TW202126686A - 可活化之經掩蔽之抗ctla4結合蛋白 - Google Patents

可活化之經掩蔽之抗ctla4結合蛋白 Download PDF

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本發明提供可活化之經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如抗體、雙特異性抗體及嵌合受體)以及其在治療及預防癌症上之用途，以及包含可活化之經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之組合物及套組。

Description

可活化之經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白
本發明係關於可活化之經掩蔽之抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)結合蛋白(例如抗CTLA4抗體)及其相關使用方法。
癌症在美國為排名第二的主要死亡原因，其導致之死亡比後五種主要原因(慢性呼吸道疾病、中風、事故、阿茲海默症(Alzheimer's disease)及糖尿病)還要多。儘管已取得巨大進步(尤其藉由靶向療法)，但此領域中仍需進行大量工作。免疫療法及此領域之分支，免疫腫瘤學，正在產生用於治療惡性病之可行的及振奮人心的治療選擇方案。特定言之，現發現癌症之一個特點為逃避免疫且已進行大量工作以鑑別目標及研發針對此等目標之療法，從而使免疫系統再活化以識別及治療癌症。實情為，抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA4)抗體，伊派利單抗(ipilimumab)，實現罹患III/IV期惡性黑色素瘤之患者之長期存活。伊派利單抗為免疫檢查點拮抗劑，其藉由阻斷CTLA4來中斷T細胞之抑制，且可引起T調節細胞(Treg)之消耗。[Korman, A.等人, 2005. Tumor immunotherapy: preclinical and clinical activity of anti-CTLA4 antibodies. Current Opinion in Investigational Drugs 6:582-591；Quezada等人, J. Exp. Med., 206(8):1717-1725, 2009；Selby等人 Cancer Immunol Res., 1(1);32-42, 2013]。不幸的是，伊派利單抗引起T細胞依賴性免疫反應之全身性(非腫瘤特異性)活化，其引起免疫相關副作用，該等免疫相關副作用可危及生命且通常限制劑量及治療持續時間(Weber, J.S.等人, 2008. Phase I/II study of ipilimumab for patients with metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology 26:5950-5956)。此等副作用包括小腸結腸炎、皮炎、垂體炎、葡萄膜炎、肝炎、腎炎及死亡。小腸結腸炎為最常見的嚴重毒性(影響約20%的患者)。與免疫介導之不良反應相關的重大安全性風險促使FDA批准對伊派利單抗使用風險評估及緩和策略(Risk Evaluation and Mitigation Strategy；REMS)。最近，已證實與單獨的伊派利單抗相比，伊派利單抗與靶向PD1之第二免疫檢查點調節劑(例如尼沃單抗(nivolumab))之共同投藥可顯著提高黑素瘤之免疫療法之功效。然而，此增益與3/4級副作用之發生率增加相關聯，其影響超過50%的接受組合治療之患者(Wolchok, J.D.等人, 2013. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med)。
此等結果說明需要研發可有效靶向腫瘤而不具有與全身性免疫活化相關聯之副作用之抗CTLA4蛋白治療劑。本文中提供抗CTLA結合蛋白、其組合物及其用於解決此需要之使用方法。
本文中所引用之所有參考文獻(包括專利申請案、專利公開案及科學文獻)皆以全文引用之方式併入本文中，如同各個參考文獻係特定地及個別地指示以引用之方式併入一般。
本文中提供可活化之經掩蔽之抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)結合蛋白、包含其之組合物及其使用方法。
本文中提供經掩蔽之抗體，其含有結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段含有第一鏈及第二鏈，及包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列之掩蔽肽，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體或其抗原結合片段之第一鏈或第二鏈之胺基端或羧基端。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈；且第二鏈為重鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段含有兩個第一鏈及兩個第二鏈。在一些實施例中，第一鏈為或包含輕鏈可變域；且第二鏈為或包含重鏈可變域。在任何此類實施例中之一些中，抗原結合片段為dAb、Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段。在任何此類實施例中之一些中，掩蔽肽之胺基端或羧基端連接至包含可裂解肽之連接子。在任何此類實施例中之一些中，包含可裂解肽之連接子含有間隔連接子及可裂解肽。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽含有選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在任何此類實施例中之一些中，間隔連接子含有選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在任何此類實施例中之一些中，至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。
在任何此類實施例中之一些中，經掩蔽之抗體以N至C端或C至N端方向含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；及c)結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段。在任何此類實施例中之一些中，經掩蔽之抗體在掩蔽肽與可裂解肽之間含有間隔連接子；且經掩蔽之抗體在可裂解肽與結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段之間含有間隔連接子。
在任何此類實施例中之一些中，抗體為鼠類抗體。在任何此類實施例中之一些中，抗體為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。在任何此類實施例中之一些中，抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在任何此類實施例中之一些中，IgG1含有胺基酸取代S298A、E333A及K334A；S239D及I332E；S239D、A330L及I332E；P247I及A339D或A339Q；D280H、K290S (具有或不具有S298D或S298V)；F243L、R292P及Y300L；F243L、R292P、Y300L及P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L；G236A、S239D及I332E；K326A及E333A；K326W及E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A及/或K326E；其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。
在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段含有輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區含有(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402或408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403或409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404或410之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區含有(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405或411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406或412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407或413之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段含有包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列之重鏈可變區。
在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:444之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，抗體含有輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列；及/或重鏈，其包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或抗原結合片段含有輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之輕鏈可變區，及包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之重鏈可變區。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之輕鏈可變區，及包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之重鏈可變區。
在任何此類實施例中之一些中，抗體含有輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列；及/或重鏈，其包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體含有輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:327、334或342-365之胺基酸序列；及/或重鏈，其包含選自SEQ ID NO:366或380-397之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:366之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:478之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:380之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈。
在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。
在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。在任何此類實施例中之一些中，抗體或其抗原結合片段與藥劑結合。在任何此類實施例中之一些中，藥劑為微管蛋白聚合抑制劑、DNA損傷劑或DNA合成抑制劑。在任何此類實施例中之一些中，藥劑為類美登素(maytansinoid)、奧瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素(calicheamicin)、倍癌黴素(duocarmycin)、吲哚啉苯并二氮呯(indo-linobenzodiazepine)二聚體或依昔替康(exatecan)衍生物Dxd。
在任何此類實施例中之一些中，本文中提供之經掩蔽之抗體呈現約20至約10,000之最佳包藏率。在另一實施例中，最佳包藏率為約20至約1,000。在另一實施例中，最佳包藏率為約80至約100。
在任何此類實施例中之一些中，經掩蔽之抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。
本文中亦提供經掩蔽之雙特異性抗體，其含有特異性結合於CTLA4之第一對輕鏈及重鏈、特異性結合於抗原之第二對輕鏈及重鏈以及包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列之掩蔽肽，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至第一對輕鏈或重鏈之胺基端或羧基端。在一些實施例中，掩蔽肽之胺基端或羧基端連接至包含可裂解肽之連接子。在任何此類實施例中之一些中，包含可裂解肽之連接子含有間隔連接子及可裂解肽。
在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽含有選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端或C端。在任何此類實施例中之一些中，間隔連接子含有選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在任何此類實施例中之一些中，至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。
在任何此類實施例中之一些中，第一對輕鏈或重鏈以N至C端或C至N端方向含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；及c)輕鏈或重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對在掩蔽肽與可裂解肽之間含有間隔連接子；且第一對在可裂解肽與輕鏈或重鏈之間含有間隔連接子。
在任何此類實施例中之一些中，雙特異性抗體為鼠類抗體。在任何此類實施例中之一些中，雙特異性抗體為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。在任何此類實施例中之一些中，雙特異性抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在任何此類實施例中之一些中，IgG1含有胺基酸取代，諸如S298A、E333A及K334A；S239D及I332E；S239D、A330L及I332E；P247I及A339D或A339Q；D280H、K290S (具有或不具有S298D或S298V)；F243L、R292P及Y300L；F243L、R292P、Y300L及P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L；G236A、S239D及I332E；K326A及E333A；K326W及E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A及/或K326E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。
在任何此類實施例中之一些中，第一對含有輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區含有(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402或408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403或409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404或410之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區含有(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405或411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406或412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407或413之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。在一些實施例中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:444之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一對含有包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列之重鏈可變區。在任何此類實施例中之一些中，第一對含有包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對含有包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列之重鏈可變區。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含有包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之輕鏈可變區，及包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之重鏈可變區。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含有包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之輕鏈可變區，及包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之重鏈可變區。
在任何此類實施例中之一些中，第一對含有包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對含有包含選自SEQ ID NO:327、334或342-365之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:366或380-397之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:366之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:478之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:380之胺基酸序列之重鏈。在任何此類實施例中之一些中，第一對包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈。
在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。在任何此類實施例中之一些中，雙特異性抗體與藥劑結合。在任何此類實施例中之一些中，藥劑為微管蛋白聚合抑制劑、DNA損傷劑或DNA合成抑制劑。在任何此類實施例中之一些中，藥劑為類美登素、奧瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素、倍癌黴素、吲哚啉苯并二氮呯二聚體或依昔替康衍生物Dxd。
在任何此類實施例中之一些中，本文中提供之第一對及第二對經掩蔽之雙特異性抗體各自呈現最佳包藏率，其可彼此相同或不同。在一些實施例中，最佳包藏率為約20至約10,000。在另一實施例中，最佳包藏率為約20至約1,000。在另一實施例中，最佳包藏率為約80至約100。
本文中亦提供經掩蔽之嵌合受體，其含有配位體結合域，其包含結合於CTLA4之第一鏈及第二鏈；掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，即跨膜域；及包含信號傳導域之細胞內信號傳導域，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至配位體結合域之第一鏈或第二鏈之胺基端或羧基端。
在一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域；且第二鏈為重鏈可變域。在一些實施例中，掩蔽肽之胺基端或羧基端連接至包含可裂解肽之連接子。在任何此類實施例中之一些中，包含可裂解肽之連接子含有間隔連接子及可裂解肽。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽含有選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端或C端。在任何此類實施例中之一些中，間隔連接子含有選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在任何此類實施例中之一些中，至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在任何此類實施例中之一些中，配位體結合域之第一鏈或第二鏈以N至C端或C至N端方向含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；及c)第一鏈或第二鏈。在任何此類實施例中之一些中，配位體結合域在掩蔽肽與可裂解肽之間含有間隔連接子；及配位體結合域在可裂解肽與第一鏈或第二鏈之間含有間隔連接子。
在任何此類實施例中之一些中，配位體結合域含有第一鏈及第二鏈，其中第一鏈含有(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402或408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403或409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404或410之胺基酸序列；及/或其中第二鏈含有(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405或411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406或412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407或413之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。在一些實施例中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:444之胺基酸序列；及/或第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
在任何此類實施例中之一些中，第一鏈含有SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或第二鏈含有SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一鏈含有選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或第二鏈含有選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，及第二鏈包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，第一鏈包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，及第二鏈包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。
在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。在任何此類實施例中之一些中，可裂解肽由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。
在任何此類實施例中之一些中，本文中提供之經掩蔽之嵌合受體呈現約20至約10,000之最佳包藏率。在另一實施例中，最佳包藏率為約20至約1,000。在另一實施例中，最佳包藏率為約80至約100。
亦提供一種核酸，其編碼如前述實施例中任一項之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。亦提供一種載體，其包含如前述實施例之核酸。在一些實施例中，載體為表現載體。亦提供一種宿主細胞，其包含前述核酸實施例。
亦提供用於製備經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體之方法，其包含在產生經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體之條件下培養前述宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞具有α1,6-海藻糖基轉移酶(Fut8)基因剔除。在一些實施例中，其中宿主細胞過表現β1,4-N-乙醯基糖胺多糖基轉移酶III (GnT-III)。在一些實施例中，宿主細胞亦過表現高爾基體(Golgi)μ-甘露糖苷酶II (ManII)。任何此類實施例中之一些進一步包括回收由宿主細胞產生之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。在一些實施例中，藉由前述方法產生經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。
亦提供一種組合物，其含有如前述實施例中任一項之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。一些實施例涵蓋一種組合物，其包含如前述實施例之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。在一些實施例中，組合物為醫藥組合物。
亦提供一種套組，其含有如前述實施例中任一項之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體、經掩蔽之嵌合受體或組合物。
亦提供用於治療或預防個體中之贅瘤性疾病之方法，該方法其包含向個體投與有效量之如前述實施例中任一項之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體、經掩蔽之嵌合受體或組合物。在一個實施例中，贅瘤性疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、***癌、胰臟癌、黑素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌或睪丸癌。
應理解，可組合本文中所描述之各種實施例的一種、一些或所有特性以形成本發明之其他實施例。本發明之此等及其他態樣將對熟習此項技術者變得顯而易見。藉由以下詳細說明進一步描述本發明之此等及其他實施例。
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諸如檢查點抑制劑之治療劑在癌症中顯示前所未有的反應，但其用途受免疫相關不良事件(irAE)及其他毒性(例如垂體炎)限制。本文中提供蛋白質治療劑，其在目標位點處由蛋白酶活化之後特異性結合CTLA4，例如在腫瘤微環境中，以實現增加之持久反應率及顯著改良之安全性概況。本文中提供之蛋白質治療劑經工程改造以藉由利用癌症之一種標誌，即活性蛋白酶之高局部濃度來使藥理學活性精確靶向腫瘤微環境。使用腫瘤微環境之此特徵將全身性惰性分子轉型成局部活性藥物。腫瘤微環境中之藥物之活化可顯著降低可與以活性形式向個體投與之藥物相關聯之全身性毒性。I. 定義
在詳細描述本發明之前，應理解，本發明不限於特定組合物或生物系統，其可理所當然有所變化。亦應理解，本文中所用術語僅出於描述特定實施例之目的且不意欲為限制性。除非內容另有明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，對「抗體」之參考視情況包括兩個或更多個此類抗體之組合及其類似物。
如本文中所使用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之各別值的常見誤差範圍。本文中，對「約」一個值或參數之參考包括(及描述)針對該值或參數本身之實施例。
應理解，本文中所描述之本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由態樣及實施例組成」及「基本上由態樣及實施例組成」。
術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區之全長抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體及單鏈分子)以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2及Fv)。在本文中，術語「免疫球蛋白」(Ig)可與「抗體」互換使用。
基礎4鏈抗體單元係由兩條一致輕(L)鏈及兩條一致重(H)鏈構成的雜四聚醣蛋白。IgM抗體由5個基本雜四聚體單元及稱為J鏈之其他多肽組成且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包含2-5個基礎4鏈單元，其可聚合以與J鏈組合形成多價聚集物。在IgG之情況下，4鏈單元通常係約150,000道爾頓。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈視H鏈同型而藉由一或多個二硫鍵彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N端具有可變域(VH)，接著為各α及γ鏈之三個恆定域(CH)以及μ及ε同型之四個CH域。各L鏈在N端具有可變域(VL)，接著在其另一端為恆定域。VL與VH對準且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH與VL配對在一起以形成單一抗原結合位點。對於不同類別之抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology, 第8版, Daniel P. Sties, Abba I. Terr及Tristram G. Parsolw (編), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 第71頁及第6章。
來自任何脊椎動物物種之L鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種顯著不同類型(稱為κ及λ)中之一種。視免疫球蛋白之重鏈(CH)之恆定域之胺基酸序列而定，其可歸為不同類別或同型。存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其分別具有稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。基於CH序列及功能之相對較小差異，γ及α類別進一步分成子類，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。IgG1抗體可以多個稱為異型之多晶型變異體形式存在(綜述於Jefferis及Lefranc 2009. mAbs 第1卷, 第4期1-7中)，其中任一者皆適用於本發明。人類群體中之常見異型變異體為由字母a、f、n、z指定之變異體。
「經分離」之抗體為已自其產生環境之組分鑑別、分離及/或回收(例如以天然或重組方式)之抗體。在一些實施例中，經分離之多肽與來自其產生環境之所有其他組分無關聯。其製備環境之污染物組分(諸如由重組轉染細胞產生的污染物組分)為通常干擾抗體之研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，將多肽純化達到(1)大於抗體之95重量%，如藉由例如勞立法(Lowry method)所測定，且在一些實施例中，純化至大於99重量%；(1)足以藉由使用例如旋轉杯式測序儀獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)均質，此係使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或銀染料在非還原或還原條件下藉由SDS-PAGE實現。經分離之抗體包括原位存在於重組細胞內之抗體，因為抗體之天然環境中的至少一種組分將不存在。然而，通常，經分離之多肽或抗體係藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文中所使用，術語「單株抗體」係指一種自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即，組成該群體之個別抗體除可能天然存在之突變及/或可能少量存在之轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外其餘相同。在一些實施例中，單株抗體在重鏈及/或輕鏈處具有C端裂解。舉例而言，1、2、3、4或5個胺基酸殘基在重鏈及/或輕鏈之C端處裂解。在一些實施例中，C端裂解自重鏈移除C端離胺酸。在一些實施例中，單株抗體在重鏈及/或輕鏈處具有N端裂解。舉例而言，1、2、3、4或5個胺基酸殘基在重鏈及/或輕鏈之N端處裂解。在一些實施例中，可藉由重組技術製得單株抗體之截短形式。在一些實施例中，單株抗體針對單一抗原位點具有高度特異性。在一些實施例中，單株抗體針對多個抗原位點具有高度特異性(諸如雙特異性抗體或多特異性抗體)。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，該等技術包括例如融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現技術及用於在具有部分或所有的編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類抗體或人類樣抗體之技術。
術語「裸抗體」係指未細胞毒性部分或放射性標記結合之抗體。
術語「親本抗體」係指在修飾(諸如用掩蔽肽掩蔽抗體)之前的抗體。
術語「經掩蔽之抗體」係指滿足以下條件之抗體：經修飾以包含掩蔽肽且在一些實施例中，包含允許在較佳環境中活化或移除掩蔽肽之其他組分。
「抗體-藥物結合物」或「ADC」係指與一或多種異種分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)結合之抗體。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用以指代相較於抗體片段呈實質上完整形式之抗體。特定言之，完全抗體包括具有包括Fc區之重鏈及輕鏈之抗體。恆定域可為原生序列恆定域(例如人類原生序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗原結合抗體片段之實例包括結構域抗體(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線抗體(參見美國專利案第5,641,870號，實例2；Zapata等人, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；單鏈抗體分子，及由抗體片段形成之多特異性抗體。單重鏈抗體或單輕鏈抗體可經工程改造或在重鏈之情況下，可自經工程改造以產生單重鏈分子之駱駝、鯊魚、文庫或小鼠分離。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個一致的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，及殘餘「Fc」片段，該名稱反映易於結晶之能力。Fab片段由完整L鏈以及H鏈(VH)之可變區結構域及一個重鏈之第一恆定域(CH1)組成。各Fab片段就抗原結合而言係單價的，亦即，其具有單一抗原結合位點。抗體之胃蛋白酶處理產生單一大型F(ab')2片段，其大致對應於兩個二硫鍵連接之具有不同抗原結合活性且仍能夠與抗原交聯之Fab片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，Fab'片段在CH1域之羧基端具有若干個其他殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH係其中恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'在本文中的名稱。F(ab')2抗體片段最初係以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對之形式產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
Fc片段包含藉由二硫鍵結合在一起的兩個H鏈之羧基端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列及聚糖決定，該區亦由在某些類型之細胞上發現之Fc受體(FcR)識別。
「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由緊密非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變區結構域之二聚體組成。由此等兩個結構域之摺疊產生六個高變環(各來自H鏈及L鏈之3個環)，其提供用於抗原結合之胺基酸殘基且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單個可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性之HVR之Fv之一半)仍具有識別及結合抗原之能力，但親和力低於完整結合位點。
「單鏈Fv」亦簡稱為「sFv」或「scFv」，其為包含連接至單一多肽鏈中之VH及VL抗體結構域之抗體片段。在一些實施例中，sFv多肽進一步包含介於VH與VL域之間的多肽連接子，其使得sFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。關於sFv之評述，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)。
本發明之抗體之「功能片段」包含完整抗體之一部分，該等片段通常包括完整抗體之抗原結合區或可變區或保留有或具有經修飾之FcR結合能力的抗體之Fv區。抗體片段之實例包括線抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。
在本文中，單株抗體特定包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈及/或輕鏈與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體中之對應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一種抗體類別或子類別之抗體中之對應序列一致或同源，以及此類抗體之片段，只要其呈現所需生物活性即可(美國專利案第4,816,567號；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本文中之相關嵌合抗體包括PRIMATIZED®抗體，其中抗體之抗原結合區來源於藉由例如用相關抗原使獼猴免疫而產生之抗體。如本文中所使用，「人類化抗體」係作為「嵌合抗體」之子集使用。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。在一個實施例中，人類化抗體為其中來自受體之HVR之殘基由來自非人類物種(供體抗體)之HVR之殘基置換之人類免疫球蛋白(受體抗體)，該等非人類物種諸如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和力及/或能力之非人類靈長類動物。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現之殘基。可進行此等修飾以進一步優化抗體效能，諸如結合親和力。通常，人類化抗體將包含實質上至少一個且典型地，兩個可變域之全部，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白序列之高變環，且所有或實質上所有FR區域為人類免疫球蛋白序列之FR區域，但FR區域可包括一或多種改良抗體效能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)之個別FR殘基取代。在一些實施例中，FR中之此等胺基酸取代之數目在H鏈中不超過6個，且在L鏈中不超過3個。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地，人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他細節，參見例如Jones等人, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323-329 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；以及美國專利案第6,982,321號及第7,087,409號。在一些實施例中，人類化抗體係針對單一抗原位點。在一些實施例中，人類化抗體係針對多個抗原位點。替代性人類化方法描述於美國專利案第7,981,843號及美國專利申請公開案第2006/0134098號中。
抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體之重鏈或輕鏈之胺基端結構域。因此，如本文中所使用之術語「可變區」及「可變域」可互換使用。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH」及「VL」。此等結構域通常係抗體之可變度最高的部分(相對於同一類別之其他抗體而言)且含有抗原結合位點。重鏈及輕鏈之可變域可使用任何可用的方法或編號流程測定且可包括如例如WO 2018/207701中所描述之可變域，其內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，重鏈及/或輕鏈之可變域可不具有可變域之羧基端(亦即，第四構架結構域之羧基端)上之一或多個胺基酸殘基，該一或多個胺基酸殘基可以其他方式包括於基於某些編號流程之可變域之描述中。在一些實施例中，重鏈及/或輕鏈之可變域可包括可變域之羧基端(亦即，第四構架結構域之羧基端)上之一或多個胺基酸殘基，該一或多個胺基酸殘基可以其他方式包括於基於某些編號流程之可變域之描述中。
當在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域中序列具有高變性及/或形成結構上界定之環的區域。通常，抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。在原生抗體中，H3及L3顯示六個HVR之大部分多樣性，且咸信尤其H3在賦予抗體精細特異性方面起到獨特作用。參見例如Xu等人 Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及Wu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003))。實情為，由重鏈組成之天然存在之駱駝抗體僅在不存在輕鏈之情況下具有功能性且為穩定的。參見例如Hamers-Casterman等人, Nature 363:446-448 (1993)及Sheriff等人, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。
已使用多種HVR描述且涵蓋於本文中。作為Kabat互補決定區(CDR)之HVR係基於序列可變性且為最常用的(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。Chothia改為提及結構環之位置(Chothia及Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。「Contact」HVR係基於可用複合晶體結構之分析。來自此等HVR中之每一者之殘基標註如下。環 Kabat           Chothia         Contact L1          L24-L34       L26-L34        L30-L36 L2          L50-L56       L50-L56        L46-L55 L3          L89-L97       L91-L96        L89-L96 H1         H31-H35B   H26-H32      H30-H35B  (Kabat編號) H1         H31-H35      H26-H32      H30-H35    (Chothia編號) H2         H50-H65      H53-H56      H47-H58 H3         H95-H102     H95-H102     H93-H101
除非另有指示，否則可變域殘基(HVR殘基及構架區殘基)係根據Kabat等人，見上文編號。
「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之HVR殘基以外的可變域殘基。
表述「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人，見上文中用於抗體之編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線形胺基酸序列可含有較少或其他胺基酸，其對應於可變域之FR或HVR之縮短或其中之***。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單個胺基酸***物(殘基52a，根據Kabat)，及重鏈FR殘基82之後的***殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。
對於本文中之目的，「受體人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之VL或VH構架的胺基酸序列之構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有預先存在之胺基酸序列變化。在一些實施例中，預先存在之胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少或2個或更少。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且視需要引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。用於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較之序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。舉例而言，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，其可表述為相對於、與或針對既定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%之既定胺基酸序列A)計算如下： 100乘以分數X/Y 其中X為在A與B之比對程式中藉由序列評估為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。
「結合於」、「特異性結合於」特定多肽或特定多肽上之抗原決定基或「對特定多肽或特定多肽上之抗原決定基具有特異性」之抗體為結合於特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而實質上不結合於任何其他多肽或多肽抗原決定基之抗體。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)與不相關、非CTLA4多肽之結合小於抗體與CTLA4之結合之約10%，如藉由此項技術中已知之方法(例如酶聯結免疫吸附分析法(ELISA))所量測。在一些實施例中，結合於CTLA4 (例如鼠類CTLA4及/或人類CTLA4)之結合蛋白(例如抗體)之平衡解離常數(KD )≤1μM、≤100 nM、≤10 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.7 nM、≤0.6 nM、≤0.5 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或0.001 nM (例如10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。
如本文所提供之術語「CTLA4」或「CTLA4蛋白質」包括細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)之重組或天然存在之形式中之任一者或其保持CTLA4蛋白質活性(例如在與CTLA4相比至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%活性以內)之變異體或同系物。在一些態樣中，與天然存在之CTLA4多肽相比，變異體或同系物跨越整個序列或一部分序列(例如50、100、150或200個連續胺基酸部分)具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，CTLA4為由NCBI序列參考GI：83700231鑑別之蛋白質、其同系物或功能片段。在一些實施例中，CTLA4為人類CTLA4。在一些實施例中，CTLA4為鼠類CTLA4。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(例如原生序列Fc區或胺基酸序列變異型Fc區)之生物活性且隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指某種形式之細胞毒性，其中所分泌的Ig結合於存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)，使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合於攜帶抗原之目標細胞且隨後用細胞毒素殺傷目標細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且需要藉由此機制殺傷目標細胞。用於介導ADCC之原生細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之Fc表現概述於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)之第464頁之表3中。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)在不具有海藻糖基化Fc聚糖之能力以具有增強之ADCC的細胞中經工程改造或表現。為了評估相關分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析法，諸如美國專利案第5,500,362號或美國專利案第5,821,337號中所描述。適用於此類分析法之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可活體內評估相關分子之ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人, PNAS USA 95:652-656 (1998)中揭示之動物模型。其他改變ADCC活性及其他抗體特性之Fc變異體包括由以下揭示之變異體：Ghetie等人, Nat Biotech. 15:637-40, 1997；Duncan等人, Nature 332:563-564, 1988；Lund等人, J. Immunol 147:2657-2662, 1991；Lund等人, Mol Immunol 29:53-59, 1992；Alegre等人, Transplantation 57:1537-1543, 1994；Hutchins等人, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995；Jefferis等人, Immunol Lett. 44:111-117, 1995；Lund等人, FASEB J9:115-119, 1995；Jefferis等人, Immunol Lett 54:101-104, 1996；Lund等人, J Immunol 157:4963-4969, 1996；Armour等人, Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999；Idusogie等人, J Immunol 164:4178-4184, 200；Reddy等人, J Immunol 164:1925-1933, 2000；Xu等人, Cell Immunol 200:16-26, 2000；Idusogie等人, J Immunol 166:2571-2575, 2001；Shields等人, J Biol Chem 276:6591-6604, 2001；Jefferis等人, Immunol Lett 82:57-65. 2002；Presta等人, Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Lazar等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006；美國專利案第5,624,821號；第5,885,573號；第5,677,425號；第6,165,745號；第6,277,375號；第5,869,046號；第6,121,022號；第5,624,821號；第5,648,260號；第6,194,551號；第6,737,056號；第6,821,505號；第6,277,375號；第7,335,742號；及第7,317,091號。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括原生序列Fc區及變異型Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。適用於本發明之抗體之原生序列Fc區包括人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
如本文中所使用，「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之強度。在一些實施例中，結合蛋白(例如抗體)對CTLA4之親和力通常可由平衡解離常數(KD )表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文中所描述之方法)來量測親和力。
如本文中所使用，「結合親合力」係指分子(例如抗體)之多個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之結合強度。
在本文中，編碼抗體之「經分離」之核酸分子為經鑑別且與至少一種污染性核酸分子分離之核酸分子，在其產生環境中，該至少一種污染性核酸分子通常與其相關聯。在一些實施例中，經分離之核酸不與所有與產生環境相關聯之組分相關聯。在本文中，編碼多肽及抗體之經分離之核酸分子呈與其在自然界中所發現的形式或環境不同之形式。因此，經分離之核酸分子與本文中天然存在於細胞中之編碼多肽及抗體之核酸不同。
術語「醫藥調配物」係指呈允許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受的毒性之其他組分之製劑。此類調配物為無菌的。
如本文中所使用，「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒性。通常，生理學上可接受之載劑為水性pH值緩衝溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。
如本文中所使用，術語「治療」係指經設計以改變所治療之個體或細胞在臨床病理學之病程期間的天然病程的臨床介入。所需治療作用包括降低疾病發展速率、改善或減輕疾病病況及緩解或改良預後。舉例而言，若與病症(例如贅瘤性疾病)相關之一或多種症狀緩解或消除，則成功「治療」個體。舉例而言，若治療引起提高罹患疾病之個體之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥物之劑量、降低疾病之復發率、減輕疾病之嚴重程度、延緩疾病之發展或進程及/或延長個體之存活期，則成功「治療」個體。
如本文中所使用，「與……結合」或「與……組合」係指除一種治療形式以外亦投與另一種治療形式。因此「與……結合」或「與……組合」係指在向個體投與一種治療形式之前、期間或之後投與另一種治療形式。
如本文中所使用，術語「預防」包括提供關於個體中疾病之發生或復發之防治。個體可能易患病症、對病症敏感或具有產生病症之風險，但尚未診斷患有病症。在一些實施例中，使用本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體)延緩病症之發展。
如本文中所使用，「具有產生病症之風險」的個體可具有或不具有可偵測之疾病或疾病症狀，且在本文中所描述之治療方法之前可能已經顯示或尚未顯示可偵測之疾病或疾病症狀。「具有風險」表示個體具有一或多種風險因素，其為與疾病之發展相關的可量測之參數，如此項技術中已知。具有此等風險因素中之一或多者的個體比不具有此等風險因素中之一或多者的個體具有更高的產生病症之機率。
「有效量」係指在所需劑量及時間段下，至少有效達成所需或所指示之作用(包括治療或預防結果)之量。可在一或多次投藥中提供有效量。「治療有效量」至少為實現特定病症之可量測的改良所需之最小濃度。在本文中，治療有效量可根據諸如以下之因素而變化：患者之疾病狀態、年齡、性別及體重，及抗體引起個體中之所需反應的能力。治療有效量亦可為其中抗體之治療有利作用超過任何毒性或有害作用之量。「預防有效量」係指以必要的劑量及時間段有效達成所需預防結果之量。通常但未必，由於個體在患病之前或在疾病早期階段使用預防劑量，所以預防有效量可小於治療有效量。
「慢性」投藥係指與急性模式相反，以持續模式投與藥劑，以便長時間保持初始治療作用(活性)。「間歇性」投藥為不在無間斷情況下連續進行，而實際上循環進行之治療。
如本文中所使用，「個體」為哺乳動物。出於治療之目的，「哺乳動物」包括人類、家養及農場動物以及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓等。在一些實施例中，個體為人類。II. 可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 結合蛋白
在一個態樣中，提供可活化的經掩蔽之細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)結合蛋白，其包含(i)CTLA4結合域；(ii)CTLA4結合域掩蔽肽(在本文中亦稱為「掩蔽肽」)；及(iii)連接子，其包含使掩蔽肽連接至CTLA4結合域之可裂解肽。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之CTLA4結合蛋白為經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之CTLA4結合蛋白為結合於CTLA4之經掩蔽之雙特異性抗體。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之CTLA4結合蛋白為結合於CTLA4之經掩蔽之嵌合受體。
本文中提供之可活化的經掩蔽之CTLA4結合蛋白可結合於來自各種物種之CTLA4，舉例而言，一些結合於人類CTLA4及/或鼠類CTLA4或食蟹獼猴CTLA4。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白具有以下特徵中之一或多者：(1)結合CTLA4 (例如人類CTLA4)；(2)在使掩蔽肽連接至結合蛋白之肽連接子之蛋白酶裂解(例如活化)之後，以更高的親和力結合CTLA4；及(3)在腫瘤位點處活體內結合CTLA4。
在一個態樣中，本文中提供尤其適用於治療其中CTLA4起作用之贅瘤性疾病之可活化的經掩蔽之CTLA4結合蛋白。如本文中所提供之可活化的經掩蔽之CTLA4結合蛋白包括結合域，其能夠與表現於細胞(例如癌細胞或T細胞)表面上之CTLA4蛋白質相互作用(例如結合)。在一些實施例中，結合域經由包含可裂解肽之連接子連接至掩蔽肽，使得掩蔽肽阻止CTLA4結合域結合於CTLA4蛋白質。在可裂解肽裂解之後，掩蔽肽被釋放，藉此允許結合域與CTLA4蛋白質相互作用。
在一些實施例中，本文中亦提供經掩蔽之CTLA4結合蛋白(例如經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)，其包含(a)CTLA4結合蛋白(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含第一鏈及第二鏈)；及(b)掩蔽肽。在一些實施例中，CTLA4結合蛋白為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含第一鏈及第二鏈，且掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體或其抗原結合片段之第一鏈或第二鏈之胺基端或羧基端。在一些實施例中，第一鏈為或包含重鏈，且第二鏈為或包含輕鏈；或第一鏈為或包含輕鏈，且第二鏈為或包含重鏈。在一些實施例中，第一鏈為或包含重鏈可變區，且第二鏈為或包含輕鏈可變區；或第一鏈為或包含輕鏈可變區，且第二鏈為或包含重鏈可變區。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以胺基端至羧基端方向包含：間隔連接子、可裂解肽及間隔連接子。在一些實施例中，掩蔽肽之C端連接至包含可裂解肽之連接子之N端，且包含可裂解肽之連接子之C端連接至第一鏈(例如輕鏈或輕鏈可變區)之N端。 CTLA4結合蛋白
如本文所提供，術語「CTLA4結合蛋白」係指包含CTLA4結合域之多肽，其能夠結合於CTLA4蛋白質或以其他方式對其呈現親和力。在一些實施例中，CTLA4結合蛋白為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體、抗原結合片段、單鏈抗體等。在一些實施例中，CTLA4結合蛋白為結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。因此，在一些實施例中，CTLA4結合蛋白為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，CTLA4結合蛋白為結合CTLA4之嵌合抗原受體之組分。
術語「CTLA4結合域」係指以重組方式表現之多肽結構域，其能夠結合於在細胞中或上發現之CTLA4蛋白質或以其他方式對其呈現親和力。用於測定CTLA4結合域與CTLA4之結合程度之方法為此項技術中熟知的。
在一些實施例中，抗體為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。在一些實施例中，本文中所描述之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段為單株抗體。在一些實施例中，本文中所描述之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段為抗體片段(包括抗原結合片段)，例如dAb、Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為二聚體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為均二聚體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為雜二聚體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為包含第一鏈及第二鏈之雜二聚體，諸如包含重鏈及輕鏈之雜二聚體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含第一鏈及第二鏈。在一些實施例中，第一鏈為或包含重鏈，且第二鏈為或包含輕鏈；或第一鏈為或包含輕鏈，且第二鏈為或包含重鏈。在一些實施例中，第一鏈為或包含重鏈可變區，且第二鏈為或包含輕鏈可變區；或第一鏈為或包含輕鏈可變區，且第二鏈為或包含重鏈可變區。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含第一鏈及第二鏈(例如輕鏈及重鏈)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含兩個第一鏈及兩個第二鏈(例如兩個輕鏈及兩個重鏈)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402或408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403或409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404或410之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405或411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406或412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407或413之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或其中重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含有包含於VL域內之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且包含有包含於VH域內之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含有包含於VL域內之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且包含有包含於VH域內之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或重鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列；及/或包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列；及包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈，其包含與SEQ ID NO:334之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或包含重鏈，其包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈，其包含與SEQ ID NO:334之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含重鏈，其包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列；及/或包含重鏈，其包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列；及包含重鏈，其包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列；及/或重鏈，其包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列；及/或重鏈，其包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:327、334或342-365之胺基酸序列；及/或重鏈，其包含選自SEQ ID NO:366或380-397之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段具有IgG1同型，其包含增強如本文中所描述之效應功能之胺基酸取代。
在一些實施例中，CTLA4結合域包含雙特異性抗體之抗原結合臂之輕鏈及重鏈。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402或408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403或409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404或410之胺基酸序列；及/或其中重鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405或411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406或412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407或413之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及重鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及重鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及重鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及重鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含有包含於VL域內之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，及重鏈包含有包含於VH域內之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含有包含於VL域內之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，及重鏈包含有包含於VH域內之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或重鏈包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或重鏈包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或重鏈包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。
在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或重鏈包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或重鏈包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列；及/或重鏈包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列。
在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含與選自由SEQ ID NO:327-341組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或重鏈包含與選自由SEQ ID NO:366-380、421及478組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列；及/或重鏈包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含選自SEQ ID NO:327、334或342-365之胺基酸序列；及/或重鏈包含選自SEQ ID NO:366、380-397、421及478之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO:334之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或重鏈包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列，及重鏈包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。在雙特異性抗體之一些實施例中，CTLA4為人類CTLA4。在雙特異性抗體之一些實施例中，CTLA4為鼠類CTLA4。在一些實施例中，雙特異性抗體為鼠類抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些實施例中，雙特異性抗體具有IgG1同型，其包含增強如本文中所描述之效應功能之胺基酸取代。
在一些實施例中，CTLA4結合域包含結合於CTLA4之第一鏈及第二鏈，諸如作為用於嵌合受體之配位體結合域之一部分。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域。在一些實施例中，第二鏈為重鏈可變域。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402或408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403或409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404或410之胺基酸序列；及/或其中第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405或411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406或412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407或413之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及第二鏈，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含有包含於VL域內之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，及第二鏈包含有包含於VH域內之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含有包含於VL域內之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，及第二鏈包含有包含於VH域內之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或第二鏈包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含與SEQ ID NO:321之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或第二鏈包含與SEQ ID NO:323之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含與SEQ ID NO:322之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或第二鏈包含與SEQ ID NO:324之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或第二鏈包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或第二鏈包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。在嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，及第二鏈包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 掩蔽肽
如本文所提供之CTLA4結合域掩蔽肽(亦稱為「掩蔽肽」)係指能夠結合於CTLA4結合域或以其他方式對其呈現親和力之肽。當結合於CTLA4結合域時，掩蔽肽阻斷、禁止、抑制(例如降低)或以其他方式阻止(例如掩蔽)CTLA4結合域對其同源受體或蛋白質(亦即，CTLA4)之活性或結合。用於測定CTLA4結合域與CTLA4蛋白質之結合程度之方法為此項技術中熟知的。
在實施例中，掩蔽肽之長度為至少4個胺基酸。在一些實施例中，掩蔽肽為線形肽。在一些實施例中，線形肽為4聚體至24聚體。在實施例中，掩蔽肽為環狀肽。在實施例中，環狀肽為3聚體至12聚體，如由2個半胱胺酸之間的胺基酸之數目定義。在實施例中，環狀肽為3聚體至20聚體。當掩蔽肽為環化肽時，環化肽係由連接兩個半胱胺酸胺基酸殘基之雙硫鍵形成。在一些實施例中，半胱胺酸胺基酸殘基為末端半胱胺酸(亦即，位於或靠近掩蔽肽之N端及/或C端)。在實施例中，雙硫鍵連接N端半胱胺酸與C端半胱胺酸。
在一些實施例中，掩蔽肽連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈或重鏈之N端。在一些實施例中，掩蔽肽連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區或重鏈可變區之N端。在一些實施例中，掩蔽肽連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈或重鏈之C端。在一些實施例中，掩蔽肽連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區或重鏈可變區之C端。
在一些實施例中，掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈或重鏈之N端。在一些實施例中，掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈之N端。在一些實施例中，掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區或重鏈可變區之N端。在一些實施例中，掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區之N端。在一些實施例中，掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈或重鏈之C端。在一些實施例中，掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區或重鏈可變區之C端。
在一些實施例中，掩蔽肽包含與選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。因此，在實施例中，掩蔽肽包含與以下胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列：CNLIVEGHC (SEQ ID NO:1)、MQTRCKEYPRWCEHWL (SEQ ID NO:2)、CKHAPYALC (SEQ ID NO:3)、CPFPAKILC (SEQ ID NO:4)、CPGKGLPSC (SEQ ID NO:5)、NWLGEWLPPGKV (SEQ ID NO:6)、QFIECPNFPRQCPGKN (SEQ ID NO:7)、VRQQCSLNPGRCPYLV (SEQ ID NO:8)、VWQECHTAPQLCPGKI (SEQ ID NO:9)、DSYTCRGPTWMCAGNM (SEQ ID NO:10)、FNHDCSGHWMRCLDQQ (SEQ ID NO:11)、NKSPCRPKMVACYGIL (SEQ ID NO:12)、PTPQCWNQYYECWIPS (SEQ ID NO:13)、SQKCPWTKETCMHYM (SEQ ID NO:14)、WHLSMYPKPPAE (SEQ ID NO:15)、WHTDGFYTRLPA (SEQ ID NO:16)、CIHAPYAKC (SEQ ID NO:17)、CPAKIGQEC (SEQ ID NO:18)、CPFPALELC (SEQ ID NO:19)、CTKPAKALC (SEQ ID NO:20)、DTATCYTTTGWCEGMV (SEQ ID NO:21)、NSDNCGPAKSTCMYND (SEQ ID NO:22)、PPGKCTQPHRCPPLN (SEQ ID NO:23)、DDPVCWDSNPTCQTIA (SEQ ID NO:24)、ISDQCSVLFLSCNTRV (SEQ ID NO:25)、ACHFPHPEGC (SEQ ID NO:26)、CLPPFPTKC (SEQ ID NO:27)、CPDHVFPKC (SEQ ID NO:28)、CWLPKPDMC (SEQ ID NO:29)、CWSWPSKAC (SEQ ID NO:30)、CYPFGKYEC (SEQ ID NO:31)、ALTPAKWLPADD (SEQ ID NO:32)、DDKECDWMHFACTGPQ (SEQ ID NO:33)、DEMKCAWSLEMCVRTS (SEQ ID NO:34)、DPILCPNTRMSCDNQT (SEQ ID NO:35)、GNALYDSPGTML (SEQ ID NO:36)、KNYECREVMPPCEPNT (SEQ ID NO:37)、NSYTSPYWLPDS (SEQ ID NO:38)、SLTPPYWIPREW (SEQ ID NO:39)、SPLTPHDRPSFL (SEQ ID NO:40)、TADVFSSSRYTR (SEQ ID NO:41)、TDLQCPPSSPICQIEH (SEQ ID NO:42)、TKCHCDGNCVMCYQMQ (SEQ ID NO:43)、TLAYETPLLWLP (SEQ ID NO:44)、TNWHCNNDGSSCNVRA (SEQ ID NO:45)或CNLIVQGHC (SEQ ID NO:46)。
在一些實施例中，掩蔽肽包含與選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列具有約90%同源性之胺基酸序列。舉例而言，掩蔽肽包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有約90%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，掩蔽肽包含與選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列具有約80%同源性之胺基酸序列。舉例而言，掩蔽肽包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有約80%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，掩蔽肽包含與選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列具有約70%同源性之胺基酸序列。舉例而言，掩蔽肽包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有約70%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，掩蔽肽胺基酸序列為選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列。舉例而言，掩蔽肽胺基酸序列為SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
在一些實施例中，掩蔽肽包含與SEQ ID NO:5之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，掩蔽肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。
在一些實施例中，掩蔽肽包含與SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，掩蔽肽包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列。
在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過30個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過40個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端，該掩蔽肽包含與選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過50個胺基酸直接連接至選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過50個胺基酸直接連接至選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之掩蔽肽之N端，其中該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過50個胺基酸直接連接至選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之掩蔽肽之N端，其中該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)。 連接子
在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含連接子，例如間隔連接子。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含超過一個連接子，例如第一間隔連接子及第二間隔連接子。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含有包含可裂解肽之連接子。如本文中所使用，「包含可裂解肽之連接子」係指可以酶促方式裂解之連接子，其共價鍵結至CTLA4結合域且共價鍵結至掩蔽肽。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子係以重組方式表現。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子為使用例如結合化學反應使連接至連接子之功能性(反應性)基團與掩蔽肽反應而形成之連接子。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子為使用例如結合化學反應藉由使連接至連接子之功能性(反應性)基團與CTLA4結合域反應而形成之連接子。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子使掩蔽肽連接至CTLA4結合域之N端(例如輕鏈之N端)。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子使掩蔽肽連接至CTLA4結合域之C端(例如輕鏈之C端)。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子與掩蔽肽稠合，諸如當核酸編碼連接子及掩蔽肽且由細胞以編碼連接子及掩蔽肽之胺基酸序列形式表現時。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子與CTLA4結合域稠合，諸如當核酸編碼連接子及CTLA4結合域且由細胞以編碼連接子及CTLA4結合域之胺基酸序列形式表現時。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子使掩蔽肽連接至CTLA4結合域之N端(例如輕鏈之N端)。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子使掩蔽肽連接至CTLA4結合域之C端(例如輕鏈之C端)。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子為可撓性連接子，其包括一或多個甘胺酸殘基、絲胺酸殘基、丙胺酸殘基、組胺酸殘基及/或脯胺酸殘基。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子含有直接連接至可裂解肽之N端及/或C端之間隔連接子。在一些實施例中，間隔連接子包含一或多個甘胺酸殘基、絲胺酸殘基、丙胺酸殘基、組胺酸殘基及/或脯胺酸殘基。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子包含間隔連接子及可裂解肽。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子。因此，在一些實施例中，經掩蔽之CTLA4結合蛋白(例如經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)包含有包含可裂解肽之連接子，其包含連接至可裂解肽之N端之間隔連接子(例如第一間隔連接子，或間隔連接子1)，及連接至可裂解肽之C端之間隔連接子(例如第二間隔連接子，或間隔連接子2)，其中各間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子之C端連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈或輕鏈可變域，且包含可裂解肽之連接子之N端連接至掩蔽肽。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子之C端連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之重鏈或重鏈可變域，且包含可裂解肽之連接子之N端連接至掩蔽肽。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子之N端連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之輕鏈或輕鏈可變域，且包含可裂解肽之連接子之C端連接至掩蔽肽。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子之N端連接至抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之重鏈或重鏈可變域，且包含可裂解肽之連接子之C端連接至掩蔽肽。
在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端且包含選自SEQ ID NO:89-100之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之C端且包含選自SEQ ID NO:101-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之掩蔽肽直接連接至間隔連接子之N端。因此，在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子(例如包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列的胺基酸序列之間隔連接子)，2)可裂解肽，諸如本文中所描述之可裂解肽(例如包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列的胺基酸序列之可裂解肽)，及3)間隔連接子(例如包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列的胺基酸序列之間隔連接子)。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:420之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:415之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:416之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:417之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:418之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:417之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:418之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:419之胺基酸序列；2)可裂解肽，其包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列；及3)間隔連接子，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子包含與選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子包含SEQ ID NO:454之胺基酸序列。在一些實施例中，包含可裂解肽之連接子包含SEQ ID NO:455之胺基酸序列。
連接子可藉由此項技術中熟知之各種方法與掩蔽肽及/或CTLA4結合蛋白結合。術語「結合」及「結合化學反應」係指在相對溫和條件下進行的與已知反應性基團之反應。此等反應包括(但不限於)親核取代(例如胺及醇與醯基鹵化物、活性酯之反應)、親電子取代(例如烯胺反應)及與碳-碳及碳-雜原子多重鍵之加成(例如邁克爾反應(Michael reaction)、狄爾斯-阿德爾加成(Diels-Alder addition))。此等及其他適用的反應論述於例如March, Advanced Organic Chemistry, 第3版, John Wiley & Sons, New York, 1985；Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996；及Feeney等人, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, 第198卷, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982中。
適用於本文中之結合化學反應之反應性官能基包括例如：(a)羧基及其各種衍生物，包括(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺酯、N-羥基苯并***酯、酸鹵化物、醯基咪唑、硫酯、對硝基苯基酯、烷基酯、烯基酯、炔基酯及芳族酯；(b)可轉化成酯、醚、醛等之羥基；(c)鹵烷基，其中鹵離子可隨後由親核性基團(諸如胺、羧酸根陰離子、硫醇陰離子、碳陰離子或醇鹽離子)置換，藉此引起鹵素原子之位點處新的基團之共價連接；(d)親二烯基團，其能夠參與狄爾斯-阿德爾反應，諸如順丁烯二醯亞胺基；(e)醛或酮基團，使得有可能經由形成羰基衍生物(諸如亞胺、腙、半卡腙或肟)或經由諸如格林納加成(Grignard addition)或烷基鋰加成之機制進行後續衍生作用；(f)用於與胺之後續反應之磺醯基鹵化物基團，例如以形成磺醯胺；(g)硫醇基，其可轉化成二硫化物、與醯基鹵化物反應或鍵結於金屬，諸如金；(h)胺或硫氫基，其可例如醯基化、烷基化或氧化；(i)烯烴，其可經歷例如環加成、醯化、邁克爾加成等；(j)環氧化物，其可與例如胺及羥基化合物反應；(k)胺基磷酸酯及其他適用於核酸合成之標準官能基；(i)金屬氧化矽鍵結；及(l)金屬，其鍵結至反應性磷基團(例如膦)以形成例如磷酸二酯鍵。
可選擇反應性官能基使得其不參與或干擾本文中所描述之組合物之化學穩定性。或者，可藉由存在保護基來保護反應性官能基避免參與交聯反應。
在一些實施例中，可藉由此項技術中熟知之各種方法來工程改造連接子以與掩蔽肽及/或CTLA4結合蛋白稠合。舉例而言，當由宿主細胞以重組方式表現時，核酸可經工程改造以用掩蔽肽及/或CTLA4結合蛋白來編碼連接子，以產生融合蛋白質。 可裂解肽
在一些實施例中，本文中提供之經掩蔽之CTLA4結合蛋白(例如經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)包含可裂解肽。在一些實施例中，可裂解肽包含於包含可裂解肽之連接子內。本文中提供之包含可裂解肽之連接子可包括可裂解肽內之蛋白酶裂解位點。如本文中所使用，「裂解位點」係指在本文中所描述之CTLA4結合蛋白中發現的用於連接子(例如，如上文所描述之包含可裂解肽之連接子)之一部分之裂解之可識別位點。因此，可在如本文中所描述之可裂解肽之序列(包括其實施例)中發現裂解位點。在一些實施例中，裂解位點為由裂解劑識別及裂解之胺基酸序列。例示性裂解劑包括蛋白質、酶、DNA酶、RNA酶、金屬、酸及鹼基。可裂解肽可為任何包括蛋白酶裂解位點之肽。例示性可裂解肽展示於表1中。表 1. 代表性可裂解肽
例示性可裂解肽
MPYDLYHP (SEQ ID NO:47) RAAAVKSP (SEQ ID NO:72) IYDQKT (SEQ ID NO:481)
GGIGQLTA (SEQ ID NO:48) DLLAVVAAS (SEQ ID NO:73) AHNYKT (SEQ ID NO:482)
DLGRFQTF (SEQ ID NO:49) VQTVTWPD (SEQ ID NO:74) MMDQAN (SEQ ID NO:483)
DSGGFMLT (SEQ ID NO:50) AIPMSIPP (SEQ ID NO:75) MLGEFVSE (SEQ ID NO:484)
TSVLMAAP (SEQ ID NO:51) GYEVHHQK (SEQ ID NO:76) GLVALRGA (SEQ ID NO:485)
TSEFVFAPDQ (SEQ ID NO:52) VHHQKLVF (SEQ ID NO:77) KEHKYKAE (SEQ ID NO:486)
KLVLPVLP (SEQ ID NO:53) IRRVSYSF (SEQ ID NO:78) LAQAVRSS (SEQ ID NO:487)
KPILFFRL (SEQ ID NO:54) MPYDLYHPILFFRL (SEQ ID NO:79) LGGSGRSNAQVRLE (SEQ ID NO:488)
ANQLKG (SEQ ID NO:55) GGIGQLTSVLMAAP (SEQ ID NO:80) LGGSGRKASLSLE (SEQ ID NO:489)
QSQLKE (SEQ ID NO:56) DSGGFMLTLVLPVLP (SEQ ID NO:81) SGRIGFLRTA (SEQ ID NO:490)
HEQLTV (SEQ ID NO:57) TSEFVFAPDLGRFQTF (SEQ ID NO:82) SGAIGFLRTA (SEQ ID NO:491)
PANLVAPDP (SEQ ID NO:58) TSTSGRSANPR (SEQ ID NO:83) RPARSGRSAGGSVA (SEQ ID NO:492)
PAPGVYPGP (SEQ ID NO:59) TSTSGRSANPG (SEQ ID NO:84) VTGRGDSPASS (SEQ ID NO:493)
APAGLIVPYN (SEQ ID NO:60) TSTSGRSANPH (SEQ ID NO:85) PRFKIIGG (SEQ ID NO:494)
PQALVA (SEQ ID NO:61) VPLSLY (SEQ ID NO:86) LSGRIGFLRTA (SEQ ID NO:495)
VGNLNF (SEQ ID NO:62) TSASGASASAA (SEQ ID NO:87) LSGRSNAGGIGQLTA (SEQ ID NO:496)
VANLLYE (SEQ ID NO:63) PSSPGGGSSP (SEQ ID NO:88) LSGRSNAVPLSLY (SEQ ID NO:497)
VYNLMD (SEQ ID NO:64) ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO:464) LSGRSNADSGGFMLT (SEQ ID NO:498)
TFNIKQ (SEQ ID NO:65) AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO:465) LSGRSNAHEQLTA (SEQ ID NO:499)
DLWKLLP (SEQ ID NO:66) VPLSLYSG (SEQ ID NO:466) LSGRSNARAAAVKSP (SEQ ID NO:500)
PGSTKRA (SEQ ID NO:67) RQARVVG (SEQ ID NO:467) LSGRSNATSVLMAAP (SEQ ID NO:501)
QQYRALKS (SEQ ID NO:68) LSGRSNAMPYDLYHP (SEQ ID NO:468) VPLSLYLSGRSNA (SEQ ID NO:502)
YVPRAVL (SEQ ID NO:69) MPYDLYHPRQARVVG (SEQ ID NO:469) DSGGFMLTLSGRSNA (SEQ ID NO:503)
GVNKWPT (SEQ ID NO:70) IPESLRAG (SEQ ID NO:479) GGIGQLTALSGRSNA (SEQ ID NO:504)
LAQAVRSS (SEQ ID NO:71) IPVSLRSG (SEQ ID NO:480) MPYDLYHPLSGRSNA (SEQ ID NO:505)
      HEQLTVLSGRSNA (SEQ ID NO:506)
      RAAAVKSPLSGRSNA (SEQ ID NO:507)
      TSVLMAAPLSGRSNA (SEQ ID NO:508)
因此，在一些實施例中，可裂解肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列。
在一些實施例中，蛋白酶裂解位點為腫瘤相關蛋白酶裂解位點。如本文所提供，「腫瘤相關蛋白酶裂解位點」為由蛋白酶識別之胺基酸序列，其表現對腫瘤細胞或其腫瘤細胞環境具有特異性。在一些實施例中，蛋白酶裂解位點為由一或多種選自由以下組成之群之酶識別之裂解位點：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。在一些實施例中，蛋白酶裂解位點為由一或多種選自由以下組成之群之酶識別之裂解位點：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。
在實施例中，蛋白酶裂解位點為基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點、含有解整合素及金屬蛋白酶結構域(ADAM)之金屬蛋白酶裂解位點、***特異性抗原(PSA)蛋白酶裂解位點、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)蛋白酶裂解位點、膜型絲胺酸蛋白酶1 (MT-SP1)蛋白酶裂解位點、間質蛋白酶蛋白酶裂解位點(ST14)或豆莢蛋白蛋白酶裂解位點。在實施例中，基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點為MMP9裂解位點、MMP13裂解位點或MMP2裂解位點。在實施例中，含有解整合素及金屬蛋白酶結構域(ADAM)之金屬蛋白酶裂解位點為ADAM9金屬蛋白酶裂解位點、ADAM10金屬蛋白酶裂解位點或ADAM17金屬蛋白酶裂解位點。蛋白酶裂解位點可由特異性胺基酸序列指定。
在一些實施例中，可裂解肽由一或多種選自由以下組成之群之酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。在一些實施例中，可裂解肽由一或多種選自由以下組成之群之酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。
在實施例中，可裂解肽為5聚體(亦即，長度為5個胺基酸之肽)、6聚體(亦即，長度為6個胺基酸之肽)、7聚體(亦即，長度為7個胺基酸之肽)、8聚體(亦即，長度為8個胺基酸之肽)、9聚體(亦即，長度為9個胺基酸之肽)、10聚體(亦即，長度為10個胺基酸之肽)、11聚體(亦即，長度為11個胺基酸之肽)、12聚體(亦即，長度為12個胺基酸之肽)或13聚體(亦即，長度為13個胺基酸之肽)。
因此，在一些實施例中，掩蔽肽及包含可裂解肽之連接子以N端至C端方向包含：1)掩蔽肽(例如包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列的胺基酸序列之掩蔽肽)，2)間隔連接子(例如包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列的胺基酸序列之間隔連接子)，3)可裂解肽，諸如本文中所描述之可裂解肽(例如包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列的胺基酸序列之可裂解肽)，及4)間隔連接子(例如包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列的胺基酸序列之間隔連接子)。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過30個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過40個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。
在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、間隔連接子及可裂解肽，其中該肽包含選自SEQ ID NO:113-231之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、間隔連接子及可裂解肽，其中該肽包含選自SEQ ID NO:113-193之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、間隔連接子及可裂解肽，其中該肽包含選自SEQ ID NO:194-206之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、間隔連接子及可裂解肽，其中該肽包含選自SEQ ID NO:207-231之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子，其中該肽包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列：SEQ ID NO:113-231、444、446-448及450-453。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子，其中該肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:113-231、444、446-448及450-453。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子，其中該肽包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列：SEQ ID NO:444、446-448及450-453。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白包含肽，其包含掩蔽肽、第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子，其中該肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:444、446-448及450-453。 例示性經掩蔽之 CTLA4 結合蛋白
以下描述含有如上文所描述之某些特徵的經掩蔽之CTLA4結合蛋白之某些例示性實施例。此等實施例僅為例示性且不應解釋為限制性。
在一些實施例中，本文中提供經掩蔽之抗體，其包含a)結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含第一鏈及第二鏈，及b)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體或其抗原結合片段之第一鏈或第二鏈之胺基端或羧基端。在一些實施例中，結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段為本文中所描述之任何抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含兩個第一鏈及兩個第二鏈。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈且第二鏈為重鏈。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域且第二鏈為重鏈可變域。在一些實施例中，可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。
在一些實施例中，本文中亦提供經掩蔽之抗體，其包含a)結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含第一鏈及第二鏈，及b)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體或其抗原結合片段之第一鏈及第二鏈之胺基端。在一些實施例中，結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段為本文中所描述之任何抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含兩個第一鏈及兩個第二鏈。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈且第二鏈為重鏈。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域且第二鏈為重鏈可變域。在一些實施例中，可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。
在一些實施例中，本文中亦提供經掩蔽之抗體，其包含a)結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段包含第一鏈及第二鏈，及b)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體或其抗原結合片段之第一鏈及第二鏈之羧基端。在一些實施例中，結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段為本文中所描述之任何抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含兩個第一鏈及兩個第二鏈。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈且第二鏈為重鏈。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域且第二鏈為重鏈可變域。在一些實施例中，可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。
在一些實施例中，本文中亦提供掩蔽抗體，其包含a)結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之抗體或其抗原結合片段，及b)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體之第一鏈之C端或N端且掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至抗體之第二鏈之C端或N端。在一些實施例中，結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段為本文中所描述之任何抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，a)抗體之第一鏈為輕鏈且抗體之第二鏈為輕鏈；b)抗體之第一鏈為重鏈且抗體之第二鏈為重鏈；或c)抗體之第一鏈為輕鏈且抗體之第二鏈為重鏈。因此，在一些實施例中，經分離之抗體在兩個輕鏈中之每一者之C端及/或N端以及兩個重鏈中之每一者之C端及/或N端上包含掩蔽肽。在一些實施例中，可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。
在一些實施例中，本文中亦提供經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含：a)抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及重鏈可變區，該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3；b)掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列；及c)可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列。在一些實施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。在一些實施例中，掩蔽肽連接至可裂解肽，且可裂解肽連接至輕鏈可變區或重鏈可變區。在一些實施例中，經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段進一步包含使掩蔽肽連接至可裂解肽之包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列之間隔連接子，且進一步包含使可裂解肽連接至輕鏈可變區或重鏈可變區之包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列之間隔連接子。在一些實施例中，使掩蔽肽連接至可裂解肽之間隔連接子包含SEQ ID NO:420之胺基酸序列，且使可裂解肽連接至輕鏈可變區或重鏈可變區之間隔連接子包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。在一些實施例中，使掩蔽肽連接至可裂解肽之間隔連接子包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列，且使可裂解肽連接至輕鏈可變區或重鏈可變區之間隔連接子包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且重鏈可變區包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。在一些實施例中，經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，以及包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列之肽。在一些實施例中，經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。
在一個態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列之輕鏈可變區及/或包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列之重鏈可變區。在另一態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列之輕鏈及/或包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列之重鏈。
在一個態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列之輕鏈可變區及/或包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列之重鏈可變區。在一些實施例中，本文中提供經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之輕鏈可變區，及包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之重鏈可變區。在另一態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列之輕鏈及/或包含有包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列之重鏈。在另一態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含選自SEQ ID NO:327、334或342-365之胺基酸序列之輕鏈及/或包含有包含選自SEQ ID NO:366或380-397之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，本文中提供經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，本文中提供經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:478之胺基酸序列之重鏈。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列與參考序列相比含有取代、***或缺失，但包含該胺基酸序列之抗體保留結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之能力。在一些實施例中，取代、***或缺失(例如1、2、3、4或5個胺基酸)存在於HVR外部之區域中(亦即，在FR中)。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，其包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，其包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列與參考序列相比含有取代、***或缺失，但包含該胺基酸序列之抗體保留結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之能力。在一些實施例中，取代、***或缺失(例如1、2、3、4或5個胺基酸)存在於HVR外部之區域中(亦即，在FR中)。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，其包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含a)包含有掩蔽肽、包含可裂解肽之連接子及輕鏈之胺基酸序列；及b)包含重鏈之胺基酸序列。在一些實施例中，包含有掩蔽肽、包含可裂解肽之連接子及輕鏈之胺基酸序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:358、422、424-426及428-431。在一些實施例中，包含重鏈之胺基酸序列包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。在一些實施例中，包含有掩蔽肽、包含可裂解肽之連接子及輕鏈之胺基酸序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:358、422、424-426及428-431；且包含重鏈之胺基酸序列包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及/或包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含與選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列；及/或包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列；及包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:422之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:422之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:358之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:423之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:423之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:424之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:424之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:425之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:425之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:426之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:426之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:427之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:427之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:428之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:428之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:429之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:429之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:430之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:430之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。 在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:431之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列；及包含與SEQ ID NO:421之胺基酸序列具有或具有約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:431之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。
存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其分別具有稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。γ及α類別進一步分成子類，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。IgG1抗體可以多種稱為異型之多晶型變異體形式存在(評述於Jefferis及Lefranc 2009. mAbs 第1卷, 第4期1-7中)，其中任一者皆適用於本文中之一些實施例。人類群體中之常見異型變異體為由字母a、f、n、z或其組合指定之變異體。在本文中之一些實施例中，抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些實施例中，本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段具有IgG1同型(例如人類IgG1同型)。在一些實施例中，本文所提供之抗體包含重鏈恆定域，其包含SEQ ID NO:235或236之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所提供之抗體包含重鏈恆定域，其包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所提供之抗體包含重鏈恆定域，其包含SEQ ID NO:463之胺基酸序列。
在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段在蛋白酶(諸如本文中所描述之蛋白酶)裂解後結合CTLA4。在一些實施例中，可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。
在本發明之一個態樣中，提供編碼可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸。在某些實施例中，提供包含聚核苷酸之載體，該等聚核苷酸編碼可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，提供包含此類載體之宿主細胞。在本發明之另一態樣中，提供一種組合物，其包含本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或編碼本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體之聚核苷酸。在某些實施例中，本發明之組合物為醫藥調配物，其用於治療其中CTLA4起作用之贅瘤性疾病，諸如本文中列舉之疾病。
在一些實施例中，本文中提供之CTLA4結合蛋白為能夠結合於CTLA4之雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。在一些實施例中，一種結合特異性係針對CTLA4且另一種係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於CTLA4之兩個不同抗原決定基。
在一些態樣中，本文中提供經掩蔽之雙特異性抗體，其包含a)第一對輕鏈及重鏈，其特異性結合於CTLA4；b)第二對輕鏈及重鏈，其特異性結合於抗原；及c)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至第一對中之輕鏈及/或重鏈之胺基端。在一些態樣中，本文中提供經掩蔽之雙特異性抗體，其包含a)第一對輕鏈及重鏈，其特異性結合於CTLA4；b)第二對輕鏈及重鏈，其特異性結合於抗原；及c)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至第一對中之輕鏈及/或重鏈之羧基端。在一些實施例中，抗原為與CTLA4不同之抗原。在一些實施例中，第一對或第二對中之輕鏈為本文中所描述之任何輕鏈。在一些實施例中，第一對或第二對中之重鏈為本文中所描述之任何輕鏈。在一些實施例中，第一對中之輕鏈包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及第一對中之重鏈包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。在一些實施例中，第二對中之輕鏈包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及第二對中之重鏈包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。在一些實施例中，抗原係針對CTLA4之不同抗原決定基。在一些實施例中，可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。
本文中所涵蓋之用於經掩蔽之雙特異性抗體之雙特異性抗體包括鼠類雙特異性抗體、人類化雙特異性抗體、嵌合雙特異性抗體及人類雙特異性抗體。在本文中之一些實施例中，雙特異性抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些實施例中，本文中提供之雙特異性抗體具有IgG1同型(例如人類IgG1同型)。在一些實施例中，抗體具有IgG1同型，其包含胺基酸取代或由不具有海藻糖基化Fc聚糖之能力至具有降低之海藻糖基化Fc聚糖之能力之細胞表現，該Fc聚糖增強如本文中所描述之效應功能。在一些實施例中，本文中提供之經掩蔽之雙特異性抗體包含重鏈恆定域，其包含SEQ ID NO:235或236之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中提供之經掩蔽之雙特異性抗體包含重鏈恆定域，其包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中提供之經掩蔽之雙特異性抗體包含重鏈恆定域，其包含SEQ ID NO:463之胺基酸序列。
在一個態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含有包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列之輕鏈可變區及/或包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列之重鏈可變區。在另一態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含有包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列之輕鏈及/或包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列之重鏈。
在一個態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含有包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列之輕鏈可變區及/或包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列之重鏈可變區。在另一態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含有包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列之輕鏈及/或包含有包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列之重鏈。在另一態樣中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含有包含選自SEQ ID NO:327、334或342-365之胺基酸序列之輕鏈及/或包含有包含選自SEQ ID NO:366或380-397之胺基酸序列之重鏈。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含與選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列與參考序列相比含有取代、***或缺失，但包含該胺基酸序列之抗體保留結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之能力。在一些實施例中，取代、***或缺失(例如1、2、3、4或5個胺基酸)存在於HVR外部之區域中(亦即，在FR中)。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體包含重鏈可變域，其包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體包含重鏈可變域，其包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中提供可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體，其包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含與選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列與參考序列相比含有取代、***或缺失，但包含該胺基酸序列之抗體保留結合於CTLA4 (例如人類CTLA4)之能力。在一些實施例中，取代、***或缺失(例如1、2、3、4或5個胺基酸)存在於HVR外部之區域中(亦即，在FR中)。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體包含輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體包含輕鏈可變域，其包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中提供之CTLA4結合蛋白為能夠結合於CTLA4之嵌合受體(例如嵌合抗原受體(CAR))。CAR為一種分子，其組合針對所需抗原(例如CTLA4)之基於抗體之特異性與T細胞受體活化細胞內結構域，以產生呈現特異性抗腫瘤細胞活性之嵌合蛋白。在一個實施例中，本文中提供嵌合受體，其經工程改造以包含與T細胞抗原受體複合物ζ鏈(例如CD3ζ)之細胞內信號傳導域融合之具有本文中所描述之CTLA4結合域之細胞外結構域。CTLA4結合域經工程改造使得其經由包含可裂解肽之連接子連接至掩蔽肽，諸如本文中所描述之掩蔽肽。當表現於T細胞中時，本文中提供之可活化的經掩蔽之嵌合受體在由識別可裂解肽之蛋白酶進行之裂解後能夠基於抗原結合特異性再引導抗原識別。在一些實施例中，CTLA4結合域較佳與來自共刺激性分子及ζ鏈中之一或多者之細胞內結構域融合。在一些實施例中，CTLA4結合域與一或多種選自以下之群之細胞內結構域融合：CD137(4-1BB)信號傳導域、CD28信號傳導域、CD3ζ信號傳導域及其任何組合。
在一些態樣中，本文中提供經掩蔽之嵌合受體，其包含a)包含第一鏈及第二鏈之配位體結合域，其結合於CTLA4；b)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，c)跨膜域；及d)細胞內信號傳導域，其包含信號傳導域，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至配位體結合域之第一鏈及/或第二鏈之胺基端。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域且第二鏈為重鏈可變域。在本文中所描述之可活化的經掩蔽之嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或第二鏈包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在一些實施例中，第一鏈包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或第二鏈包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。
在一些態樣中，本文中提供經掩蔽之嵌合受體，其包含a)包含第一鏈及第二鏈之配位體結合域，其結合於CTLA4；b)掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列，c)跨膜域；及d)細胞內信號傳導域，其包含信號傳導域，其中掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至配位體結合域之第一鏈及/或第二鏈之羧基端。在一些實施例中，第一鏈為輕鏈可變域且第二鏈為重鏈可變域。在本文中所描述之可活化的經掩蔽之嵌合受體之一些實施例中，第一鏈包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或第二鏈包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。在一些實施例中，第一鏈包含選自SEQ ID NO:321或322之胺基酸序列；及/或第二鏈包含選自SEQ ID NO:323或324之胺基酸序列。
在本文中所描述之可活化的經掩蔽之嵌合受體之一些實施例中，可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔連接子直接連接至可裂解肽之N端及/或C端。在一些實施例中，間隔連接子包含選自SEQ ID NO:89-112及415-420之胺基酸序列。在一些實施例中，至少一個胺基酸但不超過20、30、40或50個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。在一些實施例中，該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為可偵測標記物。在一些實施例中，直接連接至掩蔽肽之N端之該至少一個胺基酸為YPYDVPDYA (SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK (SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL (SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO:401)。 1. 結合親和力
免疫結合相互作用(諸如在抗體與對抗體具有特異性之抗原之間)之強度或親和力可由相互相用之平衡解離常數(KD )表示，其中較小的KD 表示較大的親和力。蛋白質之免疫結合特性可使用此項技術中熟知之方法定量。舉例而言，一種方法包含量測抗原結合蛋白(例如抗體)/抗原複合物形成及解離之速率，其中此等速率視複合搭配物之濃度、相互作用之親和力及同等影響兩個方向上之速率之幾何結構參數而定。「締合速率常數」(Kon)及「解離速率常數」(Koff)可藉由計算濃度以及締合及解離之實際速率來確定。Koff/Kon之比率使得能夠消除所有與親和力無關之參數，且等於平衡解離常數KD 。參見Davies等人, Annual Rev Biochem. 59:439-473, (1990)。
在一些態樣中，與不包含可裂解肽之親本抗CTLA4結合蛋白相比，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)在蛋白酶裂解後以約相同或更高之親和力結合於CTLA4。在某些實施例中，本文中提供之抗CTLA4結合蛋白之平衡解離常數(KD )≤1μM、≤150 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM (例如10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一些實施例中，本文中提供之抗CTLA4結合蛋白(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)以約50 pM至約5 nM之平衡解離常數(KD )結合於目標蛋白質(例如CTLA4蛋白質)。用於評估結合親和力之分析法為此項技術中熟知的，例如本文中之實例3A及實例3B中描述之分析法。
在一些態樣中，提供呈現所需包藏率之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。如本文中所使用，術語「包藏率」係指(a)在第一組條件下，參數之最大偵測量與(b)在第二組條件下，參數之最小偵測值之比率。舉例而言，在可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之情形下，包藏率係指(a)在存在至少一種能夠裂解可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之可裂解肽的蛋白酶之情況下，結合於可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段的目標蛋白質(例如CTLA4蛋白質)之最大偵測量與(b)在不存在蛋白酶之情況下，結合於可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段的目標蛋白質(例如CTLA4蛋白質)之最小偵測量之比率。可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之包藏率可計算為在蛋白酶裂解之前的可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之解離常數與在蛋白酶裂解之後的可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之解離常數之比率。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之包藏率越大，表明與在不存在蛋白酶之情況下相比，在存在能夠裂解可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之可裂解肽之蛋白酶之情況下，所進行的可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段與目標蛋白質(例如CTLA4蛋白質)之結合程度越大(例如顯著進行)。在一些實施例中，本文中提供具有最佳包藏率之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段之最佳包藏率指示可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段具有適用於本文中涵蓋之方法或組合物之理想特性。在一些實施例中，本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白呈現約20至約10,000，例如約80至約100之最佳包藏率。在另一實施例中，包藏率為約20至約7,500、約20至約5,000、約20至約2,500、約20至約2,000、約20至約1,000、約20至約900、約20至約800、約20至約700、約20至約600、約20至約500、約20至約400、約20至約300、約20至約200、約20至約100、約20至約50、約30至約100、約40至約100、約50至約100、約60至約100、約70至約100、約80至約100或約100至約1,000。在一些實施例中，本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白呈現約80至約100之最佳包藏率。在一些實施例中，本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白呈現約20至約1,000之最佳包藏率。可使用此項技術中熟知的技術(諸如ELISA)測定在蛋白酶裂解之前及/或在蛋白酶裂解之後，可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白與目標蛋白質(例如CTLA4蛋白質)之結合。
在一些態樣中，與抗CTLA4結合蛋白與目標蛋白質(例如CTLA4蛋白質)之間的親和力相比，本文中所描述之掩蔽肽以較低親和力結合於抗CTLA4結合蛋白(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。在某些實施例中，本文中提供之掩蔽肽以≤1 mM、≤1 μM、≤150 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM (例如10-5 M或更低，例如10-5 M至10-13 M，例如10-5 M至10-7 M)之平衡解離常數(KD )結合於抗CTLA4結合蛋白(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。在一些實施例中，本文中提供之掩蔽肽以約50 nM至約50 µM之平衡解離常數(KD )結合於抗CTLA4結合蛋白(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。用於評估掩蔽肽與抗CTLA4結合蛋白(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)之間的結合親和力之例示性分析法可見於本文中之實例2中。 2. 生物活性分析法
在一些態樣中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白在活體內鼠類腫瘤模型中減小腫瘤體積。用於評估腫瘤體積之減小之分析法為此項技術中熟知的，例如本文中之實例4A及實例4B中描述之分析法。III. 經掩蔽之抗 CTLA4 結合蛋白製備
使用此項技術中可用的技術製備本文中所描述之經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白，其例示性方法更詳細地描述於以下章節中。 1. 經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白：抗體片段
本發明涵蓋作為經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之抗體片段。可藉由傳統手段(諸如酶促消化)或藉由重組技術產生經掩蔽之抗體片段。在某些情形中，使用經掩蔽之抗體片段而非完全抗體可具有優點。關於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人 (2003) Nat. Med. 9:129-134。
已研發出多種用於產生抗體片段之技術。傳統上，此等片段經由完整抗體之蛋白水解消化而獲得(參見例如Morimoto等人, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992))；及Brennan等人, Science, 229:81 (1985))。然而，此等片段現可藉由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可在大腸桿菌及其他細胞類型中表現及分泌，因此使得可容易地產生大量此等經掩蔽之片段。或者，可直接自培養基回收經掩蔽之Fab'-SH片段且以化學方式偶合以形成F(ab')2片段(Carter等人, Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。根據另一種方法，可直接自重組宿主細胞培養物分離經掩蔽之F(ab')2片段。活體內半衰期延長且包含FcRN/救助受體結合抗原決定基殘基之經掩蔽之Fab及F(ab')2片段描述於美國專利案第5,869,046號中。經掩蔽之抗體片段之其他製備技術對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。在某些實施例中，經掩蔽之抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利案第5,571,894號；及第5,587,458號。Fv及scFv為僅有的具有不含恆定區之完整組合位點之種類；因此，其可適用於活體內使用期間降低之非特異性結合。可構築scFv融合蛋白以在scFv之胺基或羧基端產生效應蛋白之融合。參見Antibody Engineering, Borrebaeck編, 見上文。又，可使用包含兩個經由多肽連接子連接之scFv之雙重scFv作為雙特異性抗體。或者，可使用包含三個或更多個scFv之多重scFv作為多特異性抗體。
本發明包括線抗體(例如美國專利案第5,641,870號中所描述)或單鏈免疫球蛋白，其包含經由適合的連接子連接之抗體之重鏈及輕鏈序列。此類線抗體或免疫球蛋白可為單特異性或雙特異性。此類單鏈免疫球蛋白可二聚以藉此保持結構及與抗體(其最初為四聚體)類似之活性。又，本發明之抗體可為具有單一重鏈可變區且不具有輕鏈序列之抗體。此類抗體稱為單結構域抗體(sdAb)或奈米抗體。此等抗體亦涵蓋於本發明之抗體之功能性片段之含義中。 2. 經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白：人類化抗體
本發明涵蓋經掩蔽之人類化抗體。根據本文中提供之指導來掩蔽人類化抗體。用於人類化非人類抗體之各種方法為此項技術中已知的。舉例而言，人類化抗體可具有一或多個由非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地取自「輸入」可變域。人類化可基本上遵循Winter之方法(Jones等人, (1986) Nature 321:522-525；Riechmann等人, (1988) Nature 332:323-327；Verhoeyen等人, (1988) Science 239:1534-1536)，藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，此類「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利案第4,816,567號)，其中實質上小於完整人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體典型地為一些高變區殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。 3. 經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白：人類抗體
本發明之人類抗CTLA4抗體可藉由組合選自人類衍生之噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列與已知的人類恆定域序列來構築。或者，本發明之人類單株抗CTLA4抗體可藉由融合瘤方法製得。用於製備人類單株抗體之人類骨髓瘤及鼠類-人類融合骨髓瘤細胞株已例如由Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人, J. Immunol., 147: 86 (1991)描述。根據本文中提供之指導來掩蔽人類抗體。 4. 經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白：雙特異性抗體
雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體為人類或人類化抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對CTLA4且另一種係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於CTLA4之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒素劑定位至表現CTLA4之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。根據本文中提供之指導來掩蔽雙特異性抗體。
用於製備雙特異性抗體之方法係此項技術中已知的。參見Milstein及Cuello, Nature, 305: 537 (1983)；1993年5月13日公開之WO 93/08829；Traunecker等人, EMBO J., 10: 3655 (1991)；Kontermann及Brinkmann, Drug Discovery Today, 20(7):838-847。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。雙特異性抗體包括交聯或「異結合」抗體。舉例而言，異結合物中之一種抗體可與抗生素蛋白偶合，另一種抗體與生物素偶合。異結合抗體可使用任何適宜的交聯方法製得。適合的交聯劑以及許多交聯技術為此項技術中熟知的且揭示於美國專利案第4,676,980號中。 5. 經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白：單結構域抗體
在一些實施例中，根據本文中提供之指導來掩蔽單結構域抗體。單結構域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域之單一多肽鏈。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, Mass.；參見例如美國專利案第6,248,516 B1號)。在一個實施例中，單結構域抗體由抗體之全部或一部分重鏈可變域組成。 6. 經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白：抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋本文中所描述之經掩蔽之抗體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良經掩蔽之抗體之結合親和力及/或其他生物特性。可藉由將適合的變化引入編碼抗體之核苷酸序列或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此類修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或***及/或取代。可進行缺失、***及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。可在製得序列時，在標的抗體胺基酸序列中引入胺基酸變化。
一種適用於鑑別抗體中作為用於突變誘發之較佳位置的某些殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989) Science, 244:1081-1085所描述。本文中，鑑別一個殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且由中性或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換，以影響胺基酸與抗原之相互相用。接著，藉由在取代位點處或為取代位點引入另外的或其他變異體來優化對取代呈現功能敏感性之胺基酸位置。因此，儘管用於引入胺基酸序列變化之位點係預定的，但突變本身之性質無需為預定的。舉例而言，為了分析既定位點處之突變效能，在目標密碼子或區域進行Ala掃描或隨機突變誘發且根據所需活性篩選經表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列***包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內***。末端***之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他***變異體包括抗體之N端或C端與酶或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
在一些實施例中，改良藥物動力學之FcRn突變包括(但不限於)M428L、T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E、P257I/N434H、D376V/N434H、P257I/Q3111、N434A、N434W、M428L/N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434A、V308P/N434A、N434H、V308P。在一些實施例中，此類突變在低pH值下增強抗體與FcRn之結合，但在中性pH值下不改變抗體親和力。
在某些實施例中，改變本發明之抗體以增加或降低抗體之糖基化程度。多肽之糖基化通常為N-連接型或O-連接型。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈之連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸，為用於碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈之酶促連接之識別序列。因此，在多肽中存在此等三肽序列中之任一者可產生潛在糖基化位點。O-連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥胺基酸，最通常絲胺酸或蘇胺酸之連接，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
宜藉由改變胺基酸序列，使得產生或移除上述三肽序列中之一或多者來實現針對抗體之糖基化位點之添加或缺失(對於N-連接型糖基化位點)。亦可藉由針對原始抗體之序列的一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加、缺失或取代來實現變化(對於O-連接型糖基化位點)。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。舉例而言，具有成熟碳水化合物結構(其不具有連接至抗體之Fc區之海藻糖)之抗體描述於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta, L.)中。亦參見US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。在連接至抗體之Fc區之碳水化合物中具有等分N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)之抗體描述於Jean-Mairet等人之WO 2003/011878及Umana等人之美國專利案第6,602,684號中。在連接至抗體之Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體報導於Patel等人之WO 1997/30087中。關於具有與Fc區連接之經改變之碳水化合物之抗體，亦參見WO 1998/58964 (Raju, S.)及WO 1999/22764 (Raju, S.)。關於具有經修飾之糖基化之抗原結合分子，亦參見US 2005/0123546 (Umana等人)。
在某些實施例中，糖基化變異體包含Fc區，其中連接至Fc區之碳水化合物結構不具有海藻糖或具有減少之海藻糖。此類變異體具有改良之ADCC功能。視情況地，Fc區進一步包含一或多種胺基酸取代，其進一步改良ADCC，例如Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之Eu編號)處之取代。關於「無海藻糖基化」、「去海藻糖基化」或「海藻糖缺失型」抗體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等人 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括蛋白質海藻糖基化缺失型Lec13 CHO細胞(Ripka等人 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號, Presta, L；及WO 2004/056312 A1, Adams等人，尤其在實例11中)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因(FUT8)剔除CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))，及過表現β1,4-N-乙醯基糖胺多糖基轉移酶III (GnT-III)及高爾基體μ (Golgi μ)-甘露糖苷酶II (ManII)之細胞。
在本文中之任何實施例中，經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白可經工程改造以改良抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。在一些實施例中，可在具有α1,6-海藻糖基轉移酶(Fut8)基因剔除之細胞株中產生經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白。在一些其他實施例中，可在過表現β1,4-N-乙醯基糖胺多糖基轉移酶III (GnT-III)之細胞株中產生經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白。在其他實施例中，細胞株亦過表現高爾基體μ-甘露糖苷酶II (ManII)。在本文中之一些實施例中，經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白可在Fc區中包含至少一個改良ADCC活性之胺基酸取代。
在一個實施例中，改變經掩蔽之抗體以改良其血清半衰期。為延長抗體之血清半衰期，可將FcRN/救助受體結合抗原決定基併入抗體(尤其抗體片段)，例如美國專利案第5,739,277號中所描述。如本文中所使用，術語「救助受體結合抗原決定基」係指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區之抗原決定基，其負責延長IgG分子之活體內血清半衰期(US 2003/0190311、美國專利案第6,821,505號；美國專利案第6,165,745號；美國專利案第5,624,821號；美國專利案第5,648,260號；美國專利案第6,165,745號；美國專利案第5,834,597號)。
另一種變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個由不同殘基置換之胺基酸殘基。取代型突變誘發之相關位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。保守性取代展示於表2中「較佳取代」標題下。若此類取代引起生物活性之理想改變，則可引入更多的實質變化，表2中稱為「例示性取代」或如下文參考胺基酸類別進一步描述，且篩選產物。表 2.
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp, Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
抗體之生物特性之實質修飾係藉由選擇取代實現，該等取代在其對維持以下的作用上顯著不同：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如片或螺旋構形，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性，或c)側鏈之體積。胺基酸可根據其側鏈之特性的相似性來分組(A. L. Lehninger, Biochemistry, 第二版, 第73-75頁, Worth Publishers, New York (1975))： (1) 非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M) (2) 不帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q) (3) 酸性：Asp (D)、Glu (E) (4) 鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)
或者，天然存在之殘基可以基於共同的側鏈特性分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。此類經取代之殘基亦可引入保守性取代位點或引入其餘(非保守性)位點。
一種取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，所選擇的用於進一步開發之所得變異體相對於產生其的親本抗體而言具有經修飾(例如改良)之生物特性。用於產生此類取代型變異體之適宜方式涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。由此產生的抗體係以與封裝於各顆粒內之噬菌體鞘蛋白(例如M13之基因III產物)之至少一部分之融合物形式自絲狀噬菌體顆粒呈現。接著，針對噬菌體呈現變異體之生物活性(例如結合親和力)對其進行篩選。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行掃描突變誘發(例如丙胺酸掃描)以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，其可有利於分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基為根據此項技術中已知之技術(包括本文中詳細描述的技術)的取代之候選物。在此類變異體產生後，使用此項技術中已知的技術(包括本文中所描述之技術)對該組變異體進行篩選，且可選擇在一或多種相關分析法中具有優良特性之抗體用於進一步開發。
藉由此項技術中已知的多種方法製備編碼經掩蔽之抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下)，或藉由對抗體之早期製備變異體或非變異型版本進行寡核苷酸介導(或定點)突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備。
可能需要在本發明之抗體之Fc區中引入一或多種胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱胺酸之胺基酸位置)處包含胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，或可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體)具有IgG1同型，其具有增強之效應功能。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段為無海藻糖基化的。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體為無海藻糖基化的。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段具有增加之甘露糖部分含量。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段具有增加之等分聚糖部分含量。在一些實施例中，可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體具有增加之甘露糖部分含量。在一些實施例中，IgG1包含胺基酸突變。
在一些實施例中，本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段或可活化的經掩蔽之抗CTLA4雙特異性抗體具有IgG1同型(例如人類IgG1同型)。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S298A、E333A及K334A，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S239D及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代S239D、A330L及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代P247I及A339D或A339Q，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代D280H、K290S (具有或不具有S298D或S298V)，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代F243L、R292P及Y300L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代F243L、R292P、Y300L及P396L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代G236A、S239D及I332E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K326A及E333A，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K326W及E333S，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。在一個實施例中，IgG1包含胺基酸取代K290E或K290N、S298G、T299A及/或K326E，其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。
根據本說明書及此項技術之教示內容，預期在一些實施例中，本發明之抗體與野生型對應抗體相比可包含一或多種變化，例如在Fc區中。此等抗體與其野生型對應物相比將仍然保留治療效用所需的實質上相同之特徵。舉例而言，認為某些變化可在Fc區中作出，其將引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之改變(亦即，改良或減弱)，例如WO99/51642中所描述。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter, Nature 322:738-40 (1988)；美國專利案第5,648,260號；美國專利案第5,624,821號；及WO94/29351。WO00/42072 (Presta)及WO 2004/056312 (Lowman)描述具有改良或減弱之與FcRs之結合之抗體變異體。此等專利公開案之內容特定地以引用之方式併入本文中。亦參見Shields等人 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer等人, J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol. 24:249 (1994))之結合改良的抗體描述於US 2005/0014934A1 (Hinton等人)中。此等抗體包含Fc區，其具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代。具有改變之Fc區胺基酸序列及增加或降低之C1q結合能力之多肽變異體描述於美國專利案第6,194,551B1號、WO99/51642中。此等專利公開案之內容特定地以引用之方式併入本文中。亦參見Idusogie等人 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。 7. 經掩蔽之抗體-藥物結合物
本發明亦提供經掩蔽之抗體-藥物結合物(ADC)，其包含與一或多種細胞毒性劑(諸如化學治療劑或藥物)、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素結合之本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白。
在一個實施例中，與抗體-藥物結合物結合之一或多種藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利案第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利案EP 0 425 235 B1)；奧瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF (MMAE及MMAF)(參見美國專利案第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利案第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及Lode等人, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；蒽環黴素(anthracycline)，諸如柔紅黴素或小紅莓(參見Kratz等人, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等人, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等人, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等人, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等人, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；美國專利案第6,630,579號)；甲胺喋呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，諸如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，與抗體-藥物結合物結合之一或多種藥物包括(但不限於)微管蛋白聚合抑制劑(例如類美登素及奧瑞他汀)、DNA損傷劑(例如吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素、倍癌黴素及吲哚啉苯并二氮呯二聚體)及DNA合成抑制劑(例如依昔替康衍生物Dxd)。
在另一實施例中，抗體-藥物結合物包含與酶活性毒素或其片段結合之如本文中所描述之抗體，該酶活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲***素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(tricothecenes)。
在另一實施例中，抗體-藥物結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物的如本文中所描述之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m 或I123 ，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之旋轉標記，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)與細胞毒性劑之結合物，該等雙功能蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如鹽酸己二醯亞胺酸二甲酯)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人, Science 238:1098 (1987)中所述來製備。碳-14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於放射性核苷酸與抗體之結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為在細胞中促進細胞毒性藥物之釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子(Chari等人, Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利案第5,208,020號)。
本文中之ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯劑製備之此類結合物，該等交聯劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，以及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯劑可商購(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。 8. 載體、宿主細胞及重組方法
對於本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之重組產生，編碼其之核酸經分離且***可複製的載體中以用於進一步選殖(DNA之擴增)或用於表現。編碼抗體之DNA容易使用習知程序分離及測序(例如使用能夠特異性結合於編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。可利用許多載體。載體之選擇部分地視所用宿主細胞而定。通常，宿主細胞具有原核或真核(通常哺乳動物)來源。應瞭解，任何同型之恆定區可用於此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此類恆定區可獲自任何人類或動物物種。 9. 使用原核宿主細胞產生結合蛋白 a) 載體構築
可使用標準重組技術獲得編碼本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之多肽組分之聚核苷酸序列。所需聚核苷酸序列可自產抗體細胞(諸如融合瘤細胞)分離及測序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術合成聚核苷酸。在獲得之後，將編碼多肽之序列***能夠在原核宿主中複製及表現異源聚核苷酸之重組載體中。此項技術中可獲得且已知的許多載體可用於本發明之目的。適合的載體之選擇將主要視***載體中的核酸之尺寸及用載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體含有各種組分，此視其功能(異源聚核苷酸之擴增或表現，或其兩者)及與其駐存之特定宿主細胞之相容性而定。載體組分通常包括(但不限於)：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸***物及轉錄終止序列。
通常，將含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體與此等宿主結合使用。載體通常攜帶複製位點以及能夠在經轉型之細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，大腸桿菌典型地使用pBR322 (來源於大腸桿菌物種之質體)轉型。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin；Amp)及四環素(tetracycline；Tet)抗性之基因且因此提供容易鑑別經轉型之細胞之方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或細菌噬菌體亦可含有或經修飾以含有可供微生物體用於表現內源性蛋白質之啟動子。用於特定抗體之表現之pBR322衍生物之實例詳細地描述於Carter等人之美國專利案第5,648,237號中。
此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可作為轉型載體結合此等宿主使用。舉例而言，諸如λGEM.TM.-11之細菌噬菌體可用於製備重組載體，其可用於使諸如大腸桿菌LE392之敏感宿主細胞轉型。
本發明之表現載體可包含兩個或更多個編碼多肽組分中之每一者的啟動子-順反子對。啟動子為位於順反子上游(5')之調節其表現之未經轉譯之調節序列。原核啟動子典型地分為兩類：誘導型及組成型。誘導性啟動子為在其控制下，回應於培養條件之變化(例如存在或不存在營養物或溫度變化)而起始順反子之轉錄量增加之啟動子。
已熟知由多種潛在宿主細胞所識別之許多啟動子。所選擇的啟動子可操作地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA，此係藉由經由限制酶消化來移除源DNA中之啟動子且將經分離之啟動子序列***本發明之載體來達成。原生啟動子序列與許多異源啟動子皆可用於引導目標基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，與原生目標多肽啟動子相比，由於異源啟動子通常實現經表現之目標基因之更多的轉錄及更高的產量，因此使用異源啟動子。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、β-半乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(Trp)啟動子系統及雜交啟動子，諸如tac或trc啟動子。然而，在細菌(諸如其他已知的細菌或噬菌體啟動子)中發揮功能之其他啟動子亦適合。其核苷酸序列已公開，藉此使得熟練工作者能夠可操作地使用連接子或接附子將該等核苷酸序列與編碼目標輕鏈及重鏈的順反子接合(Siebenlist等人(1980) Cell 20: 269)，以提供任何所需的限制位點。
在本發明之一個態樣中，重組載體內的各順反子包含分泌信號序列組分，其引導跨越膜之經表現之多肽之易位。通常，信號序列可為載體之組分，或其可為***載體中之目標多肽DNA之一部分。為了本發明之目的所選擇的信號序列應為被宿主細胞識別及處理(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及處理異源多肽之原生信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列經選自由例如以下組成之群的原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II (STII)前導子、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一個實施例中，表現系統之兩個順反子中所用的信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，根據本發明之免疫球蛋白的產生可在宿主細胞之細胞質中進行，且因此不需要各順反子內存在分泌信號序列。在此方面，免疫球蛋白輕鏈及重鏈在存在或不存在掩蔽肽之序列、連接序列等之情況下表現、摺疊及組裝以在細胞質內形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成的細胞質條件，藉此實現經表現之蛋白質子單元之正確的摺疊及組裝。Proba及Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)。
本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白亦可使用表現系統產生，其中可調節經表現之多肽組分之定量率以最大化本發明之分泌及適當組裝之抗體之產量。此類調節係至少部分地藉由同時調節多肽組分之轉譯強度來實現。
適用於表現本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白的原核宿主細胞包括太古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性(Gram-positive)生物體。適用的細菌之實例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、桿菌(例如枯草桿菌(B. subtilis))、腸內細菌、假單胞菌種(例如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa))、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、志賀桿菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)或副球菌屬(Paracoccus)。在一個實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施例中，使用大腸桿菌細胞作為本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, 第2卷(Washington, D. C.: American Society for Microbiology, 1987), 第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR之菌株33D3 (美國專利案第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)亦為適合的。此等實例為說明性而非限制性的。用於構築具有所定義之基因型的任一種以上提及之細菌之衍生物的方法在此項技術中已知且描述於例如Bass等人, Proteins, 8:309-314 (1990)中。考慮複製子在細菌之細胞中之可複製性，選擇適合的細菌通常為有必要的。舉例而言，當使用熟知質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供應複製子時，宜使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia)或沙門氏菌種作為宿主。通常，宿主細胞應分泌最少量的蛋白水解酶，且細胞培養物中宜併入其他蛋白酶抑制劑。 b) 結合蛋白產生
宿主細胞用上述表現載體轉型且在適當時經改良之習知營養物培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主，使得DNA可以染色體外元件形式或由染色體整合體複製。視所用宿主細胞而定，轉型係使用適於此類細胞之標準技術進行。使用氯化鈣之鈣處理通常用於含有實質性細胞壁障壁之細菌細胞。另一種轉型方法使用聚乙二醇/DMSO。另一種所用技術為電致孔。
用於產生本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之原核細胞在此項技術中已知且適用於培養所選擇的宿主細胞之培養基中生長。適合的培養基之實例包括魯利亞培養液(luria broth；LB)加必需的營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築而選擇之選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞之生長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以用於表現安比西林抗性基因之細胞之生長。
除碳、氮及無機磷酸鹽源以外，亦可包括適合的濃度之任何必需補充劑，其係單獨或以與諸如複合氮源之其他補充劑或培養基之混合物形式引入。視情況地，培養基可含有一或多種選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇組成之群之還原劑。
在適合的溫度下培養原核宿主細胞。在某些實施例中，對於大腸桿菌生長，生長溫度在約20℃至約39℃；約25℃至約37℃範圍內；或為約30℃。培養基之pH值可為約5至約9範圍內之任何pH值，此主要視宿主生物體而定。在某些實施例中，對於大腸桿菌，pH值為約6.8至約7.4，或約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適用於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽之轉錄。因此，經轉型之宿主細胞在用於誘導的磷酸鹽限制性培養基中培養。在某些實施例中，磷酸鹽限制性培養基為C.R.A.P.培養基(參見例如Simmons等人, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147)。根據所用載體構築體，可使用多種其他誘導劑，如此項技術中已知。
在一個實施例中，經表現之本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白分泌至宿主細胞之周質中且自宿主細胞之周質中回收。蛋白質回收典型地涉及破壞微生物，通常藉由諸如滲壓衝擊、音波處理或溶胞之手段。細胞破壞後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或完全細胞。可進一步純化蛋白質，例如藉由親和樹脂層析。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且自其中分離。可自培養物移除細胞，且過濾且濃縮培養物上清液以進一步純化所產生之蛋白質。經表現之多肽可使用通常已知的方法(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析法)進一步分離及鑑別。
在本發明之一個態樣中，藉由醱酵過程大量進行可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白產生。可使用各種大規模分批饋料醱酵程序來產生重組蛋白質。大規模醱酵具有至少1000公升容量且在某些實施例中，具有約1,000至100,000公升容量。此等醱酵器使用攪拌器葉輪分配氧及營養物，尤其葡萄糖。小規模醱酵通常係指在體積容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵器中醱酵。
在醱酵過程中，典型地在細胞已在適合的條件下生長至所需密度(例如約180-220之OD550)之後開始誘導蛋白質表現，在此階段，細胞處於早期固定相。根據所用載體構築體，可使用多種誘導劑，如此項技術中已知及上文所描述。細胞在誘導之前可生長更短的時段。細胞通常誘導約12-50小時，但可使用更長或更短的誘導時間。
為了改良本發明之多肽之產量及品質，可修改各種醱酵條件。舉例而言，為了改良所分泌之抗體多肽之正確組裝及摺疊，可使用過表現伴隨蛋白之其他載體(諸如Dsb蛋白質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA (具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順,反-異構酶))使宿主原核細胞共轉型。已證明伴隨蛋白可促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質之正確摺疊及溶解性。Chen等人 (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605；Georgiou等人, 美國專利案第6,083,715號；Georgiou等人, 美國專利案第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等人 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
為了使經表現之異源蛋白質(尤其對蛋白水解敏感之異源蛋白質)的蛋白水解最小化，本發明可使用某些蛋白水解酶缺失型宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。可獲得一些蛋白酶缺失型大腸桿菌菌株且描述於例如Joly等人(1998), 見上文；Georgiou等人, 美國專利案第5,264,365號；Georgiou等人, 美國專利案第5,508,192號；Hara等人, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)中。
在一個實施例中，使用蛋白水解酶缺失型且經過表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株作為本發明之表現系統中之宿主細胞。 c) 結合蛋白純化
在一個實施例中，進一步純化本文中產生的經掩蔽之抗體蛋白質以獲得實質上均質的製劑，以用於其他分析法及用途。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序舉例說明適合的純化程序：免疫親和或離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上之層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱，及使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一個態樣中，使用固定在固相上之蛋白質A對本發明之抗體產物進行免疫親和純化。蛋白質A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之41 kD細胞壁蛋白質，其以高親和力結合於抗體之Fc區。Lindmark等人 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。固定蛋白質A的固相可為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，或受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱經諸如甘油之試劑塗佈，以可能防止污染物之非特異性附著。
作為純化之第一步驟，可將如上文所描述之來源於細胞培養物的製劑施用於蛋白質A固定之固相上以實現相關抗體與蛋白質A之特異性結合。接著洗滌固相，以移除非特異性結合於固相之污染物。最後，藉由溶離自固相回收相關抗體。 10. 使用真核宿主細胞產生結合蛋白
用於真核宿主細胞之載體通常包括以下非限制性組分中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。 a) 信號序列組分
用於真核宿主細胞之載體亦可含有信號序列或在相關成熟蛋白質或多肽之N端處具有特定裂解位點之其他多肽。所選擇的異源信號序列可為由宿主細胞識別及處理(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現時，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導子，例如單純疱疹gD信號。此類前驅體區域之DNA在閱讀框架中接合至編碼抗體之DNA。 b) 複製起點
通常，哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例而言，通常可使用SV40起點，僅因為其含有早期啟動子。 c) 選擇基因組分
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型的選擇基因編碼如下蛋白質：(a)賦予針對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、甲胺喋呤或四環素)之抗性，(b)補體營養缺陷性不足(若有關)，或(c)提供無法自複合培養基獲得之重要營養物。
選擇流程之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞生長。此等經異源基因成功轉型之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質且因此在選擇療法中存活。此類顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)及潮黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選標記物之另一實例為實現能夠吸收可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白編碼核酸之細胞的鑑別之標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II、靈長類動物金屬硫蛋白基因、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。
舉例而言，在一些實施例中，首先藉由將所有轉型體在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)的培養基中培養來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。在一些實施例中，當使用野生型DHFR時，適合的宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞株(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可藉由在含有用於可選標記物之選擇劑(諸如胺基醣苷抗生素，例如卡那黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之培養基中之細胞生長來選擇經編碼可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白、野生型DHFR蛋白質及另一種可選標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))轉型或共轉型之宿主細胞(尤其含有內源性DHFR之野生型宿主)。參見美國專利案第4,965,199號。宿主細胞可包括NS0，包括麩醯胺酸合成酶(GS)缺失型細胞株。使用GS作為哺乳動物細胞之可選標記物之方法描述於美國專利案第5,122,464號及美國專利案第5,891,693號中。 d) 啟動子組分
表現及選殖載體通常含有啟動子，其由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼相關可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之核酸。已知真核生物之啟動子序列。舉例而言，幾乎所有的真核基因皆具有富含AT之區域，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因之轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一個序列為CNCAAT區域，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'端處係AATAAA序列，其可為將聚A尾區添加至編碼序列之3'端之信號。在某些實施例中，任何或全部此等序列可適當地***真核表現載體中。
可控制哺乳動物宿主細胞中自載體之轉錄，例如藉由自以下獲得之啟動子實現：病毒之基因組，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40 (SV40)；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，限制條件為此類啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子宜以HindIII E限制性片段形式獲得。用於在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體表現DNA之系統揭示於美國專利案第4,419,446號中。此系統之修改描述於美國專利案第4,601,978號中。亦參見Reyes等人, Nature 297:598-601 (1982)，其描述在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子之控制下，在鼠類細胞中人類β-干擾素cDNA之表現。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。 e) 強化子元件組分
編碼本發明之抗體之DNA由高級真核生物進行的轉錄通常藉由將強化子序列***載體中來增加。現已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之許多強化子序列。然而，通常將使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製源之晚期側(bp 100-270)上之SV40強化子、人類細胞巨大病毒早期啟動子強化子、鼠類細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製源之晚期側上之多瘤病毒強化子及腺病毒強化子。亦參見Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)，其描述用於真核啟動子之活化之強化子元件。強化子可在抗體多肽編碼序列之5'或3'位置剪接至載體中，但通常位於相對於啟動子之5'位點。 f) 轉錄終止組分
真核宿主細胞中所使用之表現載體亦可含有轉錄終止及使mRNA穩定所需之序列。此類序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'未轉譯區。此等區域在編碼抗體之mRNA的未轉譯部分中含有以聚腺苷酸化片段形式轉錄之核苷酸區段。一種適用的轉錄終止組分係牛生長激素聚腺苷酸化區域。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。 g) 宿主細胞之選擇及轉型
本文中適用於在載體中選殖或表現DNA之宿主細胞包括本文中所描述之高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已變成常規程序。適用的哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎臟CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(293或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；鼠類塞特利氏細胞(murine sertoli cell)(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；鼠類***腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
宿主細胞經用於可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白產生之上述表現或選殖載體轉型且在適當時經改良之習知營養物培養基中培養，以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。 h) 培養宿主細胞
用於產生本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之宿主細胞可在多種培養基中培養。市售培養基(諸如Ham's F10 (Sigma)、最小必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜貝克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM，Sigma))適用於培養宿主細胞。此外，可使用以下文獻中描述之培養基中之任一者作為宿主細胞之培養基：Ham等人, Meth. Enz. 58:44 (1979)；Barnes等人, Anal. Biochem. 102:255 (1980)；美國專利案第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利復審案30,985。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量源。亦可以熟習此項技術者已知之適合的濃度包括任何其他補充劑。培養條件(諸如溫度、pH值及類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。 i) 結合蛋白之純化
當使用重組技術時，可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白可在細胞內產生或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步驟，可例如藉由離心或超濾來移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。在可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白分泌至培養基中之情況下，可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析係便利的技術。蛋白質A作為親和配位體之適合性視抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983))。建議將蛋白質G用於所有鼠類同型及人類γ3 (Guss等人, EMBO J. 5:15671575 (1986))。與親和配位體連接之基質可為瓊脂糖，但可使用其他基質。與瓊脂糖可實現的相比，機械穩定基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)實現更快的流動速率及更短的處理時間。在抗體包含CH3域之情況下，Bakerbond ABX™樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可使用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSE™層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後，包含相關經掩蔽之結合蛋白及污染物之混合物可經歷進一步純化，例如藉由在低鹽濃度(例如約0-0.25 M鹽)下進行之使用pH值在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液之低pH值疏水性相互作用層析。
通常，用於製備用於研究、測試及臨床用途之抗體之各種方法係在此項技術中公認、符合上述方法及/或被熟習此項技術者視為適用於特定相關抗體。 IV.     組合物
在一些態樣中，本文中亦提供組合物(例如醫藥組合物)，其包含本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白中之任一者。
藉由混合具有所需純度之活性成分與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑來製備用於儲存之治療性調配物(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott Williams & Wiklins出版, Gennaro編, Philadelphia, Pa. 2000)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝液、抗氧化劑(包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑、等張劑(例如氯化鈉)、穩定劑、金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；螯合劑，諸如EDTA及/或非離子性界面活性劑。
緩衝液可用於將pH值控制在最佳化治療有效性之範圍內，尤其在穩定性為pH值依賴性之情況下。緩衝液可以約20 mM至約250 mM範圍內之濃度存在。適用於本發明之緩衝劑包括有機酸及無機酸以及其鹽。舉例而言，檸檬酸鹽、磷酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。此外，緩衝液可包含組胺酸及三甲胺鹽，諸如Tris。
可添加防腐劑以防止微生物生長，且通常以約0.2%-1.0% (w/v)之範圍存在。適用於本發明之防腐劑包括十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯甲烴銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨；硫柳汞、酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇、3-戊醇及間甲酚。
可存在張力劑(有時稱為「穩定劑」)以調節或維持液體在組合物中之張力。當與大型帶電生物分子(諸如蛋白質及抗體)一起使用時，其通常稱為「穩定劑」，因為其可與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，藉此減小分子間及分子內相互作用之可能性。考慮其他成分之相對量，張力劑可以約0.1重量%至約25重量%之間或約1至約5重量%之間的任何量存在。在一些實施例中，張力劑包括多羥基糖醇、三元醇或高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇。
其他賦形劑包括可充當以下中之一或多者之試劑：(1)膨化劑，(2)溶解性增強劑，(3)穩定劑，及(4)防止變性或黏著至容器壁之試劑。此類賦形劑包括：多羥基糖醇(上文所列舉)；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-***酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或聚葡萄糖。
可存在非離子性界面活性劑或洗滌劑(亦稱為「濕潤劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質避免攪拌誘導之聚集，其亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不引起活性治療性蛋白質或抗體之變性。非離子性界面活性劑係以約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml或約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍存在。在一些實施例中，非離子性界面活性劑係以約0.001%至約0.1% w/v或約0.01%至約0.1% w/v或約0.01%至約0.025% w/v之範圍存在。
適合的非離子性界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、聚氧化物(polyoxamer)(184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50及60、甘油單硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧基甲基纖維素。可使用之陰離子性洗滌劑包括月桂基硫酸鈉、二辛基磺基丁二酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子性洗滌劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了使調配物可用於活體內投藥，其必須為無菌的。可藉由經無菌過濾膜過濾而使調配物為無菌的。本文中之治療性組合物通常置放於具有無菌存取口之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子之靜脈內溶液袋或瓶。
投藥途徑係根據已知及可接受之方法，諸如藉由以適合的方式在長時段內之單次或多次快速注射或輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑之注射或輸注，局部投藥，吸入或藉由持續釋放或緩釋方法。
本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)可單獨或與其他治療劑組合使用，諸如在本文中所描述之方法中。術語「組合」涵蓋包括於同一或獨立調配物中之兩種或更多種治療劑(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白及治療劑)。在一些實施例中，「組合」係指「同時」投藥，在此情況下，本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之投藥與一或多種其他治療劑之投藥同時進行(例如在相同時間或可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之投藥與一或多種其他治療劑之投藥之間的間隔在一小時內)。在一些實施例中，「組合」係指依序投藥，在此情況下，本發明之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之投藥在一或多種其他治療劑之投藥之前及/或之後進行(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白之投藥與一或多種其他治療劑之投藥之間的間隔大於一小時)。本文中涵蓋之藥劑包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞介素、靶向免疫檢查點分子之藥劑、靶向免疫刺激分子之藥劑或生長抑制劑。
本文中之調配物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所必需之活性化合物，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性化合物。或者或另外，組合物可包含細胞毒性劑、細胞介素、靶向免疫檢查點分子或刺激分子之藥劑，或生長抑制劑。此類分子宜以有效達成所欲目的之量的組合存在。V. 治療方法
本文中提供用於治療或預防個體中之疾病之方法，其包含向個體投與有效量之本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)或其組合物。在一些實施例中，個體(例如人類患者)已診斷患有贅瘤性病症(例如癌症)或具有產生此類病症之風險。
對於疾病之預防或治療，如上文所定義，活性劑之適當劑量將視所治療之疾病之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與藥劑以用於預防性或治療性目的、先前療法、個體之臨床病史及對藥劑之反應以及主治醫師之判斷而定。宜一次性或經一系列治療向個體投與藥劑。在本文中所描述之方法之一些實施例中，所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)之投藥之間的間隔為約一個月或更長時間。在一些實施例中，投藥之間的間隔為約兩個月、約三個月、約四個月、約五個月、約六個月或更長時間。如本文中所使用，投藥之間的間隔係指一次抗體投藥與下一次抗體投藥之間的時間段。如本文中所使用，約一個月之間隔包括四週。在一些實施例中，投藥之間的間隔為約兩週、約三週、約四週、約八週、約十二週、約十六週、約二十週、約二十四週或更長時間。在一些實施例中，治療包括抗體之多次投藥，其中投藥之間的間隔可不同。舉例而言，第一次投藥與第二次投藥之間的間隔為約一個月，且後續投藥之間的間隔為約三個月。在一些實施例中，第一次投藥與第二次投藥之間的間隔為約一個月，第二次投藥與第三次投藥之間的間隔為約兩個月，且後續投藥之間的間隔為約三個月。在一些實施例中，本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)係以均一劑量投與。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之抗體可為用於投與患者之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次獨立投藥或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一種典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更大之範圍內。對於經數日或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療通常將持續至發生疾病症狀之所需抑制為止。抗體之一種例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。在一些實施例中，以每次給藥約25 mg至約500 mg之劑量向個體投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。在一些實施例中，以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或約1.0 mg/kg至約10 mg/kg之劑量向個體投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。以約0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg或10.0 mg/kg中之任一者之劑量向個體投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。在一些實施例中，以0.1 mg/kg與10 mg/kg之間或約0.1 mg/kg與10 mg/kg之間、10 mg/kg與20 mg/kg之間或約10 mg/kg與20 mg/kg之間、20 mg/kg與30 mg/kg之間或約20 mg/kg與30 mg/kg之間、30 mg/kg與40 mg/kg之間或約30 mg/kg與40 mg/kg之間、40 mg/kg與50 mg/kg之間或約40 mg/kg與50 mg/kg之間、50 mg/kg與60 mg/kg之間或約50 mg/kg與60 mg/kg之間、60 mg/kg與70 mg/kg之間或約60 mg/kg與70 mg/kg之間、70 mg/kg與80 mg/kg之間或約70 mg/kg與80 mg/kg之間的劑量向個體投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。可使用上文所描述之給藥頻率中之任一者。
本文中涵蓋之治療方法為用本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)治療病症或疾病。可用本發明之調配物治療之病症或疾病包括白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、***癌、胰臟癌、黑素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌(例如梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma))或睪丸癌。
在一些實施例中，本文中提供一種藉由投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)來治療或預防癌症之方法。如本文中所使用，術語「癌症」係指在哺乳動物中發現之所有類型之癌症、贅瘤或惡性腫瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神經內分泌腫瘤、癌瘤及肉瘤。可用本文中提供之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)、醫藥組合物或方法治療之例示性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、甲狀腺癌、白血病、***癌、乳癌(例如三陰性、ER陽性、ER陰性、化學療法抗性、賀癌平(Herceptin)抗性、HER2陽性、小紅莓(doxorubicin)抗性、他莫昔芬(tamoxifen)抗性、導管癌、小葉癌、原發性、轉移性)、卵巢癌、胰臟癌、肝癌(例如肝細胞癌)、肺癌(例如非小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌、腺癌、大細胞肺癌瘤、小細胞肺癌瘤、類癌、肉瘤)、多形性神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、黑素瘤、***癌、去勢抵抗性***癌、乳癌、三陰性乳癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肺癌、鱗狀細胞癌(例如頭部、頸部或食道)、結腸直腸癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤或多發性骨髓瘤。其他實例包括甲狀腺、內分泌系統、腦部、***、子宮頸、結腸、頭部及頸部、食道、肝臟、腎臟、肺、非小細胞肺、黑素瘤、間皮瘤、卵巢、肉瘤、胃、子宮之癌症，或神經管胚細胞瘤(Medulloblastoma)、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、多形性神經膠母細胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多、原發性巨球蛋白血症、原發性腦瘤、癌症、惡性胰島瘤、惡性類癌、膀胱癌、惡化前皮膚病灶、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、子宮內膜癌、腎上腺皮層癌、內分泌或外分泌胰臟之贅瘤、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺髓樣癌瘤、黑素瘤、結腸直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、肝細胞癌、乳頭之佩吉特氏病(Paget's Disease)、葉狀腫瘤、小葉癌、導管癌、胰臟星形細胞癌、肝星形細胞癌或***癌。
在一些實施例中，本文中提供一種藉由投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)來治療或預防白血病之方法。術語「白血病」廣泛地指造血器官之進行性、惡性疾病，且通常特徵為血液及骨髓中之白血球及其前驅體之畸變增殖及發育。白血病通常基於以下在臨床上分類(1)疾病之持續時間及特徵-急性或慢性；(2)所涉及之細胞類型；骨髓(骨髓性)、淋巴(淋巴生成)或單核細胞性；及(3)血液中之異常細胞數目之增加或不增加-白血病或白血球缺乏(亞白血性)。可用本文中提供之化合物、醫藥組合物或方法治療之例示性白血病包括例如急性非淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性前髓細胞性白血病、成年人T細胞白血病、白血球缺乏性白血病、白血球性白血病、嗜鹼性白血病、母細胞白血病、牛白血病、慢性骨髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚胎白血病、嗜伊紅血球性白血病、格羅斯白血病(Gross' leukemia)、毛細胞白血病、血母細胞白血病、血胚細胞白血病、組織細胞白血病、幹細胞白血病、急性單核細胞性白血病、白血球減少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母細胞白血病、淋巴球性白血病、淋巴生成白血病、淋巴白血病、淋巴肉瘤細胞白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞白血病、微骨髓母細胞白血病、單核細胞性白血病、骨髓母細胞白血病、骨髓細胞性白血病、骨髓粒細胞性白血病、骨髓單核細胞性白血病、內格利白血病(Naegeli leukemia)、漿細胞白血病、多發性骨髓瘤、漿球性白血病、前髓細胞性白血病、里德爾細胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling's leukemia)、幹細胞白血病、亞白血性白血病或未分化細胞白血病。
在一些實施例中，本文中提供一種藉由投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)來治療或預防肉瘤之方法。術語「肉瘤」通常係指由如胚胎結締組織之物質組成且通常由包埋於纖維狀或均質物質中之緊實細胞構成之腫瘤。可用本文中提供之化合物、醫藥組合物或方法治療之肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、軟組織肺泡狀肉瘤、成釉細胞肉瘤、葡萄樣肉瘤、綠色瘤肉瘤、絨膜癌瘤、胚胎肉瘤、威耳姆氏腫瘤肉瘤(Wilms' tumor sarcoma)、子宮內膜肉瘤、基質肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纖維母細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、粒細胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特發性多發性色素沉著出血性肉瘤、B細胞之免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞之免疫母細胞肉瘤、詹恩遜氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、庫普弗細胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間質瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞斯肉瘤(Rous sarcoma)、漿液囊性肉瘤、滑膜肉瘤或毛細管擴張性肉瘤。
在一些實施例中，本文中提供一種藉由投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)來治療或預防黑素瘤之方法。術語「黑素瘤」用於意謂由皮膚及其他器官之黑色素細胞系統引起之腫瘤。可用本文中提供之化合物、醫藥組合物或方法治療之黑素瘤包括例如肢端-雀斑黑素瘤、無黑色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克勞德曼黑素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑素瘤、哈帕二氏黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、惡性黑色素瘤、結節性黑素瘤、陰囊黑素瘤或淺表擴散性黑素瘤。
在一些實施例中，本文中提供一種藉由投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)來治療或預防癌瘤之方法。術語「癌瘤」係指由傾向於浸潤周圍組織及引起癌轉移之上皮細胞組成之惡性新生長物。可用本文中提供之化合物、醫藥組合物或方法治療之例示性癌瘤包括例如甲狀腺髓樣癌、家族性甲狀腺髓樣癌、腺泡癌瘤、腺泡狀癌瘤、腺囊癌瘤、腺樣囊性癌症、癌瘤腺瘤、腎上腺皮質之癌瘤、肺泡癌瘤、肺泡細胞癌瘤、基底細胞癌、基底樣細胞癌、基底樣癌瘤、基底鱗狀細胞癌瘤、細支氣管肺泡癌、細支氣管癌瘤、支氣管癌、腦狀癌瘤、膽管細胞癌瘤、絨毛膜癌瘤、膠體癌瘤、粉刺癌瘤、子宮體癌瘤、篩骨狀癌瘤、鎧甲狀癌、皮狀癌瘤、圓柱形癌瘤、圓柱形細胞癌瘤、導管癌、導管樣癌、硬癌、胚胎性癌、腦樣癌瘤、表皮樣癌、腺狀上皮癌、外生性癌瘤、潰瘍性癌、纖維癌瘤、膠狀癌、膠體癌、巨大細胞癌、巨細胞癌、腺癌瘤、粒層細胞癌瘤、毛髮基質癌瘤、血樣癌瘤、肝細胞癌、何氏細胞癌瘤(Hurthle cell carcinoma)、透明癌瘤、腎上腺樣癌瘤、嬰兒胚胎性癌、原位癌、表皮內癌瘤、上皮內癌瘤、侵蝕性潰瘍(Krompecher's carcinoma)、庫爾契茨基細胞癌瘤(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細胞癌瘤、豆狀癌(lenticular carcinoma)、豆狀癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤樣癌瘤、小葉癌、淋巴上皮癌瘤、髓樣癌瘤、髓性癌、黑色素癌瘤、髓樣癌、黏液性癌瘤、黏液癌、黏液細胞癌、黏液表皮樣癌瘤、黏膜癌、黏液癌瘤、黏液瘤樣癌瘤、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌瘤、骨樣癌瘤、乳頭狀癌、門脈周性癌瘤、原位癌、棘細胞癌瘤、腦樣癌、腎臟之腎細胞癌、儲備細胞癌瘤、肉瘤樣癌瘤、施耐德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、陰囊癌、印戒細胞癌瘤、單純形癌瘤、小細胞癌瘤、馬鈴薯狀癌瘤、類似球形細胞癌瘤、梭狀細胞癌瘤、髓狀癌瘤、鱗狀癌瘤、鱗狀細胞癌、繩捆癌、毛細管擴張癌、血管擴張性癌瘤、移行細胞癌、塊狀癌、管狀癌、結節性癌、疣狀癌或絨毛狀癌。
在一些實施例中，本文中提供一種藉由投與本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)來治療或預防轉移性癌症之方法。如本文所使用，術語「轉移」、「轉移性」及「轉移性癌症」可互換地使用且係指贅瘤性疾病或病症(例如癌症)自一個器官擴散至另一個不相鄰的器官或身體部分。癌症在起始位點(例如***)處發生，此位點稱為原發性腫瘤，例如原發性乳癌。原發性腫瘤或起始位點中之一些癌細胞獲取滲透及浸潤局部區域中之周圍正常組織之能力及/或滲透淋巴系統或血管系統之障壁之能力，經由該系統循環至身體內之其他位點及組織。由原發性腫瘤之癌細胞形成之繼發性臨床可偵測腫瘤稱為轉移性或繼發性腫瘤。當癌細胞轉移時，假設轉移性腫瘤及其細胞與原始腫瘤之細胞類似。因此，若肺癌轉移至***，則***位點處之繼發性腫瘤由異常肺細胞及非異常***細胞組成。***中之繼發性腫瘤稱為轉移性肺癌。因此，片語轉移性癌症係指其中個體具有或曾經具有原發性腫瘤且具有一或多種繼發性腫瘤之疾病。片語非轉移性癌症或患有非轉移性癌症之個體係指其中個體具有原發性腫瘤，但不具有一或多種繼發性腫瘤之疾病。舉例而言，轉移性肺癌係指其中個體具有原發性肺腫瘤或具有原發性肺腫瘤之病史且在第二位置或多個位置(例如在***中)具有一或多種繼發性腫瘤之疾病。
在一些實施例中，可自本文中所描述之經掩蔽之CTLA4結合蛋白獲益之疾病或病症包括由CTLA4或CTLA4活性或功能引起(完全或部分)之疾病(例如糖尿病、癌症(例如***癌、腎癌、轉移性癌症、黑素瘤、去勢抵抗性***癌、乳癌、三陰性乳癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肺癌、鱗狀細胞癌(例如頭部、頸部或食道)、結腸直腸癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤或多發性骨髓瘤))或由CTLA4或CTLA4活性或功能引起(完全或部分)之疾病之症狀。 VI.     製品或套組
在另一態樣中，提供一種製品或套組，其包含本文中所描述之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。製品或套組可進一步包含結合蛋白在本發明之方法中之使用說明書。因此，在某些實施例中，製品或套組包含在用於治療或預防個體中之病症(例如癌症)之方法中使用可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)之說明，其包含向個體投與有效量之可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。在某些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體患有選自由以下組成之群之疾病：白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、***癌、胰臟癌、黑素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌或睪丸癌。
製品或套組可進一步包含容器。適合的容器包括例如瓶子、小瓶(例如雙腔室小瓶)、注射器(諸如單腔室注射器或雙腔室注射器)及試管。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器保存調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。
製品或套組可進一步包含位於容器上或與容器相關聯之標籤或藥品說明書，其可指示復原及/或使用調配物之指導。標籤或藥品說明書可進一步指示調配物適用於或意欲用於皮下、靜脈內或其他投藥模式，以用於治療或預防個體中之病症(例如癌症)。保存調配物之容器可為單次使用型小瓶或多次使用型小瓶，其允許重複投與經復原之調配物。製品或套組可進一步包含第二容器，其包含適合的稀釋劑。製品或套組可進一步包括自商業、治療性及使用者觀點來看所需之其他材料，包括具有使用說明書之其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及藥品說明書。
在特定實施例中，本發明提供用於單次給藥型投藥單元之套組。此類套組包含治療性抗體之水性調配物之容器，包括單腔室或多腔室預填充注射器。例示性預填充注射器可自Vetter GmbH, Ravensburg, Germany獲得。
本文中，製品或套組視情況進一步包含有包含第二藥劑之容器，其中可活化的經掩蔽之抗CTLA4結合蛋白(例如可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)為第一藥劑，且該製品或套組進一步包含標籤或藥品說明書上之用於以有效量之第二藥劑治療個體之說明。
在另一實施例中，本文中提供一種製品或套組，其包含用於在自動注射器裝置中投與之本文中所描述之調配物。自動注射器可描述為注射裝置，其在啟動後將在無來自患者或投與者之其他必需操作之情況下遞送其內含物。其在遞送率必須恆定且遞送時間需要持續一段時間時尤其適用於治療性調配物之自行用藥。 例示性實施例
所提供之例示性實施例包括： 1.     一種經掩蔽之抗體，其包含： a)     抗體或其抗原結合片段，其結合於CTLA4，其中該抗體或其抗原結合片段包含第一鏈及第二鏈，及 b)     掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列， 其中，該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該抗體或其抗原結合片段之第一鏈或第二鏈之胺基端或羧基端。 2.     如實施例1之經掩蔽之抗體，其中 a)     該第一鏈為輕鏈；及 b)     該第二鏈為重鏈。 3.     如實施例1或2之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含兩個第一鏈及兩個第二鏈。 4.     如實施例1之經掩蔽之抗體，其中 a) 該第一鏈為輕鏈可變域；及 b) 該第二鏈為重鏈可變域。 5.     如實施例1至4中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗原結合片段為dAb、Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2 片段。 6.     如實施例1至5中任一項之經掩蔽之抗體，其中該掩蔽肽之胺基端或羧基端連接至包含可裂解肽之連接子。 7.     如實施例1至6中任一項之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含： a) 第一間隔連接子及可裂解肽；或 b) 第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子。 8.     如實施例1至7中任一項之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。 9.     如實施例1至8中任一項之經掩蔽之抗體，其中： a) 該第一間隔連接子直接連接至該可裂解肽之N端及/或C端；或 b) 該第一間隔連接子直接連接至該可裂解肽之N端，且該第二間隔連接子直接連接至該可裂解肽之C端。 10.   如實施例7至9中任一項之經掩蔽之抗體，其中該第一間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列；及/或該第二間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。 11.   如實施例1至10中任一項之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。 12.   如實施例1至10中任一項之經掩蔽之抗體，其中至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至該掩蔽肽之N端。 13.   如實施例12之經掩蔽之抗體，其中該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。 14.   如實施例1至13中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體以N至C端或C至N端方向包含：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；及c)結合CTLA4之抗體或其抗原結合片段之第一鏈或第二鏈。 15.   如實施例14之經掩蔽之抗體，其中 a)     該經掩蔽之抗體包含該掩蔽肽與該可裂解肽之間的間隔連接子；及 b)     該經掩蔽之抗體包含該可裂解肽與該結合於CTLA4之抗體或其抗原結合片段之間的間隔連接子。 16.   如實施例1至15中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。 17.   如實施例1至16中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段為鼠類抗體。 18.   如實施例1至16中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。 19.   如實施例1至18中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。 20.   如實施例19之經掩蔽之抗體，其中該IgG1包含以下胺基酸取代： a)     S298A、E333A及K334A； b)     S239D及I332E； c)     S239D、A330L及I332E； d)     P247I及A339D或A339Q； e)     D280H、K290S (具有或不具有S298D或S298V)； f)     F243L、R292P及Y300L； g)     F243L、R292P、Y300L及P396L； h)     F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L； i)     G236A、S239D及I332E； j)     K326A及E333A； k)     K326W及E333S；或 l)     K290E或K290N、S298G、T299A及/或K326E； 其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。 21.   如實施例1至20中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中： a) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。 22.   如實施例1至21中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列之重鏈可變區。 23.   如實施例22之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含有包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列之重鏈。 24.   如實施例1至21中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含： a) 包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之重鏈可變區；或 b) 包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之重鏈可變區。 25.   如實施例24之經掩蔽之抗體，其中該抗體包含有包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列之重鏈。 26.   如實施例24或實施例25之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈；或該抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:478之胺基酸序列之重鏈。 27.   如實施例1至26中任一項之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。 28.   如實施例1至27中任一項之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽係由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。 29.   如實施例28之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽係由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。 30.   如實施例1至29中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。 31.   如實施例1至30中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段與藥劑結合。 32.   如實施例31之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為微管蛋白聚合抑制劑、DNA損傷劑或DNA合成抑制劑。 33.   如實施例32之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為類美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素、倍癌黴素、吲哚啉苯并二氮呯二聚體或依昔替康衍生物Dxd。 34.   一種經掩蔽之雙特異性抗體，其包含 a)     特異性結合於CTLA4之第一對之輕鏈及重鏈； b)     特異性結合於抗原之第二對之輕鏈及重鏈；及 c)     掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列， 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該第一對之輕鏈或重鏈之胺基端或羧基端。 35.   如實施例34之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該掩蔽肽之胺基端或羧基端連接至包含可裂解肽之連接子。 36.   如實施例34或35之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含： a) 第一間隔連接子及可裂解肽；或 b) 第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子。 37.   如實施例34至36中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。 38.   如實施例36或實施例37之經掩蔽之雙特異性抗體，其中： a) 該第一間隔連接子直接連接至該可裂解肽之N端或C端；或 b) 該第一間隔連接子直接連接至該可裂解肽之N端，且該第二間隔連接子直接連接至該可裂解肽之C端。 39.   如實施例36至38中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列；及/或該第二間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。 40.   如實施例34至39中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。 41.   如實施例34至40中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至該掩蔽肽之N端。 42.   如實施例41之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。 43.   如實施例34至42中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對之輕鏈或重鏈以N至C端或C至N端方向包含：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；及c)輕鏈或重鏈。 44.   如實施例43之經掩蔽之雙特異性抗體，其中 a)     該第一對包含該掩蔽肽與該可裂解肽之間的間隔連接子；及 b)     該第一對包含該可裂解肽與該輕鏈或該重鏈之間的間隔連接子。 45.   如實施例34至44中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。 46.   如實施例34至45中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體為鼠類抗體。 47.   如實施例34至45中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。 48.   如實施例34至47中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。 49.   如實施例48之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該IgG1包含以下胺基酸取代： a)     S298A、E333A及K334A； b)     S239D及I332E； c)     S239D、A330L及I332E； d)     P247I及A339D或A339Q； e)     D280H、K290S (具有或不具有S298D或S298V)； f)     F243L、R292P及Y300L； g)     F243L、R292P、Y300L及P396L； h)     F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L； i)     G236A、S239D及I332E； j)     K326A及E333A； k)     K326W及E333S；或 l)     K290E或K290N、S298G、T299A及/或K326E， 其中胺基酸殘基係根據如Kabat中之EU索引編號。 50.   如實施例34至49中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中： a) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該輕鏈可變區包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。 51.   如實施例34至50中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對包含有包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列之重鏈可變區。 52.   如實施例51之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對包含有包含選自SEQ ID NO:237-318之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:319或320之胺基酸序列之重鏈。 53.   如實施例34至50中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對包含： a) 包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之重鏈可變區；或 b) 包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之輕鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之重鏈可變區。 54.   如實施例53之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對包含有包含選自SEQ ID NO:327-341之胺基酸序列之輕鏈；及/或包含選自SEQ ID NO:366-380、421及478之胺基酸序列之重鏈。 55.   如實施例53或實施例54之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈；或該第一對包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之輕鏈，及包含SEQ ID NO:478之胺基酸序列之重鏈。 56.   如實施例34至55中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。 57.   如實施例34至56中任一項之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽係由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。 58.   如實施例57之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該可裂解肽係由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。 59.   如實施例34至58中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。 60.   如實施例34至59中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體與藥劑結合。 61.   如實施例60之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為微管蛋白聚合抑制劑、DNA損傷劑或DNA合成抑制劑。 62.   如實施例60之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為類美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素、倍癌黴素、吲哚啉苯并二氮呯二聚體或依昔替康衍生物Dxd。 63.   一種經掩蔽之嵌合受體，其包含： a)     結合於CTLA4之配位體結合域，其包含第一鏈及第二鏈； b)     掩蔽肽，其包含選自SEQ ID NO:1-46之胺基酸序列， c)     跨膜域；及 d)     細胞內信號傳導域，其包含信號傳導域，其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該配位體結合域之第一鏈或第二鏈之胺基端或羧基端。 64.   如實施例63之經掩蔽之嵌合受體，其中 a)     該第一鏈為輕鏈可變域；及 b)     該第二鏈為重鏈可變域。 65.   如實施例63或64之經掩蔽之嵌合受體，其中該掩蔽肽之胺基端或羧基端連接至包含可裂解肽之連接子。 66.   如實施例63至65中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該包含可裂解肽之連接子包含： a) 第一間隔連接子及可裂解肽；或 b) 第一間隔連接子、可裂解肽及第二間隔連接子。 67.   如實施例63至66中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該可裂解肽包含選自SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508之胺基酸序列。 68.   如實施例66或實施例67之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該第一間隔連接子直接連接至該可裂解肽之N端或C端；或 b) 該第一間隔連接子直接連接至該可裂解肽之N端，且該第二間隔連接子直接連接至該可裂解肽之C端。 69.   如實施例68之經掩蔽之嵌合受體，其中該第一間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列；及/或該第二間隔連接子包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。 70.   如實施例63至69中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。 71.   如實施例63至70中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中至少一個胺基酸但不超過20個胺基酸直接連接至掩蔽肽之N端。 72.   如實施例71之經掩蔽之嵌合受體，其中該至少一個胺基酸為丙胺酸(A)或甘胺酸-丙胺酸(GA)。 73.   如實施例63至72中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該配位體結合域之第一鏈或第二鏈以N至C端或C至N端方向包含：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；及c)第一鏈或第二鏈。 74.   如實施例73之經掩蔽之嵌合受體，其中 a)     該配位體結合域包含該掩蔽肽與該可裂解肽之間的間隔連接子；及 b)     該配位體結合域包含該可裂解肽與該第一鏈或第二鏈之間的間隔連接子。 75.   如實施例63至74中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該經掩蔽之嵌合受體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。 76.   如實施例63至75中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或其中該第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或其中該第二鏈包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該第一鏈包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或其中該重鏈可變區包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。 77.   如實施例63至76中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該第一鏈包含SEQ ID NO:232之胺基酸序列；及/或該第二鏈包含SEQ ID NO:233之胺基酸序列。 78.   如實施例63至76中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該第一鏈包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列；及/或該第二鏈包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該第一鏈包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列；及/或該第二鏈包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 79.   如實施例63至78中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該可裂解肽為蛋白酶之受質，該蛋白酶與表現CTLA4之細胞或組織共同位於一個區域中。 80.   如實施例63至79中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該可裂解肽係由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1及TPSG1。 81.   如實施例80之經掩蔽之嵌合受體，其中該可裂解肽係由選自由以下組成之群之一或多種酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC及HTRA3。 82.   一種核酸，其編碼如實施例1至33、100至112及139至148中任一項之經掩蔽之抗體，如實施例34至62及113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例63至82及122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體。 83.   一種載體，其包含如實施例82之核酸。 84.   如實施例83之載體，其為表現載體。 85.   一種宿主細胞，其包含如實施例82之核酸。 86.   一種用於製備經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體之方法，其包含在產生該經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體之條件下培養如實施例85之宿主細胞。 87.   如實施例86之方法，其中該宿主細胞具有α1,6-海藻糖基轉移酶(Fut8)剔除。 88.   如實施例86或87之方法，其中該宿主細胞過表現β1,4-N-乙醯基糖胺多糖基轉移酶III (GnT-III)。 89.   如實施例88之方法，其中該宿主細胞亦過表現高爾基體μ-甘露糖苷酶II (ManII)。 90.   如實施例86至89中任一項之方法，其進一步包含回收由該宿主細胞產生之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。 91.   一種經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體，其係藉由如實施例86至90中任一項之方法產生。 92.   一種組合物，其包含如實施例1至33、100至112及139至148中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例34至62及113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，或如實施例63至82及122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體。 93.   一種組合物，其包含如實施例91之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體。 94.   一種醫藥組合物，其包含如實施例1至33、100至112及139至148中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例34至62及113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例63至82及122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體，及醫藥學上可接受之載劑。 95.   一種醫藥組合物，其包含如實施例91之經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體，及醫藥學上可接受之載劑。 96.   一種套組，其包含如實施例1至33、100至112及139至148中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例34至62及113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體、如實施例63至82及122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體，或如實施例92至95中任一項之組合物。 97.   一種治療或預防個體中之贅瘤性疾病之方法，該方法其包含向個體投與有效量之如實施例1至33、100至112及139至148中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例34至62及113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體、如實施例63至82及122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體，或如實施例92至95中任一項之組合物。 98.   如實施例97之方法，其中該贅瘤性疾病為癌症。 99.   如實施例98之方法，其中該癌症為白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、***癌、胰臟癌、黑素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌或睪丸癌。 100.  一種經掩蔽之抗體，其包含： a) 抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域；及 b) 掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列； 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域或該VH域之胺基端或羧基端。 101.  如實施例100之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。 102.  如實施例100或101之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽包含胺基端及羧基端，且該包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子及第二間隔連接子，其中該第一間隔連接子連接至該可裂解肽之胺基端且包含選自由SEQ ID NO:89至112及415至420組成之群之胺基酸序列，且該第二間隔連接子連接至該可裂解肽之羧基端且包含選自由SEQ ID NO:89至112及415-420組成之群之胺基酸序列。 103.  如實施例100至102中任一項之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。 104.  如實施例100至103中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。 105.  如實施例100至104中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。 106.  如實施例100至105中任一項之經掩蔽之抗體，其中： a) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。 107.  如實施例100至106中任一項之經掩蔽之抗體，其中： a) 該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 108.  如實施例100至107中任一項之經掩蔽之抗體，其中該VL域包含於輕鏈內，該輕鏈包含選自由SEQ ID NO:327-341組成之群之胺基酸序列，且該VH域包含於重鏈內，該重鏈包含選自由SEQ ID NO:366-380、421及478組成之群之胺基酸序列。 109.  如實施例100至108中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。 110.  如實施例100至109中任一項之經掩蔽之抗體，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段與藥劑結合。 111.  如實施例110之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為微管蛋白聚合抑制劑、DNA損傷劑或DNA合成抑制劑。 112.  如實施例110之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為類美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素、倍癌黴素、吲哚啉苯并二氮呯二聚體或依昔替康衍生物Dxd。 113.  一種經掩蔽之雙特異性抗體，其包含： a) 特異性結合於CTLA4之第一對之輕鏈及重鏈； b) 特異性結合於抗原之第二對之輕鏈及重鏈；及 c) 掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列， 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該第一對之輕鏈或重鏈之胺基端或羧基端。 114.  如實施例113之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。 115.  如實施例113或114之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該可裂解肽包含胺基端及羧基端，且該包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子及第二間隔連接子，其中該第一間隔連接子連接至該可裂解肽之胺基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列，且該第二間隔連接子連接至該可裂解肽之羧基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。 116.  如實施例113至115中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。 117.  如實施例113至116中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。 118.  如實施例113至117中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對之輕鏈包含VL域，且該第一對之重鏈包含VH域，其中： a) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。 119.  如實施例113至118中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中： a) 該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 120.  如實施例113至119中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對之輕鏈包含選自由SEQ ID NO:327-341組成之群之胺基酸序列，且該第一對之重鏈包含選自由SEQ ID NO:366-380、421及478組成之群之胺基酸序列。 121.  如實施例113至120中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。 122.  一種經掩蔽之嵌合受體，其包含： a) 結合於CTLA4之配位體結合域，其包含VL域及VH域； b) 掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列； c) 跨膜域；及 d) 細胞內信號傳導域，其包含信號傳導域， 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域或該VH域之胺基端或羧基端。 123.  如實施例122之經掩蔽之嵌合受體，其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。 124.  如實施例122或123之經掩蔽之嵌合受體，其中該可裂解肽包含胺基端及羧基端，且該包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子及第二間隔連接子，其中該第一間隔連接子連接至該可裂解肽之胺基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列，且該第二間隔連接子連接至該可裂解肽之羧基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。 125.  如實施例122至124中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。 126.  如實施例122至125中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中該經掩蔽之嵌合受體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。 127.  如實施例122至126中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。 128.  如實施例122至127中任一項之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 129.  一種核酸，其編碼如實施例100至112中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體。 130.  一種載體，其包含如實施例129之核酸。 131.  一種宿主細胞，其包含如實施例129之核酸。 132.  一種用於製備經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體之方法，其包含在產生經掩蔽之抗體之條件下培養如實施例131之宿主細胞。 133.  一種經掩蔽之抗體、經掩蔽之雙特異性抗體或經掩蔽之嵌合受體，其係藉由如實施例132之方法產生。 134.  一種組合物，其包含如實施例100至112中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體。 135.  一種醫藥組合物，其包含如實施例100至112中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體，及醫藥學上可接受之載劑。 136.  一種套組，其包含如實施例100至112中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體。 137.  一種用於治療或預防個體中之贅瘤性疾病之方法，該方法包含向個體投與有效量之如實施例100至112中任一項之經掩蔽之抗體、如實施例113至121中任一項之經掩蔽之雙特異性抗體或如實施例122至128中任一項之經掩蔽之嵌合受體。 138.  一種用於治療或預防個體中之贅瘤性疾病之方法，該方法包含向個體投與有效量之如實施例135之醫藥組合物。 139.  一種經掩蔽之抗體，其包含： a) 抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域；及 b) 掩蔽肽，其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列； 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域之胺基端； 其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列； 其中(a)該VL域包含有包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列之CDR-H3；或(b)該VL域包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。 140.  如實施例139之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含SEQ ID NO:454之胺基酸序列。 141.  如實施例139或140之經掩蔽之抗體，其中該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 142.  如實施例139至141中任一項之經掩蔽之抗體，其中該VL域包含於包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈中，且該VH域包含於包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈中。 143.  如實施例139至142中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含SEQ ID NO:358之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。 144.  一種經掩蔽之抗體，其包含： a) 抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域；及 b) 掩蔽肽，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列； 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域之胺基端； 其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列； 其中(a)該VL域包含有包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列之CDR-H3；或(b)該VL域包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。 145.  如實施例144之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含SEQ ID NO:455之胺基酸序列。 146.  如實施例144或145之經掩蔽之抗體，其中該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。 147.  如實施例144至146中任一項之經掩蔽之抗體，其中該VL域包含於包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈中，且該VH域包含於包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈中。 148.  如實施例144至147中任一項之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含SEQ ID NO:422之胺基酸序列，及SEQ ID NO:421之胺基酸序列。 實例
參考以下實例將更充分地理解本發明。然而，其不應解釋為限制本發明之範疇。應理解，本文中所描述之實例及實施例僅用於說明之目的，且根據其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括在本申請案之精神及範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。實例 1 ：製備 可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體
自BioXcell購得抗CTLA4抗體9D9 muIgG2b mAb (9D9 mAb)以用於生物淘選實驗。對於所有其他實驗，在ATUM產生且純化具有針對鼠類CTLA4之反應性的親本抗CTLA4抗體(9D9)、可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)及不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體(不可裂解的經掩蔽之9D9)。
可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體、親本抗CTLA4抗體及不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體係藉由表現質體pD2610-v5使用HEK293短暫表現製備(ATUM，Newark CA)及使用鼠類IgG2a同型藉由基因合成產生(ATUM，Newark CA)。在轉染之後第七天，收集來自經轉染之細胞之上清液且用KanCapA樹脂(Kaneka)純化經掩蔽之抗CTLA4抗體以及親本抗CTLA4抗體，且將緩衝液更換成磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。接著，使用Source S或Capto S ImpAct (GE)藉由離子交換進一步純化抗體。藉由分光光度計在OD280之光學密度下測定抗體濃度。
藉由生物淘選來自噬菌體呈現肽文庫之空間包藏肽來獲得上文所描述之經掩蔽之9D9抗體及不可裂解的經掩蔽之9D抗體中所含之掩蔽肽。首先在ProteinG Magnetic Beads (MB)(Thermo Fisher Scientific)上，在室溫下經30分鐘捕捉9D9 muIgG2b mAb (BioXcell)。在用脫脂乳阻斷9D9 muIgG2b mAb固著之MB之後，添加Ph.D.TM-C7C噬菌體肽文庫(New England BioLabs)以篩檢空間包藏肽。在室溫下培養30分鐘，接著徹底洗滌未結合之噬菌體之後，用0.2 M甘胺酸pH 2.2將結合之噬菌體溶離成pH值中和溶液。經溶離之噬菌體藉由感染至大腸桿菌K12 ER2738 (New England BioLabs)中來擴增，以用於下一輪生物淘選。進行後續三輪生物淘選，且使用同型對照物(BioXcell)進行額外一輪陰性分選以消除在9D9 mAb CDR外部之肽結合。實現在9D9 mAb與小鼠CTLA4之間的界面處特異性結合之肽之鑑別及富集。
在最後一輪生物淘選之後，藉由ELISA評估來自經富集之群體之個別純系與9D9 mAb之特異性結合。在存在或不存在等莫耳muCTLA4-hsIgG (R&D Systems)之情況下，在4℃下將9D9 mAb塗佈於96孔MaxiSorp盤(Thermo Fisher Scientific)上隔夜。向經脫脂乳阻斷之盤一式三份地添加呈現獨特肽之個別噬菌體且在室溫下培養1小時。在徹底洗滌未結合之噬菌體之後，使用HRP結合之抗M13抗體(GE Healthcare)及HRP受質(Sigma-Aldrich)偵測結合之噬菌體。在微量盤讀取器(Synergy HT，BioTek)中量測在405 nm下之吸光度。
選擇產生高9D9結合信號且抑制鼠類CTLA4與9D9 mAb之結合之純系，且提取DNA以用於測序。選擇來自編碼肽CNLIVEGHC之噬菌體之序列以用於後續代表性實驗。
關於可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)之設計，在高解析度(1.8 Å，表3)下測定9D9 Fab與肽CNLIVEGHC之複合物之結構特徵。在37℃下，用木瓜蛋白酶樹脂(Sigma)使9D9裂解隔夜。藉由蛋白質-A、陽離子交換(HiTrap SP-FF，GE Healthcare)及尺寸排阻(Superdex S75，GE Healthcare)管柱層析純化Fab。用0.2 M甲酸鈉及23% (w/v)PEG 3350作為母液，使用懸滴蒸汽擴散方法獲得經純化之Fab於10 mM Tris-HCl pH 8.0、25 mM NaCl、1 mM EDTA中之結晶。在低溫保護劑(35% (w/v)內消旋赤藻糖醇與儲備溶液之1:1混合物)中收集結晶且用具有Rigaku RAXISIV++偵測器之Rigaku MicroMax007-HF旋轉陽極繞射儀收集數據。在100 K下，在1.5418 Å下收集原始數據且使用XDS處理，產生達到1.8 Å之98.5%完整度數據集。使用藉由CCP4套件中之Phaser且曲妥珠單抗Fab (PDB ID：4IOI)作為檢索模型進行之分子置換以產生初始相。參見Donaldson J.M.等人, PNAS., 110:17456-61, (2013)。使用若干個在Coot中人工構建，接著用Phenix優化之循環以產生最終模型。數據收集及優化統計列舉於表3中。使用軟體PDBePISA表徵表4中之抗體-肽界面。測定CNLIVEGHC肽在9D9抗體之重鏈與輕鏈之間的界面處結合於CDR環。肽:9D9 Fab界面由5個氫鍵組成(表4)，產生375 Å2之相互相用表面積。9D9 Fab之靜電表面表示展示重鏈及輕鏈之抗原結合位點界面處之大型疏水性區域。CNLIVEGHC肽之中央Leu-Ile-Val基元包埋在此界面處。模型指示CNLIVEGHC肽之C端指向輕鏈之N端。肽之羧基碳與輕鏈之醯胺氮(殘基Asp1)之間的距離為20.4 Å。選擇含有MMP2/7/9裂解位點之肽以連接9D9抗體與肽。參見Turk B. E.等人, Nat Biotech, 19:661-667, (2001)。使用甘胺酸及絲胺酸胺基酸以橋接N及C端間隙。此外，MMP2/7/9受質序列突變以產生經掩蔽之抗CTLA4抗體之『不可裂解』版本(不可裂解的經掩蔽之9D9)。表 3. X射線繞射數據及優化統計
空間群 P221 21
單位晶胞尺寸(Å) 37.0 × 88.5 × 128.7
結晶條件之pH值 8.5
蛋白質/肽濃度(µM) 60/600
     
數據集   
波長，Å 1.5418
解析度範圍 50-1.8
獨特反射(總計) 34911 (188519)
完整度 98.5 (91.1)
冗餘度 5.4% (4.9%)
R meas 0.073 (0.35)
CC(1/2) 99.9 (93.0)
I/σ 20.83 (5.14)
NCS複本 1
     
模型優化   
解析度範圍，Å 33-1.88
反射數 34,855
蛋白質原子數 3,936
水分子數 561
模型中之殘基 LC：1-219，HC：1-216，經包藏之肽1-10
Rwork/Rfree，% 16.31/20.6
均方根偏差   
鍵長度，Å 0.009
鍵角 1
     
拉曼圖(Ramachandran plot)   
最有利區域，% 99.08
其他允許區域，% 0.92
非允許區域 0
表 4. 空間包藏肽與9D9-Fab之間的氫鍵
空間包藏肽 9D9-Fab 距離，Å
ASN   3 [ OD1 ] LC：TYR 101 [ OH ] 2.58
ASN   3 [ ND2 ] LC：GLY  96 [ O ] 2.96
ASN   3 [ ND2 ] LC：SER  97 [ O ] 3.16
LEU   4 [ O ] HC：TYR  33 [ OH ] 3.53
ILE   5 [ N ] LC：TYR 101 [ OH ] 3.78
實例 2 ：測定掩蔽肽與抗 CTLA4 抗體之間的結合親和力
測定合成CNLIVEGHC肽針對9D9抗體之結合親和力。 方法
在37℃下，用GE Biacore T200儀器進行表面電漿子共振。9D9抗體及同型對照物(參考通道)在100 RU固定量下與CM5晶片(GE Healthcare)偶合。合成肽且在HBS-EP+操作緩衝液(GE Healthcare)中稀釋。使用Biacore評估軟體，版本3.0分析結合數據。 結果
使用穩定模型，如藉由SPR所測定之合成CNLIVEGHC肽與9D9抗體之結合親和力為11 E-6 ± 2.3E-6 M(圖1)。陰性對照肽不結合於9D9抗體且CNLIVEGHC肽不結合於同型對照抗體。此等結果證實來自噬菌體文庫之所選擇之肽對9D9抗體具有特異性。實例 3A ： 結合於鼠類 CTLA4 之 可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體外表徵 方法經掩蔽之抗原結合位點之評估
ELISA盤在TBS中用鼠類CTLA4-Fc (R&D Systems)塗佈隔夜且接著用具有0.05% Tween 20之TBS洗滌，且用含1% BSA之PBS阻斷，接著用具有Tween 20之TBS洗滌。使親本抗CTLA4抗體及經掩蔽之抗CTLA4抗體於PBS中之稀釋物結合於CTLA4保持60分鐘，隨後用TBS Tween 20洗滌。用抗muKappa-HRP (Abcam)及Super Signal Pico化學發光受質偵測結合。由預先裂解之經掩蔽之抗CTLA4抗體之EC50及親本抗CTLA4抗體之EC50測定掩蔽率。蛋白酶裂解之測試
親本抗CTLA4抗體及經掩蔽之抗CTLA4抗體與6 nM MMP2 (R&D Systems)一起在150 mM NaCl、50 mM Tris (pH 7.5)、10 mM CaCl2、0.02% NP-40中，在37℃下培養隔夜。使用「任何無Kd染色之預製聚丙烯醯胺凝膠」(Bio-Rad)，藉由上文所描述之ELISA及還原型SDS-PAGE分析來測試抗體稀釋物與鼠類CTLA4-Fc之結合。 結果
可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體所呈現的與鼠類CTLA4之結合低90倍(圖2A)。經掩蔽之抗CTLA4抗體之蛋白酶活化以與親本抗CTLA4抗體類似之水準完全恢復抗體與鼠類CTLA4之結合(圖2A)。實例 3B ： 結合於鼠類 CTLA4 之 可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體及不可裂解的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體外表徵 方法低密度抗原結合 ELISA
所有ELISA係以與以下說明實質上類似之方式進行且通常符合此項技術中已知之方法。以3 ng muCTLA4hsIgG蛋白質(Abcam)/孔塗佈Polysterene 96孔微量培養盤(Thermo Fisher Scientific)且在4℃下儲存隔夜。盤用含0.1% Tween之TBS (TBS-T)洗滌，在4℃下用含1% BSA (Fisher)之PBS阻斷2小時且用TBS-T洗滌。向盤中添加測試抗體於含0.05% Tween+1% BSA之PBS (PBS-TB)中之連續稀釋物且在室溫下培養1小時。在用TBS-T洗滌之後，將在PBS-TB中以1:4000稀釋之HRP結合之山羊抗小鼠κ輕鏈抗體(Abcam)施用於各孔且在室溫下培養1小時。用TBS-T洗滌盤，將化學發光HRP受質施用於盤，且使用分光光度計(Synergy HT，BioTek)記錄發光。用GraphPad Prism，版本7.02分析數據。經掩蔽之抗體之酶促活化
親本抗CTLA4抗體、經掩蔽之抗CTLA4抗體及不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體各自在裂解緩衝液(150 mM NaCl；50 mM Tris，pH 7.5；10 mM CaCl2；0.02% NP-40)中稀釋至1 μM溶液。向各抗體溶液中添加在37℃下用1 mM對胺基苯乙酸汞(AMPA)活化1小時之重組MMP2 (R&D Systems)達到4 nM之最終濃度且在37℃下培養隔夜。藉由如上文所描述之低密度抗原結合ELISA方案測試抗體稀釋物與鼠類CTLA4 (muCTLA4hsIgG蛋白質；Abcam)之結合。 結果
與親本抗CTLA4抗體相比，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體及不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體所顯示的與鼠類CTLA4之結合分別低約156倍及218倍(圖2B)。親本抗CTLA4抗體之平均EC50為0.31±0.08 nM，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體之平均EC50為48.4±7.2 nM且不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體之平均EC50為67.7±16.3 nM，如在三個實驗中量測(圖2C)。當用重組MMP2處理時，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體恢復至與親本抗CTLA4抗體類似之結合(平均EC50=0.29±0.03 nM，圖2C)，而不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體之結合未改變(平均EC50=64.3±18.5 nM，圖2C)。實例 4A ： 可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體內表徵 方法製備可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體以用於活體內研究
藉由表現質體pD2610-v5，使用HEK293短暫表現來製備經掩蔽之抗CTLA4抗體(ATUM，Newark CA)。在轉染之後第七天，收集來自經轉染之細胞之上清液且用KanCapA樹脂(Kaneka)純化經掩蔽之抗CTLA4抗體，接著使用Source S管柱(GE Healthcare)藉由陽離子交換純化且用0-1 M NaCl梯度在pH 5下溶離。接著，將抗體之緩衝液更換成PBS。藉由分光光度計在OD280之光學密度下測定抗體濃度且使用Charles River Endotoxin套組測定內毒素含量。藉由可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體進行之腫瘤根除
向攜帶50-100 mm³ MC38腫瘤之C57BL/6小鼠腹膜內投與單次劑量之200 μg IgG2a對照物(BioXcel)、對鼠類CTLA4具有反應性之親本抗CTLA4抗體(9D9.IgG2a，輕鏈包含SEQ ID NO:237，重鏈包含SEQ ID NO:319)、對鼠類CTLA4具有反應性之可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體(輕鏈包含SEQ ID NO:238，重鏈包含SEQ ID NO:319)、對鼠類CTLA4具有反應性之經掩蔽之抗CTLA4抗體1005 (輕鏈包含SEQ ID NO:240，重鏈包含SEQ ID NO:319)或與人類CTLA4及鼠類CTLA4具有交叉反應之抗CTLA4抗體1 (輕鏈包含SEQ ID NO:327，重鏈包含SEQ ID NO:366)。每兩週一次量測體重及腫瘤尺寸。T 細胞 群體分析
在第1、4及8天，向攜帶50-100 mm³ MC38腫瘤之C57BL/6小鼠投與三個200 μg劑量之IgG2a對照物(BioXcel)、親本抗CTLA4抗體(9D9.IgG2a，輕鏈包含SEQ ID NO:237，重鏈包含SEQ ID NO:319)、經掩蔽之抗CTLA4抗體2 (輕鏈包含SEQ ID NO:238，重鏈包含SEQ ID NO:319)、經掩蔽之抗CTLA4抗體1005 (輕鏈包含SEQ ID NO:240，重鏈包含SEQ ID NO:319)或與人類CTLA4及鼠類CTLA4具有交叉反應性之抗CTLA4抗體1 (輕鏈包含SEQ ID NO:327，重鏈包含SEQ ID NO:366)。在第9天，處死小鼠且使用gentleMACS™方案「腫瘤解離套組(Tumor Dissociation Kit)」(Milteni)解離腫瘤，且經由70微米細胞過濾器過濾且在PBS/2.5% FBS緩衝液中沖洗兩次以移除酶緩衝液。脾細胞具有腫瘤浸潤物且藉由溫和地研磨組織穿過篩網來解離脾細胞。用ACK緩衝液(Thermo Fisher)溶解紅血球，隨後進行細胞染色。用經螢光標記之抗CD45 (BioLegend)、抗CD3 (BioLegend)、抗CD4 (BioLegend)、抗CD8 (BD Biosciences)、抗CD25 (BioLegend)進行細胞染色。在用抗FoxP3 (eBioscience)及抗Ki67 (eBioscience)進行染色之前，對細胞進行滲透。針對活(購自Life之Live/Dead Aqua)CD45陽性細胞之CD4+、CD8+及CD25 Foxp3+ (Treg)細胞之百分比以及呈Ki67陽性(細胞增殖之標誌)之此等三個細胞群體之百分比，藉由螢光活化細胞分選(FACS)來分析經染色之細胞。 結果
與用IgG2a對照抗體處理之小鼠中之腫瘤體積相比，親本抗CTLA4抗體(9D9.IgG2a)降低小鼠中之腫瘤體積(圖3A及3B)。與親本抗CTLA4抗體(圖3B)相比，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體在降低腫瘤體積方面展示等效的功效(圖3C)。TME中之調節性T淋巴細胞(Treg)對於免疫抑制而言為重要的。親本抗CTLA4抗體(9D9.IgG2a)及可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體2 (經掩蔽之9D9)皆經由效應功能優先消耗腫瘤中之調節性T淋巴細胞(Treg)群體(圖4)。活體內T細胞上CTLA4之阻斷引起CD4+及CD8+ T細胞之增殖。在親本抗CTLA4抗體(9D9.IgG2a)或可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體2 (經掩蔽之9D9)之多劑量投藥之後，藉由%Ki67+評估脾中之T細胞之增殖。與親本抗體(9D9.IgG2a)相比，經掩蔽之抗CTLA4抗體展示周邊區域中降低之CD4+細胞(圖5A)及CD8+ T細胞(圖5B)之增殖。
人類化經掩蔽之抗CTLA4抗體1與伊派利單抗相比具有更高的針對人類CTLA4之親和力(分別為7倍及38倍)且與食蟹獼猴CTLA4及鼠類CTLA4具有交叉反應性。與親本抗CTLA4抗體(圖3B)相比，人類化經掩蔽之抗CTLA4抗體1在降低腫瘤體積方面展示等效的功效(圖3D)。實例 4B ：可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體內表徵
使用先前證實對用9D9抗體進行之處理起反應的MC38小鼠結腸直腸癌模型，研究可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體對腫瘤生長以及腫瘤及周邊區域中之免疫參數之作用。參見Peggs K.S.等人, J Exp Med., 206:1717-1725, (2009)及Selby M. J.等人, Cancer Immunol Res., 1:32-42, (2013)。 方法藉由可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體進行之腫瘤根除
向年齡在8與12週之間的雌性C57BL/6皮下注射0.5×106個MC38腫瘤細胞。當平均腫瘤體積達到50-100 mm3時，將小鼠隨機分為具有類似平均腫瘤體積之處理組。為評估抗腫瘤功效，在隨機分組後第1天，以每劑量200 μg，以＜250 μL之體積腹膜內(i.p.)投與在PBS中調配之抗體。每週兩次測定腫瘤體積。個別地監測所有小鼠且在腫瘤體積達到1500 mm3時或隨機分組後第45天處死。為藉由如下文所描述之FACS分析評估抗體對調節性T細胞(Treg)之生物功能，在隨機分組後第1、4及8天，以每劑量200 μg，以＜250 μL之體積向攜帶腫瘤之小鼠腹膜內投與抗體。對照抗體為muIgG2a (BioXcell)。在第9天處死所有小鼠；收集腫瘤及脾以用於FACS分析。T 細胞 群體分析
藉由腫瘤解離套組(gentleMACS)，根據標準方案解離小鼠腫瘤樣本且通過70 μm細胞過濾器。在70 μm細胞過濾器中，用注射器之背部解離脾樣本。用ACK緩衝液(Lonza)溶解紅血球。洗滌最終細胞懸浮液且以2×107個細胞/毫升再懸浮於染色緩衝液(PBS pH 7.4、2.5% FBS、0.09% NaN3)中。細胞用Mu Trustain fcX (BioLegend)處理以阻斷Fc受體，隨後用針對CD45 (BioLegend)、CD3 (BioLegend)、CD4 (BioLegend)、CD8 (BD Biosciences)、CD25 (BioLegend)及Live/Dead Aqua (ThermoFisher)之抗體染色。對於細胞內染色，固定細胞，滲透且用針對FoxP3 (eBioscience)及Ki-67 (eBioscience)之抗體染色。進行單色染色及FMO以達成閘控目的。 結果
親本抗CTLA4抗體(圖6C)及可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體(圖6D)之投藥誘導皮下植入之MC38腫瘤之腫瘤消退，而腫瘤在用同型對照抗體(圖6A)或不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體(圖6B)處理之小鼠中快速生長。此等結果表明可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體保持符合腫瘤微環境中之掩蔽肽之有效裂解及解離之抗腫瘤活性。此外，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體之完全活性視蛋白酶裂解而定，因為不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體未能抑制腫瘤生長。此等結果與指示抗CTLA4抗體之局部投藥可有效誘導小鼠中之腫瘤消退之早期觀測結果一致。參見Marabelle, A.等人, JCI, 123:2447-2463, (2013)。
分析藉由可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體投藥進行之瘤內及全身性免疫活化。先前工作確定muIgG2a抗CTLA4抗體以FcγR依賴性方式瘤內消耗Treg細胞，但其引起經處理之小鼠的脾中之Treg之活化及擴增。參見Selby M. J.等人, Cancer Immunol Res., 1:32-42, (2013)。因此，為評估經掩蔽之抗CTLA4抗體之局部及全身活性，分別評估瘤內(圖7A)及脾(圖7B)中之Treg之豐度及增殖狀態。在抗體之最後三次給藥之後24小時收集腫瘤及脾樣本。流式細胞分析顯示Treg在用親本抗CTLA4抗體處理之小鼠之腫瘤中顯著減少(圖7A)。可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體可與親本抗CTLA4抗體同樣有效地減少Treg (圖7A)。相比之下，不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體對瘤內Treg豐度不具有顯著作用(圖7A)。此等結果表明，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體在腫瘤環境中以取決於腫瘤相關蛋白酶之活性的方式與親本抗CTLA4抗體具有類似活性。
與對腫瘤組織中之Treg細胞之作用相反，親本抗CTLA4抗體引起經處理之小鼠之脾中的增殖(Ki67+ FOXP3+)Treg之顯著增加(圖7B)。當與親本抗CTLA4抗體相比時，可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體引起增殖脾Treg之邊際增加，而當與同型對照抗體相比時，不可裂解的經掩蔽之抗CTLA4抗體對Treg增殖無作用(圖7B)。綜合而言，此等結果支持以下結論：可活化的經掩蔽之抗CTLA4抗體之腫瘤活化主要受限於在正常組織中具有降低之活性之腫瘤環境。實例 5 ： 結合於人類 CTLA4 之 可活化的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體外表徵 方法 經掩蔽之抗原結合位點之評估
ELISA盤在TBS中用人類CTLA4-Fc (R&D Systems)塗佈隔夜且接著用具有0.05% Tween 20之TBS洗滌，且用含1% BSA之PBS阻斷，接著用具有Tween 20之TBS洗滌。使親本抗CTLA4抗體及經掩蔽之抗CTLA4抗體於PBS中之稀釋物結合於CTLA4保持60分鐘，隨後用TBS Tween 20洗滌。用抗huKappa-HRP (Abcam)及Super Signal Pico化學發光受質偵測結合。由預先裂解之經掩蔽之抗CTLA4抗體之EC50及親本抗CTLA4抗體之EC50測定掩蔽率。蛋白酶裂解之測試
親本抗CTLA4抗體及經掩蔽之抗CTLA4抗體與含6 nM 1)間質蛋白酶之50 mM Tris (pH 9)、50 mM NaCl、0.01% Tween-20一起在37℃下培養隔夜。使用「任何無Kd染色之預製聚丙烯醯胺凝膠」(Bio-Rad)，藉由上文所描述之ELISA及還原型SDS-PAGE分析來測試抗體稀釋物與人類CTLA4之結合。 結果
人類化經掩蔽之抗CTLA4抗體1所呈現之與人類CTLA4之結合低50倍(圖8)。人類化經掩蔽之抗CTLA4抗體1之蛋白酶活化以與親本抗CTLA4抗體類似之水準完全恢復抗體與人類CTLA4之結合(圖8)。實例 6 ：經掩蔽之抗體之酶活化
藉由下文所描述之方案，使用重組蛋白酶活化經掩蔽之抗體。
將經掩蔽之抗體之緩衝液更換成MMP裂解緩衝液，隨後與蛋白酶一起培養。關於活化，蛋白酶(Anaspec、ProsecBio及R&D Systems)在MMP裂解緩衝液(50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、10 mM CaCl2)中稀釋100 ng/µL。添加APMA (10 mM於DMSO中)達到1 mM之最終濃度。酶在37℃下培養1小時。以1:1000抗體:蛋白酶(例如1 μg MMP:1 mg抗體)之比率向經掩蔽之抗體中添加經活化之蛋白酶，或向陰性對照樣本中添加等量緩衝液。樣本在37℃下培養隔夜。
在培養之後，使用蛋白質A樹脂純化經處理之抗體。簡言之，向1.7 mL試管中添加150 µL MabSure ProA漿料(GE Healthcare)。漿料藉由在mySpin 6離心機中旋轉兩分鐘，用1 mL PBS洗滌兩次。向漿料中添加經活化之抗體(500 µL)且在振盪下，在室溫下培養三十分鐘或在4℃下培養三小時。抗體-漿液混合物在mySpin 6離心機中旋轉兩分鐘且收集流體。樹脂用1 mL 1x PBS洗滌兩次且收集洗滌液。抗體使用100 µL 25 mM乙酸鈉pH 3.5溶離至少六次(與6 µL 1 M Tris pH 8.0一起進入新的1.7 mL試管)。量測溶離液之濃度。
使所有溶離液及緩衝液更換之樣本彙集至PBS中。向所彙集之樣本中添加500 µL PBS。將樣本添加至過濾器中且旋轉三次。藉由向過濾器之頂部添加100 µL PBS且混合以移除所更換之蛋白質來收集所彙集之樣本。量測經純化之抗體之濃度。樣本在PBS中稀釋至1 mg/mL。
使用SDS-PAGE分析樣本之活化。簡言之，將10 µL樣本(1 mg/mL)與10 µL上樣緩衝液混合且在90℃下沸騰十分鐘。將10 µL樣本裝載至15孔Any-kDa無染色之凝膠(BioRad)上且在200 V下運行三十分鐘。蛋白質使用BioRad成像器成像以藉由遷移尺寸之變化來確保完全活化。
藉由經裂解之抗體的遷移尺寸之變化來證明經掩蔽之抗體之完全活化。實例 7 ： 結合於人類 CTLA4 之 抗 CTLA4 抗體之活體外表徵 ： 低密度抗原結合 ELISA 方法
聚苯乙烯96孔微量培養盤(Fisher #07-200-591)用1 µg/mL之人類CTLA4-Fc (R&D #7268-CT)/孔塗佈且在4℃下儲存隔夜。盤用含0.05% Tween之TBS (TBS-T)洗滌，用1% BSA (Sigma Aldrich #B4287-25G)阻斷且用TBS-T洗滌。在分析緩衝液(PBS+0.05% Tween+1% BSA)中製得含有抗CTLA4抗體之樣本之連續稀釋物，添加至盤中且在室溫下，在100 RPM下在軌道上振盪一小時。在用TBS-T洗滌之後，將在分析緩衝液中以1:8000稀釋之抗人類κ輕鏈[純系：SB81a]-HRP (Abcam #ab79115)施用於各孔且在室溫下振盪一小時。用TBS-T洗滌盤，將HRP受質(Super Signal Pico Chemiluminescent Substrate，Thermo #37069)施用於盤且使用分光光度計(BioTek)記錄發光。用GraphPad Prism分析數據。
所測試之抗體包括人類化抗CTLA4抗體(稱為抗體1及抗體2)，及其變異體/形式/版本。根據特定編號流程，抗體1包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列之CDR-L3，且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列之CDR-H3。抗體1包含有包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之VL域，及包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之VH域。根據Kabat編號流程，抗體1包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列之CDR-L3，且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列之CDR-H3。根據特定編號流程，抗體2包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列之CDR-L3，且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列之CDR-H3。根據Kabat編號流程，抗體2包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3，且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。產生抗體1之各種形式，其各自具有名稱「抗體1-#」，且產生抗體2之各種形式，其各自具有名稱「抗體2-#」。結果
圖9A及圖9B展示用稱為抗體1及抗體2之人類化抗CTLA4抗體或其變異體進行之結合研究。圖9A展示抗體1之具有野生型Fc區之版本(抗體1-1)及抗體1之在Fc區中具有S239D突變及I332E突變之版本(抗體1-2)與人類CTLA4-Fc之結合之間的不可偵測之差異。抗體1-2包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之VL域，及包含SEQ ID NO:478之胺基酸序列之VH域。圖9B比較抗體2之各種形式之CTLA4結合，包括抗體2之具有野生型Fc區之版本(抗體2-1)；抗體2之在Fc區中具有S239D突變及I332E突變之版本(抗體2-2)；抗體2之具有S239D突變、Fc區中之I332E突變及兩個鉸鏈區突變之版本(抗體2-3)；抗體2之具有Fc區中之S239D、I332E及A330L突變之版本(抗體2-4)；及抗體2之具有Fc區中之S239D、I332E、A330L突變及兩個鉸鏈區突變之版本(抗體2-5)。如圖9B中所示，抗體之所有形式皆以類似方式結合於人類CTLA4-Fc。所測試之抗體之平均EC50 值提供於以下表5中。表 5
結合於人類CTLA4-Fc 之 抗體
抗體 EC50  (nM) R2
抗體1-1 0.32 ± 0.01 0.9984
抗體1-2 0.32 ± 0.01 0.998
抗體2-1 0.44 ± 0.02 0.9978
抗體2-2 0.39 ± 0.01 0.9979
抗體2-3 0.40 ± 0.02 0.9967
抗體2-4 0.40 ± 0.02 0.9962
抗體2-5 0.41 ± 0.02 0.9968
實例 8 ：蛋白酶活化對人類 CTLA4 結合之影響 方法
人類化抗CTLA4抗體用於實例7中描述之低密度抗原結合ELISA中。對於評估人類化抗CTLA4抗體之經掩蔽之可活化的形式之活化，如實例6中所概述使用重組蛋白酶。
使用抗體2之具有Fc區中之S239D突變及I332E突變之未經掩蔽之版本(抗體2-6)作為未經掩蔽之對照物，以用於與抗體之具有相同的兩個突變，但亦包括掩蔽肽(其包括SEQ ID NO:19或5之胺基序列)以及間隔連接子及可裂解肽之版本進行比較。親本未經掩蔽之抗體2-6包括具有SEQ ID NO:324之胺基酸序列之可變重鏈、具有SEQ ID NO:322之胺基酸序列之可變輕鏈、具有SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈及具有SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈。抗體2-7至抗體2-21之經掩蔽之抗體包括親本未經掩蔽之抗體2-6之可變重鏈、可變輕鏈、重鏈及輕鏈序列，且進一步包括掩蔽肽、間隔連接子1、可裂解(或不可裂解)肽及間隔連接子2，如表6及表9中所描述。因此，抗體2-6、抗體2-7、抗體2-8、抗體2-9、抗體2-10、抗體2-11、抗體2-12、抗體2-13、抗體2-14、抗體2-15、抗體2-16、抗體2-17、抗體2-18、抗體2-19、抗體2-20及抗體2-21中之每一者包含有包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之VH域、包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之VL域、包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之輕鏈。除非另有指示，否則稱為抗體2-7至抗體2-21之經掩蔽之抗體係藉由如下以N端至C端方向使以下組分連接至親本未經掩蔽之抗體2-6之輕鏈來掩蔽：1)掩蔽肽；2)間隔連接子1；3)可裂解肽；4)間隔連接子2；輕鏈之N端。抗體2-10包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。所測試之例示性抗體之實例(包括抗體2-7至抗體2-13中之間隔連接子及可裂解肽之序列)提供於表6中。表 6
抗體 掩蔽肽 間隔連接子 1 可裂解肽 間隔連接子 2 重鏈 輕鏈 + 掩蔽組分
抗體2-7 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGSGGS (SEQ ID NO:415) VPLSLY (SEQ ID NO:86) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:424
抗體2-8 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGPGSSP (SEQ ID NO:416) MPYDLYHP (SEQ ID NO:47) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:425
抗體2-9 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGSSPP (SEQ ID NO:417) HEQLTV (SEQ ID NO:57) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:426
抗體2-10 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGGSSGGSG (SEQ ID NO:96) GSGGSG (SEQ ID NO:414) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:427
抗體2-11 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) SSPSPSGG (SEQ ID NO:418) GGIGQLTA (SEQ ID NO:48) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:428
抗體2-12 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GSPGSP (SEQ ID NO:419) KPILFFRL (SEQ ID NO:54) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:431
抗體2-13 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGSSPP (SEQ ID NO:417) RAAAVKSP (SEQ ID NO:72) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:429
在分析緩衝液中製得抗體之連續稀釋物，添加至塗有人類CTLA4-Fc之96孔微量培養盤中，且在室溫下振盪一小時。盤用TBS-T洗滌，用BSA阻斷且再用TBS-T洗滌。將抗體添加至盤中且振盪。在洗滌之後，將分析緩衝液中之抗人類κ輕鏈(與HRP結合)施用於各孔且在室溫下振盪。再洗滌盤，隨後添加HRP受質。使用分光光度計記錄發光且用GraphPad Prism分析數據。結果
圖10A及圖10B展示在不存在(圖10A)或存在(圖10B)蛋白酶之情況下，用抗體2之經掩蔽之及未經掩蔽之版本進行之結合研究。圖10A展示在不存在蛋白酶之情況下，抗體2之各種版本與IgG1同型之結合。需要更高的抗體濃度以展示結合，如由未經掩蔽之抗體2-6及IgG1同型之右移證明(圖10A)。認為經掩蔽之抗體被掩蔽肽包藏。各經掩蔽之抗體之包藏展示於以下表7中，且藉由用經掩蔽之抗體之EC50除以未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)之EC50來計算。包藏量之可變性證實間隔連接子及/或可裂解肽之序列影響掩蔽肽阻斷抗原結合之能力。抗體之EC50及所計算之包藏度展示於以下表7中。表 7
表2. 結合於CTLA4 之 經掩蔽之抗體
抗體 EC50  ± SE (nM) R2 包藏度
抗體2-6 0.69 ± 0.03 0.9967   
抗體2-7 33.9 ± 0.7 0.9997 49
抗體2-8 54.8 ± 1.0 0.9999 79
抗體2-9 48.9 ± 1.0 0.9998 62
抗體2-10 29.4 ± 1.5 0.9985 43
抗體2-11 34.9 ± 0.5 0.9999 51
抗體2-12 3.3 ± 0.2 0.9962 5
抗體2-13 14.2 ± 0.2 0.9998 21
圖10B展示在存在蛋白酶(亦即，活化)之情況下，抗體2之各種版本(排除具有不可裂解之連接子之抗體2-10)之結合。包括未經掩蔽之親本抗體2-6作為對照物且不暴露於蛋白酶。根據實例6中提供之方案進行蛋白酶消化。圖10B中展示之數據表明，可裂解肽之蛋白水解***藉由以與未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)類似之水準恢復抗體之結合來完全挽救抗體與人類CTLA4之結合。藉由存在蛋白酶而「活化」之所測試之抗體之結合數據及活化數據提供於以下表8中。藉由下式計算活化水準：活化水準=1-(經活化之經掩蔽之抗體之EC50-未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)之EC50)/(未經活化之經掩蔽之抗體之EC50-親本抗體(抗體2-6)之EC50)。表 8
結合於CTLA4 之經 活化之抗體
抗體 EC50 ± SE (nM) R2 活化水準
抗體2-6 0.69 ± 0.03 0.9967   
抗體2-7 (活化) 0.58 ± 0.02 0.9971 1.00
抗體2-8 (活化) 0.67 ± 0.04 0.9951 1.00
抗體2-9 (活化) 0.67 ± 0.02 0.9984 1.00
抗體2-11 (活化) 0.62 ± 0.03 0.9973 1.00
抗體2-12 (活化) 0.62 ± 0.02 0.9962 1.03
抗體2-13 (活化) 0.57 ± 0.02 0.9985 1.01
實例 9 ： 經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之蛋白酶裂解之活體外表徵 ： 酶動力學、蛋白質裂解及雷達圖
使用抗體2之經掩蔽之形式在存在例示性蛋白酶之情況下進行結合研究，該等經掩蔽之形式各自包括掩蔽肽(其包括SEQ ID NO:5或19之胺基序列)，以及第一間隔連接子及第二間隔連接子及可裂解肽。抗體2-15包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。在一些研究中，亦測試未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)以進行比較。所測試之抗體之實例(包括掩蔽肽、間隔連接子及可裂解肽之序列)提供於表9中。表 9
抗體 掩蔽肽 間隔連接子 1 可裂解肽 間隔連接子 2 重鏈 輕鏈 + 掩蔽組分
抗體2-14 CPGKGLPSC (SEQ ID NO:5) GGGSSGGSG (SEQ ID NO:96) VPLSLY (SEQ ID NO:86) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:358
抗體2-15 CPGKGLPSC (SEQ ID NO:5) GGGSSGGSG (SEQ ID NO:96) GSGGSG (SEQ ID NO:414) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:423
抗體2-16 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) SSGGSGP (SEQ ID NO:420) DSGGFMLT (SEQ ID NO:50) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:422
抗體2-17 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) SSPSPSGG (SEQ ID NO:418) GGIGQLTA (SEQ ID NO:48) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:428
抗體2-18 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGPGSSP (SEQ ID NO:416) MPYDLYHP (SEQ ID NO:47) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:425
抗體2-19 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGSSPP (SEQ ID NO:417) HEQLTV (SEQ ID NO:57) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:426
抗體2-20 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGSSPP (SEQ ID NO:417) RAAAVKSP (SEQ ID NO:72) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:429
抗體2-21 CPFPALELC (SEQ ID NO:19) GGSSPP (SEQ ID NO:417) TSVLMAAP (SEQ ID NO:51) SGG (SEQ ID NO:102) SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:430
可裂解肽序列選擇蛋白酶之活體外敏感性之比較以雷達圖形式展示於圖11A-H中。使用雷達圖描繪由雷達圖上之各蛋白酶進行之各抗體之活化，其中在0 (不活化)至1.0 (完全活化)之範圍內描繪活化。藉由下式計算活化水準：活化水準=1-(經活化之經掩蔽之抗體之EC50-未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)之EC50)/(未經活化之經掩蔽之抗體之EC50-親本抗體(抗體2-6)之EC50)。各經掩蔽之抗體之包藏展示於以下表12中，且藉由用經掩蔽之抗體之EC50除以未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)之EC50來計算。根據實例7及實例8中提供之方案進行結合，且根據實例6及實例8中提供之方案進行抗體之蛋白水解處理。在適合的裂解緩衝液中製得經掩蔽之抗CTLA4抗體之溶液(1000 nM)。將兩份抗體樣本等分至兩個0.5 mL埃彭道夫管(Eppendorf tubes)中。向相應的抗體樣本中添加裂解緩衝液之工作溶液(參見表11)且向對照物(無蛋白酶)樣本中添加裂解緩衝液。表 10
蛋白酶
蛋白酶 來源 裂解緩衝液1 每次反應中之蛋白酶(ng) 工作溶液(ng/uL) 反應時間(min)
Adam17 R&D Systems A 50 5 60
MMP1 Anaspec B 234 23.4 15
MMP2 R&D Systems B 8 0.8 15
MMP7 ProspecBio B 15 1.5 15
MMP9 ProspecBio B 50 5 15
MMP10 R&D Systems B 382 38.2 15
MMP14 R&D Systems C 201 20.1 15
NapsinA R&D Systems B 400 40 300
1 關於裂解緩衝液，參見表11。表 11
裂解緩衝液
裂解緩衝液 緩衝液化學組成
A 100 mM NaOAc、200 mM NaCl，pH 3.5
B 50 mM Tris、50 mM NaCl、0.01% Tween-20，pH 9
C 50 mM Tris、3 mM CaCl2、1 μM ZnCl2，pH 8.5
具有各種可裂解肽序列之抗體之雷達圖展示於圖11A-G中。圖11H展示抗體2-15 (其含有不可裂解之可裂解肽，以用作陰性對照物)之結合不受各種例示性蛋白酶之添加影響。圖11A展示抗體2-14之雷達圖。
如先前所描述，在健康及攜帶MC38腫瘤之小鼠中評估在第2天(d2)、第4天(d4)或第7天(d7)的蛋白酶裂解之SDS-PAGE分析，且展示於圖11I-11M中。如圖11I中所示，在健康小鼠之血漿中評估抗體2-14中之可裂解肽之裂解。除小鼠1* (上部圖，向其投與150 µg抗體2-14)以外，向各組中之5隻健康小鼠之組投與200 µg抗體2-14。用蛋白酶(右側泳道)或不用蛋白酶(左側泳道)處理標準物。如圖11J中所示，在健康小鼠之血漿中評估抗體2-16中之可裂解肽之裂解。圖11J中使用之標準物為抗體2-18。除小鼠4* (向其投與150 µg抗體2-14)以外，向健康小鼠投與200 µg抗體2-16。
如圖11K-11M中所示，在攜帶MC38腫瘤之小鼠之血漿中評估抗體2-14中之可裂解肽、抗體2-15中之不可裂解肽及抗體2-16中之可裂解肽之裂解。向攜帶MC38腫瘤之小鼠投與200 µg各抗體。在圖11M中，小鼠2之第2天(d2)樣本似乎有錯誤且應忽略。
抗體2-6、抗體2-14及抗體2-15在存在或不存在蛋白酶之情況下與CTLA4之結合展示於圖12A中，且EC50、包藏及活化提供於表12中。未經掩蔽之抗體2-6顯示不受蛋白酶之存在影響之結合(圖12A)。在不存在蛋白酶之情況下，與未藉由添加蛋白酶來挽救之未經掩蔽之親本抗體2-6相比，經掩蔽但包括不可裂解之可裂解肽序列之抗體2-15顯示降低之結合親和力(圖12A)。在不存在蛋白酶之情況下，經掩蔽且包括可裂解肽之抗體2-14顯示降低之結合親和力且包藏值為101，但此降低之結合親和力在藉由添加蛋白酶來活化時被挽救(圖12A)，其中活化值為1.0 (表12)。抗體2-6、抗體2-14及抗體2-15在存在或不存在蛋白酶之情況下之EC50提供於以下表12中。表 12
結合於CTLA4 之 經掩蔽及活化之抗體
抗體 蛋白酶 EC50 (nM) R2 包藏 活化
抗體2-6 - 0.39 ± 0.01 0.9979      
抗體2-6 + 0.39 ± 0.01 0.9981 1.0   
抗體2-14 - 39.4 ± 1.8 0.9989 101   
抗體2-14 + 0.41 ± 0.01 0.9982 1.1 1.00
抗體2-15 - 24.3 ± 0.5 0.9997 62   
抗體2-15 + 17.3 ± 0.7 0.9982 44 0.29
抗體2-6、抗體2-7及抗體2-10在存在或不存在蛋白酶之情況下與CTLA4之結合展示於圖12B中，且EC50、包藏及活化提供於表13中。抗體2-10包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。經掩蔽且包括可裂解肽之抗體2-7在不存在蛋白酶之情況下顯示包藏值為49，且在使用蛋白酶活化後之活化值為1.0(圖12B；表13)。在不存在蛋白酶之情況下，經掩蔽之抗體2-7顯示與經掩蔽之抗體2-10類似之結合，且在藉由添加蛋白酶來活化後，抗體2-7顯示與未經掩蔽之親本抗體2-6類似之結合。抗體2-6、抗體2-7及抗體2-10之EC50提供於以下表13中。表 13
結合於CTLA4 之 經掩蔽及活化之抗體
抗體 蛋白酶 EC50  (nM) R2 包藏 活化
抗體2-6 - 0.69 0.9967      
抗體2-7 - 33.9 0.9997 49   
抗體2-7 + 0.58 0.9971 0.8 1.00
抗體2-10 - 29.4 0.9985 43   
圖12A、圖12B、表12及表13中展示之數據證實抗體2-7 (SEQ ID NO:19)及抗體2-14 (SEQ ID NO:5)中包括之例示性掩蔽肽皆能夠以可逆方式掩蔽結合活性。實例 10 ：腸毒素分析 方法 SEB 分析法
使用葡萄球菌腸毒素B (SEB)分析法檢驗各種抗體促進外周血液單核細胞(PBMC)產生IL-2之能力。對於SEB分析法，由所選擇之抗體在預溫熱之培養基(RPMI+10%熱滅活FBS+1% HEPES+1% MEM NEAA+1%丙酮酸鈉)中製備稀釋液。塗佈抗體溶液一式三份且僅向「PBMC+SEB」孔、「僅PBMC」孔及最外面一排添加培養基。在預溫熱之培養基中製備SEB溶液且添加至除「僅PBMC」以外之所有實驗孔中。PBMC (BioIVT)在37℃之水浴中解凍。將細胞逐滴轉移至錐形管且添加20x預溫熱之培養基以清洗細胞。將細胞離心且抽吸培養基。使細胞再懸浮於20 mL預溫熱之培養基中且取出等分試樣進行計數。將剩餘細胞離心且使細胞以1×106 個細胞/毫升之體積再懸浮。以100微升/孔塗佈細胞，且培養盤在37℃，5% CO2 培養箱中培養五天。在第五天，培養盤在1000 RPM下旋轉五分鐘。自各孔取250 µL細胞轉移至新的96孔盤中。培養盤再旋轉一次，取225 µL細胞轉移至PCR管中。樣本在-80℃下儲存直至進行ELISA分析為止。IL-2 ELISA
採用Human IL-2 ELISA MAX組合(BioLegend，目錄號431806)進行分析，測定使用上文所描述之方案產生之細胞上清液中之IL-2含量。使用分析緩衝液稀釋細胞上清液樣本，以落在標準曲線內。使用GraphPad Prism及杜凱氏多重比較試驗法(Tukey's multiple comparisons test)(單向ANOVA)分析樣本，以測定處理組之間的統計顯著性。結果
在SEB分析法中測試各種形式之抗體1與抗體2。在抗體1-1或抗體1-2 (如實例7中所描述)之存在下或無抗體之情況下產生之IL-2含量之數據示於圖13A中。在抗體2-1、抗體2-2、抗體2-3、抗體2-4及抗體2-5 (如實例7中所描述)之存在下或無抗體之情況下產生之IL-2含量之數據示於圖13C中。與無抗體之對照物相比，所有已測試之抗體皆顯示提高IL-2含量之能力。各抗體所提高之IL-2含量高於無抗體對照物的倍數及與同型對照物之比較展示於圖13B及圖13中。實例 11 ：經掩蔽及活化之抗 CTLA4 抗體之免疫功能
進行根據實例10之方案之SEB分析法以測試回應於用抗體2之各種形式進行之處理之IL-2產生。亦在不存在抗體(亦即，無抗體)或作為對照物之同型對照抗體之情況下進行分析法。亦測試未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)以進行比較。
如圖14A及14B中所示，與促進大量IL-2產生之未經掩蔽之抗體2-6相反，抗體2之經掩蔽之形式通常在促進IL-2產生方面無效。如圖14B中所示，抗體2-12為唯一的與同型對照物相比引起IL-2產生之顯著增加之經掩蔽之抗體，但此增加顯著小於在使用未經掩蔽之抗體2-6親本抗體時觀測到的增加。相比之下，抗體2-7、抗體2-8、抗體2-9、抗體2-10、抗體2-11及抗體2-13與同型對照物相比皆不促進IL-2產生之顯著增加(圖14B)。使用單向ANOVA比較進行統計分析。
圖14C及14D展示根據實例6之方案進行之蛋白酶處理對抗體2-7、抗體2-8、抗體2-9及抗體2-10促進IL-2產生之能力之影響。抗體2-10包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。測試未經掩蔽之親本抗體2-6作為陽性對照，且測試同型對照抗體及無抗體之對照物作為陰性對照。使用與抗體2-6之單向ANOVA比較進行圖14D中展示之統計分析。
圖14C中展示之結果表明用蛋白酶進行之處理以與未經掩蔽之親本抗體2-6類似之水準挽救抗體2-7、抗體2-8及抗體2-9促進IL-2產生之能力。圖14B中展示之曲線比較高於無抗體之對照物之IL-2產生之倍數增加。用經掩蔽但不可由蛋白酶活化之抗體2-10進行之處理引起與同型對照物類似的IL-2產量及類似的高於無抗體之對照物之倍數變化(圖14C及圖14D)。實例 12 ： 經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體內裂解 方法 健康小鼠之血漿中的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體內裂解
在第0天，向健康、未攜帶腫瘤之七-八週齡雌性C57BL/6J小鼠腹膜內注射200 µg抗體2之經掩蔽之形式。在第二天及第四天，經由RO竇收集血液且用LiHep處理以進行血漿分離。在第七天，經由心臟穿刺收集血液且用LiHep處理以進行血漿分離。將血漿等分且在-80℃下儲存直至進行西方墨點分析。包括在存在或不存在蛋白酶之情況下活體外處理經掩蔽之抗體之標準樣本作為陽性對照物。對於西方墨點分析，在PBS中稀釋血漿樣本，接著在Laemmli樣本緩衝液及βME中稀釋。在95℃下加熱樣本，接著裝載在Criterion TGX無染色之預製凝膠上。在200 V下進行SDS-PAGE歷時四十二分鐘。將蛋白質轉移至硝化纖維膜且在室溫下，在振盪下，在1x TBS中用1%酪蛋白阻斷劑阻斷一小時。在4℃下，在振盪下，膜用針對人類κ輕鏈[純系EPR5367-8]之在酪蛋白阻斷劑中以1:10,000稀釋之HRP結合之Rb mAb探測隔夜。膜用PBS-Tween洗滌三次且用SuperSignal ELISA Pico化學發光受質進行研究。用ImageLab軟體分析原始數據。活化百分比計算如下：經活化之譜帶之強度/(經活化之譜帶之強度+經掩蔽之未經活化之譜帶之強度)×100%。
在兩個群組中跨越兩週進行活體內實驗，兩個群組中皆包括抗體2-14。所測試之抗體包括抗體2-14、抗體2-15、抗體2-16、抗體2-17、抗體2-18、抗體2-19、抗體2-20及抗體2-21。抗體2-15包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。結果
抗體2-14 (圖15A)及抗體2-20 (圖15C)皆活體內活化。未活體內偵測到抗體2-19之活化(圖15B)。亦未偵測到抗體2-16、抗體2-17、抗體2-18及抗體2-21之活體內活化(數據未展示)，且亦未偵測到陰性對照抗體2-15之活體內活化。抗體2-14及抗體2-20之自第2天至第7天之活化百分比之增加展示於圖15D中。實例 13 ： 攜帶腫瘤之小鼠之血漿中的經掩蔽之抗 CTLA4 抗體之活體內裂解
將MC38細胞(1×106 個)皮下注射至七-八週齡雌性C57BL/6J小鼠中。在第0天，基於腫瘤體積量測值將小鼠隨機分組且腹膜內注射200 µg抗體2構築體。在第二天及第四天，經由RO竇收集血液且用LiHep處理以進行血漿分離。在第七天，經由心臟穿刺收集血液且用LiHep處理以進行血漿分離。將血漿等分且在-80℃下儲存直至進行西方墨點分析。包括在存在或不存在蛋白酶之情況下活體外處理經掩蔽之抗體之標準樣本作為陽性對照物。對於西方墨點分析，在PBS中稀釋血漿樣本，接著在Laemmli樣本緩衝液及βME中稀釋。在95℃下加熱樣本，接著裝載在Criterion TGX無染色之預製凝膠上。在200 V下進行SDS-PAGE歷時四十二分鐘。將蛋白質轉移至硝化纖維膜且在室溫下，在振盪下，在1x TBS中用1%酪蛋白阻斷劑阻斷一小時。在4℃下，在振盪下，膜用針對人類κ輕鏈[純系EPR5367-8]之在酪蛋白阻斷劑中以1:10,000稀釋之HRP結合之Rb mAb探測隔夜。膜用PBS-Tween洗滌三次且用SuperSignal ELISA Pico化學發光受質進行研究。用ImageLab軟體分析原始數據。
在兩個群組中跨越兩週進行活體內實驗，兩個群組中皆包括抗體2-14。所測試之抗體包括抗體2-14、抗體2-15、抗體2-16、抗體2-17、抗體2-18、抗體2-19、抗體2-20及抗體2-21。抗體2-15包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。
在另一組實驗中，將MC38細胞(1×106 個)皮下注射至用人類CTLA4進行基因嵌入之小鼠模型中。向攜帶MC38腫瘤之小鼠投與單次注射之200 µg測試抗體(例如IgG對照物、抗體2-1、抗體2-10、伊派利單抗或伊派利單抗之無海藻糖基化形式(伊派利單抗-aFuc))，且在注射之後第五天對CD45+脾細胞及CD45+瘤內細胞進行免疫表型分析。在一些研究中，在單次注射20 µg、7 µg或2 µg測試抗體後量測隨時間推移之腫瘤體積。針對標記物評估CD45+細胞，包括對CD3+/ICOS+、CD3+ T細胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+ T細胞、CD8+/ICOS+、CD8+ T細胞、Tregs+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+之選擇性，及所鑑別之具有此等標記物之CD45+細胞之相對比例。結果
在攜帶MC38之小鼠中，活體內活化抗體2-14及抗體2-20 (圖16A及16C)。未活體內偵測到抗體2-19之活化(圖16B)。亦未偵測到抗體2-16、抗體2-17、抗體2-18及抗體2-21之活化(數據未展示)，且亦未偵測到陰性對照抗體2-15之活化。與健康、未攜帶腫瘤之小鼠相比，攜帶MC38之小鼠中的抗體2-14之活化百分比顯著更大，如藉由2向ANOVA (經調節之P值=0.0113)所測定(圖16D)。
使用攜帶MC38腫瘤之小鼠之研究結果描繪於圖19A-19D中，其中針對CD3+/ICOS+、CD3+ T細胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+ T細胞、CD8+/ICOS+、CD8+ T細胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+之標記物選擇性提供脾CD45+ (圖19A及19B)或瘤內CD45+ (圖19C及19D)之相對比例。統計數據提供於圖19E (脾細胞)及19F (瘤內細胞)中。第1組：IgG，第2組：抗體2-1；第3組：抗體2-10；第4組：伊派利單抗；第5組：伊派利單抗-aFuc。
使用接受20 µg、7 µg或2 µg測試抗體之單次注射的攜帶MC38腫瘤之小鼠之研究結果描繪於圖20A及20B中。圖20A展示抗體2-6、抗體2-10及具有Fc域中之S239D及I332E突變之RSV抗體(RSV-m)的隨時間推移之腫瘤體積(mm3 )。如圖20A中所示，與經掩蔽但不可裂解之抗體2-10相比，未經掩蔽之親本抗體2-6抑制腫瘤生長。圖20B描繪隨時間推移之腫瘤體積之腫瘤平均值，其表明與抗體2-10或RSV-m對照物相比，在投與抗體2-6後之腫瘤生長較慢。實例 14 ： 藉由抗 CTLA4 抗體實現之 ADCC 活性 及 CTLA4 阻斷 方法 報導子生物分析法
使用各種抗CTLA4抗體進行FcγRIIIa報導子生物分析法。在預溫熱之完全培養基(具有RPMI1640之FBS)中稀釋抗體。將CTLA4效應細胞(目標細胞：Promega J158A)解凍且轉移至含有完全培養基之錐形管中。混合細胞且計數，且將細胞之密度調節至1×106 個細胞/毫升。向96孔盤(Corning，目錄號：3917)之各孔中添加目標細胞。向適合的孔中添加經稀釋之抗體且一式兩份地測試。溫和地混合各孔之內含物且盤在37℃下培養十五分鐘。將效應細胞(表現Jurkat細胞之FcγRIIIa)解凍且轉移至含有完全培養基之錐形管中。混合細胞且計數，且將細胞之密度調節至3×106 個細胞/毫升。緊接著，將效應細胞分配至各孔中且溫和地混合。盤用蓋子覆蓋且在37℃下保持六小時。在量測之前一小時，在4℃下移出Bio-Glo受質及Bio-Glo緩衝液。將Bio-Glo緩衝液轉移至Bio-Glo受質之瓶中以產生Bio-Glo試劑，且藉由翻轉來溫和地混合。瓶保持在室溫下。在培養之後，自培養箱移出分析盤且在室溫下保持十分鐘。向各孔中添加Bio-Glo試劑，且盤在室溫下培養五-十五分鐘。接著，用光度計對盤進行讀取。
所測試之抗體包括抗體2-6、抗體2-14及抗體2-15以及同型對照物。抗體2-6為針對抗體2-14及抗體2-15之未經掩蔽之親本抗體。抗體2-15包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。抗體2-6、抗體2-14及抗體2-15各自在未預先暴露於蛋白酶之情況下測試，且亦在暴露於蛋白酶之後測試，該蛋白酶藉由可裂解肽之裂解而實現活化。藉由將抗體之EC50除以未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)之EC50來計算各抗體之包藏度。結果
未經掩蔽之親本抗體2-6在存在及不存在蛋白酶之情況下顯示類似的報導子活化曲線(圖17)。當在未預先暴露於蛋白酶之情況下測試時，與未經掩蔽之親本抗體2-6相比，經掩蔽之抗體(抗體2-14及抗體2-15)顯示降低之報導子活化(圖17)。抗體2-15 (其不可由蛋白酶活化)之報導子活化未由於預先添加蛋白酶而被挽救(亦即，未恢復至與未經掩蔽之親本抗體2-6相關聯之水準類似的活化水準)(圖17)。抗體2-14 (其可由蛋白酶活化)之報導子活化被挽救至與未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)相關聯之水準類似之水準(圖17)。所測試之抗體之EC50值及包藏值提供於表14中。表 14
抗體 蛋白酶 EC50 (ng/mL) ± SE R2 包藏度
抗體2-6 - 8.0 × 10-3 ± 1.8 × 10-3 0.927   
抗體2-6 + 4.9 × 10-3 ± 1.3 × 10-3 0.8759 0.6
抗體2-14 - 33 ± 6 0.9906 4,125
抗體2-14 + 2.8 × 10-3 ± 0.5 × 10-3 0.8953 0.4
抗體2-15 - 19 ± 2 0.9942 2,375
抗體2-15 + 10 ± 2 0.9722 1,250
CTLA4 阻斷生物分析法
使用CTLA4阻斷生物分析法測試抗CTLA4抗體(包括經掩蔽之抗CTLA4抗體)阻斷CTLA4與其配位體CD80及CD86之相互相用之能力。抗體在預溫熱之完全培養基中稀釋。將表現Jurkat細胞(效應細胞)之CTLA4解凍且轉移至含有完全培養基之錐形管中。混合細胞且計數。向96孔盤(Corning，#3917)之各孔中添加細胞。向適合的孔中添加經稀釋之抗體且一式兩份地測試。溫和地混合盤且在37℃下培養15分鐘。將APC細胞(表現Raji細胞之CD80/CD86)解凍且轉移至含有完全培養基之錐形管中。溫和地混合細胞，計數且立即分配至各孔中且溫和地混合。覆蓋盤且在37℃下保持6小時。藉由翻轉來溫和地混合Bio-Glo試劑且瓶保持在室溫下。在培養六小時之後，自培養箱移出分析盤且在室溫下保持十分鐘。向各孔中添加Bio-Glo試劑且盤在室溫下培養五-十五分鐘。接著，用光度計讀取盤且使用GraphPad Prism分析。使用單向ANOVA比較進行阻斷結合之能力之倍數變化之統計分析。
所測試之抗體包括抗體2-2及抗體2-14以及同型對照物。抗體2-2為抗體2之未經掩蔽之形式。抗體2-14在未預先暴露於蛋白酶之情況下(亦即，以經掩蔽之未經活化之形式)測試，且亦在暴露於蛋白酶之後(亦即，以經活化之形式)測試。亦在不使用抗體之情況下進行分析法(亦即，作為無抗體對照)。結果
如圖18A中所示，當由於不存在蛋白酶而呈未經活化之形式時，抗體2-14未顯示有效阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力。對於阻斷CTLA4與其配位體之結合，高於無抗體之對照物之倍數變化之分析未顯示呈未經活化之形式的抗體2-14之能力與同型對照物之能力之間的顯著差異(圖18B)。然而，當抗體2-14由於預先暴露於蛋白酶而呈經活化之形式時，其在某一範圍內之濃度下顯示有效阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力(圖18A)。經活化之抗體2-14阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力與未經掩蔽之抗體2-2類似(圖18A及18B)。實情為，對於阻斷CTLA4與其配位體之結合，高於無抗體之對照物之倍數變化之分析未顯示經活化之抗體2-14與未經掩蔽之抗體2-2之能力之間的顯著差異(圖18B)。 實例15：抗CTLA4抗體在MB49鼠類膀胱腫瘤模型中之功效及藥效學方法
使用MB49鼠類膀胱腫瘤模型評估抗CTLA4抗體之功效及藥效學(PD)。藉由投與各測試抗體(RSV-m對照抗體、伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-14及抗體2-15)且接著評估腫瘤體積及體重來評估功效。抗RSV對照抗體含有S239D及I332E突變(RSV-m對照抗體)。在第5天亦進行周邊免疫表型分析，其評估在投藥後第5天，周邊血液中CD4+Ki67+細胞之百分比及CD4+ICOS+細胞之百分比。評估十四個小鼠群組以進行功效研究，其中劑量(mg/kg)如表15中所示。如本文中所使用，呈mg/kg形式之劑量亦稱為「mpk」。將MB49細胞皮下接種至C57/BL6-huCTLA4小鼠中。當腫瘤達到約350 mm3 時開始處理。進行單向ANOVA及鄧奈特事後檢定(Dunnett's post-test)以測定處理組與對照組(RSV-m對照物)之統計顯著性。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。 表15
群組 抗體 劑量(mg/kg)
1 RSV-m對照物 10
2 伊派利單抗 0.3
3 伊派利單抗 1
4 伊派利單抗 3
5 抗體2-6 0.3
6 抗體2-6 1
7 抗體2-6 3
8 抗體2-6 10
9 抗體2-14 1
10 抗體2-14 3
11 抗體2-14 10
12 抗體2-15 1
13 抗體2-15 3
14 抗體2-15 10
藉由向五個小鼠群組中之每一者投與抗體來評估藥效學，其中劑量(mg/kg)如表16中所示。在腫瘤、肝臟、脾及血液中進行免疫表型分析及其他讀取。藉由以CD4+細胞之百分比形式量測Foxp3+CD25+細胞來評估T細胞，且以CD45+細胞之百分比形式量測CD8+細胞。亦評估腫瘤、肝臟、腎臟、脾及血漿中之裂解及藥物含量。 表16
群組 抗體 劑量(mg/kg)
1 RSV-m對照物 10
2 伊派利單抗 3
3 抗體2-6 3
4 抗體2-14 3
5 抗體2-15 3
結果
圖23A展示在投藥後第5天，對周邊血液中之CD4+Ki67+細胞(左側)及CD4+ICOS+細胞(右側)之百分比之功效研究之結果，其表示T細胞活化水準。結果表明，經掩蔽之抗CTLA4抗體(抗體2-14)在10 mg/kg之劑量下所呈現之T細胞活化低於抗CTLA4抗體伊派利單抗在低3.3倍之劑量(3 mg/kg)下所呈現之T細胞活化。此表明在MB49鼠類模型中，經掩蔽之抗體2-14比伊派利單抗更安全。
如圖23B中所示，在用10 mg/kg (RSV-m對照物)或3 mg/kg (伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-14、抗體2-15)處理之小鼠中，在第7天評估腫瘤重量及CD8/Treg比率。在第7天，在3 mg/kg下，用抗體2-6或抗體2-14處理之小鼠呈現最低的腫瘤重量及最高的腫瘤中之CD8/Treg比率。在所有療法情況下皆未觀測到體重、脾重量、腎臟重量或肝臟重量之改變(數據未展示)。
如圖23C中所示，在抗體2-14但非伊派利單抗之情況下觀測到調節性T細胞消耗及CD8+ T細胞活化。
如圖23D中所示，在用抗CTLA4抗體處理後觀測到強抗腫瘤活性。在0.3 mg/kg劑量下，抗體2-6與伊派利單抗相比顯示更好的抗腫瘤活性。 實例16：腫瘤、肝臟、腎臟、脾及血漿中之抗CTLA4抗體之活體內裂解偵測方法
自Biocytogen購得B-hCTLA-4基因轉殖雌性小鼠且在研究開始時之年齡為8-10週。將MC38結腸直腸腫瘤細胞(5×105 個細胞/小鼠)、MB49膀胱癌細胞(1×106 個細胞/小鼠)或MCA205纖維肉瘤細胞(1×106 個細胞/小鼠)皮下接種至各小鼠之右側腹中。在腫瘤尺寸達到約250-500 mm3 時(第0天)，小鼠接受所指示之抗體之單次10 mg/kg腹膜內給藥。在第4天收集腫瘤、肝臟、腎臟、脾及血漿以藉由西方墨點法進行裂解分析。
對於血漿樣本，藉由在梯度規則預製凝膠(BioRad)上分離等體積之變性血漿(1-2 µL輸入物)來利用直接西方墨點法。接著，使用Turbo Transblot系統(BioRad)將經分離之蛋白質轉移至硝化纖維膜中。接著，使用標準方法針對與HRP結合之抗體(ab202549)之抗人類κ輕鏈反應性研究膜。目視評估裂解，因為在2 kD之質量差異下，經裂解之輕鏈之遷移低於未裂解之輕鏈。
在補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Thermo Fisher，78442)之RIPA緩衝液(Pierce，87788)中，使用Tissue Lyser II (Qiagen)珠粒均質器產生來自腫瘤、肝臟、脾及腎臟之蛋白質溶解物。藉由BCA分析法測定蛋白質濃度且3 mg組織溶解物與生物素結合之抗人類κ輕鏈抗體(LSBio，LS-C351451-500)及抗生蛋白鏈菌素磁珠(Pierce，88816)一起經歷免疫沈澱。蛋白質在50 µL 10 mM甘胺酸(pH 2)中溶離且用1 M Tris (pH 8)中和，隨後進行如上文所描述之人類κ輕鏈之西方墨點法偵測。
在另一項研究中，使用CTLA4 ELISA分析法評估健康的猴(食蟹獼猴)組織(N=2)及血漿(N=3)之離體裂解。所測試之組織包括腎臟、脾、肝臟、膀胱、皮膚、結腸及肺。
在另一項研究中，在投藥之後第1小時、第1天及第7天評估健康食蟹獼猴之血漿中之活體內裂解。藉由毛細電泳法(CE)及質譜法(MS)鑑別裂解。計算抗體2-14內之預期裂解位點(VPLS**LY)處的裂解產物之豐度。亦計算另一位點(VPLSLY**SGG)處之裂解以進行比較。亦計算抗體2-16之裂解物之豐度。
在另一項研究中，使用CTLA4 ELISA分析法評估鼠類腫瘤、組織及血漿中之離體裂解。此包括以下鼠類模型：C57/Bl6 (N=9)、野生型小鼠中之MC38 (N=9)、hCTLA4小鼠中之MC38 (N=5)、野生型小鼠中之MB49 (N=6)、野生型小鼠中之MCA205 (N=4)及野生型小鼠中之B16 (N=4)。評估腫瘤、脾、肝臟、腎臟及血漿中之裂解。將血漿樣本彙集。計算裂解發生率及裂解分子之百分比(中值)。
在另一項研究中，使用來自人類腫瘤(結腸腫瘤、肺腫瘤)之人類條件培養基進行離體裂解。在分析之前，在兩輪免疫沈澱中使用蛋白質A/G珠粒以自人類樣本移除人類IgG。使用抗hkLC抗體進行SDS-PAGE分析，以偵測所測試之抗體之裂解及未裂解形式。進行ELISA分析以計算裂解百分比(%)。結果
如圖24A中所示，對於使用MCA205纖維肉瘤細胞之研究，在抗體2-14但非抗體2-16之情況下，在腫瘤及肝臟組織中偵測到大量裂解產物。陽性對照物(對照物*)包括來自抗體2-14之具有50%未裂解及50%裂解產物之樣本。
如圖24B中所示，對於使用MB49膀胱癌細胞之研究，在抗體2-14但非抗體2-16之情況下，在肝臟組織中偵測到大量裂解產物。陽性對照物(對照物*)包括來自抗體2-14之具有50%未裂解及50%裂解產物之樣本。
如圖24C中所示，對於使用MC38結腸直腸癌細胞之研究，在抗體2-14但非抗體2-16之情況下，在肝臟組織中偵測到大量裂解產物。陽性對照物(對照物*)包括來自抗體2-14之具有50%未裂解及50%裂解產物之樣本。
亦進行以下研究：藉由ELISA分析法定量向攜帶MB49之小鼠投與之各抗體之IgG含量，且接著在經CTLA4塗佈之MSD盤上，以1 µg/mL (脾)或0.04 µg/mL (腎臟及肝臟組織)開始在一系列3倍稀釋物中分析各樣本，以評估CTLA4結合。此等研究包括未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)、經掩蔽及可裂解之抗體(例如抗體2-14及抗體2-16)及經掩蔽但不可裂解之抗體(抗體2-10)。圖24D為展示抗體2-14之裂解產物之百分比(%)之SDS-PAGE分析。基於感光強度計算裂解百分比(裂解百分比=低譜帶/(低譜帶+高譜帶))。第一泳道(左側)展示血漿中之28%裂解、腎臟中之60%裂解、肝臟中之59%裂解及脾中之73%裂解。第二泳道(中間)展示血漿中之39%裂解、腎臟中之54%裂解、肝臟中之77%裂解及脾中之72%裂解。第三泳道(右側)展示血漿中之35%裂解、腎臟中之64%裂解、肝臟中之75%裂解及脾中之69%裂解。箭頭指示用於評估與CTLA4之結合之樣本，結果展示於圖24E中。圖24E展示各抗體與CTLA4之間的結合，其中在對攜帶MB49之B-hCTLA4基因轉殖小鼠進行投藥後，自血漿、腎臟、肝臟或脾分離各抗體。如圖24E中所示，不可裂解的經掩蔽之抗體2-10與未經掩蔽之親本抗體2-6相比顯示降低之結合，而可裂解的經掩蔽之抗體2-14在肝臟及脾中顯示與抗體2-6類似之結合且在血漿、腎臟、肝臟及脾中顯示與抗體2-10相比更多之結合。在腎臟、肝臟及脾中，抗體2-16與抗體2-10相比顯示更強之結合。圖24F描繪由一組例示性蛋白酶進行之可裂解肽受質之活體外裂解之熱圖。
使用CTLA4 ELISA分析法測試食蟹獼猴器官及血漿中之抗體2-14、抗體2-15、抗體2-10、抗體2-16及抗體1334之離體裂解之研究概述如下。抗體2-14在肺(88%)、膀胱(37%)及結腸(36%)中顯示高裂解百分比。抗體2-16在肺(30%)及脾(15%)中顯示中等裂解百分比。抗體1334在肺(22%)中顯示中等裂解百分比。抗體2-14在血漿(4%)中顯示低裂解百分比。在血漿中未偵測到抗體2-16之裂解。抗體1334在血漿(5%)中顯示低裂解百分比。
對於C57/Bl6-wt、MC38-wt、MC38-hCTLA4、M49-wt、MCA205-wt及B16小鼠，使用CTLA4 ELISA分析法評估用於測試某些抗體(例如抗體2-14、抗體2-15、抗體2-10、抗體2-16及抗體1334)在鼠類腫瘤、組織及血漿中之離體裂解之研究之結果，如圖25A-25F中所展示。如藉由ELISA分析法計算之裂解分子之百分比概述於表17中。 表17. 裂解分子百分比(%)
鼠類模型 組織 抗體2-14 抗體2-15 抗體2-10 抗體2-16 抗體1334
C57/Bl6-wt 脾(n=9) 3% 2% 2% 3% 4%
肝(n=9) 2% 2% 3% 2% 2%
腎(n=9) 7% 4% 3% 2% 40%
血漿(n=2) 6% 3% 5% 19% 0%
MC38-wt 腫瘤(n=9) 1%    0% 4%   
脾(n=9) 4%    3% 0%   
肝(n=9) 2%    1% 5%   
腎(n=9) 8%    1% 3%   
血漿(n=1) 1% 0% 0% 0% 0%
MC38-hCTLA4 腫瘤(n=5) 0% 0% 0% 7% 1%
脾(n=5) 7% 0% 0% 6% 0%
肝(n=5) 2% 0% 2% 2% 6%
腎(n=5) 25% 4% 3% 5% 72%
血漿(n=1) 1% 0% 0% 0% 30%
MB49-wt 腫瘤(n=6) 1% 5% 15% 2% 0%
脾(n=6) 3% 0% 0% 1% 0%
肝(n=6) 0% 6% 7% 1% 4%
腎(n=6) 9% 2% 1% 5% 84%
血漿(n=1)       0% 4%   
MCA205-wt 腫瘤(n=4) 2% 2% 0% 0%   
脾(n=4) 0% 12% 0% 2%   
肝(n=4) 0% 2% 0% 0%   
腎(n=4) 10% 4% 1% 0%   
血漿(n=1) 0%    0% 0%   
B16-wt 腫瘤(n=4) 0% 0% 0% 0% 1%
脾(n=4) 2% 0% 2% 1% 3%
肝(n=4) 2% 0% 1% 1% 0%
腎(n=4) 16% 3% 3% 2% 38%
血漿(n=1) 0% 0% 0% 0% 1%
裂解發生率以雷達圖形式展示，如圖25A-25F中所示。關於腫瘤條件培養基中之裂解發生率，抗體2-14在MC38-wt之腫瘤條件培養基中呈現33%發生率、在MB49-wt之腫瘤條件培養基中呈現17%發生率且在MCA205-wt之腫瘤條件培養基中呈現25%發生率；且抗體2-16在MC38-wt之腫瘤條件培養基中呈現100%發生率、在MC38-hCTLA4之腫瘤條件培養基中呈現40%發生率且在MB49-wt之腫瘤條件培養基中呈現17%發生率。關於腎臟條件培養基中之裂解發生率，抗體2-14在MC38-wt、MC38-hCTLA4、MB49-wt、MCA205-wt及B16-wt之腎臟條件培養基中呈現100%發生率；且抗體2-16在MC38-wt之腎臟條件培養基中呈現67%發生率、在MC38-hCTLA4之腎臟條件培養基中呈現80%發生率、在MB49-wt之腎臟條件培養基中呈現17%發生率且在B16-wt之腎臟條件培養基中呈現100%發生率。
圖26A及26B描繪在健康食蟹獼猴之血漿中，使用抗體2-14之活體內裂解研究之結果。如圖26A中所示，所計算的使用毛細電泳法(CE)之抗體2-14之裂解為0% (所有三名個體，第1小時)、8% (第1號個體，第1天)、6% (第3號個體，第1天)及4% (第5號個體，第1天)；且為35% (第1號個體，第7天)、32% (第3號個體，第7天)及31% (第5號個體，第7天)。亦使用質譜(MS)計算第3號個體之抗體2-14之裂解，其計算為0% (第1小時)、18% (第1天)及32.3% (第7天)。對完整(亦即，未裂解)抗體2-14以及預期裂解位點(VPLS**LY)或另一位點(VPLSLY**SGG)處之裂解產物之豐度進行定量。所計算的完整抗體2-14之豐度為100% (第1小時)、82.1% (第24小時)及67.7% (第72小時)；所計算的裂解產物VPLS**LY之豐度為0% (第1小時)、17%(第24小時)及32.3%豐度(第72小時)；且所計算的裂解產物VPLSLY**SGG之豐度為0% (第1小時及第72小時)及1% (第24小時)。
圖26C描繪健康食蟹獼猴之血漿中，使用抗體2-16之活體內裂解研究之結果。如圖26C中所示，在測試條件下，使用CE或MS未鑑別到抗體2-16之裂解。所計算的完整(亦即，未裂解)抗體2-16之豐度為100%豐度(第1小時、第24小時及第72小時)。
圖27A及27B描繪離體裂解研究之結果，該等研究使用藉由人類肺或結腸腫瘤樣本調節之培養基。圖27A描繪SDS-PAGE分析，其展示藉由進行兩輪免疫沈澱(IP)來移除人類IgG，藉此實現裂解分析。圖27B描繪SDS-PAGE分析之結果，其展示在藉由人類腫瘤樣本調節之培養基中培養之後，存在呈裂解狀態、未裂解狀態或兩種狀態之測試抗體。亦用所展示之描繪裂解之所選樣本的裂解百分比(%)計算使用ELISA分析法之結果(參見圖28E)。如圖27B中所示，證實抗體2-14在腫瘤樣本中呈現裂解，且計算為在肺腫瘤樣本情況下呈現2.7%裂解、在結腸2 8aug結腸腫瘤樣本情況下呈現100%裂解、在結腸28aug結腸腫瘤樣本情況下呈現75%裂解且在結腸2 4sept結腸腫瘤樣本情況下呈現100%裂解。如圖27B中所示，證實抗體2-16在腫瘤樣本中呈現裂解，且計算為在肺腫瘤樣本情況下呈現21%裂解、在結腸2 8aug結腸腫瘤樣本情況下呈現98%裂解、在結腸28aug結腸腫瘤樣本情況下呈現45%裂解且在結腸2 4sept結腸腫瘤樣本情況下呈現100%裂解。此表明ELISA結合分析法之結果與裂解相關，如SDS-PAGE分析中關於抗體2-14及抗體2-16所示。
亦用結腸腫瘤上清液(結腸2 4 sept結腸腫瘤樣本)，使用質譜分析裂解分子之百分比(%)且與ELISA分析法結果進行比較。計算可裂解肽內之各位點處的完整(亦即，未裂解)抗體以及由裂解產生之裂解產物之豐度。結果展示於圖28A-28D中。如圖28A中所示，當在結腸腫瘤條件培養基中培養時，完整抗體2-14之豐度為4.8%，相比之下，當在作為對照物之RPMI中培養時，豐度為99.6%。當在結腸腫瘤條件培養基中培養抗體2-14時，L*SLY裂解產物之豐度為69%，S*LY裂解產物之豐度為5.9%，L*YSGG裂解產物之豐度為2.7%，Y*SGG裂解產物之豐度為11.3%，且S*GG裂解產物之豐度為6.3%。如圖28B中所示，當在結腸腫瘤條件培養基或作為對照物之RMPI中培養時，完整抗體2-15之豐度為98.8%。如圖28C中所示，當在結腸腫瘤條件培養基中培養時，完整抗體2-16之豐度為0.2%，相比之下，當在作為對照物之RMPI中培養時，豐度為99.8%。當在結腸腫瘤條件培養基中培養抗體2-16時，T*SGG裂解產物之豐度為96.8%。如圖28D中所示，當在結腸腫瘤條件培養基中培養時，完整抗體2-10之豐度為94.3%，相比之下，當在作為對照物之RMPI中培養時，豐度為97.5%。
使用抗體2-6、抗體2-14、抗體2-15、抗體2-10、抗體2-16及含有Fc域中之S239D及I332E突變之伊派利單抗之經掩蔽之版本(經掩蔽之伊派利單抗-m)進行ELISA分析法，其中在結腸腫瘤條件培養基(結腸2 4 sept結腸腫瘤樣本)或作為對照物之RPMI中培養各所測試之抗體。結果展示於圖28E中。所計算的抗體2-14呈現100%分子裂解，所計算的抗體2-15呈現0%分子裂解，所計算的抗體2-10呈現4%分子裂解，且所計算的抗體2-16呈現100%分子裂解。
對於裂解分子之百分比(%)，圖28A-28D中展示之MS數據與ELISA數據相關。對於抗體2-14，在此結腸腫瘤樣本之情況下，ELISA分析展示100%裂解，相比之下，基於MS數據時為95.2%。對於抗體2-15，在此結腸腫瘤樣本之情況下，ELISA分析展示0%裂解，相比之下，基於MS數據時為1.2%。對於抗體2-10，在此結腸腫瘤樣本之情況下，ELISA分析展示4%裂解，相比之下，基於MS數據時為5.7%。對於抗體2-16，在此結腸腫瘤樣本之情況下，ELISA分析展示100%裂解，相比之下，基於MS數據時為99.8%。
使用自聯合人類組織樣本庫(Cooperative Human Tissue Network；CHTN)獲得之人類腫瘤組織及與腫瘤組織相鄰之正常組織(NAT)進行抗CTLA4 ELISA分析。所測試之抗體包括抗體2-14、抗體2-16及抗體1334。表18概述結果。如表18中所示，抗體2-14 (65%)之人類腫瘤組織之裂解之總發生率高於抗體2-16 (22%)。抗體2-16 (26%)之由腫瘤裂解之分子之百分比略微高於抗體2-14 (22%)。抗體2-14 (24%)之由NAT裂解之分子之總百分比高於抗體2-16 (7%)。 表18
      裂解發生率 裂解百分比(%)
抗體 組織 NAT 腫瘤 NAT 腫瘤
抗體2-14 黑素瘤 1/1 3/3 100% 18%
腎細胞 19/25 15/26 10% 25%
卵巢 1/1 4/9 4% 5%
膀胱 3/3 4/5 56% 7%
淋巴結    1/1    2%
結腸 8/8 7/7 34% 46%
肺 5/6 4/7 3% 4%
*** 3/4 3/4 64% 37%
肝 4/5 3/6 28% 2%
總計 44/53 = 83% 44/68 = 65% 24% 22%
抗體2-16 黑素瘤 1/1 1/3 9% 1%
腎細胞 9/25 4/26 2% 26%
卵巢 0/1 2/9 0% 5%
膀胱 0/3 0/5 0% 0%
淋巴結    0/1    0%
結腸 3/8 5/7 3% 50%
肺 1/6 1/7 2% 21%
*** 1/4 1/4 5% 6%
肝 1/5 1/6 71% 2%
總計 16/53 = 30% 15/68 = 22% 7% 26%
抗體1334 黑素瘤 1/1 2/3 32% 4%
腎細胞 16/24 17/25 8% 15%
卵巢 1/1 3/9 5% 6%
膀胱 2/3 4/5 57% 8%
淋巴結    1/1    14%
結腸 2/6 4/6 41% 39%
肺 1/6 1/7 18% 6%
*** 2/4 2/3 20% 11%
肝 4/5 2/6 28% 4%
總計 26/50 = 52% 33/65 = 51% 18% 14%
實例 17 ：用患者腫瘤及正常相鄰組織 (NAT) 進行之 MC38 及 H228 細胞株之酶及蛋白質組分析
根據標準方案(Thermo Scientific #23225)，藉由二喹啉甲酸(BCA)分析法評估樣本中之總蛋白質濃度。腫瘤/NAT對樣本之濃度為約1 mg/mL，而細胞株樣本之濃度低約10倍。因此，使用10 kDa截止膜將兩個重複細胞株樣本(MC38-1及H2228-1)濃縮10倍。樣本與A MSP-MS文庫一起在50 μg/mL之蛋白質之最終反應濃度下培養。 A. 細胞毒性
使用LDH分析法(Thermo Scientific #88953)根據製造商方案在條件培養基樣本中量測乳酸脫氫酶(LDH)之活性，以量測細胞毒性。亦在作為MC38之對照物之無血清DMEM培養基及作為H2228之對照物之具有或不具有血清之RPMI以及NAT/腫瘤樣本中量測背景LDH活性。相對於相應背景培養基對照物之細胞毒性來表示細胞毒性。
使用條件培養基樣本中之LDH之活性作為壞死之代表，如圖29中所示。圖29展示使用在不含血清或補充有胎牛血清(FCS)之培養基中完成的LDH釋放分析法量測之細胞毒性，該培養基用所指示之細胞株或腫瘤/NAT組織調節。吸光度值表示為在各樣本之相應培養基中量測之基線活性之百分比。儘管MC38細胞具有與先前細胞活力數據類似之LDH細胞毒性，但H2228細胞具有高於預期之細胞毒性(比MC38高約2.6倍)。
當在無血清培養基中培養時，腫瘤及NAT組織展示增加之細胞死亡。腫瘤樣本比NAT樣本對血清不足更敏感，潛在地反映腫瘤樣本中之較高生長速率。如圖29中所示，與無血清培養基中之組織或所培養之細胞株相比，在完全培養基中培養之組織樣本具有最低細胞毒性水準。 B. 蛋白酶特異性分析
藉由質譜(A MSP-MS)方法，用Alaunus多重受質分析(Alaunus Multiplex Substrate Profiling)進行蛋白酶特異性篩檢。此方法使用物理-化學多樣性肽文庫作為蛋白酶之受質，且藉由裂解產物之質譜偵測隨時間推移而監測反應。藉由與來自不含酶之對照性培養之結果相比較，針對經酶處理之樣本中之特異性裂解來評估所得裂解。
對於特異性概況之差異分析，用iceLogo軟體(v.1.2)產生各位置處之各胺基酸之Z 分數之矩陣。此等Z 分數計算特定胺基酸之出現率與平均值(亦即，陰性參考集合中該特定位置處之特異性胺基酸之出現率)之偏差次數。接著，使用gplot及RColorBrewer套裝軟體，使用樣本對之間的差異Z 分數產生R環境中之熱圖。
經由LC-MS/MS鑑別來自A MSP-MS文庫之時間依賴性肽裂解產物。兩個細胞株樣本MC38及H228各自展示良好的針對文庫之活性水準。在時程期間觀測到之裂解總數為40 (15分鐘)、107 (60分鐘)及306 (240分鐘)，對於MC38；149 (15分鐘)、170 (60分鐘)及371 (240分鐘)，對於H2228。由跨越整個時程觀測到之453 (對於MC38)及690 (對於H2228)次裂解之累積列表外推受質特異性之概況，且在圖30中使用iceLogo表示法報導。IceLogo考慮肽文庫中之裂解及未裂解之位置，且用於觀察在(P1-P1')處側接裂解位點之胺基酸之倍數富集及去富集。圖30以iceLogo圖形式展示MC38及H2228細胞株之受質裂解。字母高度量測相對於文庫中之所有可能的肽裂解，經裂解之肽之胺基酸出現率之差異百分比，在各位置P4至P4'處標繪。中心線上方之殘基為有利的；中心線下方之殘基為不利的。藉由物理化學性質對統計顯著殘基(p ≤0.05)進行著色(黑色：疏水性；紅色：酸性；藍色：鹼性；紫色：醯胺化；綠色：小型)。灰色殘基係在p ＞0.05下觀測。
本文中藉由A MSP-MS鑑別之特異性概況展示內肽酶活性，極偏好兩種細胞株共有之P1中之疏水性及鹼性胺基酸。MC38細胞展示對P1'中之R及Y以及在P3、P2及P4'處之其他疏水性特異性之偏好。H2228細胞展示對P1'處之H、S及Y以及P2'及P4'處之其他疏水性特異性之偏好。 C. NAT 及腫瘤差異分析
如上文在實例 17.B 中所描述鑑別來自MSP-MS文庫之時間依賴性肽裂解產物。兩份患者組織樣本展示針對文庫之高活性水準。在時程期間觀測到之總裂解數目為134 (15分鐘)、270 (60分鐘)及475 (240分鐘)，對於NAT；63 (15分鐘)、184 (60分鐘)及447 (240分鐘)，對於腫瘤組織。有跨越整個時程觀測之879 (對於NAT)及694 (對於腫瘤)次裂解之累積列表外推受質特異性之概況，且使用展示於圖31A中之iceLogo表示法報導。與圖2相同，圖31A及31B以iceLogo形式展示NAT及腫瘤(TUM)組織之受質裂解。
此外，在更長的24小時時間點時監測兩份患者樣本針對文庫之活性，以揭示受質特異性中之其他差異。在此額外時間點時觀測到之裂解為719次(對於NAT)及636次(對於腫瘤)。整個時程(包括24小時時間點)之概況展示於圖31B中。正白胺酸(n)為文庫中Met之替代物。NAT樣本展示對P1中之鹼性胺基酸(主要為R及K)以及P1'中之R、H及S之強烈偏好。腫瘤樣本展示對P1中之鹼性(R及K)及疏水性胺基酸之偏好，以及對P1'中之H之強烈偏好。腫瘤樣本亦展示對P2'處之疏水性胺基酸之偏好，而患者樣本共有對P4'處之疏水性胺基酸之偏好。
為定量NAT與腫瘤樣本之間的整體受質特異性之差異，亦使用來自各樣本中之裂解之Z 分數以產生來源於各子位點處之殘基偏好之差異圖，如圖31C中所展示。圖31C以熱圖形式展示P4-P4'位置處Z分數之差異，以突出有利於NAT或腫瘤特異性裂解之殘基。正白胺酸(n)為文庫中Met之替代物。此確認NAT樣本中P1處之離胺酸及精胺酸之主要特異性，以及突出對其他位置之其他較小偏好，尤其在腫瘤樣本中(諸如P1中之G及F)。
包含細胞株H2228可提供在特異性概況方面比較永生化細胞株與類似來源之主要組織之機會，本文中選擇非小細胞肺癌(NSCLC)。與腫瘤樣本相比，H2228細胞展示更顯著之與NAT之特異性差異。此外，當與NAT (左圖)比較時，此差異分析表明H2228細胞中之一些偏好，其與以類似方式與NAT比較之腫瘤組織(包括P1處之G、H及F)之概況類似。然而，亦在H2228細胞與圖31D中展示之腫瘤組織之間偵測到特異性差異(儘管明顯較低)，提供對腫瘤微環境中之蛋白酶活性方面之患者非均質性之支持。圖31D以熱圖形式展示P4-P4'位置處Z分數之差異，以突出與NAT或腫瘤樣本相比，有利於H2228特異性裂解之殘基。正白胺酸(n)為文庫中Met之替代物。 D. 肽序列之動力學分析
經由A MSP-MS分析表19中展示之十個序列(AK10)。自原始序列略微修飾此等序列以產生質譜相容肽(在一些情況下，添加鹼性殘基以增加正電荷)及間隔殘基(GG)，以產生更長的約14聚體肽。在A MSP-MS反應中，在500 nM最終濃度下製備肽。亦藉由LC-MS/MS分別分析AK10文庫，以進行肽物質之化學驗證。 表19
受質名稱 相關序列 用於分析之經修飾之序列
AK-01 ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO:464) KISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO:470)
AK-02 AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO:465) RAVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO:471)
AK-03 VPLSLYSG (SEQ ID NO:466) RGGVPLSLYSGGGK (SEQ ID NO:472)
AK-04 MPYDLYHP RGGMPYDLYHPGGK (SEQ ID NO:473)
AK-05 DSGGFMLT RGGDSGGFMLTGGK (SEQ ID NO:474)
AK-06 HEQLTV RGSGHEQLTVGGSK (SEQ ID NO:475)
AK-07 RAAAVKSP GSGRAAAVKSPGSK (SEQ ID NO:476)
AK-08 RQARVVG (SEQ ID NO:467) GSGRQARVVGGGSK (SEQ ID NO:477)
AK-09 LSGRSNAMPYDLYHP (SEQ ID NO:468) N/A (未經修飾)
AK-10 MPYDLYHPRQARVVG (SEQ ID NO:469) N/A (未經修飾)
在標準受質特異性分析條件下進行A MSP-MS分析，在反應培養期間之取樣時間點為0、15、60、240及1200分鐘。由各肽物質之MS1前驅體離子峰面積，藉由質譜無標記之定量對肽進行定量。在GraphPad Prism軟體v 8.0中將酶進程曲線模型化且使用非線性最小平方擬合來擬合數據與一級動力學方程式： 𝑌 = 𝑒( — [K obs ]t ) 其中Y =產物形成百分比，Kobs 為所觀測之比率，且t =時間。在米-門二氏動力學(Michaelis-Menten kinetics)中，所觀測之比率Kobs 為酶濃度與催化效率之函數(kcat /KM )。在酶混合物之此分析中，使用Kobs 對產物裂解進行分級。
為表示A MSP-MS反應中AK10肽之整體照片，隨時間推移標繪各受質肽之標準化相對豐度。用MC38無血清條件培養基，經由AMSP-MS監測AK10文庫中之受質肽之相對豐度。觀測到對於MC38無血清條件培養基反應，由於酶促及非酶促過程之組合(諸如Met氧化)，各受質之豐度在不同比率下降低。為評估酶促裂解，亦需要產物形成分析。
為評估受質是否被酶促處理耗盡，針對理想地達到飽和之單相衰變模型之擬合品質評估產物形成率。圖32A及32B展示所選擇之肽之個別進程曲線，在MC38細胞株情況下發生明顯降解。圖32A及32B展示在MC38條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖32A，左側)、AK10-02 (圖32A，右側)；AK10-04 (圖32B，左側)及AK10-05 (圖32B，右側)。在AK10-02之情況下，顯而易見透明產物形成，具有極微小曲線，而由AK10-01、AK10-4及AK10-05形成之「產物」之非特異性降解之實例。AK10-01基本上為線性，AK10-04存在於時間零點，其AK10-05之產物由於化學過程(藉由LC-MS/MS觀測到之過程)繼續降解。
MC38之最佳受質為AK-09及AK-10，其中觀測到此等肽之多個裂解產物。擬合其進程曲線與一級動力學比率，且接著藉由其相對效率對裂解進行分級，如圖33中所示。圖33展示來自使用AK10文庫肽之MC38 AMSP-MS反應之主要裂解產物之相對效率。最快速裂解在肽AK-10中之PRQA|RVVG處發生，其中「|」指示易切斷的鍵。在肽AK-09中，在最有效受質之窄倍數範圍內觀測到多次裂解，其中裂解位於：LS|GRSNAM、LSG|RSNAM及LSGR|SNAM。亦展示AK-02之低效裂解。
H2228細胞株產生肽AK10-01、-02、-04、-09及-10中之裂解。個別受質之產物形成展示於圖34A及34B中。圖34A及34B展示在H2228條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖34A，左上部)、AK10-02 (圖34A，右上部)、AK10-04 (圖34A，下部)、AK10-09 (圖34B，左側)及AK10-10 (圖34B，右側)。由H2228條件培養基裂解之最高受質及所計算之相對效率展示於圖35中。
擬合AK10文庫中之最高裂解受質與一級動力學比率，且最有效裂解基元為：YDLY|HP及LSGR|S。基元LSGR|S在三個肽中按以下排序順序裂解：AK-01＞AK-09＞AK-02。YDLY|HP基元在兩個肽之情形下按以下排序順序裂解：AK-04＞AK-09。在肽AK-10中，易切斷的鍵偏移至HPRQ|AR，但此肽仍在最高受質之5倍效率內裂解。
患者樣本產生比AK10文庫肽之AMSP-MS分析中之任一種細胞株樣本更廣泛之裂解集合。個別產物形成跡線展示於圖36A-36C中。此等圖式描繪在腫瘤條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖36A，左上部)、AK10-02 (圖36A，中上部)、AK10-03 (圖36A，底部)、AK10-04 (圖36B，左上部)及AK10-05 (圖36B，右上部)、AK10-09 (圖36B，底部)、AK10-09氧化肽(圖36C，左側)及AK10-10 (圖36C，右側)。如前所述，觀測到肽AK-09之若干降解產物(在非氧化及氧化肽物質兩者中)。然而，肽AK-10之唯一顯著裂解位於PRQA|RVV處，且圖36C，右圖中之產物進程曲線支持二級反應降低產物信號。
腫瘤條件培養基中之AK10文庫之最高受質展示於圖36D中。最高裂解位於AK-03之LSLY|SG基元及AK-04之YDLY|HP中。來自H2228及腫瘤組織之NSCLC樣本共有肽AK-04 (在YDLY|HP處)及多個位點處之AK-09 (LSG|R|SNAMPYDLY|HP)之顯著裂解。
NAT條件培養基亦產生特異性裂解。受質豐度監測顯示在實驗情形內，顯著AK10文庫降解之整體趨勢。個別產物展示圖37A-37D中所描繪之一系列特性。圖37A-37D描繪在NAT條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖37A，上部)、AK10-02 (圖37A，下部)、AK10-04 (圖37B，上部)及AK10-05 (圖37B，下部)、AK10-09 (圖37C，上部)、AK10-09氧化肽(圖37C，下部)及AK10-10 (圖37D)。表現較好之受質為AK-01、-04、-09及-10，且較弱受質為AK-02及AK-05。
最有效的NAT催化之受質之動力學分析展示於圖37E中。最有效的NAT受質為AK-10 (LSGR|SDNH)，與H2228但非腫瘤樣本共有之裂解。其他有效受質為多個位點處之AK-09 (LS|GR|SNAMPYDLY|HP)，其中一些係與H2228及腫瘤共有，及AK-04 (在YDLY|HP處)。
此分析表明正常相鄰組織含有與其匹配腫瘤組織共有之位點特異性酶活性。特定言之，對於圖31A，右圖中展示之腫瘤條件培養基，YDLY |HP 裂解在iceLogo基元中顯而易見。朝向LSGR |S 基元之特異性在圖31A，右圖中之4小時反應之後產生之腫瘤條件培養基iceLogo中亦顯而易見，且甚至在圖31B，左圖中之同樣的既定24小時培養時間下，在NAT樣本中更明顯地偵測到。
MC38僅與在肽AK-09及AK-02中發現之LSGRS基元內之NSCLC樣本共有裂解。HPRQ|AR基元處由MC38進行之AK-10之裂解係與H2228但非腫瘤樣本共有，或在HPRQA|R位點處與NAT共有。GLSG|R S處AK-02之MC38裂解與其對Arg之強烈P1'偏好一致，如在圖30，左圖中描繪之其iceLogo基元中所見。
總而言之，表20支持AK10文庫肽具有與酶促裂解一致的一級動力學特性之結論。表20指示肽受質是否由條件培養基樣本裂解(是/否/未測定)。未測定指示其在經條件培養基處理之樣本中未被以完整或裂解物質之形式偵測到。 表20
   是否由條件培養基樣本裂解?
受質 MC38 H2228 NAT 腫瘤
AK-01 否 是 是 是
AK-02 否 是 否 是
AK-03 否 否 否 是
AK-04 否 是 是 是
AK-05 否 否 否 是
AK-06 否 否 否 否
AK-07 否 否 否 否
AK-08 未測定 未測定 未測定 未測定
AK-09 是 是 是 是
AK-10 是 是 是 是
E. 蛋白質組分析
藉由BCA分析法對樣本中之蛋白質濃度進行定量，且每次消化反應使用5 μg總蛋白質。樣本用4 M脲變性，用5 mM二硫蘇糖醇(DTT)藉由在56℃下反應30分鐘來還原。樣本用碘乙醯胺(IAM)在10 mM下，藉由在黑暗中，在室溫下反應1小時來烷基化。用5 mM DTT淬滅過量的IAM，且接著將反應物稀釋至1 M最終脲。樣本用測序級豬胰蛋白酶(Promega，V5111)，以1:50之胰蛋白酶:樣本質量比在37℃下消化隔夜。在第二天，用C18吸管尖(C18 zip tip，Millipore-Sigma)將所得肽消化樣本去鹽且接著冷凍乾燥。使樣本再懸浮於含0.1%甲酸之HPLC級水中以用於LC-MS/MS分析。
用配備有nanoACQUITY (Waters)超效LC (UPLC)系統及EASY-Spray離子源(Thermo)之QExactive Plus質譜儀(Thermo)進行藉由LC-MS/MS進行之肽測序。用EASY-Spray PepMap C18管柱(Thermo，ES800；3 μm珠粒尺寸，75 μm×150 mm)進行逆相層析。在14分鐘樣本裝載期間，在600 nl/min之流動速率下進行層析，且接著用含2至35% (體積/體積)乙腈之0.1%甲酸之線性梯度，在用於肽分離之400 nl/min之流動速率下進行層析歷時90分鐘。在最小值為2,000個計數、分離寬度為2.0m/z 且最小標準化碰撞能量為25之情況下，在六個最劇烈之前驅體離子上藉由高能碰撞解離(HCD)來進行肽片段化。
用MSConvert6 產生MS峰清單，且使用Protein Prospector軟體，v.5.22.1 (UCSF)分析數據。針對SwissProt人類或小鼠文庫(2017 年 11 月 1 日 下載 )檢索數據，分別總計20,240或16,942條項目。與人類NSCLC樣本獨立地分析MC38，一種小鼠細胞株。亦檢索SwissProt牛文庫以鑑別FCS蛋白質。使用誘餌數據庫檢索方法以評估假探索率(FDR)，且選擇用於報導蛋白質鑑別之分數閾值以實現＜1% FDR。質量容差設定為20 ppm (親本離子)及30 ppm (片段離子)，且在允許一個非特異性裂解及一個遺漏裂解之情況下選擇胰蛋白酶特異性。使用Cys上之胺甲醯胺基甲基化作為固定修飾。使用以下標準可變修飾：蛋白質N端乙醯化、蛋白質N端乙醯化+氧化、來自麩醯胺酸之N端焦麩胺酸形成、Met丟失及Met氧化。此外，在跨越重複樣本之既定實驗中，每次蛋白質鑑別要求進行一次LC-MS/MS最少需要至少兩個獨特肽。
藉由光譜計數(肽計數)以相對蛋白質豐度之近似值形式輸出數據。為校正各操作之間的蛋白質裝載之潛在差異，藉由來自操作之總計數之總和來標準化肽計數。接著在Perseus中處理檢索，數據經log2 標準化，接著若蛋白質在3個複本中之至少2個中未具有肽計數＞1，則排除該等蛋白質。接著，用由常態分佈估算之隨機數置換漏測值。在兩個複本集合之間進行威氏t測試(Welch's t-test)，且在R中產生火山圖。
蛋白質鑑別包括47種蛋白酶或蛋白酶抑制劑，包括基質金屬蛋白酶(Mmp2、7及12)、MMP抑制劑(Timp2)、蛋白酶體子單元(Psma)、絲胺酸蛋白酶抑制劑(serpins)及胱抑素、羧基肽酶(Cpe及Cpd)、組織蛋白酶(Ctsd、b、h、z及l)、胺基肽酶(Rnpep、Lap3)、鈣激活中性蛋白酶(Cpns)、脯胺醯基定向肽酶(Dpp3、Xpnpep1及Pepd)絲胺酸蛋白酶(Prss23)、三肽基-肽酶(Tpp1)、Adam10及Casp3。
蛋白酶及抑制劑豐度未必總計為所觀測之活性，但蛋白質鑑別提供對活性數據中鑑別之基元之理解。組織蛋白酶之存在可解釋P1 nLeu偏好(Ctsd)，或例如P1 Arg、Gly (Ctsb、Ctsl)。受質特異性概況中之P1處對鹼性殘基之強烈偏好亦可與來自凝血級聯之背景血清蛋白相關，如在蛋白質組數據中偵測到牛凝血酶及纖維蛋白溶酶。
組合人類NSCLC相關樣本之分析以實現樣本之間的比較；此包括H2228細胞株、患者腫瘤及正常相鄰組織。本文中，蛋白質組分析引起跨越所有三個樣本之2243個獨特蛋白質之確信鑑別。
鑑別包括蛋白酶及其抑制劑之類似清單：蛋白酶體子單元；胺基肽酶B及N；鈣蛋白酶子單元；羧基肽酶E及A；半胱天冬酶1、3、6、8；組織蛋白酶B、D、E、L1、L2、S及Z；DPP1、2及3；ADAM10；MMP14及9；MMP抑制劑1及2；絲胺酸蛋白酶抑制劑；絲胺酸蛋白酶HTRA1；脯胺醯基內肽酶，包括FAP、脯胺醯基胺基肽酶、三肽基肽酶TPP1及TPP2；以及凝血因子及補體蛋白質。
使用Perseus軟體進行在來自NAT及腫瘤樣本之條件培養基中偵測之蛋白質清單之實例差異分析，實現兩組重複樣本之間的差異表現之雙側威氏t測試(基於肽計數)。在圖38中之火山圖中觀測結果，其中在腫瘤(右上側，第2部分)或NAT (左上側，第1部分)中顯著富集之蛋白質存在於此等部分中。此清單中鑑別三種相關蛋白質：Serpin H1、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3)及巨噬細胞甘露糖受體1 (MRC1)。
總之，使用A MSP-MS進行之無偏活性分析顯示各樣本之裂解概況，及對於鹼性殘基之整體強烈偏好。MC38及H2228細胞株具有不同的蛋白酶特異性概況，而來自同一名患者之腫瘤及NAT組織共有類似的蛋白酶特異性，但差異分析顯示與腫瘤中之P1 Leu、Phe或Gly相比，NAT樣本中對P1 Arg/Lys之更強烈的偏好。比較性動力學分析表明兩個特異性基元在多個樣本及個別受質(包括YDLY|HP及LSGR|S)內穩定裂解。小鼠MC38細胞株與另一種人類NSCLC相關樣本具有不同的生物學來源，而在MC38條件培養基中鑑別之蛋白酶及抑制劑之集合與NSCLC集合明顯類似。由蛋白質組分析鑑別之蛋白酶包括具有與所觀測之AMSP-MS裂解一致的特異性之候選物，包括組織蛋白酶。 實例18：食蟹獼猴中經掩蔽之抗CTLA4抗體之活體內評估
在第一組實驗中，向食蟹獼猴投與伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-10或同型對照物，且藉由量測CD4+細胞中之Ki67+細胞之百分比(%)來評估藥效學(PD)作用。在第二組實驗中，向食蟹獼猴投與抗體2-6、抗體2-10、抗體2-14、抗體2-16或同型對照物，且藉由量測CD4+細胞中之Ki67+細胞之百分比(%)來評估藥效學作用。
第一及第二組PD實驗之結果展示於圖21中。與伊派利單抗相比，親本未經掩蔽之抗體2-6在誘導周邊PD作用方面更有效，如由與伊派利單抗相比，CD4+細胞中之Ki67+細胞之百分比升高所示。抗體2-10 (其為抗體2-6之經掩蔽但不可裂解之版本)阻斷與抗體2-6相關聯之PD作用。如第二組實驗(實驗2)中所示，與未經掩蔽之親本抗體2-6相比，經掩蔽及可裂解之抗體(抗體2-14及抗體2-16)呈現降低之PD作用。
亦使用食蟹獼猴，在測試抗體(RSV-m對照物、伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-10、抗體2-14、抗體2-16或伊派利單抗之含有Fc域中之S239D及I332D突變之經掩蔽之版本(經掩蔽之伊派利單抗-m))之10 mg/kg靜脈內給藥之後評估藥物動力學。量測血漿中各抗體之含量，且在兩項研究中量測半衰期(天)、Cmax (µg/mL)及曲線下面積(AUC)(天×微克/毫升)。
藥物動力學研究之結果展示於圖22中。圖22展示在14天時段內，各所投與之抗體之含量。此數據表明抗體2-14及抗體2-16在10 mg/kg靜脈內給藥之後，在食蟹獼猴中顯示有利的藥物動力學。
圖 1A 及1B 為一系列展示由掩蔽肽進行之抗CTLA4抗體包藏之活體外分析之曲線。進行表面電漿子共振(SPR)以檢驗9D9抗體(配位體)與掩蔽肽CNLIVEGHC (分析物)之間的A) 動力學及B) 親和力。在37℃下，以0.1至50 μM之增加濃度之2倍連續稀釋物進行分析。標繪減去參考之反應。SPR進行三次且展示來自一個實驗之代表性跡線。
圖 2A-2C 為一系列展示經掩蔽之鼠類抗CTLA4抗體之蛋白酶活化之曲線。圖 2A )與親本抗CTLA4抗體(9D9，實心圓)相比，可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體所呈現的與鼠類CTLA4-Fc (經掩蔽之9D9，實心正方形)之結合低90倍。以與親本抗CTLA4抗體類似之水準，可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體之蛋白酶活化完全恢復與鼠類CTLA4-Fc (蛋白酶活化，星號)之結合。X軸指示所測試之抗體之量。圖 2B) 與親本抗CTLA4抗體(9D9，實心圓)，可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9，實心倒三角形)及不可裂解之經掩蔽之抗CTLA4抗體(NC經掩蔽之9D9，空心正方形)所顯示的與鼠類CTLA4之結合分別低約156倍及約218倍。X軸指示所測試之抗體之量。圖 2C) 在不存在或存在重組MMP2之情況下，藉由ELISA測定可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)、不可裂解之經掩蔽之抗CTLA4抗體(NC經掩蔽之9D9)及親本抗CTLA4抗體(9D9)之EC50。各組進行至少三次且報導平均EC50+/-SE。
圖 3A-3D 為一系列曲線，其展示蛋白酶活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)在減小腫瘤體積方面之功效與親本抗CTLA4抗體(9D9 IgG2a)之功效相等。在C57BI/6小鼠中植入MC38同基因型腫瘤。在腫瘤尺寸達到60-120 mm3之後，向鼠類腹膜內投與單次200 μg劑量之圖 3A) muIgG2a對照抗體、圖 3B) 具有IgG2a同型之親本抗CTLA4抗體(9D9 IgG2a)、圖 3C) 可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)，在MC38鼠類腫瘤模型中，與用3B)親本抗CTLA4抗體(9D9 IgG2a)或3A)muIgG2a對照抗體處理之小鼠相比，圖 3D) 人類化IgG1抗CTLA4抗體1 (抗體1)在減小腫瘤體積方面顯示類似的活體內功效。
圖 4 為展示在腫瘤浸潤物中，由蛋白酶活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)及親本抗CTLA4抗體(9D9 IgG2a)進行之等效調節性T淋巴細胞(Treg)消耗之圖。對照物指示用muIgG2a對照抗體進行之處理。
圖 5A 及5B 為一系列曲線，其展示在經處理之小鼠之脾中，蛋白酶活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)顯著降低A)CD4+ T細胞及B)CD8+ T細胞之增殖。箭頭指向使用親本抗CTLA4抗體(9D9 IgG2a)及蛋白酶活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)之處理組之間的平均值。
圖 6A-6D 為一系列展示經掩蔽之抗CTLA4抗體之功效及安全性研究之曲線。在攜帶MC38腫瘤之C57BL/6小鼠(n=10)中檢驗圖 6A) 同型對照抗體(IgG2a對照物)、圖 6B) 不可裂解之經掩蔽之抗CTLA4抗體(NC經掩蔽之9D9)、圖 6C) 親本抗CTLA4抗體(9D9)及圖 6D) 可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)之腫瘤抑制活性。
圖 7A 及7B 為一系列曲線，其展示A)腫瘤中之調節性T淋巴細胞(Treg)之消耗，及B)用同型對照抗體(IgG2a對照物)、親本抗CTLA4抗體(9D9)、可活化之經掩蔽之抗CTLA4抗體(經掩蔽之9D9)及不可裂解之經掩蔽之抗CTLA4抗體(NC經掩蔽之9D9)處理之小鼠(n=6)之脾中之Treg增殖。
圖 8 為展示經掩蔽之人類化抗CTLA4抗體1之蛋白酶活化之圖。與親本人類化抗CTLA4抗體1 (親本，空心圓)相比，經掩蔽之人類化抗CTLA4抗體1所呈現的與人類CTLA4-Fc (經掩蔽，實心正方形)之結合較低。以與親本人類化抗CTLA4抗體1類似之水準，經掩蔽之人類化抗CTLA4抗體之蛋白酶活化完全恢復與人類CTLA4-Fc (蛋白酶活化，星號)之結合。X軸指示所測試之抗體之量。y軸上之分子RLU/親本RLU指示與親本人類化抗CTLA4抗體1相比之相對光單位之分數。
圖 9A 及9B 為展示在某一範圍內之抗體濃度下，未經掩蔽之抗CTLA4抗體與人類CTLA4-Fc之結合之曲線。圖 9A 展示在某一範圍內之抗體濃度下，抗體1之各種形式(抗體1-1及抗體1-2)與人類CTLA4-Fc之結合，其顯示所展示之抗體之類似結合。圖 9B 展示在某一範圍內之抗體濃度下，抗體2之各種形式(抗體2-1、抗體2-2、抗體2-3、抗體2-4及抗體2-5)與人類CTLA4-Fc之結合，其顯示所展示之抗體之類似結合。
圖 10A 及10B 為展示在某一範圍內之抗體濃度下，經掩蔽之抗CTLA4抗體與人類CTLA4-Fc之結合之曲線。圖 10A 展示在不存在蛋白酶活化之情況下，經掩蔽之抗體之結合。圖 10B 展示在蛋白酶活化之後，經掩蔽之抗體之結合。抗體2-6為抗體2-7、抗體2-8、抗體2-9、抗體2-10、抗體2-11、抗體2-12及抗體2-13之未經掩蔽之親本抗體。圖 10A 及10B 展示在蛋白酶活化之後，經掩蔽之抗體顯示與未經掩蔽之親本抗體，抗體2-6類似之結合特徵。
圖 11A-11H 展示含有各種可裂解肽序列之抗體2之經掩蔽之形式之雷達圖。抗體2-15包括不可裂解之可裂解肽序列。使用雷達圖描繪圖 11A-11H 中展示之各抗體由雷達圖上展示之各蛋白酶進行之活化，其中在0 (不活化)至1.0 (完全活化)之範圍內描繪活化。圖 11I-11M 描繪在健康小鼠之血漿(圖 11I 及11J )及攜帶MC38腫瘤之小鼠之血漿(圖 11K-11M )中，用選擇抗體進行之蛋白酶裂解之SDSP-PAGE西方墨點分析(SDSP-PAGE Western blot analysis)之結果。
圖 12A 及12B 為描繪在存在或不存在蛋白酶活化之情況下，經掩蔽之抗CTLA4抗體與人類CTLA4-Fc之結合之曲線。在存在蛋白酶之情況下，經掩蔽之抗體藉由可裂解肽之蛋白酶裂解而「活化」。圖 12A 包括不可活化之同型對照物及不可活化之經掩蔽之抗體(抗體2-15，因為其可裂解肽序列不可裂解)作為對照物。圖 12B 包括同型對照物及不可活化之經掩蔽之抗體(抗體2-10，因為其可裂解肽序列不可裂解)作為對照物。以與未經掩蔽之親本抗體，抗體2-6類似之水準，抗體2-14之活化完全恢復其與人類CTLA4-Fc之結合(圖 12B )。
圖 13A-13D 為描繪對於抗體1及抗體2之未經掩蔽之形式，如使用葡萄球菌腸毒素B (Staphylococcal enterotoxin B；SEB)分析法測定之IL-2含量(pg/mL)(圖 13A 及13C )或IL-2含量之倍數變化(圖 13B 及13D )之曲線。使用SEB分析法，測試抗體1之未經掩蔽之形式(抗體1-1及1-2)(圖 13A 及13B )及抗體2之未經掩蔽之形式(抗體2-1、抗體2-2、抗體2-3、抗體2-4及抗體2-5)(圖 13C 及13D )促進周邊單核細胞之IL-2產生之能力。與無抗體之對照物相比，所有所測試的抗體1及抗體2之形式皆顯示提高IL-2含量之能力(圖 13A 及13C )。
圖 14A-14D 為描繪對於抗體2之經掩蔽之形式，如使用葡萄球菌腸毒素B (SEB)分析法測定之IL-2含量(pg/mL)(圖 14A 及14C )或IL-2含量之倍數變化(圖 14B 及14D )之曲線。測試抗體2之未經掩蔽之形式(抗體2-6)及抗體2-6之經掩蔽之形式(抗體2-7、抗體2-8、抗體2-9、抗體2-10、抗體2-11、抗體2-12及抗體2-13)。圖 14A 及14B 描繪在未活化狀態下(亦即，未暴露蛋白酶)，抗體對IL-2含量之影響(圖 14A )及IL-2含量之倍數變化(圖 14B )。未經掩蔽之親本抗體，抗體2-6顯示顯著提高IL-2含量之能力，且僅一種經掩蔽之抗體(抗體2-12)展示IL-2含量之顯著增加，但與抗體2-6相比水準顯著較低(圖 14A 及14B )。圖 14C 及14D 描繪在活化狀態下(亦即，暴露於蛋白酶之後)，抗體對IL-2含量之影響(圖 14C )及IL-2含量之倍數變化(圖 14D )。圖 14C 及14D 展示以與未經掩蔽之親本抗體，抗體2-6類似之水準，對蛋白酶之暴露挽救抗體2-7、抗體2-8及抗體2-9促進IL-2產生之能力。
圖 15A-15D 描繪在健康小鼠之血漿中，經掩蔽之抗CTLA4抗體之活體內裂解程度，如藉由西方墨點分析所示。在抗體之腹膜內投藥之後第2、4及7天展示健康小鼠中抗體2之經掩蔽之形式(抗體2-14、抗體2-19及抗體2-20)之活體內裂解。使用其中在存在或不存在蛋白酶之情況下活體外處理經掩蔽之抗體之標準樣本作為裂解之對照物。活體內活化抗體2-14 (圖 15A )及抗體2-20 (圖 15C )。圖 15B 展示抗體2-19之活化不足。抗體2-14及抗體2-20之自第2天至第7天之活化百分比之增加展示於圖15D中。
圖 16A-16D 描繪在攜帶腫瘤之小鼠之血漿中，經掩蔽之抗CTLA4抗體之活體內裂解程度，如藉由西方墨點分析所示。在抗體之腹膜內投藥之後第2、4及7天展示攜帶MC38腫瘤之小鼠中抗體2之經掩蔽之形式(抗體2-14、抗體2-19及抗體2-20)之活體內裂解。使用其中在存在或不存在蛋白酶之情況下活體外處理經掩蔽之抗體之標準樣本作為裂解之對照物。抗體2-14 (圖 16A )及抗體2-20 (圖 16C )皆活體內活化。圖 16B 展示抗體2-19之活化不足。抗體2-14及抗體2-20之自第2天至第7天之活化百分比之增加展示於圖 16D 中。與健康的未攜帶腫瘤之小鼠相比，攜帶MC38腫瘤之小鼠中的抗體2-14之活化百分比顯著更高，如藉由2向ANOVA (經調節之P值=0.0113)所測定(圖 16D )。
圖 17 為展示在經掩蔽之狀態及作為預先暴露於蛋白酶之結果之「活化」狀態下，經掩蔽之抗CTLA4抗體促進ADCC活性之能力之圖，如使用ADCC報導子生物分析法測定。圖 17 描繪由未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)及抗體2-6之經掩蔽之版本(抗體2-14及抗體2-15)進行之報導子活化之程度。抗體2-15包括不可裂解之可裂解肽序列，以用作陰性對照物。亦測試同型對照物。預先暴露於蛋白酶之抗體描繪為「活化」。當在未預先暴露於蛋白酶之情況下測試時，與未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)相比，經掩蔽之抗體(抗體2-14及抗體2-15)顯示降低之報導子活化(圖 17 )。抗體2-15 (其不可由蛋白酶活化)之降低之報導子活化未因預先暴露於蛋白酶而得到挽救(圖 17 )。抗體2-14 (其可由蛋白酶活化)之報導子活化被挽救至與由未經掩蔽之親本抗體(抗體2-6)所誘導類似之水準(圖 17 )。
圖 18A 及18B 為描繪抗CTLA4抗體阻斷CTLA4與其配位體CD80及CD86之相互相用的能力之曲線，如使用CTLA4阻斷生物分析法測定。圖 18A 描繪抗體2之未經掩蔽之形式(抗體2-2)及抗體2之經掩蔽之形式(抗體2-14)阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力。在經掩蔽之狀態(亦即，未預先暴露於蛋白酶)及由預先暴露於蛋白酶而引起之「活化」狀態下測試抗體2-14。作為對比，亦使用同型對照物進行分析法且亦在無抗體之情況下進行分析法(亦即，作為無抗體之對照物)。圖 18A 展示當呈由不存在蛋白酶而引起之經掩蔽之(未活化)形式時，抗體2-14未顯示有效阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力。對於阻斷CTLA4與其配位體之結合，高於無抗體之對照物之倍數變化之分析未顯示呈經掩蔽(未活化)之形式的抗體2-14之能力與同型對照物之能力之間的顯著差異(圖 18B )。然而，圖 18A 展示當抗體2-14呈由預先暴露於蛋白酶而引起之「活化」形式時，其在某一範圍內之濃度下顯示有效阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力。「活化」抗體2-14阻斷CTLA4與其配位體之結合之能力與未經掩蔽之抗體2-2類似(圖 18A 及18B )。對於阻斷CTLA4與其配位體之結合，高於無抗體之對照物之倍數變化之分析未顯示「活化」抗體2-14與未經掩蔽之抗體2-2之能力之間的顯著差異(「ns」)(圖 18B )。
圖 19A-19D 描繪免疫表型研究之結果，該等研究評估表現包括以下之標記物之CD45+細胞之比例：CD3+/ICOS+、CD3+ T細胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+ T細胞、CD8+/ICOS+、CD8+ T細胞、Tregs+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Tregs、Tregs+/Ki67+。圖 19E 及19F 提供比較所測試之抗體(第1組：IgG，第2組：抗體2-1；第3組：抗體2-10；第4組：伊派利單抗；第5組：伊派利單抗-aFuc)之統計數據。
圖 20A 及20B 描繪曲線，其展示在投與20 µg、7 µg或2 µg測試抗體之單次注射之後的隨時間推移之腫瘤體積。
圖 21 描繪展示兩組實驗(實驗1及實驗2)之結果之曲線，該等實驗藉由評估在投與抗體2-6、抗體2-10、抗體2-14、抗體2-16或同型對照物之後總CD4+細胞中之Ki67+細胞之百分比來評估在食蟹獼猴中之藥效學作用。
圖 22 描繪實驗結果，該等實驗評估在投與一種以下測試抗體之後在食蟹獼猴中之藥物動力學：RSV-m對照物、伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-10、抗體2-14、抗體2-16或經掩蔽之伊派利單抗-m。圖 22 描繪展示在14天時段內，每種所投與之抗體之量(µg/mL)之曲線。
圖 23A 描繪在投藥後第5天，對周邊血液中之CD4+Ki67+細胞(左側)及CD4+ICOS+細胞(右側)之百分比之功效研究之結果曲線，其表示T細胞活化水準。圖 23B 描繪曲線，其展示在用10 mg/kg (RSV-m對照物)或3 mg/kg (伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-14、抗體2-15)處理之小鼠中，在第7天評估之腫瘤重量(左側)及CD8/Treg比率(右側)。圖 23C 描繪曲線，其展示在小鼠中，在投與RSV-m對照物、伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-14或抗體2-15之後，腫瘤微環境中之調節性T細胞(左側)及腫瘤微環境中之CD8+ T細胞(右側)。圖 23D 描繪曲線，其展示在投與0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg之抗體(包括RSV-m對照物、伊派利單抗、抗體2-6、抗體2-14及抗體2-15)之後，小鼠中隨時間推移之腫瘤體積(mm3 )。
圖 24A 描繪使用MCA205纖維肉瘤細胞之SDS-PAGE西方墨點分析之結果，其評估血漿、腎臟、肝臟及腫瘤組織中抗體2-6、抗體2-14、抗體2-16及抗體2-10之裂解。圖 24B 描繪使用MB49細胞之SDS-PAGE西方墨點分析之結果，其評估血漿、腎臟及肝臟組織中抗體2-6、抗體2-14、抗體2-16及抗體2-10之裂解。圖 24C 描繪使用MC38細胞之SDS-PAGE西方墨點分析之結果，其評估血漿、腎臟、肝臟及腫瘤組織中抗體2-6、抗體2-14、抗體2-16及抗體2-10之裂解。圖 24D 描繪評估裂解之使用MC38細胞之SDS-PAGE西方墨點分析之結果，且提供所選樣本之裂解百分比。基於感光強度計算裂解百分比(裂解百分比=低譜帶/(低譜帶+高譜帶))。圖 24E 描繪曲線，其展示在投與攜帶MB49之B-hCTLA4基因轉殖小鼠之後，各抗體與CTLA4之間的結合，其中各抗體係自血漿、腎臟、肝臟或脾分離。圖 24F 描繪由一組例示性蛋白酶進行之可裂解肽受質之活體外裂解之熱圖。
圖 25A-25F 描繪雷達圖，其展示使用所鑑別之鼠類模型(C57/Bl6-wt、MC38-wt、MC38-hCTLA4、MB49-wt、MCA205-wt、B16-wt)之條件培養基中之裂解之發生率。用如所指示之組織調節培養基，諸如脾、肝臟、腎臟、血漿或腫瘤。
圖 26A 及26B 描繪在健康食蟹獼猴之血漿中，使用抗體2-14之活體內裂解研究之結果。如圖 26A 中所繪示，使用毛細電泳(CE)及質譜(MS)計算抗體2-14之裂解，如所指示。圖 26B 描繪曲線，其展示在1小時、24小時及72小時時，完整的抗體2-14及其裂解產物之比例。圖 26C 描繪在健康食蟹獼猴之血漿中，使用抗體2-16之活體內裂解研究之結果，包括使用毛細電泳(CE)及質譜(MS)評估所計算之裂解，如所指示。
圖 27A 及27B 描繪離體裂解研究之結果，該等研究使用藉由人類肺或結腸腫瘤樣本調節之培養基。
圖 28A-28D 描繪用結腸腫瘤上清液，使用質譜之裂解分子(抗體2-14，圖 28A ；抗體2-15，圖 28B ；抗體2-16，圖 28C ；抗體2-10，圖 28D )之百分比(%)之分析結果。圖 28E 描繪使用抗體2-6、抗體2-14、抗體2-15、抗體2-10、抗體2-16及經掩蔽之伊派利單抗-m進行之ELISA分析法之結果，其中在結腸腫瘤條件培養基(結腸2 4 sept結腸腫瘤樣本)或作為對照物之RPMI中培養各所測試之抗體。
圖 29 描繪使用在不含血清或補充有胎牛血清(FCS)之培養基中完成的LDH釋放分析法量測之細胞毒性，該培養基用所指示之細胞株或腫瘤/NAT組織調節。
圖 30 以iceLogo圖形式描繪MC38及H2228細胞株之受質裂解。
圖 31A 及31B 以iceLogo形式描繪NAT及腫瘤(TUM)組織之受質裂解。圖 31C 以熱圖形式描繪P4-P4'位置處Z分數之差異，以突出有利於NAT或腫瘤特異性裂解之殘基。正白胺酸(n)為文庫中Met之替代物。圖 31D 以熱圖形式描繪P4-P4'位置處Z分數之差異，以突出與NAT或腫瘤樣本相比，有利於H2228特異性裂解之殘基。正白胺酸(n)為文庫中Met之替代物。
圖 32A 及32B 描繪在MC38條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖 32A ，左側)、AK10-02 (圖 32A ，右側)；AK10-04 (圖 32B ，左側)及AK10-05 (圖 32B ，右側)。
圖 33 描繪來自使用AK10文庫肽之MC38 AMSP-MS反應之主要裂解產物之相對效率。
圖 34A 及34B 描繪在H2228條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01( 圖 34A ，左上部)、AK10-02 (圖 34A ，右上部)、AK10-04 (圖 34A ，下部)、AK10-09 (圖 34B ，左側)及AK10-10 (圖 34B ，右側)。
圖 35 描繪經由AMSP-MS監測之由H2228條件培養基裂解之最高受質及其相對效率。
圖 36A-36C 描繪在腫瘤條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖 36A ，左上部)、AK10-02 (圖 36A ，中上部)、AK10-03 (圖 36A ，下部)、AK10-04 (圖 36B ，左上部)及AK10-05 (圖 36B ，右上部)、AK10-09 (圖 36B ，下部)、AK10-09氧化肽(圖 36C ，左側)及AK10-10 (圖 36C ，右側)。圖 36D 描繪經由AMSP-MS展示之由腫瘤條件培養基裂解之最高受質及其相對效率。
圖 37A-37D 描繪在NAT條件培養基情況下，所選擇之受質之產物形成曲線；AK10-01 (圖 37A ，上部)、AK10-02 (圖 37A ，下部)、AK10-04 (圖 37B ，上部)及AK10-05 (圖 37B ，下部)、AK10-09 (圖 37C ，上部)、AK10-09氧化肽(圖 37C ，下部)及AK10-10 (圖 37D )。圖 37E 描繪在肽之AK10文庫情況下，由NAT條件培養基產生之最高裂解及相對效率。
圖 38 以火山圖形式描繪腫瘤及NAT組織樣本中之以不同方式表現之蛋白質。統計顯著蛋白質具有≥2倍倍數變化之閾值倍數差。在腫瘤(右上側，部分2)或NAT (左上側，部分1)中顯著富集之蛋白質存在於此等部分中。
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Claims (40)

  1. 一種經掩蔽之抗體，其包含： a) 抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域；及 b) 掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列； 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域或該VH域之胺基端或羧基端。
  2. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之經掩蔽之抗體，其中該可裂解肽包含胺基端及羧基端，且該包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子及第二間隔連接子，其中該第一間隔連接子連接至該可裂解肽之胺基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列，且該第二間隔連接子連接至該可裂解肽之羧基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。
  6. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段為人類化抗體、嵌合抗體或人類抗體。
  7. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中： a) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中： a) 該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
  9. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該VL域包含於輕鏈內，該輕鏈包含選自由SEQ ID NO:327-341組成之群之胺基酸序列，且該VH域包含於重鏈內，該重鏈包含選自由SEQ ID NO:366-380及421組成之群之胺基酸序列。
  10. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該經掩蔽之抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。
  11. 如請求項1之經掩蔽之抗體，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段係與藥劑結合。
  12. 如請求項11之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為微管蛋白聚合抑制劑、DNA損傷劑或DNA合成抑制劑。
  13. 如請求項11之經掩蔽之抗體，其中該藥劑為類美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體、卡奇黴素(calicheamicin)、倍癌黴素(duocarmycin)、吲哚啉苯并二氮呯(indo-linobenzodiazepine)二聚體或依昔替康(exatecan)衍生物Dxd。
  14. 一種經掩蔽之雙特異性抗體，其包含： a) 特異性結合於CTLA4之第一對之輕鏈及重鏈； b) 特異性結合於抗原之第二對之輕鏈及重鏈；及 c) 掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列， 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該第一對之輕鏈或重鏈之胺基端或羧基端。
  15. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。
  16. 如請求項15之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該可裂解肽包含胺基端及羧基端，且該包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子及第二間隔連接子，其中該第一間隔連接子連接至該可裂解肽之胺基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列，且該第二間隔連接子連接至該可裂解肽之羧基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。
  17. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。
  18. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。
  19. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對之輕鏈包含VL域，且該第一對之重鏈包含VH域，其中： a) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
  20. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中： a) 該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
  21. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該第一對之輕鏈包含選自由SEQ ID NO:327-341組成之群之胺基酸序列，且該第一對之重鏈包含選自由SEQ ID NO:366-380及421組成之群之胺基酸序列。
  22. 如請求項14之經掩蔽之雙特異性抗體，其中該經掩蔽之雙特異性抗體包含SEQ ID NO:421之胺基酸序列，且包含選自由SEQ ID NO:358及422-431組成之群之胺基酸序列。
  23. 一種經掩蔽之嵌合受體，其包含： a) 結合於CTLA4之配位體結合域，其包含VL域及VH域； b) 掩蔽肽，其包含選自由SEQ ID NO:1-46組成之群之胺基酸序列； c) 跨膜域；及 d) 細胞內信號傳導域，其包含信號傳導域， 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域或該VH域之胺基端或羧基端。
  24. 如請求項23之經掩蔽之嵌合受體，其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含選自由SEQ ID NO:47-88、464-469及479-508組成之群之胺基酸序列。
  25. 如請求項23之經掩蔽之嵌合受體，其中該可裂解肽包含胺基端及羧基端，且該包含可裂解肽之連接子包含第一間隔連接子及第二間隔連接子，其中該第一間隔連接子連接至該可裂解肽之胺基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列，且該第二間隔連接子連接至該可裂解肽之羧基端且包含選自由SEQ ID NO:89-112及415-420組成之群之胺基酸序列。
  26. 如請求項23之經掩蔽之嵌合受體，其中該包含可裂解肽之連接子包含選自由SEQ ID NO:454-462組成之群之胺基酸序列。
  27. 如請求項23之經掩蔽之嵌合受體，其中該經掩蔽之嵌合受體包含選自由SEQ ID NO:113-231及444-453組成之群之胺基酸序列。
  28. 如請求項23之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:402之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:403之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:404之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:405之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:406之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:407之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列；或 c) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:432之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:433之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:434之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:435之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:436之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:437之胺基酸序列；或 d) 該VL域包含(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列，(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列，及(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列；及/或該VH域包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列，及(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列。
  29. 如請求項23之經掩蔽之嵌合受體，其中： a) 該VL域包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列；或 b) 該VL域包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列，且該VH域包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列。
  30. 一種核酸，其編碼如請求項1之經掩蔽之抗體。
  31. 一種載體，其包含如請求項30之核酸。
  32. 一種宿主細胞，其包含如請求項30之核酸。
  33. 一種製備經掩蔽之抗體之方法，其包含在產生該經掩蔽之抗體之條件下培養如請求項32之宿主細胞。
  34. 一種經掩蔽之抗體，其係藉由如請求項之33方法製備。
  35. 一種組合物，其包含如請求項1之經掩蔽之抗體。
  36. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之經掩蔽之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  37. 一種套組，其包含如請求項1之經掩蔽之抗體。
  38. 一種如請求項1之經掩蔽之抗體之用途，其係用於製造供治療或預防贅瘤性疾病之藥劑。
  39. 一種經掩蔽之抗體，其包含： a) 抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域；及 b) 掩蔽肽，其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列； 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域之胺基端； 其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列； 其中(a)該VL域包含有包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列之CDR-H3；或(b)該VL域包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。
  40. 一種經掩蔽之抗體，其包含： a) 抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域；及 b) 掩蔽肽，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列； 其中該掩蔽肽經由包含可裂解肽之連接子連接至該VL域之胺基端； 其中該包含可裂解肽之連接子包含可裂解肽，其包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列； 其中(a)該VL域包含有包含SEQ ID NO:408之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:409之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:410之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:411之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:412之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:413之胺基酸序列之CDR-H3；或(b)該VL域包含有包含SEQ ID NO:438之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO:439之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO:440之胺基酸序列之CDR-L3；及該VH域包含有包含SEQ ID NO:441之胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO:442之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO:443之胺基酸序列之CDR-H3。
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