JP2022516881A - 抗ｃｔｌａ４抗体およびその使用方法 - Google Patents

抗ｃｔｌａ４抗体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗体、二重特異性抗体、およびキメラ受容体）、ならびに癌の治療および予防におけるそれらの使用、ならびに抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を含む組成物およびキットを提供する。【選択図】図８Ｄ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２６日に出願された米国仮出願第６２／７８５，１１１号からの優先権を主張するものであり、その内容はその全体が参照により組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７７６２００２５４０．ｔｘｔ、記録日：２０１９年１２月２３日、サイズ：３９．５ＫＢ）。
発明の分野
本発明は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体）、およびそれらの使用に関連する方法に関する。
発明の背景
癌は米国で２番目に多い死因であり、次の５つの主要な原因（慢性呼吸器疾患、脳卒中、事故、アルツハイマー病、および糖尿病）よりも多くの死因を占めている。標的療法では特に大きな進歩が遂げられたが、この分野ではまだ多くの研究が残されている。免疫療法およびこの分野の分科である免疫腫瘍学は、悪性腫瘍を治療するための実行可能で刺激的な治療選択肢を生み出している。特に、癌の１つの特徴は免疫回避であり、顕著な努力が、癌を認識および治療するために免疫系を再活性化するための標的を特定し、これらの標的に対する療法を開発してきたことが現在では認識されている。事実、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）抗体であるイピリムマブは、ステージＩＩＩ／ＩＶ悪性黒色腫を患う患者の長期生存をもたらした。イピリムマブは、ＣＴＬＡ４を遮断することによってＴ細胞の阻害を中断する免疫チェックポイントアンタゴニストであり、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇をもたらし得る（Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ ６：５８２－５９１（非特許文献１）、Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０６（８）：１７１７－１７２５，２００９（非特許文献２）、Ｓｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，１（１）；３２－４２，２０１３（非特許文献３））。残念なことに、イピリムマブは、生命を脅かし得る免疫関連有害作用をもたらすＴ細胞依存性免疫応答の全身的（腫瘍特異的ではない）活性化を引き起こし、しばしば用量および治療期間が制限される（Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：５９５０－５９５６（非特許文献４））。これらには、腸炎、皮膚炎、下垂体炎、ブドウ膜炎、肝炎、腎炎、および死亡が含まれる。腸炎は、最も一般的な主な毒性である（患者の約２０％に影響する）。免疫媒介性有害反応に関連する重度の安全性リスクがあったため、ＦＤＡは、リスク評価および軽減戦略（ＲＥＭＳ）を伴ってイピリムマブを承認した。最近、イピリムマブと、ＰＤ１を標的とする第２の免疫チェックポイント調節因子（例えば、ニボルマブ）との併用投与は、イピリムマブ単独と比較して、黒色腫の免疫療法の有効性を有意に増加させることが示されている。しかしながら、この増加は、併用療法を受けている患者の５０％超に影響するグレード３／４の有害作用の頻度の増加と関連していた（Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（非特許文献５））。
これらの所見は、イピリムマブなどのある特定の抗ＣＴＬＡ４抗体に関連する副作用のない、腫瘍を効果的に標的化する抗ＣＴＬＡ４タンパク質治療薬の開発の必要性を説明している。この必要性に対処するための抗ＣＴＬＡ結合タンパク質、その組成物、およびその使用方法が本明細書に提供される。
特許出願、特許公開、および科学文献を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の参考文献が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ ６：５８２－５９１ Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０６（８）：１７１７－１７２５，２００９ Ｓｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，１（１）；３２－４２，２０１３ Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：５９５０－５９５６ Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ
抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）結合タンパク質、それを含む組成物、およびそれを使用する方法が本明細書に提供される。
軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、ＶＬドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、ＶＬドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、ＶＬドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、ＶＬドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、ＶＬドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、またはＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含む。提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５～３８からなる群から選択されるＣＨ配列を含む。提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、ＣＨは、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤもしくはＩ３３２Ｅまたは両方を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。提供される実施形態のうちのいずれかのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３８のＣＨ配列を含む。
任意の実施形態のうちいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９のＣＬ配列を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、または軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されているかまたはフコース欠損である。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、薬剤と複合体化される。任意の実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対の軽鎖は、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖は、ＶＨドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対の軽鎖は、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖は、ＶＨドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対の軽鎖は、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖は、ＶＨドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対の軽鎖は、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖は、ＶＨドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対の軽鎖は、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖は、ＶＨドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対の軽鎖は、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖は、ＶＨドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、あるいはＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ／またはＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、またはＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５～３８からなる群から選択されるＣＨ配列を含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＣＨは、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤもしくはＩ３３２Ｅまたは両方を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３８のＣＨ配列を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９のＣＬ配列を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、または軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、第１の対は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、非フコシル化されているかまたはフコース欠損である。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、薬剤と複合体化される。任意の実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである。
提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれかをコードする核酸もまた本明細書に提供される。
本明細書に提供される核酸のうちのいずれかを含むベクターもまた提供される。
提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または本明細書に提供される核酸のうちのいずれかを含む宿主細胞もまた提供される。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、宿主細胞は、非フコシル化されているかまたはフコース欠損である抗体またはその抗原結合断片を生成することができる。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、宿主細胞は、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、宿主細胞は、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、宿主細胞は、ゴルジμ－マンノシダーゼＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。
抗体またはその抗原結合断片を生成する条件下で、提供される宿主細胞のうちのいずれかを培養することを含む、抗体またはその抗原結合断片を生成する方法もまた提供される。
抗体またはその抗原結合断片を生成する条件下で、提供される宿主細胞のうちのいずれかを培養することを含む、非フコシル化もしくはフコース欠損抗体またはその抗原結合断片を生成する方法もまた提供される。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、方法はまた、宿主細胞によって生成される抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む。
本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片を生成する方法のうちのいずれかによって生成される、抗体またはその抗原結合断片もまた提供される。
提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物もまた提供される。
提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物もまた提供される。
対象において腫瘍性疾患を治療または予防するのに使用するための、提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物もまた提供される。
対象において腫瘍性疾患を治療または予防するための医薬の製造における、提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の使用もまた提供される。
提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれかを含むキットもまた提供される。
対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法もまた提供され、方法は、有効量の、提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、提供される抗体もしくはその抗原結合断片のうちのいずれか、または提供される組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む。
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、またはすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者にとって明らかとなるであろう。本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
図１Ａおよび１Ｂは、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの抗ＣＴＬＡ４抗体の結合を示すグラフである。図１Ａは、示される抗体間で類似の結合を示した、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの抗体１（抗体１－１および抗体１－２）の形態の結合を示す。図１Ｂは、示される抗体間で類似の結合を示した、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの抗体２（抗体２－１、抗体２－２、抗体２－３、抗体２－４、および抗体２－５）の形態の結合を示す。 図１Ａの説明を参照のこと。 図１Ｃ～１Ｅは、ＥＬＩＳＡによって評価される、ヒトＣＴＬＡ－Ｆｃおよびヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体、ならびに抗体１（図１Ｃ）、抗体２（図１Ｄ）、またはイピリムマブ（図１Ｅ）のバリアント（例えば、Ｆｃ領域における変異または脱フコシル化バージョンを含む）の結合の結果を示す。示されるように、抗体の各々のすべてのバリアントは、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃに同様に結合した。 図１Ｃの説明を参照のこと。 図１Ｃの説明を参照のこと。 ３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、および２ｎＭで、抗体２－６（Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン）またはイピリムマブとヒトＣＴＬＡ４（ｈｕＣＴＬＡ４）との間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。 図２Ａに示される結果について結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）、ならびに抗体２－６とイピリムマブとの間の差の倍率を提供する。 ３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、および２ｎＭで、イピリムマブのＦａｂ（イピリムマブ－Ｆａｂ）または抗体２のＦａｂ（抗体２－Ｆａｂ）とｒｈＣＴＬＡ４－Ｆｃとの間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。 図２Ｃに示される結果について結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、およびχ２値を提供する。 ３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、および２ｎＭで、イピリムマブのＦａｂ（イピリムマブ－Ｆａｂ）または抗体２のＦａｂ（抗体２－Ｆａｂ）とｃｙｎｏＣＴＬＡ４－Ｆｃとの間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。 図２Ｅに示される結果について結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、およびχ２値を提供する。 様々な濃度での抗体２－１（野生型Ｆｃ領域を有する抗体２のバージョン）、抗体２－６（Ｆｃ領域中にＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン）、またはイピリムマブと、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）との間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。 ４Ａ～４Ｄは、抗体１および抗体２について、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイを使用して決定された場合の、ＩＬ－２レベル（ｐｇ／ｍＬ）（図４Ａおよび４Ｃ）、またはＩＬ－２レベルの変化倍率（図４Ｂおよび４Ｄ）を示すグラフである。抗体１（抗体１－１および１－２）（図４Ａおよび４Ｂ）および抗体２（抗体２－１、抗体２－２、抗体２－３、抗体２－４、および抗体２－５）（図４Ｃおよび４Ｄ）を、ＳＥＢアッセイを使用して末梢単核細胞からのＩＬ－２生成を促進する能力について試験した。すべての試験された抗体１および抗体２の形態は、非抗体対照と比較してＩＬ－２レベルを増加させる能力を示した（図４Ａおよび４Ｃ）。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 様々なバージョンの抗ＣＴＬＡ４抗体１［野生型Ｆｃ領域を有する（抗体１－１）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（抗体１－２）、ならびに抗体１の非フコシル化バージョン（抗体１－ａＦｕｃ）］、抗体２［野生型Ｆｃ領域を有する（抗体２－１）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（抗体２－６）、ならびに抗体２の非フコシル化バージョン（抗体２－ａＦｕｃ）］、またはイピリムマブ［野生型Ｆｃを有する（イピリムマブ）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（イピリムマブ－ｍ）、ならびにイピリムマブのアフコシル化バージョン（イピリムマブ－ａＦｕｃ）］を用いるＳＥＢアッセイの結果を示す。 図５Ａ～５Ｄは、抗体１バリアント（図５Ａ）、抗体２バリアント（図５Ｂ）、イピリムマブバリアント（図５Ｃ）、および３つの抗体すべての非フコシル化バリアント（図５Ｄ）のＡＤＣＣ、ＦｃγＲＩＩＩａレポーターバイオアッセイからのレポーター活性化の曲線およびＥＣ５０値を示す。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図５Ａの説明を参照のこと。 図６Ａ～６Ｄは、以下を含むマーカーを発現するＣＤ４５＋細胞の割合を評価した免疫表現型研究の結果を示す：ＣＤ３＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ３＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇｓ＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ＋／Ｋｉ６７＋。試験された抗体は以下の通りである：群１：ＩｇＧ、群２：抗体２－１、群４：イピリムマブ、群５：イピリムマブ－ａＦｕｃ。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図６Ａの説明を参照のこと。 図７Ａ～７Ｄは、以下の通り、２０μｇ、７μｇ、または２μｇの試験抗体の単回注射の投与後の経時的な腫瘍体積を示すグラフを示す。図７Ａ（群平均）および図７Ｂ（個々のマウス）は、抗体２－６、イピリムマブ、または非フコシル化形態のイピリムマブ（イピリムマブ－ａＦｕｃ）を注射したマウスの経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、図７Ｃ（２０μｇ）、図７Ｄ（７μｇ）、および図７Ｅ（２μｇ）は、異なる抗体の各用量での経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）の比較を示す。 図７Ａの説明を参照のこと。 図７Ａの説明を参照のこと。 図７Ａの説明を参照のこと。 図７Ａの説明を参照のこと。 投与後５日目の末梢血液中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋細胞（左）およびＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞（右）の割合に関する有効性研究の結果を示すグラフであり、これはＴ細胞活性化のレベルを表す。 １０ｍｇ／ｋｇ（ＲＳＶ－ｍ対照）または３ｍｇ／ｋｇ（イピリムマブまたは抗体２－６）で処置されたマウスにおいて、７日目に評価された腫瘍重量（左）およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右）を示すグラフを示す。 マウスにおけるＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、または抗体２－６の投与後の、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞（左）および腫瘍微小環境におけるＣＤ８＋Ｔ細胞（右）を示すグラフを示す。 ＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、または抗体２－６を含む抗体の０．３ｍｇ／ｋｇの投与後の、マウスにおける経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフを示す。 抗体２－６、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照の投与後の、総ＣＤ４＋細胞のうちのＫｉ６７＋細胞の割合を評価することによって、カニクイザルにおける薬力学的効果を評価した、２つの実験のセット（実験１および実験２）の結果を示すグラフを示す。
詳細な説明
チェックポイント阻害剤などの治療は、癌において前例のない応答を示すが、その使用は、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）および他の毒性（例えば、下垂体炎）によって制限される。例えば、腫瘍微小環境で、ＣＴＬＡ４に結合し、持続的な応答速度の増加および改善された安全性プロファイルを達成するために、タンパク質治療薬が本明細書に提供される。結合親和性の改善、ＡＤＣＣなどの機能的活性の増加、および抗体、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質の本明細書に記載される他の利点は、治療に対する応答の改善、およびある特定の免疫療法と関連付けられ得る有害事象の低減または最小化などの安全性プロファイルの改善をもたらすことができる。
Ｉ．定義．
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、当然のことながら変化し得る特定の組成物または生物学系に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるに過ぎず、制限を意図するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、抗体への言及は、任意に、２つ以上のかかる抗体の組み合わせなどを含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータを本質的に対象とする実施形態を含む（および記載する）。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解される。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（イムノグロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、および単鎖分子、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。「イムノグロブリン（Ｉｇ）」という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。
塩基性４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とから構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとともに、５個の塩基性ヘテロ四量体ユニットからなり、１０個の抗原結合部位を含むが、一方でＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせた多価集合体を形成するように重合することができる２～５個の塩基性４鎖ユニットからなる。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、概して、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されるが、一方で２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて各α鎖およびγ鎖に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμおよびεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその他方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと整列し、ＣＬは、重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。ＶＨおよびＶＬの対合は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる、２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それぞれ、指定されたα、δ、ε、γ、およびμの重鎖を有する。γおよびαのクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さな差異に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと称される複数の多型バリアント（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７）に存在してもよく、そのいずれも本発明での使用に好適である。ヒト集団における一般的なアロタイプバリアントは、ａ、ｆ、ｎ、ｚという文字で示されるものである。
「単離された」抗体は、その生成環境（例えば、天然または組換え）の構成要素から識別され、分離され、および／または回収された抗体である。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その生成環境から他のすべての構成要素と無関連である。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなどのその生成環境の汚染成分は、抗体の研究、診断、または治療用途に典型的には干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％超まで、およびいくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（１）回転カップシークエンサーの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーまたは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで抗体を含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能な天然発生型変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖でＣ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基は、重鎖および／または軽鎖のＣ末端で切断される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端切断は、重鎖からＣ末端リジンを除去する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖でＮ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基は、重鎖および／または軽鎖のＮ末端で切断される。
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の短縮型形態は、組換え技術によって作製され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に配向されている。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、複数の抗原部位（例えば、二重特異性抗体または多重特異性抗体など）に配向されている。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体群から取得されたときの抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の生成が必要とはみなされないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ提示技術、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部もしくはすべてまたはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術を含む、様々な技術によって作製され得る。
「ネイキッド抗体」という用語は、細胞傷害性部分または放射性標識と複合体化されていない抗体を指す。
「親抗体」という用語は、修飾前の抗体を指す。
「抗体－薬物複合体」または「ＡＤＣ」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子と複合体化された抗体を指す。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」という用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すように互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。いくつかの場合では、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有してもよい。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、抗原結合、および／またはインタクトな抗体の可変領域を含む。抗原結合抗体断片の例としては、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；抗体；線形抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。単一の重鎖抗体または単一の軽鎖抗体は、操作することができ、または重鎖の場合には、単一の重鎖分子を生成するように操作されたラクダ、サメ、ライブラリ、またはマウスから単離することができる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Ｆｃ」断片とを生成した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメイン、および１つの重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインとともに、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合したＦａｂ断片にほぼ対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を産出し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の追加の残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合もまた既知である。
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の配列およびグリカンによって決定され、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域は、ある特定の細胞型上に見られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、緊密な非共有結合の会合における１つの重鎖可変領域ドメインおよび１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、かつ抗体に抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（それぞれＨ鎖およびＬ鎖から３ループ）が発せられる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
また、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と省略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結合されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
本発明の抗体の「機能性断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、概して、インタクトな抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、または修飾ＦｃＲ結合能を保持するもしくは有する抗体のＦｖ領域を含む。抗体断片の例としては、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である、「キメラ」抗体（イムノグロブリン）を含むが、残りの鎖は、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片の対応する配列と同一であるか、または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書の目的のキメラ抗体は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含み、抗体の抗原結合領域は、例えば、目的の抗原を有するマカクザルを免疫化することによって生成される抗体に由来する。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに精密化するために行われてもよい。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中で、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性などの抗体性能を改善する１つ以上の個々のＦＲ残基置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、Ｈ鎖では６個以下であり、Ｌ鎖では３個以下である。またヒト化抗体は任意に、少なくとも、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号もまた参照されたい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、単一の抗原部位に対して配向される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、複数の抗原部位に対して配向される。代替的なヒト化方法は、米国特許第７，９８１，８４３号および米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号に記載されている。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「可変領域」および「可変ドメイン」は、互換的に使用され得る。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、概して、抗体の最も可変な部分（同じクラスの他の抗体と比較して）であり、抗原結合部位を含む。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、任意の利用可能な方法または番号付けスキームを使用して決定することができ、例えば、ＷＯ２０１８／２０７７０１に記載される可変ドメインを含んでもよく、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインは、可変ドメインのカルボキシル末端上に（すなわち、第４のフレームワークドメインのカルボキシル末端に）１つ以上のアミノ酸残基を欠いていてもよく、そうでなければ、ある特定の番号付けスキームに基づく可変ドメインの説明に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインは、可変ドメインのカルボキシル末端上に（すなわち、第４のフレームワークドメインのカルボキシル末端に）１つ以上のアミノ酸残基を含んでもよく、そうでなければ、ある特定の番号付けスキームに基づく可変ドメインの説明に含まれていなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」は、配列において超可変であり、かつ／または構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。概して、抗体は、６つのＨＶＲを含み、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３は、６つのＨＶＲの最も多様性を示し、特にＨ３は、抗体に微細な特異性を付与する上で固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３））を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然発生型ラクダ科抗体は、軽鎖の不在下で機能的かつ安定的である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）およびＳｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照されたい。
いくつかのＨＶＲの説明が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列変動性に基づき、最も一般的に使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａ ＨＶＲは、代わりに構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。「コンタクト」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下に記載する。
Figure 2022516881000002
別段の示唆が無い限り、可変ドメイン残基（ＨＶＲ残基およびフレームワーク領域残基）は、Ｋａｂａｔらの上記に従って番号付けされる。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔにある可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるアミノ酸位置番号付け」という表現、またはその変形は、Ｋａｂａｔらの上記の抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはＦＲもしくはＨＶＲへの挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２後の挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「標準」のＫａｂａｔ番号付けされた配列とともに抗体の配列の相同性の領域での整列によって決定されてもよい。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶＬまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来」するアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、または既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、それらの配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮していない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、ある一定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと代替的に称され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢの整列における配列によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａ対Ｂのアミノ酸配列同一性％は、Ｂ対Ａのアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されよう。
特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに「結合する」、「特異的に結合する」、または「特異的である」抗体は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の、関連のない抗ＣＴＬＡ４ポリペプチドへの結合は、当該技術分野で既知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって測定された場合、ＣＴＬＡ４への抗体結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４（例えば、マウスＣＴＬＡ４および／またはヒトＣＴＬＡ４）に結合する結合タンパク質（例えば、抗体）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．７ｎＭ、≦０．６ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
本明細書に提供される「ＣＴＬＡ４」または「ＣＴＬＡ４タンパク質」という用語は、ＣＴＬＡ４タンパク質活性（例えば、ＣＴＬＡ４と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性以内）を維持する、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）またはそのバリアントもしくは相同体の組換え型または天然発生型の形態のうちのいずれかを含む。いくつかの態様では、バリアントまたは相同体は、天然発生型ＣＴＬＡ４ポリペプチドと比較して、配列全体または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００の連続アミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ＮＣＢＩ配列参照ＧＩ：８３７００２３１、相同体、またはその機能性断片によって識別されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、マウスＣＴＬＡ４である。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞障害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上で結合された分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、その後、標的細胞を細胞毒素で殺傷することを可能にする、ある形態の細胞傷害を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「アーム」し、この機構によって標的細胞を殺傷するために必要である。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページ目の表３に要約されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、Ｆｃグリカンをフコシル化してＡＤＣＣを強化させる能力を欠く細胞において操作または発現される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるアッセイなどのインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいてインビボで評価されてもよい。ＡＤＣＣ活性および他の抗体特性を変化させる他のＦｃバリアントには、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７－４０，１９９７、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３－５６４，１９８８、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７－２６６２，１９９１、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：５３－５９，１９９２、Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３，１９９４、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１９８０－１１９８４，１９９５、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４：１１１－１１７，１９９５、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ９：１１５－１１９，１９９５、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４：１０１－１０４，１９９６、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：４９６３－４９６９，１９９６、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３－２６２４，１９９９、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４１７８－４１８４，２００、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５－１９３３，２０００、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６－２６，２０００、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１－２５７５，２００１、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６６０４，２００１、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５．２００２、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０，２００２、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５－４０１０，２００６、米国特許第５，６２４，８２１号、第５，８８５，５７３号、第５，６７７，４２５号、第６，１６５，７４５号、第６，２７７，３７５号、第５，８６９，０４６号、第６，１２１，０２２号、第５，６２４，８２１号、第５，６４８，２６０号、第６，１９４，５５１号、第６，７３７，０５６号、第６，８２１，５０５号、第６，２７７，３７５号、第７，３３５，７４２号、および第７，３１７，０９１号によって開示されるものを含む。
本明細書の「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を画定するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと画定される。本発明の抗体で使用するための好適な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。
本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）およびその結合パートナー（例えば、抗原）の単一結合部位間の非共有結合相互作用の強度を指す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に対する結合タンパク質（例えば、抗体）の親和性は、概して、平衡解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）およびその結合パートナー（例えば、抗原）の複数の結合部位の結合強度を指す。
本明細書の抗体をコードする「単離された」核酸分子は、それが生成された環境で通常関連する少なくとも１つの汚染核酸分子から識別および分離される核酸分子である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、生成環境と関連付けられたすべての構成要素と無関連である。本明細書のポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態または環境以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書のポリペプチドおよび抗体をコードする核酸と区別される。
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の構成要素を含まない、調製物を指す。かかる製剤は滅菌されている。
本明細書で使用される場合、「担体」は、用いられる用量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に非毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化物質；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、臨床病理の経過中に治療されている個体または細胞の自然経過を変えるように設計された臨床介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善または緩和、ならびに寛解または予後の改善が含まれる。個体は、例えば、障害（例えば、腫瘍性疾患）に関連する１つ以上の症状が軽減または除去される場合、首尾よく「治療される」。例えば、治療が、疾患を患う個体の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、疾患の再発頻度の低減、疾患の重症度の低減、疾患の発症もしくは進行の遅延、および／または個体の生存の延長をもたらす場合、個体は、首尾よく「治療される」。
本明細書で使用される場合、「と併用して」または「と組み合わせて」は、別の治療モダリティに加えて、１つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「と併用して」または「と組み合わせて」は、個体への他の治療モダリティの投与の前、その間、またはその後の、１つの治療モダリティの投与を指す。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、個体における疾患の発生または再発に関して予防を提供することを含む。個体は、障害の素因がある、障害にかかりやすい、または障害を発症するリスクがあるが、障害と診断されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体）は、障害の発症を遅らせるために使用される。
本明細書で使用される場合、障害を発症する「リスクがある」個体は、検出可能な疾患または疾患の症状を有してもよく、または有さなくてもよく、本明細書に記載される治療方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を示していても、または示さなくてもよい。「リスクがある」とは、当該技術分野で既知であるように、個体が、疾患の発症と相関する測定可能なパラメータである１つ以上のリスク因子を有することを示す。これらのリスク因子のうちの１つ以上を有する個体は、これらのリスク因子のうちの１つ以上を有しない個体よりも、障害を発症する確率が高い。
「有効量」は、少なくとも、治療結果または予防的結果を含む、所望のまたは示された効果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。有効量は、１つ以上の投与で提供され得る。「治療有効量」は、少なくとも、特定の障害の測定可能な改善に影響を与えるために必要な最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が抗体の任意の毒性または有害な効果を上回る量であり得る。「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。典型的には、必ずしもではないが、予防用量は、疾患の前または早期の段階の対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくてもよい。
「慢性的」投与は、長期間にわたる初期治療効果（活性）を主流にするように、急性モードとは対照的に、連続での医薬の投与を指す。「断続的」投与は、中断することなく連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的である治療である。
本明細書で使用される場合、「個体」または「対象」は、哺乳動物である。治療の目的のための「哺乳動物」には、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどの動物園、スポーツ、またはペット動物が含まれる。いくつかの実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
ＩＩ．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）に結合するタンパク質が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片であるか、またはＣＴＬＡ４結合ドメインを含むタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合する、二重特異性抗体またはその抗原結合断片である。例えば、ＣＴＬＡ結合ドメインを含む二重特異性抗体。一態様では、本明細書に記載されるＣＴＬＡ４結合ドメインを含む融合タンパク質などのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＣＴＬＡ４結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、例えば、ＣＴＬＡ４に結合することができる抗原結合ドメインによって、ＣＴＬＡ４に結合するキメラ受容体である。
本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、様々な種に由来するＣＴＬＡ４に結合することができ、例えば、ヒトＣＴＬＡ４および／またはマウスＣＴＬＡ４、もしくはカニクイザルＣＴＬＡ４に結合するものもある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、以下の特徴：（１）ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する、および（２）腫瘍部位で、インビボでＣＴＬＡ４に結合する、のうちの１つ以上を有する。
一態様では、特にＣＴＬＡ４が役割を果たす腫瘍性疾患の治療に有用なＣＴＬＡ４結合タンパク質が本明細書に提供される。本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、細胞（例えば、癌細胞またはＴ細胞）の表面上に発現されるＣＴＬＡ４タンパク質と相互作用（例えば、結合）することができる結合ドメインを含む。
また、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、第１の鎖および第２の鎖を含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）を含む、ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、重鎖および軽鎖を含むヘテロ二量体などの第１の鎖および第２の鎖を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、第１の鎖および第２の鎖を含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、重鎖および軽鎖の両方を含む一本鎖タンパク質などの一本鎖タンパク質である。
前述の実施形態のうちのいずれか１つの抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、またはキメラ受容体をコードする核酸もまた提供される。前述の実施形態の核酸を含むベクターもまた提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。前述の核酸の実施形態を含む宿主細胞もまた提供される。
抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、またはキメラ受容体を生成する方法もまた提供され、前述の宿主細胞を、抗体、二重特異性抗体、またはキメラ受容体を生成する条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、さらに、ゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかは、宿主細胞によって生成される抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、またはキメラ受容体を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の方法によって生成される二重特異性抗体またはキメラ受容体。
前述の実施形態のうちのいずれか１つの抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、またはキメラ受容体を含む組成物もまた提供される。いくつかの実施形態は、前述の実施形態の抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、またはキメラ受容体を含む組成物を包含する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的組成物である。
前述の実施形態のうちのいずれか１つの抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、キメラ受容体、または組成物を含むキットもまた提供される。
対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法もまた提供され、方法は、前述の実施形態のうちのいずれか１つの、有効量の抗体、二重特異性抗体、もしくはその任意の抗原結合断片、キメラ受容体、または組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、腫瘍性疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、または精巣癌である。
ＣＴＬＡ４結合タンパク質
本明細書に提供される「ＣＴＬＡ４結合タンパク質」という用語は、ＣＴＬＡ４タンパク質に結合することができるか、またはそうでなければＣＴＬＡ４タンパク質に対する親和性を呈することができるＣＴＬＡ４結合ドメインを含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗原結合断片、一本鎖抗体などである。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合するキメラ抗原受容体の構成要素である。
「ＣＴＬＡ４結合ドメイン」という用語は、細胞中または細胞上に見出されるＣＴＬＡ４タンパク質に結合することができるか、またはそうでなければＣＴＬＡ４タンパク質に対する親和性を呈することができる組換え発現ポリペプチドドメインを指す。ＣＴＬＡ４結合ドメインのＣＴＬＡ４への結合の程度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＣＴＬＡ４に結合することができる抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、マウスＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、二量体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖を含むヘテロ二量体などの第１の鎖および第２の鎖を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖（例えば、軽鎖および重鎖）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖（例えば、２つの軽鎖および２つの重鎖）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２もしくは１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３もしくは１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４もしくは１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５もしくは１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６もしくは１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、第１の鎖は軽鎖であり、第２の鎖は重鎖である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗原結合断片は、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、マウス抗体である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８ＤありまたはなしのＫ２９０Ｓ、もしくはＳ２９８Ｖ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；またはＫ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／もしくはＫ３２６Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号２８のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号２８のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号２９のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号２９のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号３４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７および３２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号２８、２９、３３、および３４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、ならびに抗原、例えば、腫瘍抗原である抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む、二重特異性抗体もまた本明細書に提供される。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、マウス抗体である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、ＩｇＧ１は、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８ＤありまたはなしのＫ２９０Ｓ、もしくはＳ２９８Ｖ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；またはＫ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／もしくはＫ３２６Ｅなどのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２もしくは１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３もしくは１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４もしくは１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５もしくは１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６もしくは１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２７および３２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号２８、２９、３３、および３４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖は、（ｉ）配列番号１もしくは１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２もしくは１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３もしくは１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４もしくは１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５もしくは１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６もしくは１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ／または配列番号２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ／または配列番号３１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号３１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ／または配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に記載されるエフェクター機能を強化するアミノ酸置換を含むＩｇＧ１アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、二重特異性抗体の抗原結合アームの軽鎖および重鎖を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号１もしくは１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２もしくは１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３もしくは１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖は、（ｉ）配列番号４もしくは１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５もしくは１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６もしくは１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体の任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体の任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
二重特異性抗体の任意の実施形態のうちのいくつかでは、ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体の任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２７および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２８、２９、３３、および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２７および３２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２８、２９、３３、および３４から選択されるアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４である。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、マウスＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、マウス抗体である。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書に記載されるエフェクター機能を強化するアミノ酸置換を含むＩｇＧ１アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、二量体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、ヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖を含むヘテロ二量体などの第１の鎖および第２の鎖を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体または抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、キメラ受容体で使用するためのリガンド結合ドメインの一部など、ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号１もしくは１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２もしくは１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３もしくは１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４もしくは１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５もしくは１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６もしくは１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号１９アミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、第２の鎖は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、当該技術分野で周知の様々な方法によって、追加の分子と複合体化され得る。「複合体」および「複合体化学」という用語は、比較的軽度の条件下で進行する既知の反応性基との反応を指す。これらには、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールの、ハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素および炭素－ヘテロ原子多重結合（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）への付加が含まれるが、これらに限定されない。これらの反応および他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、およびＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２で議論されている。
本明細書の複合体化学に使用される有用な反応性官能性基には、例えば、（ａ）これらに限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステルを含むカルボキシル基およびその様々な誘導体、（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得るヒドロキシル基、（ｃ）ハロアルキル基であって、ハロゲン化物が後に、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置き換えられ得、それによりハロゲン原子の部位における新しい基の共有結合をもたらす、ハロアルキル基、（ｄ）例えば、マレイミド基などの、ディールス・アルダー反応に関与することができるジエノフィル基、（ｅ）グリニャール付加またはアルキルリチウム付加などの機構を介して、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、またはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介してその後の誘導体化が可能になるようなアルデヒド基またはケトン基、（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成する、アミンとのその後の反応のためのスルホニルハロゲン基、（ｇ）ジスルフィドに変換することができ、ハロゲン化アシルと反応することができ、または金などの金属に結合され得る、チオール基、（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化され得る、アミン基またはスルフヒドリル基、（ｉ）例えば、環状付加、アシル化、マイケル追加などの経ることができる、アルケン、（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド、（ｋ）核酸合成に有用なホスホロアミダイトおよび他の標準的な官能性基、（ｉ）金属酸化ケイ素結合、ならびに（ｌ）例えば、リン酸ジエステル結合を形成する反応性リン基（例えば、ホスフィン）への金属結合が含まれる。
反応性官能性基は、本明細書に記載される組成物の化学的安定性に関与しないか、または干渉しないように選択することができる。あるいは、反応性官能性基は、保護基の存在によって架橋反応に関与することから保護され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、当該技術分野で周知の様々な方法によって、追加の分子および／またはＣＴＬＡ４結合タンパク質に融合されるように操作され得る。例えば、核酸は、宿主細胞から組換え発現されたときに融合タンパク質を生成するために、追加の分子および／またはＣＴＬＡ４結合タンパク質を含むリンカーをコードするように操作され得る。
例示的なＣＴＬＡ４結合タンパク質
上述のある特定の特徴を含むＣＴＬＡ４結合タンパク質のある特定の例示的な実施形態を以下に記載する。これらの実施形態は、単に例示的であり、限定するものであると解釈されるべきではない。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供され、抗体またはその抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は軽鎖であり、第２の鎖は重鎖である。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、ａ）抗体の第１の鎖は軽鎖であり、抗体の第２の鎖は軽鎖であり、ｂ）抗体の第１の鎖は重鎖であり、抗体の第２の鎖は重鎖であり、またはｃ）抗体の第１の鎖は軽鎖であり、抗体の第２の鎖は重鎖である。
いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片もまた本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一態様では、配列番号２５もしくは３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２６もしくは３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
さらなる態様では、配列番号２７および３２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号２８、２９、３３、および３４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号２６および３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６または３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２５または３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５または３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
免疫グロブリンには５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それぞれ、指定されたα，δ，ε，γ、およびμの重鎖を有する。γおよびαのクラスは、サブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと称される複数の多型バリアント（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７）に存在してもよく、そのいずれも本明細書の実施形態のうちのいくつかでの使用に好適である。ヒト集団における一般的なアロタイプバリアントは、ａ、ｆ、ｎ、ｚ、またはその組み合わせの文字によって指定されるものである。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。
本発明の一態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある特定の実施形態では、かかるベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明の別の態様では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体、または本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＴＬＡ４が、本明細書に列挙されるものなどの役割を果たす腫瘍性疾患の治療のための薬学的製剤である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合することができる二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、結合特異性のうちの一方は、ＣＴＬＡ４に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４の２つの異なるエピトープに結合し得る。
いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、ならびにｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、ならびにｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖を含む二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＴＬＡ４とは異なる抗原である。いくつかの実施形態では、第１の対または第２の対の軽鎖は、本明細書に記載される任意の軽鎖である。いくつかの実施形態では、第１の対または第２の対の重鎖は、本明細書に記載される任意の軽鎖である。いくつかの実施形態では、第１の対の軽鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第１の対の重鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の対の軽鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の対の重鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＴＬＡ４の異なるエピトープに対するものである。
二重特異性抗体で使用するための本明細書で企図される二重特異性抗体には、マウス二重特異性抗体、ヒト化二重特異性抗体、キメラ二重特異性抗体、およびヒト二重特異性抗体が含まれる。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸置換を含むＩｇＧ１アイソタイプを有するか、または本明細書に記載されるエフェクター機能を強化するＦｃグリカンをフコシル化する低減された能力を有さない細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。
一態様では、配列番号２５および３０から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ならびに／または配列番号２６および３１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号２７および３２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号２８、２９、３３、および３４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号２６および３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６および３１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２５および３０から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５および３０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合することができるキメラ受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））である。ＣＡＲは、所望の抗原（例えば、ＣＴＬＡ４）に対する抗体ベースの特異性を、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞活性を呈するキメラタンパク質を生成する分子である。一実施形態では、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合された、本明細書に記載されるＣＴＬＡ４結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作されたキメラ受容体が本明細書に提供される。本明細書に提供されるキメラ受容体は、Ｔ細胞中で発現された場合、細胞外ドメインにより抗原結合特異性に基づいて抗原認識をリダイレクトすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、共刺激分子およびゼータ鎖のうちの１つ以上からの細胞内ドメインと融合することが好ましい。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、およびそれらの任意の組み合わせの群から選択される１つ以上の細胞内ドメインと融合される。
いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含むリガンド結合ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ならびにｃ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号２５および３０から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２６および３１から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含むリガンド結合ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ならびにｄ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号２５および３０から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２６および３１から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、１）ＣＴＬＡ４に結合するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むリガンド結合ドメインであって、ａ）ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、またはｂ）ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む、リガンド結合ドメインと、２）膜貫通ドメインと、３）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ受容体が本明細書に提供される。
いくつかの態様では、１）ＣＴＬＡ４に結合するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むリガンド結合ドメインであって、ａ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはｂ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはｃ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、あるいはｄ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、リガンド結合ドメインと、２）膜貫通ドメインと、３）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ受容体が本明細書に提供される。
いくつかの態様では、提供されるキメラ受容体のうちのいずれかにおいて、ａ）ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいはｂ）ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、提供されるキメラ受容体のうちのいずれかでは、ａ）ＶＬドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、またはｂ）ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
１．結合親和性
抗体と抗体が特異的である抗原との間のものなど、免疫学的結合相互作用の強度、または親和性は、相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）に関して表すことができ、Ｋｄが小さいほどより高い親和性を表す。タンパク質の免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。例えば、１つの方法は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを含み、この速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。「オンレート定数」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの速度は、親和性に関連しないすべてのパラメータの削除を可能にし、平衡解離定数ＫＤと等しい。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９－４７３，（１９９０）を参照されたい。
いくつかの態様では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質と比較して、ほぼ同じまたはより高い親和性でＣＴＬＡ４に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、約５０ｐＭ～約５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）で標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）に結合する。結合親和性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、本明細書の実施例１に記載されるアッセイなどである。
２．生物学的活性アッセイ
いくつかの態様では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、インビボでのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍体積を低減させる。腫瘍体積の低減を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、本明細書の実施例１に記載されるアッセイなどである。
ＩＩＩ．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の調製
本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、当該技術分野で利用可能な技術を使用して調製され、その例示的な方法は、以下のセクションにより詳細に記載される。
１．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：抗体断片
本発明は、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質として抗体断片を包含する。抗体断片は、酵素消化などの従来の手段によって、または組換え技術によって生成され得る。ある特定の状況では、全抗体よりも抗体断片を使用する利点がある。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４を参照されたい。
抗体断片の生成のために様々な技術が開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接的に生成され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細胞型で発現され、それから分泌されてもよく、したがって、大量のこれらの断片の容易な生成を可能にする。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、培養培地から直接回収され、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するように化学的に結合され得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。ＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期の増加を伴うＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の生成のための他の技術は、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態では、抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、および第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、したがって、それらは、インビボでの使用中に低減された非特異的結合に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築され得る。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。また、ポリペプチドリンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖを含む二重ｓｃＦｖを、二重特異性抗体として使用することができる。あるいは、３つ以上のｓｃＦｖを含むマルチｓｃＦｖを、多重特異性抗体として使用してもよい。
本発明は、線形抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような）、または適切なリンカーを介して連結された抗体の重鎖配列および軽鎖配列を含む一本鎖免疫グロブリンを含む。かかる線形抗体または免疫グロブリンは、単一特異性または二重特異性であってもよい。かかる一本鎖免疫グロブリンは、二量体化されて、それにより元々四量体である抗体のものと類似の構造および活性を維持することができる。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、かつ軽鎖の配列を有さない抗体であってもよい。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディと呼ばれる、かかる抗体。これらの抗体はまた、本発明による抗体の機能性断片の意味に包含される。
２．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。ヒト化抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って生成される。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「輸入」可変ドメインから取り込まれる「輸入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に超可変領域の配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）の後に本質的に行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、より実質的に少ないインタクトなヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
３．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：ヒト抗体
本発明のヒト抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を、既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。ヒト抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って生成される。
４．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、ＣＴＬＡ４に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、ＣＴＬＡ４を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。二重特異性抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って生成される。
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３）、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２０（７）：８３８－８４７を参照されたい。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロ複合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体内の抗体の一方は、アビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。ヘテロ複合体抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、いくつかの架橋技術とともに、当該技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
５．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従って生成される。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む単一ポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１を参照されたい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部からなる。
６．抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行い、最終構築物を得ることができるが、ただし、最終構築物は、所望の特徴を保有していることを条件とする。アミノ酸変化は、配列が作製されたときに対象の抗体アミノ酸配列に導入されてもよい。
変異誘発に好ましい位置である抗体のある特定の残基または領域を特定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基または群が識別され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、または置換部位のために、さらなるまたは他のバリアントを導入することによって精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は、予め決められているが、変異自体の性質は予め決められる必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、標的コドンまたは領域においてＡｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が実施され、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入には、１残基から数百以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合を含み、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントには、酵素またはポリペプチドに対する、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれ、それにより抗体の血清半減期が延長される。
いくつかの実施形態では、薬物動態を改善するＦｃＲｎ変異には、これらに限定されないが、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１１、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｖ３０８Ｐが含まれる。いくつかの実施形態では、かかる変異は、低いｐＨでＦｃＲｎへの抗体結合を強化するが、中性ｐＨでは抗体親和性を変化させない。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的にグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型のグリコシル化とは、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンもまた使用されてもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、上述のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位の）のうちの１つ以上が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成される。改変はまた、元の抗体の配列（Ｏ結合型グリコシル化部位の）に対して、１つ以上のセリン残基またはスレオニン残基の付加、欠失、または置換により行われてもよい。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合された炭水化物は改変され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に結合されたフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体は、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）もまた参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合された炭水化物中のバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８、Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．、および米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．で参照されている。抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ１９９７／３００８７、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．に報告されている。また、そのＦｃ領域に結合された改変炭水化物を有する抗体に関するＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）もまた参照されたい。修飾グリコシル化を有する抗原結合分子に関するＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）もまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、グリコシル化バリアントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合された炭水化物構造は、フコースを欠くか、または低減されたフコースを有する。そのようなバリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意に、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する、その中に１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４での置換（残基のＥＵナンバリング）をさらに含む。「非フコシル化」抗体、「脱フコシル化」抗体、または「フコース欠損」抗体に関連する刊行物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を生成する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、およびアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））などのノックアウト細胞株、およびβ１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）とゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）とを過剰発現する細胞が挙げられる。
本明細書の実施形態のうちのいずれかでは、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するために操作され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株で生成されてもよい。いくつかのさらなる実施形態では、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株で生成されてもよい。さらなる実施形態では、細胞株は、さらに、ゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
一実施形態では、抗体は、その血清半減期を改善するために改変される。抗体の血清半減期を増加させるために、１つは、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、抗体（特に抗体断片）にＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープを組み込み得る。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加する要因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（ＵＳ２００３／０１９０３１１、米国特許第６，８２１，５０５号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，８３４，５９７号）。
バリアントの別のタイプは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、異なる残基により置き換えられた抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発についての目的の部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで、表１に示されている。そのような置換により生物活性に望ましい変化が生じる場合、より大きな置換変化は、表１において「例示的な置換」で表示され、またはアミノ酸のクラスに関して以下に詳述されるように、そうした置換変化が導入され、生成物はスクリーニングされ得る。
Figure 2022516881000003
抗体の生物学的特性における置換修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の例えばシート立体構造またはヘリカル立体構造としての構造、（ｂ）標的部位の分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の体積、の維持に対する効果において、大きく異なる置換を選択することにより実現される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然発生型残基は、以下の一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分けられ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することを伴う。かかる置換残基はまた、保存的置換部位、または残りの（非保存的）部位に導入されてもよい。
置換バリアントの１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。概して、さらなる開発のために選択された得られたバリアントは、それらが生成される親抗体に対して、修飾された（例えば、改善された）生物学的特性を有する。かかる置換バリアントを生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）を変異させて、各部位ですべての可能なアミノ酸置換を生成する。したがって、生成された抗体は、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物）の少なくとも一部への融合として、繊維状ファージ粒子からディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイバリアントを、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための超可変領域部位候補を特定するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または追加的に、抗体と抗原の間の接触点を特定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接残基は、本明細書に詳述されるものを含む、当該技術分野で既知の技術による置換の候補である。かかるバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の技術を使用してスクリーニングされ、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる開発のために選択され得る。
抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、これらに限定されないが、天然源からの単離（天然発生型アミノ酸配列バリアントの場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向型）変異誘発による調製、ＰＣＲ変異誘発、および以前に調製された抗体のバリアントもしくは非バリアントバージョンのカセット変異誘発が含まれる。
本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体）は、強化されたエフェクター機能を有するＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、非フコシル化される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、非フコシル化される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、マンノース部分の増加されたレベルを有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、バイセクティンググリカン部分の増加されたレベルを有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、マンノース部分の増加されたレベルを有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８Ｄを有するかもしくは有さないＫ２９０Ｓ、またはＳ２９８Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＫ３２６Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質内に含まれる例示的な重鎖定常領域は、配列番号３５～３８に示される重鎖定常領域配列を含む。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質内に含まれる例示的な軽鎖定常領域は、配列番号３９に示される軽鎖定常領域配列を含む。
いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、配列番号３８に示される配列を含む重鎖定常領域を含む。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、配列番号３５に示される配列を含む重鎖定常領域を含む。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、配列番号３９に示される配列を含む軽鎖定常領域を含む。
いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、配列番号３８に示される配列を含む重鎖定常領域、および配列番号３９に示される配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片などの提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、配列番号３５に示される配列を含む重鎖定常領域、および配列番号３９に示される配列を含む軽鎖定常領域を含む。
この説明および当該技術分野の教示によれば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えば、Ｆｃ領域において、野生型の対応する抗体と比較して、１つ以上の改変を含み得ることが企図される。しかしながら、これらの抗体は、その野生型の対応するものと比較して、治療的有用性のために必要とされる実質的に同じ特徴を保持するであろう。例えば、ある特定の改変は、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、改変された（すなわち、改善されたまたは減少されたのいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすであろうＦｃ領域において行われ得る。Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＦｃ領域バリアントの他の例についてのＷＯ９４／２９３５１もまた参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲへの結合が改善されたまたは減少した抗体バリアントを説明する。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）もまた参照されたい。増加された半減期と、母体のＩｇＧの胎児への移入の要因となる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合とを有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する、その中の１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。改変Ｆｃ領域アミノ酸配列を有し、Ｃ１ｑ結合能が増加または減少したポリペプチドバリアントは、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）もまた参照されたい。
７．抗体－薬物複合体
本発明はまた、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合体化された、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を含む抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）も提供する。
一実施形態では、抗体－薬物複合体に複合体化される１つ以上の薬物には、これらに限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照されたい）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号、および第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリチアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、および第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）、およびＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）、および米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；およびＣＣ１０６５が含まれる。
別の実施形態では、抗体－薬物複合体に複合体化される１つ以上の薬物は、これらに限定されないが、チューブリン重合の阻害剤（例えば、メイタンシノイドおよびアウリスタチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアミシン、デュオカルマイシン、およびインドリノベンゾジアゼピン二量体）、およびＤＮＡ合成阻害剤（例えば、エキサテカン誘導体Ｄｘｄ）が含まれる。
別の実施形態では、抗体－薬物複合体は、酵素的に活性な毒素またはその断片に複合体化された本明細書に記載される抗体を含み、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ジェロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。
別の実施形態では、抗体－薬物複合体は、放射性原子に複合体化された本明細書に記載される抗体を含み、放射性複合体を形成する。放射性複合体の生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体が検出に使用される場合、放射性複合体は、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３などのシンチグラフィー研究用の放射性原子、または再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）用のスピン標識を含み得る。
抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）および細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミジン酸塩ＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合体化するための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書のＡＤＣは、これらに限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）から）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む、架橋試薬で調製されたかかる複合体を明確に企図する。
８．ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の組換え生成については、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のために、それをコードする核酸を単離し、複製可能なベクター内に挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用することにより（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、シーケンシングされる。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。概して、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（概して哺乳動物）起源のいずれかである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域をこの目的に使用することができること、ならびにかかる定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されよう。
９．原核宿主細胞を使用した結合タンパク質の生成
ａ）ベクター構築
本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体生成細胞から単離され、配列決定されてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。得られると、ポリペプチドをコードする配列は、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入される。当該技術分野で利用可能かつ既知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）、およびそれが常駐する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な構成要素を含む。ベクター構成要素には、概して、これらに限定されないが、複製の起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、および転写終結配列が含まれる。
概して、レプリコンを含むプラスミドベクターおよび宿主細胞と適合する種に由来する対照配列は、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を担持する。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、遺伝子コードアンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性を含み、したがって形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージもまた、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含み得るか、または含むように修飾され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６４８，２３７号に記載されている。
さらに、レプリコンを含むファージベクターおよび宿主微生物と適合する制御配列を、これらの宿主と関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えベクターを作製する際に、λＧＥＭ．ＴＭ．－１１などのバクテリオファージが利用されてもよい。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする２つ以上のプロモーター－シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導性および恒常性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応答して、その制御下でシストロンの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してプロモーターをソースＤＮＡから除去し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに動作可能に連結することができる。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅および／または発現を配向することができる。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、それらが、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写量およびより高い収率を一般的に許容するため、利用される。
原核宿主との使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能する他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーターなど）も同様に好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それによって、当業者が、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖および重鎖をコードするシストロンに動作可能にライゲーションすることが可能になっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたって発現ポリペプチドの転座を配向する分泌シグナル配列構成要素を含む。概して、シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに対して天然のシグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態では、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはそのバリアントである。
別の態様では、本発明による免疫グロブリンの生成は、宿主細胞の細胞質内で発生し得るため、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点において、免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、追加の分子などの配列ありまたはなしで発現され、フォールディングされ、アセンブリされて、細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切なフォールディングおよびアセンブリを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、本発明の分泌および適切にアセンブリされた抗体の収率を最大化するために、発現ポリペプチド構成要素の定量的比を調節することができる発現系を使用することによって生成することができる。かかる調節は、ポリペプチド構成要素の翻訳強度を同時に調節することによって少なくとも部分的に達成される。
本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を発現するのに好適な原核宿主細胞には、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物などの古細菌および真正細菌が含まれる。有用な細菌の例としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、またはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞は、本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）、およびその誘導体が挙げられ、遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する株３３Ｄ３を含む。大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）などの他の株およびその誘導体、大腸菌Ｂ、大腸菌λ １７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）もまた好適である。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体を構築するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、大腸菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種を宿主として好適に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌するべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤は、細胞培養に組み込まれ得ることが望ましい。
ｂ）結合タンパク質生成
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切な場合に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体統合体によってのいずれかで複製可能となるように、原核宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準的な技術を使用して行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、電気穿孔法である。
本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を生成するために使用される原核細胞は、当該技術分野で既知の培地中で増殖され、選択された宿主細胞の培養に好適である。好適な培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）に加えて、必要な栄養補助剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に許容する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために、アンピシリンが培地に添加される。
炭素、窒素、および無機リン酸源以外の任意の必要な補助剤もまた、単独で、または別の補助剤もしくは複合窒素源などの培地との混合物として、適切な濃度で導入されてもよい。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタアミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、およびジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含み得る。
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。ある特定の実施形態では、大腸菌の増殖については、増殖温度は、約２０℃～約３９℃、約２５℃～約３７℃、または約３０℃の範囲である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５～約９の範囲の任意のｐＨであってもよい。ある特定の実施形態では、大腸菌については、ｐＨは約６．８～約７．４、または約７．０である。
誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターで使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。ある特定の実施形態では、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３－１４７を参照されたい）。当該技術分野で既知であるように、用いられるベクター構築物に従って、様々な他の誘導剤が使用されてもよい。
一実施形態では、本発明の発現された抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、宿主細胞の周辺質に分泌され、宿主細胞の周辺質から回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などのかかる手段によって微生物を破壊することを伴う。細胞が破壊されると、細胞片または細胞全体が、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞を培養物から除去され得、培養上清は、生成されたタンパク質のさらなる精製のために濾過され、濃縮される。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなどの一般的に既知である方法を使用して、さらに単離および特定することができる。
本発明の一態様では、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質生成は、発酵プロセスによって大量に実施される。組換えタンパク質の生成には、様々な大規模な流加発酵手順が利用可能である。大規模な発酵は、少なくとも１０００リットルの容量を有し、ある特定の実施形態では、約１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵剤は、酸素および栄養素、特にグルコースを分配するために撹拌器インペラーを使用する。小規模の発酵とは、一般的に、体積容量が約１００リットル以下であり、かつ約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る発酵機での発酵を指す。
発酵プロセスでは、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が好適な条件下で、所望の密度、約１８０～２２０のＯＤ５５０へと成長した後に開始され、その段階では細胞は、初期静止期である。様々な誘導剤が、当該技術分野で既知であり、上述されるように、用いられるベクター構築物に従って使用されてもよい。細胞は、誘導の前により短い期間にわたって成長し得る。細胞は通常、約１２～５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間が使用されてもよい。
本発明のポリペプチドの生成収率および品質を改善するために、様々な発酵条件を修飾することができる。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（カペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランス－イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現する追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で生成される異種タンパク質の適切なフォールディングおよび溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０。
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のタンパク質）のタンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素を欠損したある特定の宿主株を本発明に使用することができる。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、およびそれらの組み合わせなどの既知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内の遺伝的変異に影響するように修飾され得る。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株は、例えば、上記のＪｏｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素を欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株は、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
ｃ）結合タンパク質精製
一実施形態では、本明細書の生成される抗体タンパク質は、さらなるアッセイおよび使用のために、実質的に均質な調製物を得るためにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は、好適な精製手順の例である：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過。
一態様では、固相上に固定されたプロテインＡは、本発明の抗体生成物の免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の４１ｋＤ細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３。プロテインＡが固定される固相は、ガラスもしくはシリカ表面、または制御された細孔ガラスカラムもしくはケイ酸カラムを含むカラムであり得る。いくつかの用途では、カラムは、グリセロールなどの試薬でコーティングされ、汚染物質の非特異的な付着を防止する可能性がある。
精製の第１のステップとして、上述の細胞培養に由来する調製物を、プロテインＡ固定化固相に適用して、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を可能にすることができる。次いで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合された汚染物質を除去する。最後に、目的の抗体は、溶出によって固相から回収される。
１０．真核宿主細胞を使用した結合タンパク質の生成
真核宿主細胞で使用するためのベクターには、概して、以下の非限定的な構成要素：シグナル配列、複製の起源、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれる。
ａ）シグナル配列構成要素
真核宿主細胞で使用するためのベクターはまた、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくは目的のポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドを含み得る。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームで、抗体をコードするＤＮＡにライゲーションされる。
ｂ）複製の起源
概して、複製構成要素の起源は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起源は、典型的には、早期プロモーターを含むためにのみ使用され得る。
ｃ）選択遺伝子構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子を含んでもよく、選択マーカーとも称される。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連する場合、栄養要求性欠損を相補するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子で正常に形質転換することに成功したそれらの細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を生成し、したがって選択レジメンを生き延びる。かかる優性の選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンの薬物を使用する。
哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉおよび－ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの核酸をコードする抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を取り出す能力を有する細胞の識別を可能にするものである。
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中ですべての形質転換体を培養することによって特定される。いくつかの実施形態では、野生型ＤＨＦＲを用いる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）である。
あるいは、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列と形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またＧ４１８などの選択可能マーカーの選択剤を含む培地中の細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）を欠損した細胞株を含むＮＳ０を含んでもよい。哺乳動物細胞用の選択マーカーとしてのＧＳの使用方法は、米国特許第５，１２２，４６４号および米国特許第５，８９１，６９３号に記載されている。
ｄ）プロモーター構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつ目的の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーター配列は、真核生物について既知である。例えば、ほぼすべての真核遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。ある特定の実施形態では、これらの配列のうちのいずれかまたはすべては、真核生物発現ベクターに好適に挿入されてもよい。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、ファウルポックスウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され、ただし、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起源も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時早期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾については、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載している、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
ｅ）エンハンサー要素構成要素
より高い真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによってしばしば増加される。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）から既知である。しかしながら、典型的には、１つは真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、ヒトサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のエンハンサー要素について記載している、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、５’または３’の位置で抗体ポリペプチドコード配列にベクター内にスプライスされてもよいが、概して、プロモーターから５’の部位に位置する。
ｆ）転写終結構成要素
真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含み得る。かかる配列は、真核またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’の非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中に開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載されるより高い真核細胞を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
宿主細胞は、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質生成のために上述の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切な場合に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてもよい。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、もしくは第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許再発行３０，９８５に記載される培地のうちのいずれかは、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれも、必要な場合、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で補充されてもよい。任意の他のサプリメントも、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
ｉ）結合タンパク質の精製
組換え技術を使用する場合、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、細胞内で生成され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が第１のステップとして細胞内で生成される場合、宿主細胞または溶解断片のいずれかである微粒子状破片は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去され得る。抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質が培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、最初に、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮されてもよい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するための前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を防止するために含まれてもよい。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーは簡便な技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２：１－１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ、およびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースであってもよいが、他のマトリックスが利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製に有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップに続いて、目的の結合タンパク質および汚染物質を含む混合物は、例えば、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で行われる、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、さらなる精製に晒されてもよい。
概して、研究、試験、および臨床使用における使用のための抗体を調製するための様々な方法論は、上述の方法論と一致し、かつ／または特定の目的の抗体について当業者によって適切であるとみなされるように、当該技術分野で定着している。
ＩＶ．組成物
いくつかの態様では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質のうちのいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）もまた本明細書に提供される。
治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって保管のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｋｌｉｎｓ，Ｐｕｂ．，Ｇｅｎｎａｒｏ Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．２０００）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、緩衝剤；アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、ピロ亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化物質；防腐剤、等張剤、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；ＥＤＴＡおよび／または非イオン性界面活性剤などのキレート剤を含む。
緩衝剤を使用して、特に安定性がｐＨ依存性である場合に、治療有効性を最適化する範囲内でｐＨを調整することができる。緩衝剤は、約２０ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。本発明とともに使用するための好適な緩衝剤は、有機酸および無機酸ならびにその塩の両方を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。さらに、緩衝剤は、トリスなどの、ヒスチジン塩およびトリメチルアミン塩からなってもよい。
防腐剤は、微生物の成長を防止するために添加することができ、典型的には、約０．２％～１．０％（ｗ／ｖ）の範囲内に存在する。本発明とともに使用するための好適な防腐剤には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；ヘキサメトニウム塩化物；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ベンゼトニウム塩化物；チメロサール、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールが含まれる。
等張剤は、時には「安定剤」として知られ、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在し得る。タンパク質および抗体などの大きな荷電生体分子とともに使用された場合、それらはアミノ酸側鎖の荷電群と相互作用し、それによって分子間相互作用および分子内相互作用の可能性を低減することができるため、しばしば「安定剤」と称される。等張剤は、他の成分の相対量を考慮に入れて、約０．１重量％～約２５重量％または約１～約５重量％の任意の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、等張剤としては、多価糖アルコール、三価または価数がより多い糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールが挙げられる。
追加の賦形剤には、（１）増量剤、（２）溶解性エンハンサー、（３）安定剤、および（４）ならびに容器壁への変性または付着を防止する薬剤のうちの１つ以上として作用し得る薬剤が含まれる。かかる賦形剤には、多価糖アルコール（上記に列挙）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；ならびにデキストリンまたはデキストランなどの多糖類が含まれる。
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤を可溶化させるのを助け、ならびに撹拌誘導凝集から治療用タンパク質を保護するために存在することができ、これはまた、活性治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤がせん断表面応力に曝露されることを可能にする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌまたは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で存在する。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０１％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０１％～約０．０２５％ｗ／ｖの範囲内で存在する。
好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、および６０、モノステアリン酸グリセロール、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得る陰イオン性洗剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、およびジオクチルスルホン酸ナトリウムが含まれる。陽イオン性洗剤には、ベンザルコニウム塩化物またはベンゼトニウム塩化物が含まれる。
製剤をインビボでの投与に使用するためには、製剤は滅菌でなければならない。製剤は、滅菌濾過膜を介する濾過によって滅菌され得る。本明細書の治療用組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静注液バッグ、または皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内、もしくは関節内経路、局所投与、吸入による、または徐放性もしくは持続放出手段による、注射または注入などの好適な様式で、単回もしくは複数回のボーラス、または長期間にわたる注入など、既知の許容された方法に従う。
本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、本明細書に記載される方法にあるのと同じように使用することができる。「と組み合わせて」という用語は、同一または別個の製剤に含まれる２つ以上の治療剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質および治療剤）を包含する。いくつかの実施形態では、「と組み合わせて」とは、「同時」投与を指し、その場合、本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与は、１つ以上の追加の治療剤の投与に同時に発生する（例えば、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与と、１つ以上の追加の治療剤の投与との間と同時または１時間以内）。いくつかの実施形態では、「と組み合わせて」とは、逐次的投与を指し、その場合、本発明の抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与は、１つ以上の追加の治療剤の投与の前および／または後に発生する（例えば、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与と、１つ以上の追加の治療剤の投与との間の１時間超）。本明細書で意図される薬剤には、これらに限定されないが、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子を標的とする薬剤、免疫刺激分子を標的とする薬剤、または成長阻害剤が含まれる。
本明細書の製剤はまた、治療されている特定の適応症、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する適応症に必要な場合に、複数の活性化合物を含み得る。あるいは、または追加的に、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子もしくは刺激分子を標的とする薬剤、または成長阻害剤を含んでもよい。かかる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて好適に存在する。
Ｖ．治療方法
有効量の本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）またはその組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患を治療または予防するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、腫瘍性障害（例えば、癌）と診断されたか、またはかかる障害を発症するリスクがある。
疾患の予防または治療について、活性薬剤の適切な投与量は、上に定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、予防または治療目的のために薬剤が投与されるかどうか、以前の治療、対象の臨床歴および薬剤に対する応答、ならびに担当医師の裁量に依存する。薬剤は、一度に、または一連の治療にわたって、対象に好適に投与される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与の間の間隔は、約１ヶ月またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、投与の間の間隔は、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、またはそれ以上である。本明細書で使用される場合、投与の間の間隔は、抗体の１つの投与と抗体の次の投与との間の期間を指す。本明細書で使用される場合、約１ヶ月の間隔は、４週間を含む。いくつかの実施形態では、投与の間の間隔は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、治療は、抗体の複数回投与を含み、投与の間の間隔は、変化し得る。例えば、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１ヶ月であり、その後の投与の間の間隔は、約３ヶ月である。いくつかの実施形態では、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１ヶ月であり、第２の投与と第３の投与との間の間隔は、約２ヶ月であり、その後の投与の間の間隔は、約３ヶ月である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、フラット用量で投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体は、例えば、１つ以上の別個の投与によって、または連続注入によってにかかわらず、患者への投与のための初期候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が発生するまで治療が概して維持されるであろう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が患者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、用量あたり約２５ｍｇ～約５００ｍｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかの投与量で対象に投与される。上述の投与頻度のうちのいずれかを使用してもよい。
本明細書に企図される治療方法は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）による、障害または疾患の治療である。本発明の製剤により治療可能な障害または疾患には、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌）、または精巣癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による癌の治療または予防の方法が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経内分泌腫瘍、癌腫および肉腫を含む、哺乳動物に見られるすべてのタイプの癌、新生物、または悪性腫瘍を指す。本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）、薬学的組成物、または方法により治療され得る例示的な癌には、リンパ腫、肉腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、骨髄腫、甲状腺癌、白血病、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ、ＥＲ陽性、ＥＲ陰性、化学療法抵抗性、ハーセプチン耐性、ＨＥＲ２陽性、ドキソルビシン耐性、タモキシフェン耐性、腺管癌、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣癌、脾臓癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、腺癌、肺大細胞癌、小細胞肺癌、カルチノイド、肉腫）、多形性膠芽腫、神経膠腫、黒色腫、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膠芽腫、卵巣癌、肺癌、扁平上皮細胞癌（例えば、頭、首、または食道）、結腸直腸癌、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫が含まれる。追加の例としては、甲状腺の癌、内分泌系の癌、脳の癌、***の癌、子宮頸部の癌、結腸の癌、頭頸部の癌、食道の癌、肝臓の癌、腎臓の癌、肺の癌、非小細胞肺癌、黒色腫、中皮腫、卵巣の癌、肉腫、胃の癌、子宮の癌、または髄芽腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形性膠芽腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、内分泌または外分泌脾臓の新生物、甲状腺髄様癌、甲状腺髄様癌、黒色腫、結腸直腸癌、甲状腺乳頭癌、肝細胞癌、乳頭パジェット病、葉状腫瘍、小葉癌、腺管癌、膵星細胞の癌、肝星細胞の癌、または前立腺癌が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による白血病の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「白血病」という用語は、血液形成器官の進行性の悪性疾患を広く指し、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体の歪んだ増殖および発生によって一般的に特徴付けられる。白血病は一般的に、（１）疾患急性または慢性の期間および特徴、（２）関与する細胞の種類、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）（骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））、リンパ性（リンパ行性）、または単球性、および（３）血液白血病または白血病（亜白血病）における異常細胞数の増加または非増加に基づいて、臨床的に分類される。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る例示的な白血病には、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ）白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｉｄ）白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、または未分化細胞白血病が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による肉腫の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「肉腫」という用語は、一般に、胚性結合組織のような物質からなり、かつ線維状または均質な物質に埋め込まれた密接に充填された細胞から一般に構成される腫瘍を指す。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛上皮腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血病肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性間葉腫肉腫、傍骨性肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、網状赤血球肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫、または毛細管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による黒色腫の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると取られる。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る黒色腫には、例えば、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセイ黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による癌腫の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある上皮細胞からなる悪性の新しい成長を指す。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る例示的な癌腫には、例えば、甲状腺髄様癌、家族性甲状腺髄様癌、腺房癌（ａｃｉｎａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、 腺房癌（ａｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌、肺胞上皮癌、肺胞上皮細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、気管支肺胞癌、気管支癌、気管支原性癌、脳状癌腫、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、子宮体癌（ｃｏｒｐｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌、鎧状癌、皮膚の癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、円筒形癌、円筒細胞癌、導管癌、導管性癌、硬性癌、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性癌（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｘ ｕｌｃｅｒｅ）、線維性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、膠状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌（ｈｅｍａｔｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子様癌（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小児胎児性癌（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪性癌、小葉癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腺癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽腔癌、燕麦細胞癌、骨化性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌（ｏｓｔｅｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、粥状癌（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌（ｒｅｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫様癌、シュナイダー癌（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錐細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、ストリング癌（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張症様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、管状癌（ｔｕｂｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結節性癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、または絨毛癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による転移性癌の治療または予防の方法が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「転移」、「転移性」、および「転移性癌」という用語は、互換的に使用され、腫瘍性疾患または障害、例えば、癌の、１つの器官または別の非隣接器官または身体部分からの広がりを指す。癌は、原発性腫瘍、例えば、原発性乳癌と称される、例えば、***などの起源部位で発生する。原発性腫瘍または起源部位の一部の癌細胞は、局所領域の正常な組織を取り囲むように浸透し浸潤する能力、および／または系を循環するリンパ系または血管系の壁を体内の他の部位および組織に浸透する能力を獲得する。原発性腫瘍の癌細胞から形成される第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性または二次性腫瘍と称される。癌細胞が転移すると、転移性腫瘍およびその細胞は、元の腫瘍のものと類似していると推定される。したがって、肺癌が***に転移した場合、***の部位の二次性腫瘍は、異常な肺細胞からなり、異常な***細胞からではない。***の二次性腫瘍は、転移性肺癌を指す。したがって、転移性癌という語句は、対象が原発性腫瘍を有するかまたは有した、かつ１つ以上の二次性腫瘍を有する疾患を指す。非転移性癌、または転移性ではない癌を有する対象という語句は、対象が原発性腫瘍を有するが、１つ以上の二次性腫瘍を有さない疾患を指す。例えば、転移性肺癌は、原発性肺腫瘍を有するか、もしくは原発性肺腫瘍の既往歴を有する、および例えば、***の第２の位置もしくは複数の位置において１つ以上の二次性腫瘍を有する対象における疾患を指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＬＡ４結合タンパク質によって有益であり得る疾患または障害には、（全体的または部分的に）ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４の活性もしくは機能によって引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、癌（例えば、前立腺癌、腎臓癌、転移性癌、黒色腫、去勢抵抗性前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膠芽腫、卵巣癌、肺癌、扁平上皮細胞癌（例えば、頭、首、または食道）、結腸直腸癌、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫））が含まれるか、または疾患の症状は、（全体的または部分的に）ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４の活性もしくは機能によって引き起こされる。
ＶＩ．製造物品またはキット
別の態様では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）を含む製造物品またはキットが提供される。製造物品またはキットは、本発明の方法における結合タンパク質の使用のための説明書をさらに含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、製造物品またはキットは、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の有効量を個体に投与することを含む、個体において障害（例えば、癌）を治療または予防するための方法における、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の使用のための説明書を含む。ある特定の実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、または精巣癌からなる群から選択される疾患を有する。
製造物品またはキットは、容器をさらに含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（シングルチャンバーシリンジまたはデュアルチャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は製剤を保持する。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤である。
製造物品またはキットは、容器上のまたは容器と関連付けられるラベルまたは添付文書をさらに含んでもよく、製剤の再構成および／または使用の指示を示してもよい。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体における障害（例えば、癌）を治療または予防するための、皮下、静脈内、または他の投与様式に有用であるか、または意図されていることをさらに示し得る。製剤を保持する容器は、単回使用バイアルまたは複数回使用バイアルであってもよく、これは再構成された製剤の反復投与を可能にする。製造物品またはキットは、好適な希釈剤を含む第２の容器をさらに含み得る。製造物品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書を含む、商業的、治療的、およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明は、単回用量投与ユニット用のキットを提供する。かかるキットは、単一または複数チャンバーのプレフィルドシリンジの両方を含む治療用抗体の水性製剤の容器を含む。例示的なプレフィルドシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ（Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。
本明細書の製造物品またはキットは、任意に、第２の医薬を含む容器をさらに含み、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、第１の医薬であり、その物品またはキットは、有効量で、第２の医薬で対象を治療するためのラベルまたは添付文書上の説明書をさらに含む。
別の実施形態では、自動注射器での投与のための本明細書に記載される製剤を含む製造物品またはキットが本明細書に提供される。自動注射器は、起動時に、患者または投与者からの追加の必要な措置なしにその内容物を送達する、注射装置として説明され得る。これらは、送達速度が一定でなければならず、かつ送達時間が数瞬よりも長い場合、治療用製剤のセルフメディケーションに特に好適である。
例示的な実施形態
提供される例示的な実施形態のうち、以下が挙げられる。
１．軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
２．ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または
ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
実施形態１に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
３．ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
実施形態１または２に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
４．軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、あるいは
ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
５．前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
６．前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
７．重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
８．配列番号３５～３８からなる群から選択されるＣＨ配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
９．前記ＣＨが、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤもしくはＩ３３２Ｅまたは両方を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされている、実施形態７または８に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１０．配列番号３８のＣＨ配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１１．軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１２．配列番号３９のＣＬ配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１３．ａ）前記軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）前記軽鎖が、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
実施形態１～１２のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１４．配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１５．配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１６．非フコシル化されているかまたはフコース欠損である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１７．薬剤と複合体化されている、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１８．前記薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、実施形態１７に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
１９．前記薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、実施形態１７に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
２０．１）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
前記第１の対の前記軽鎖が、ＶＬドメインを含み、かつ前記第１の対の前記重鎖が、ＶＨドメインを含み、
ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２１．ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または
ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
実施形態２０に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２２．ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
実施形態２０または２１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２３．１）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
前記第１の対の前記軽鎖が、ＶＬドメインを含み、かつ前記第１の対の前記重鎖が、ＶＨドメインを含み、
ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、あるいは
ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２４．前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、実施形態２０～２３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２５．前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、実施形態２０～２３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２６．重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含む、実施形態２０～２５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２７．配列番号３５～３８からなる群から選択されるＣＨ配列を含む、実施形態２０～２６のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２８．前記ＣＨが、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤもしくはＩ３３２Ｅまたは両方を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされている、実施形態２６または２７に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
２９．配列番号３８のＣＨ配列を含む、実施形態２０～２８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３０．軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、実施形態２０～２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３１．配列番号３９のＣＬ配列を含む、実施形態２０～３０のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３２．ａ）前記軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）前記軽鎖が、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
実施形態２０～３１のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３３．１）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
前記第１の対が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、
二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３４．１）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
前記第１の対が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、
二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３５．非フコシル化されているかまたはフコース欠損である、実施形態２０～３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３６．薬剤と複合体化されている、実施形態２０～３５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３７．前記薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、実施形態３６に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３８．前記薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、実施形態３６に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
３９．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片をコードする、核酸。
４０．実施形態３９に記載の核酸を含む、ベクター。
４１．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態３９に記載の核酸を含む、宿主細胞。
４２．非フコシル化されているかまたはフコース欠損である抗体またはその抗原結合断片を生成することができる、実施形態４１に記載の宿主細胞。
４３．アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する、実施形態４１または４２に記載の宿主細胞。
４４．β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の宿主細胞。
４５．ゴルジμ－マンノシダーゼＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載の宿主細胞。
４６．抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を生成する条件下で、実施形態４１～４５のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
４７．非フコシル化もしくはフコース欠損抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を生成する条件下で、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
４８．前記宿主細胞によって生成された抗体またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む、実施形態４３～４５のいずれか１つに記載の方法。
４９．実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の方法によって生成される、抗体またはその抗原結合断片。
５０．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を含む、組成物。
５１．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
５２．対象において腫瘍性疾患を治療または予防するのに使用するための、
実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
５３．対象において腫瘍性疾患を治療または予防するための医薬の製造における、
実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物
の使用。
５４．実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を含む、キット。
５５．対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法であって、有効量の、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態２０～３８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、実施形態４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または実施形態５０～５２のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのみであり、それを考量したその様々な修飾または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および目的、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解されるべきである。
実施例１：ＣＴＬＡ４への抗ＣＴＬＡ４抗体結合のインビトロ特徴付け：低密度抗原結合ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ
例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体と、ＣＴＬＡ４またはＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に対するバリアントとの間の結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。
方法
抗体
試験された抗体は、抗体１および抗体２と称されるヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体、ならびにそのバリアント／形態／バージョンを含む。特定の番号付けスキームに従って、抗体１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って、抗体１は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。特定の番号付けスキームに従って、抗体２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って、抗体２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。例えば、Ｆｃドメイン内に特定の変異を含むか、または非フコシル化バージョンを含み、各々に「抗体１－＃」の命名法が用いられる、抗体１の様々な形態を生成および評価し、例えば、Ｆｃドメイン内に特定の変異を含むか、または非フコシル化バージョンを含み、各々に「抗体２－＃」の命名法が用いられる、抗体２の様々な形態を生成および評価した。
ＥＬＩＳＡ
すべてのＥＬＩＳＡを、以下の記載と実質的に類似した様式で、または当該技術分野で既知の方法と概して一致した様式で行った。ポリスチレン９６ウェルマイクロプレート（Ｆｉｓｈｅｒ ＃０７－２００－５９１）を、ウェルあたり１μｇ／ｍＬのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ＃７２６８－ＣＴ）でコーティングし、４℃で一晩保存した。プレートを、ＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｂ４２８７－２５Ｇ）でブロッキングし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。以下に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体を含む試料の連続希釈を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ＋１％ＢＳＡ）中で作製し、プレートに添加し、室温で１時間、１００ＲＰＭで軌道振盪した。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、アッセイ緩衝液中で１：８０００に希釈された抗ヒトカッパ軽鎖［クローン：ＳＢ８１ａ］－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ７９１１５）を、ウェルに塗布し、室温で１時間振盪した。プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ＨＲＰ基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ＃３７０６９）をプレートに塗布し、発光を分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてデータを分析した。
ＳＰＲ
すべての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を、以下の記載と実質的に類似した様式で、または当該技術分野で既知の方法と概して一致した様式で行った。抗体またはその断片と、ヒトＣＴＬＡ４（ｈｕＣＴＬＡ４）、カニクイザルＣＴＬＡ４（ｃｙｎｏＣＴＬＡ４）、またはＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）などの標的タンパク質との間の結合を評価するために、ある特定の抗体に対してＳＰＲを行った。いくつかの研究では、ある特定の抗体、例えば、抗体２－６（Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン）および抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブのヒトＣＴＬＡ４への結合を試験するために、ＳＰＲ分析を行った。いくつかの研究では、ある特定の抗原結合断片、例えば、抗体２およびイピリムマブなどの抗体のＦａｂの組換えヒトＣＴＬＡ４（ｒｈＣＴＬＡ４）への結合を試験するために、ＳＰＲ分析を行った。いくつかの研究では、ある特定の抗原結合断片、例えば、抗体２およびイピリムマブなどの抗体のＦａｂのｃｙｎｏＣＴＬＡ４－Ｆｃへの結合を試験するために、ＳＰＲ分析を行った。ＳＰＲ分析を、３７℃でＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器で行った。抗体およびアイソタイプ対照（参照チャネル）を、１００ＲＵの固定化レベルでＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合した。ペプチドを合成し、ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に希釈した。結合データを、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．０を使用して分析した。
結果
ＥＬＩＳＡ
図１Ａおよび図１Ｂは、上述のヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体である抗体１および抗体２、またはそのバリアントを用いた、ヒトＣＴＬＡ－Ｆｃに対する、ＥＬＩＳＡにより評価した結合研究の結果を示す。図１Ａは、野生型Ｆｃ領域を有する抗体１のバージョン（抗体１－１）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体１のバージョン（抗体１－２）とのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの結合の間の検出可能な差異がないことを示す。図１Ｂは、野生型Ｆｃ領域を有する抗体２のバージョン（抗体２－１）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－２）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異、および２つのヒンジ領域変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－３）、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌ変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－４）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ変異、および２つのヒンジ領域変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－５）とを含む、抗体２の様々な形態のＣＴＬＡ４結合を比較する。図１Ｂに示されるように、抗体のすべての形態は、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃに同様に結合した。試験された抗体の平均ＥＣ５０値を、以下の表２に提供する。
Figure 2022516881000004
図１Ｃ～１Ｅは、ＥＬＩＳＡによって評価される、Ｆｃ領域における変異または非フコシル化バージョンを含む、ヒト化ＣＴＬＡ４抗体である抗体１、抗体２、もしくはイピリムマブ、またはそのバリアントのヒトＣＴＬＡ－Ｆｃに対する結合研究の結果を示す。試験された抗体の平均ＥＣ５０値を、それぞれの図に提供する。図１Ｃは、野生型Ｆｃ領域を有する抗体１のバージョン（抗体１－１）、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体１のバージョン（抗体１－２）、および抗体１の非フコシル化バージョン（抗体１－ａＦｕｃ）のヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの結合の間の検出可能な差異がないことを示す。図１Ｄは、野生型Ｆｃ領域を有する抗体２のバージョン（抗体２－１）、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－６）、および抗体２の非フコシル化バージョン（抗体２－ａＦｕｃ）のヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの結合の間の検出可能な差異がないことを示す。図１Ｅは、野生型Ｆｃを有するイピリムマブのバージョン（イピリムマブ）、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有するイピリムマブのバージョン（イピリムマブ－ｍ）、およびイピリムマブの非フコシル化バージョン（イピリムマブ－ａＦｕｃ）のヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの結合の間に検出可能な差がないことを示す。図１Ｃ～１Ｅに示されるように、抗体の各々のすべてのバリアントは、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃに同様に結合した。
ＳＰＲ
図２Ａは、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、および２ｎＭで、抗体２－６（Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン）またはイピリムマブとヒトＣＴＬＡ４（ｈｕＣＴＬＡ４）との間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。図２Ｂは、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）、ならびに抗体２－６とイピリムマブとの間の差の倍率に関して、図２Ａに示される結合結果を要約する。図２Ｂに示されるように、抗体２－６は９１ｐＭのＫＤを有するが、一方でイピリムマブは１６４０ｐＭのＫＤを有し、これは、抗体２－６が、ＫＤによって測定された場合に、イピリムマブよりも、ｈｕＣＴＬＡ４への約１８倍高い結合親和性を有することを示す。抗体２－６とｃｙｎｏＣＴＬＡ４との間の結合のＳＰＲ分析は、１３１ｐＭのＫＤを示した。
図２Ｃは、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、および２ｎＭで、イピリムマブのＦａｂ（イピリムマブ－Ｆａｂ）または抗体２のＦａｂ（抗体２－Ｆａｂ）とｒｈＣＴＬＡ４－Ｆｃとの間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。図２Ｄは、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、およびχ２値に関して、図２Ｃに示される結合結果を要約する。図２Ｄに示されるように、イピリムマブは４．７４ｎＭのＫＤ値を有するが、一方で抗体２－Ｆａｂは４．５３ｐＭのＫＤ値を有し、これは、抗体２－Ｆａｂが、ＫＤによって測定された場合に、イピリムマブ－Ｆａｂよりも、ｒｈＣＴＬＡ４－Ｆｃへのはるかにより高い結合親和性を有することを示す。ｒｈＣＴＬＡ４－Ｆｃとイピリムマブ－Ｆａｂまたは抗体２－Ｆａｂのいずれかとの間の追加の結合親和性データを、以下の表３に提供し、これは、イピリムマブ－Ｆａｂの平均ＫＤが５．７１±０．８７ｎＭであり、抗体２－Ｆａｂの平均ＫＤが３．８６±２．１ｐＭであることを示す。
Figure 2022516881000005
図２Ｅは、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、および２ｎＭで、イピリムマブのＦａｂ（イピリムマブ－Ｆａｂ）または抗体２のＦａｂ（抗体２－Ｆａｂ）とｃｙｎｏＣＴＬＡ４－Ｆｃとの間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。図２Ｆは、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、およびχ２値に関して、図２Ｅに示される結合結果を要約する。図２Ｆに示されるように、イピリムマブは２８．６ｎＭのＫＤ値を有するが、一方で抗体２－Ｆａｂは０．６２３ｎＭのＫＤ値を有し、これは、抗体２－Ｆａｂが、ＫＤに関してイピリムマブ－Ｆａｂよりも、ｃｙｎｏＣＴＬＡ４－Ｆｃへのはるかにより高い結合親和性を有することを示す。ｃｙｎｏＣＴＬＡ４－Ｆｃとイピリムマブ－Ｆａｂまたは抗体２－Ｆａｂのいずれかとの間の追加の結合親和性データを、以下の表４に提供し、これは、イピリムマブ－Ｆａｂの平均ＫＤが２３．１±６．３ｎＭであり、抗体２－Ｆａｂの平均ＫＤが０．７７９±０．１５ｎＭであることを示す。
Figure 2022516881000006
図３は、様々な濃度での抗体２－１（野生型Ｆｃ領域を有する抗体２のバージョン）、抗体２－６（Ｆｃ領域中にＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン）、またはイピリムマブと、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）との間の結合を示すＳＰＲ分析の結果を示す。動態および親和性は、結果に基づいて計算することができなかった。
実施例２：エンテロトキシン分析
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイを使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ－２生成を促進する様々な抗体の能力を調べた。
方法
ＳＥＢアッセイ
ＳＥＢアッセイについては、選択された抗体の希釈物を、予め加温された培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ＋１％ＨＥＰＥＳ＋１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ＋１％Ｎａ－ピルビン酸塩）中で調製した。抗体溶液を三重に播種し、培地のみを「ＰＢＭＣ ＋ ＳＥＢ」ウェル、「ＰＢＭＣのみ」のウェル、および外縁壁に添加した。ＳＥＢ溶液を予め加温した培地中で調製し、「ＰＢＭＣのみ」を除くすべての実験ウェルに添加した。ＰＢＭＣ（ＢｉｏＩＶＴ）を、３７℃の水浴中で解凍した。細胞をコニカルチューブに滴加で移し、２０倍の予め加温した培地を添加して細胞を洗浄した。細胞を遠心分離し、培地を吸引した。細胞を、２０ｍＬの予め加温した培地中に再懸濁し、アリコートを計数のために採取した。残りの細胞を遠心分離し、大量に再懸濁して、細胞を１×１０６個の細胞／ｍＬにした。細胞をウェルあたり１００μＬで播種し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間インキュベートした。５日目に、プレートを１０００ＲＰＭで５分間スピンした。各ウェルから、２５０μＬの細胞を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートを再びスピンし、２２５μＬの細胞をＰＣＲストリップに移した。試料を、ＥＬＩＳＡにより分析されるまで－８０℃で保存した。
ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ
上述のプロトコルを使用して生成された細胞上清のＩＬ－２レベルを、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅセット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号＃４３１８０６）を用いた分析によって決定した。細胞上清試料をアッセイ緩衝液で希釈して、標準曲線内に収まった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、およびテューキーの多重比較検定（一元配置分散分析）を用いて試料を分析して、治療群間の統計的有意性を決定した。
結果
抗体１および抗体２の様々な形態を、ＳＥＢアッセイで試験した。実施例１に記載される、抗体１－１もしくは抗体１－２の存在下で生成された、または抗体なしのＩＬ－２のレベルを示すデータを、図４Ａに示す。実施例１に記載される、抗体２－１、抗体２－２、抗体２－３、抗体２－４、および抗体２－５の存在下で生成された、または抗体なしのＩＬ－２のレベルを示すデータを、図４Ｃに示す。すべての試験された抗体は、非抗体対照と比較してＩＬ－２レベルを増加させる能力を示した。各抗体に対する抗体なし対照を上回るＩＬ－２レベルの倍増を、アイソタイプ対照との比較とともに、図４Ｂ（抗体１およびバリアント）および図４Ｄ（抗体２およびバリアント）に示す。
様々なバージョンの抗ＣＴＬＡ４抗体１［野生型Ｆｃ領域を有する（抗体１－１）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（抗体１－２）、ならびに抗体１の非フコシル化バージョン（抗体１－ａＦｕｃ）］、抗体２［野生型Ｆｃ領域を有する（抗体２－１）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（抗体２－６）、ならびに抗体２の非フコシル化バージョン（抗体２－ａＦｕｃ）］、またはイピリムマブ［野生型Ｆｃを有する（イピリムマブ）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（イピリムマブ－ｍ）、ならびにイピリムマブのアフコシル化バージョン（イピリムマブ－ａＦｕｃ）］を用いるＳＥＢアッセイによる同様の評価の結果を、図４Ｅに示す。結果は、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体が、より高いＩＬ－２生成をもたらすことを示した。
実施例３：抗ＣＴＬＡ４抗体によるＡＤＣＣ活性
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらす抗ＣＴＬＡ４抗体の能力を、ＦｃγＲＩＩＩａレポーターバイオアッセイを使用して評価した。
方法
ＦｃγＲＩＩＩａレポーターバイオアッセイ
ＦｃγＲＩＩＩａレポーターバイオアッセイを、様々な抗ＣＴＬＡ４抗体を使用して行った。抗体を、予め加温した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０を有するＦＢＳ）中で希釈した。ＣＴＬＡ４エフェクター細胞（標的細胞：Ｐｒｏｍｅｇａ Ｊ１５８Ａ）を解凍し、完全培地を含むコニカルチューブに移した。細胞を混合および計数し、細胞の密度を１×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。標的細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号＃３９１７）の各ウェルに添加した。希釈された抗体を適切なウェルに添加し、二重で試験した。各ウェルの内容物を穏やかに混合し、プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。エフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞を発現するＦｃγＲＩＩＩａ）を解凍し、完全培地を含むコニカルチューブに移した。細胞を混合および計数し、細胞の密度を３×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。直ちに、エフェクター細胞を各ウェルに分注し、穏やかに混合した。プレートを蓋で覆い、３７℃で６時間維持した。測定の１時間前に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質およびＢｉｏ－Ｇｌｏ緩衝液を４℃から除去した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ緩衝液をＢｉｏ－Ｇｌｏ基質のボトルに移して、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を作製し、反転により穏やかに混合した。ボトルを室温で維持した。インキュベーション後、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で１０分間維持した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、プレートを室温で５～１５分間インキュベートした。次いで、プレートをルミノメーターで読み取った。
試験される抗体には、抗ＣＴＬＡ４抗体１［野生型Ｆｃ領域を有する（抗体１－１）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（抗体１－２）、ならびに抗体１の非フコシル化バージョン（抗体１－ａＦｕｃ）］、抗体２［野生型Ｆｃ領域を有する（抗体２－１）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（抗体２－６）、ならびに抗体２の非フコシル化バージョン（抗体２－ａＦｕｃ）］、またはイピリムマブ［野生型Ｆｃを有する（イピリムマブ）、Ｆｃ領域においてＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する（イピリムマブ－ｍ）、ならびにイピリムマブのアフコシル化バージョン（イピリムマブ－ａＦｕｃ）］が含まれた。
結果
図５Ａ～５Ｄは、抗体１バリアント（図５Ａ）、抗体２バリアント（図５Ｂ）、イピリムマブバリアント（図５Ｃ）、および３つの抗体すべての非フコシル化バリアント（図５Ｄ）のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイからのレポーター活性化の曲線およびＥＣ５０値を示す。結果は、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体および非フコシル化抗体が、各抗体について野生型Ｆｃ領域を有するそれぞれのバージョンと比較して、より高い活性化をもたらしたことを示した。
実施例４：抗ＣＴＬＡ４抗体の投与後のヒトＣＴＬＡ４を発現する腫瘍担持マウスモデルにおける免疫細胞のインビボ免疫表現型検査
免疫細胞の免疫表現型を、様々な抗ＣＴＬＡ４抗体を投与されたヒトＣＴＬＡ４ノックインを有するＭＣ３８腫瘍担持遺伝子操作マウスモデルで決定した。
方法
ＭＣ３８細胞（１×１０６個）を、ヒトＣＴＬＡ４によるノックインを有するマウスモデルに皮下注射した。０日目に、マウスを腫瘍体積測定値に基づいて無作為化し、２００μｇの試験抗体（抗体２－１、イピリムマブ、非フコシル化形態のイピリムマブ（イピリムマブ－ａＦｕｃ）、またはＩｇＧ対照の単回注射で腹腔内注射した。免疫表現型検査を、注射の５日後にＣＤ４５＋脾臓細胞およびＣＤ４５＋腫瘍内細胞で行った。ＣＤ４５＋細胞を、評価されるそれらのマーカーを発現するＣＤ４５＋細胞の相対割合で、ＣＤ３＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ３＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ＋／Ｋｉ６７＋を含むマーカーの発現について評価した。
結果
ＭＣ３８腫瘍担持ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスからの免疫表現型検査からの結果を、図６Ａ～６Ｄに示し、ＣＤ４５＋脾臓（図６Ａおよび６Ｂ）またはＣＤ４５＋腫瘍内（図６Ｃおよび６Ｄ）の相対割合を、ＣＤ３＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ３＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ＋／Ｋｉ６７＋に対してマーカーのために提供する。統計を表５（脾臓細胞）および表６（腫瘍内細胞）に提供する。群１：ＩｇＧ、群２：抗体２－１、群４：イピリムマブ、群５：イピリムマブ－ａＦｕｃ。
Figure 2022516881000007
Figure 2022516881000008
実施例５：ヒトＣＴＬＡ４を発現する腫瘍担持マウスモデルにおける抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ腫瘍成長阻害
ヒトＣＴＬＡ４ノックインを有するＭＣ３８腫瘍担持遺伝子操作マウスモデルにおける投与後の様々な抗ＣＴＬＡ４抗体の腫瘍成長阻害活性を評価した。
ＭＣ３８細胞（１×１０６個）を、ヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインコード領域のノックインを含むマウスモデルに皮下注射した。マウスに、２０μｇ、７μｇ、または２μｇの試験抗体［抗体２－６、イピリムマブ、非フコシル化形態のイピリムマブ（イピリムマブ－ａＦｕｃ）、またはＦｃドメインにおけるＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異を有するＲＳＶ抗体（ＲＳＶ－ｍ）］の単回注射を腹腔内注射した。試験抗体の単回注射後に、経時的な腫瘍体積を測定した。
結果を図７Ａ～７Ｄに示す。図７Ａ（群平均）および図７Ｂ（個々のマウス）は、抗体２－６、イピリムマブ、または非フコシル化形態のイピリムマブ（イピリムマブ－ａＦｕｃ）を注射したマウスの経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、結果は、試験された抗体のすべてが腫瘍成長阻害を示すことを示した。図７Ｃ（２０μｇ）、図７Ｄ（７μｇ）、および図７Ｅ（２μｇ）は、異なる抗体の各用量での経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）の比較を示す。結果は、抗体２－６が、２μｇおよび７μｇ用量での最良の腫瘍成長阻害、ならびに２０μｇ用量でのイピリムマブ抗体と類似の腫瘍成長阻害を示したことを示した。
実施例６：ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルにおける抗ＣＴＬＡ４抗体の有効性および薬力学
方法
抗ＣＴＬＡ４抗体の有効性および薬力学（ＰＤ）を、ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルを使用して評価した。各試験抗体（ＲＳＶ－ｍ対照抗体、イピリムマブ、および抗体２－６）を投与し、次いで、腫瘍体積および体重を評価することによって有効性を評価した。抗ＲＳＶ対照抗体は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異（ＲＳＶ－ｍ対照抗体）を含む。末梢免疫表現型検査も５日目に実施し、投与後５日目の末梢血液中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋細胞の割合およびＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞の割合を評価した。有効性研究について、表７に示されるように、ｍｇ／ｋｇ単位での用量を用いて、マウスを評価した。本明細書で使用される場合、ｍｇ／ｋｇ単位での用量はまた、「ｍｐｋ」とも称される。ＭＢ４９細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６－ｈｕＣＴＬＡ４マウスに皮下接種した。治療は、腫瘍が約３５０ｍｍ３に達したときに開始した。ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析を行い、処置対対照（ＲＳＶ－ｍ対照）の統計的有意性を決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
Figure 2022516881000009
薬力学は、表８に示される用量（ｍｇ／ｋｇ）を用いて、マウスの５つのコホートの各々に抗体を投与することによって評価した。腫瘍、肝臓、脾臓、および血液において、他のリードアウトの中でも特に免疫表現型検査を行う。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ４＋細胞のうちの割合として測定することによってＴ細胞を評価し、ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ４５＋細胞のうちの割合として測定する。
Figure 2022516881000010
結果
図８Ａは、投与後５日目の末梢血液中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋細胞（左）およびＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞（右）の割合に関する有効性研究の結果を示し、これはＴ細胞活性化のレベルを表す。
図８Ｂに示されるように、１０ｍｇ／ｋｇ（ＲＳＶ－ｍ対照）または３ｍｇ／ｋｇ（イピリムマブまたは抗体２－６）で処置されたマウスにおいて、腫瘍重量およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を７日目に評価した。抗体２－６で処置されたマウスは、７日目に３ｍｇ／ｋｇで、腫瘍において最も低い腫瘍重量および最も高いＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を呈した。治療群のうちのいずれにおいても、体重、脾臓重量、腎臓重量、または肝臓重量の変化は観察されなかった（データには示さず）。
図８Ｃに示されるように、制御性Ｔ細胞枯渇およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、抗体２－６では観察されるが、イピリムマブでは観察されない。
図８Ｄに示されるように、抗ＣＴＬＡ４抗体を用いた処置後に強力な抗腫瘍活性が観察された。０．３ｍｇ／ｋｇ用量で、抗体２－６は、イピリムマブと比較して優れた抗腫瘍活性を示した。
実施例７：カニクイザルにおける抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ評価
抗ＣＴＬＡ４抗体の薬力学的（ＰＤ）効果を、カニクイザルにおいて評価した。実験の２つの異なるセットでは、カニクイザルに、イピリムマブ、抗体２－６、またはアイソタイプ対照を投与し、薬力学的（ＰＤ）効果を、ＣＤ４＋細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合（％）を測定することによって評価した。
ＰＤ実験の第１および第２のセットからの結果を図９に示す。抗体２－６は、イピリムマブと比較して、ＣＤ４＋細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合の上昇によって示されるように、イピリムマブよりも末梢ＰＤ効果の誘導においてより強力である。
また、試験抗体（ＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、または抗体２－６）の１０ｍｇ／ｋｇ静脈内用量後のカニクイザルを使用して薬物動態も評価した。血漿中の各抗体のレベルを測定し、半減期（日）、Ｃｍａｘ（μｇ／ｍＬ）、および曲線下面積（ＡＵＣ）（日＊μｇ／ｍＬ）を２つの研究で決定した。各試験された抗体についての薬物動態研究からの半減期（日）、Ｃｍａｘ（μｇ／ｍＬ）、および曲線下面積（ＡＵＣ）（日＊μｇ／ｍＬ）の結果を計算した。イピリムマブは、最も長い半減期および最大ＡＵＣを有していた。抗体２－６は、イピリムマブとほぼ同じＣｍａｘを有していた。

Claims (55)

  1. 軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片であって、
    ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  2. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  3. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
    請求項１または２に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  4. 軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片であって、
    ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
    抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  5. 前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  7. 重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  8. 配列番号３５～３８からなる群から選択されるＣＨ配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  9. 前記ＣＨが、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤもしくはＩ３３２Ｅまたは両方を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされている、請求項７または８に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  10. 配列番号３８のＣＨ配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  11. 軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  12. 配列番号３９のＣＬ配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  13. ａ）前記軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記軽鎖が、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  14. 配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  15. 配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  16. 非フコシル化されているかまたはフコース欠損である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  17. 薬剤と複合体化されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  18. 前記薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、請求項１７に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  19. 前記薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、請求項１７に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片。
  20. １）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
    ２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
    を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
    前記第１の対の前記軽鎖が、ＶＬドメインを含み、かつ前記第１の対の前記重鎖が、ＶＨドメインを含み、
    ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  21. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項２０に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  22. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
    請求項２０または２１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  23. １）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
    ２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
    を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
    前記第１の対の前記軽鎖が、ＶＬドメインを含み、かつ前記第１の対の前記重鎖が、ＶＨドメインを含み、
    ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、
    二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  24. 前記ＶＬドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  25. 前記ＶＬドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  26. 重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  27. 配列番号３５～３８からなる群から選択されるＣＨ配列を含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  28. 前記ＣＨが、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤもしくはＩ３３２Ｅまたは両方を含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされている、請求項２６または２７に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  29. 配列番号３８のＣＨ配列を含む、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  30. 軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  31. 配列番号３９のＣＬ配列を含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  32. ａ）前記軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記軽鎖が、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
    請求項２０～３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  33. １）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
    ２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
    を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
    前記第１の対が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、
    二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  34. １）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
    ２）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と
    を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、
    前記第１の対が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、
    二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  35. 非フコシル化されているかまたはフコース欠損である、請求項２０～３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  36. 薬剤と複合体化されている、請求項２０～３５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  37. 前記薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、請求項３６に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  38. 前記薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、請求項３６に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
  39. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片をコードする、核酸。
  40. 請求項３９に記載の核酸を含む、ベクター。
  41. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項３９に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  42. 非フコシル化されているかまたはフコース欠損である抗体またはその抗原結合断片を生成することができる、請求項４１に記載の宿主細胞。
  43. アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する、請求項４１または４２に記載の宿主細胞。
  44. β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  45. ゴルジμ－マンノシダーゼＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  46. 抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を生成する条件下で、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  47. 非フコシル化もしくはフコース欠損抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片を生成する条件下で、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  48. 前記宿主細胞によって生成された抗体またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法によって生成される、抗体またはその抗原結合断片。
  50. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を含む、組成物。
  51. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  52. 対象において腫瘍性疾患を治療または予防するのに使用するための、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  53. 対象において腫瘍性疾患を治療または予防するための医薬の製造における、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物
    の使用。
  54. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を含む、キット。
  55. 対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法であって、有効量の、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片、請求項４９に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項５０～５２のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
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