｐｈＢ４タンパク質若しくはエフリンＢ２タンパク質の単量体リガンド結合部分、又はＥｐｈＢ４若しくはエフリンＢ２に結合し、影響を及ぼす抗体である。さまざまな実施形態では、ポリペプチド剤は、エフリンＢ２ポリペプチドに特異的に結合する可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）ポリペプチドであり、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の残基１～５２２に少なくとも９０％同一である配列、残基１～４１２に少なくとも９０％同一である配列、残基１～３１２に少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状（Ｇ）ドメイン（配列番号１のアミノ酸２９～１９７）、並びに任意選択で、システインリッチドメイン（配列番号１のアミノ酸２３９～３２１）、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号１のアミノ酸３２４～４２９）及び第２のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号１のアミノ酸４３４～５２６）などの追加のドメイン包含する配列を含みうる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸１～５３７を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸１～４２７を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸１～３２６を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１９７、２９～１９７、１～３１２、２９～１３２、１～３２１、２９～３２１、１～３２６、２９～３２６、１～４１２、２９～４１２、１～４２７、２９～４２７、１～４２９、２９～４２９、１～５２６、２９～５２６、１～５３７及び２９～５３７を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６～１９７、１６～３１２、１６～３２１、１６～３２６、１６～４１２、１６～４２７、１６～４２９、１６～５２６、及び１６～５３７を含むことになる。

さまざまな実施形態では、可溶性ポリペプチドは、例えば、Ｆｃ融合タンパク質又は他の多量体化ドメインとの融合体として発現させることによって、多量体形態で調製することができる。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を依然として保持しつつ、血清半減期の増加を付与する追加の成分をさらに含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは単量体であり、１つ又は複数のポリオキシアクリレン基（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）に共有結合している。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基（単数又は複数）に共有結合している（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＰＥＧ」とする）。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合を実質的に減少させることなく、半減期の向上を付与する第２の安定化ポリペプチドと安定的に結合している。さまざまな実施形態では、安定化ポリペプチドは、ヒト患者（又は獣医学的用途が企図されている場合には動物の患者）と免疫適合性があり、有意な生体活性をほとんど又はまったく有しないことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」とする）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」とする）からなる群より選択されるアルブミンと共有結合的又は非共有結合的に結合している。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～１９７を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３１２を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２１を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２６を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４１２を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４２７を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４２９を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５２６を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５３７を含む。

さまざまな実施形態では、対象は、過去に抗がん療法による治療に反応したが、療法を中止すると、再発した（以下「再発がん」とする）。さまざまな実施形態では、対象は、抵抗性又は難治性のがんを有する。さまざまな実施形態では、がんは、白金製剤をベースとした化学療法に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、免疫療法治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、化学療法剤による治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、又は融合分子による標的治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、低分子キナーゼ阻害剤を用いた標的治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、手術を用いた治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、幹細胞移植を用いた治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、放射線を用いた治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、例えば、免疫療法治療、白金をベースとした化学療法剤を用いた治療、腫瘍抗原特異的除去抗体を用いた治療、腫瘍抗原特異的除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子を用いた治療、低分子キナーゼ阻害剤を用いた標的治療、手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、並びに放射線を用いた治療のうちの２つ以上を含む併用療法に抵抗性である。

別の態様では、本発明は、対象のがんを治療するための併用療法で使用するための医薬品を調製する際のＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用に関する。さまざまな実施形態では、併用療法はがんの治療に対する相乗効果がある。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の転移性尿路上皮がんを治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、がんは、再発／難治性のシスプラチン不応又は不耐の尿路上皮がんである。さまざまな実施形態では、尿路上皮がんは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、尿路上皮がんは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した尿路上皮がんを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、ＮＳＣＬＣは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、ＮＳＣＬＣは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発したＮＳＣＬＣを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の肝細胞がん（ＨＣＣ）を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、ＨＣＣは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、ＨＣＣは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発したＨＣＣを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の大腸がんを治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、大腸がんは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、大腸がんは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した大腸がんを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の腎細胞がん（ＲＣＣ）を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、ＲＣＣは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、ＲＣＣは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発したＲＣＣを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、ＨＮＳＣＣは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、ＨＮＳＣＣは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発したＨＮＳＣＣを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象のカポジ肉腫（ＫＳ）を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、ＫＳは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、ＫＳは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発したＫＳを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の乳がんを治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、乳がんは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、乳がんは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した乳がんを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の中皮腫を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、中皮腫は、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、中皮腫は、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した中皮腫を有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の前立腺がんを治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、前立腺がんは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、前立腺がんは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した前立腺がんを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の膵がんを治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、膵がんは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、膵がんは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した膵がんを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の膀胱がんを治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、膀胱がんは、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、膀胱がんは、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した膀胱がんを有する。

さまざまな実施形態では、使用は、対象の白血病を治療する方法に関し、その対象に、ａ）治療有効量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチド、及びｂ）治療有効量のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。さまざまな実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１阻害剤である。さまざまな実施形態では、白血病は、白金製剤をベースとした化学療法及び／又は放射線療法を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、白血病は、チェックポイント阻害剤を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、対象は、再発した白血病を有する。

さまざまな実施形態では、方法は、免疫療法、化学療法、標的特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療、標的共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子を用いた標的治療、低分子キナーゼ阻害剤標的療法、手術、放射線療法、並びに幹細胞移植からなる群より選択される１つ又は複数の追加の抗がん療法を含む。併用療法は相乗的でありうる。併用療法は、抗がん療法の治療指数を上げることができる。

さまざまな実施形態では、追加療法は、これらに限定されないが、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＴＩＭ－３及びＢ７－Ｈ４を含むリストからの免疫チェックポイントタンパク質抗原又は当技術分野で教示された任意の免疫チェックポイントタンパク質抗原抗体に特異的に結合する抗体の投与を含む。

さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、これらに限定されないが、ニボルマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ）（ドラッグバンク（Ｄｒｕｇｂａｎｋ）０９０３５、ドラッグバンク０６１３２）、ペムブロリズマブ（メルク）（ドラッグバンク０９０３７）及びピジリズマブ（メディヴェイション）（ドラッグバンク１５３８３）からなる群より選択される。

さまざまな実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、これらに限定されないが、イピリムマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ）（ドラッグバンク０６１８６）及びトレメリムマブ（メディミューン）（ドラッグバンク１１７７１）からなる群より選択される。

図１は、上皮がんにおけるＥｐｈＢ４発現の免疫染色による評価を示す。 図２Ａは、Ｂ１６メラノーマ（左）若しくは神経膠腫ＫＲ１５８（右）をもつエフリンＢ２－ＬａｃＺマウスの腫瘍血管、又は対照としての正常な筋肉（中央）におけるエフリンＢ２発現を示す。図２Ｂは、Ｂ１６メラノーマをもつエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して腫瘍増殖が減少していることを示す。図２Ｃは、Ｂ１６メラノーマをもつエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスは、野生型マウスと比較してＣＤ３＋Ｔ細胞数が増加していることを示す。図２Ｄは、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の除去が、エフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスの腫瘍成長の減少を消失させることを示す。図２Ｅは、ＫＲ１５８を移植したエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスは腫瘍増殖が減少していることを示す。図２Ｆは、先の実験で採取した腫瘍は、野生型マウスと比較してエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスでＣＤ３＋Ｔ細胞数が増加していることを示す。図２Ｇは、ＣＤ４／ＣＤ８除去抗体を投与したマウスは、エフリンＢ２コンディショナルノックアウト及び野生型マウスがほとんど同じであることを示す。 図３は、Ｂ１６メラノーマに対するｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡの腫瘍増殖阻害効果が、ＣＤ４細胞の除去ではなく、ＣＤ８細胞の除去で消失することを示す。 図４は、ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ投与がＰＤ－Ｌ１発現を誘導することを示す。対照及びｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡを腫瘍に投与したマウスの腫瘍試料を、免疫蛍光法でＰＤ－Ｌ１の発現について分析した。膜でのＰＤ－Ｌ１の局在が見られる。 図５は、ＥｐｈＢ４－Ａｌｂ療法後のＢ１６メラノーマ腫瘍ライセートにおけるサイトカイン及びケモカインの分析を示す。 図６はＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の定量を示す。 図７は、ｓＥｐｈＢ４１０ｍｇ／ｋｇを週３回、ＰＤ－１中和抗体１００μｇを週２回、ＣＴＬＡ４抗体１００μｇを週２回、腹腔内に１０日間投与したＢ１６メラノーマ腫瘍の腫瘍体積を示す。腫瘍体積は経時的に測定する。 図８は、ベースラインでの腫瘍サイズ評価及び少なくとも１回のベースライン後瘍サイズ評価を行った対象病変について、最長径の合計におけるベースラインからの最高の変化割合を測定したウォーターフォールプロットを示す。生検で腫瘍が認められ、残存病変のみの切除では腫瘍の証拠がなく、これらの対象の全奏効は放射線学的にはＰＲ及び病理学的にはＣＲでる。 図９は、経時的な患者の反応を示すスパイダープロットである。病勢進行（赤）、病勢安定（黄）、部分奏効（薄緑）、完全奏効（濃緑）の患者が示されている。 図１０は、奏効期間を示す。下の矢印は、ＳＤをもち、残存病変部位の切除を受けた患者を示す。副腎の１つの結節のみが生存腫瘍を有した。患者は、１２＋か月以上経過した後も、病気にかかっていない状態のままで、治療を受けていない。 図１１は、全生存期間（Ａ）と無増悪生存期間（Ｂ）のカプラン・マイヤープロットを示す。無増悪生存期間の中央値は５．７ヶ月（９５％ＣＩ：２．５～１４．６）であった。 図１２は、ベースライン及び治療中の生検試料で、治療中に遺残腫瘍を有した７名の患者で測定されたＣＤ３及びＣＤ８による腫瘍細胞浸潤を示す。５人のさらなる患者は、再生検で腫瘍が有しなかった（ベースラインのデータは示されていない）。 図１３は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブを受けた、広範囲に転移した膀胱がんをもつ６３歳の女性を表す。１２週目のスキャンは、肺転移の９０％超の退縮を示す。 図１４は、新膀胱をもつ７９歳の男性を表す。治療の１５週目に大きな腫瘤は完全に消失し、患者はいまも治療中である。

定義
本明細書で特に定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者が一般的に理解する意味を持つものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学とハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野でよく使用され、よく知られているものである。本発明の方法及び技術は、一般的に、当該技術分野で周知の従来の方法にしたがって行われ、特に示さない限り、本明細書を通して引用及び議論されているさまざまな一般的な文献及びより具体的な文献に記載されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）を参照されたい。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野で一般的に遂行されているように、又は本明細書に記載されているように行われる。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、及び医薬品及び創薬化学に関連して使用される命名法、並びに実験室での手順及び技術は、当技術分野でよく使用され、よく知られているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤、及び送達、並びに対象の治療に使用される。

本明細書で使用される場合、「増殖性疾患」は、腫瘍疾患（良性若しくはがん性を含む）及び／又はいずれの転移も含む。増殖性疾患としては、過形成、線維症（特に肺線維症であるが、腎線維症などの他のタイプの線維症も含む）、血管新生、乾癬、アテローム性動脈硬化及び血管形成術後の狭窄又は再狭窄など血管の平滑筋増殖などの過剰増殖状態が挙げられうる。さまざまな実施形態では、増殖性疾患はがんである。さまざまな実施形態では、増殖性疾患は非がん性疾患である。さまざまな実施形態では、増殖性疾患は良性又は悪性の腫瘍である。

本明細書で使用すされる「腫瘍」という用語は、悪性であれ、良性であれ、すべての新生物的な細胞の成長及び増殖、並びにすべての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。

「原発性腫瘍」という用語は、悪性であれ、良性であれ、すべての新生物細胞の成長及び増殖、並びに細胞の自律的で制御不能な成長が開始された解剖学的部位、例えば、元のがん性腫瘍の器官に位置するすべての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。原発性腫瘍には転移は含まれない。

本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、元のがん性腫瘍の器官とは直接つながっていない器官又は身体の一部でのがん性腫瘍の成長を指す。転移は、元のがん性腫瘍の器官（例えば、原発腫瘍を含有する器官）に直接接続つながっていない器官又は身体の一部に検出不可能な量のがん性細胞が存在する微小転移を包含することが理解されるであろう。転移はまた、元の腫瘍部位（例えば、原発腫瘍部位）からのがん細胞の離脱や、身体の他の部分へのがん細胞の遊走及び／又は浸潤など、プロセスのいくつかの段階として定義することもできる。

本発明の方法による治療の対象の腫瘍としては、固形腫瘍、例えば、癌腫、神経膠腫、メラノーマ、肉腫などが挙げられる。乳がんは特に関心が高い。癌腫としては、例えば前立腺、肺などのさまざまな腺がん、副腎皮質がん、肝細胞がん、腎細胞がん、卵巣がん、上皮内がん、乳管がん、乳がん、基底細胞がん、扁平上皮がん、移行上皮癌、大腸がん、鼻咽腔がん、多包性嚢胞状腎細胞がん、燕麦細胞がん、大細胞肺がん、小細胞肺がんなどが挙げられる。がん腫は、前立腺、膵臓、結腸、脳（通常は二次転移（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）として）、肺、***、皮膚などに見られうる。軟部組織の腫瘍と称されるもの包含されるのは、線維芽細胞、筋線維芽細胞、組織球、血管細胞／内皮細胞及び神経鞘細胞に由来する新生物である。結合組織の腫瘍としては、肉腫、組織球腫、線維腫、骨格性軟骨肉腫、骨外性粘液型軟骨肉腫、明細胞肉腫、線維肉腫などが挙げられる。血液のがんとしては、白血病及びリンパ腫、例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などが挙げられる。

「抵抗性又は難治性のがん」は、例えば、化学療法、手術、放射線療法、幹細胞移植、及び免疫療法を含むこれまでの抗がん療法に反応しない腫瘍細胞又はがんを指す。腫瘍細胞は、治療開始時に抵抗性又は難治性である可能性もあり、治療中に抵抗性又は難治性になることもある。難治性腫瘍細胞には、治療開始時に反応しない腫瘍や、初期に短期間反応するものの、治療に反応しない腫瘍が含まれる。難治性腫瘍細胞には、抗がん療法による治療には反応するが、それに続く療法には不応の腫瘍も含まれる。本発明では、難治性腫瘍細胞はまた、抗がん治療による治療によって阻害されたように見えるが、治療が中止された最大５年後、時には最大１０年後又はそれより後に再発する腫瘍も包含する。抗がん治療は、化学療法剤単独、放射線単独、標的療法単独、手術単独、又はそれらの組み合わせを用いることができる。説明を容易にし、限定しないために、難治性腫瘍細胞は抵抗性腫瘍細胞と交換可能であることが理解されるであろう。

本明細書で使用される場合、「治療」とは、有益又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明では、有益な又は所望の臨床結果としては、１つ又は複数の症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の拡大（例えば、転移、例えば、肺又はリンパ節への転移）を予防する、又は遅らせること、疾患の再発を予防する、又は遅らせること、疾患の進行を安定させる、遅らせる、又は遅延させること、疾患の状態の改善、寛解（部分寛解でも、全体寛解でも）、及び生活の質を向上させることのうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。また、「治療」には、増殖性疾患の病理学的な結果の軽減も包含される。本発明の方法は、治療のこれら側面のいずれか１つ又は複数を企図する。

本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、その症状の１つ又は複数を改善、緩和、軽減、及び／又は遅延など、特定の障害、病的状態又は疾患を治療するのに十分な化合物又は組成物の量を指す。ＮＨＬ及び他の癌又は他の望ましくない細胞増殖に関連して、有効量は、以下に十分な量を含む。（ｉ）癌細胞の数を減らすこと、（ｉｉ）腫瘍サイズを小さくすること、（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害する、遅延させる、ある程度遅らせる、好ましくは止めること、（ｉｖ）腫瘍の転移を抑制する（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは止める）こと、（ｖ）腫瘍の成長を抑制すること、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／若しくは再発を予防又は遅らせること、並びに／又は（ｖｉｉ）がんに関連する１つ若しくは複数の症状をある程度緩和する。有効量は１つ又は複数の投与で投与することができる。

「アジュバント設定」とは、対象が増殖性疾患、特にがんの既往歴を有し、これらに限定されないが、手術（外科的切除など）、放射線療法、及び化学療法を含む治療法に対して、一般的に（必ずしもそうではないが）反応してきた臨床設定を指す。しかし、増殖性疾患（がんなど）の既往歴があるので、それらの被験者は疾患を発症するリスクがあるとみなされる。「アジュバント設定」での治療又は投与とは、そのあとの治療様式を指す。リスクの程度（すなわち、アジュバント設定における対象が「高リスク」又は「低リスク」と考えられるとき）は、いくつかの要因、最も普通には最初の治療時の疾患の程度に依存する。

「相乗効果」という表現は、有効成分を一緒に使用したときに生じる効果が、その有効成分を別々に使用したときに生じる効果の合計よりも大きいことを指す。

「投与する」又は「投与させる（ｃａｓｕｅ ｔｏ ｂｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」という表現は、医療従事者（例えば、医師）又は対象の医療を管理する者によって行われる、問題となっている薬剤（単数若しくは複数）／化合物（単数若しくは複数）の対象への投与を制御及び／又は許可する行為をいう。投与させることは、診断及び／又は適切な治療レジメンの決定、及び／又は対象に特定の薬剤（単数若しくは複数）／化合物を処方することを含みうる。そのような処方としては、例えば、処方箋を書くこと、医療記録に注釈を付けることなどが挙げられる。投与が本明細書に記載されているとき、「投与させること」も意図されている。

「患者」、「対象」、及び「対象」という用語は、交換可能に使用することができ、哺乳類、好ましくはヒト又は非ヒト霊長類であるが、家畜化された哺乳類（例えば、イヌ又はネコ）、実験哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、及び農業用哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）を指しうる。さまざまな実施形態では、患者は、病院、精神科医療施設において、外来患者として、又は他の臨床状況において、医師又は他の医療従事者のケアを受けているヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年期男性、青年期女性、男児、女児）であり得る。

本明細書で使用される場合、本発明の融合分子及び１つ又は複数の他の治療薬に関連する「共投与」、「共投与される」及び「と併用」という用語は、以下を意味し、参照し、含むように意図されている。本発明の融合分子及び治療薬（単数又は複数）のそのような組み合わせを、治療を必要とする対象に同時に投与することであって、そのような成分が一緒に、前記成分を実質的に同時に、前記対象に放出する単一の剤形に製剤化されている場合；本発明の融合分子及び治療薬（単数又は複数）のそのような組み合わせを、治療を必要とする対象に実質的に同時に投与することであって、そのような成分が、前記対象によって実質的に同時に摂取され、前記成分が実質的に同時に、前記対象に放出される別個の剤形に、互いに別々に製剤化される場合；本発明の融合分子及び治療薬（単数又は複数）のそのような組み合わせを、治療を必要とする対象に順次投与することであって、そのような成分が互いに別々に別個の剤形に製剤化され、各投与間にかなりの時間間隔をおいて前記対象に連続して服用され、前記成分が実質的に異なる時間に前記対象に放出される場合；並びに本発明の融合分子及び治療薬（単数又は複数）のそのような組み合わせを、治療を必要とする対象に順次投与することであって、そのような成分が、制御された方法で前記成分を放出する単一の剤形に一緒に製剤化され、前記対象に同時及び／又は異なる時間に並行して、連続して、及び／又は重複して放出され、各部分が同じ又は異なる経路のいずれかで投与されうる場合。

本明細書で使用される場合、「免疫療法」という用語は、これらに限定されないが、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療、抗体－薬物複合体を使用した治療、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、及びＶＩＳＴＡなどの共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療、ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を使用した治療、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－γなどの生体応答調節物質の投与を伴う治療、シプリューセル－Ｔなどの治療ワクチンを使用した治療、樹状細胞ワクチン又は腫瘍抗原ペプチドワクチンを使用した治療、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を使用した治療、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を使用した治療、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用した治療、養子移入抗腫瘍Ｔ細胞（生体外増殖及び／又はＴＣＲランスジェニック）を使用した治療、ＴＡＬＬ－１０４細胞を使用した治療、並びにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストＣｐＧやイミキモドなどの免疫賦活剤を用いた治療を含むがん治療を指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用されてアミノ酸残基のポリマーを指す。ある特定の実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、アルファ炭素がペプチド結合を通して連結しているアミノ酸の鎖である。したがって、鎖の一端にある末端アミノ酸（アミノ末端）は、遊離のアミノ基を有し、一方で、鎖の他端にある末端アミノ酸（カルボキシ末端）は、遊離のカルボキシル基を有する。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」（Ｎ末端と略す）という用語は、ペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸の遊離α－アミノ基、又はペプチド内の他の場所にあるアミノ酸のα－アミノ基（ペプチド結合に参加しているときはイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」とは、ペプチドのカルボキシ末端にある遊離カルボキシル基、又はペプチド内の他の場所にあるアミノ酸のカルボキシル基を意味する。また、ペプチドには、これに限定されないが、アミド結合ではなくエーテルで結合したアミノ酸などのペプチド模倣物を含む本質的にいずれのポリアミノ酸も含まれる。

本明細書で使用される「組換えポリペプチド」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチドなど、組換え手段によって調製、発現、作成、派生、又は単離された融合分子を含むすべてのポリペプチドを含むことを意図している。

本開示のポリペプチドには、任意の方法及び任意の理由で、例えば、（１）タンパク質分解の影響を受けにくくする、（２）酸化の影響を受けにくくする、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変える、（４）結合親和性を変える、及び（５）他の物理化学的又は機能的特性を付与又は変更するために改変されたポリペプチドが含まれる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（単数又は複数）の外側のポリペプチドの部分）において可能である。「保存的アミノ酸置換」は、ポリペプチドにおける、あるアミノ酸の機能的に類似したアミノ酸での置換を指す。以下の６つのグループは、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む。
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）
アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）
アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）
アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）

本明細書で使用される「ポリペプチド断片」及び「切断ポリペプチド」という用語は、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００又は少なくとも１０００アミノ酸の長さであることができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、例えば、最大で１０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４５０、最大で４００、最大で３５０、最大で３００、最大で２５０、最大で２００、最大で１５０、最大で１００、最大で５０、最大で２５、最大で１０、又は最大で５アミノ酸の長さであることもできる。断片は、その両端のいずれか又は両方において、１つ又は複数の追加のアミノ酸、例えば、異なる天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸の配列（例えば、Ｆｃ又はロイシンジッパードメイン）又は人工的なアミノ酸の配列（例えば、人工的なリンカー配列）をさらに含むことができる。

本明細書で使用される「ポリペプチドバリアント」及び「ポリペプチド変異体」という用語は、別のポリペプチド配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が、アミノ酸配列に挿入、欠失及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、挿入、欠失、又は置換されるアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０又は少なくとも５００アミノ酸の長さであることができる。本開示のバリアントには、融合タンパク質が含まれる。

本明細書で使用される「可溶性ポリペプチド」という用語は、単に、ポリペプチドが、生理食塩水中でのポリペプチドの溶解性を損なうのに十分な膜貫通ドメイン又は膜貫通ドメインの一部分を含有しないことを示す。

「医薬組成物」とは、動物における医薬品用途に適した組成物を指す。医薬組成物は、薬理学的に有効な量の活性剤と、薬学的に許容される担体とを含む。「薬理学的に有効な量」とは、意図した薬理学的結果をもたらすのに有効な薬剤の量を指す。「薬学的に許容される担体又は賦形剤」とは、一般的に安全で、毒性がなく、望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、ヒトの医薬品用途だけでなく獣医用途にも許容される賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物の場合は気体であり、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロースの５％水溶液、及び油／水エマルション又は水／油エマルションなどのエマルション、並びにさまざまなタイプの湿潤剤及び／又はアジュバントなどの標準的な医薬担体、ビヒクル、緩衝剤、及び賦形剤のいずれかを指す。好適な医薬用担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄ．２００５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎに記載されている。「薬学的に許容される塩」は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）、アンモニア又は有機アミンの塩を含む、医薬品用途の化合物に製剤化できる塩である。

本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態は、「からなる」及び／又は「から本質的になる」態様及び実施形態を包含することが理解される。

本明細書において値やパラメータを「約」と表記することは、その値やパラメータ自体に向けられたばらつきを包含（記述）する。例えば、「約Ｘ」という記述は、「Ｘ」に関する記述を含む。

本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形の「ａ」、「ｏｒ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照語を含む。

開示を実施するための形態
本開示の方法は、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤を、単剤療法として、又はＰＤ－１阻害剤、若しくは免疫チェックポイント分子に対する他のアンタゴニスト抗体若しくは遮断抗体と併用して投与することによって、原発腫瘍増殖又は原発がんの形成又はがんの転移を治療、軽減又は予防することを含む。

ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害剤
１型受容体チロシンキナーゼであるＥｐｈＢ４及び膜局在リガンドであるエフリンＢ２は、双方向のシグナル伝達（受容体を発現している細胞ではフォワード、リガンドを発現している細胞ではリバースシグナル）を誘導する。ＥｐｈＢ４は受容体チロシンキナーゼの最大のファミリーに属し、エフリンＢ２リガンドと相互作用すると、神経細胞の遊走、骨の再構築、血管新生、癌の進行及び転移を制御することが報告されている（Ｐａｓｑｕａｌｅ ＥＢ，Ｃｅｌｌ，１３３：３８－５２，２００８）。ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２発現の発現は、成人の正常組織の大部分では、生後発育でもダウンレギュレートされているが、ＥｐｈＢ４は、肺がん、膀胱がん、頭頸部がん及び膵がんを含む複数の上皮がんで過剰発現している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＢＤ，ｅｔ ｅｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３２：２０２－６，２０１４）。変異体Ｋｒａｓ及びＰＴＥＮの欠失を含むがん遺伝子がＥｐｈＢ４の発現を誘導する。ＥｐｈＢ４のノックダウンはアポトーシスによる細胞死につながるので、ＥｐｈＢ４の発現はステージ、グレード、生存率と相関する。リガンドであるエフリンＢ２の過剰発現及び不良転帰との相関は、いくつかのがんの種類で報告されている。ＩＣＴは腫瘍血管（及び腫瘍）のエフリンＢ２を増加させ、エフリンＢ２が高いと、免疫細胞の動員を妨げ、したがって治療抵抗性になる。

ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用の阻害は、インビトロ及び細胞外での腫瘍細胞の増殖に対する直接的な阻害効果を有する。ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤は、本発明者らによって以前に報告されている（例えば、米国特許第７，３８１，４１０号、米国特許第７，８６２，８１６号、米国特許第７，９７７，４６３号、米国特許第８，０６３，１８３号、米国特許第８，２７３，８５８号、米国特許第８，９７５，３７７号、米国特許第８，９８１，０６２号、米国特許第９，５３３，０２６号を参照されたい。各特許はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、Ｃ末端にアルブミンを融合した可溶性ＥｐｈＢ４細胞外ドメインから構成され、１２３．３ｋＤａのシームレスな単一タンパク質として発現される完全ヒト融合タンパク質である。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡはエフリンＢ２に特異的に結合する。腫瘍モデルでのｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの予備的研究は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の腫瘍への遊走の増加を示す。これに伴って、腫瘍血管でＩＣＡＭ－１が誘導された。ＩＣＡＭ－１は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の内皮への接着を促進し、それに続いて腫瘍への細胞の遊出を促進するインテグリンである。また、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、腫瘍細胞及び腫瘍血管においてＥｐｈＢ－エフリンＢ２相互作用を遮断することによってＰＩ３Ｋシグナル伝達のダウンレギュレーションを示す。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ＰＩ３Ｋ経路をダウンレギュレーションすることによって、免疫細胞の腫瘍への輸送を促進し、腫瘍細胞の生存シグナルを阻害する。

ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２を標的とすることは、治験の試練を生き残ってきた治療戦略の代表的なものである。おそらく正常組織での発現レベルが低いので、複数の治験において、最小限の毒性で安全であることが示されている（Ａ．Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙ ＢＧ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６９，２０１６）。がんに関連する免疫応答におけるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用を示唆する直接的な証拠は不足しているものの、複数の報告が、Ｅｐｈ／エフリン遺伝子ファミリーメンバーが動脈硬化や創傷治癒などの炎症モデルでの免疫細胞プロセスを調節することを実証している（Ｂｒａｕｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，３１：２９７－３０５，２０１１、Ｐｏｉｔｚ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６８：６４８－５６，２０１５、Ｙｕ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：１０６－１４，２００３、Ｆｕｎｋ ＳＤ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，３２：６８６－９５，２０１２）。また、Ｅｐｈ－エフリン相互作用は、単球の血管壁への接着、経内皮遊走、Ｔ細胞の走化性、活性化、増殖及びアポトーシス、並びに骨髄類洞血管からの造血細胞の動員などを制御することが報告されている。

本発明のさまざまな実施形態では、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤は、ＥｐｈＢ４タンパク質若しくはエフリンＢ２タンパク質の単量体リガンド結合部分、又はＥｐｈＢ４若しくはエフリンＢ２に結合し、影響を及ぼす抗体である。さまざまな実施形態では、ポリペプチド剤は、エフリンＢ２ポリペプチドに特異的に結合する可溶性ＥｐｈＢ４（ｓＥｐｈＢ４）ポリペプチドであり、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の残基１～５２２に少なくとも９０％同一、残基１～４１２に少なくとも９０％同一、及び残基１～３１２に少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状（Ｇ）ドメイン（配列番号１のアミノ酸２９～１９７）を包含する配列、並びに任意選択で、システインリッチドメイン（配列番号１のアミノ酸２３９～３２１）、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号１のアミノ酸３２４～４２９）及び第２のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号１のアミノ酸４３４～５２６）などの追加のドメインを含みうる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～５３７を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～４２７を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～３２６を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１９７、２９～１９７、１～３１２、２９～１３２、１～３２１、２９～３２１、１～３２６、２９～３２６、１～４１２、２９～４１２、１～４２７、２９～４２７、１～４２９、２９～４２９、１～５２６、２９～５２６、１～５３７及び２９～５３７を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６～１９７、１６～３１２、１６～３２１、１６～３２６、１６～４１２、１６～４２７、１６～４２９、１６～５２６を含むことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を保持しつつ、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、任意選択で９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むものであることができる。さまざまな実施形態では、配列番号１に示される配列からのアミノ酸配列のいずれの変化も、特に表面ループ領域における、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸の保存的変化又は欠失である。

さまざまな実施形態では、可溶性ポリペプチドは、例えば、Ｆｃ融合タンパク質又は他の多量体化ドメインとの融合体として発現させることによって、多量体形態で調製することができる。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合活性を依然として保持しつつ、血清半減期の増加を付与する追加の成分をさらに含むであろう。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは単量体であり、１つ又は複数のポリオキシアクリレン基（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）に共有結合している。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、単一のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に共有結合している（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＰＥＧ」とする）。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、２つ、３つ、又はそれより多いＰＥＧ基に共有結合している。

さまざまな実施形態では、１つ又は複数のＰＥＧは、約１ｋＤａ～約１００ｋＤａ、約１０～約６０ｋＤａ、約１０～約４０ｋＤａの範囲の分子量を有しうる。ＰＥＧ基は、直鎖ＰＥＧであってもよく、分岐したＰＥＧであってもよい。さまざまな実施形態では、可溶性で単量体のｓＥｐｈＢ４複合体は、約１０～約４０ｋＤａ（モノＰＥＧ化ＥｐｈＢ４）、又は約１５～３０ｋＤａの１つのＰＥＧ基に、好ましくはｓＥｐｈＢ４リジンのｓ－アミノ基又はＮ末端アミノ基を介して共有結合したｓＥｐｈＢ４ポリペプチドを含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４は、ｓＥｐｈＢ４リジンのｓ－アミノ基及びＮ末端アミノ基からなる群のうちの１つのアミノ基でランダムにＰＥＧ化されている。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合を実質的に減少させることなく、半減期の向上を付与する第２の安定化ポリペプチドと安定的に結合している。さまざまな実施形態では、安定化ポリペプチドは、ヒト患者（又は獣医学的用途が企図されている場合には動物の患者）と免疫適合性があり、有意な生体活性をほとんど又はまったく有しないことになる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」とする）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（以下「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」とする）からなる群より選択されるアルブミンと共有結合的又は非共有結合的に結合している。

さまざまな実施形態では、共有結合は、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドをヒト血清アルブミンとの共翻訳融合物として発現させることによって達成することができる。アルブミン配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はｓＥｐｈＢ４ポリペプチドの非破壊的な内部位置で融合することができる。ｓＥｐｈＢ４の露出したループは、アルブミン配列の挿入に適した位置であることになる。アルブミンはまた、例えば、化学的架橋によってｓＥｐｈＢ４ポリペプチドに翻訳後に結合することもできる。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４ポリペプチドは、複数のアルブミンポリペプチドと安定的に結合することもできる。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合体は、エフリンＢ２とＥｐｈＢ４の間の相互作用、エフリンＢ２若しくはＥｐｈＢ４のクラスター化、エフリンＢ２若しくはＥｐｈＢ４のリン酸化、又はそれらの組み合わせを阻害する。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ融合体は、未修飾の野生型ポリペプチドと比較して、生体内で安定性が増している。

さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～１９７を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３１２を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２１を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２６を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４１２を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４２７を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～４２９を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５２６を含む。さまざまな実施形態では、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５３７を含む。

免疫チェックポイント阻害剤
例えば、ＳＩＲＰ（マクロファージ、単球、樹状細胞に発現）、ＣＤ４７（腫瘍細胞及び他の細胞型に高発現）、ＶＩＳＴＡ（単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞に発現）、ＣＤ１５２（活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞に発現）、ＣＤ２７９（腫瘍浸潤リンパ球に発現、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４とＣＤ８の両方）、制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞、不応答性Ｔ細胞、単球、樹状細胞に発現）、ＣＤ２７４（Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、膵臓島細胞に発現）、並びにＣＤ２２３（活性化Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、不応答性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及び形質細胞様樹状細胞に発現）を含む、数多くの免疫チェックポイントタンパク質抗原がさまざまな免疫細胞に発現していることが報告されている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１２：２５２－２６４，２０１２を参照）。免疫チェックポイント蛋白質と明らかになっている抗原に結合する抗体は、当業者に公知である。例えば、さまざまな抗ＣＤ２７６抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第２０１２０２９４７９６号（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、さまざまな抗ＣＤ２７２抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第２０１４００１７２５５号（Ｍａｔａｒａｚａ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、さまざまな抗ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第２０１３０１３６７４９号（Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、さまざまな抗ＬＡＧ－３／ＣＤ２２３抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第２０１１０１５０８９２号（Ｔｈｕｄｉｕｍ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、さまざまな抗ＣＤ２７９（ＰＤ－１）抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第７，４８８，８０２号（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、さまざまな抗ＰＤ－Ｌ１抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第２０１３０１２２０１４号（Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、さまざまな抗ＴＩＭ－３抗体が当該技術分野で報告され（例えば米国特許第２０１４００４４７２８号（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）、並びにさまざまな抗Ｂ７－Ｈ４抗体が当該技術分野で報告されている（例えば米国特許第２０１１００８５９７０号（Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ）及びその明細書に引用されている参考文献を参照）。これらの参考文献は各々、その中で教示されている特定の抗体及び配列について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

さまざまな実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質抗原は、これらに限定されないが、ＰＤ１及びＰＤＬ－１、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＣＤ４０、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＯＸ－４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＴＩＭ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４及びＶＩＳＴＡからなる群より選択される。

免疫チェックポイントＰＤ－１及びＣＴＬＡ阻害剤は、インターフェロンガンマシグネチャーを発現し、腫瘍浸潤免疫細胞が豊富であり、ＰＤ－Ｌ１を発現するいくつかのがんに効果がある。腫瘍血管は免疫細胞の腫瘍への遊出を制御しているため、腫瘍血管の調節は腫瘍環境を変える手段を提供しうる。

ＰＤ－１受容体－リガンド相互作用は、腫瘍によって乗っ取られて免疫制御を抑制する主要な経路である。健常な状況下で活性化Ｔ細胞の細胞表面に発現するＰＤ－１の正常な機能は、自己免疫反応を含む望ましくないか又は過剰な免疫反応をダウンモジュレートすることである。ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、恒常的に発現されるか、又は非造血組織を含むさまざまな細胞型及び種々の腫瘍において誘導される可能性がある。いずれかのＰＤ－１リガンドのＰＤ－１への結合は、Ｔ細胞受容体を通したＴ細胞活性化を阻害する。ＰＤ－１はメラノーマ（ＭＥＬ）の対象の腫瘍特異的Ｔ細胞増殖を制御することが示唆されている。これは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路が腫瘍免疫回避で重要な役割を果たし、治療的介入のための魅力的な標的と考えるべきであることを示唆する。

ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））は、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との相互作用を直接遮断するように設計された、ＩｇＧ４／カッパアイソタイプの強力で高選択的なヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０１６年８月５日、キイトルーダ（登録商標）を、進行型の頭頸部がんの一部の患者の治療に承認した。承認は、化学療法による標準治療にもかかわらず進行が続いている再発又は転移頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）の患者を対象としている。キイトルーダ（登録商標）は、切除不能又は転移メラノーマで、イピルムマブ及びＢＲＡＦ Ｖ６００変異陽性の場合はＢＲＡＦ阻害剤の後に、病気が進行した患者の治療に米国で最近承認された。

ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））は、チェックポイント阻害剤として機能するヒトＩｇＧ４抗ＰＤ－１モノクローナル抗体であり、がんを攻撃するのを妨げていたと思われるシグナルを遮断し、よって免疫系ががんを排除することを可能にする。オプジーボ（登録商標）は、手術不能又は転移メラノーマの１次治療として、がんがＢＲＡＦに変異を有しない場合は、イピリムマブによる治療後の２次治療としてイピリムマブと併用し、がんがＢＲＡＦに変異を有する場合は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用し、扁平上皮非小細胞肺がんの２次治療として、腎細胞がんの２次治療として使用される。

さまざまな実施形態では、併用療法の方法で使用されるＰＤ－１阻害剤は、これらに限定されないが、ニボルマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ）（ドラッグバンク０９０３５、ドラッグバンク０６１３２）、ペムブロリズマブ（メルク）（ドラッグバンク０９０３７）及びピジリズマブ（メディヴェイション）（ドラッグバンク１５３８３）からなる群より選択される。

さまざまな実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、これらに限定されないが、イピリムマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ）（ドラッグバンク０６１８６）及びトレメリムマブ（メディミューン）（ドラッグバンク１１７７１）からなる群より選択される。

がん
尿路上皮がんは発生率が１年に８０，４７０症例であり、１年に１７，６７０名が死亡し、依然として米国において重大な健康上の課題である（Ｓｉｅｇｅｌ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１９；６９（１）：７－３４，２０１９）。未治療の場合、患者の生存期間の中央値は～４．５か月である。細胞障害性化学療法で治療した場合、生存期間は～７．５か月に伸び、ＯＲＲは～１５％、ＰＦＳは３～３．５か月である。しかし、細胞障害性化学療法はかなりの毒性をもたらす。併用細胞障害性化学療法は、生存率の向上なしに奏効率をわずかに上げるが、毒性はさらにひどくなる。結果的に、免疫療法がない頃は、治療歴のある転移性尿路上皮患者に対して、併用療法よりも単剤療法が好まれていた。米国で最もよく使用される単剤としては、ゲムシタビン、パクリタキセル、及びドセタキセルが挙げられる。

転移した状況では、フロントライン設定の標準的な治療法は２０００年以降変わっておらず、シスプラチンをベースとした化学療法のままである。ビンフルニン（ＯＲＲ１８％、ＯＳ６．６か月）、ゲムシタビン（ＯＲＲ１１％、ＯＳ８．７か月）、ペメトレキセド（ＯＲＲ２８％、ＯＳ９．６か月）、パクリタキセル（ＯＲＲ１０％、ＯＳ７．２か月）などの数多くの単剤治療法及びパクリタキセルとメトトレキサート（ＯＲＲ３２％、ＯＳ５か月）若しくはゲムシタビン（ＯＲＲ４７％、ＯＳ７．５か月）又はドセタキセルとイホスファミド（ＯＲＲ２５％、ＯＳ４か月）などの併用レジメンが、第１選択療法失敗後に検討されている。安全性と有効性に基づいて、最もよく使用される薬剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、及びカルボプラチンである。奏効率は～１０～１５％、全生存期間は６～９か月である。併用化学療法は、より高い奏効率、より高い毒性という結果になったが、生存率の向上はなかった（Ｒａｇｇｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２７（１）：４９－６１，２０１６）。抗ＰＤ１／ＰＤＬ１抗体が承認されて初めて、転移性尿路上皮がんの治療歴のある患者に対して、延命効果を伴う、より持続性のある第２の選択肢が利用可能になった。予想生存期間中央値は最大１０．３カ月、奏効率は２１．１％であり、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブを含む５つの異なる薬剤が実際の臨床現場で使われている。ペンブロリズマブは、この患者集団に対して承認されている。少数の患者にのみ効果があり、この患者集団では、全生存期間（ＯＳ）の中央値は１０．３カ月（９５％ＣＩ、８～１１．８）、全無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値は２．１カ月（９５％ＣＩ、２．０～２．２）、全奏功率（ＯＲＲ）は２１．１％（９５％ＣＩ、１６．４～２６．５）、完全奏功率は７％である。

肝細胞がん（ＨＣＣ）は、世界の特定の地域で最も頻度の高いがんであり、全世界で５番目に多いがんである。世界的に見ると、男性のがんによる死因の第２位であり、女性のがんによる死因の第６位である（例えば、Ｐａｒｋｉｎ Ｄ．Ｍ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：５３３－４３，２００１を参照）。ＨＣＣは臨床症状の経過の遅い段階で診断されることが多いので、根治手術の適応となるのは１０～１５％の患者のみである。ＨＣＣ患者の大部分では、全身化学療法又は支持療法が治療選択肢の中心である。ＨＣＣは一般に治療抵抗性が高く、ほとんどの化学療法剤の効果は限定的で、患者の生存を改善することはできていない（例えば、Ｇｉｓｈ Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２５：３０６９－７５，２００７、Ｒａｍａｎａｔｈａｎ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２４：４０１０，２００６を参照）。Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １（ＰＤ－１）抗体であるニボルマブ（オプジーボ（登録商標））を評価した最近の研究では、約１０～２０％の奏効率が示された。奏効持続期間は、ＣＲが１４～１７＋か月、ＰＲが＜１～８＋か月、病勢安定（ＳＤ）が１．５～１７＋か月であった。６か月時の全生存（ＯＳ）率は７２％である。ニボルマブは、管理可能なＡＥプロファイルを示し、すべての投与量レベル及びＨＣＣコホートにわたって効果が長く続き、６か月ＯＳ率も良好であった。

頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）は、上部気道消化管（ＵＡＤＴ）を侵すがんのほぼ９０％を占める。２００５年に米国では、口腔、咽頭及び喉頭のがんは、発症がんの約３％及びがん死亡の２％を占めると予想されている。世界では毎年、約５０万の新たに診断された症例がある。男性は、女性に比べて２倍を超えて多く罹患する。これらのがんの半分は口腔を侵す。残りは、喉頭と咽頭に等しく分かれる。数多くの治験が、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）を含むヒトのがんでの免疫療法の有益性を検証している。客観的奏効率は６～２０％であり（Ｓｚｔｕｒｚ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄ，１５：１１０，２０１７、Ｆｅｒｒｉｓ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ，８１：４５－５１，２０１８、Ｐｏｓｔｏｗ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３３：１９７４－８２，２０１５、Ｃｈｏｗ ＬＱＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３４：３８３８－４５，２０１６、Ｓｉｕ ＬＬ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ ２０１８）、圧倒的多数の患者は、免疫療法に対して生来の抵抗性又は適応抵抗性のいずれかを示す。また、より多くの免疫チェックポイント阻害剤を単純に組み合わせる試みも、患者への毒性が増加し、追加の有益性を欠くことから、期待外れであることもわかっている（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２２０５３３３）。同所性ＨＮＳＣＣマウスモデルにおいて、我々は最近、抗ＰＤＬ１抗体と放射線療法（ＲＴ）の併用治療後でも、腫瘍の再増殖が起こることを示した（７、８）。（Ｏｗｅｉｄａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１８、Ｍｅｓｓｅｎｈｅｉｍｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２３：６１６５－７７，２０１７）。

放射線療法は、依然として、局所的に進行したＨＮＳＣＣ患者の決定的な管理における標準的な治療法であり、免疫療法のアジュバントとして作用できるが、ＲＴに反応して増える望ましくない効果がいくつか存在し、その結果免疫療法剤の有効性を損なう。ＲＴは、後（修復）期におけるＴｒｅｇなどの免疫抑制集団の蓄積を克服することができない（７）。したがって、ＲＴと相乗効果を発揮し、その負の効果を弱める他の治療を見つけることは、有害な副作用、治療抵抗性、及び腫瘍の再増殖を克服するために決定的に重要である。

ＨＮＳＣＣの５年生存率は低く、ここ数十年改善されてきていない。さらに、この疾患の患者は、容姿の変貌、発話、嚥下及び呼吸の問題を含む重度の病的状態を経験する。また、診断が後期であること及び再発しやすいことも、これら患者の転帰を改善するための努力を妨害する難題である。ペムブロリズマブは、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との相互作用を直接遮断するように設計された、強力で高選択的なＩｇＧ４／カッパアイソタイプのヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。食品医薬品局（ＦＤＡ）は２０１６年８月５日、進行型の頭頸部がんの一部の患者の治療にペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））を承認した。その承認は、化学療法による標準治療にもかかわらず進行が続く再発又は転移頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）の患者を対象とする。ＦＤＡの承認概要によると、２８名（１６％）の患者がペンブロリズマブによる治療後に腫瘍反応を経験した。それらの患者のうち２３名（８２％）では、腫瘍反応が６か月以上持続し、数名では２年を超えて持続している。典型的には、腫瘍がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性であるＨＮＳＣＣの患者は、腫瘍がＨＰＶ陰性である患者よりも、化学療法による治療後の転帰が良好である。ＦＤＡの承認概要によると、ＨＰＶ陽性の腫瘍をもつ患者でも、ＨＰＶ陰性の腫瘍をもつ患者でも奏効が見られた（それぞれ２４％と１６％）。

非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、肺がんの最も一般的なタイプである。扁平上皮細胞がん、腺がん、及び大細胞がんはすべてＮＳＣＬＣのサブタイプである。ＮＳＣＬＣは、肺がん全体の約８５％を占める。がん分類クラスとして、ＮＳＣＬＣは、小細胞がんに比較して、化学療法に比較的感受性が低い。可能であれば、主に根治目的の外科的切除によって治療されるが、術前（ネオアジュバント化学療法）と術後（アジュバント化学療法）の両方で化学療法が使用されることが増えてきている。２０１５年１０月２日、ＦＤＡは、腫瘍がＰＤ－Ｌ１を発現し、他の化学療法剤による治療に不応の患者の転移非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療のために、ペムブロリズマブを承認した。２０１６年１０月、ペムブロリズマブは、がんがＰＤＬ１を過剰発現し、がんにＥＧＦＲ又はＡＬＫの変異がない場合に、ＮＳＣＬＣの治療において第１選択で使用できる最初の免疫療法となった。化学療法が既に施行されている場合、ペムブロリズマブを２次治療として使用できるが、がんにＥＧＦＲ又はＡＬＫの変異がある場合は、それらの変異を標的とする薬剤を最初に使用すべきである。ＰＤＬ１の評価は、有効であることが認められ、かつ承認されているコンパニオン診断薬を用いて行われなければならない。Ｋｅｙｎｏｔｅ－００１試験（ＮＴＣ０１２９５８２７）では、進行非小細胞肺がん患者において、ペムブロリズマブによるｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １（ＰＤ－１）阻害の有効性と安全性が評価された。すべての患者で、客観的奏効率は１９．４％で、奏効継続期間の中央値は１２．５カ月であった。無増悪生存期間の中央値は３．７カ月、全生存期間の中央値は１２．０カ月であった。少なくとも５０％の腫瘍細胞でのＰＤ－Ｌ１発現が、トレーニング（ｔｒａｉｎｉｎｇ）群からカットオフとして選択された。検証群において割合スコアが少なくとも５０％の患者で、奏効率は４５．２％であった。割合スコアが少なくとも５０％の患者で、無増悪生存期間の中央値は６．３か月であった。全生存期間の中央値は到達されなかった。少なくとも５０％の腫瘍細胞でのＰＤ－Ｌ１発現は、ペムブロリズマブの有効性の向上と相関した（Ｇａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７２：２０１８－２０２８，２０１５）。

前立腺がんは、男性で最もよくある非皮膚悪性腫瘍であり、西欧諸国では男性のがんによる死因の第２位である。前立腺がんは、前立腺での異常な細胞の制御されない増殖から生じる。いったん前立腺がんの腫瘍が発生すると、テストステロンなどのアンドロゲンが前立腺がんの腫瘍増殖を促進する。初期の段階では、限局性前立腺がんは、例えば、前立腺の外科的除去及び放射線治療を含む局所療法で治療されることが多い。しかし、局所療法で前立腺がんが治癒しなかった場合、最大３分の１の男性がそうであるように、病気は治癒不能の転移性疾患（すなわち、がんが体のある一部から他の部分に広がった疾患）に進行する。本明細書で使用される場合、「前立腺がん」という用語は、最も広い意味で使用され、前立腺の組織から生じるすべての段階及びすべての形態のがんを指す。「前立腺がん」という用語は、例えば、前立腺腺がん、前立腺肉腫、未分化前立腺がん、前立腺扁平上皮がん、前立腺管移行がん及び前立腺上皮内新生物など、前立腺の組織に位置するあらゆるタイプの悪性（すなわち非良性）腫瘍を包含する。

カポジ肉腫（ＫＳ）は、血管内皮の多発性血管増殖性障害であり、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）としても知られるカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）の感染に最も関連している。ＫＳは、多くの疫学的及び病態生理学的要因と関連している。ＫＳは、古典的地中海性ＫＳ、アフリカ風土病型ＫＳ、免疫抑制剤関連ＫＳ、及びＨＩＶ関連ＫＳの４つの異なる臨床タイプに分類される。ＨＩＶ関連ＫＳは、ＨＩＶとＡＩＤＳの時代以前は稀な疾患であったが、ＨＩＶ感染患者において最も頻度の高い悪性腫瘍である。ＫＳは多くの臓器に影響を及ぼす。ＫＳは皮膚の疾患として最も頻繁に現れる。多くの進行した症例では、肺、肝臓、又は消化管などの器官が侵される。現在のところ、ＫＳは不治である。利用可能な治療法は症状緩和のためのものである。一般に、全身化学療法は、より進行した疾患の患者又は疾患が急速に進行している証拠がある患者に使用される。治療の主要な目標は、症状の緩和、疾患の進行の予防、及びリンパ浮腫、臓器機能不全、及び心理的ストレスを軽減するための腫瘍負担の減少である。内臓型及び進行した皮膚型ＫＳに対する標準的な治療法は、リポソーム製剤にしたアンスラサイクリン及びパクリタキセルなどの細胞傷害性化学療法である。リポソーム製剤のドキソルビシンは、非リポソーム製剤のドキソルビシン、ビンクリスチン、及びブレオマイシンの併用と比較して、優れた有効性と良好な忍容性及び毒性を有し、ＨＩＶ患者での全奏功率は５９％であった。古典的なＫＳでは、ドキソルビシンリポソーム製剤の奏効率は、より高くなる可能性がある。しかし、完全奏効はまれであり、治癒はない。現時点では、ＫＳに対する標的療法は十分に開発されていない。

２０１４年、米国では新たに４６，４２０名の膵がんの症例が診断されると予想され、３９，５９０人名がこの病気で死亡すると推定されている。外科的切除は唯一の治癒の可能性がある根治的治療手段であるが、診断時に切除可能な疾患を有する患者は１５～２０％に過ぎず、切除不能、局所進行、及び転移性の膵がんに対する治療は、依然として大部分が緩和的なままである。無作為化試験により、単剤のフルオロウラシルと比較して、臨床的有益性及び約１か月の延命効果が示されてからは、ゲムシタビン単剤療法が進行膵がんに対する治療の基準レジメンとして使用されている。局所進行性及び転移性膵がんに対するゲムシタビンをベースとするレジメンを含む併用療法は、メタアナリシスにおいて、毒性の頻度が高いものの、全生存期間（ＯＳ）ではわずかに有益性であることが示され、さらに、パフォーマンスステータスが良好な患者において、併用レジメンの有益性の向上を示唆する証拠も存在する。そのような併用レジメンの１つは、ゲムシタビンとアルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル）である。第ＩＩＩ相オープンラベルＭＰＡＣＴ試験では、８６１名の患者が、ゲムシタビン（体表面積１平方メートルあたり１０００ｍｇ又はｍｇ／ｍ^２）単独の点滴静注、又はゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ^２）とｎａｂ－パクリタキセル（１２５ｍｇ／ｍ^２）の点滴静注のいずれかを受けるように１：１の割合で無作為に割り付けられた。併用群は全生存期間の中央値が８．５カ月であり、単剤群の６．７カ月に比較して伸びたが、前者では高グレードの好中球減少症、疲労、神経障害がより多く見られた。併用群では、４１％の患者がｎａｂ－パクリタキセルを減量し、４７％の患者がゲムシタビンを減量した。ＯＳが１．８カ月増加したので、この試験は２０１３年に、進行期膵がんの治療に対するｎａｂ－パクリタキセルの食品医薬品局（ＦＤＡ）による承認に至った。２０１５年に論文掲載されたＭＰＡＣＴ試験の最新のＯＳ解析では、ｎａｂ－パクリタキセルとゲムシタビンの併用群はＯＳ中央値が８．７カ月であり、ゲムシタビン単剤療法群の６．６カ月と比較して長いことが確認された。

さまざまな実施形態では、がんは、これらに限定されないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、大腸がん、転移性尿路上皮がん、乳がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、中皮腫、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、カポジ肉腫、及び白血病からなる群より選択される。

さまざまな実施形態では、患者は、過去に抗がん療法による治療に反応したが、療法を中止すると、再発した（以下「再発増殖性疾患」とする）。

さまざまな実施形態では、患者は、抵抗性又は難治性のがんを有する。さまざまな実施形態では、がんは、免疫療法治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、化学療法剤による治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、又は抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、融合分子を用いた標的治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、低分子キナーゼ阻害剤を用いた標的治療に抵抗性である。さまざまな実施形態では、がんは、免疫療法治療、化学療法剤による治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療、共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子を用いた治療、低分子キナーゼ阻害剤を用いた標的治療、手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、並びに放射線を用いた治療のうちの２つ以上を含む併用療法に抵抗性である。

医薬組成物
さまざまな実施形態では、本発明のポリペプチド治療薬は、多く場合、活性治療剤、すなわち、及び他のさまざまな薬学的に許容される成分を含む医薬組成物として投与される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０を参照）。好ましい形態は、意図される投与様式及び治療適用に依存する。組成物はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性担体又は希釈剤を含むことができ、それらは動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして定義される。希釈剤は、混合物の生体活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。さらに、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤なども含むことができる。

さまざまな実施形態では、原発がん又は転移がんの治療のための医薬組成物は、非経口、局所、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、又は筋肉内の手段によって投与することができる。

非経口投与の場合、本発明の医薬組成物は、水、油、生理食塩水、グリセロール、又はエタノールなどの無菌液体でありうる医薬担体を用いて、生理学的に許容される希釈剤中の物質の溶液又は懸濁液を注射用調剤として投与することができる。さらに、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が組成物に存在することができる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、又は合成起源のものであり、例えば、ピーナッツ油、大豆油、及び鉱物油である。一般的には、プロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射液には好ましい液体担体である。抗体及び／又はポリペプチドは、活性成分の徐放を可能にするような方法で製剤化できるデポ注射又はインプラント製剤の形態で投与することができる。典型的には、医薬組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製される。注射前に液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態も調製することができる。また、製剤は、上述のように、アジュバント効果を高めるために、リポソーム又はポリラクチド、ポリグリコリド、若しくはコポリマーなどのマイクロ粒子に乳化又はカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７－１１９，１９９７。本発明のポリペプチド剤は、活性成分の徐放又はパルス放出を可能にするような方法で製剤化できるデポ注射剤又はインプラント製剤の形態で投与することができる。

他の投与様式に適したさらなる製剤としては、経口、経鼻、及び肺製剤、坐薬、並びに経皮投与が挙げられる。

さまざまな実施形態では、本発明の方法は、治療を必要とする患者に、治療有効量又は有効投与量の本発明のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡポリペプチドを投与することを含む。さまざまな実施形態では、本明細書に記載の、例えば原発がん又は転移がんの治療のための本発明のポリペプチドの有効投与量は、投与の手段、標的部位、患者の体の状態、患者がヒトか動物か、投与された他の薬物、及び治療が予防的か治療的かを含む多くのさまざまな要因によって異なる。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒトの哺乳類も治療することができる。安全性と有効性を最適にするように治療投与量を調整する必要がある。

さまざまな実施形態では、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの宿主の体重、より通常は０．０１～５ｍｇ／ｋｇの宿主の体重の範囲であることができる。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇの体重又は１０ｍｇ／ｋｇの体重、又は１～１０ｍｇ／のｋｇの範囲内でありうる。さまざまな実施形態では、患者に投与されるポリペプチドの投与量は、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、及び約１０．０ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。さまざまな実施形態では、治療計画は、２週間毎に１回、又は１か月に１回、又は３～６か月毎に１回の投与を伴う。本発明の治療実体（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）は、通常、複数の機会に投与される。個々の投与の間隔は、毎週、隔週、毎月又は毎年であることができる。また、間隔は、患者の治療実体の血中レベルを測定することによって、適応があれば、不規則であることもできる。あるいは、本発明の治療実体は、徐放性製剤として投与でき、その場合、投与は少ない頻度で済む。投与量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期によって異なる。

本明細書に記載のポリペプチドの毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ_５０（人口の５０％を死亡させる投与量）又はＬＤ_１００（人口の１００％を死亡させる投与量）を求めることによって決定することができる。毒性作用と治療効果の間の投与量比が治療指数である。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトで使用したときに毒性を示さない投与量範囲を決めるのに使用することができる。本明細書に記載のポリペプチドの投与量は、好ましくは、毒性がほとんどない又はまったくない有効投与量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形や使用される投与経路に応じて、この範囲内で変えることができる。正確な剤形、投与経路、投与量は、対象となる医師（ｓｕｂｊｅｃｔ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）が患者の状態を考慮して選択することができる。（例えば、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章のＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５を参照）。

さまざまな実施形態では、方法は、免疫療法、化学療法、標的特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療、標的共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、ＡＤＣ、又は融合分子を用いた標的治療、低分子キナーゼ阻害剤標的療法、手術、放射線療法、並びに幹細胞移植からなる群より選択される１つ又は複数の追加の抗がん療法を含む。併用は相乗的でありうる。併用は、併用療法は、抗がん療法の治療指数を上げることができる。

さまざまな実施形態では、免疫療法は、抗体－薬物複合体を使用した治療、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、及びＶＩＳＴＡなどの共刺激又は共阻害分子（免疫チェックポイント）に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療、ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を使用した治療、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－γなどの生体応答調節物質の投与を伴う治療、シプリューセル－Ｔなどの治療ワクチンを使用した治療、樹状細胞ワクチン又は腫瘍抗原ペプチドワクチンを使用した治療、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を使用した治療、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を使用した治療、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用した治療、養子移入抗腫瘍Ｔ細胞（生体外増殖及び／又はＴＣＲランスジェニック）を使用した治療、ＴＡＬＬ－１０４細胞を使用した治療、並びにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストＣｐＧやイミキモドなどの免疫賦活剤を用いた治療からなる群より選択される。さまざまな実施形態では、免疫療法は、共刺激又は共阻害分子に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を使用した治療、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を使用した治療及び二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を使用した治療からなる群より選択される。さまざまな実施形態では、免疫療法は、共刺激又は共阻害分子に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体を使用した治療である。さまざまな実施形態では、免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を使用した治療である。さまざまな実施形態では、免疫療法は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を使用した治療である。さまざまな実施形態では、免疫療法は、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））を使用した治療である。

さまざまな実施形態では、追加療法は、これらに限定されないが、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ２７４、ＴＩＭ－３及びＢ７－Ｈ４を含むリストからの免疫チェックポイントタンパク質抗原に特異的に結合する抗体又は当技術分野で教示された任意の免疫チェックポイントタンパク質抗原抗体を含む。さまざまな実施形態では、併用療法の方法で使用されるＰＤ－１阻害剤は、これらに限定されないが、ペムブロリズマブ（メルク）、ニボルマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ）、及びピジリズマブ（メディヴェイション）からなる群より選択される。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤はペムブロリズマブである。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤はニボルマブである。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤はピジリズマブである。

さまざまな実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約３ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約１０ｍｇ～約４００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約５０ｍｇ～約４００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約１０ｍｇ～約３００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約５０ｍｇ～約３００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約１０ｍｇ～約２５０ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、約５０ｍｇ～約２５０ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約５０ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約１００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約１５０ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約２００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約２５０ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、少なくとも約３００ｍｇのＰＤ－１阻害剤が投与される。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、１サイクル中に少なくとも１回投与される。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、１サイクル中に少なくとも２回投与される。さまざまな実施形態では、サイクルは２１日である。さまざまな実施形態では、サイクルは２８日である。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は少なくとも１週間に１回投与される。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は少なくとも２週間毎に１回投与される。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は少なくとも３週間毎に１回投与される。さまざまな実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は少なくとも４週間毎に１回投与される。

併用療法の性質に応じて、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、他の療法を行っている間及び／又はその後に継続することができる。ポリペプチド治療薬は、追加の抗がん療法の前、それと同時、又はその後に、通常、少なくとも約１週間、少なくとも約５日、少なくとも約３日、少なくとも約１日以内に投与することができる。ポリペプチド治療薬は、単回投与で送達してもよく、複数回投与に分けてもよく、例えば、毎日、隔日、半週毎、毎週などを含む、一定期間にわたって送達することができる。有効量は、投与の経路、特定の薬剤、抗がん剤の投与量などによって異なることになり、当業者によって経験的に決めることができる。

以下の例は、本開示をさらに詳細に説明するために提供される。

実施例１
上皮がんにおけるＥｐｈＢ４発現
ヒトの腫瘍におけるＥｐｈＢ４の発現を免疫染色アッセイで分析した。新鮮な凍結腫瘍試料及び可能であれば隣接する正常組織を、ＥｐｈＢ４特異的モノクローナル抗体ＭＡｂ１３１を用いてＥｐｈＢ４発現について分析した。ＥｐｈＢ４発現は、分析した上皮がんの多くで誘導された（表１にまとめた）。例えば、ＥｐｈＢ４は正常な膀胱及び結腸では発現していないが、膀胱及び結腸腫瘍では高発現している。乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、及び前立腺がんにおけるＥｐｈＢ４発現の代表的な症例も図１に示されている。

ＥｐｈＢ４遺伝子増幅を、頭頸部がん、肺がん、及び食道がんで解析した。食道扁平上皮がんでは、１５名中９名（６０％）の患者が４～２０の遺伝子コピー数を有した。同様に、食道腺癌では、８名中５名（６２％）が４～２０の範囲の遺伝子コピー数を有した。

実施例２
ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２シグナル伝達の阻害は、さまざまながんの腫瘍免疫のプログラムを書き換える。
エフリンＢ２は腫瘍における免疫細胞輸送の門番役（ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ）である。腫瘍微小環境及び免疫細胞輸送に関連するＥｐｈＢ４－エフリンＢ２シグナル伝達の阻害の効果を評価するために研究を行った。

すべてのマウス試験で、マウス血清アルブミンに融合したｓＥｐｈＢ４のマウスアナログ（ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ）を薬物に対する免疫応答を防ぐのに使用した。ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡを投与したマウスは、タンパク質に対する抗体応答を誘導しなかった。腫瘍細胞をエフリンＢ２^{ｌａｃＺ／ＷＴ}マウスに皮下注射又は静脈内注射し、ｘ－ｇａｌ染色を用いて組織を分析した。エフリンＢ２発現は、すべての同系腫瘍（Ｂ１６、ＫＲ１５８、ＬＬＣ、ＥＬ４）及び自然発生リンパ腫の腫瘍血管系で観察された。肝臓などの正常な隣接する重要臓器はエフリンＢ２発現を欠く（図２Ａ）。Ｂ１６メラノーマをもつエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して腫瘍増殖の低下を示す（図２Ｂ）。Ｂ１６メラノーマをもつエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスは、野生型マウスと比較してＣＤ３＋Ｔ細胞数が増加している（図２Ｃ）。エフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスにおいて、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の除去は腫瘍増殖の減少を消失させる（図２Ｄ）。ＫＲ１５８を移植したエフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスは腫瘍増殖の低下を示す（図２Ｅ）。先の実験から採取した腫瘍は、野生型マウスと比較して、エフリンＢ２コンディショナルノックアウトマウスにおいてＣＤ３＋Ｔ細胞数の増加を示す（図２Ｆ）。ＣＤ４／ＣＤ８除去抗体を投与したマウスは、エフリンＢ２コンディショナルノックアウト及び野生型マウスにおいて同様の腫瘍増殖を示す（図２Ｇ）。

ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ融合タンパク質は、エフリンＢ２を標的とし、ＥｐｈＢ受容体への結合を遮断し、双方向シグナル伝達を停止させる。ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡは腫瘍増殖を阻害し、腫瘍への免疫細胞の遊走を促進する。ＣＤ８細胞（ＣＤ４細胞ではない）の除去はｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡの腫瘍増殖抑制作用を消失させる（図３）。これらの研究は、腫瘍でのＴ細胞の動員が、腫瘍血管においてエフリンＢ２によって調節されていることを示す。

ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡによるＴ細胞動員の機序を理解するために、我々はＣＤ４５選択Ｔ細胞について不偏遺伝子発現解析を行った。７７０個の腫瘍免疫関連遺伝子の発現解析のパネルは、炎症経路、樹状細胞成熟経路の誘導、ＮＦ－ｋＢ経路のアップレギュレーションを示した。遺伝子発現解析は、Ｔ細胞の疲弊及びＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ２７、ＣＴＬＡ－４、ＭＡＲＣＯ、ＥＯＭＥＳ、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０などを含む共刺激遺伝子の誘導を示した。

下に示すように、Ｂ１６メラノーマをもつｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ及び対照マウス由来の腫瘍試料で、マウスｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ治療によるＰＤ－Ｌ１誘導が確認された（図４）。

また、Ｂ１６メラノーマ腫瘍ライセートをサイトカイン及びケモカインについて分析した。ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ投与マウスの腫瘍は、ＴＮＦ－α、インターフェロンガンマ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＭＩＰａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ－１の有意な増加を示し、腫瘍での炎症反応と一致した（図５）。

腫瘍へのＴ細胞遊出を調節する機序を詳しく調べるために、一般的なチェックポイント阻害剤、ＣＴ抗原及び自然免疫応答と適応免疫応答をともにカバーする遺伝子を含む、２４種の異なる細胞型からの７７０個の遺伝子の腫瘍免疫細胞パネルを解析した。通常、免疫細胞は血管内皮に沿って転がるが、ＩＣＡＭ－１の存在はＬＦＡ－１と結合することによって免疫細胞をつなぎ止める（Ｙａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６（２）：５８４－５９２，２００５）。この相互作用は免疫細胞を活性化し、血管外への遊出を促進する。このプロセスを検証するために、担がんマウスにＩＣＡＭ－１抗体を投与した。ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡを投与したマウスは、ＩＣＡＭ－１抗体をマウスに曝露した後、腫瘍増殖が対照マウスと同等であった。特に、ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡの腫瘍抑制活性による腫瘍増殖抑制は、ＩＣＡＭ－１抗体の投与を受けたマウスで著しく低下し、ＩＣＡＭ－１誘導が循環から腫瘍に免疫細胞を輸送するのに必要であることを示した。これらのデータは、ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡに応答する免疫細胞輸送におけるＩＣＡＭ－１の役割を裏付け、ｍｓｐｈＢ４－ＭＳＡ投与がＩＣＡＭ－１を誘導して免疫細胞輸送を調節することを示している。

腫瘍浸潤免疫細胞（ＣＤ４５＋）における遺伝子発現研究により、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及びＰＤ－１の誘導が明らかになった。ＰＤ－Ｌ１の誘導は、ｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ活性のフィードバック阻害を示唆する。したがって、ＰＤ－１アンタゴニスト抗体とｍｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡの組み合わせをマウスモデルで調べた。Ｂ１６メラノーマ細胞をもつＣ５７Ｂｌ６マウスに、対照ＰＢＳ、ｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡ、ＰＤ－１抗体又は併用療法を投与した。腫瘍体積を経時的に測定した。ｓＥｐｈＢ４－ＭＳＡとＰＤ－１抗体は抗腫瘍活性及び免疫細胞の動員を増強する。併用療法は各化合物単独よりも効果的であった。腫瘍をＣＤ４又はＣＤ８について染色した。併用療法は、腫瘍へのＴ細胞局在の最大の増加を示した。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の定量は併用療法で最も高い増加を示す（図６）。

Ｂ１６メラノーマ細胞をＣ５７／Ｂ６免疫正常マウスに移植した。腫瘍が約１００ｍｍ^３の体積に達したとき、マウスに、ｓＥｐｈＢ４１０ｍｇ／ｋｇを週３回、ＰＤ－１中和抗体１００μｇを週２回、ＣＴＬＡ４抗体を１００μｇで週２回、１０日間腹腔内投与した。腫瘍体積は経時的に測定する。ｓＥｐｈＢ４はＴ細胞浸潤を促進し、腫瘍体積を著しく減少させる。この効果は、ＰＤ－１抗体との組み合わせ及びＣＴＬＡ－４抗体との組み合わせでさらに増強される（図７）。

これらの研究により、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体及びＣＴＬＡ－４抗体と併用したとき、エフリンＢ２シグナル伝達を遮断して腫瘍微小環境を変化させ、Ｔ細胞動員を促進し、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１を誘導し、有効性を増強することが示されている。この実験データは、Ｔ細胞の腫瘍への動員を妨げるエフリンＢ２の役割を裏付けている。

実施例３
ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ第Ｉ相用量漸増試験は最大耐用量（ＭＴＤ）に達することなく完了した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞がん及びカポジ肉腫を含むある特定の腫瘍種において単剤活性を示した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは忍容性が良好で、薬物関連毒性として高血圧の頻度が顕著に増加した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤試験は、腫瘍へのＴ細胞動員の増加及び腫瘍血管でのＩＣＡＭ－１の誘導を示した。

実施例４
この実施例は、ペムブロリズマブと併用したｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの第ＩＩ相治験を記載している。患者の適格基準は、局所進行性又は転移性尿路上皮がんで、過去に局所進行性又は転移疾患に対するシスプラチン含有レジメンが無効（再発又は難治又は不耐）であったか、又はシスプラチン含有ネオアジュバント療法から１２ヶ月以内に再発した患者であった。除外基準は、チェックポイント阻害剤を標的とした治療を前に受けたことがある患者であった。

投与レジメンは、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ１０ｍｇ／ｋｇを週１回点滴静注し、それにくわえてペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））２００ｍｇを３週間毎に点滴静注した。腫瘍反応を６週間毎に測定した。ベースライン組織又はアーカイブ組織を、バイオマーカー（特にペムブロリズマブペムブロリズマブ／キイトルーダ（登録商標）のコンパニオンマーカーであるＰＤ－Ｌ１ ＩＨＣ ２２Ｃ３ ＰｈａｒｍＤｘ）用に採取した。反応の独立した評価は、盲検下の放射線判定で評価した。ＰＤ－Ｌ１染色はレファレンス検査機関で行った。患者はすべて、毒性評価の対象となった。治験の主要評価項目はＯＳであり、副次評価項目はＯＲＲ及びＰＦＳである。高リスクサブセットの解析には、扁平細胞バリアント、上部尿路疾患、肝転移、ヘモグロビン＜１０ｍｇ／ｄｌ、レベル、及び０を超えるパフォーマンスステータスが含まれる。予定登録患者数は６０名である。３４名の患者の中間解析がまとめられている。予定されていた中間解析の時点で、３４名の患者の同意がした。それらの患者うち３名が、試験投与の初回投与直後に、治験に不適格であったことが判明した。２名の患者は試験開始時にＣＮＳ疾患があり１週間で死亡したため不適格となり、１名の患者は１週間後に同意を撤回した。規制当局への申請の目的のために、それらの不適格患者はＯＳ及びＰＦＳの治療企図解析に含まれるが、それらの不適格患者は反応について評価不能であったので、奏効率には含まれていない。

患者の背景は、全体として次のようにまとめられる：年齢の中央値は６７歳で、２９名／３４名が男性である。２６名／３４名は過去にシスプラチンベースの化学療法を受けたことがあった。大部分の患者は内臓転移を有し、肝臓への侵襲は７例、３カ月以内に試験に登録したのは１２例、Ｈｂ＜１０ｇ／ｄＬは６例、扁平上皮バリアントは９例、上部尿生殖路は７例である。ＰＤ－Ｌ１複合陽性スコアが１％以上であったのは３０例中１４例で、１名の患者については組織が入手できなかった。エフリンＢ２用の検査機関自家開発アッセイでは、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの標的は３０例中１９例で１％を超えていた。

結果
カプラン・マイヤー法を用いた追跡期間の中央値は１８．９カ月（９５％ＣＩ １５．５～２７．２）であったので、全生存期間の中央値は２１．４＋カ月で推定できなかった。ＰＤ－Ｌ１陽性患者の全生存期間の中央値は推定不能（９５％ＣＩ １６．５～推定不能）であり、ＰＤ－Ｌ１陰性のＯＳ中央値は２１．０か月（９５％ＣＩ １４．９～推定不能）であった。ログランク検定のｐ値＝０．１１（ＯＳ ＰＤ－Ｌ１陽性対陰性）。エフリンＢ２陽性のＯＳ中央値は２４．６か月（９５％ＣＩ １４．９～推定不能）であり、ＥｐｈｒｎＢ２陰性では２１．０か月（９５％ＣＩ ４．１～推定不能）であった。ログランク検定のｐ値＝０．３（ＯＳ ＥｐｈｒｎＢ２陽性対陰性）。

ＰＦＳは５．７か月（９５％ＣＩ ２．５～１４．６）であった。ＰＤ－Ｌ１陽性対象のＰＦＳ中央値は８．２（９５％ＣＩ ２．３～推定不能）であり、ＰＤ－Ｌ１陰性対象では４．８か月（９５％ＣＩ １．４～１４．６）であった。ログランク検定のｐ値＝０．１３（ＰＦＳ ＰＤ－Ｌ１陽性対陰性）。エフリンＢ２陽性対象のＰＦＳ中央値は１４．９か月（９５％ＣＩ ２．７～推定不能）であり、エフリンＢ２陰性対象では２．８か月（９５％ＣＩ １．３～８．２）であった。ログランク検定のｐ値＝０．０２（ＰＦＳ ＥｐｈｒｎＢ２陽性対陰性）。

ＯＲＲは４５．２％（９５％ＣＩ ２７～６１）であった。ＣＲは２９．０％（９／３１）であった（Ｘ線撮影による奏効６例及び病理学的奏効３例）。奏効持続期間は１４．７＋か月で推定不能である。ＰＤ－Ｌ１は１４名の患者で１％を超え、それらの患者ではＯＲＲは５７．１％（８名／１４名の患者）であり、ＣＲは３５．７％（５名／１４名の患者）であった。エフリンＢ２用の検査機関自家開発ＩＨＣでは、１９人の患者で１％を超え、それらの患者ではＯＲＲは６３．２％（１２名／１９名）、ＣＲは４２．１％（８名／１９名）であった。病状が安定していた別の患者は、副腎の残存腫瘍部位を一箇所切除し、１２＋か月継続して外科的完全寛解（外科的ＣＲ又はｓＣＲ）を達成した。この患者は奏功解析に含まれていない。

サブセット解析か、上部尿路（５／７－７１．４％ＯＲＲ）、扁平細胞バリアント（４／９－４４．４％ＯＲＲ）、内臓疾患（６／１６－３５．２％ＯＲＲ）、肝転移（３／７－４２．８％ＯＲＲ）、１０ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン（２／６－３３．３％ＯＲＲ）、及びリスクグループ１、２又は３（それぞれ４／９－４４．４％、３／７－４２．８％、及び１／４－２５％）における奏効が見られる。上記データをすべて表３～４に示す。

腫瘍反応の程度をウォーターフォールプロット（図８）に示す。遺残腫瘍の証拠を示さない生検又は残存放射線学的異常の切除のいずれかを受けた部分奏効の患者は、病理学的ＣＲに分類する。それらの患者は完全寛解カテゴリーに含まれている。これらの症例は、治療を受けていない間、長期間（中央値は１４．７＋月で推定不能）にわたって腫瘍再発がない点でも注目に値する。腫瘍退縮までの時間及び腫瘍の状態をスパイダープロット（図９）に示す。一部の症例では、腫瘍の完全な消退が最初のスキャンで観察されている。奏効持続期間を図１０に示す。ＯＳ中央値の確率は２１．４か月であり、ＰＦＳ中央値は５．７か月である（図１１）。

ベースライン及び治療（ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブ）中２回目のバイオプシーで採取した腫瘍試料は、以下に示す併用療法でＣＤ３細胞及びＣＤ８細胞の数値の増加を示した。特に、ベースラインで常在Ｔ細胞が少ない又はまったくなかった患者でも、検査機関自家開発アッセイ（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｓｓａｙ）を用いて、特にベースラインでエフリンＢ２発現をもつ腫瘍で治療によるＣＤ３及びＣＤ８細胞の増加が示されている（図１２）。ＣＤ３及びＣＤ８による腫瘍細胞浸潤を、ベースライン及び治療時の生検試料を用いて、治療時に遺残腫瘍があった７名の患者で測定した。さらなる５名の患者は、再生検で腫瘍がなかった（ベースラインのデータは示されていない）。

ＰＤ－Ｌ１は、免疫チェックポイント阻害剤を用いた尿路上皮がんのフロントライン治療として確立されている。免疫チェックポイント阻害剤で治療した再発／難治性の尿路上皮がんにおいて数値的な差はあるが、統計的には有意ではない。ＰＤ－Ｌ１の発現及びｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブの併用に対する反応を表５に３１症例中３０例で評価した。

エフリンＢ２は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの標的である。したがって、エフリンＢ２の発現と治療との相関は潜在的なバイオマーカーである。膀胱がんにおけるエフリンＢ２免疫組織化学的染色を、市販のモノクローナル抗体を用いて、検査機関ベースのアッセイで行われた。染色は、ＣＬＩＡ認定を受けた検査機関でライカのプラットフォームを使用して行った。染色した組織はすべて、組織の採取時期（ベースライン又は治療中）及び患者の治療結果を知らされていない１名の病理医が評価した。抗体の特異性は、エフリンＢ２の発現を欠く同種の細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはＣＨＯ細胞）、又はヒトエフリンＢ２若しくは近縁のタンパク質（エフリンＢ１又はエフリンＢ３）を発現するように遺伝子操作した細胞株を用いて行った。エフリンＢ２の発現と併用レジメンに対する反応を下の表６に示す。

ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブの併用は忍容性が良好である。最初の６名の患者が、すべての投与量での併用の安全性を評価した。併用の忍容性は良好で、併用療法から新たな毒性は観察されなかった。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単剤の安全性試験では、高血圧が頻発した。高血圧がｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブの併用で見られた。ペンブロリズマブに関連する毒性もこの併用試験で認められた。新たな毒性も予期せぬ毒性も認められなかった。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブの併用を長期使用は、新たな予期せぬ毒性をもたらさなかった。毒性のまとめを下の表７に示す。

まとめ
ペムブロリズマブと併用したｖｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡでは、ＯＳ中央値が２１．４＋か月、ＰＦＳが５．７か月、ＯＲＲが４５％、ＣＲが２９％である。尿路上皮がんの高リスクバリアントでは奏効が見られ、例えば扁平細胞バリアントでは９名の患者のうち５名（５５．６％）、上部尿路疾患では８名の患者のうち５名（６２．５％））であった。Ｂｅｌｌｍｕｎｔのリスクグループ２の患者では７名中３名（４２．８％）、リスクグループ３／４の患者では５名中１名（２０％）であった。歴史的比較として、同じ患者集団でペムブロリズマブが研究されている。ペムブロリズマブは、ＯＲＲが２１．１％（９５％ＣＩ １６．４～２６．５）、無増悪生存期間が２．１か月（９５％ＣＩ ２．０～２．２）、全生存期間が１０．３か月（９５％ＣＩ ８．０～１１．８）である。４つのさらなる抗体、ＰＤ－１（ニボルマブ）又はＰＤ－Ｌ１（アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ）抗体が、この患者集団に対してＦＤＡから承認されている。これらの薬剤の全生存期間中央値は次の通りである。ニボルマブ－８．７か月、アテゾリズマブ－７．９か月、デュルバルマブ－１８．２か月、及びアベルマブ－６．５か月。５つの抗体すべて、ＰＦＳが２．１カ月以下である。ＯＲＲは２１．１％以下であり、ＣＲは７％以下である。

ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブの併用は、予想生存期間中央値が１年未満の再発／難治性尿路上皮がん患者において、実質的な有効性と持続性を示した。ＣＲを達成した患者は、たいていの場合、治療を受けずにがんを発症しない状態を維持している。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペムブロリズマブの併用は、バリアント組織構造、上部尿路、低ヘモグロビン、パフォーマンスステータス２、３及び４、肝転移、Ｂｅｌｌｍｕｎｔ不良リスクサブグループ並びにＰＤ－Ｌ１陰性の患者を含む、すべてのサブグループで実質的な有益性がある。

ＰＤ－１抗体と併用したとき、投与は明らかな重複する毒性がなく忍容性が良好であり、その投与は長期間の施行することができる。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの標的であるエフリンＢ２用の検査機関自家開発アッセイは、エフリンＢ２陽性の腫瘍で６８．４％（１３名／１９名の患者）のより高いＯＲＲを示す。エフリンＢ２とＰＤ－Ｌ１の両方が陽性の患者は、ＯＲＲ率が８７．５％（７名／８名）である。ＰＤ－Ｌ１陰性の患者はＯＲＲが３７．５％（６名／１６名の患者）である。

ＰＤ－１抗体と組み合わせたｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡの併用の作用は、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡがＴ細胞の腫瘍への遊走を促進し、一方でＰＤ－１抗体が新たに動員された免疫細胞及び常在免疫細胞を活性化して、長く持続する反応を達成する相補的な機能によって生じるようである。

実施例５
この実施例では、局所進行膀胱がんの６３歳の女性が、ネオアジュバントゲムシタビン・シスプラチン化学療法で治療され、根治的膀胱切除術を受けた。しかし、その女性は術後短期間で、多数の大きな両側肺の疾患を含む複数の部位での急速進正疾患を再発した。彼女はｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとペンブロリズマブの治療を受けた。彼女は治療６週間で深い反応があり、治療を続けている。１２週目に撮影した断層画像（図１３）は、肺転移の９０％退縮を示している。

ゲムシタビンとシスプラチンのネオアジュバント化学療法、それに続く根治的膀胱切除術後に広範囲の局所再発があった新膀胱をもつ７９歳男性。この男性はｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ＋ペムブロリズマブを受けた。治療の１５週目に大きな腫瘤は完全に消退し、１５週目以降も治療を続けている。１５週目に撮影した断層画像（図１４）。

実施例６
本実施例では、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害単独又は放射線（ＲＴ）との併用が、同所性頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）モデルにおいて、対照群と比較して、腫瘍内制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を減少させ、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞の活性化を増加させることが見出された。また、ＲＴと併用したＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害の効果を抗ＰＤＬ１とＲＴの併用と比較すると、特に早期の時点で同様の腫瘍増殖抑制が観察された。我々のデータは、患者由来の異種移植モデルにおいて、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害とＲＴの後、腫瘍付随Ｍ２マクロファージが減少し、抗腫瘍性Ｍ１表現型への極性化に有利に働くこと示している。インビトロでは、ＥｐｈＢ４シグナル伝達の阻害は、対照群と比較してＫｉ６７発現Ｔｒｅｇを減少させ、Ｔｒｅｇの活性化を低下させる。全体として、我々の研究は、腫瘍免疫反応におけるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２の役割を示唆する初めての報告を提示し、我々の結果は、ＲＴと併用したＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害は、ＨＮＳＣＣ患者にとって潜在的な代替法であり、特に抗ＰＤＬ１療法が不適応である患者又はその療法に耐えられない患者にとって有益でありうることを示唆している。我々の研究は、ＨＮＳＣＣ患者において、放射線と併用して効果的な抗腫瘍免疫反応を誘発できる、抗ＰＤＬ１療法に対する新規の代替法として、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害を提示する。

ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害に起因する腫瘍増殖遅延に対する腫瘍免疫微小環境の寄与を調べるために、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃプラスミド（下記の材料及び方法を参照）又はｐｃＤＮＡ３対照プラスミドを投与した後１４～１８日目に、ＣｙＴＯＦ分析をＬｙ２腫瘍で行った。我々のデータは、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ投与後の腫瘍浸潤免疫細胞の有意な変化を示している。特に、腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｐｃＤＮＡ３対照と比較して、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ投与後に１．２倍の増加を示した（ｐ＝０．０３）。しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は変化しないままであった。Ｔｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３マーカーに対しても陽性であるＣＤ４＋Ｔ細胞）は、ＴＭＥで重要な免疫抑制集団を構成しており、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害群では劇的に約３倍減少した（ｐ＝０．００９）。重量なことには、治療反応の指標であるＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞／Ｔｒｅｇ比も、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害の後に有意に増加した（ｐ＝０．０２）。さらに、従来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態はともに、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）の発現に基づいて評価して、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害の後に～２．８倍の増加を示した（ｐ＝０．０００２、ｐ＝０．００９）。

Ｔ細胞で観察された変化にくわえて、マクロファージ集団（Ｆ４／８０＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞でゲーティング）でも変化が観察された。ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ投与群では、Ｆ４／８０＋マクロファージにおいて１．９倍の減少があった（ｐ＝０．０４）。特に、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ投与後に、腫瘍形成促進Ｍ２マクロファージ（Ａｒｇ１＋Ｆ４／８０＋細胞）で１．４倍の減少（ｐ＝０．０１）及びＭ１マクロファージ（Ｆ４／８０＋ｉＮＯＳ＋）で１６倍の増加（ｐ＜０．０００１）が認められた。腫瘍内のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球又はＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋好中球に有意な差は検出されなかった。また、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２遮断後のＣＤ１１Ｃ＋樹状細胞集団で１．７倍のアップレギュレーション（ｐ＝０．０１）が観察された。

ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用がＨＮＳＣＣ腫瘍でのＴ細胞の数と機能に影響を及ぼす機序を理解するために、担がんマウスの脾臓から単離し、組換えエフリンＢ２－Ｆｃで７２時間処理したＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ解析を行った。組換えエフリンＢ２－Ｆｃタンパク質は高濃度（２０μｇ／ｍｌ）で、ある特定のＥｐｈＢ４下流シグナルを阻害することが報告されているので、インビトロ研究に選択した。２０μｇ／ｍｌのエフリンＢ２－Ｆｃで処理したＣＤ４＋Ｔ細胞では、Ｆｃ対照で処理したＣＤ４＋Ｔ細胞よりもチロシンリン酸化されたＥｐｈＢ４のレベルが低いことが観察された。これらの結果を確かめるために、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用を遮断することも知られているＰＥＧ化型のＴＮＹＬ－ＲＡＷペプチドＥｐｈＢ４アンタゴニストでＣＤ４＋Ｔ細胞を処理し、同様の効果が観察された。

Ｋｉ６７（増殖のサロゲートマーカー）を発現しているＴｒｅｇに対するエフリンＢ２－Ｆｃ処理の影響を、フローサイトメトリーを使用して調べ、２０μｇ／ｍｌ濃度のエフリンＢ２－Ｆｃは、Ｆｃ対照処理と比較して、Ｋｉ６７を発現しているＴｒｅｇを１．７倍（ｐ＝０．０２）減少させたことが観察された。総ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、対照群とエフリンＢ２－Ｆｃ処理群の間で変わらないままであった。

Ｔｒｅｇはまた、恒常的に高いレベルのＩＬ－２Ｒαを発現し、増殖、生存、及び適切な機能に関してＩＬ－２に依存している。高投与量のエフリンＢ２－Ｆｃ投与後にＫｉ６７発現Ｔｒｅｇｓの減少が観察されたので、これがＩＬ－２などのサイトカインの分泌の減少によって媒介されうるかどうか調べた。我々のデータは、実際にｉｎｄｅｅｄ、２０μｇ／ｍｌのエフリンＢ２－Ｆｃで処理したＴｒｅｇ細胞の条件培地で、ＩＬ－２（ｐ＝０．０７）及びＴｒｅｇ機能の重要な調節因子であるＴＧＦ－β（ｐ＝０．００９）の分泌レベルの減少を示している。さらに、対照Ｆｃと比較して、高濃度のエフリンＢ２－Ｆｃで２４時間処理した後、Ｔ細胞のライセートで、ｐ－ＡＫＴやＢｃｌ－ＸＬなどの生存促進マーカーのレベルの低下がウエスタンブロッティングで観察された。一方で、切断型カスパーゼ－３のレベルは、対照－Ｆｃと比較して、２０μｇ／ｍｌのエフリンＢ２－Ｆｃで処理した後に増加した。

Ｌｙ２同所性モデルにおいて、腫瘍免疫微小環境を調節し、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２シグナル伝達の腫瘍形成促進効果を軽減することによって腫瘍増殖を抑制するためのＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害剤ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－ＦｃとＲＴの併用の有効性を評価した。また、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害とＲＴの併用の生体内有効性を、免疫チェックポイント阻害剤抗ＰＤＬ１とＲＴの併用の生体内有効性と比較した。我々のデータは、放射線単独（ＲＴ＋ＩｇＧ＋ｐｃＤＮＡ３）は、ＩｇＧ＋ｐｃＤＮＡ３対照群と比較して、腫瘍増殖を２．２倍（ｐ＝０．０００３）減少させたことを示している。しかし、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－ＦｃをＲＴと併用したとき、併用群ではＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ単独に比較して、４．４倍の減少をもたらすという結果になった（ｐ＝０．０００３）。重要なことは、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害をＲＴと併用したとき、腫瘍移植後２０日目にＲＴと併用した抗ＰＤＬ１と同様の抗腫瘍反応が生み出された。抗ＰＤＬ１＋ＲＴとＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃの３つの組み合わせは、さらなる相乗効果を追加しなかった。長期間にわたって腫瘍増殖をモニタリングすると、Ｌｙ２腫瘍において、ＲＴ＋ＩｇＧ＋ｐｃＤＮＡ３と比較して、ＲＴ＋ＩｇＧ＋ＴＮＹＬ併用群で高い腫瘍増殖抑制が示された。また、別の悪性度の高いＨＮＳＣＣ腫瘍のモデルであるＭｏｃ２におけるＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ阻害剤とＲＴの併用の有効性も評価し、単剤ＲＴのみと比較して併用群で同様の腫瘍増殖抑制が示された。Ｍｏｃ２腫瘍にＲＴで投与すると、対照ｐｃＤＮＡ３群と比較して、腫瘍増殖の１．５９倍の有意な減少がもたらされるという結果になった（ｐ＜０．０００１）。ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ阻害剤をＲＴと併用したとき、腫瘍増殖を１．３６倍減少させた（ｐ＜０．００５）。照射群は、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ又は抗ＰＤＬ１を併用したとき、腫瘍移植後１７日目及び２１日目にＲＴ単独と比較して、同様のレベルの腫瘍増殖抑制が得られた。Ｌｙ２モデルと同様に、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ阻害剤と抗ＰＤＬ１＋ＲＴを組み合わせても、さらなる有益性は示されなかった。

ＲＴの存在下における免疫調節に対するＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害の寄与を理解するために、ＲＴ有り及びＲＴ無しで、対照群とＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ群から採取したＬｙ２腫瘍をフローサイトメトリーで分析した。我々のデータは、ＲＴ非存在下において、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに影響を及ぼすことなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を増加させることを示した。Ｌｙ２腫瘍を１０ＧｙのＲＴに曝露すると、ＲＴ後３日目にＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の両方が有意に増強された。ＲＴによるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害は、ＲＴ単独と比較して、これらのＴ細胞集団に影響を及ぼさなかった。ＲＴ後３日目に、対照群と比較して、ＲＴ投与によるＴｒｅｇ集団の１．６倍の減少が観察された（ｐ＝０．００９）。ＲＴにＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃを追加すると、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇが、単剤のどちらと比較しても、さらに減少した（合計で～２．７倍）。また、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比も、併用投与において、対照又はＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ療法と比較して有意に増加した。ＲＴによるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害がＴ細胞の機能に及ぼす影響を調べるため、活性化されたＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋）及び活性化された従来のＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－ＩＦＮγ＋）の割合を評価した。ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ単独と比較して、併用群では両細胞の割合の増加（２．２～２．４倍）が観察された。さらに、ＲＴとともにＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用を阻害することも、ＲＴ単独に比較して、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－ＩＦＮγ＋細胞の有意な増加（２．２倍）をもたらした（ｐ＝０．０４）。機能的な細胞傷害性Ｔ細胞を引き付ける強力なケモカインであるＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０の分泌レベルの増加は、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ又はＲＴ投与によって誘導され、ＲＴと比較して両投与の併用によってさらに増加した。最後に、対照群に比較してＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ及びＲＴ投与で、Ｔｒｅｇの免疫抑制作用の結果である循環ＴＧＦ－βのそれぞれ１．４倍及び１．８倍の減少が観察された。ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－ＦｃをＲＴと併用することにより、ＴＧＦ－βレベルの減少がさらに増した（ＲＴと比較してｐ＝０．０２）。

ＴＡＭの減少が、マクロファージへの単球分化を促進することが知られているＴｒｅｇの変化の直接的な結果であるかどうかを判定するために、Ｔ細胞非依存モデルであるヌードマウスでＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害の効果を検証した。腫瘍環境を保持し、ヒトのがんを模倣することが知られているＨＮＳＣＣ ＰＤＸ腫瘍モデルを使用した。我々はこれまでに、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡを、放射線単独又は放射線とＥＧＦＲ阻害剤セツキシマブの併用によるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害後の有意な腫瘍増殖の減少を示した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡは、エフリンＢ２に結合することによってＥｐｈＢ４とエフリンＢ２の間の相互作用を阻害する可溶性タンパク質である（一方では、ＴＮＹＬ－ＲＡＷはＥｐｈＢ４に結合することによってその相互作用を阻害する）。ＨＮＳＣＣ ＰＤＸ腫瘍モデルで酸化鉄（ＳＰＩＯ）蓄積によるＴ２強調ＭＲＩを用いることによってＴＡＭ浸潤を測定した。ＲＴそれ自体は、信号強度の減少によって表されるように、ＳＰＩＯ取り込みを著しく増加させるが、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡによるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用の阻害は、そのＲＴの作用を打ち消すことが観察された（ｐ＜０．０５）。

これらの画像データは、対照群及び実験群から採取したＣＵＨＮ０１３腫瘍を使用したＩＦ染色によってさらに裏付けられた。このことは、ＲＴと併用したｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡによるＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害は、いずれかの投与単独と比較して、汎マクロファージマーカーＣＤ１０７ｂ＋及びＦ４／８０＋の染色の減少で判定して、ＴＡＭの割合を有意に減少させることを示した。また、ＣＵＨＮ０１３腫瘍においてＣＤ１６３＋Ｍ２マクロファージの染色の減少及びＧｐｒ１８＋Ｍ１マクロファージの染色の増加が観察され、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害及びＲＴは、マクロファージの極性を腫瘍促進Ｍ２表現型から抗腫瘍Ｍ１表現型へとシフトさせることを示唆している。これは、Ｍ２マーカーに対するＭ１マーカーの比（Ｇｐｒ１８：ＣＤ１６３）の増加でも明らかであり、併用群ではより増加している。最後に、循環サイトカイン／ケモカインプロファイルの解析により、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡとＲＴを併用することが、Ｍ２極性化を媒介する重要な分化因子であるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）のレベルを、単剤投与に比較して有意に減少させることが示されている。これに伴って、ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ単独又はＲＴ単独のいずれかと比較して、特に併用投与群で、ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮγの両方のレベルが著しく増加する。ＧＭ－ＣＳＦとＩＦＮγはともに、Ｍ１極性に有利に働くことが知られている。したがって、まとめると、我々のデータは、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害とＲＴの併用は、マクロファージの極性化に影響を及ぼすことによって抗腫瘍免疫反応を誘導することを示している。

ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２阻害がＭ１表現型への極性化に有利に働くことを示す我々のデータに照らして、ＴＣＧＡ及びＣＩＢＥＲＳＯＲＴ解析を行って、ＨＮＳＣＣ患者の生存に対するそのような極性化の意義を調べた。この解析により、Ｍ１／Ｍ２比がより低いことと、全生存期間及び無病生存期間が短いこととの間に有意な相関があることが初めて明らかになった。その解析では、０．５のカットオフＭ１／Ｍ２比に基づいた。Ｍ１／Ｍ２比が＜０．５のとき、Ｍ１／Ｍ２比が＞０．５の患者に比較して、患者は全生存率が低い。Ｍ１／Ｍ２比が＞０．５の患者の生存期間中央値は、Ｍ１／Ｍ２比が＜０．５の患者の３２．８ヵ月に対して、６５．８ヵ月であった（ｐ＝０．０１７０）。さらに、Ｍ１／Ｍ２比が＞０．５の患者コホートの病勢進行までの期間の中央値は、Ｍ１／Ｍ２比が＜０．５の患者の５３．１ヵ月に対し、７６．２ヵ月であった（ｐ＝０．０１１１）。

材料及び方法
細胞培養及び試薬
マウスＭｏｃ２細胞株はＲａｖｉｎｄｒａ Ｕｐｐａｌｕｒｉ博士（ダナ・ファーバーがん研究所、マサチューセッツ州）から、Ｌｙ２細胞株はＮａｄａｒａｊａｈ Ｖｉｇｎｅｓｗａｒａｎ博士（テキサス大学ヒューストン医療科学センター、テキサス州）から入手した。Ｌｙ２細胞はＤＭＥＭ－Ｆ１２で、Ｍｏｃ２細胞はＩＭＤＭ培地で培養した。培地には１０％ＦＢＳと１％プリモシンを補充し、細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養した。ヒト血清アルブミンに融合した可溶性ＥｐｈＢ４細胞外ドメイン（ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ）を用いて、ＰＤＸ免疫不全マウスモデルでＥｐｈＢ４－エフリンＢ２相互作用を阻害した。ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡタンパク質は、Ｐａｒｋａｓｈ Ｇｉｌｌ博士（南カリフォルニア大学、カリフォルニア州、Ｖａｓｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）から提供された。免疫完全マウスモデルでは、ＥｐｈＢ４－エフリンＢ２シグナル伝達を遮断するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合した１５アミノ酸長のＴＮＹＬ－ＲＡＷペプチド（ＥｐｈＢ４アンタゴニストであるＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ）をコードするプラスミドを使用した。ｐｃＤＮＡ３プラスミドを対照として使用した。プラスミドはＥｌｅｎａ Ｐａｓｑｕａｌｅ博士の研究室（サンフォード・バーナム・プレビーズ・メディカル・ディスカバリー・インスティテュート、カリフォルニア州）から入手した。ＰＥＧ化型のＴＮＹＬ－ＲＡＷペプチドは、Ｔ細胞に関わるインビトロ研究用にＡｎａｓｐｅｃ（フリーモント、カリフォルニア州）から入手した。

生体内モデル
マウスはすべて、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパス動物実験委員会によって設定及び監修された倫理ガイドラインに従って取り扱い、安楽死させた。免疫不全マウスモデル研究では、雌の胸腺欠損ヌードマウス胸腺欠損の（５～６週齢、１群あたりｎ＝５～７）をエンヴィーゴ（インディアナポリス、インディアナ州、米国）から購入した。ＨＮＳＣＣ ＰＤＸ腫瘍ＣＵＨＮ０１３及びＣＵＨＮ００４（Ｆ８～Ｆ１６代）は、Ａｎｔｏｎｉｏ Ｊｉｍｅｎｏ博士の研究室（コロラド大学、アンシュッツメディカルキャンパス、オーロラ、コロラド州）から入手した。

腫瘍移植は、先述（２５）のように行った。腫瘍体積が約５０～１５０ｍｍ^３に達した時点で、マウスを無作為に、４つのグループ（１）ＰＢＳ、（２）ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ、（３）ＰＢＳ＋ＲＴ、（４）ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ＋ＲＴに割り付けた。マウスは、ＰＢＳ若しくは２０ｍｇ／ｋｇ投与量のｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ（３回／週）の注射及び／又は先述のようにＲＴ（５Ｇｙ／分割×４分割）を受けた。

酸化鉄イメージング研究では、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子を生成した。Ｓｅｒｋｏｖａらによって報告された磁気共鳴（ＭＲ）イメージングの詳細なプロトコールに従った。ＭＲイメージングは、投与前及びＲＴの最後の投与の９６時間後に行った。最終的な画像は、ＰａｒａＶｉ－ｓｉｏｎソフトウェア（ブルカー・バイオスピン）で処理した。

免疫完全マウスモデル研究では、５～６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）又はＣ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州）を使用した。腫瘍細胞接種は先述のように行った。実験群又は対照群あたり７～８匹のマウスを移植した。腫瘍接種後４～５日目（腫瘍体積～５０ｍｍ^３）に、マウスを無作為に割り付け、先述のようにｐｃＤＮＡ３対照プラスミド又はＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃプラスミドのいずれかをハイドロダイナミックインジェクションで投与した。簡潔に言うと、２０μｇのプラスミドＤＮＡを～２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、６秒未満に尾静脈に注射した。腫瘍サイズは２週間毎にデジタルノギスを用いて測定し、腫瘍体積は［（小さい方の直径）^２×最も長い直径／２］の式を用いて推定した。併用療法の研究では、マウスを無作為に、ＩｇＧ＋ｐｃＤＮＡ３対照、ＩｇＧ＋ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ、抗ＰＤＬ１＋ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ、ＲＴ＋ＩｇＧ＋ｐｃＤＮＡ３、ＲＴ＋ＩｇＧ＋ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ、ＲＴ＋抗ＰＤＬ１＋ｐｃＤＮＡ３、及びＲＴ＋抗ＰＤＬ１＋ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃに割り付けた。ＩｇＧ２ｂ対照（ＩｇＧと呼ぶ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州）及び抗ＰＤＬ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州）は、実験の期間を通して１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１週間に２回、腹腔内に投与した。ｐｃＤＮＡ３及びＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃは、上記のように投与した。ＲＴは先述のように１０Ｇｙの一回照射で行った。プラスミドＤＮＡ投与は、腫瘍接種後５日目に開始し、単回投与として与えたした。ＩｇＧ２ｂ又は抗ＰＤＬ１は、腫瘍接種後７～９日目にＲＴと組み合わせて開始し、実験の期間を通して続けた。マウスを、施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって設定されたガイドラインに従って安楽死させた。犠牲にした時点で腫瘍組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定するか、又はさらなる分析のために瞬間冷凍した。

免疫細胞除去に関する研究
ＣＤ８Ｔ細胞除去を、抗ＣＤ８抗体（クローン５３－６．７、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州）を使用して行った。対応するラットＩｇＧ１アイソタイプを対照として使用した。腫瘍移植の１週間前に抗体を投与し、腫瘍移植後は週に１回、３週間続けた。この研究で使用した腫瘍モデルは悪性度が高い性質をもつので、ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ又はｐｃＤＮＡ３の投与（２０μｇ／２ｍｌ ＰＢＳ、ハイドロダイナミック尾静脈インジェクション）は腫瘍移植後４日目に行った。全身のＣＤ８＋Ｔ細胞の除去を確かめるために、除去実験に使用したクローン５３－６．７と競合しない抗ＣＤ８抗体クローンを使用することによってフローサイトメトリーを行った。

フローサイトメトリー
腫瘍及び脾臓を、先述のようにフローサイトメトリー解析用の単一細胞の懸濁液に加工し、１～２×１０^６個の生細胞を９６ウェルプレートにまき、続いて抗ＣＤ１６／３２抗体でブロッキングした。免疫細胞、サイトカイン、及びリン酸化ＳＴＡＴ３マーカーの解析では、次の結合抗体を使用した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００－ＣＤ４５（１：５０、クローン３０－Ｆ１１、カタログ番号５６－０４５１－８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢＵＶ７３７－ＣＤ１１ｂ（１：１００、クローンＭ１／７０、カタログ番号５６４４４３、ＢＤバイオサイエンス）、ＦＩＴＣ－Ｆ４／８０（１：１００、クローンＢＭ８、カタログ番号１２３１０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＤｙＬｉｇｈｔ３５０－ＣＤ３（１：１００、クローン１４５－２Ｃ１１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ｅＦｌｕｏｒ４５０－ＣＤ４（１：１００、クローンＲＭ４－５、カタログ番号４８－００４２－８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０－ＣＤ８（１：１００、クローン５３－６．７、カタログ番号４７－００８１－８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥＣｙａｎｉｎｅ７－ＩＦＮγ（１：２０、クローンＸＭＧ１．２、カタログ番号２５－７３１１－８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｋｉ６７－ＢＶ６０５（１：５０、クローン１６Ａ８、カタログ番号６５２４１３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｐ－ＳＴＡＴ３－ＰＥ（１：５、クローン４９、ｐ７２７、カタログ番号５５８５５７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。

サイトカイン放出実験では、単一細胞の懸濁液を、モネンシン（サイトカイン放出を遮断するため）及びブレフェルジンを含む細胞活性化カクテルの存在下で６ウェルプレートにまいて、サイトカイン産生を３７℃で３．５～４時間刺激した。ＦＡ３バッファー（ＰＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＦＢＳ）で洗浄した後、ＦＡ３バッファー／Ｆｃブロックに希釈した表面マーカー抗体（１：１００希釈）で室温にて３０分間細胞を染色した。それに続いて洗浄した後に、細胞を１００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒＭ（商標）溶液（ＢＤバイオサイエンス）に４℃で２０分間再懸濁した。インキュベートした後、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液（ＢＤバイオサイエンス）で細胞を洗浄し、抗サイトカイン抗体で４℃にて３０分間染色した。細胞ペレットをＦＡ３バッファーに再懸濁し、試料をＹＥＴＩセルアナライザーにかけた。培養Ｔ細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化（ｐ－ＳＴＡＴ３）及びＫｉ６７発現をフローサイトメトリーで検出するために、刺激投与量のエフリンＢ２－Ｆｃ（２．５μｇ／ｍｌ）で２４～４８時間投与した後、予めクラスター化した対照Ｆｃ、２０μｇ／ｍｌのエフリンＢ２－Ｆｃ又はＰＥＧ化ＴＮＹＬ－ＲＡＷ（４．５μｇ／ｍｌ）で処理した単一細胞懸濁液を、免疫細胞の表面マーカーで染色した。これに続いて、１×ｌｙｓｅ／ｆｉｘバッファー（ＢＤバイオサイエンス）中で３７℃にて３０分間インキュベートした。予備クラスター化は、オービタルシェーカーでＦｃタンパク質をｈＩｇＧと１：３の割合で４℃にて３０分間インキュベートすることによって行った。

ＰＢＳで洗浄した後、試料を冷やしたｐｅｒｍＩＩＩバッファー（ＢＤバイオサイエンス）に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、ｐ－ＳＴＡＴ３抗体又はＫｉ６７抗体で室温にて３０分間染色した。ＦＡ３バッファーで洗浄した後、試料をＹＥＴＩセルアナライザーにかけた。ビーズのみ、単一の抗体で染色した試料、アイソタイプ対照、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照など、さまざまな対照も含めた。生細胞はＡｑｕａ／ｖｉ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を用いてゲーティングした。染色細胞は、コロラド大学デンバーがんフローサイトメトリーコアのＹＥＴＩセルアナライザーにかけた。カルーザ解析ソフトウェアを使用してデータを解析した。

ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ解析
Ｔｒｅｇ及び単球をＬｙ２腫瘍から単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して採取した。単球をＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍｌ）で処理してＭ２マクロファージに分化させた。トータルＲＮＡを、Ｔｒｅｇ及びマクロファージからＲＮｅａｓｙミニプレップキット（キアゲン）を使用して集めた。５μｇのＲＮＡ試料からＭａｘｉｍａファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（サーモサイエンティフィック）を使用した逆転写反応でｃＤＮＡを調製した。逆転写反応物の１：２希釈のアリコート（２μＬ）を、ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を含む１０μＬ反応物中で以下のプライマーを用いて、ｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオ・ラッド）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）に供した。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルを正規化のためのハウスキーピング遺伝子として解析した。同様のＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲプロトコールを用いて、線量１０ＧｙのＲＴ非存在下及び存在下でのＬｙ２腫瘍のＥＰＨＢ４及びＥＦＮＢ２のｍＲＮＡレベルを検出した。

マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）
マスサイトメトリー実験では、腫瘍を採取し、フローサイトメトリーの項で上記したように消化した。単一細胞の懸濁液をＰＢＳで洗浄し、製造業者の指示に従って重金属タグ付き抗体で染色した（フリューダイム、サンフランシスコ、カリフォルニア州）。次の抗体を使用した。ＣＤ４５－Ｙ８９（カタログ番号３０８９００５Ｂ）、ＣＤ３ｅ－Ｓｍ１５２（カタログ番号３１５２００４Ｂ）、ＦｏｘＰ３－Ｇｄ１５８（カタログ番号３１５８００３Ａ）、ＣＤ４－Ｎｄ１４５（カタログ番号３１４５００２Ｂ）、ＣＤ８ａ－Ｅｒ１６８（カタログ番号３１６８００３Ｂ）、ＣＤ１１ｂ－Ｎｄ１４８（カタログ番号３１４８００３Ｂ）、Ｆ４／８０－Ｎｄ１４６（カタログ番号３１４６００８Ｂ）、ＣＤ１１ｃ－Ｎｄ１４２（カタログ番号３１４２００３Ｂ）、Ｌｙ６Ｇ－Ｐｒ１４１、Ｌｙ６Ｃ－Ｎｄ１５０、ＩＣＯＳ－Ｙｂ１７６（カタログ番号３１７６０１４Ｂ）、及びｌｉｖｅ－ｄｅａｄ－Ｐｔ－１９５。染色した細胞を、コロラド大学デンバーがんセンターフローサイトメトリ－コアのＨｅｌｉｏｓマスサイトメーターにかけた。カルーザ又はＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを使用してデータを解析した。

イムノブロッティング
イムノブロッティングでは、タンパク質の細胞ライセートを調製し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにかけ、それに続いてＰＶＤＦ膜に移し、ウエスタンブロッティングを行った。ブロットを、一次抗体を用いて４℃で一晩プローブした。抗ｐ－ＡＫＴ（１：１０００、カタログ番号４０５８）、抗ＡＫＴ（１：１０００、カタログ番号９２７２）、抗Ｂｃｌ－ＸＬ（１：１０００、カタログ番号２７６４）、抗切断型カスパーゼ－３（１：１０００、カタログ番号９５７９）及び抗β－アクチン抗体（１：５０００、カタログ番号１２２６２）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバース、マサチューセッツ州、米国）から購入した。抗ＥｐｈＢ４（クローンｍ２６５）は、Ｖａｓｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国）によって提供された、又はＲ＆Ｄシステムズ（カタログ番号ＡＦ４４６）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体はシグマ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手した。ｐ－ＥｐｈＢ４解析では、ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウス脾臓細胞からＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離し、６ウェルプレートに播き、続いて予めクラスター化した対照Ｆｃ、エフリンＢ２－Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ）、又はＰＥＧ－ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃ（４．５μｇ／ｍｌ）とエフリンＢ２－Ｆｃ（２．５μｇ／ｍｌ）で３７℃にて７２時間処理した。予備クラスター化は上記のように行った。ライセートを集め、上記のように１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。膜を、ｐ－ＥｐｈＢ４（１：１０００、カタログ番号ＰＡ５－６４７９２、サーモフィッシャー）及び抗β－アクチン抗体でプローブした。

免疫蛍光染色
免疫蛍光（ＩＦ）染色を、４％緩衝ホルマリンに固定したパラフィン包埋切片で行った。４μｍの切片にした腫瘍組織を脱パラフィンして水和させ、抗原賦活化バッファー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でスライドを１０～１５分インキュベートすることによって抗原エピトープ賦活化を行った。切片を一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。次の抗体を使用した。ＣＤ１０７ｂ（１：１００、カタログ番号５５０２９２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１６３（１：１００、カタログ番号ｏｒｂ１３３０３、Ｂｉｏｒｂｙｔ）、Ｇｐｒ１８（１：１００、カタログ番号ＮＢＰ２－２４９１８ＳＳ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｆ４／８０（１：５０、カタログ番号ＮＢ６００－４０４ＳＳ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｆｏｘｐ３（１：１０００、カタログ番号ａｂ２００３４、アブカム）、Ｆ４／８０（１：１００、カタログ番号７００７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、及び汎ケラチン（１：１００、カタログ番号４５４５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。一次抗体とのインキュベーションの後、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒタグ付きＩｇＧ二次抗体（１：４００希釈、ライフテクノロジーズ）で処理した。核を、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）で対比染色した。画像は、ニコン蛍光顕微鏡又はオリンパス共焦点顕微鏡を使用して、２０×の対物レンズで撮影した。各実験を少なくとも２回繰り返した。実験群と対照群のそれぞれについて、６～８箇所の無作為に選んだ視野で解析を行った。

ＥＬＩＳＡ
ＴＮＹＬ－ＲΑＷ－Ｆｃ及びｐｃＤＮＡ３対照マウスから採取した血漿試料を分離し、ＥＬＩＳＡに供して、先述のようにＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃのレベルを測定した。簡潔に言うと、９６ウェルプレートを抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ捕捉抗体（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＢＳＡ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）で室温にて１時間ブロックした。１：１００に希釈した血漿試料又は標準物質として組換えヒトＦｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ）を予めコーティングしたウェルに加えた。ヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（１：７００希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を室温で１時間加え、洗浄後、ＴＭＢ基質を加え、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＴＧＦ－β１のレベルを検出するために、血漿試料又は細胞培養上清／条件培地を、製造業者の指示に従ってＴＧＦ－βＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用して分析した。

Ｕ－ｐｌｅｘサイトカインアレイ
ＴＮＹＬ－ＲＡＷ－Ｆｃプラスミドのハイドロダイナミックインジェクションの１１～１８日後（免疫完全マウスモデル）又はＲＴの９６時間後（ヌードマウスモデル）に、後眼窩採血をマウスで行った。血漿を分離し、製造業者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ロックビル、メリーランド州）の指示に従ってＵ－ｐｌｅｘアレイに供した。

ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ、ＴＣＧＡ、及びｍＲＮＡ発現解析
遺伝子発現データを、ＴＣＧＡデータベースのＨＮＳＣＣコホートから入手した（ｎ＝５３０）。ＴＣＧＡは参照ゲノムにアラインメントされ、期待値最大化によるＲＮＡ－Ｓｅｑ（ＲＳＥＭ）を用いて遺伝子転写産物レベルで定量化されたレベル３ＲＮＡ－ｓｅｑデータを提供している。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ解析は先述のように行った。免疫細胞浸潤の信頼できる推定を示すｐ値が＜０．０５の症例のみ、さらなる生存分析に使用した。生存分析には、Ｍ１：Ｍ２のカットオフ値を０．５に設定した。Ｒ２プラットフォームを用いることによって、ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２発現を解析した。

照射
照射は、ＲＳ－２０００照射装置（Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ジョージア州）を１６０ｋＶｐ、１０ｍＡで、又は０．３ｍｍ銅フィルターを備えたＰＸｉ－２２５Ｃｘ画像誘導照射装置（ＰＸｉ ｉｎｃ、ＫＣ）を２２５ｋＶｐ、１３ｍＡで使用して行った。マウスを腹臥位にして、ＣＴスキャンを撮った。投与計画と放射線量の照射は記載の通りに行った。放射線は５．６Ｇｙ／分の線量率で照射した。

統計解析
統計解析はグラフパッドプリズムソフトウェアを用いて行った。実験はすべて、二連又は三連で行い、２～３回繰り返した。２群間の差の統計解析は、スチューデントのｔ検定又は一元配置分散分析を用いて行った。ダネットの事後検定を、複数の実験群を対照群と比較するＡＮＯＶＡ後のさらなる検証に用いた。ｐ値＜０．０５を有意とした。

本明細書で開示及びクレームされているすべての物品及び方法は、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく製造及び実行することができる。本発明の物品及び方法を好ましい実施形態の点から記載してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変形が物品及び方法に適用できることは、当業者に明らかであろう。そのような当業者に明らかな変形及び均等物はすべて、既存するか又は後に開発されるかにかかわらず、添付の請求項によって画定される本発明の趣旨及び範囲内にあるとみなされる。本明細書で言及されている特許、特許出願、及び刊行物はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示している。すべての特許、特許出願、及び刊行物は、各対象刊行物が、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ主題的（ｓｕｂｊｅｃｔｌｙ）に示されている場合と同様に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素（単数又は複数）が少しも存在しない場合でも好適に実行することができる。使用されている用語及び表現は、限定のための用語ではなく、説明のための用語として用いられ、そのような用語及び表現の使用において、示され、記載された特徴又はその部分のいずれの均等物も除外する意図はないが、さまざまな変更が、クレームされた発明の範囲内で可能であることが認識されている。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は本明細書に開示の概念の変更及び変形を用いることができ、そのような変更及び変形は、添付の請求項によって画定される本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。

配列表
添付の配列表に列挙されているアミノ酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定められている通り、アミノ酸の標準的な３文字表記を使用して示されている。

配列番号１は、ヒトエフリンタイプＢ受容体前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿００４４３５．３）である。アミノ酸残基１～１５はシグナル配列をコードする。ＭＥＬＲＶＬＬＣＷＡＳＬＡＡＡＬＥＥＴＬＬＮＴＫＬＥＴＡＤＬＫＷＶＴＦＰＱＶＤＧＱＷＥＥＬＳＧＬＤＥＥＱＨＳＶＲＴＹＥＶＣＤＶＱＲＡＰＧＱＡＨＷＬＲＴＧＷＶＰＲＲＧＡＶＨＶＹＡＴＬＲＦＴＭＬＥＣＬＳＬＰＲＡＧＲＳＣＫＥＴＦＴＶＦＹＹＥＳＤＡＤＴＡＴＡＬＴＰＡＷＭＥＮＰＹＩＫＶＤＴＶＡＡＥＨＬＴＲＫＲＰＧＡＥＡＴＧＫＶＮＶＫＴＬＲＬＧＰＬＳＫＡＧＦＹＬＡＦＱＤＱＧＡＣＭＡＬＬＳＬＨＬＦＹＫＫＣＡＱＬＴＶＮＬＴＲＦＰＥＴＶＰＲＥＬＶＶＰＶＡＧＳＣＶＶＤＡＶＰＡＰＧＰＳＰＳＬＹＣＲＥＤＧＱＷＡＥＱＰＶＴＧＣＳＣＡＰＧＦＥＡＡＥＧＮＴＫＣＲＡＣＡＱＧＴＦＫＰＬＳＧＥＧＳＣＱＰＣＰＡＮＳＨＳＮＴＩＧＳＡＶＣＱＣＲＶＧＹＦＲＡＲＴＤＰＲＧＡＰＣＴＴＰＰＳＡＰＲＳＶＶＳＲＬＮＧＳＳＬＨＬＥＷＳＡＰＬＥＳＧＧＲＥＤＬＴＹＡＬＲＣＲＥＣＲＰＧＧＳＣＡＰＣＧＧＤＬＴＦＤＰＧＰＲＤＬＶＥＰＷＶＶＶＲＧＬＲＰＤＦＴＹＴＦＥＶＴＡＬＮＧＶＳＳＬＡＴＧＰＶＰＦＥＰＶＮＶＴＴＤＲＥＶＰＰＡＶＳＤＩＲＶＴＲＳＳＰＳＳＬＳＬＡＷＡＶＰＲＡＰＳＧＡＶＬＤＹＥＶＫＹＨＥＫＧＡＥＧＰＳＳＶＲＦＬＫＴＳＥＮＲＡＥＬＲＧＬＫＲＧＡＳＹＬＶＱＶＲＡＲＳＥＡＧＹＧＰＦＧＱＥＨＨＳＱＴＱＬＤＥＳＥＧＷＲＥＱＬＡＬＩＡＧＴＡＶＶＧＶＶＬＶＬＶＶＩＶＶＡＶＬＣＬＲＫＱＳＮＧＲＥＡＥＹＳＤＫＨＧＱＹＬＩＧＨＧＴＫＶＹＩＤＰＦＴＹＥＤＰＮＥＡＶＲＥＦＡＫＥＩＤＶＳＹＶＫＩＥＥＶＩＧＡＧＥＦＧＥＶＣＲＧＲＬＫＡＰＧＫＫＥＳＣＶＡＩＫＴＬＫＧＧＹＴＥＲＱＲＲＥＦＬＳＥＡＳＩＭＧＱＦＥＨＰＮＩＩＲＬＥＧＶＶＴＮＳＭＰＶＭＩＬＴＥＦＭＥＮＧＡＬＤＳＦＬＲＬＮＤＧＱＦＴＶＩＱＬＶＧＭＬＲＧＩＡＳＧＭＲＹＬＡＥＭＳＹＶＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＶＮＳＮＬＶＣＫＶＳＤＦＧＬＳＲＦＬＥＥＮＳＳＤＰＴＹＴＳＳＬＧＧＫＩＰＩＲＷＴＡＰＥＡＩＡＦＲＫＦＴＳＡＳＤＡＷＳＹＧＩＶＭＷＥＶＭＳＦＧＥＲＰＹＷＤＭＳＮＱＤＶＩＮＡＩＥＱＤＹＲＬＰＰＰＰＤＣＰＴＳＬＨＱＬＭＬＤＣＷＱＫＤＲＮＡＲＰＲＦＰＱＶＶＳＡＬＤＫＭＩＲＮＰＡＳＬＫＩＶＡＲＥＮＧＧＡＳＨＰＬＬＤＱＲＱＰＨＹＳＡＦＧＳＶＧＥＷＬＲＡＩＫＭＧＲＹＥＥＳＦＡＡＡＧＦＧＳＦＥＬＶＳＱＩＳＡＥＤＬＬＲＩＧＶＴＬＡＧＨＱＫＫＩＬＡＳＶＱＨＭＫＳＱＡＫＰＧＴＰＧＧＴＧＧＰＡＰＱＹ（配列番号１）

配列番号２は、ヒト血清アルブミンプレプロタンパク質のアミノ酸配列（ＮＰ＿０００４６８．１）である。アミノ酸残基２５～６０９は成熟ペプチドをコードする。ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）

Claims (25)

1. 免疫チェックポイント阻害剤と併用して、がんの治療に使用する医薬品を調製するためのＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用であって、前記がんが、白金製剤をベースとした化学療法による治療に抵抗性である、使用。
2. 免疫チェックポイント阻害剤と併用して、がんの治療に使用する医薬品を調製するためのＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用であって、前記がんが、放射線療法による治療に抵抗性である、使用。
3. 免疫チェックポイント阻害剤と併用して、がんの治療に使用する医薬品を調製するためのＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用であって、前記がんが、免疫チェックポイント阻害剤による治療に抵抗性である、使用。
4. 前記がんが、これらに限定されないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、大腸がん、転移性尿路上皮がん、乳がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、中皮腫、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、カポジ肉腫、及び白血病からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
5. がん腫瘍がＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項４に記載の使用。
6. がん腫瘍がエフリンＢ２を発現する、請求項４に記載の使用。
7. がん腫瘍がＰＤ－Ｌ１及びエフリンＢ２を発現する、請求項４に記載の使用。
8. 併用療法が相乗効果をもたらす、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びピジリズマブからなる群より選択されるＰＤ－１抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ及びトレメリムマブからなる群より選択されるＣＴＬＡ－４抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用。
11. 前記ポリペプチド剤が、前記ＥｐｈＢ４タンパク質の単量体リガンド結合部分であり、血清半減期を増加させる改変を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用。
12. ポリペプチド剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）からなる群より選択されるアルブミンと共有結合的又は非共有結合的に結合した配列番号１（「ｓＥｐｈＢ４ポリペプチド」）のアミノ酸１～１９７、１６～１９７、２９～１９７、１～３１２、１６～３１２、２９～３１２、１～３２１、１６～３２１、２９～３２１、１～３２６、１６～３２６、２９～３２６、１～４１２、１６～４１２、２９～４１２、１～４２７、１６～４２７、２９～４２７、１～４２９、１６～４２９、２９～４２９、１～５２６、１６～５２６、２９～５２６、１～５３７、１６～５３７及び２９～５３７からなる群より選択される配列である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２６を含む、請求項１２に記載の使用。
14. 前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５３７を含む、請求項１２に記載の使用。
15. 患者のがんの治療に使用する医薬品を調製するための、単離ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用であって、前記ポリペプチド剤が、前記ＥｐｈＢ４タンパク質の単量体リガンド結合部分であり、血清半減期を増加させる改変を含み、前記がんが、免疫療法治療、化学療法剤による治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体を使用した治療、共刺激又は共阻害分子に対するアゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、又は遮断抗体（免疫チェックポイント阻害剤）を使用した治療、特異的腫瘍抗原に対する除去抗体及び細胞傷害性物質を含む免疫複合体、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、又は融合分子、低分子キナーゼ阻害剤を用いた標的治療、手術を用いた治療、幹細胞移植を用いた治療、並びに放射線を用いた治療からなる群より選択される抗がん治療に抵抗性である、使用。
16. 前記がんが免疫チェックポイント阻害剤による治療に抵抗性である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記がんが、放射線療法による治療に抵抗性である、請求項１５に記載の使用。
18. 前記がんが、白金製剤をベースとした化学療法による治療に抵抗性である、請求項１５に記載の使用。
19. 前記がんが、限定されないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、大腸がん、転移性尿路上皮がん、乳がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、中皮腫、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、カポジ肉腫、及び白血病からなる群より選択される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の使用。
20. がん腫瘍がエフリンＢ２を発現する、請求項１９に記載の使用。
21. ポリペプチド剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡ」）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（「ｓＥｐｈＢ４－ＢＳＡ」）からなる群より選択されるアルブミンと共有結合的又は非共有結合的に結合した配列番号１（「ｓＥｐｈＢ４ポリペプチド」）のアミノ酸１～１９７、１６～１９７、２９～１９７、１～３１２、１６～３１２、２９～３１２、１～３２１、１６～３２１、２９～３２１、１～３２６、１６～３２６、２９～３２６、１～４１２、１６～４１２、２９～４１２、１～４２７、１６～４２７、２９～４２７、１～４２９、１６～４２９、２９～４２９、１～５２６、１６～５２６、２９～５２６、１～５３７、１６～５３７及び２９～５３７からなる群より選択される配列を含む、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の使用。
22. 前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～３２６を含む、請求項２１に記載の使用。
23. 前記ｓＥｐｈＢ４－ＨＳＡが、配列番号２の残基２５～６０９に直接融合した配列番号１の残基１６～５３７を含む、請求項２１に記載の使用。
24. 免疫チェックポイント阻害剤と併用して、がんの治療に使用する医薬品を調製するための、ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２媒介機能を阻害するポリペプチド剤の使用であって、療法が、免疫チェックポイント阻害剤による単剤療法と比較して、全奏効率の向上をもたらす、使用。
25. 併用療法が相乗効果をもたらす、請求項２４に記載の使用。

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