KR20190051983A - 암의 치료를 위한 abx196을 포함하는 조합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한, (i) 화합물 ABX196 및 (ii) 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제를 포함하는 항종양 약제학적 조합물에 관한 것이다.

Description

암의 치료를 위한 ABX196을 포함하는 조합물
본 발명은 암의 치료를 위한 신규한 치료법에 관한 것이다.
수년간의 연구와 치료의 진보에도 불구하고 암은 사망의 주요 원인이다.
화학요법 및 면역요법을 포함한 다수의 치료법들이 존재한다. 그러나, 이러한 치료들이 일부 경우에 효과적일지라도, 이들은 일반적으로 매우 길고 재발이 빈번하다. 게다가, 이들은 환자의 삶의 질에 영향을 미치는 수많은 부작용의 원인이 된다.
새로운 치료법들이 암에 대한 방어에 있어서의 면역계의 연루와 같은 최근에 발견된 암종학(cancerology)의 측면에 작용한다. 그러나, 이러한 치료들이 항상 매우 효과적인 것은 아니다.
따라서, 바람직하게는 현재의 치료법들, 특히 화학요법 및/또는 면역요법의 부작용을 감소시키면서 이들의 효능을 개선시킬 중요한 필요성이 있다.
본 발명은 다른 공지된 항암 치료, 특히 화학요법 및/또는 면역요법과 병용한 특정 NKT 효능제(NKT agonist), 즉 하기 화학식 I의 α-갈락토실세라마이드 유도체 ABX196(α-galactosylceramide derivative ABX196)의 사용이, 특히 공격적인 암에 대한 이들 공지된 치료법의 효능을 상당히 개선시킬 수 있다는 본 발명자들의 예기치 못한 조사결과로부터 야기한다.
화학식 I
Figure pct00001
특히, 본 발명자들은 다른 공지된 항암 치료, 특히 화학요법 및/또는 면역요법과 병용한, 하기 화학식 I의 화합물 ABX196 및 종양 항원을 포함하는 백신 조성물의 사용이 특히 공격적인 암에 대한 이들 공지된 치료법의 효능을 상당히 개선시킬 수 있음을 밝혀내었다.
화학식 I
Figure pct00002
본 발명자들은 실제 독소루비신(doxorubicin) 또는 항-PD-1 단클론 항체(anti-PD-1 monoclonal antibodies)와 병용한, ABX196 및 종양 항원 Trp2를 포함하는 백신 조성물의 사용이 흑색종 마우스 모델에서 이들 화합물의 항종양 효과를 개선시켰음을 입증하였다.
본 발명자들은 또한 독소루비신, 소라페니브(sorafenib) 또는 항-PD-1 단클론 항체와 병용한 ABX196의 사용이 흑색종, 결장직장암, 방광암 및 간암종 마우스 모델에서 이들 화합물의 항종양 효과를 개선시켰으며, 추가로 마우스 모델의 생존을 개선시켰음을 입증하였다.
따라서, 본 발명은,
(i) 화학식 I의 화합물 ABX196
화학식 I
Figure pct00003
및,
(ii) 적어도 하나의 화학요법제(chemotherapeutic agent) 및/또는 적어도 하나의 면역요법제(immunotherapeutic agent)를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 항종양 약제학적 조합물은 종양 항원을 더 포함한다. 특정 양태에서, 화학식 I
Figure pct00004
의 화합물 ABX196은, 종양 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물(iii)에 포함된다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 치료에서 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제와의 조합물로 사용하기 위한, 화학식 I
Figure pct00005
의 화합물 ABX196 및 종양 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 암의 치료에서 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제와의 조합물로 사용하기 위한 하기 화학식 I의 화합물 ABX196에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 조합물은 종양 항원을 더 포함한다.
화학식 I
Figure pct00006
본 발명의 또 다른 목적은,
(i) 하기 화학식 I의 화합물 ABX196의 하나 이상의 투여 단위(dosage units)
화학식 I
Figure pct00007
및
(ii) 적어도 하나의 화학요법제의 하나 이상의 투여 단위 및/또는 면역요법제의 하나 이상의 투여 단위를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제(combined preparation)에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 상기 조합 제제에서 화학식 I
Figure pct00008
의 화합물 ABX196은 종양 항원을 더 포함하는 백신에 포함된다.
하나의 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 화합물 ABX196이 본 발명의 상기 목적에 따르는 백신 조성물에 포함되는 경우, 이것은 상기 백신 조성물에서 보조제(adjuvant)로서 사용된다.
특히, ABX196과 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제의 조합물에 대해 수득된 처리군(treated)/대조군(control) 퍼센트(T/C(%)) 지수(index)는 적어도 하나의 화학요법제 단독 및/또는 적어도 하나의 면역요법제 단독에 대해 수득된 T/C(%) 지수보다 낮다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조합물의 T/C(%)는 42% 이하이다.
처리군/대조군 퍼센트(T/C(%)) 지수는 처리군 종양 체적 중간값(median)을 대조군 종양 체적 중간값으로 나누고 이에 100을 곱함으로써 계산할 수 있다. 예를 들면, 처리군 종양 체적 중간값은 본 발명에 따르는 ABX196과 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제의 조합물의 투여 후 수득되고, 대조군 종양 체적 중간값은 상기 조합물의 비히클의 투여 후 수득되며, 상기 종양 체적은 동시에 평가된다.
발명의 상세한 설명
항종양 약제학적 조합물 ( Antitumor pharmaceutical combination)
본 발명에 따라 사용되는 화학식 I
Figure pct00009
의 화합물 ABX196은 NKT(자연 살해(Natural Killer) T) 세포를 자극하는 것으로 알려진 α-갈락토실유도체(α-galactosylderivative )이다. 본 발명에 따르면, 화합물 ABX196은 또한 이의 약제학적으로 허용되는 염을 가리킨다. 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 ABX196의 생물학적 효과 및 특성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 염을 가리킨다. 약제학적으로 허용되는 염의 검토를 위해, 문헌[Berge, et al. ((1977) J. Pharm. Sd, vol. 66, 1)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조합물(combination)", "치료학적 조합물" 또는 "약제학적 조합물"은 병용 투여(combined administration)를 위한 하나의 투여 단위 형태의 고정된 조합물 또는 부분의 키트를 정의한다. 특정 양태에서, 화합물 ABX196 또는 아래에 정의된 바와 같은 백신 조성물 및 아래에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제는, 독립적으로 동시에 또는 조합 대응물(combination partner)이 상승 효과를 보일 수 있도록 하는 시간 간격 내에 별도로 투여될 수 있다.
특히, 화합물 ABX196 또는 백신 조성물이 화학요법제와 조합하여 사용되는 경우, 이들은 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에 별도로 투여될 수 있다. 유사하게, 화합물 ABX196 또는 백신 조성물이 면역요법제와 조합하여 사용되는 경우, 이들은 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에 별도로 투여될 수 있다.
추가로, 화합물 ABX196 또는 백신 조성물이 하나 이상의 화학요법제와 조합하여 사용되는 경우, 조합물의 성분들 각각은 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에 별도로 투여될 수 있거나, 조합물의 성분들 중의 일부는 독립적으로 동시에 투여될 수 있는 반면 조합물의 나머지 성분들은 간격 내에 별도로 투여될 수 있다.
유사하게, 화합물 ABX196 또는 백신 조성물이 하나 이상의 면역요법제와 조합하여 사용되는 경우, 조합물의 성분들 각각은 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에 별도로 투여될 수 있거나, 조합물의 성분들 중의 일부는 독립적으로 동시에 투여될 수 있는 반면 조합물의 나머지 성분들은 간격 내에 별도로 투여될 수 있다.
유사하게, 화합물 ABX196 또는 백신 조성물이 화학요법제 및 면역요법제와 조합하여 사용되는 경우, 조합물의 성분들 각각은 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에 별도로 투여될 수 있거나, 조합물의 성분들 중의 일부는 독립적으로 동시에 투여될 수 있는 반면 조합물의 나머지 성분들은 간격 내에 별도로 투여될 수 있다.
조합물을 이루는 구성성분들은 동시에(simultaneously), 반-동시에(semi-simultaneously), 별도로(separately), 또는 조합물의 최대 효능을 수득하도록 하는 기간에 걸쳐 간격을 두고 투여될 수 있다; 각 투여는 급속 투여(rapid administration) 내지 연속 관류(continuous perfusion)로 이들의 지속 시간이 달라질 수 있다.
따라서, 본 발명의 조합물의 화합물은 두 개, 세 개 또는 그 이상의 별도의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 적어도 하나의 투여와 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제의 적어도 하나의 투여 간의 시간은 바람직하게는 약 4일이다.
바람직하게는, 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제는 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 투여 4일 후에 투여된다. 바람직하게는, 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제는 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 투여 4일 전에 투여된다.
화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 적어도 하나의 투여와 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제의 적어도 하나의 투여 간의 시간은 바람직하게는 약 7일이다.
바람직하게는, 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제는 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 투여 7일 후에 투여된다. 바람직하게는, 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제는 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 백신 조성물의 투여 7일 전에 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여될 수 있는 조성물이다. 그러나, 이들 조성물은 국부 국소 요법의 경우에는 경구, 피하 또는 복강 내 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 이러한 조성물은 종양 내(intratumorally)로 투여된다.
용어 "조합 제제(a combined preparation)"는 상기 정의된 바와 같은 조합 대응물 (i) 및 (ii)가 독립적으로 또는 구분된 양의 조합 대응물(combination partners)을 갖는 상이한 고정 조합물의 사용에 의해, 즉, 동시에 또는 상이한 시점에서 복용될 수 있다는 의미에서 특히 "부분의 키트"를 가리키는 것으로 본원에서 정의된다(이것은 또한 화학요법제와 면역요법제 둘 다가 사용되는 경우, 또는 몇몇 화학요법제 및/또는 몇몇 면역요법제가 사용되는 경우 대응물(ii)의 상이한 성분들에 대해서도 적용된다). 그 후, 부분의 키트의 부분들은 예를 들어, 동시에 또는 연대순으로 시차를 두고, 즉 상이한 시점에서 및 부분의 키트의 임의의 부분들에 대해 동일하거나 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조합 제제의 조합 대응물은 바람직하게는 투여 단위 형태로 제형화된다. 용어 "투여 단위"는 사람 대상체 및 다른 포유류를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 가리키며, 각 단위는 임의로 적합한 약제학적 부형제와 공동으로 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 예비결정된 양의 활성 물질(들)을 함유한다.
조합 제제에서 투여하고자 하는 조합 대응물(i) 대 조합 대응물(ii)(또는 해당될 경우 조합 대응물 (ii)의 상이한 성분들)의 총 양의 비는, 예를 들어, 치료하고자 하는 환자 하위 집단의 요구 또는 단일 환자의 요구에 대처하기 위해 변할 수 있다.
백신 조성물
본 발명의 맥락에서 사용되는 백신 조성물은, 하기 화학식 I의 화합물 ABX196 및 종양 항원을 포함한다.
화학식 I
Figure pct00010
"종양 항원(tumor antigen)"이란 본원에서 종양 조직 상에 독점적으로 발현되거나, 종양 조직과 관련되거나, 종양 조직에서 과발현되는 항원을 의미한다. 예시적인 종양 항원은 5-α-리덕타제(5-α-reductase), α-페토프로테인(α-fetoprotein, AFP), AM-1, APC, APRIL, B 흑색종 항원 유전자(B melanoma antigen gene, BAGE), β-카테닌, Bcl12, Bcr-Abl, 브라큐리(Brachyury), CA-125, 카스파제(caspase)-8(CASP-8, 또한 FLICE로도 공지됨), 카텝신(Cathepsin) S, CD19, CD20, CD21/보체 수용체 2(complement receptor 2, CR2), CD22/BL-CAM, CD23/FcεRII, CD33, CD35/보체 수용체 1(CRT), CD44/PGP-1, CD45/백혈구 공통 항원(leucocyte common antigen, LCA), CD46/막 보조인자 단백질(membrane cofactor protein, MCP), CD52/CAMPATH-1, CD55/붕괴 촉진 인자(decay accelerating factor, DAF), CD59/프로텍틴, CDC27, CDK4, 암배 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), c-myc, 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, cox-2), 결장직장암 유전자 결실(deleted in colorectal cancer gene, DCC), DcR3, E6/E7, CGFR, EMBP, Dna78, 파네실 트랜스퍼라제(farnesyl transferase), 섬유아세포 성장 인자-8a(fibroblast growth factor-8a, FGF8a), 섬유아세포 성장 인자-8b(FGF8b), FLK-1/KDR, 엽산 수용체, G250, G 흑색종 항원 유전자 패밀리(GAGE-family), 가스트린 17, 가스트린-방출 호르몬, 강글리오시드(ganglioside) 2(GD2)/강글리오시드 3(GD3)/강글리오시드-모노시알산(monosialic acid)-2(GM2), 고나도트로핀 방출 호르몬(gonadotropin releasing hormone, GnRH), UDP-GlcNAc:R1Man(α1-6)R2[GlcNAc 내지 Man(α1-6)]β1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제(acetylglucosaminyltransferase) V(GnTV), GP1, gp100/Pme1-17, gp-100-in4, gp15, gp75/티로신-관련 단백질(tyrosine-related protein)-1(gp75/TRP-1), 인간 융모막 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin, hCG), 헤파라나제(heparanase), Her2/neu, EGFR, 인간 유방 종양 바이러스(human mammary tumor virus, HMTV), 70 kD 열-충격 단백질(heat-shock protein, HSP70), 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase, hTERT), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(insulin-like growth factor receptor)-1(IGFR-1), 인터류킨(interleukin)-13 수용체(IL-13R), 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS), Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, 흑색종 항원-암호화 패밀리(적어도 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, 및 MAGE-4를 포함하는 MAGE-패밀리), 맘마글로빈(mammaglobin), MAP17, T-세포-1에 의해 인지되는 멜란-A/흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(mesothelin), MIC A/B, MT-MMPs, 뮤신(mucin), 고환-특이 항원(testes-specific antigen) NY-ESO-1, 오스테오넥틴(osteonectin), p15, P170/MDR1, p53, p97/멜라노트랜스페린(melanotransferrin), PAI-1, 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), PRAME, 프로바신(probasin), 프로게니포이에틴(progenipoietin), 전립선-특이 항원(prostate-specific antigen, PSA), 전립선-특이 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA), 전립선산 포스파타제(prostatic acid phosphatase, PAP), RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX-패밀리, STAT3, STn, TAG-72, 형질전환 성장 인자(transforming growth factor)-α(TGF-α), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), uPA, uPAR, TNF-α 전환 효소(TNF-α Converting Enzyme, TACE), 티모신(Thymosin)-β-15, 종양 괴저 인자(tumor necrosis factor)-α(TNF-α), TP1, TRP-2, 티로시나제(tyrosinase), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), ZAG, p16INK4, PD-1, PD-L1, PD-L2, 글리피칸(glypican)-3, 클라우딘(claudin)-3, 클라우딘-4, BMCA, 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 상기 종양 항원은 TRP-2이다.
하나의 양태에서, 상기 종양 항원의 서열은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4, 바람직하게는 서열번호 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 종양 항원은 치료하고자 하는 특정 암에 따라 선택된다. 당업자는 실제 어떤 종양 항원이 특정 암과 특이적으로 관련되는지를 알고 있다. 예를 들면, TRP-2 종양 항원은 흑색종 암 세포에 의해 발현된다는 것은 당업자로부터 널리 공지되어 있다.
따라서, 특히 바람직한 양태에서, 종양 항원은 TRP-2이고 치료하고자 하는 암은 흑색종이다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 백신 조성물은 추가의 보조제를 포함할 수 있다. ABX196 이외의 추가의 보조제는 당업자들로부터 널리 공지되어 있으며 알루미늄 염, 수중유 에멀젼, 예를 들어 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant) 또는 MF59®, PRR 리간드, TLR3 및 RLR 리간드, 예를 들어 폴리(I:C), TLR4 리간드, 예를 들어 LPS 또는 모노포스포릴 지질 A(or monophosphoryl lipid A, MPLA), TLR5 리간드, 예를 들어 플라겔린(flagellin), TLR7/8 리간드, 예를 들어 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines), TLR9 리간드, 예를 들어 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotides) 및 NOD2 리간드, 예를 들어 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide, MDP)를 포함한다.
그러나, 화합물 ABX196은 본 발명의 맥락에서 사용되는 백신 조성물에 보조제로서 존재할 수 있기 때문에, 바람직한 양태에서 백신 조성물 만이 보조제로서 화합물 ABX196을 포함한다. 바람직한 양태에서, 화합물 ABX196은 본 발명에 따르는 상기 백신 조성물에서 보조제로서 사용된다.
화학요법제
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "화학요법제"는 항암성 화학요법에서 사용되는 임의의 세포 성장 억제 화합물 또는 세포독성 화합물을 가리킨다. 이러한 화합물은 항원이 아닌 것으로 이해된다. 이러한 화학요법제는 당업자들로부터 널리 공지되어 있으며 다음을 포함한다:
- 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 클로람부실(chlorambucil) 및 멜팔란(melphalan)과 같은 머스타드 질소(nitrogen mustards); 티오테파(thiotepa)와 같은 에틸렌아민(ethyleneamines) 및 메틸멜라민(methylmelamines); 프로카바진(procarbazine)과 같은 메틸하이드라진 유도체(methylhydrazine derivatives); 부술판(busulfan)과 같은 알킬설포네이트(alkylsulfonates); 카르무스틴(carmustine) 또는 로무스틴(lomustine)과 같은 니트로소우레아(nitrosoureas); 다카바진(dacarbazine) 및 테모졸로미드(temozolomide)와 같은 트리아젠(triazenes); 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)과 같은 백금 배위 착물(platinum coordination complexes)을 포함하는 알킬화제(alkylating agents);
- 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 엽산 유사체(folic acid analogs); 플루오로우라실(fluorouracil), 시타라빈(cytarabine), 겜시타빈(gemcitabine) 및 카페시타빈(capecitabine)과 같은 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs); 머캅토푸린(mercaptopurine), 펜토스타틴(pentostatin), 클라드리빈(cladribine) 및 플루다라빈(fludarabine)과 같은 푸린 유사체(purine analogs)를 포함하는 항대사산물(antimetabolites);
- 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine) 및 빈크리스틴(vincristine)과 같은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids);
- 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 탁산(taxanes);
- 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)와 같은 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins);
- 토포테칸(topotecan) 및 이리노테칸(irinotecan)과 같은 캄프토테신(camptothecins);
- 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플리코마이신(plicomycin) 및 에피루비신(epirubicin)과 같은 항암 항생제;
- 미톡산트론(mitoxantrone), 미토마이신(mitomycin) 및 블레오마이신(bleomycin)과 같은 안트라센디온(anthracenediones);
- 돌라스타틴(dolastatins)과 같은 유사분열 억제제;
- L-아스파라기나제(L-asparaginase)와 같은 효소;
- 하이드록시우레아(hydroxyurea)와 같은 치환된 우레아;
- 트레티노인(tretinoin)과 같은 분화제(differentiating agents);
- 이마티니브(imatinib) 또는 브리오스타틴(bryostatin)과 같은 프로테인 키나제 억제제(proteine kinase);
- 게프티니브(geftinib) 및 보르테조미브(bortezomib)와 같은 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitors);
- 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)와 같은 부신피질 억제제(adrenocortical suppressants); 프레드니손(prednisone)과 같은 아드레노코르티코스테로이드(adrenocorticosteroids); 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate) 및 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone)과 같은 프로게스틴(progestins); 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol)과 같은 에스트로겐; 타목시펜(tamoxifen), 이독시펜(idoxifen), 드롤록시펜(droloxifene), 진독시펜(zindoxifene), 트리옥시펜(trioxifene), ICI 182,780, EM-800 및 토레미펜(toremifene)과 같은 항-에스트로겐; 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole) 및 엑세메스탄(exemestane)과 같은 아로마타제 억제제(aromatase inhibitors); 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate)와 같은 안드로겐(androgens); 플루타미드(flutamide)와 같은 항-안드로겐(anti-androgens); 및 류프롤리드(leuprolide)와 같은 고나도트로핀-방출제(gonadotropin-releasing agents)를 포함하는 호르몬 및 길항제.
물론, 암의 유형에 따라, 화학요법제의 임의의 적합한 조합물이 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, 적어도 하나의 화학요법제는 독소루비신, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 적어도 하나의 화학요법제는 독소루비신 또는 키나제 억제제, 예를 들어 소라페니브이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 화학요법제는 독소루비신 또는 소라페니브, 보다 바람직하게는 독소루비신이다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 화학요법제는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 이것은 아래에 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 추가로 포함할 수 있다.
상이한 화학요법제들의 조합물이 사용되는 경우, 이들 화학요법제는 단일 약제학적 조성물로 또는 별도의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 화학요법제는 당업자로부터 널리 공지되어 있는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 당업자들에 의해 인지되는 바와 같이, 화학요법제(들)를 포함하는 약제학적 조성물(들)은 의도된 투여 경로(들)와 적합하도록 적절하게 제형화될 수 있다. 적합한 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥 내, 피부 내(intradermal), 피하, 근육 내, 복강 내, 경구(예를 들어, 구강, 흡입, 비강 및 폐 스프레이), 피부 내, 경피(transdermal)(국소), 경점막(transmucosal), 안구 내(intraocular) 및 직장 투여를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 화학요법제는 정맥 내 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 화학요법제의 투여량 계획(dosage regimen)은 사용되는 특정 제제에 따라 좌우될 것이다. 이러한 투여량 계획은 당업자로부터 널리 공지되어 있다. 이들은 전형적으로 투여된 화학요법제의 특정 농도와 특정 투여 체계를 조합한다.
예를 들면, 독소루비신은 바람직하게는 주기당 40 내지 75mg/m2의 용량으로 3-5분의 정맥 내 주입에 의해 투여되며, 각 주기는 3 내지 4주의 간격으로 이전 주기와 떨어져 있으며 주기는 바람직하게는 550mg/m2의 최대 총 용량에 도달할 때까지 반복된다.
그러나, 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 백신 조성물과 화학요법제의 병용이 상기 화학요법제의 항암 효과를 상당히 상승작용적(synergically)으로 증가시키기 때문에, 표준 투여량 계획에 비해 사용되는 화학요법제의 용량 및/또는 투여 지속시간을 감소시킬 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 화학요법제는 특히 단독으로 또는 다른 화학요법제 및/또는 면역요법제와 조합하여 사용되는, 이 화학요법제에 대해 권장되는 표준 투여량 계획보다 낮은 투여량 계획으로 투여된다.
면역요법제
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역요법제"는 종양 항원을 표적화하는 항체 또는 림프구와 같은, 암성(cancerous) 세포에 대해 새로운 면역 반응을 개시하거나 기존 면역 반응을 촉진시킴으로써 항종양(antineoplastic) 효과를 매개하는 항암제를 가리킨다. 면역요법제는 악성 세포에 대해 숙주 면역계를 (재-)활성화시키는 이들의 능력에 기초하여 "능동" 또는 "수동"으로 분류될 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 면역요법제는 항원이 아니다.
바람직하게는, 면역요법제는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같이 종양 항원에 특이적인 항체이다.
"항체"는 두 개의 중쇄가 디설파이드 결합에 의해 서로 결합되고 각 중쇄가 디설파이드 결합에 의해 경쇄에 결합되는 자연 항체 또는 기존 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 기존 항체 및 이의 단편, 뿐만 아니라 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 특히 단일 도메인 항체의 가변 중쇄, 및 키메라, 인간화, 이중특이 또는 다중특이 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항체는 또한 상보성 결정 영역(complementary determining regions)이 단일 도메인 폴리펩타이드의 일부인 항체인 "단일 도메인 항체"를 포함한다. 단일 도메인 항체의 예는 중쇄 항체(heavy chain antibodies), 자연적으로 경쇄가 없는 항체, 종래의 4쇄 항체로부터 유도되는 단일 도메인 항체, 조작된 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 마우스, 사람, 낙타, 라마, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유도될 수 있다. 단일 도메인 항체는 낙타과 종, 예를 들면 낙타, 단봉 낙타, 라마, 알파카 및 과나코(guanaco)에 의해 생산되는 것과 같은 경쇄가 없는 중쇄 항체로 알려진 자연 발생적 단일 도메인 항체일 수 있다.
경쇄(light chains)가 없는 이러한 단일 도메인 항체의 가변 중쇄는 "VHH" 또는 "나노바디"로서 당업계에 공지되어 있다. 기존 VH 도메인과 유사하게, VHH는 네 개의 FR 및 세 개의 CDR을 함유한다. 나노바디는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다는 이점을 가지며, 그 결과로서 적절하게 접힌 기능적 나노바디가 높은 수율을 달성하면서 시험관 내 발현에 의해 생산될 수 있다. 게다가, 나노바디는 매우 안정하며, 프로테아제의 작용에 내성이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 특정 항체에 대해 지시된 단일 아미노산 조성의 항체 분자를 가리킨다.
단클론 항체는 B 세포 또는 하이드리도마의 단일 클론에 의해 생산될 수 있지만, 또한 재조합체일 수 있으며, 즉 단백질 조작에 의해 생산될 수 있다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역(들) 및 하나 이상의 다른 항체(들)로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 조작된 항체를 가리킨다. 특히 키메라 항체는 다른 항체, 특히 사람 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인과 공동으로 비-사람 동물(non-human animal)로부터 유도된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 비-사람 동물로서, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 등과 같은 임의의 동물들이 사용될 수 있다. 키메라 항체는 또한 적어도 두 개의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다중특이(multispecific) 항체를 나타낼 수 있다. 한 양태에서, 키메라 항체는 마우스 기원의 가변 도메인 및 사람 기원의 불변 도메인을 갖는다.
용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 초기에는 전적으로 또는 부분적으로 비-사람 기원(non-human origin)이고, 사람에서 면역 반응을 없애거나 최소화하기 위해 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역에서 특정 아미노산을 대체하도록 변형된 항체를 가리킨다. 인간화 항체의 불변 도메인은 대부분의 시간에 사람 CH 및 CL 도메인이다. 한 양태에서, 인간화 항체는 사람 기원의 불변 도메인을 갖는다.
(기존) 항체의 "단편"은 비손상 항체의 일부, 특히 비손상 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디(diabodies), 항체 단편으로부터 형성된 이중특이 및 다중특이 항체를 포함한다. 기존 항체의 단편은 또한 중쇄 항체 또는 VHH와 같은 단일 도메인 항체일 수 있다.
용어 "Fab"는 약 50,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 나타내며, 여기서 IgG를 프로테아제, 파파인으로 처리함으로써 수득된 단편들 중에서, H 쇄의 N-말단측의 대략 절반 및 전체 L 쇄는 디설파이드 결합을 통해 함께 결합된다.
용어 "F(ab')2"는 IgG를 프로테아제, 펩신으로 처리함으로써 수득된 단편들 중에서 힌지 영역의 디설파이드 결합을 통해 결합된 Fab보다 약간 더 큰, 약 100,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 가리킨다.
용어 "Fab'"는 F(ab')2 단편의 힌지 영역의 디설파이드 결합을 절단함으로써 수득되는, 약 50,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 가리킨다.
단일 쇄 Fv("scFv") 폴리펩타이드는 펩타이드-암호화 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합체로부터 통상적으로 발현되는 공유 결합된 VH::VL 이형이량체이다. 사람 scFv 단편은 특히 유전자 재조합 기법을 사용함으로써 적합한 형태로 유지되는 CDR을 포함한다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv의 결합에 의해 자발적으로 형성될 수 있거나, 2가 sc(Fv)2와 같은 펩타이드 링거에 의해 1가 scFv를 커플링시킴으로써 생성될 수 있다.
"dsFv"는 디설파이드 결합에 의해 안정화된 VH::VL 이형이량체이다.
"(dsFv)2"는 펩타이드 링커에 의해 커플링된 두 개의 dsFv를 나타낸다.
용어 "이중특이 항체" 또는 "BsAb"는 단일 분자 내에 두 개의 항체의 항원-결합 부위를 구비하는 항체를 가리킨다. 따라서, BsAb는 두 개의 상이한 항원을 동시에 결합시킬 수 있다.
용어 "다중특이 항체"는 단일 분자 내에 둘 이상의 항체의 항원-결합 부위를 구비하는 항체를 나타낸다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 가리키며, 이러한 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH-VL). 너무 짧아서 동일한 쇄에서 두 개의 도메인 사이에 쌍을 형성하지 못하는 링커를 사용함으로써, 도메인이 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다.
특정 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 단클론 항체 또는 이의 단편, 특히 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디 및 VHH로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단편이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 단클론 항체이다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 Her2/neu, EGFR, VEGF, CD20, CD52, CD33, TACE, 카텝신 S(cathepsin S), uPA, uPAR, PD-1, 글리피칸(Glypican)-3, 클라우딘(claudin)-3, 클라우딘-4, BMCA 및 CTLA4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 항원에 특이적인 항체, 특히 단클론 항체이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 PD-1에 특이적인 항체, 특히 단클론 항체이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체이다: 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-PD-L1, 항-GITR, 항-CD38, 항-4-1BB, 항-OX40, 항-LAG3 및 항-TIM-3.
특히 바람직한 양태에서, 면역요법제는 단클론 항-PD1 항체이다.
상기 종양 항원에 특이적인 단클론 항체의 예는 당업자로부터 널리 공지되어 있으며 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(Herceptin)(trastuzumab(Herceptin)), 알렘투주맙(alemtuzumab), 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 베바시주맙(bevacizumab), 이필리무맙(ipilimumab), 니볼루맙(nivolumab)(MBS-936558, MDX-1106 또는 ONO-4538 항-PD-1 항체로도 알려짐), 펨브롤리주맙(MK-3475 항-PD-1 항체로도 알려짐), 피딜리주맙(pidilizumab)(CT-011 항-PD-1 항체로도 알려짐), BMS-936559 항-PD-L1 항체, MPDL3280A 항-PD-L1 항체, MEDI4736 항-PD-L1 항체, MSB0010718C 항-PD-L1 항체, D1(A12) 항-TACE 항체, A9 항-TACE 항체, Fsn0503h 항-카텝신 S 항체, ATN-658 항-uPAR 항체, 또는 J6M0 항-BMCA 항체를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizuma) 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 또한 상기 정의된 바와 같은 단클론 항체 및 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 화학요법제를 포함하는 접합체일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 입양 전달된 T 세포이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "입양 세포 전달(adoptive cell transfer)"은 일반적으로 (1) 순환 또는 종양-침윤 림프구의 수집, (2) 이들의 선택/변형/확장/생체외 활성화 및 (3) 가장 흔히 림프구제거 예비-컨디셔닝 후 및 면역자극제와 조합하여 이들의 환자에의 (재-)투여를 수반하는 세포-기반 항암 면역요법의 변형태를 가리킨다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 면역요법제는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 이것은 아래에 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상이한 면역요법제의 조합이 사용되는 경우, 이들 면역요법제는 단일 약제학적 조성물로 또는 별도의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 면역요법제는 당업자로부터 널리 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 당업자들에 의해 인지되는 바와 같이, 면역요법제(들)를 포함하는 약제학적 조성물(들)은 의도된 투여 경로(들)에 적합하도록 적절하게 제형화될 수 있다. 적합한 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥 내, 피부 내, 피하, 근육 내, 복강 내, 경구(예를 들어, 구강, 흡입, 비강 및 폐 스프레이), 피부 내, 경피(국소), 경점막, 안내 및 직장 투여를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 면역요법제는 정맥 내 또는 종양 내 투여된다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 적어도 하나의 면역요법제는 정맥 내 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제의 투여량 계획은 사용되는 특정 제제에 따라 좌우될 것이다. 이러한 투여량 계획은 당업자로부터 널리 공지되어 있다. 이들은 전형적으로 투여된 면역요법제의 특정 농도 및 특정 투여 체계를 구비한다.
예를 들면, 니볼루맙은 바람직하게는 2주마다 3mg/체중 kg의 용량으로 60분의 정맥 내 주입에 의해 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 면역요법제는 바람직하게는 다중 투여를 포함하는 주기에 걸쳐 투여되며, 각 투여는 바람직하게는 3 내지 4일의 시간 간격을 둔다.
그러나, 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 백신 조성물과 면역요법제의 조합된 사용이 상기 면역치료제의 항암 효과를 상승작용적으로 상당히 증가시키기 때문에, 표준 투여량 계획에 비해 사용되는 면역요법제의 용량 및/또는 투여 지속시간을 감소시키는 것이 가능하다.
따라서, 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 면역요법제는 특히 단독으로 또는 다른 면역요법제 및/또는 화학요법제와 조합하여 사용되는, 이 면역요법제에 대해 권장되는 표준 투여량 계획보다 낮은 투여량 계획으로 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
"약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용되는"은 포유류, 특히 사람에게 경우에 따라 투여되는 경우 부작용, 알레르기 또는 다른 원치않는 반응을 야기하지 않는 분자 완전체 및 조성물을 가리킨다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 비-독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화재 또는 임의 유형의 제형화 보조제를 가리킨다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 당업자로부터 널리 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 당업자들에 의해 인지되는 바와 같이, 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 의도된 투여 경로와 적합하도록 적절하게 제형화될 수 있다. 적합한 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥 내, 피부 내, 피하, 근육 내, 복강 내, 경구(예를 들어, 구강, 흡입, 비강 및 폐 스프레이), 피부 내, 경피(국소), 경점막, 안내 및 직장 투여를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피하, 비강 내 또는 종양 내, 보다 바람직하게는 정맥 내 투여된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 정맥 내 또는 종양 내 투여된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 한 번, 또는 여러 번(예를 들면 주 용량에 이어 한 번 또는 수 회의 추가 용량(들)을 포함함) 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용되는 백신 조성물은 한 번만 투여된다(따라서 추가 용량의 임의의 투여를 필요로 하지 않는다). 본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 적어도 0.2μg/환자의 화합물 ABX196의 용량으로 전달될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 약제학적 조합물 및/또는 백신 조성물은 적어도 3ng/kg, 예를 들면 3ng/kg 내지 5ng/kg의 화합물 ABX196의 용량으로 전달될 수 있다. 유효량은 또한 투여 경로, 뿐만 아니라 다른 제제와의 공동-사용의 가능성에 따라 변할 것이다.
암의 치료
본 발명은 추가로, 다음을 포함하는 상기 섹션 "항종양 약제학적 조합물"에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 항종양 약제학적 조합물을 이를 필요로 하는 환자에서 투여함을 포함하여, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다:
(i) 화학식 I의 화합물 ABX196
Figure pct00011
및,
(ii) 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제, 및/또는 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제. 하나의 양태에서, 상기 ABX196 화합물은 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 종양 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물에 포함된다.
본 발명은 또한 암의 치료용 항종양 약제학적 조합물의 제조를 위한,
(i) 화학식 I의 화합물 ABX196
화학식 I
Figure pct00012
및,
(ii) 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제의 용도에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 ABX196 화합물은 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 종양 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물에 포함된다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 화학식 I
Figure pct00013
의 화합물 ABX196을 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 면역요법제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에서 투여, 특히 공동-투여함을 포함하여, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 상기 ABX196 화합물은 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 종양 항원을 추가로 포함하는 백신 조성물에 포함된다.
본 발명은 또한 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제와 조합하여 암의 치료용의 백신 조성물의 제조를 위한, 화학식 I
Figure pct00014
의 화합물 ABX196 및 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 종양 항원의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 화학식 I
Figure pct00015
의 화합물 ABX196을 (a) 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 종양 항원, 및 (b) 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 면역요법제와 조합하여, 이를 필요로 하는 환자에서 투여, 특히 공동-투여함을 포함하여, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 종양 항원, 및 (b) 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역요법제와 조합하여 암의 치료용 약제의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물 ABX196의 용도에 관한 것이다:
화학식 I
Figure pct00016
.
본 발명의 상기 명시된 측면 모두에서, 화합물 ABX196은 백신 조성물에 포함되는 경우, 보조제로서 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "공동-투여(co-administration)" 또는 "병용 투여(combined administration)"는 단일 환자에의 선택된 치료제의 투여를 포함하는 것으로 정의되며, 제제가 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되는 것은 아니라는 치료 계획을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따르면, 용어 "대상체(subject)" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 암에 걸렸거나 암에 걸릴 것 같은 사람 또는 비-사람 포유류로 의도된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 진행을 억제시키거나, 예방함을 의미한다.
본 발명의 화합물의 "치료학적 유효량"이란 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합당한 이익/위험 비로 암을 치료(예를 들면, 성장을 제한하거나 종양 전이를 지연 또는 차단)시키기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 화합물의 1일 총 사용량은 건전한 의학적 판단 범위 내에서 담당의에 의해 결정되는 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 대상체를 위한 구체적인 치료학적 유효량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도, 사용되는 특정 화합물의 활성, 사용되는 특정 조합물, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 사용되는 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도, 치료의 지속시간, 사용되는 특정 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물 등 의학 분야에 널리 공지된 인자들을 포함한 다양한 인자들에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, 목적하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮은 수준으로 화합물의 용량을 시작하여 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 재량 내에 있다.
본 발명에 따르는 항종양 약제학적 조합물은 암을 치료하는데 특히 유용하다.
본 발명의 항종양 약제학적 조합물은 진화의 진행 단계의 암을 포함하여, 임의의 발달 단계에 있는 감지할 수 있는 암성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 항종양 약제학적 조합물은 매우 공격적인 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
보다 특히, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "암의 치료"는 다음의 특징들 중의 적어도 하나를 포함한다: 암과 관련된 증상들의 완화, 암성 종양의 정도의 감소(예를 들어 종양 성장의 감소), 암성 종양의 상태의 안정화(예를 들어 종양 성장의 억제), 암의 추가의 확산의 예방(예를 들어 전이), 암의 발병 또는 재발의 예방, 암의 진행의 지연 또는 방해(예를 들어 종양 성장의 감소) 또는 암의 상태의 개선(예를 들어 종양 크기의 감소).
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "암" 또는 "암성 종양"은 세포들의 집단이, 다양한 정도로, 증식 및 분화를 정상적으로 지배하는 제어 메카니즘에 반응하지 않게 되는 장애를 가리킨다. 암은 원발성 종양, 및 종양 전이를 포함한 다양한 유형의 악성 신생물 및 종양을 가리킨다. 본 발명의 조합물에 의해 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는 림프구증식성 장애, 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체부암, 골암, 간암, 위암, 결장암, 췌장암, 갑상선의 암, 두경부암, 중추 신경계의 암, 말초 신경계의 암, 피부암, 신장암, 간세포 암종, 간세포암, 간모세포종, 횡문근육종, 식도 암종, 갑상선 암종, 신경절모세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문육종(rhabdotheliosarcoma), 침습성 관 암종, 유두상 선암, 흑색종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 신세포 암종, 부신종, 부신모양 선암종, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 태생성 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 고환 종양, 소세포, 비-소세포 및 대세포 폐 암종을 포함한 폐 암종, 방광 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막 세포종, 송과체종, 망막아종, 신경아세포종, 결장 암종, 직장 암종, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 비만세포성 백혈병, 다발성 골수종, 골수성 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종을 포함한 모든 유형의 백혈병 및 림프종을 포함한 조혈성 악성종양, 및 간암종이다.　
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 치료되는 암은 흑색종, 신장암, 간암종, 췌장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 맥락에서 치료되는 암은 흑색종, 간암종, 방광암 및 결장직장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 치료되는 암은 흑색종이다.
병용 요법은 개별 치료와 관련된 차등있는 독성의 측면에서 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 하나의 화학요법제로의 또는 하나의 면역요법제로의 치료는 ABX196 또는 본 발명의 백신 조성물에서는 보이지 않는 특정 독성을 야기할 수 있다. 이로써, 이러한 차등있는 독성은 각 치료가, 함께 병용 요법이 병용 제제의 구성분 각각의 독성을 피하면서 치료 용량을 제공하도록, 독성이 존재하지 않거나 최소인 용량으로 투여될 수 있게 한다. 게다가, 병용 치료의 결과로서 달성되는 치료 효과가 증진되기 때문에, 제제 각각의 용량을 훨씬 더 감소시킬 수 있으며, 따라서 관련 독성을 훨씬 더 큰 정도로 낮출 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명에 따르는 암의 치료방법은 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 본 발명의 백신 조성물의 1회, 바람직하게는 정맥 내 투여에 이어 4일 후, 상기 섹션 "화학요법제"에 정의된 바와 같은 화학요법제, 특히 독소루비신의 1회, 바람직하게는 정맥 내 주입에 의한 투여를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 암의 치료방법은 화합물 ABX196 또는 상기 섹션 "백신 조성물"에 정의된 바와 같은 본 발명의 백신 조성물의 1회, 바람직하게는 정맥 내 투여에 이어 7일 후, 상기 섹션 "면역요법제"에 정의된 바와 같은 면역요법제, 특히 니볼루맙의 바람직하게는 정맥 내 주입에 의한 1차 투여에 이어 4일 후, 상기 면역요법제의 바람직하게는 정맥 내 주입에 의한 2차 투여에 이어 바람직하게는 추가로 3일 후, 상기 면역요법제의 바람직하게는 정맥 내 주입에 의한 3차 투여에 이어, 추가로 바람직하게는 4일 후, 상기 면역요법제의 바람직하게는 정맥 내 주입에 의한 4차 투여를 포함한다.
본 발명은 아래 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.
도 1: 실시예 1에서, D3에 TRP2-ABX196, D10, D14, D17 및 D21에 항-PD-1 항체 또는 TRP2-ABX196과 항-PD-1 항체의 조합물로 처리한 C57BL/6 마우스에서 이식된 B16-F10 종양의 체적 평균 및 중간값.
도 2: 실시예 1에서, TRP2-ABX196, 항-PD-1 항체 또는 TRP2-ABX196과 항-PD-1 항체의 조합물로 처리된 B16-F10 종양을 갖는 C57BL/6 마우스의 생존률.
***: p < 0.001; ****: p < 0.0001; n.s.: 유의적이지 않음.
도 3: 실시예 1에서, D3에 TRP2-ABX196, D7에 독소루비신 또는 TRP2-ABX196과 독소루비신의 조합물로 처리된 C57BL/6 마우스에서 이식된 B16-F10 종양의 체적 평균 및 중간값.
도 4: 실시예 1에서, TRP2-ABX196, 독소루비신 또는 TRP2-ABX196과 독소루비신의 조합물로 처리된 B16-F10 종양을 갖는 C57BL/6 마우스의 생존률.
**: p < 0.01 ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001; n.s. : 유의적이지 않음.
도 5: 비히클, 항-PD-1 단클론 항체, i.v 투여된 ABX196, 또는 i.v 투여된 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물에 노출된 실시예 5의 B16F10을 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3). 평균 +/- SEM.
도 6: 비히클, 항-PD-1 단클론 항체, i.t 투여된 ABX196, 또는 i.t 투여된 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물에 노출된 실시예 5의 B16F10을 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3). 평균 +/- SEM.
도 7: 비히클, 항-PD-1 단클론 항체, i.v 투여된 ABX196, 또는 i.v 투여된 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물에 노출된 실시예 5의 B16F10을 갖는 마우스의 생존률. 평균 +/- SEM.
도 8: 비히클, 항-PD-1 단클론 항체, i.t 투여된 ABX196, 또는 i.t 투여된 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물에 노출된 실시예 5의 B16F10을 갖는 마우스의 생존률. 평균 +/- SEM.
도 9: 비히클, 항-PD-1 단클론 항체, i.v 투여된 ABX196, 또는 i.v 투여된 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물에 노출된 실시예 6의 CT-26을 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3). 평균 +/- SEM.
도 10: 비히클, 항-PD-1 단클론 항체, i.v 투여된 ABX196, 또는 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물에 노출된 실시예 6의 MBT-2를 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3). 평균 +/- SEM
도 11: 비히클(2), 항-PD-1 단클론 항체(4), i.v 투여된 ABX196(3), 또는 항-PD-1 단클론 항체와 ABX196의 조합물(1)에 노출된 실시예 6의 MBT-2를 갖는 마우스의 생존률.
도 12: 20일째에 실시예 7의 마우스의 각 그룹으로부터의 간의 종양 침습의 %. G1: 비히클; G2: 소라페니브; G3: 소라페니브+ABX196; G4: 독소루비신; G5 독소루비신 + ABX196; G6: 항-PD-1; G7 항-PD-1 + ABX196
서열의 설명
Figure pct00017
실시예
실시예 1
당해 실시예는 화합물 ABX196 및 종양 항원을 포함하는 백신 조성물이 독소루비신과 같은 화학요법제 또는 항-PD-1 항체와 같은 면역요법제의 항암 효과를 증가시킴을 입증한다.
1. 재료 및 방법
1.1. 화합물
사용된 백신 조성물은 펩타이드 CI II-TRP2180 -188 및 ABX196 보조제를 포함한다.
서열 KFGWTGPDCNRKKPA GGNCSVYDFFVWLHYY(서열 번호: 1)의 펩타이드 Cl II-TRP2180-188은, 멜라닌세포(melanocyte)에서 과발현되는, 종양 관련 항원 티로시나제-관련 단백질-2(tumor associated antigen tyrosinase-related protein-2)로부터의 면역우세 펩타이드(immunodominant peptide)(SVYDFFVWL(서열 번호: 3))와 융합된 클래스 II 에피토프(epitope)(KFGWTGPDCNRKKPA(서열 번호: 2))로 이루어진다.
보조제 ABX196은 NKT 세포를 활성화시키는 특성을 갖는다.
사용된 화학요법제는 독소루비신(DOXO CELL, Cell Pharm)이었다.
사용된 면역요법제는 항-PD-1 항체(ref.: BE0146, BioXcell; 클론: RMP1-14, 각각: 마우스; 이소타입: Rat IgG2a; 저장 조건: +4℃)였다.
1.2. 화합물 비히클
독소루비신은 NaCl 0.9%에서 희석시켰다.
항-PD-1 항체는 제조자의 권고에 따라 인산염 완충 염수(phosphate buffered saline, PBS) 또는 다른 적합한 비히클 중에서 제조하였다.
Cl II-TRP2 펩타이드(5mg/관)는 50mg/mL의 농도로 DMSO에 재현탁시켰다.
보조제 ABX196은 250μg/mL의 용액으로 제공되었다.
Cl II-TRP2 펩타이드 및 ABX196을 함유하는 백신의 최종 제형은 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 제조하였다.
3일째에 그룹 1에서 사용되는 비히클 용액(섹션 2.1.2. 참조)은 CL II-TRP2/ABX196 백신에 관한 것과 동일한 최종 농도로 인산염 완충 염수(PBS)에 희석시킨 DMSO를 함유하였다.
1.3. 처리 용량
펩타이드 Cl II-TRP2는 1μg의 보조제 ABX196과 함께 마우스당 50μg의 용량으로 투여하였다.
항-PD-1 항체는 10mg/kg의 용량으로 투여하였다.
독소루비신은 12mg/kg의 용량으로 투여하였다.
1.4. 투여 경로
백신 조성물은 마우스의 미정맥에 정맥 내 경로에 의해 주사하였다(IV, 농축괴).
항-PD-1 항체는 마우스의 복강에 주사하였다(복강 내, IP).
독소루비신은 마우스의 미정맥(caudal vein)에 정맥 내 주사하였다(IV, 농축괴).
모든 그룹에서, 백신 조성물은 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다(즉, 몸무게가 20g인 한 마리의 마우스에 대해, 200μL의 백신 조성물이 투여되었다).
1.5. 암 세포주 및 배양 조건
1.5.1. 암 세포주(Cancer cell lines)
사용된 세포주가 아래 표 1에 상세되어 있다.
사용된 세포주
세포주 타입 종 기원
B16-F10 흑색종(Melanoma) 마우스 ATCC a
a 미국 버지니아주 머내서스에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)
B16-F10 세포주는 C57BL/6J 마우스에서 자발적으로 발생하는 흑색종으로부터 야기된 폐 전이로부터 확립되었다.
1.5.2. 세포 배양 조건
세포를 이들 각각의 배양 배지에서 가습 대기(5%　CO2, 95% 공기) 중에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다(아래 표 참조). 배양 배지는 10% 태아 소 혈청(ref: 3302, Lonza)이 보충된 2mM L-글루타민(ref: BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)을 함유하는 DMEM이었다. 종양 세포가 플라스틱 플라스크에 부착된다. 실험적 사용을 위해, 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘이 없는 행크 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중에서 트립신-버센(trypsin-versene)(ref: BE17-161E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리시키고, 완전 배양 배지의 첨가에 의해 중화시켰다. 세포를 혈구계산기에서 계수하고 이들의 생존력을 0.25% 트리판 블루 배제 검정(trypan blue exclusion assay)에 의해 평가하였다.
1.6. 동물의 사용
1.6.1. 동물
95마리의 6-7주령의 건강한 암컷 C57BL/6(C57BL/6J) 마우스를 JANVIER LABS(Le Genest-Saint-Isle, France)로부터 입수하였다. 동물을 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지시켰다.
동물 수용 및 실험 과정은 실험 동물의 관리와 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따라 실현하였다.
1.6.2. 수용 조건
동물을 제어된 환경 조건하에서 수용실에 유지시켰다:
- 온도: 22±2℃,
- 습도 55±10%,
- 광주기(Photoperiod)(12h 명/12h 암),
- HEPA 여과된 공기,
- 재순환 없이 시간당 15회 공기 교환. 　
동물 울타리친 장소에 기술된 바와 같이 깔개, 음식과 물, 환경적 및 사회적 농화(그룹 수용)를 갖는 멸균된 적당한 공간을 제공하였다:
- 탑 필터 폴리카보네이트 유로스텐다드 타입 III 또는 IV 케이지,
- 옥수숫대 깔개(ref: LAB COB 12, SERLAB, France),
- 25 kGy 조사된 식이(Irradiated diet)(Ssniff® Soest, Germany),
- 면역적격 설치류를 위한 완전 식품 - R/M-H 압출물,
- 0.2μm 물에서 멸균, 여과됨,
- 환경적 농화(SIZZLE-dri kraft -　D20004 SERLAB, France).
2. 처리
2.1. 피하 B16-F10 흑색종을 갖는 마우스에서 PD-1 표적화 항체 또는 독소루비신과 조합한 신규한 백신의 항종양 활성 연구
2.1.1. 동물에서 B16-F10 종양의 유도
종양은 200μL의 PBS 완충액 중의 1x106개 B16-F10 세포를 95마리 C57BL/6 암컷 동물의 우측 옆구리에 피하 주사하여 유도하였다. 우측 옆구리에 종양 세포를 주사한 날을 D0으로 간주하였다.
2.1.2. 처리 스케줄
D3에, 95마리 중의 90마리를 이들의 체중에 따라 각 15마리로 하여 6개 그룹으로 무작위화하였다(그룹 1-6).
통계 검정(분산 분석, ANOVA)을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 그룹들 간의 동질성을 시험하기 위해 실시하였다.
· 그룹 1로부터의 동물은 3일째에 백신 조성물에 대해 사용된 비히클의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체에 대해 사용된 비히클의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 2로부터의 동물은 3일째에 1μg의 ABX196과 함께 50μg의 Cl II-TRP2의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 3으로부터의 동물은 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 4로부터의 동물은 3일째에 1μg의 ABX196과 함께 50μg의 CL II-TRP2의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 5로부터의 동물은 7일째에 12mg/kg으로 독소루비신의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 6으로부터의 동물은 3일째에 1μg의 ABX196과 함께 50μg의 CL II-TRP2의 1회 IV 주사 및 7일째에 12mg/kg으로 독소루비신의 1회 IV 주사를 제공받았다.
처리 스케줄(Treatment schedules)은 아래 표 2에 요약되어 있다.
처리 스케줄
그룹 동물 수 처리 용량 경로 처리 스케줄
1 15 비히클 - IV/IP D3-IV/TWx2 IP
2 15 CL II-TRP2/ABX196 50μg/1μg IV D3에 Q1Dx1
3 15 항-PD-1 Ab 10mg/kg IP D10/D14/D17/D21에 TWx2
4 15 CL II-TRP2/ABX196 50μg/1μg IV D3에 Q1Dx1
항-PD-1 Ab 10mg/kg IP D10/D14/D17/D21에 TWx2
5 15 독소루비신 12mg/kg IV D7에 Q1Dx1
6 15 CL II-TRP2/ABX196 50μg/1μg IV D3에 Q1Dx1
독소루비신 12mg/kg IV D7에 Q1Dx1
총 90
동물의 모니터링은 섹션 2.2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
2.2. 동물 모니터링
2.2.1. 임상적 모니터링
생존력 및 거동을 매일 기록하였다. 체중은 종양 세포의 주사때까지 1주일에 2회 측정하다가 그후 1주일에 3회 측정하였다. 종양의 길이 및 폭은 캘리퍼스로 1주일에 3회 측정하였고 종양의 체적은 하기 식에 의해 추정하였다:
Figure pct00018
2.2.2. 인도적 종점(Humane endpoints)
- 통증, 고통 또는 괴로움의 징후: 통증 자세, 통증 안면 마스크, 거동,
- 정상 체중의 10%를 초과하지만(개별 종양을 계산에 넣음) 1,500mm3를 초과하지 않는 종양(우측 옆구리에서의 종양 체적/MFP 및 좌측 옆구리에서의 종양 체적의 합/MFP을 계산에 넣음),
- 보행 또는 영양을 방해하는 종양,
- 궤양이 생긴 종양 또는 조직 짓무름,
- 연이어 2일간 지속되는 20% 체중 감소,
- 좋지 못한 신체 상태, 쇠약, 악액질(cachexia), 탈수,
- 외부 자극에 대한 수의적 반응의 장기 부재,
- 빠르고 부자연스러운 호흡, 빈혈, 상당한 출혈,
- 신경학적 징후: 빙글빙글 돌기, 경련, 마비,
- 체온의 지속적인 감소,
- 복부 팽만.
2.2.3. 부검(Necropsy)
부검(맨눈 검사)은 연구 중인 모든 종료된 동물에 대해, 및, 가능하다면, 모든 안락사된 빈사상태의 또는 시체로 발견된 동물에 대해 수행하였다.
2.3. 동물 과정
2.3.1. 마취
이소플루란(Isoflurane) 가스 마취를 종양 접종 및 i.v. 주사에 사용하였다.
2.3.2. 안락사
동물의 안락사는 가스 마취제 과잉-투여(이소플루란)에 이어 경추 탈골 또는 방혈에 의해 수행하였다.
3. 데이터 처리
3.1. 건강 파라미터
다음의 건강 평가 기준을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 결정하였다:
- 동물의 개별 및 평균 체중을 제공하였다.
- 평균 체중 변화(Mean body weight change, MBWC): 처리된 동물의 평균 체중 변화를 퍼센트로 계산하였다(B일째 체중 마이너스 A일째 체중을 A일째 체중으로 나눔). MBWC가 계산된 간격을 체중 곡선 및 체중 측정일의 함수로서 선택하였다.
3.2. 효능 파라미터(Efficacy parameters)
치료 효능은 대조군 동물에 비해 처리된 동물의 종양 체적에 대한 백신 조성물의 효과 측면에서 평가하였다. 다음의 항종양 효능 평가 기준을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 결정하였다:
- 개별, 평균 및 중간값 종양 체적을 제공하였다.
- 종양-비함유 마우스의 수를 제공하였다.
마우스 생존률을 또한 모니터링하였으며 효능 파라미터로서 사용하였다. 생존률 곡선을 작성하였다.
퍼센트 처리군/ 대조군(T/C (%) 지수)는 14일째에 처리군 종양 체적 중간값을 대조군 종양 체적 중간값으로 나누고 100을 곱하여 계산한다. 42% 이하의 T/C %는 암 치료 분과의 약물 평가 지사(NCI)에 의해 유의적인 항종양 활성으로 간주된다.
Figure pct00019
종양 성장 억제가 또한 항종양 효과를 반영하며 하기 식에 따라 계산된다:
Figure pct00020
50%보다 높은 % TGI는 활성인 것으로 간주된다.
3.3. 통계 분석
정의된 시간에서의 평균 종양 체적을 모든 처리에 대해 Kruskall-Wallis 검정을 사용하여 GrapadPrism 소프트웨어(버전 6.07)로 분석하였다. 모든 처리들 간의 유의적인 차이(P < 0.05)는 Dunn's 다중 비교 검정을 사용하여 쌍별(pairwise) 비교가 뒤따랐다. 생존률은 GrapadPrism 소프트웨어(버전 6.07)로 로그-순위(Mantel-Cox) 검정을 사용하여 분석하였다. 모든 처리들 간의 유의적인 차이(P　<　0.05)는 로그-순위(Mantel-Cox) 검정을 사용한 쌍별 비교가 뒤따랐다.
4. 결과
4.1. 피하 B16-F10 흑색종을 갖는 마우스에서 PD-1 표적화 항체 또는 독소루비신과 조합한 본 발명의 백신 조성물( TRP2 - ABX196 )의 항종양 활성 연구
4.1.1. 독성 파라미터
평균 체중 곡선을 구하였으며, 마우스 개별 체중에 대한 처리의 효과를 연구하였다.
일반적인 상태에 있어서의 약화는 관찰되지 않았으며 임상적 상태는 어떤 처리군이든 연구 동안 처리된 동물에 대해 여전히 양호하였다.
TRP2-ABX196으로 면역화된 세 개의 마우스 그룹에 대해, 면역화한지 2일후에 중요한 체중 감소, 즉, 대략 10% 감소가 측정되었다. 체중 감소는 모든 마우스에서 일시적이었으며 이들은 5일째에 체중을 신속하게 회복하였다.
체중이 처리 기간 동안 안정화되었던 TRP2-ABX196과 독소루비신의 조합물로 처리된 마우스를 제외하고는, 체중 발달이 모든 다른 처리군에서 유사하였다.
따라서, 백신 TRP2-ABX196 단독 또는 조합의 투여 후 일시적인 체중 감소를 제외하고는, B16-F10 종양을 가진 C57BL/6J 마우스는 모든 처리를 잘 견뎌내었다.
4.1.2. 항종양 활성 분석
개별, 평균 및 중간값 종양 체적 곡선이 도 1 및 3에 나타내어져 있다.
마우스 생존률 곡선이 도 2 및 4에 나타내어져 있다.
일수로 중간값 생존 시간의 요약이 아래 표 3에 나타내어져 있다.
실험 그룹당 생존률 중간값(일).
처리군 생존률 중간값 (일)
비히클 17
TRP2-ABX196 21
항-PD-1 Ab 17
TRP2-ABX196 + 항-PD-1 Ab 28
독소루비신 21
TRP2-ABX196 + 독소루비신 26
D17에서 종양 체적의 통계 분석이 아래 표 4에 나타내어져 있다.
D17에서 처리 간의 종양 성장의 통계 분석. D17에서 모든 처리의 전반적인 비교: P 값 < 0.0001 (Kruskal-Wallis 검정). 처리들 간의 쌍별 비교: Dunn's 다중 비교 검정에 따르는 P 값.
처리군 Vehic . TRP2 - ABX196 α-PD-1 TRP2 - ABX196 + α-PD-1 Doxo . TRP2 - ABX196 + Doxo.
Vehic . - ns ns *** ns ***
TRP2 - ABX196 ns - ns ns ns ns
α-PD-1 ns ns - *** ns ****
TRP2 - ABX196 + α-PD-1 *** ns *** - ns ns
Doxo . ns ns ns ns - *
TRP2 - ABX196 + Doxo. *** ns **** ns * -
Vehic. : 비히클; α-PD-1 : 항-PD-1 항체; Doxo.: 독소루비신
*: P < 0.05; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001
D19에서 종양 체적의 통계 분석은 아래 표 5에 나타내어져 있다.
D19에서 처리들 간의 종양 성장의 통계 분석. D19에서 모든 처리의 전반적인 비교 : P 값 < 0.0001 (Kruskal-Wallis 검정). 처리들 간의 쌍별 비교 : Dunn's 다중 비교 검정에 따르는 P 값.
처리군 Vehic . TRP2 - ABX196 α-PD-1 TRP2 - ABX196 + α-PD-1 Doxo . TRP2 - ABX196 + Doxo.
Vehic . - ns ns ns ns **
TRP2 - ABX196 ns - ns ns ns ns
α-PD-1 ns ns - ** ns ***
TRP2 - ABX196 + α-PD-1 ns ns ** - ns ns
Doxo . ns ns ns ns - *
TRP2 - ABX196 + Doxo. ** ns *** ns * -
Vehic. : 비히클; α-PD-1 : 항-PD-1 항체; Doxo.: 독소루비신
*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001
세 개의 하위그룹에서 D17 및 D19에서의 종양 체적의 통계 분석은 아래 표 6에 나타내어져 있다.
D17 및 D19에서 세 개의 하위그룹 간의 종양 성장의 통계 분석. 기준 그룹으로서 TRP2-ABX196을 갖는 세 가지 그룹의 통계 분석:
D17 D19
P 값 - Kruskal - Wallis 검정 a 0.0228 0.0121
TRP2 - ABX196 + 항-PD-1 Ab b * ns
TRP2 - ABX196 + 독소루비신 b * **
a: 세 가지 그룹(TRP2-ABX196, TRP2-ABX196 + 항-PD-1 Ab 및 TRP2-ABX196 + 독소루비신이 고려된다)
b: TRP2-ABX196을 기준 그룹으로 하는 Dunn's 다중 비교 검정
*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001
마우스 생존률의 통계 분석은 아래 표 7에 나타내어져 있다.
처리들 간의 마우스 생존률의 통계 분석. 모든 생존률 곡선의 전반적인 비교 : P* < 0.0001, 쌍별 비교의 요약:
처리군 TRP2 - ABX196 α-PD-1 TRP2 - ABX196 + α-PD-1 Doxo . TRP2 - ABX196 + Doxo.
비히클 0.0001** 0.279 < 0.0001 0.0015 < 0.0001
α-PD-1 - 0.0002 0.0710 0.624 0.22
Doxo . < 0.0001 - 0.1285
α-PD-1 : 항-PD-1 항체; Doxo.: 독소루비신
* 로그-순위(Mantel-Cox) 검정
** : 볼드체 숫자는 비교된 그룹들 간의 유의적인 차이를 가리킨다(P　<　0.05).
14일째의 항-종양 활성 지수.
TRP2 / ABX196 항-PD-1 독소루비신 TRP2 / ABX196 +
항-PD-1 		TRP2 / ABX196 +
독소루비신
T/C 33,5 99,8 56,3 11,8 15,4
TGI 63,1 22,5 52,7 90,5 78,5
항-PD-1 Ab와 조합된 TRP2-ABX196의 항종양 활성 분석
B16-F10 종양을 갖는 마우스를 D3에 TRP2-ABX196 백신, D10, D14, D17 및 D21에 항-PD-1 Ab 또는 이들 둘 다의 조합으로 처리하였다. 종양 성장의 동력학이 도 1에 나타내어져 있다.
예상대로, 비히클-처리 그룹에 비해 항-PD-1 Ab 처리와 관련된 항-종양 활성은 없었다. 이러한 관찰은 항-PD-1이 어떤 활성을 하는지 입증함을 보여주는 T/C 및 TGI 값에 의해 뒷받침된다(표 8; T/C > 42% 및 TGI < 50%). 이와 달리, TRP2-ABX196으로의 마우스 처리는 비히클-처리 그룹에 비해 B16-F10 종양의 보다 느린 성장을 초래하였다. T/C 및 TGI 값은 TRP2/ABX196 활성의 항 종양 활성을 반영한다(표 8; T/C < 42% 및 TGI > 50%). TRP2/ABX196의 항종양 활성은 항-PD-1 항체와 조합하여 더욱 개선되며, 각각 15% 미만 및 90% 초과인 T/C 및 TGI 값(표 8)에 의해 또한 나타내어지는 바와 같이 후자의 그룹에서 14일째까지 종양 성장의 완전한 안정화를 갖는다. NCI 가이드라인에 따르면, 15% 미만의 T/C가 치료의 높은 효능을 입증하기 때문에 이러한 값은 매우 활성적인 치료를 나타낸다.
D17에서의 종양 성장의 엄격하고 철저한 통계 분석(표 5)은 모든 그룹간의 종양 체적의 유의적인 차이 및 비히클-처리 그룹에 비해 TRP2-ABX196 백신 및 항-PD-1 단독으로 처리된 마우스의 그룹에 대한 종양 체적의 매우 유의적인 감소를 나타낸다.
통계 분석의 힘을 증가시키고 조합물 그룹 대 백신-처리 그룹 간의 차이를 입증하는 것을 목표로 하여, 후속의 통계 분석을 세 가지 그룹, 즉 TRP2-ABX196, TRP2-ABX196 + 항-PD-1 Ab 및 TRP2-ABX196 + 독소루비신으로 수행하였다(표 6). 이러한 분석은 TRP2-ABX196 및 항-PD-1 항체와 조합된 TRP2-ABX196 간의 D17에서의 종양 체적의 유의적인 감소를 나타내지만 이러한 차이는 19일째에 유의도에 도달하지 못했다.
마우스 생존률이 도 2에 예시되어 있다. TRP2-ABX196 및 항-PD-1 항체와 조합된 TRP2-ABX196으로 처리된 마우스의 생존률은 비히클-처리된 그룹에 비해 유의적으로 개선된 반면(표 7) 증가는 TRP2-ABX196 백신 단독에 비해 조합물 처리에 대해 유의도에 가까웠다(P　= 0.0710).
독소루비신과 조합된 TRP2-ABX196의 항종양 활성 분석
B16-F10 종양을 갖는 마우스를 D3에 TRP2-ABX196 백신, D7에 독소루비신 또는 이들 둘 다의 조합으로 처리하였다. 종양 성장의 동력학이 도 3에 나타내어져 있다.
독소루비신 단독으로 처리된 마우스는 비히클-처리 그룹에 비해 종양 성장의 약하고 비유의적인(표 4 및 5) 감소를 나타내었다. TGI는 50%보다 약간 더 높지만, T/C 값은 42%보다 우수하게 남아 있었으며, 이는 독소루비신의 항종양 효능의 부족을 나타낸다. 독소루비신과 조합된 TRP2-ABX196의 조합물로 처리된 마우스는 14일째까지 종양 성장의 완전한 안정화를 나타내었다; D17 및 D19에서 종양 체적의 감소는 실험의 완전한 통계 분석시 비히클-처리 그룹에 비해 유의도(significance)에 도달하였다(표 4 및 5). TRP2/ABX196과 독소루비신의 상승 효과는 또한 각각 <42% 및 > 50%인 T/C 및 TGI 값에 의해 입증된다(표 8).
세 가지 그룹의 후속적인 통계 분석(표 6) 후, TRP2-ABX196 및 독소루비신과 조합된 TRP2-ABX196 간의 D17 및 D19에서의 종양 체적의 유의적인 감소가 발견되었다.
마우스 생존률이 도 4에 예시되어 있다. 독소루비신과 조합된 TRP2-ABX196으로 처리된 마우스의 생존률은 비히클-처리된 그룹에 비해 유의적으로 개선된 반면(표 7) 생존률 증가는 각 처리 양식 단독에 비해 유의도에 도달하지 못했다.
모든 실험 그룹에 대한 생존률 중간값의 종합이 표 3에 나타내어져 있다.
5. 결론
당해 실시예의 목적은 TRP2-ABX196 백신을 항-PD-1 항체 또는 면역원성 세포사를 유도하는 것으로 알려진 화학요법제 독소루비신과 조합하는 것이었다.
시험된 화합물은, 단독으로 또는 조합하여, 동물이 잘 견디었으며 약물-관련된 심각한 독성 또는 사망은 기록되지 않았다.
10%에 가까운 일시적인 체중 감소가 TRP2-ABX196 백신을 제공받은 모든 그룹에서 관찰되었지만 모든 마우스는 신속하게, 즉, 단일 백신 주사 후 2 내지 5일에 이들의 정상 체중을 회복하였다.
TRP2-ABX196 백신으로 처리된 마우스의 생존률은 비히클-처리 그룹에 비해 유의적으로 개선되었다. 조합물 그룹 둘 다에 대해, 항-종양 활성은 항-PD-1 항체 또는 독소루비신과 조합되는 경우 각각 28일 및 26일로 증가되어 21일의 생존률 중간값을 갖는 백신 단독에 비해 더욱 개선되었다. 생존률 증가는 백신 단독에 비해 TRP2-ABX196 백신과 항-PD-1 항체의 조합물로 유의도에 가까웠다(P = 0.071). TRP2/ABX196 및 독소루비신 처리가 항-종양 효과를 나타내기는 하지만, 이러한 처리는 마우스를 조합물로 처리한 경우 16%보다 더 낮은 T/C 비(표 8 참조)에 의해 반영되는 바와 같이 본 발명의 조합물(ABX196 플러스 항-PD-1 또는 플러스 독소루비신)에 의해 개선된다. 15% 미만에서, 처리는 NCI 가이드라인에 따라 매우 활성인 것으로 간주된다. 동일 선상에서, TGI(종양 성장 억제(tumor growth inhibition))는 조합물 처리의 존재하에서 78% 이하이며, 이것은 조합물 처리가 매우 활성임을 입증한다.
이러한 결과는 B16-F10 모델의 강한 공격성 및 이의 불량한 특기할 만한 면역원성의 맥락에서 주목할 만하다. 중요하게도, 실험은 많은 수의 주사된 종양 세포, 즉, 동물당 백만 개로 수행하였으며, 이것은 종양의 완전한 퇴행이 관찰되지 않았던 이유를 가능성있게 설명할 수 있다.
실시예 2
당해 실시예는 다른 α-갈락토실세라마이드 유도체를 보조제로서 포함하는 다른 백신 조성물에 비해, ABX196을 보조제로서 포함하는 본 발명의 백신 조성물로 수득된 특수한 효과를 기술한다.
재료 및 방법
실험은 마우스에게 5X105개 B16-F10 세포를 투여함을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
사용된 다른 α-갈락토실세라마이드 유도체(α-galactosylceramide derivative)는 다음 화학식의 α-GalCer이었다:
Figure pct00021
- 1차 실험의 처리 스케줄은 다음과 같았다:
Figure pct00022
- 2차 실험의 처리 스케줄은 다음과 같았다:
Figure pct00023
- 3차 실험의 처리 스케줄은 다음과 같았다:
Figure pct00024
- 4차 실험의 처리 스케줄은 다음과 같았다:
Figure pct00025
그룹당 5마리 마우스를 희생시키고 D12 및 D16에 부검하였다.
종양을 수집하고 다음 집단의 유동 세포 분석을 수행하였다:
· T 세포독성 집단 : CD45+/CD3+/CD8+/TNFα/퍼포린/그랜자임
· Treg 집단 : CD45+/CD3+/CD4+/CD8-/FoxP3+
실시예 3
1. 연구 목적
이소성 B16-F10 흑색종 모델에서 ABX196 및 실시예 2에 정의된 바와 같은 α-Gal-Cer의 항-종양 활성을 평가한다.
이소성 B16-F10 흑색종 모델에서 독소루비신 처리와 조합된 ABX196 및 α-Gal-Cer의 항-종양 활성을 평가한다.
2. 재료 및 방법
실험은 다음을 제외하고는 실시예 1에 대한 것과 동일하다.
시험 및 기준 물질 비히클
독소루비신은 NaCl 0.9%에서 희석시켰다.
ABX196은 250μg/mL의 용액으로서 제공되었다.
α-Gal-Cer는 1mg/mL의 용액으로서 제공되었다.
ABX196 또는 αGalCer의 희석은 PBS 완충액 중에서 수행하였다.
7일째에 그룹 1에서 사용된 비히클 용액은 ABX196 시험 항목과 동일한 최종 농도로 인산염 완충 염수(PBS)에 희석시킨 DMSO를 함유하였다.
처리 용량
ABX196 및 α-Gal-Cer 화합물은 마우스당 10 또는 100ng의 용량으로 투여하였다.
독소루비신은 12mg/kg의 용량으로 투여하였다.
투여 경로
시험 물질은 마우스의 미정맥에 정맥 내 경로에 의해 주사하였다(IV, 농축괴).
독소루비신은 마우스의 미정맥에 정맥 내 주사하였다(IV, 농축괴).
모든 그룹에서, 시험 물질(ABX196 및 α-Gal-Cer)은 마우스의 가장 최근 체중에 따라 5mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다(즉, 체중이 20g인 한 마리의 마우스에 대해, 100μL의 시험 물질이 투여되었다). 독소루비신은 10mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다.
3. 실험 설계 및 처리
3.1.1. 동물에서 B16-F10 종양의 유도
종양은 200μL의 PBS 완충액 중의 5x105개 B16-F10 세포를 195마리의 C57BL/6 암컷 동물의 우측 옆구리에 피하 주사하여 유도하였다. 우측 옆구리에 종양 세포를 주사한 날짜를 D0로 간주하였다.
3.1.2. 처리 스케줄
D7에, 195 마리 중 150 마리를 그후 이들의 종양 체적에 따라 각 15마리 동물로 하여 10개 그룹으로 무작위화하였다(그룹 1-10). D7에서의 체적이 너무 작다면, 특히 측정 가능한 종양을 나타내지 않는 마우스에서, 무작위화는 이들의 체중에 따라 실시하였다.
통계 검정(분산 분석)은 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 그룹들 간의 동질성을 시험하기 위해 실시하였다.
처리 스케줄이 아래 표에 요약되어 있다:
Figure pct00026
· 그룹 1로부터의 동물은 7일 및 10일째에 시험 물질 비히클의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 2로부터의 동물은 10일째에 10ng의 ABX196의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 3으로부터의 동물은 10일째에 10ng의 α-Gal-Cer의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 4로부터의 동물은 10일째에 100ng의 ABX196의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 5로부터의 동물은 10일째에 100ng의 α-Gal-Cer의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 6으로부터의 동물은 7일째에 12mg/kg으로 독소루비신의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 7로부터의 동물은 7일째에 12mg/kg의 독소루비신의 1회 IV 주사 및 10일째에 10ng의 ABX196의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 8로부터의 동물은 7일째에 12mg/kg의 독소루비신의 1회 IV 주사 및 10일째에 100ng의 ABX196의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 9로부터의 동물은 7일째에 12mg/kg의 독소루비신의 1회 IV 주사 및 10일째에 10ng의 α-Gal-Cer의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 10으로부터의 동물은 7일째에 12mg/kg의 독소루비신의 1회 IV 주사 및 10일째에 100ng의 α-Gal-Cer의 1회 IV 주사를 제공받았다.
실시예 4
1. 연구 목적
파트 1: 이소성(ectopic) B16-F10 흑색종 모델에서 백신 CL II-TRP2/ABX196 또는 CL II-TRP2/α-Gal-Cer과 항-PD-1 항체의 조합물의 항-종양 활성을 평가한다
파트 2: CL II-TRP2/ABX196 백신 단독으로 처리되거나 항-PD-1 항체 처리와 조합하여 처리된 마우스로부터의 B16-F10 종양에서 면역 침윤물의 특성화.
2. 재료 및 방법
실험의 파트 1은 다음을 제외하고는 실시예 1에 대한 것과 동일하다.
시험 및 기준 물질 비히클
항-PD-1 항체는 제조자의 권고에 따라 인산염 완충 염수(PBS) 또는 다른 적합한 비히클 중에서 제조하였다.
Cl II-TRP2 펩타이드(5mg/관)는 50mg/mL의 농도로 DMSO에 재현탁시켰다.
보조제 ABX196은 250μg/mL의 용액으로서 제공되었다.
보조제 α-Gal-Cer는 1mg/mL의 용액으로서 제공되었다.
Cl II-TRP2 펩타이드 및 ABX196을 함유하는 백신의 최종 제형은 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 제조하였다.
3일째에 그룹 1에서 사용되는 비히클 용액은 CL II-TRP2/ABX196 백신에 대한 것과 동일한 최종 농도로 인산염 완충 염수(PBS)에 희석시킨 DMSO를 함유하였다.
처리 용량
펩타이드 Cl II-TRP2를 100ng의 보조제 ABX196 또는 α-Gal-Cer과 함께 마우스당 50μg의 용량으로 투여하였다.
항-PD-1 항체는 10mg/kg의 용량으로 투여하였다.
투여 경로
시험 물질을 마우스의 미정맥에서 정맥 내 경로에 의해 주사하였다(IV, 농축괴).
항-PD-1 항체를 마우스의 복강에 주사하였다(복강 내, IP).
모든 그룹에서, 시험 물질은 마우스의 가장 최근 체중에 따라 5mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다(즉, 체중이 20g인 한 마리의 마우스에 대해, 100μL의 시험 물질이 투여되었다).
항-PD-1 항체는 10mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다.
3. 실험 설계 및 처리
파트 I: 피하 B16-F10 흑색종을 갖는 마우스에서 PD-1 표적화 항체와 조합한 백신의 항종양 활성 연구
i. 동물에서 B16-F10 종양의 유도
종양은 200μL의 PBS 완충액 중의 5x105개 B16-F10 세포를 156마리의 C57BL/6 암컷 동물의 우측 옆구리에 피하 주사함으로써 유도하였다. 우측 옆구리에 종양 세포를 주사한 날짜를 D0로 간주하였다.
ii. 처리 스케줄
D3에, 156마리 중 120마리를 그후 이들의 체중에 따라 15마리 동물 6 그룹(ACT2의 그룹 1-6) 및 10마리 동물 3 그룹(ACT3의 그룹 1-3)으로 하여 9개 그룹으로 무작위화하였다.
통계 검정(분산 분석)을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 그룹들 간의 동질성을 시험하기 위해 수행하였다.
· 그룹 1로부터의 동물은 3일째에 시험 물질 비히클의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 시험 물질 비히클(항체)의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 2로부터의 동물은 3일째에 100ng의 ABX196과 함께 50μg의 Cl II-TRP2의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 3으로부터의 동물은 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 4로부터의 동물은 3일째에 100ng의 ABX196과 함께 50μg의 CL II-TRP2의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 5로부터의 동물은 3일째에 100ng의 α-Gal-Cer와 함께 50μg의 Cl II-TRP2의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 6으로부터의 동물은 3일째에 100ng의 α-Gal-Cer과 함께 50μg의 CL II-TRP2의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
처리 스케줄이 아래 표에 요약되어 있다:
Figure pct00027
파트 II: PD-1 표적화 항체와 조합하여 백신으로 처리된 마우스로부터의 B16-F10 흑색종 종양에서 면역 T 세포 침윤물의 특성화.
· 그룹 1로부터의 동물은 3일째에 시험 물질 비히클의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 시험 기준 비히클(항체)의 4회 IP 투여를 제공받았다.
· 그룹 2로부터의 동물은 3일째에 100ng의 ABX196과 함께 50μg의 Cl II-TRP2의 1회 IV 주사를 제공받았다.
· 그룹 3으로부터의 동물은 3일째에 100ng의 ABX196과 함께 50μg의 CL II-TRP2의 1회 IV 주사 및 10, 14, 17 및 21일째에 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
처리 스케줄은 아래 표에 요약되어 있다:
Figure pct00028
종양에서 면역 T 세포 침윤물을 D13 및 D17에 평가하였다. 종료시에, 각 그룹의 5마리 마우스로부터 종양을 수집하였다. 그룹 2 및 3에 대해, 반응 및 무반응 마우스 간의 균형잡힌 비율은 각 수집 일자에, 즉 D13 및 D17에 수집하였다.
마우스로부터 제거 후, 각 종양을 칭량하고 RPMI 배양 배지를 갖는 관으로 옮겼다. 종양을 메스로 몇 mm 크기의 작은 조각으로 기계적으로 파열시키고 마지막으로 70μm 체 상에서 1mL 시린지 플런저로 으깨었다(Ref. 352350, FALCON). 세포를 트리판 블루 염색 후 계수하고 백만 개의 세포를 원심분리하고 염색 완충액(PBS(ref: 17-516F, Lonza), 0.2% BSA(ref: A7030, Sigma, Saint-Quentin-Fallavier, France), 0.02% NaN3(ref: S2002, Sigma))에서 재현탁시켰다.
선택된 마커에 대해 지시된 항체를 각 항체에 대한 공급처에 의해 기술된 조건에 따라 종양 세포 현탁액에 가하였다. 마커 CD45, CD3, CD4, CD8을 세포 표면 상에서 검출하였다. 마커 FoxP3, TNFalpha, 퍼포린, 그랜자임을 세포 투과화 후 세포내에서 검출하였다. 이소타입 대조 항체가 각 경우에 음성 대조군으로서 사용되었다. 다음의 두 가지 집단을 측정하는데 사용되는 항체의 패널이 아래 표에 열거되어 있다:
· Treg 세포 집단: CD45+/CD3+/CD4+/CD8-/FoxP3+
· T 세포독성 집단: CD45+/CD3+/CD8+/TNFa/퍼포린(Perforin)/그랜자임(Granzyme)
Figure pct00029
세포와 항체의 혼합물을 암흑에서 실온에서 20 내지 30분 동안 배양하고, 세척하고, 200μL 염색 완충액에 재현탁시켰다. 모든 샘플을 빙상에서 저장하고 유동 세포 분석시까지 빛으로부터 보호하였다. 염색된 세포를 파장 405, 488 및 633nm의 3개 여기 레이저가 장착된 CyFlow® 스페이스 유동 세포 측정기(LSR II, BD Biosciences)로 분석하였다. 각 샘플에 대해 10,000 mCD45+ 이벤트가 기록될 때까지, 또는 최대 2분의 지속시간 동안 유동 세포분석 데이터를 획득하였다.
실시예 5 : 항-PD-1 항체와 조합하여 정맥 내 또는 종양 내 투여된 ABX196의 연구.
1. 연구 목적
연구는 공통유전자 생체 내 흑색종 B16F10 종양-함유 마우스 모델에 대해 수행하였다. B16F10 종양 세포를 면역-적격 C57BL/6 마우스에 피하 접종하였다.
흑색종 B16F10 종양 세포를 8-10주령 암컷 C57BL/6 마우스의 옆구리에 세포를 주사함으로써 0일째에 피하 접종하였으며, 그후 동물을 대조(비히클 PBS-처리된) 및 처리 그룹으로 무작위로 할당하였다.
항-PD-1 항체 처리를 위해, 마우스에게 6, 9, 12, 15 및 21일에 항-PD-1 항체를 복강 내(IP) 주사하였다. 게다가, ABX196을 종양 크기의 평균이 100mm3에 도달할 때 10일째에 1회 투여로 1회 용량을 정맥 내 또는 종양 내 투여하였다.
항-종양 효능 평가를 위한 동물 약리학적 그룹을 다음과 같이 조직하였다:
- 대조 비히클-처리된 그룹(항-PD-1 처리 스케줄에 따른 PBS)
- 항-PD-1-처리된 그룹 (1회 용량으로, 복강 내 투여)
- ABX196-처리된 그룹 (1회 용량으로, 10일째에 정맥 내 (iv) 투여)
- 조합물-처리된 그룹 (1회 용량으로 항-PD-1 항체, 복강 내 (ip) 투여와 조합하여 10일째에 1회 용량으로 ABX196, 정맥 내 (iv) 투여)
- ABX196-처리된 그룹 (1회 용량으로, 10일째에 종양 내 (it) 투여)
- 조합물-처리된 그룹 (1회 용량으로 항-PD-1 항체, 복강 내 (ip) 투여와 조합하여 10일째에 1회 용량으로 ABX196, 종양 내 (it) 투여)
이때:
그룹당 14-15마리 마우스
생체 내 효능 평가를 위해 총 90마리 마우스
2. 실험 과정
2.1 동물
마우스(Mus musculus), 종 C57BL/6, 암컷
공급처: Charles River Laboratories - BP 0109 - F 69592 L'Arbresle Cedex
동물은 8주와 10주 사이에 사용하였다. 6주령 마우스를 약 14일 동안 적응하도록 두었다(8주에 B16F10 종양 세포 이식). 90마리 동물을 이 연구를 위해 사용하였다.
통풍 및 공기 처리는 잦은 순환횟수를 통해 수행하고(수용된 동물의 밀도에 따라 8-20 용적/시간) 22 내지 25℃로 온도 조절하였다. 습도를 40 내지 70%로 유지시켰다. 인공 조명을 1일 12시간 유지시켰다. 음식(펠렛) 및 음료(수돗물)의 양 및 접근을 매일 확인하였다. 마우스를 케이지당 10마리 동물로 하여 집단 케이지에 수용하였다(820cm2 케이지). 케이지는 동물 관리사가 매주 한번 갈아주었다.
2.2 동물 모니터링
동물의 종양 체적 및 체중을 측정하고 1주당 3회 기록하였다. 2000mm3을 초과하는 종양 체적 또는 동물의 초기 체중에 비해 15%보다 큰 체중 감소를 종점으로 간주하였다.
유사하게, 마우스가 (i) 엎드려 있거나, (ii) 더 이상 털을 깨끗하게 하지 못하거나(털 곤두서 있음 및 광택 없음), (iii) 덜 움직인다면, 이것을 또한 종점으로 간주하였다. 이러한 조건들 중의 적어도 하나가 충족되었을 경우 마우스를 경추 탈골에 의해 희생시켰다.
모델과 관련된 통증, 고통 및 불안을 최소화하기 위해, 동물을 2일마다 모니터링하였다. 관찰은 체중 감소(15%) 및 자세 변화와 같은 신뢰할만한 기준을 포함하였다. 불안을 최소화하기 위해 환경 풍부화를 이루었다(플라스틱 관).
통증 과정:
수술 단계(종양 세포의 피하 주사)를 위해, 케타민(Ketamine)(0.33mg/ml) 및 자일라진(Xylazine)(33.6μg/ml)을 사용하여 복강 내 주사에 의해 마취를 달성하였다.
2.3 흑색종 암 세포 이식 과정
- 암 세포주:
흑색종 B16F10 세포를 공급처의 명세서에 따라 시험관 내에서 배양하였다. RPMI 1640을 10%의 최종 농도로 FBS로 보충시켰다. 마우스에 이식하기 전, 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 생존력을 평가하고 세포 현탁액을 생균수에 따라 제조하였다.
- 마우스에서 흑색종 B16F10 종양의 유도:
B16F10 세포를 C57BL/6 면역적격 마우스(8주령 암컷)의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 이식 과정은 다음과 같았다(모든 단계는 멸균 층류 조건하에서 수행하였다):
마우스(체중 대략 20g)를 90μL의 마취제(즉, 1.5mg/Kg 케타민 및 자일라진 150μg/Kg)의 복강 내 주사로 마취시켰다. 이식하고자 하는 세포를 멸균 PBS에 재현탁시키고 이식에 필요한 용적을 25G 바늘을 갖는 1ml 시린지에 부하하였다(1 000,000개 세포/100μL).
2.4 약리학적 처리
- 항-PD-1 항체 처리
항-PD-1 단클론 항체(a-PD-1) 처리 스케줄, 100μg i.p. 주사를 적용하였다. 처리는 6, 9, 12, 15 및 18일에 4회 반복하였다.
27G 게이지 바늘을 i.p. 주사에 사용하였다.
재료:
- 항-PD-L1 단클론 항체 (a-PD-1) - (클론 RMP1-14)
- i.p 투여를 위한 항-PD-1 단클론 항체 제제
- 인산염 완충 염수(PBS) 용액에 용해된 항-PD-1 mAb.
둘베코 PBS를 1,0mg/mL(100uL의 용적)의 농도로 항-PD-1 Ab를 용해시키는데 사용하였다. 그후, 스톡 용액을 분취하고(1일 처리를 위한 양) -20℃에서 저장하였다.
- ABX 196 처리
ABX196을 다음 중의 어느 하나에 의해 10일째에 투여하였다:
- 마우스당 100ng의 용량으로 정맥 내(i.v) 주사에 의해; 또는
- 마우스당 10ng의 용량으로 종양 내(i.t) 주사에 의해.
재료 :
i.v 투여를 위한 ABX196
ABX196은 PBS 중의 250μg/mL의 용액으로 제공하였다. 1μg/mL의 ABX196 용액을 제조하고 4℃에서 저장하였다. 10일째에, 100μL의 1μg/mL ABX196 용액을 그룹 3 & 4로부터의 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.
i.t 투여를 위한 ABX196
ABX196은 PBS 중의 250μg/mL의 용액으로 제공하였다. 0,4μg/mL의 ABX196 용액을 제조하고 4℃에서 저장하였다. 10일째에, 그룹 5 & 6으로부터의 동물을 마취시키고 25μL의 0,4μg/mL ABX196 용액을 종양에 주사하였다.
약리학적 처리의 요약
Figure pct00030
3. 결과
B16F10 세포 접종한지 6일 후부터 시작하여, 모든 실험 동물 그룹을 다음의 파라미터에 대해 4주 기간에 걸쳐 1주당 3회 모니터링하였다:
- 종양 크기: 1주당 3회 신체 검사에 의해 측정,
- 체중: 1주당 3회 모니터링, 및
- 생존률: 1주당 3회, Kaplan-Meier 플롯으로 나타냄.
항-종양 활성 지수 계산은 T/C (%) 지수 및 TGI (%)에 대해 실시예 1에 대한 것과 동일하였다.
1. 항-종양 반응 평가
a) 종양 체적
종양 유발시험(tumor challenge) 후, 상이한 처리에 노출된 B16F10을 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3)을 보여주는 결과가 도 5 및 6에 제공되어 있다.
특히, 결과는 본 발명에 따르는 항-PD-1 Ab와 ABX196의 조합물이 i.v. 또는 i.t.로 투여된 ABX196 단독 또는 항-PD-1 Ab 단독보다 종양 체적을 감소시키는데 보다 효과적임을 보여준다.
결과가 또한 아래 표에 나타내어져 있다.
6가지 시험된 그룹들 간의 17일째의 평균 종양 체적의 통계 분석.
Welch's 보정을 갖는 양방 비쌍체(Unpaired) t 검정
Figure pct00031
Figure pct00032
비히클은 참조 그룹이다. 평균 +/- SEM. 로그-순위(Mantel-Cox) 검정은 Graph Pad Prism®을 사용하여 수행하였다 → 평균 +/- SEM. 로그-순위(Mantel-Cox) 검정은 유의적으로 수행되었다; * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001b)
생존률
종양 유발시험 후, 상이한 처리에 노출된 B16F10을 갖는 마우스의 생존률을 보여주는 결과가 도 7 및 8에 제공되어 있다.
특히, 결과는 본 발명에 따르는 항-PD-1 Ab와 ABX196의 조합물이 i.v. 또는 i.t.로 투여된 ABX196 단독 또는 항-PD-1 Ab 단독보다 더 높은 생존률 퍼센트를 야기함을 보여준다.
c) 항종양 활성 지수
Figure pct00033
결론 :
이 연구는 흑색종의 공통유전자 마우스 모델에서 PD-1 차단제와 조합된 ABX196의 이점을 평가하는 것을 목표로 하였다.
추가 용량이 18일째에 투여되더라도 항-PD-1 항체의 효과는 없었다. 효과의 부족은 종양 체적(도 5 및 6) 및 생존률 수준(도 7 및 8) 둘 다에서 관찰되었다.
또한, ABX196의 일시적인 효과가 이의 투여(iv 또는 it) 후 초기 시점에서 관찰되었으며, 이것이 유의적인 효과로 번역되지는 않았다.
그러나, ABX196과 항-PD1 Ab 사이에 상승 효과를 관찰하는 것이 흥미로웠다. 사실상, ABX196은 항-PD-1 효과를 증진시킬 수 있었다 - 이것은 전혀 효과적이지 않았다. 이러한 상승 효과는 ABX196의 iv 및 it 투여 둘 다에서 관찰 가능하였다. 특히, 종양 체적 수준(도 5 및 6)에서 항-PD-1 및 항-PD-1 + ABX196(iv 또는 it)(각각 p=0,012 및 0,0245) 간의 유의적인 차이가 관찰 가능하였다. 생존률 데이터는 조합적 ABX196 및 항-PD-1 Ab vs 비히클의 이익을 명백히 입증하였다.
실시예 6: 결장암 및 방광암에서 단독으로 또는 항-PD-1 항체와 조합하여 전신 투여된 ABX196의 항-종양 활성의 결정.
1. 재료 및 방법
1.1. 시험 및 기준 물질
1.1.1. 시험 물질
ABX196.
1.1.2. 기준 물질
항-PD-1 항체(ref.: BE0146, BioXcell; 클론: RMP1-14, 반응성: 마우스; 이소타입: Rat IgG2a; 저장 조건: +4℃).
1.1.3. 시험 및 기준 물질 비히클
항-PD-1 항체는 제조자의 권고사항에 따라 인산염 완충 염수(PBS) 또는 다른 적합한 비히클 중에서 제조하였다.
ABX196는 250μg/mL의 용액으로서 제공하였다.
1.2. 처리 용량
ABX196은 마우스당 100ng의 용량으로 투여하였다. 항-PD-1 항체는 10mg/kg의 용량으로 투여하였다.
1.3. 투여 경로
시험 물질은 마우스의 미정맥에 정맥 내 경로에 의해 주사하였다(IV, 농축괴).
항-PD-1 항체는 마우스의 복강에 주사하였다(복강 내, IP)
모든 그룹에서, ABX196은 100μL의 고정된 용량 용적으로 투여하였다(즉, 체중이 20g인 한 마리 마우스에 대해 대략 5mL/kg/adm).
항-PD-1 항체를 10mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다.
1.4. 암 세포주 및 배양 조건
1.4.1. 암 세포주
사용된 세포주가 아래 표에 상세되어 있다:
Figure pct00034
a 미국 버지니아주 머내서스에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)
· CT-26 세포주는 BALB/C 마우스의 N-니트로소-N-메틸우레탄-(NNMU) 유도된, 미분화 결장 암종 세포주이다.
· 뮤린 MBT-2 세포주는 C3H/HeJ 마우스에서 발암물질-유도된 방광 종양으로부터 유래하였다. MBT-2 세포주는 메모리얼 슬론 케터링 암 센터(미국, 뉴욕)의 코지 박사(Dr Cozzi)로부터 입수하였다.
1.4.2. 세포 배양 조건
종양 세포를 가습 대기(5% CO2, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지는 10% 태아 소 혈청(ref: 3302, Lonza)이 보충된 2mM L-글루타민(ref: BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)을 함유하는 RPMI 1640이었다. 종양 세포는 플라스틱 플라스크에 부착되었다. 실험적 사용을 위해, 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘이 없는 행크 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중에서 트립신-버센(ref: BE02-007E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리시키고, 완전 배양 배지의 첨가에 의해 중화시켰다.
세포를 계수하고 이들의 생존력을 0.25% 트리판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.
1.5. 동물
6-7주령의 63마리 건강한 암컷 BALB/c 마우스는 이러한 종의 마우스에 공통유전성인 각 모델(즉, CT-26)에 대해 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 입수하였고 6-7주령의 68마리 건강한 암컷 C3H/HeJ (C3H/HeOuJ) 마우스는 MBT-2 모델에 대해 Jackson Laboratory(Bar Harbor, Maine)로부터 입수하였다.
동물을 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지시켰다. 동물 수용 및 실험 과정은 실험 동물의 관리와 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따라 실현하였다. 동물의 수용 조건은 실시예 1에서와 동일하였다.
2. 실험 설계 및 처리
2.1. 동물에서 CT-26, 및 MBT-2 종양의 유도
종양은 200μL의 RPMI 1640 중의 1x106개의 CT-26 세포를 63마리 암컷 BALB/C 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사함으로써 유도하였다. MBT-2 종양은 200μL의 RPMI 1640 중의 1x106개 세포를 68마리 암컷 동물의 우측 옆구리에 피하 주사함으로써 유도하였다.
2.2. 처리 스케줄
처리는 종양이 80-120mm3의 평균 체적에 도달할 때 시작하였다. CT-26 모델의 경우 63마리 또는 MBT-2 모델의 경우 68마리 중 48마리를 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 이들의 개별 종양 체적에 따라 각 12마리 동물로 하여 4개 그룹으로 무작위화하였다. 통계 검정(분산 분석, ANOVA)은 그룹들 간의 동질성에 대해 시험하기 위해 수행하였다. 처리 스케줄은 다음과 같았다:
- 그룹 1로부터의 동물은 ABX196 비히클의 IV 주사 및 항-PD-1 항체 비히클의 IP 주사를 제공받았고,
- 그룹 2로부터의 동물은 100ng의 ABX196의 IV 주사를 제공받았고,
- 그룹 3으로부터의 동물은 항-PD-1 항체의 매주 2회 투여를 제공받았고,
- 그룹 4로부터의 동물은 100ng의 ABX196의 IV 주사 및 항-PD-1 항체의 매주 2회 투여를 제공받았다.
처리 스케줄은 아래 표에 요약되어 있다:
Figure pct00035
- * : 지체 없이 ABX196의 1차 IV 투여 후 개시된 항-PD-1 Ab의 IP 주사(동시 투여).
2.3. 동물 모니터링
2.3.1. 임상 모니터링
동물 체중 측정치, 종양 체적, 임상적 및 사망률 기록, 및 처리를 포함한 모든 연구 데이터를 기입하고 Vivo Manager® 데이터베이스(Biosystemes, Dijon, France)에 기록하였다.
생존력 및 거동은 매일 기록하였다. 체중은 1주에 2회 측정하였다. 종양의 길이 및 폭은 캘리퍼스로 1주에 2회 측정하고 종양의 체적은 다음 식에 의해 추정하였다:
Figure pct00036
항-종양 활성 지수 계산은 T/C (%) 지수 및 TGI (%)에 대해 실시예 1에 대한 것과 동일하였다.
2.4. 통계 검정
모든 통계 분석은 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 수행하였다. 평균 체중, MBWC, 무작위화시 평균 종양 체적, 평균 종양 체적　V, V에 도달하는 평균 시간 및 평균 종양 배가 시간의 통계 분석은 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 쌍체 검정은 유의적인 ANOVA 결과의 경우에 Bonferroni/Dunn 보정을 사용하여 수행하였다. 로그-순위(Kaplan-Meier) 검정은 생존률 곡선을 비교하기 위해 사용하였다. p 값 <　0.05는 유의적인 것으로 간주하였다.
2.5. 인도적인 종점
인도적인 종점은 실시예 1에 대한 것과 동일하였다.
2.6. 부검
부검(맨눈 검사)은 연구 중인 모든 종료된 동물에 대해, 및, 가능하다면, 모든 안락사된 빈사상태의 또는 시체로 발견된 동물에 대해 수행하였다.
2.7. 마취
이소플루란 가스 마취제를 모든 과정을 위해 사용하였다: 종양 접종 및 i.v. 주사.
2.8. 진통
모든 고통스러운 절차에 대해서는 비-약리학적 관리가 제공되었다. 추가로, 연구를 방해하지 않는 약리학적 관리(국소 치료)가 담당 수의사의 권고로 제공될 수 있다.
2.9. 안락사
동물의 안락사는 가스 마취제 과잉-투여(이소플루란)에 이어 경추 탈골 또는 방혈에 의해 수행하였다.
3. 결과
3.1. 피하 CT-26 결장직장암을 갖는 마우스에서 시험된 처리의 항종양 활성
종양 유발시험 후, 상이한 처리에 노출된 CT-26을 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3)을 보여주는 결과가 도 9에 제공되어 있다. 특히, 결과는 본 발명에 따르는 항-PD-1 Ab와 ABX196의 조합물이 ABX196 단독 또는 항-PD-1 Ab 단독보다 종양 체적을 감소시키는데 더 효과적임을 보여준다.
항종양 활성 지수는 아래 표에 제공되어 있다:
Figure pct00037
3.2. 피하 MBT-2 방광암을 갖는 마우스에서 시험된 처리의 항종양 활성
종양 유발시험 후, 상이한 처리에 노출된 MBT-2를 갖는 마우스의 평균 종양 체적(mm3)을 보여주는 결과가 도 10에 제공되어 있다. 특히, 결과는 본 발명에 따르는 항-PD-1 Ab와 ABX196의 조합물이 ABX196 단독 또는 항-PD-1 Ab 단독보다 종양 체적을 감소시키는데 더 효과적임을 보여준다.
항종양 활성 지수는 아래 표에 제공되어 있다:
Figure pct00038
3.3. 생존
아래 표에서 종양 유발시험 후, 상이한 처리에 노출된 MBT-2를 갖는 마우스의 생존률을 보여주는 결과가 도 11에 제공되어 있다.
실험 그룹으로부터의 MBT -2를 갖는 마우스당 생존률 중간값 (일수).
Figure pct00039
ABX196와 항-PD-1 항체의 조합물은 ABX196 또는 항-PD-1 항체 단독으로의 치료에 비해 마우스의 생존률을 유의적으로 개선시킨다.
처리 간의 마우스 생존률의 통계 분석.
Figure pct00040
모든 생존률 곡선의 전반적인 비교: p 값 0,0045 (***)(로그-순위(Mantel-cox) 검정)
쌍별 비교의 요약
4. 결론
단독으로 또는 조합하여 시험된 처리들을 동물들은 잘 견뎠으며 약물-관련된 심각한 독성도 사망도 기록되지 않았다.
결장직장암에 대한 ABX196 플러스 항-PD-1의 항종양 활성
ABX196 플러스 항-PD-1로 처리된 마우스의 종양 성장 지연은 비히클-처리된 그룹에 비해 유의적으로 개선된다(도 9 참조). T/C 및 TGI 비는 ABX196과 항-PD-1 항체 간의 상승 효과를 명백히 입증한다. ABX196+항-PD-1 처리를 갖는 그룹 만이 T/C <42%를 나타낸다.
방광암에 대한 항종양 효과
ABX196+항-PD-1 항체의 조합물은 종양 성장을 유의적으로 감소시킨다(도 10 참조). T/C 및 TGI 비는 ABX196과 항-PD-1 항체 간의 시너지를 명백히 입증한다. ABX196 + 항-PD-1로 처리된 마우스의 생존률은 비히클-처리된 그룹에 비해 유의적으로 개선된다(도 11 참조). 조합물 그룹의 경우, 항-종양 활성은 ABX196 단독 또는 항-PD-1 단독과 비교할 때 더욱 개선되며 27 또는 28일의 생존율 중간값이 항-PD-1 항체와 조합되는 경우 34일까지 증가한다.
실시예 7 : 정위 Hepa 1-6 간암종 모델에서 독소루비신 또는 소라페니브 또는 항-PD-1 항체와 조합된 ABX196의 항-종양 활성의 평가.
1. 재료 및 방법
1.1 시험 및 기준 물질
1.1.1 시험 물질
ABX196
1.1.2 기준 물질
독소루비신: DOXO CELL, Cell Pharm.
소라페니브 (Nexavar®, Bayer Pharma, 200mg/환제).
항-PD-1 항체 (ref.: BE0146, BioXcell; 클론: RMP1-14, 반응성: 마우스; 이소타입: Rat IgG2a; 저장 조건: +4℃).
1.2. 시험 및 기준 물질 비히클
독소루비신은 NaCl 0.9%에 희석시켰다.
항-PD-1 항체는 제조자의 권고에 따라 인산염 완충 염수(PBS) 또는 다른 적합한 비히클 중에서 제조하였다.
마우스에의 각 투여 일에, 소라페니브 환제를 으깨어 먼저 DMSO(ref: 41640, Fluka, Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)에 용해시킨 다음 Tween 20(ref: P9416, Sigma)에 용해시킨 후 NaCl(0.9%)을 첨가하여(최종 비 DMSO/Tween 20/NaCl (0.9%): 5/5/90 v/v) 10mg/mL의 적절한 농도에 도달하였다.
ABX196은 250μg/mL의 용액으로 제공되었다. ABX196의 희석은 PBS 완충액 중에서 수행하였다.
5일째에 그룹 1에서 사용되는 비히클 용액은 ABX196 시험 항목과 동일한 최종 농도로 인산염 완충 염수(PBS)에 희석시킨 DMSO를 함유하였다.
1.3. 처리 용량
ABX196은 마우스당 100ng의 용량으로 투여하였다.
독소루비신은 12mg/kg의 용량으로 투여하였다.
항-PD-1 항체는 10mg/kg의 용량으로 투여하였다.
소라페니브는 100mg/kg의 용량으로 투여하였다.
1.4. 투여 경로
ABX 196은 마우스의 미정맥에 정맥 내 경로에 의해 주사하였다(IV, 농축괴).
독소루비신은 마우스의 미정맥에 정맥 내 투여하였다(IV, 농축괴)
항-PD-1 항체는 마우스의 복강에 주사하였다(복강 내, IP)
소라페니브는 캐뉼라를 통해 경구 위관법에 의해 투여하였다(경구로, PO).
모든 그룹에서, ABX196은 100μL의 고정된 용량 용적으로 투여하였다(체중이 20g인 마우스에 대해 대략 5mL/kg/adm). 독소루비신, 항 PD-1 항체 및 소라페니브는 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10mL/kg/adm의 용량 용적으로 투여하였다.
1.5. 암 세포주 및 배양 조건
1.5.1. 암 세포주
사용되는 세포주는 아래 표에 상세되어 있다:
Figure pct00041
a 미국 버지니아주 머내서스에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)
Hepa 1-6 세포주는 C57/L 마우스에서 발생한 BW7756 마우스 간종양의 파생물이다.
1.5.2. 세포 배양 조건
종양 세포를 가습 대기(5% CO2, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지는 10% 태아 소 혈청(ref: 3302, Lonza)이 보충된 4mM L-글루타민(ref: BE12-604F, Lonza, Verviers, Belgium), 4.5g/l 글루코스 및 1mM NaPyr을 함유하는 DMEM이었다. 세포는 플라스틱 플라스크에 부착되었다.
실험적 사용을 위해, 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘이 없는 행크 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중에서 트립신-버센(ref: BE17-161E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 분리시키고, 완전 배양 배지의 첨가에 의해 중화시켰다. 세포를 혈구 계산기에서 계수하고 이들의 생존력을 0.25% 트리판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.
1.5.3. 동물
5-6주령의 100마리 건강한 암컷 C57BL/6 (C57BLl6J) 마우스를 JANVIER LABS(Le Genest-Saint-Isle)로부터 입수하였다.
동물을 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지시켰다. 동물 수용 및 실험 과정은 실험 동물의 관리와 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따라 실현하였다. 수용 조건은 실시예 1에서와 동일하였다.
1.6. 자기 공명 영상
모든 영상화 실험은 능동 차폐 경사 시스템이 장착된 4.7T 수평 자석(PharmaScan, Bruker Biospin GmbH, Germany) 상에서 수행하였다. 모든 MR 영상은 ParaVision(PV5.1, Bruker Biospin) 하에서 획득되었다.
1.6.1. 코일 및 요람
마우스를 Pharmascan 내의 볼륨 코일(38mm 내경)에 슬라이딩된 전용 마우스 몸체 요람에 엎드린 자세로 두었다.
1.6.2. 마취 및 생리학적 모니터링
모든 획득 동안, 마우스를 노이즈 피스를 통해 공기의 혼합물 중에 이소플루란(Minerve, Bondoufle, France)을 사용하여 계속해서 마취시켰다. 마우스의 호흡률을 이의 복부에 테이핑된 압력 센서를 사용하여 계속해서 모니터링하였다. 생리적 신호를 MRI 워크스테이션 다음에 배치되고 광섬유 케이블(SA Instruments, USA)에 의해 센서에 연결된 랩톱(laptop)을 통해 모니터링하였다.
1.6.3. MR 영상 시퀀스
검량 및 배치
자석에 동물을 배치한 후, 검량 목적으로 스카우트 영상을 획득하였다. 시상면(sagittal), 관상면(coronal), 축상면(axial) 슬라이스를 획득하였다. 이러한 획득 시작시에, MR 신호의 심(shim), RF 출력 및 증폭을 최적화하기 위해 자동 조정을 수행하였다.
Figure pct00042
이 단계 동안 사용되는 시퀀스는 다음의 특징을 갖는다:
여기서: TE는 에코까지의 시간(time to echo)이고, TR은 반복 시간이며, FOV는 시계(field of view)이다.
1.6.4. T2-강조(T2w) 해부학적 영상 - 축상 배향
해부학적 영상은 T2w RARE 시퀀스를 사용하여 획득하였다. 이 단계 동안 사용되는 시퀀스는 다음의 특징을 갖는다:
Figure pct00043
필요에 따라, FOV 크기 및 시퀀스 파라미터는 최상의 영상 결과를 제공하도록 맞추었다.
1.6.5. 영상 처리
모든 MR 영상은 ImageJ 하에서 분석하고자 하는 Windows®-기반 워크스테이션으로 전송하였다. 종양 침습은 전체 간에서 종양의 퍼센트의 가시적 평가에 의해 반-정량적으로 평가하였다.
2. 실험 설계 및 처리
2.1. 비장 내 주사에 의한 동물에서의 Hepa 1-6 종양의 유도
50μL의 RPMI 1640 배지 중의 백만 개(1x106)의 종양 세포를 비장 내 주사를 통해 100마리의 C57BL/6 마우스에게 이식하였다. 간략하게, 작은 좌측 늑골하 측면을 절개하였다. 비장을 몸밖으로 꺼내었다. 비장을 멸균 거즈 상에 노출시키고, 시각적 통제하에 27-게이지 바늘로 세포 현탁액을 주사하였다. 세포 접종 후, 비장을 절제하였다. 종양 세포 주사일을 D0로 간주하였다.
2.2. 처리 스케줄
처리는 D5에 시작하였다. 100마리 중 99마리 동물을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 이들의 개별 체중에 따라 13마리 동물 3 그룹 및 12마리 동물 5그룹으로 무작위화하였다. 통계 검정(분산 분석, ANOVA)은 그룹들 간의 동질성에 대해 시험하기 위해 수행하였다.
처리 스케줄은 다음과 같았다:
- 그룹 1로부터의 동물은 5일째에 ABX196 비히클의 1회 IV 주사를 제공받았고,
- 그룹 2로부터의 동물은 5일째에 시작하여 21일 연속 100mg/kg/adm의 소라페니브의 1일 1회 PO 투여를 제공받았고,
- 그룹 3으로부터의 동물은 5일째에 100ng의 ABX196의 1회 IV 주사 및 5일째에 시작하여 21일 연속 100mg/kg/adm의 소라페니브의 1일 1회 PO 투여를 제공받았고,
- 그룹 4로부터의 동물은 5일째에 12mg/kg의 독소루비신의 1회 IV 주사를 제공받았고,
- 그룹 5로부터의 동물은 5일째에 100ng의 ABX196의 1회 IV 주사 및 12mg/kg의 독소루비신의 1회 IV 주사를 제공받았고,
- 그룹 6으로부터의 동물은 7, 10, 14 및 17일째에(매주 2회 x2) 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았고,
- 그룹 7로부터의 동물은 5일째에 100ng의 ABX196의 1회 IV 주사 및 7, 10, 14 및 17일째에(매주 2회 x2) 항-PD-1 항체의 4회 IP 투여를 제공받았다.
처리 스케줄은 아래 표에 요약되어 있다:
Figure pct00044
2.3. 혈액 수집
D7 및 D22에, 대략 120μL의 혈액을 응고 활성제를 갖는 혈액 수집관에 경정맥 천공에 의해 수집하였다. 혈청을 수득하기 위해 실온에서 10분 동안 1,300g에서 샘플링한 후 관을 30분 동안 원심분리하였다. 혈청 샘플을 프로필렌 관에 -80℃에서 저장하였다. D22에 모든 수집된 혈청 샘플을 ELISA 분석(Dosage 마우스 a-페토프로테인/AFP, ref: MAFP00, RD Systems)에 의해 순환 AFP 수준의 측정을 위해 분석하였다.
2.4. MRI 영상화 시점
D19 및 D20에, 그룹 1 내지 8의 그룹당 5마리 마우스를 영상화하였다(1일당 40마리 동물). 그후, 반-정량적 분석을 수행하였다.
2.5. 마우스 종료
최종 마우스 종료시에(대략 D60), 간을 칭량하였다. 전이의 수를 육안으로 평가하고, 이들 각각의 국재화, 외관(형태, 색, 조도) 및 크기를 기록하였다. 간의 육안 사진을 촬영하였다.
윤리적 이유로 또는 최종 종료에서 희생된 모든 동물로부터의 간/종양을 4mm 두께 슬라이스로 절단하고 24h 내지 48h 동안 4% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 다음 파라핀(Histosec®, Merck, Darmstadt, Germany)에 매봉시켰다.
2.6. 동물 모니터링
2.6.1. 임상적 모니터링
동물 체중 측정, 임상적 및 사망률 기록, 및 처리를 포함한 모든 연구 데이터를 기입하고 Vivo Manager® 데이터베이스(Biosystemes, Dijon, France) 상에 기록하였다.
생존력 및 거동을 매일 기록하였다. 체중은 1주에 3회 측정하였다.
2.6.2. 인도적 종점
25mm보다 큰 복부 직경
통증, 고통 또는 괴로움의 징후: 통증 자세, 통증 안면 마스크, 거동,
보행 또는 영양을 방해하는 종양,
연이어 3일간 지속되는 20% 체중 감소,
좋지 못한 신체 상태, 쇠약, 악액질, 탈수,
외부 자극에 대한 수의적 반응의 장기 부재,
빠르고 부자연스러운 호흡, 빈혈, 상당한 출혈,
신경학적 징후: 빙글빙글 돌기, 경련, 마비,
체온의 지속적인 감소,
복부 팽만.
2.6.3. 부검
부검(맨눈 검사)은 연구 중인 모든 종료된 동물에 대해, 및, 가능하다면, 모든 안락사된 빈사상태의 또는 시체로 발견된 동물에 대해 수행하였다.
2.6.4. 수술
수술 방법은 IACUC에 의해 승인된 수술 절차(Operating Procedure)에 기술되어 있었다.
2.6.5. 마취
이소플루란 가스 마취제를 모든 과정을 위해 사용하였다: 수술 및 혈액 수집.
2.6.6. 진통
다정 카르프로펜/부프레노르핀 또는 크실로카인/부프레노르핀 진통 프로토콜을 수술 절차의 심각도에 맞추었다. 모든 고통스러운 절차에 대해서는 비-약리학적 관리가 제공되었다. 추가로, 연구를 방해하지 않는 약리학적 관리(국소 치료)가 담당 수의사의 권고로 제공될 수 있다.
2.6.7. 안락사
동물의 안락사는 가스 마취제 과잉-투여(이소플루란)에 이어 경추 탈골 또는 방혈에 의해 수행하였다.
3. 데이터 표시
4.1. 건강 파라미터
다음의 건강 평가 기준을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 결정하였다:
- 동물의 개별 및/또는 평균(또는 중간값) 체중.
- 평균 체중 변화(MBWC): 처리된 동물의 평균 체중 변화를 퍼센트로 계산하였다(B일째 체중 마이너스 A일째 체중을 A일째 체중으로 나눔). MBWC가 계산된 간격을 체중 곡선 및 체중 측정일의 함수로서 선택하였다.
3.2. 효능 파라미터
치료 효능은 대조군 동물에 비해 처리된 동물의 종양 체적에 대한 시험 물질의 효과 측면에서 평가하였다. 다음의 항종양 효능 평가 기준을 결정하였다:
- MRI 영상을 사용한 간 내의 종양 침습의 D19-20에서의 개별 및/또는 평균(또는 중간값) 측정치,
- D22에 혈장 중의 순환 a-페토프로테인의 측정,
- 종료시 측정한 간 중량,
- 생존률 곡선,
- 중간값 생존 시간.
결과
종양 침습
20일째에 각 처리 그룹으로부터의 간의 종양 침습의 퍼센트를 보여주는 결과가 도 12에 제공되어 있다.
20일째에 비히클 및 각 그룹들 간의 종양 침습의 통계 분석
Kruskal-Wallis 검정 p 값 <0,0001 (****)
Dunn's 검정으로의 쌍별 비교
Figure pct00045
61일째에 살아있는 동물 및 종양 침습의 요약.
Figure pct00046
결론
당해 실험은 화학요법제 또는 면역요법제와 ABX196을 포함하는 조합물이 단독으로 취해진 조합물의 각 성분보다 더 강력함을 입증한다.
도 12에 나타낸 바와 같이, ABX196을 포함하는 조합 처리는 종양 침습을 덜 나타낸다. 종양 침습 감소는 더 나은 생존으로 변환된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABIVAX <120> Combinations including ABX196 for the treatment of cancer <130> BET16P2086 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of peptide Cl II- TRP2(180-188) <400> 1 Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala Gly 1 5 10 15 Gly Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr 20 25 30 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Class II epitope <400> 2 Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an immunodominant peptide from the tumor associated antigen tyrosinase-related protein-2 <400> 3 Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of a peptide comprising the sequence of an immunodominant peptide from TRP2 <400> 4 Gly Gly Gly Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala 20 25 30

Claims (15)

  1. (i) 하기 화학식 I의 화합물 ABX196; 및
    화학식 I
    Figure pct00047

    (ii) 적어도 하나의 화학요법제(chemotherapeutic agent) 및/또는 적어도 하나의 면역요법제(immunotherapeutic agent)를 포함하고,
    상기 적어도 하나의 면역요법제는 항원이 아닌, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물(antitumor pharmaceutical combination).
  2. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 I의 상기 화합물 ABX196은,
    화학식 I
    Figure pct00048

    종양 항원을 더 포함하는 백신 조성물(iii)에 포함되는, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하기 화학식 I의 상기 화합물 ABX196(i) 또는 백신 조성물(iii)과,
    화학식 I
    Figure pct00049

    적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제(ii)는 별도로 투여되는, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하기 화학식 I의 상기 화합물 ABX196(i) 또는 백신 조성물(iii)과,
    화학식 I
    Figure pct00050

    적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제(ii)는 반-동시에 투여되는, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하기 화학식 I의 상기 화합물 ABX196(i) 또는 백신 조성물(iii)과,
    화학식 I
    Figure pct00051

    적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제(ii)의 투여는,
    상기 조합물의 최대 효능을 수득하도록 하는 기간에 걸쳐 간격을 두고 이루어지는, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물.
  6. 하기 화학식 I의 화합물 ABX196; 및
    화학식 I
    Figure pct00052

    종양 항원을 포함하고,
    암의 치료에서 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제와의 조합물로 사용하기 위한 것이며,
    상기 적어도 하나의 면역요법제는 항원이 아닌, 백신 조성물(Vaccine composition).
  7. 암의 치료에서 적어도 하나의 화학요법제 및/또는 적어도 하나의 면역요법제와의 조합물로 사용하기 위한 것이며, 상기 적어도 하나의 면역요법제는 항원이 아닌, 하기 화학식 I의 화합물 ABX196.
    화학식 I
    Figure pct00053
    .
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조합물은,
    항종양 항원을 더 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물 ABX196.
    화학식 I
    Figure pct00054
  9. (i) 하기 화학식 I의 화합물 ABX196의 하나 이상의 투여 단위(dosage units), 및
    화학식 I
    Figure pct00055

    (ii) 적어도 하나의 화학요법제의 하나 이상의 투여 단위 및/또는 면역요법제의 하나 이상의 투여 단위를 포함하고,
    상기 적어도 하나의 면역요법제는 항원이 아닌, 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제(combined preparation).
  10. 제9항에 있어서,
    하기 화학식 I의 상기 화합물 ABX196은,
    화학식 I
    Figure pct00056

    종양 항원을 더 포함하는 백신 조성물에 포함되는, 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 제6항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 제7항 또는 제8항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 제9항 또는 제10항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제에 있어서,
    상기 화학요법제는,
    독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 제6항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 제7항 또는 제8항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 제9항 또는 제10항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제에 있어서,
    상기 화학요법제는,
    독소루비신 또는 소라페니브(sorafenib)인, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 제6항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 제7항 또는 제8항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 제9항 또는 제10항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제에 있어서,
    상기 면역요법제는,
    Her2/neu, EGFR, VEGF, CD20, CD52, CD33, TACE, 카텝신 S, uPA, uPAR, PD-1, 글리피칸-3, 클라우딘-3, 클라우딘-4, BMCA 및 CTLA4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 항원에 특이적인 항체인, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 제6항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 제7항 또는 제8항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 제9항 또는 제10항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제에 있어서,
    상기 면역요법제는,
    단클론 항-PD1 항체(monoclonal anti-PD1 antibody)인, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 제6항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 제7항 또는 제8항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 제9항 또는 제10항에 따른 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제에 있어서,
    상기 암은,
    흑색종, 간암종, 결장직장암 및 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 암의 치료에 사용하기 위한 항종양 약제학적 조합물, 암의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 ABX196 또는 암의 치료에 사용하기 위한 조합 제제.
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