JP2022505925A - 抗ｔｉｍ－３抗体 - Google Patents

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Abstract

Figure 2022505925000001
本発明は、ヒトＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）に特異的に結合する抗体のファミリーの発見にある程度基づいている。抗体は、その抗体のＣＤＲに基づいてＴＩＭ－３結合部位を含む。抗体は、単剤療法の治療薬として、又は別の治療薬と組み合わせて使用することができる。治療薬として使用される場合、抗体は、ヒト患者に投与される場合、生化学的及び／又は生物物理学的特性を改善するため、及び／又は免疫原性を低減又は排除するために最適化する、例えば、親和性成熟させることができる。抗体は、ＴＩＭ－３がＴＩＭ－３リガンド、例えば、ガレクチン－９、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、及び癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）に結合するのを阻害する。開示される抗体を使用して、インビトロ又はインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。ヒト癌患者又は動物モデルに投与される場合、抗体は、ヒト患者又は動物モデルの腫瘍増殖を阻害又は低減する。

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１８年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／７５４，３８３号の利益及び優先権を主張し、参照によりその開示全体が本明細書に援用される。
発明の分野
[0002] 本発明の分野は、分子生物学、免疫学、及び腫瘍学である。より詳細には、この分野は治療用抗体である。
背景
[0003] ２０１１年に黒色腫に対するYervoy（登録商標）（イピリムマブ、Bristol-Myers Squibb）の承認に続いて、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＣＴＬＡ－４を標的とするもの）が、治療法の開発のための有望な分子クラスとなっている。免疫チェックポイント阻害薬を開発しているいくつかの大企業には、Bristol-Myers Squibb、Merck & Co.、Roche、AstraZeneca、及びその他多数が含まれる。免疫療法の開発戦略及び投資は、説得力のある臨床効果と共に、抗ＰＤ（Ｌ）－１薬：Keytruda（登録商標）（ペンブロリズマブ、Merck & Co.）、Opdivo（登録商標）（ニボルマブ、Bristol-Myers Squibb）、Tecentriq（登録商標）（アテゾリズマブ、Roche）、Bavencio（登録商標）（アベルマブ、EMD Serono）、及びImfinzi（登録商標）（デュルバルマブ、AstraZeneca）のいくつかの新しい承認につながった。
[0004] ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤は、それらの説得力のある臨床効果及び安全性プロファイルと共に、組み合わせ免疫療法アプローチのための強固な基盤を構築した。これらの戦略には、ＰＤ－１経路阻害剤を、Ｔ細胞で発現する他の免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤と組み合わせることが含まれる。そのようなチェックポイントタンパク質の１つは、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られるＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）である。
[0005] Ｔｉｍ－３は、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）及びＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１（Ｔｃ１）Ｔ細胞上で選択的に発現する分子として最初に同定された（Monney et al. (2002) Nature 415(6871):536-41）。ＴＩＭ－３はまた、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、及び腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）などのＴ細胞の特定のサブセットを含む多くの免疫細胞型の表面で発現する（Clayton et al. (2014) J. Immunol. 192(2):782-791; Jones et al. (2008) J. Exp. Med. 205(12):2763-79; Hastings et al. (2009) Eur. J. Immunol 39(9):2492-2501; Seki et al. (2008) Clin Immunol 127(1):78-88; Ju et al. (2010) J Hepatol 52(3):322-329; Anderson et al. (2007) Science 318(5853):1141-1143; Baitsch et al. (2012) PLOS One7(2):e30852; Ndhlovu et al. (2012) Blood 119(16):3734-3743）。ホスファチジルセリン（PtdSer; Nakayama et al., (2009) Blood 113(16):3821-30）、ガレクチン－９（Ｇａｌ－９）（Zhu et al. (2005) Nat Immunol 6(12):1245-52）、高移動度群タンパク質１（ＨＭＧＢ１）（Chiba et al. (2012) Nat Immunol 13(9):832-42）、及び癌胎児性抗原細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）（Huang et al. (2015) Nature 517(7534):386-90）を含むＴＩＭ－３の推定リガンドが報告されている。
[0006] 研究は、ＴＩＭ－３が免疫応答の様々な側面を調節することを示唆している。ＴＩＭ－３とそのリガンドであるガレクチン－９（Ｇａｌ－９）との相互作用は細胞死を誘導する。この相互作用のインビボでの遮断は、実験モデルにおける自己免疫を悪化させ、耐性を無効にし、ＴＩＭ－３／Ｇａｌ－９相互作用が免疫応答を負に調節することを示唆している（Zhu et al. (2005), supra; Kanzaki et al. (2012) Endocrinology153(2):612-620）。ＴＩＭ－３の阻害はまた、インビボでの実験的自己免疫性脳脊髄炎の病理学的重症度を高めた（Monney et al. (2002) Nature 415:536-541; Das, et al. (2017) Immunol Rev276(1):97-111）。多発性硬化症（Koguchi et al. (2006) J Exp Med 203(6):1413-1418）、クローン病（ＣＤ）（Morimoto et al. (2011) Scand J Gastroenterol46(6):701-709）、及び関節リュウマチ（ＲＡ）（Liu et al. (2010) Clin Immunol137(2):288-295; Li et al. (2014) PLoS One9(2):e85784）のヒト患者からの材料を使用した研究では、Ｔ細胞でのＴｉｍ－３発現レベルが自己免疫疾患の進行と逆相関しているという観察結果が、Ｔ細胞でのＴＩＭ－３の免疫抑制の役割を示唆している。Ｔ細胞に対する効果に加えて、ＴＩＭ－３／Ｇａｌ－９相互作用は、細胞内病原体のマクロファージクリアランスを促進することによって抗菌活性をもたらし（Sakuishi et al. (2011) Trends Immunol 32(8):345-349）、且つＴＩＭ－３はまた、ホスファチジルセリンをその独特の結合裂を介して結合することによってアポトーシス細胞のクリアランスを促進することができる（DeKruyff et al. (2010) J Immunol 184(4):1918-1930）。
[0007] Ｔｉｍ－３は、多くのヒトの癌の腫瘍環境において免疫抑制の構成要素となる２つの重要な免疫細胞集団であるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ及び疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞（exhausted CD8+ T cell）を含む腫瘍浸潤リンパ球において上方制御されるため、癌免疫療法の潜在的な候補とある程度見なされる（McMahan et al. (2010) J. Clin. Invest. 120(12):4546-4557; Jin et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(33):14733-8; Golden-Mason et al. (2009) J Virol 83(18):9122-9130; Fourcade et al. (2010) J Exp Med 207(10):2175-86; Sakuishi et al. (2010) J Exp Med 207(10):2187-94; Zhou et al. (2011) Blood 117(17):4501-4510; Ngiow et al., (2011) Cancer Res. 71(10):3540-51, Yan, et al. (2013) PLoS ONE 8(3):e58006）。Ｔ細胞調節不全の分子機構は、初めに、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴｉｍ－３と腫瘍細胞上のそのリガンドであるガレクチン－９との相互作用が、チロシン２５６及び２６３でＴｉｍ－３細胞質尾部のリン酸化を引き起こし、Ｔｉｍ－３細胞質尾部からのＨＬＡ－Ｂ関連転写物３（Ｂａｔ３）及び触媒的に活性なリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）の放出をもたらすとの仮説が立てられている。Ｂａｔ３及びＬｃｋのＴｉｍ－３からの解離が、不活性なリン酸化Ｌｃｋの蓄積をもたらし、これが、観察されたＴ細胞機能障害の原因となり得る（Rangachari, et al. (2012) Nat Med 18(9):1394-400）。
[0008] さらに、腫瘍内Ｔｉｍ－３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、大量のＴｒｅｇエフェクター分子（ＩＬ－１０、パーフォリン、及びグランザイム）を発現するようである。Ｔｉｍ－３＋Ｔｒｅｇは、腫瘍環境におけるＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の機能不全表現型の発生を促進すると考えられている（Sakuishi, et al. (2013) OncoImmunology 2(4):e23849）。Ｔｉｍ－３は、骨髄区画にも影響を与えることが報告されている。Ｔｉｍ－３のＴ細胞発現は、ガレクチン－９依存的にＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を促進することが示されている（Dardalhon, et al. (2010) J Immunol 185(3):1383-92）。さらに、Ｔｉｍ－３は腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）で特異的にアップレギュレートされるため、壊死性細胞死を起こしている細胞から放出されるＤＮＡの感知を妨げ得る。Ｔｉｍ－３は、高移動度群タンパク質１（ＨＭＧＢ１）に結合し、これにより、ＨＭＧＢ１が瀕死の細胞から放出されたＤＮＡに結合して、糖化最終（ＲＡＧＥ）産物の受容体及び／又はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２及び４経路を介して自然免疫細胞への送達を仲介するのを防止する。Ｔｉｍ－３のＨＭＧＢ１への結合は、腫瘍組織における自然免疫応答の活性化を抑制する（Chiba, et al. (2012), supra）。まとめると、これらのデータは、Ｔｉｍ－３が、骨髄細胞及び異なるＴｉｍ－３／リガンド相互作用を伴うＴ細胞外因性機構によって抗腫瘍Ｔ細胞応答をさらに抑制できることを示唆している。
[0009] 前臨床マウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の阻害でのＴｉｍ－３／ＰＤ－１同時遮断の相乗効果は、同時遮断が機能不全ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／又はＴｒｅｇの機能的表現型を調節することを示唆している（Sakuishi et al. (2010), supra; Ngiow et al. (2011), supra）。実際、インビボでのＰＤ（Ｌ）－１との同時遮断に加えて、他の多くのチェックポイント阻害剤との同時遮断は、多くの前臨床腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を増強し、腫瘍増殖を抑制する（Dardalhon et al. (2010), supra; Nglow et al., Cancer Res 2011; Chiba et al. (2012), supra; Baghdadi et al., Cancer Immunol Immunother 2013; Kurtulus et al. (2015) J Clin Invest 125(11):4053-62; Huang et al. (2015), supra; Sakuishi et al. (2010), supra; Jing et al.(2015) J Immunother Cancer 3:2; Zhou et al. (2011), supra; Komohara et al., Cancer Immunology Res., 2015）。
[0010] Yervoy（登録商標）、Keytruda（登録商標）、及びOpdivo（登録商標）などのチェックポイント阻害剤の成功にもかかわらず、ごく一部の患者のみが、これらの治療法に対する持続的な臨床反応を経験する。いくつかの腫瘍型は、臨床試験における抗ＣＴＬＡ－４又は抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１単剤療法に対してほとんど反応を示さなかった。これらには、前立腺癌、大腸癌、及び膵臓癌が含まれる。従って、これらの無反応性疾患、及び反応性腫瘍型では非反応性である大多数には、改善された抗腫瘍療法が必要である。
発明の概要
[0011] 本発明は、ヒトＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）に特異的に結合する抗体のファミリーの発見にある程度基づいている。抗体は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づくＴＩＭ－３結合部位を含む。抗体は、単独で、又は他の免疫チェックポイント阻害剤などの他の治療薬と組み合わせて、治療薬として使用することができる。治療薬として使用される場合、抗体は、ヒト患者に投与される場合、生化学的特性（例えば、親和性及び／又は特異性）を改善するため、生物物理学的特性（例えば、凝集、安定性、沈殿、及び／又は非特定の相互作用）を改善するため、及び／又は免疫原性を低減又は排除するために最適化する、例えば、親和性成熟させることができる。
[0012] 本明細書に記載の抗体は、ＴＩＭ－３がＴＩＭ－３リガンド、例えば、ガレクチン－９、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、及び癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）に結合するのを阻害する。開示される抗体を使用して、インビトロ又はインビボで腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。ヒト癌患者又は動物モデルに投与される場合、抗体は、このヒト患者又は動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害又は低減する。
[0013] 従って、一態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；並びに（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体に関する。
[0014] 別の態様では、本開示は、配列番号５３、配列番号２４、配列番号５５、配列番号３４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに配列番号５２、配列番号５４、配列番号２３、及び配列番号３３からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体に関する。
[0015] 別の態様では、本開示は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体に関する。
[0016] 別の態様では、本開示は、以下からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含むヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体に関する：
[0017] （ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；並びに
[0018] （ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖。
[0019] 特定の実施形態では、本開示は、単離された抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。
[0020] 特定の実施形態では、本開示は、単離された抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
[0021] 特定の実施形態では、本開示は、単離された抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸を含む発現ベクターを含む細胞に関する。
[0022] 特定の実施形態では、本開示は、免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する方法に関し、この方法は、（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で宿主細胞を増殖させること；及び（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを精製することを含む。
[0023] 特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ－３に結合する抗体又は抗体の抗原結合断片を生産する方法に関し、この方法は、（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で宿主細胞を増殖させ、それにより抗体又は抗体の抗原結合断片を生産すること；並びに（ｂ）抗体又は抗体の抗原結合断片を精製することを含む。
[0024] 特定の実施形態では、抗体は、表面プラズモン共鳴によって測定される９．２ｎＭ以下のＫＤを有する。
[0025] 特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ－３上のガレクチン－９結合部位への結合を本明細書に記載の抗体と競合する単離された抗体に関する。
[0026] 特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ－３上のＰｔｄＳｅｒ結合部位への結合を本明細書に記載の抗体と競合する単離された抗体に関する。
[0027] 特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ－３上の癌胎児性抗原細胞接着関連分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）結合部位への結合を本明細書に記載の抗体と競合する単離された抗体に関する。
[0028] 特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ－３上のガレクチン－９結合部位、ＰｔｄＳｅｒ結合部位、及びＣＥＡＣＡＭ１結合部位への結合を本明細書に記載の抗体と競合する単離された抗体に関する。
[0029] 特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の抗体と同じ、ヒトＴＩＭ－３タンパク質上のエピトープに結合する単離された抗体に関し、このエピトープは、ヒトＴＩＭ－３タンパク質のＰ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、及びＤ１２０を含む。
[0030] 特定の実施形態では、本開示は、腫瘍微小環境における少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートする方法に関し、この方法は、腫瘍微小環境を、少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートするために本明細書に記載の有効量の抗体に曝露することを含む。特定の実施形態では、この方法は、腫瘍微小環境を有効量の第２の治療薬、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体に曝露することをさらに含む。特定の実施形態では、疲弊マーカーは、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３である。
[0031] 特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の活性化を増強する方法に関し、この方法は、Ｔ細胞を本明細書に記載の有効量の抗体に曝露し、それによりＴ細胞の活性化を増強することを含む。特定の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。
[0032] 特定の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、細胞を本明細書に記載の有効量の抗体に曝露して、腫瘍細胞の増殖することを含む。特定の実施形態では、この方法は、腫瘍細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。
[0033] 特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法に関し、この方法は、哺乳動物を本明細書に記載の有効量の抗体に曝露して、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害することを含む。特定の実施形態では、この方法は、哺乳動物を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。
[0034] 特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物の癌を処置する方法に関し、この方法は、本明細書に記載の有効量の抗体を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。特定の実施形態では、この方法は、有効量の第２の治療薬を哺乳動物に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃（gastric）／胃（stomach）腺癌（ＳＴＡＤ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
[0035] 特定の実施形態では、本開示は、腫瘍微小環境において少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートする方法で使用するための本明細書に記載の抗体に関する。この方法は、腫瘍微小環境を有効量の抗体に曝露して、少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートすることを含む。特定の実施形態では、この方法は、腫瘍微小環境を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。特定の実施形態では、第２の治療薬は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。特定の実施形態では、疲弊マーカーは、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３である。
[0036] 特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞活性化を増強する方法で使用するための本明細書に記載の抗体に関し、この方法は、Ｔ細胞を有効量の抗体に曝露し、それによりＴ細胞の活性化を増強することを含む。特定の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。
[0037] 特定の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法で使用するための本明細書に記載の抗体に関し、この方法は、細胞を有効量の抗体に曝露して腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む。特定の実施形態では、この方法は、腫瘍細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。
[0038] 特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物の腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための本明細書に記載の抗体に関し、この方法は、哺乳類を有効量の抗体に曝露して腫瘍の増殖を阻害することを含む。特定の実施形態では、この方法は、哺乳動物を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。
[0039] 特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物の癌を処置する方法で使用するための本明細書に記載の抗体に関し、この方法は、それを必要とする哺乳動物に有効量の抗体を投与することを含む。特定の実施形態では、この方法は、有効量の第２の治療薬を哺乳動物に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃／胃腺癌（ＳＴＡＤ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
[0040] 特定の実施形態では、本開示は、任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、腫瘍微小環境において少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートするための薬剤の製造のための本明細書に記載の抗体の使用に関する。特定の実施形態では、第２の治療薬は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。特定の実施形態では、疲弊マーカーは、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３である。
[0041] 特定の実施形態では、本開示は、任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、Ｔ細胞活性化を増強するための薬剤の製造のための本明細書に記載の抗体の使用に関する。
[0042] 特定の実施形態では、本開示は、任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬剤の製造のための本明細書に記載の抗体の使用に関する。
[0043] 特定の実施形態では、本開示は、任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害するための薬剤の製造のための本明細書に記載の抗体の使用に関する。
[0044] 特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物の癌を治療するための薬剤を製造するための、任意選択で第２の治療薬と組み合わせた、本明細書に記載の抗体の使用に関する。特定の実施形態では、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃／胃腺癌（ＳＴＡＤ）からなる群から選択される。
[0045] 特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
[0046] 本発明のこれら及び他の態様及び利点は、以下の図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲を考慮することで明らかになるであろう。本明細書で使用される「含む」は、限定することを意味するものではなく、引用される例は非限定的である。
図面の簡単な説明
[0047] 本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に例示されるように、好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。同様に参照される要素は、対応する図面における共通の特徴を明らかにする。図面は必ずしも正確な縮尺ではなく、代わりに本発明の原理を例示することに重点が置かれている。
[0048] ヒト、ｃｙｎｏ、及びマーモセットのＴＩＭ－３－Ｈｉｓタンパク質に結合する抗ＴＩＭ－３抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 [0049] ＥＬＩＳＡ競合アッセイの結果を示し、このアッセイでは、抗ＴＩＭ－３抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）が、２．４ｎＭのＩＣ５０で、ヒトガレクチン－９とヒトＴＩＭ－３との間の結合の用量依存的遮断をもたらした。 [0049] いくつかの既知の抗ＴＩＭ－３抗体についてガレクチン－９との競合を比較するＥＬＩＳＡ競合アッセイの結果を示す。 [0049] ＥＬＩＳＡ競合アッセイの結果を示し、抗ＴＩＭ－３抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）ＩｇＧ２ｈ（ＦＮ－ＡＱ、３２２Ａ）－ｄｅｌＫ（Ｍ６９０３）は、アイソタイプ対照抗体ではないが、７．４６±０．０５２ｎＭのＩＣ５０で、ｈｕＴＩＭ－３－ビオチンのｈｕＧｇａｌ－９への結合を濃度依存的に阻害した。 [0049] ＥＬＩＳＡ競合アッセイの結果を示し、抗ＴＩＭ－３抗体Ｍ６９０３は、アイソタイプ対照抗体ではないが、０．３５３±０．３８３ｎＭ（０．０５３±０．０５７μｇ／ｍＬ）のＩＣ５０で、ｒｈＴＩＭ－３－ＦｃのＨｉｓタグ付きＣＥＡＣＡＭ１への結合を用量依存的に阻害した。 [0050] Ｍ６９０３と複合体を形成したヒトＴＩＭ－３の結晶構造を示す。表面表現として示されているＴＩＭ－３に結合したＭ６９０３のＦａｂ部分（上部構造）の概要を示す。ＴＩＭ－３で形成された広範な接触部（下部構造）は、ＴＩＭ－３の明るい部分として示されている。 [0050] Ｍ６９０３と複合体を形成したヒトＴＩＭ－３の結晶構造を示す。ＴＩＭ－３のエピトープホットスポット残基（例えば、Ｐ５９及びＦ６１及びＥ６２）を示す。 [0050] Ｍ６９０３と複合体を形成したヒトＴＩＭ－３の結晶構造を示す。ｐｔｄＳｅｒの極性頭部基（明るい色の棒）と配位カルシウムイオン（球）が、マウスＴＩＭ－３の構造との重ね合わせによってＭ６９０３結合ＴＩＭ－３の構造にモデル化されていることを示す（DeKruyff et al. (2010), supra）。ｐｔｄＳｅｒの結合部位は、Ｍ６９０３からの重鎖のＹ５９（球の基）の配置と一致する。ＴＩＭ－３上のＤ１２０からｐｔｄＳｅｒ又はＭ６９０３への水素結合はそれぞれ点線で示されている。 [0050] Ｍ６９０３と複合体を形成したヒトＴＩＭ－３の結晶構造を示す。破線で示されているＭ６９０３とＴＩＭ－３のＣＥＡＣＡＭ－１結合残基との極性相互作用を示す。 [0051] 免疫グロブリンフォールドの１つのベータシートの表面に存在するＰ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｉ１１４、Ｎ１１９、及びＫ１２２残基を示す、抗ＴＩＭ－３抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）エピトープマップを用いてＴＩＭ－３の結晶構造のモデルを示す。 [0052] ＣＤ１４＋単球上の抗ＴＩＭ－３抗体Ｍ６９０３の標的占有率が、抗ＴＩＭ－３の濃度の増加と共に増加したことを示すグラフを示す。抗ＴＩＭ－３抗体Ｍ６９０３の段階希釈物を、新鮮なヒト全血と共に１時間インキュベートした。ＣＤ１４＋細胞上の占有されていないＴＩＭ－３を、ＴＩＭ－３結合を抗ＴＩＭ－３抗体と競合する抗ＴＩＭ－３（２Ｅ２）－ＡＰＣを用いたフローサイトメトリーによって測定した。１０のドナーすべての平均ＥＣ５０は、１１１．１±８５．６ｎｇ／ｍｌであった。グラフは、合計１０のドナーのうちの４つの代表的なドナー（ＫＰ４６２３３、ＫＰ４６２３１、ＫＰ４６３１５、及びＫＰ４６３１８）を示す。 [0053] Ｍ６９０３がアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞上のｒｈＴＩＭ－３とＰｔｄＳｅｒとの相互作用を効率的に遮断したことを示すグラフを示す。フローサイトメトリー分析の前に、スタウロスポリン（２μｇ／ｍＬ、１８時間）での処理によってアポトーシスがＪｕｒｋａｔ細胞に誘導され、ＴＩＭ－３リガンドであるＰｔｄＳｅｒの表面発現が起きた。アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞の表面へのｒｈＴＩＭ－３－ＦｃＰｔｄＳｅｒの結合をＭ６９０３の段階希釈物又は抗ＨＥＬ ＩｇＧ２ｈアイソタイプ対照とのプレインキュベーション後のｒｈＴＩＭ－３－ＦｃのＭＦＩを測定することによってフローサイトメトリーで評価した。アイソタイプ対照は効果がなかったが、Ｍ６９０３は、ｒｈＴＩＭ－３とＰｔｄＳｅｒとの相互作用を４．４３８±３．１１５ｎＭ（０．６６６±０．４６７μｇ／ｍｌ）のＩＣ５０で遮断した。非線形適合線を、シグモイド用量反応式を使用してグラフに適用した。 [0054] Ｍ６９０３が用量依存的にＣＥＦ抗原特異的Ｔ細胞活性化を増加させたことを示すグラフを示す。Ｍ６９０３とビントラファスプとの組み合わせにより、この活性化がさらに増強された。Ｍ６９０３の存在下で、ＰＢＭＣを４０μｇ／ｍｌのＣＥＦウイルスペプチドプールで４日間処理した。Ｍ６９０３は、複数の実験から計算された１±１．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０で、ＩＦＮ－γ産生によって測定するＴ細胞活性化を、ＣＥＦアッセイにおけるアイソタイプ対照と比較して用量依存的に増強した。非線形回帰分析を行って、平均及びＳＤを示す。（ｐ＜０．０５）。 [0054] Ｍ６９０３が用量依存的にＣＥＦ抗原特異的Ｔ細胞活性化を増加させたことを示すグラフを示す。Ｍ６９０３とビントラファスプとの組み合わせにより、この活性化がさらに増強された。Ｍ６９０３の存在下で、ＰＢＭＣを４０μｇ／ｍｌのＣＥＦウイルスペプチドプールで４日間処理した。Ｍ６９０３の段階希釈物を、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照又はビントラファスプα（ビントラファスプ alfa）のいずれかと組み合わせた。ビントラファスプαとの組み合わせにより、ＩＦＮ－γ産生がさらに増加した。平均及びＳＤを示す（ｐ＜０．０５）。 [0055] Ｍ６９０３による同種抗原特異的Ｔ細胞活性化の用量依存的増強を示すグラフを示す。処理の２日後に、Ｔ細胞活性化を、共培養され照射されたDaudi細胞及びヒトＴ細胞の上清中のＩＦＮ－γを測定することによる同種異系一方向ＭＬＲアッセイで評価した。共培養された細胞を、Ｍ６９０３の段階希釈物又はアイソタイプ対照で処理した。Ｍ６９０３は、１１６±１１７ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０で、同種抗原特異的Ｔ細胞活性化を用量依存的に増強した。非線形回帰分析を行って、平均±ＳＤをグラフに示す。 [0055] Ｍ６９０３による同種抗原特異的Ｔ細胞活性化の用量依存的増強を示すグラフを示す。処理の２日後に、Ｔ細胞活性化を、共培養され照射されたDaudi細胞及びヒトＴ細胞の上清中のＩＦＮ－γを測定することによる同種異系一方向ＭＬＲアッセイで評価した。共培養された細胞を、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照、アベルマブ、又はビントラファスプ（bintrafusp）と組み合わされたＭ６９０３の段階希釈物で処理した。Ｍ６９０３とアベルマブ又はビントラファスプとの組み合わせは、Ｔ細胞活性化をさらに増強した。非線形回帰分析を行って、平均±ＳＤをグラフに示す。 [0056] Ｍ６９０３が、スーパー抗原ＳＥＢアッセイにおいてアベルマブ又はビントラファスプと組み合わせられると増強された活性を示すことを実証するグラフを示す。ヒトＰＢＭＣは、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと１０ｍｇ／ｍＬのＭ６９０３（又はアイソタイプ対照）のみ、又はアベルマブ又はビントラファスプαと組み合わせて９日間処理した。次いで、細胞を培地で１回洗浄し、ＳＥＢ及び同じ抗体でさらに２日間再刺激した。上清を回収し、ＩＦＮ－γをＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡで測定した。Ｍ６９０３、アベルマブ、及びビントラファスプαはすべて、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生を増加させ、Ｍ６９０３を他の抗体のいずれかと組み合わせることによって効果が増強された。アベルマブ又はビントラファスプαと組み合わせてＭ６９０３を評価する実験を示す。 [0056] Ｍ６９０３が、スーパー抗原ＳＥＢアッセイにおいてアベルマブ又はビントラファスプと組み合わせられると増強された活性を示すことを実証するグラフを示す。ヒトＰＢＭＣは、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと１０ｍｇ／ｍＬのＭ６９０３（又はアイソタイプ対照）のみ、又はアベルマブ又はビントラファスプαと組み合わせて９日間処理した。次いで、細胞を培地で１回洗浄し、ＳＥＢ及び同じ抗体でさらに２日間再刺激した。上清を回収し、ＩＦＮ－γをＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡで測定した。Ｍ６９０３、アベルマブ、及びビントラファスプαはすべて、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生を増加させ、Ｍ６９０３を他の抗体のいずれかと組み合わせることによって効果が増強された。アベルマブのみと組み合わせられたＭ６９０３を評価する実験を示す。 [0057] Ｍ６９０３、抗ＰｄｔＳｅｒ、及び抗Ｇａｌ９を使用したＣＥＦ抗原特異的Ｔ細胞アッセイの結果を示す。ＰＢＭＣを、示された１つ又は複数の抗体の存在下で５日間、４０μｇ／ｍｌのＣＥＦウイルスペプチドプールで処理した。抗Ｇａｌ－９と抗ＰｔｄＳｅｒとの組み合わせは、Ｍ６９０３単独と同様の活性を有し、Ｇａｌ－９とＰｔｄＳｅｒの両方をブロックすることが抗ＴＩＭ－３活性に必要であり得ることを示唆している（ボックスで囲まれたデータを比較）。 [0058] 抗ＴＩＭ－３抗体で染色された１２の腫瘍ＴＭＡにおいてＩＨＣを介して測定されたＴＩＭ－３発現の定量分析を示す。プロットは発現の中央値によって順序付けられている。 [0058] 抗ＴＩＭ－３抗体で染色された１２の腫瘍ＴＭＡにおいてＩＨＣを介して測定されたＴＩＭ－３発現の定量分析を示す。プロットは、外れ値の除外後の発現の平均値によって順序付けられている。 [0059] 腫瘍微小環境（ＴＭＥ）においてＴＩＭ－３を発現する免疫細胞を識別するための８つの腫瘍組織のｍＩＦ染色を示す。ＣＤ３及びＣＤ６８をそれぞれ、リンパ球及びマクロファージのマーカーとして使用した。ＴＩＭ－３＋ＣＤ３＋リンパ球及びＴＩＭ－３＋ＣＤ６８＋マクロファージのパーセンテージを、ｍＩＦ分析を使用して腫瘍ＴＭＡ全体で定量化した。 [0060] フローサイトメトリー分析を使用したＮＳＣＬＣコホートにおけるＴＩＭ－３発現を示す。生ＣＤ３＋細胞内では、ＴＩＭ－３の発現がＣＤ８＋Ｔ細胞で最も高く、続いてＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇであることが観察された。各ドットは、個々の試料を表す。線は、各免疫サブセットの中央値を表す。 [0061] 図１４Ａ－Ｃはアベルマブと組み合わせられたＭ６９０３が、ＴＩＬにおけるＬＡＧ－３、ＰＤ－１、及びＴＩＭ－３の発現を減少させることを実証している。ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスに、ＭＣ３８細胞（３×１０５）を皮下（ｓ．ｃ．）接種し、アイソタイプ対照（２０ｍｇ／ｋｇ）、アベルマブ（７ｍｇ／ｋｇ）、Ｍ６９０３（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＭ６９０３＋アベルマブで６日間処理した。次いで、腫瘍を、全細胞中の生ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ（図１４Ａ）、ＣＤ４５＋ゲート内のＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３細胞、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、又はＴｒｅｇ細胞のパーセンテージ（図１４Ｂ）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３を共発現するＣＤ４５＋ゲート内のＣＤ４及びＣＤ８細胞のパーセンテージ（図１４Ｃ）についてフローサイトメトリーで分析した。示されている各条件では、示されている４つのバーは、左から右にアイソタイプ対照、アベルマブ、Ｍ６９０３、Ｍ６９０３＋アベルマブである。示された値は平均＋ＳＥＭである。Ｐ値は、対応のないｔ検定分析で計算し、アイソタイプ対照と比較した群間の有意差を示す；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 [0062] 図１５Ａ－Ｃは、Ｍ６９０３及びアベルマブが、単剤療法又は併用療法として、Ｂ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスにおいてＭＣ３８腫瘍体積を減少させたことを実証している。Ｂ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスの側腹部にＭＣ３８（５×１０５の細胞）を皮下接種し、次いで、アイソタイプ対照（２０ｍｇ／ｋｇ）、Ｍ６９０３（１０ｍｇ／ｋｇ）、アベルマブ（２０ｍｇ／ｋｇ）、又はＭ６９０３＋アベルマブで処理した。図１５ＡはＳＥＭを用いた平均腫瘍体積を、図１５Ｂは個々の腫瘍体積を、図１５Ｃは生存率を分析し、生存期間の中央値を計算した。 [0063] 図１６Ａ－Ｂは、Ｍ６９０３及びビントラファスプαが、単剤療法又は併用療法として、Ｂ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスにおいてＭＣ３８腫瘍体積を減少させたことを実証している。Ｂ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスの側腹部にＭＣ３８（１×１０６の細胞）を皮下接種し、次いで、アイソタイプ対照（２０ｍｇ／ｋｇ）、Ｍ６９０３（１０ｍｇ／ｋｇ）、ビントラファスプα（２４ｍｇ／ｋｇ）、又はＭ６９０３＋ビントラファスプαで処理した。図１６ＡはＳＥＭによる平均腫瘍体積を、図１６Ｂは個々の腫瘍体積を示す。
詳細な説明
[0064] 本明細書に開示される抗ＴＩＭ－３抗体は、ヒトＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）の結合及び活性化の中和に基づいて選択された特定のモノクローナル抗体の抗原結合部位に基づく。抗体は、ＴＩＭ－３の結合部位を定義する免疫グロブリン可変領域ＣＤＲ配列を含む。
[0065] これらの抗体の中和活性を考慮して、これらの抗体は、特定の癌細胞型の成長及び／又は増殖の阻害に有用である。治療薬として使用される場合、抗体は、生化学的特性及び／若しくは生物物理学的特性を改善するため、並びに／又はヒト患者に投与された場合の免疫原性を低減若しくは排除するために最適化する、例えば、親和性成熟させることができる。本発明の様々な特徴及び態様は、以下でより詳細に論じられる。
[0001] 本明細書で使用される「抗体」という用語は、特段の記載がない限り、インタクトな抗体（例えば、インタクトなモノクローナル抗体）又は抗体の抗原結合断片を意味し、最適化された、エンジニアリングされた、又は化学的に結合されたインタクトな抗体又はその抗体の抗原結合断片（例えば、完全ヒト抗体、半合成抗体、又は完全合成抗体を含むファージディスプレイ抗体）を含む。最適化された抗体の例は、親和性成熟抗体である。エンジニアリングされた抗体の例は、Ｆｃ最適化抗体、抗体融合タンパク質、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニボディ、及びダイアボディが含まれる。毒素部分に結合した抗体は、化学的に結合した抗体の一例である。抗体融合タンパク質には、例えば、サイトカインなどの可溶性リガンド、又は細胞受容体タンパク質の細胞外ドメインに遺伝的に融合した抗体が含まれる。
Ｉ．ヒトＴＩＭ－３に結合する抗体
[0066] 本明細書に開示される抗体は、（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は一緒になって、ＴＩＭ－３に結合するための単一結合部位を規定する。
[0067] いくつかの実施形態では、抗体は：（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに（ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は一緒になって、ＴＩＭ－３に結合するための単一結合部位を規定する。ＣＤＲＨ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、且つＣＤＲＨ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３配列は、免疫グロブリンＦＲ配列（配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０）間に挿入される。
[0068] いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ＩｇＧ軽鎖可変領域とＩｇＧ重鎖可変領域は一緒になって、ＴＩＭ－３に結合するための単一結合部位を規定する。ＣＤＲＬ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列は、免疫グロブリンＦＲ配列（配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４）間に挿入される。
[0069] いくつかの実施形態では、抗体は：（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は一緒になって、ＴＩＭ－３に結合するための単一結合部位を規定する。ＣＤＲＨ１は、配列番号１のアミノ酸配列であり；ＣＤＲＨ２は、配列番号２のアミノ酸配列であり；且つＣＤＲＨ３は、配列番号３のアミノ酸配列である。ＣＤＲＬ１は、配列番号４のアミノ酸配列であり；ＣＤＲＬ２は、配列番号５のアミノ酸配列であり；且つＣＤＲＬ３は、配列番号６のアミノ酸配列である。
[0070] 他の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５３、配列番号２４、配列番号５５、及び配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；並びに免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
[0071] 他の実施形態では、抗体は、配列番号５２、配列番号５４、配列番号２３、及び配列番号３３からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域；並びに免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
[0072] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５３、配列番号２４、配列番号５５、及び配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；並びに配列番号５２、配列番号５４、配列番号２３、及び配列番号３３からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
[0073] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
[0074] 特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号３２からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖；並びに免疫グロブリン軽鎖を含む。
[0075] 他の実施形態では、抗体は、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、及び配列番号３１からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖；並びに免疫グロブリン重鎖を含む。
[0076] いくつかの実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；並びに（ｉｉ）配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、及び配列番号３１からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖を含む。
[0077] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
[0078] 特定の実施形態では、ＴＩＭ－３に結合する単離された抗体は、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、若しくは配列番号３２の全可変領域又はフレームワーク領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＴＩＭ－３に結合する単離された抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３；並びに配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、若しくは配列番号３２の全可変領域又はフレームワーク領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
[0079] 特定の実施形態では、ＴＩＭ－３に結合する単離された抗体は、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、若しくは配列番号３１の全可変領域又はフレームワーク領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＴＩＭ－３に結合する単離された抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３；並びに配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号３１の全可変領域又はフレームワーク領域配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
[0080] 配列同一性は、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して決定することができる。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、及びtblastxで採用されているアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（参照により援用されるKarlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）は、配列類似性検索用に調整されている。配列データベースの検索における基本的な問題の議論については、参照により完全に援用されるAltschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129を参照されたい。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。ヒストグラム、説明、配置、期待値（即ち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、及びフィルターの検索パラメーターは、デフォルト設定である。blastp、blastx、tblastn、及びtblastxで使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックスである（参照により完全に援用されるHenikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919）。４つのblastnパラメーターは次のように調整することができる：Ｑ＝１０（ギャップ作成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ったすべてのwink.sup.th位置でワードヒットを生成する）；及びｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアラインメントが作成されているウィンドウ幅を設定する）。同等のBlastpパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；及びｇａｐｗ＝３２であり得る。検索は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のBLAST Advanced Optionパラメーターを使用して行うこともできる（例えば：－Ｇ（Cost to open gap）［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドの場合は５／タンパク質の場合は１１；－Ｅ（Cost to extend gap）［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドの場合は２／タンパク質の場合は１；－ｑ（Penalty for nucleotide mismatch）［整数］：デフォルト＝－３；－ｒ（reward for nucleotide match）［整数］：デフォルト＝１；－ｅ（expect value）［実数］：デフォルト＝１０；－Ｗ（wordsize）［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドの場合は１１／megablastの場合は２８／タンパク質の場合は３；－ｙ（Dropoff (X) for blast extensions in bits）：デフォルト＝blastnの場合は２０／その他の場合は７；－Ｘ（X dropoff value for gapped alignment (in bits)）：デフォルト＝すべてのプログラムで１５、blastnには適用されない；及び－Ｚ（final X dropoff value for gapped alignment (in bits)）：blastnの場合は５０、他の場合は２５）。ペアワイズタンパク質アラインメント用のClustalWも使用することができる（デフォルトのパラメーターには、例えば、Blosum62マトリックス及びギャップオープニングペナルティ＝１０、及びギャップエクステンションペナルティ＝０．１が含まれ得る）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のBestfit比較では、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ作成ペナルティ）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用し、タンパク質比較の同等の設定はＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。
[0081] 前述の実施形態のそれぞれにおいて、一緒になってＴＩＭ－３に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列が、重鎖及び／又は軽鎖可変領域のフレームワーク領域にアミノ酸変化（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は１０のアミノ酸置換、欠失、又は付加）を含み得ることが本明細書で企図される。特定の実施形態では、アミノ酸の変化は保存的置換である。本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、構造的に類似したアミノ酸による置換を指す。例えば、保守的な置換には、次の群の置換が含まれ得る：ＳｅｒとＣｙｓ；ＬｅｕとＩｌｅとＶａｌ；ＧｌｕとＡｓｐ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＰｈｅとＴｙｒとＴｒｐ；並びにＧｌｎとＡｓｎとＧｌｕとＡｓｐとＨｉｓ。保守的な置換は、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ置換マトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックス）、又はＰＡＭ置換：ｐマトリックス（例えば、ＰＡＭ ２５０マトリックス）によって定義することもできる。
[0082] 特定の実施形態では、抗体は、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、又は１ｎＭ以下のＫＤでＴＩＭ－３に結合する。特段の記載がない限り、ＫＤ値は、例えば、実施例１．９に記載されるように表面プラズモン共鳴によって決定される。
[0083] いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、本明細書に開示される抗ＴＩＭ－３抗体（例えば、Ｍ６９０３）のいずれかと同じＴＩＭ－３上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３への結合を本明細書に開示される抗ＴＩＭ－３抗体のいずれかと競合する。例えば、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のガレクチン－９結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。別の例では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のＰｔｄＳｅｒ結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。別の例では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のＣＥＡＣＡＭ１結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。さらなる例では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のガレクチン－９結合ドメイン及びＰｔｄＳｅｒ結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。別の例では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のガレクチン－９結合ドメイン及びＣＥＡＣＡＭ１結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。別の例では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のＰｔｄＳｅｒ結合ドメイン及びＣＥＡＣＡＭ１結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。別の例では、モノクローナル抗体は、ＴＩＭ－３のガレクチン－９結合ドメイン、ＰｔｄＳｅｒ結合ドメイン、及びＣＥＡＣＡＭ１結合ドメインへの結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合し得る。
[0084] 抗体が本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と同じエピトープに結合するか、又はガレクチン－９、ＰｔｄＳｅｒ、及び／若しくはＣＥＡＣＡＭ１との結合を本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体と競合するかどうかを決定するための競合アッセイは当技術分野で公知である。例示的な競合アッセイには、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、BIAcore分析、バイオレイヤー干渉法、及びフローサイトメトリーが含まれる。
[0085] 典型的には、競合アッセイは、固体表面に結合した又は細胞表面上に発現された抗原（例えば、ＴＩＭ－３タンパク質又はその断片）、試験ＴＩＭ－３結合抗体、及び参照抗体（例えば、抗体Ｍ６９０３）の使用を含む。参照抗体は標識されており、試験抗体は標識されていない。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識参照抗体の量を決定することによって測定される。通常は、試験抗体は過剰に存在する（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍）。競合アッセイによって同定された抗体（即ち、競合する抗体）には、参照抗体と同じエピトープ、又は類似の（例えば、重複する）エピトープに結合する抗体、及び立体障害が起きるように参照抗体によって結合されたエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
[0086] 例示的な競合アッセイでは、参照ＴＩＭ－３抗体（例えば、抗体Ｍ６９０３）を、市販の試薬を使用してビオチン化する。ビオチン化参照抗体を、試験抗体又は非標識参照抗体（自己競合対照）の段階希釈物と混合して、標識された参照抗体に対して様々なモル比（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍）の試験抗体（又は非標識参照抗体）の混合物にする。抗体混合物を、ＴＩＭ－３（例えば、ＴＩＭ－３細胞外ドメイン）ポリペプチドでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに加える。次いで、プレートを洗浄し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）－ストレプトアビジン（stepavidin）を検出試薬としてプレートに添加する。標的抗原に結合した標識された参照抗体の量を、当技術分野で周知である発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’、５、５’－テトラメチルベンジジン）又はＡＢＴＳ（２，２’’－アジノ－ジ－（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホネート））の添加後に検出する。光学濃度の読み取り値（ＯＤ単位）を、SpectraMax M2分光計（Molecular Devices）を使用して測定する。０パーセント阻害に対応するＯＤ単位を、競合する抗体のないウェルから決定する。１００％阻害に対応するＯＤ単位、即ち、アッセイバックグラウンドを、標識された参照抗体又は試験抗体のないウェルから決定する。各濃度での試験抗体（又は非標識参照抗体）によるＴＩＭ－３に対する標識参照抗体の阻害率を次のように計算する：％阻害＝（１－（ＯＤ単位－１００％阻害）／（０％阻害－１００％阻害））×１００。当業者であれば、当技術分野で周知の様々な検出システムを使用して競合アッセイを行うことができることを理解されよう。
[0087] 標識の存在が結合を妨害しないこと、又は他の方法で結合を阻害しないことを確実にするために、競合アッセイを両方向で行うことができる。例えば、最初の方向では、参照抗体を標識し、試験抗体は標識せず、第２の方向では、試験抗体を標識し、参照抗体は標識しない。
[0088] 過剰の１種類の抗体（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍）が、他の抗体の結合を、例えば、競合結合アッセイによる測定で少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、又は９９％阻害する場合、試験抗体は、抗原への特異的結合を参照抗体と競合する。
[0089] ２つの抗体のうちの一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、この２つの抗体が同じエピトープに結合すると決定することができる。２つの抗体のうちの一方の抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減又は排除する場合、この２つの抗体が重複するエピトープに結合すると決定することができる。
ＩＩ．抗体の生産
[0090] 本明細書に開示されるような抗体を生産するための方法は当技術分野で公知である。例えば、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子は、本明細書に示される配列情報を使用して化学的に合成することができる。合成ＤＮＡ分子は、例えば、定常領域コード配列、及び発現制御配列を含む他の適切なヌクレオチド配列に連結して、所望の抗体をコードする従来の遺伝子発現構築物を作製することができる。定義された遺伝子構築物の生産は、当技術分野における日常的な技術の範囲内である。
[0091] 所望の抗体をコードする核酸は、発現ベクターに組み込む（連結する）ことができ、これを、従来のトランスフェクション又は形質転換技術によって宿主細胞に導入することができる。例示的な宿主細胞は、通常はＩｇＧタンパク質を産生しない大腸菌（E.coli）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、及び骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞が免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現することを可能にする条件下で増殖させることができる。
[0092] 特定の発現及び精製条件は、使用される発現系に応じて様々である。例えば、遺伝子が大腸菌（E.coli）で発現される場合、この遺伝子はまず、適切な細菌プロモーター、例えば、Ｔｒｐ又はＴａｃ、及び原核生物のシグナル配列の下流のエンジニアリングされた遺伝子を配置することによって発現ベクターにクローニングされる。発現された分泌タンパク質は、屈折体又は封入体に蓄積し、フレンチプレス又は超音波処理による細胞の破壊後に回収することができる。次いで、屈折体は可溶化され、タンパク質が、当技術分野で公知の方法によってリフォールディングされ、切断される。
[0093] エンジニアリングされた遺伝子が真核生物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞で発現される場合、この遺伝子はまず、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ポリＡ配列、及び終止コドンを含む発現ベクターに挿入され、任意選択により、エンハンサー及び様々なイントロンを含み得る。この発現ベクターは、任意選択により、定常領域の全て又は一部をコードする配列を含み、重鎖又は軽鎖の全体又は一部を発現させることができる。遺伝子構築物は、従来の技術を使用して真核生物の宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、それぞれ別の機能（例えば、細胞毒性）を有する部分に付着することができるＶＬ若しくはＶＨ断片、ＶＬ－ＶＨヘテロダイマー、ＶＨ－ＶＬ若しくはＶＬ－ＶＨ単鎖ポリペプチド、完全な重鎖若しくは軽免疫グロブリン鎖、又はそれらの一部を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、重鎖（例えば、重鎖可変領域）又は軽鎖（例えば、軽鎖可変領域）の全体又は一部を発現するポリペプチドを発現する単一ベクターでトランスフェクトされる。他の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチド、又は（ｂ）免疫グロブリン重鎖全体及び免疫グロブリン軽鎖全体をコードする単一ベクターでトランスフェクトされる。さらに他の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の発現ベクター（例えば、重鎖又は重鎖可変領域の全体又は一部を含むポリペプチドを発現する１つの発現ベクター、及び全体を含むポリペプチド、軽鎖又は軽鎖可変領域の全体又は一部を含むポリペプチドを発現する別の発現ベクター）で同時トランスフェクトされる。
[0094] 免疫グロブリン重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドは、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、そのような可変領域をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を増殖（培養）することによって生産することができる。発現に続いて、ポリペプチドを、当技術分野で周知の技術、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びヒスチジンタグなどの親和性タグを使用して回収し、精製又は単離することができる。
[0095] ヒトＴＩＭ－３に結合するモノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合断片は、以下でトランスフェクトされた宿主細胞を増殖（培養）することによって生産することができる：（ａ）完全若しくは部分的な免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクター、及び完全若しくは部分的な免疫グロブリン軽鎖をコードする別個の発現ベクター；又は（ｂ）両鎖（例えば、完全又は部分的な重鎖及び軽鎖）の発現を可能にする条件下で、この両鎖をコードする単一発現ベクター。インタクトな抗体（又は抗原結合断片）を、当技術分野で周知の技術、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの親和性タグ、及びヒスチジンタグを使用して回収し、精製又は単離することができる。単一の発現ベクター又は２つの別個の発現ベクターから重鎖及び軽鎖を発現することは当業者の技術の範囲内である。
ＩＩＩ．抗体修飾
[0096] ヒトモノクローナル抗体は、免疫ライブラリー、ナイーブライブラリー、及び合成ライブラリーを含むファージディスプレイライブラリーから単離又は選択することができる。抗体ファージディスプレイライブラリーは当技術分野で公知であり、例えば、Hoet et al., Nature Biotech. 23:344-348, 2005; Soderlind et al., Nature Biotech. 18:852-856, 2000; Rothe et al., J. Mol. Biol. 376:1182-1200, 2008; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; and Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84, 2001を参照されたい。治療薬として使用される場合、ファージディスプレイによって単離されたヒト抗体は、親和性及び／若しくは特異性を含む生化学的特性を改善するため、凝集、安定性、沈殿、及び／若しくは非特異的相互作用を含む生物物理学的特性を改善するため、並びに／又は免疫原性を低下させるために最適化する（例えば、親和性成熟させる）ことができる。親和性成熟手順は、当業者の技術の範囲内である。例えば、多様性は、ＤＮＡシャッフリング、鎖シャッフリング、ＣＤＲシャッフリング、ランダム突然変異誘発、及び／又は部位特異的突然変異誘発によって、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖に導入することができる。
[0097] いくつかの実施形態では、単離されたヒト抗体は、フレームワーク領域に１つ又は複数の体細胞変異を含む。これらの場合、フレームワーク領域をヒト生殖細胞系列配列に変更して、抗体を最適化することができる（即ち、生殖細胞系列化（germlining）と呼ばれるプロセス）。
[0098] 一般に、最適化された抗体は、それが由来する非最適化（又は親）抗体と少なくとも同じ、又は実質的に同じ親和性を抗原に対して有する。好ましくは、最適化された抗体は、親抗体と比較した場合、抗原に対してより高い親和性を有する。
抗体断片
[0099] 本発明のタンパク質及びポリペプチドは、抗体の抗原結合断片も含み得る。例示的な抗体断片には、ラクダ起源の抗体断片などのｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及び単一ドメインＶＨＨ断片が含まれる。
[00100] 一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としても知られる一本鎖抗体断片は、典型的には抗原又は受容体に結合する組換えポリペプチドであり；これらの断片は、１つ又は複数の相互接続リンカーの有無にかかわらず、抗体可変軽鎖配列（ＶＬ）の少なくとも１つの断片につながれた抗体可変重鎖アミノ酸配列（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含む。そのようなリンカーは、一本鎖抗体断片が由来する抗体全体の標的分子結合特異性を維持するために、それらが連結されると、ＶＬ及びＶＨドメインの適切な三次元フォールディングが確実に起こるように選択された短くて柔軟なペプチドであり得る。一般に、ＶＬ又はＶＨ配列のカルボキシル末端は、そのようなペプチドリンカーによって、相補的なＶＬ及びＶＨ配列のアミノ酸末端に共有結合している。一本鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー、又は同様の技術によって作製することができる。これらのタンパク質は、細菌を含む真核細胞又は原核細胞のいずれかで産生され得る。
[00101] 一本鎖抗体断片は、本明細書に記載の抗体全体の可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むが、それらの抗体の定常ドメインの一部又はすべてを欠いている。これらの定常ドメインは、抗原結合に必要ではないが、抗体全体の構造の主要部分を構成する。従って、一本鎖抗体断片は、定常ドメインの一部又はすべてを含む抗体の使用に関連する問題のいくつかを克服し得る。例えば、一本鎖抗体断片は、生体分子と重鎖定常領域との間の望ましくない相互作用も、他の望ましくない生物学的活性もない傾向がある。加えて、一本鎖抗体断片は、抗体全体よりもかなり小さいため、抗体全体よりも毛細血管透過性が高い可能性があり、この高い毛細血管透過性は、一本鎖抗体断片がより効率的に標的抗原結合部位に局在して結合することを可能にする。また、抗体断片は、原核細胞で比較的大規模に産生され得るため、それらの産生が促進される。さらに、一本鎖抗体断片のサイズが比較的小さいため、抗体全体よりもレシピエントに免疫応答を引き起こす可能性が低い。
[00102] 抗体全体の結合特性と同じ又は同等の結合特性を有する抗体の断片も存在し得る。このような断片には、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の一方又は両方が含まれ得る。抗体断片は、抗体全体の６つすべてのＣＤＲを含み得るが、そのような領域のすべてよりも少ないＣＤＲ、例えば、３つ、４つ、又は５つのＣＤＲを含む断片も機能する。
一定の領域
[00103] 特段の記載がない限り、抗体の定常領域のアミノ酸残基は、Kabat, E.A. et al.におけるKabat EUインデックスに従って付番される（Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689 (1991)）。本明細書に記載の抗体及びその断片（例えば、親及び最適化変異体）は、特定のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を含む又は欠く特定の定常（即ち、Ｆｃ）領域を含むようにエンジニアリングすることができる。ヒト定常領域は当技術分野で公知である。
[00104] 本発明のタンパク質及びペプチド（例えば、抗体）は、免疫グロブリンの定常領域、又はその定常領域の断片、類似体、変異体、突然変異体、又は誘導体を含み得る。好ましい実施形態では、定常領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他のクラスに由来する。一実施形態では、定常領域は、ＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態では、定常領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むか、又はヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。別法では、定常領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及び／又はＣＨ３ドメインのすべて又は一部を含み得る。
[00105] 一実施形態では、定常領域は、Ｆｃ受容体に対する親和性を低下させるか、又はＦｃエフェクター機能を低下させる突然変異を含む。例えば、定常領域は、ＩｇＧ重鎖の定常領域内のグリコシル化部位を排除する突然変異を含み得る。いくつかの実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１のＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、又はＰｒｏ３３１（アミノ酸は、Kabat EUインデックスに従って付番されている）に対応するアミノ酸位置に突然変異、欠失、又は挿入を含む。特定の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１のＡｓｎ２９７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む。代替の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１のＬｅｕ２８１、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、又はＰｒｏ３７８に対応するアミノ酸位置に突然変異、欠失、又は挿入を含む。
[00106] いくつかの実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に由来するＣＨ２ドメインを含む。好ましくは、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位を排除する突然変異を含む。一実施形態では、突然変異は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖のＣＨ２ドメイン内のＧｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ（配列番号９８）アミノ酸配列内のアスパラギンを変更する。好ましくは、突然変異は、アスパラギンをグルタミンに変更する。別法では、突然変異は、Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ（配列番号９８）アミノ酸配列内のフェニルアラニン及びアスパラギンの両方を変更する。一実施形態では、Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ（配列番号９８）アミノ酸配列は、Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ（配列番号９９）アミノ酸配列で置き換えられる。Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ（配列番号９８）アミノ酸配列内のアスパラギンは、ＩｇＧ１のＡｓｎ２９７（Kabat EUインデックス）に対応する。
[00107] 別の実施形態では、定常領域は、ＣＨ２ドメイン及びヒンジ領域の少なくとも一部を含む。ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他のクラスに由来し得る。好ましくは、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他の適切なクラスに由来する。より好ましくは、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖に由来する。一実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＰｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号１００）アミノ酸配列中のシステインが変更される。好ましい実施形態では、Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号１００）アミノ酸配列は、Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）アミノ酸配列で置き換えられる。一実施形態では、定常領域は、一次抗体アイソタイプに由来するＣＨ２ドメイン及び二次抗体アイソタイプに由来するヒンジ領域を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に由来する一方、ヒンジ領域は、改変されたヒトＩｇＧ１重鎖に由来する。
[00108] 抗体又はＦｃ融合タンパク質のＦｃ部分と非Ｆｃ部分との接合部近くのアミノ酸の変更は、Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を劇的に増加させ得る（その開示が参照により本明細書に援用される国際公開第０１／５８９５７号）。従って、本発明のタンパク質又はポリペプチドの接合領域は、免疫グロブリン重鎖の天然に存在する配列と比較して、好ましくは接合点の約１０アミノ酸以内にある変更を含み得る。これらのアミノ酸の変更は、疎水性を高め得る。一実施形態では、定常領域は、Ｃ末端リジン残基が置換されているＩｇＧ配列に由来する。好ましくは、ＩｇＧ配列のＣ末端リジンは、血清半減期をさらに延ばすために、アラニン又はロイシンなどの非リジンアミノ酸で置き換えられる。別の実施形態では、定常領域は、その定常領域のＣ末端近くのＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（配列番号１０２）アミノ酸配列が潜在的な接合部Ｔ細胞エピトープを排除するように変更されているＩｇＧ配列に由来する。例えば、一実施形態では、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（配列番号１０２）アミノ酸配列は、Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（配列番号１０３）アミノ酸配列で置き換えられる。他の実施形態では、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（配列番号１０２）セグメント内のアミノ酸は、グリシン又はプロリンなどの他のアミノ酸で置き換えられる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他の免疫グロブリンクラス分子のＣ末端近くのＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（配列番号１０２）セグメントのアミノ酸置換を生成する詳細な方法は、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号で記載されている。
[00109] 本発明に適したヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び他の免疫グロブリンクラスに由来し得る。ＩｇＧ１ヒンジ領域は３つのシステインを有し、そのうちの２つは、免疫グロブリンの２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与する。これらの同じシステインは、Ｆｃ部分間の効率的で一貫したジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、本発明の好ましいヒンジ領域は、ＩｇＧ１、より好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域内の第１のシステインは、別のアミノ酸、好ましくはセリンに突然変異している。ＩｇＧ２アイソタイプヒンジ領域は、４つのジスルフィド結合を有し、組換え系での分泌中にオリゴマー化を促進し、場合によっては誤ったジスルフィド結合も促進する傾向がある。適切なヒンジ領域は、ＩｇＧ２ヒンジに由来し得；最初の２つのシステインはそれぞれ、好ましくは別のアミノ酸に突然変異している。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合を非効率的に形成することが公知である。しかしながら、本発明に適したヒンジ領域は、ＩｇＧ４ヒンジ領域に由来し得、好ましくは、重鎖由来部分間のジスルフィド結合の正しい形成を増強する突然変異を含む（Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8）。
[00110] 本発明によると、定常領域は、異なる抗体アイソタイプ、即ちハイブリッド定常領域に由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン並びにヒンジ領域を含み得る。例えば、一実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン、並びにＩｇＧ１に由来する変異ヒンジ領域を含む。別法では、別のＩｇＧサブクラスからの突然変異ヒンジ領域が、ハイブリッド定常領域で使用される。例えば、２つの重鎖間の効率的なジスルフィド結合を可能にするＩｇＧ４ヒンジの突然変異型を使用することができる。突然変異ヒンジはまた、最初の２つのシステインがそれぞれ別のアミノ酸に突然変異しているＩｇＧ２ヒンジに由来し得る。そのようなハイブリッド定常領域の構築は、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／００４４４２３号に記載されている。
[00111] 本発明によると、定常領域は、本明細書に記載の１つ又は複数の突然変異を含み得る。Ｆｃ部分の突然変異の組み合わせは、血清半減期の延長及び分子のインビボ効力の増加に相加効果又は相乗効果をもたらし得る。従って、例示的な一実施形態では、定常領域は、（ｉ）Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（配列番号１０２）アミノ酸配列がＡｌａ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（配列番号１０３）アミノ酸配列で置換されているＩｇＧ配列に由来する領域；（ｉｉ）リジンの代わりのＣ末端のアラニン残基；（ｉｉｉ）異なる抗体アイソタイプに由来するＣＨ２ドメイン及びヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ２ドメイン及び改変されたＩｇＧ１ヒンジ領域；並びに（ｉｖ）ＩｇＧ２由来ＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位を排除する突然変異、例えば、ＩｇＧ２由来ＣＨ２ドメイン内のＧｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ（配列番号９８）アミノ酸配列の代わりのＧｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ（配列番号９９）アミノ酸配列を含み得る。
[00112] 抗体が治療薬として使用される場合、抗体を、標準的なインビトロ結合化学を使用して小分子毒素又は放射性核種などのエフェクター剤に結合させることができる。エフェクター剤がポリペプチドである場合、抗体は、エフェクター剤に化学的に結合させるか、又は融合タンパク質としてエフェクター剤に結合させることができる。融合タンパク質の構築は当業者の技術の範囲内である。
ＩＶ．抗体の使用
[00113] 本明細書に記載の抗体は、腫瘍微小環境における少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートする方法に使用することができ、この方法は、腫瘍微小環境を有効量の抗ＴＩＭ－３抗体に曝露して、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３などの少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートすることを含む。疲弊マーカーのダウンレギュレーションを測定する方法は実施例６．２に記載される。特定の実施形態では、この方法は、腫瘍微小環境を、免疫チェックポイント阻害剤などの有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含み得る。免疫チェックポイント阻害剤の例には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ）などのＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＣＴＬＡ－４を標的とする阻害剤が含まれる。
[00114] 本明細書に記載の抗体はまた、Ｔ細胞活性化を増強する方法に使用することができる。この方法は、Ｔ細胞を有効量の抗ＴＩＭ－３抗体に曝露し、それによりＴ細胞の活性化を増強することを含み得る。特定の実施形態では、この方法は、Ｔ細胞を、免疫チェックポイント阻害剤などの有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む。Ｔ細胞活性化を測定するための方法は、実施例５．３に記載され、ＣＥＦ抗原への曝露によって活性化されたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ産生を測定することを含み得る。特定の実施形態では、この方法は、腫瘍微小環境を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ）などの有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含み得る。
[00115] 本明細書に開示される抗体は、様々な形態の癌を処置するために使用することができる。特定の実施形態では、癌又は腫瘍は、大腸、***、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、頸部、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌、***性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、グリア芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、癌はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃／胃腺癌（ＳＴＡＤ）である。特定の実施形態では、癌は、転移性又は局所的に進行した固形腫瘍である。特定の実施形態では、癌を処置するための標準的な治療法は存在せず、且つ／又は癌は、少なくとも１つの以前の処置からの再発性及び／又は難治性である。癌細胞は、癌細胞の増殖を阻害するために、治療上有効な量の抗体に曝露される。いくつかの実施形態では、抗体は、癌細胞の増殖を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％阻害する。
[00116] いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体は治療に使用される。例えば、この抗体を使用して哺乳動物（例えば、ヒト患者）における腫瘍増殖を阻害することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害するための抗体の使用は、治療有効量の抗体を哺乳動物に投与することを含む。他の実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体は、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
[00117] いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体は、放射線（例えば、定位放射線）又は免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＣＴＬＡ－４を標的とする）などの別の治療薬と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体は、以下の治療薬のうちの１つ又は複数と組み合わせて投与される：抗ＰＤ１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、Keytruda（登録商標）（ペンブロリズマブ、Merck & Co.）、Opdivo（登録商標）（ニボルマブ、Bristol-Myers Squibb）、Tecentriq（登録商標）（アテゾリズマブ、Roche）、Bavencio（登録商標）（アベルマブ、EMD Serono）、Imfinzi（登録商標）（デュルバルマブ、AstraZeneca）、ＴＧＦ－β経路標的薬、例えば、ガルニセルチブ（galunisertib）（ＬＹ２１５７２９９一水和物、ＴＧＦ－βＲＩの小分子キナーゼ阻害剤、ＬＹ３２００８８２（Pei et al. (2017) Cancer Res 77(13 Suppl):Abstract 955によって開示された小分子キナーゼ阻害剤ＴＧＦ－βＲＩ）、メテリムマブ（Metelimumab）（ＴＧＦ－β１を標的する抗体、Colak et al. (2017) Trends Cancer 3(1):56-71を参照）、フレソリムマブ（Fresolimumab）（GC-1008；ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２を標的する抗体）、ＸＯＭＡ０８９（ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β２を標的とする抗体；Mirza et al. (2014) INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE 55:1121を参照）、ＡＶＩＤ２００（ＴＧＦ－β１及びＴＧＦ－β３トラップ、Thwaites et al. (2017) Blood130:2532を参照）、トラベデルセン（Trabedersen）／ＡＰ１２００９（ＴＧＦ－β２アンチセンスオリゴヌクレオチド、Jaschinski et al. (2011) CURR PHARM BIOTECHNOL. 12(12):2203-13を参照）、Belagen-pumatucel-L（ＴＧＦ－Ｂ２を標的とする腫瘍細胞ワクチン、例えば、Giaccone et al. (2015) Eur J Cancer 51(16):2321-9を参照）、Colak et al. (2017), supraに記載のＴＧＢ－β経路標的剤、例えば、Ｋｉ２６８９４、ＳＤ２０８、ＳＭ１６、ＩＭＣ－ＴＲ１、ＰＦ－０３４４６９６２、ＴＥＷ－７１９７、及びＧＷ７８８３８８；国際公開第２０１１／１０９７８９号に記載されている任意の免疫調節抗体及び融合タンパク質、例えば、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－βＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１に結合する免疫調節部分を有するもの、核因子－κＢ（ＲＡＮＫ）リガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体アクチベーター、及び核因子－κＢ（ＲＡＮＫ）の受容体アクチベーター、例えば、配列番号１及び７０を含む抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質（以下の列挙で参照される配列番号は、国際公開第２０１１／１０９７８９号に開示されているような配列を識別する番号である）、配列番号２及び７１を含む抗ＥＧＦＲ１抗体及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３及び７２を含む抗ＣＤ２０及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号４及び７３を含む抗ＶＥＧＦ抗体及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号５及び７４を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号６及び／又は７を含む抗ＩＬ－２ Ｆｃ及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号８及び７５を含む抗ＣＤ２５抗体及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号９及び７６を含む抗ＣＤ２５（バシリキシマブ）及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号１１及び／又は１２を含むＰＤ－１外部ドメイン、Ｆｃ、及びＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号１３及び／又は１４を含むＴＧＦβＲＩＩ外部ドメイン、Ｆｃ、及びＲＡＮＫ外部ドメイン融合タンパク質、配列番号１５及び７０を含む抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号１６及び７１を含む抗ＥＧＦＲ１抗体及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号１７及び７２を含む抗ＣＤ２０及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号１８及び７３を含む抗ＶＥＧＦ抗体及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号１９及び７４を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号２０及び７５を含む抗ＣＤ２５抗体及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号２１及び７６を含む抗ＣＤ２５（バシリキシマブ）及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質；配列番号１６及び／又は２３を含むＩＬ－２、Ｆｃ、及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号２４及び７７を含む抗ＣＤ４抗体及びＰＤ－１細胞外ドメイン融合タンパク質、配列番号１６及び／又は２３を含むＰＤ－１外部ドメイン、Ｆｃ、ＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号２７及び７０を含む抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号２８及び７１を含む抗ＥＧＦＲ１抗体及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号２９及び７２を含む抗ＣＤ２０及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３０及び７３を含む抗ＶＥＧＦ抗体及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３１及び７４を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３２及び７５を含む抗ＣＤ２５抗体及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３３及び７６を含む抗ＣＤ２５（バシリキシマブ）及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３４及び／又は３５を含むＩＬ－２、Ｆｃ、及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３６及び７７を含む抗ＣＤ４抗体及びＲＡＮＫ ＥＣＤ融合タンパク質、配列番号３７及び７８を含む抗ＴＮＦα抗体及びＰＤ－１リガンド１又はＰＤ－１リガンド２融合タンパク質、配列番号３８及び／又は３９を含むＴＮＦＲ２細胞外結合ドメイン、Ｆｃ、及びＰＤ－１リガンド融合タンパク質、配列番号４０及び７２を含む抗ＣＤ２０及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、配列番号４１及び７５を含む抗ＣＤ２５抗体及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、配列番号４２及び７６を含む抗ＣＤ２５（バシリキシマブ）及びＰＤ－１外部ドメイン融合タンパク質、配列番号４３及び／又は４４を含むＩＬ－２、Ｆｃ、及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、配列番号４５及び７７を含む抗ＣＤ４抗体及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、配列番号４６及び／又は４７を含むＣＴＬＡ－４ ＥＣＤ、Ｆｃ（ＩｇＧ Ｃγ１）、及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、配列番号４８及び／又は４９を含むＴＧＦ－β、Ｆｃ（ＩｇＧ Ｃγ１）、及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質、配列番号５０及び７７を含む抗ＴＮＦ－α抗体及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号５１及び／又は５２を含むＴＮＦＲ２細胞外結合ドメイン、Ｆｃ、及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号５３及び７２を含む抗ＣＤ２０及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号５４及び７５を含む抗ＣＤ２５抗体及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号５５及び７６を含む抗ＣＤ２５（バシリキシマブ）及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号５６及び／又は５７を含むＩＬ－２、Ｆｃ、及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号５９及び／又は６０を含むＣＴＬＡ－４ ＥＣＤ、Ｆｃ（ＩｇＧ Ｃγ１）、及びＴＧＦ－β融合タンパク質、配列番号６１及び７８を含む抗ＴＮＦ－α抗体及びＲＡＮＫ融合タンパク質、配列番号６２及び／又は６３を含むＴＮＦＲ２細胞外結合ドメイン、Ｆｃ、及びＲＡＮＫ融合タンパク質、配列番号６４及び／又は６５を含むＣＴＬＡ－４ ＥＣＤ、Ｆｃ（ＩｇＧ Ｃγ１）、及びＲＡＮＫ融合タンパク質、配列番号６６及び／又は６７を含むＲＡＮＫ、Ｆｃ、及びＴＧＦ－β融合タンパク質、並びに配列番号６８及び／又は６９を含むＲＡＮＫ、Ｆｃ、及びＰＤ－Ｌ１融合タンパク質。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体
[00118] 本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体は、当技術分野に記載の任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて投与することができる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば２９Ｅ２Ａ３抗体（Biolegend、カタログ番号３２９７０１）は市販されている。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びＦｖ断片が含まれ、これらについては以下でさらに詳細に説明する。
[00119] 例示的な抗体は、アベルマブを記述している国際公開第２０１３／０７９１７４号に記載されている。これらの抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域ポリペプチドを含み得：
（ａ）ＣＤＲＨ１配列は、Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３（配列番号５８）であり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２配列は、ＳＩＹＰＳＧＧＸ４ＴＦＹＡＤＸ５ＶＫＧ（配列番号５９）であり；
（ｃ）ＣＤＲＨ３配列は、ＩＫＬＧＴＶＴＴＶＸ６Ｙ（配列番号６０）であり；
さらに、式中：Ｘ１は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３は、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＭであり；Ｘ４は、Ｆ又はＩであり；Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；Ｘ６は、Ｅ又はＤである。
[00120] 一実施形態では、Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２は、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３は、Ｆ又はＭであり；Ｘ４は、Ｆ又はＩであり；Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；Ｘ６は、Ｅ又はＤである。
[00121] 別の実施形態では、Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２は、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３は、Ｆ又はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；Ｘ６はＤである。
[00122] さらに別の実施形態では、Ｘ１はＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５はＴであり；Ｘ６はＤである。
[00123] 別の態様では、ポリペプチドは、式：（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＣＤＲＨ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＣＤＲＨ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＣＤＲＨ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）に一致する、ＣＤＲ間に並置された可変領域重鎖フレームワーク（ＦＲ）配列をさらに含む。
[00124] さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する。
[00125] なおさらなる態様では、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下の通りである：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号６１）であり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号６２）であり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号６３）であり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６４）である。
[00126] なおさらなる態様では、重鎖ポリペプチドは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む可変領域軽鎖とさらに組み合わされ：
（ａ）ＣＤＲＬ１配列は、ＴＧＴＸ７Ｘ８ＤＶＧＸ９ＹＮＹＶＳ（配列番号６５）であり；
（ｂ）ＣＤＲＬ２配列は、Ｘ１０ＶＸ１１Ｘ１２ＲＰＳ（配列番号６６）であり；
（ｃ）ＣＤＲＬ３配列は、ＳＳＸ１３ＴＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＲＶ（配列番号６７）であり；
さらに、式中：Ｘ７は、Ｎ又はＳであり；Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９は、Ａ又はＧであり；Ｘ１０は、Ｅ又はＤであり；Ｘ１１は、Ｉ、Ｎ、又はＳであり；Ｘ１２は、Ｄ、Ｈ、又はＮであり；Ｘ１３は、Ｆ又はＹであり；Ｘ１４は、Ｎ又はＳであり；Ｘ１５は、Ｒ、Ｔ、又はＳであり；Ｘ１６は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１７は、Ｉ又はＴである。
[00127] 別の実施形態では、Ｘ７は、Ｎ又はＳであり；Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９は、Ａ又はＧであり；Ｘ１０は、Ｅ又はＤであり；Ｘ１１はＮ又はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３は、Ｆ又はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１７はＴである。
[00128] さらに別の実施形態では、Ｘ７はＳであり；Ｘ８はＳであり；Ｘ９はＧであり；Ｘ１０は、Ｄであり；Ｘ１１はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＳであり；Ｘ１７はＴである。
[00129] なおさらなる態様では、軽鎖は、式：（ＬＣ－ＣＤＲＬ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＣＤＲＬ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＣＤＲＬ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）に一致する、ＣＤＲ間に並置された可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。
[00130] なおさらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖系列フレームワーク配列に由来する。
[00131] なおさらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列はラムダ軽鎖配列である。
[00132] なおさらなる態様では、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下の通りである：
ＬＣ－ＦＲ１は、ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣ（配列番号６８）であり；
ＬＣ－ＦＲ２は、ＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹ（配列番号６９）であり；
ＬＣ－ＦＲ３は、ＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７０）
ＬＣ－ＦＲ４は、ＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号７１）である。
[00133] 別の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片を提供し：
（ａ）重鎖は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含み、さらに：（ｉ）ＣＤＲＨ１配列は、Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３（配列番号７２）であり；（ｉｉ）ＣＤＲＨ２配列は、ＳＩＹＰＳＧＧＸ４ＴＦＹＡＤＸ５ＶＫＧ（配列番号７３）であり；（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３配列は、ＩＫＬＧＴＶＴＴＶＸ６Ｙ（配列番号７４）であり、且つ；
（ｂ）軽鎖は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含み、さらに：（ｉｖ）ＣＤＲＬ１配列は、ＴＧＴＸ７Ｘ８ＤＶＧＸ９ＹＮＹＶＳ（配列番号７５）であり；（ｖ）ＣＤＲＬ２配列は、Ｘ１０ＶＸ１１Ｘ１２ＲＰＳ（配列番号７６）であり；（ｖｉ）ＣＤＲＬ３配列は、ＳＳＸ１３ＴＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＲＶ（配列番号：７７）であり；Ｘ１は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３は、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＭであり；Ｘ４は、Ｆ又はＩであり；Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；Ｘ６は、Ｅ又はＤであり；Ｘ７は、Ｎ又はＳであり；Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９は、Ａ又はＧであり；Ｘ１０は、Ｅ又はＤであり；Ｘ１１は、Ｉ、Ｎ、又はＳであり；Ｘ１２は、Ｄ、Ｈ、又はＮであり；Ｘ１３は、Ｆ又はＹであり；Ｘ１４は、Ｎ又はＳであり；Ｘ１５はＲ、Ｔ、又はＳであり；Ｘ１６は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１７は、Ｉ又はＴである。
[00134] 一実施形態では、Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２は、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３は、Ｆ又はＭであり；Ｘ４は、Ｆ又はＩであり；Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；Ｘ６は、Ｅ又はＤであり；Ｘ７は、Ｎ又はＳであり；Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９は、Ａ又はＧであり；Ｘ１０は、Ｅ又はＤであり；Ｘ１１は、Ｎ又はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３は、Ｆ又はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１７はＴである。
[00135] 別の実施形態では、Ｘ１は、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２は、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３は、Ｆ又はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；Ｘ６はＤであり；Ｘ７は、Ｎ又はＳであり；Ｘ８は、Ｔ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９は、Ａ又はＧであり；Ｘ１０は、Ｅ又はＤであり；Ｘ１１は、Ｎ又はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３は、Ｆ又はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１７はＴである。
[00136] さらに別の実施形態では、Ｘ１はＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５はＴであり；Ｘ６はＤであり；Ｘ７はＳであり；Ｘ８はＳであり；Ｘ９はＧであり；Ｘ１０はＤであり；Ｘ１１はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＳであり；Ｘ１７はＴである。
[00137] さらなる態様では、重鎖可変領域は、（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＣＤＲＨ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＣＤＲＨ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＣＤＲＨ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）として、ＣＤＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、且つ軽鎖可変領域は、（ＬＣ－ＦＲ１ ＭＣＤＲＬ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＣＤＲＬ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＣＤＲＬ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）として、ＣＤＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。
[00138] なおさらなる態様では、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖系列配列に由来する。
[00139] なおさらなる態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号６１）であり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号６２）であり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：６３）であり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６４）である。
[00140] なおさらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列はラムダ軽鎖配列である。
[00141] なおさらなる態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ－ＦＲ１は、ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣ（配列番号６８）であり；
ＬＣ－ＦＲ２は、ＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹ（配列番号６９）であり；
ＬＣ－ＦＲ３は、ＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７０）であり；
ＬＣ－ＦＲ４は、ＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号７１）である。
[00142] なおさらなる態様では、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体、又は抗体断片は、少なくともＣＨ１ドメインをさらに含む。
[00143] より具体的な態様では、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体、又は抗体断片は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインをさらに含む。
[00144] なおさらなる態様では、可変領域軽鎖、抗体、又は抗体断片は、ＣＬドメインをさらに含む。
[00145] なおさらなる態様では、抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬドメインをさらに含む。
[00146] なおさらに具体的な態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。
[00147] なおさらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
[00148] なお、さらに具体的な態様では、ヒト又はマウス定常領域はＩｇＧ１である。
[00149] さらに別の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を特徴とし：
（ａ）重鎖は、それぞれＳＹＩＭＭ（配列番号７８）、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号７９）、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹ（配列番号８０）に対して少なくとも８０％の全配列同一性を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含み、且つ
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（配列番号８１）、ＤＶＳＮＲＰＳ（配列番号８２）、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶ（配列番号８３）に対して少なくとも８０％の全配列同一性を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む。
[00150] 特定の態様では、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
[00151] さらに別の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を特徴とし：
（ａ）重鎖は、それぞれＭＹＭＭＭ（配列番号８４）、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹ（配列番号８０）に対して少なくとも８０％の全配列同一性を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含み、且つ
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＡＹＮＹＶＳ（配列番号８６）、ＤＶＳＮＲＰＳ（配列番号８２）、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶ（配列番号８３）に対して少なくとも８０％の全配列同一性を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む。
[00152] 特定の態様では、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
[00153] なおさらなる態様では、本発明による抗体又は抗体断片では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の配列と比較して、少なくともこれらのアミノ酸は、変化しておらず、以下のように下線を引くことによって強調され：
Figure 2022505925000002
さらに、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列と比較して、少なくともこれらのアミノ酸は変化しておらず、以下のように下線を引くことによって強調されている：
Figure 2022505925000003
[00154] 別の態様では、重鎖可変領域は、（ＨＣ－ＦＲ１）－（ＣＤＲＨ１）－（ＨＣ－ＦＲ２）－（ＣＤＲＨ２）－（ＨＣ－ＦＲ３）－（ＣＤＲＨ３）－（ＨＣ－ＦＲ４）として、ＣＤＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含み、且つ軽鎖可変領域は、（ＬＣ－ＦＲ１）－（ＣＤＲＬ１）－（ＬＣ－ＦＲ２）－（ＣＤＲＬ２）－（ＬＣ－ＦＲ３）－（ＣＤＲＬ３）－（ＬＣ－ＦＲ４）として、ＣＤＲ間に並置された１つ又は複数のフレームワーク配列を含む。
[00155] さらに別の態様では、フレームワーク配列は、ヒト生殖系列配列に由来する。
[00156] さらに別の態様では、１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＨＣ－ＦＲ１は、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号６１）であり；
ＨＣ－ＦＲ２は、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号６２）であり；
ＨＣ－ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号６３）であり；
ＨＣ－ＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６４）である。
[00157] なおさらなる態様では、軽鎖フレームワーク配列は、ラムダ軽鎖配列に由来する。
[00158] なおさらなる態様では、１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列は以下の通りである：
ＬＣ－ＦＲ１は、ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣ（配列番号６８）であり；
ＬＣ－ＦＲ２は、ＬＣ－ＦＲ２ ｉｓ ＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹ（配列番号６９）であり；
ＬＣ－ＦＲ３は、ＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７０）であり；
ＬＣ－ＦＲ４は、ＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号７１）である。
[00159] なおさらに具体的な態様では、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。
[00160] なおさらなる態様では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
[00161] なおさらなる実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を特徴とし：
（ａ）この重鎖配列は、重鎖配列：
Figure 2022505925000004
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、且つ
（ｂ）この軽鎖配列は、軽鎖配列：
Figure 2022505925000005
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
[00162] 特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
[00163] なおさらなる実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供し：
（ａ）この重鎖配列は、重鎖配列：
Figure 2022505925000006
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、且つ
（ｂ）この軽鎖配列は、軽鎖配列：
Figure 2022505925000007
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
[00164] 特定の態様では、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ融合タンパク質
[00165] 本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体は、当技術分野で公知の任意の抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップと組み合わせて投与することができる。抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体－ＴＧＦβ受容体ＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合タンパク質を指す。
[00166] 一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、本明細書（例えば、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」と題した上記の段落）に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。
[00167] 一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、国際公開第２０１５／１１８１７５号に記載され、ＣＡＳ登録番号１９１８１４９－０１－５が付与されたアミノ酸配列によって反映されるように、ビントラファスプαのアミノ酸配列を有するタンパク質である。ビントラファスプαは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（配列番号９１）の軽鎖と同一の軽鎖を含む。ビントラファスプαは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（配列番号９２）の重鎖から構成される、配列番号９３に対応する配列を有する融合ポリペプチドをさらに含み、重鎖のＣ末端リジン残基が、柔軟な（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカー（配列番号９７）を介して可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（配列番号９６）のＮ末端に遺伝子学的に融合されたアラニンに突然変異した。ビントラファスプαは、配列番号９４（抗ＰＤ－Ｌ１軽鎖をコードするＤＮＡ）及び配列番号９５（抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβ受容体ＩＩをコードするＤＮＡ）によってコードされる。
[00168] 一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、ビントラファスプαのアミノ酸配列を有するタンパク質であり、また、ＣＨＯ細胞で産生されるタンパク質から生じるグリコシル化形態であるビントラファスプαであり、重鎖は、Ａｓｎ－３００、Ａｓｎ－５１８、Ａｓｎ－５４２、及びＡｓｎ－６０２（即ち、配列番号９３の）でグリコシル化されている（WHO Drug Information, Vol. 32, No. 2, 2018, p. 293を参照）。
抗ＰＤ－Ｌ１の分泌ＬＣのペプチド配列
[00169]
Figure 2022505925000008
抗ＰＤＬ１の分泌Ｈ鎖のペプチド配列
[00170]
Figure 2022505925000009
抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβトラップの分泌Ｈ鎖のペプチド配列
[00171]
Figure 2022505925000010
抗ＰＤ－Ｌ１ラムダ軽鎖の翻訳開始コドンから翻訳停止コドンまでのＤＮＡ配列（ＶＬに先行するリーダー配列は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターからのシグナルペプチドである）
[00172]
Figure 2022505925000011
翻訳開始コドンから翻訳停止コドンまでのＤＮＡ配列（ｍＶＫ ＳＰリーダー：細い下線付き；ＶＨ：大文字；ＫからＡへの変異を伴うＩｇＧｌｍ３：小文字；（Ｇ４Ｓ）×４－Ｇリンカー：太字の大文字；ＴＧＦβＲＩＩ：太字の下線付き小文字；２つの停止コドン：太字の下線付き大文字）
[00173]
Figure 2022505925000012
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
[00174]
Figure 2022505925000013
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号９７）
[00175] 本発明において有用な抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子は、上記のように、配列番号９１～９６のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
[00176] いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、国際公開第２０１８／２０５９８５号に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子である。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、国際公開第２０１８／２０５９８５号の表２に列挙されている構築物の１つであり、例えば、その構築物９又は１５である。
[00177] 他の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、それぞれが国際公開第２０１８／２０５９８５号の配列番号１２に対応する軽鎖配列を有する２つのポリペプチドと、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）ｘＧ（式中、ｘは４又は５であり得る）（配列番号１１７）を介して国際公開第２０１８／２０５９８５号の配列番号１４（式中、リンカー配列の「ｘ」は４である）又は配列番号１５（式中、リンカー配列の「ｘ」は５である）に対応するＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン配列に融合された国際公開第２０１８／２０５９８５号の配列番号１１に対応する重鎖配列をそれぞれ有する２つの融合ポリペプチドとからなるヘテロ四量体である。
[00178] 特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子は、第１及び第２のポリペプチドを含む。第１のポリペプチドは：（ａ）ヒトタンパク質プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する抗体の重鎖の少なくとも１つの可変領域；及び（ｂ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）に結合することができるヒトトランスフォーミング成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）又はその断片（例えば、可溶性断片）を含む。第２のポリペプチドは、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体の軽鎖の少なくとも可変領域を含み、第１のポリペプチドの重鎖及び第２のポリペプチドの軽鎖は、組み合わせられると、ＰＤ－Ｌ１（例えば、本明細書に記載の任意の抗体又は抗体断片）に結合する抗原結合部位を形成する。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子は、抗ＰＤ－Ｌ１の２つの免疫グロブリン軽鎖と、柔軟なグリシン－セリンリンカー（例えば、（Ｇ４Ｓ）ｘＧ、式中、ｘは４又は５であり得る（配列番号１１７））を介してヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインに遺伝子学的に融合された抗ＰＤ－Ｌ１の重鎖を含む２つの重鎖とを含むヘテロ四量体である。
[00179] 配列番号１０４
切断されたヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
Figure 2022505925000014
[00180] 配列番号１０５
切断されたヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
Figure 2022505925000015
[00181] 配列番号１０６
切断されたヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
Figure 2022505925000016
[00182] 配列番号１０７
切断されたヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
Figure 2022505925000017
[00183] 配列番号１０８
突然変異したヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
Figure 2022505925000018
[00184] 配列番号１０９
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のポリペプチド配列
Figure 2022505925000019
[00185] 配列番号１１０
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のポリペプチド配列
Figure 2022505925000020
[00186] 配列番号１１１
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のポリペプチド配列
Figure 2022505925000021
[00187] 配列番号１１２
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のポリペプチド配列
Figure 2022505925000022
[00188] 配列番号１１３
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のポリペプチド配列
Figure 2022505925000023
[00189] 配列番号１１４
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のポリペプチド配列
Figure 2022505925000024
[00190] 配列番号１１５
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のポリペプチド配列
Figure 2022505925000025
[00191] 配列番号１１６
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のポリペプチド配列
Figure 2022505925000026
[00192] 本発明において有用な抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子は、上記のように、配列番号１０４～１１６のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
処置方法
[00193] 本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」、及び「処置」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の処置を意味する。これには：（ａ）疾患を阻害すること、即ち、その発症を阻止すること；及び（ｂ）疾患を緩和すること、即ち、病状を退行させることが含まれる。
[00194] 一般に、本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体又は別の治療薬の治療有効量（単独で、又は別の処置、例えば、第２の治療薬と組み合わせて）は、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。特定の実施形態では、本明細書に記載の治療有効量の抗ＴＩＭ－３抗体又は別の治療薬は、約０．１～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約７５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約７５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１～約５ｍｇ／ｋｇ、約１～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約７５ｍｇ／ｋｇ、約１～約１００ｍｇ／ｋｇ、約５～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２５ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約７５ｍｇ／ｋｇ、約５～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約７５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約７５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０～約７５ｍｇ／ｋｇ、約５０～約１００ｍｇ／ｋｇ、約７５～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。投与される量は、処置されるべき疾患又は症状の種類及び程度、患者の全体的な健康、抗体のインビボ効力、製剤、及び投与経路などの変数によって決まる。所望の血中レベル又は組織レベルを迅速に達成するために、初期投与量を上限レベルを超えて増加させることができる。別法では、初期投与量を最適量よりも少なくすることができ、処置の過程で投与量を徐々に増加させることができる。ヒト投与量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇで行うように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験で最適化することができる。
[00195] 特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体又は別の治療薬（単独で、又は別の処置、例えば、第２の治療薬と組み合わせて）は、（哺乳動物の体重に比例する、即ちｍｇ／ｋｇ投与量ではなく）一定（固定）用量として投与することができる。治療有効量の抗ＴＩＭ－３抗体は、約５ｍｇ～約３５００ｍｇの一定（固定）用量であり得る。例えば、用量は、約５～約２５０ｍｇ、約５～約５００ｍｇ、約５～約７５０ｍｇ、約５～約１０００ｍｇ、約５～約１２５０ｍｇ、約５～約１５００ｍｇ、約５～約１７５０ｍｇ、約５～約２０００ｍｇ、約５～約２２５０ｍｇ、約５～約２５００ｍｇ、約５～約２７５０ｍｇ、約５～約３０００ｍｇ、約５～約３２５０ｍｇ、約５～約３５００ｍｇ、約２５０～約５００ｍｇ、約２５０～約７５０ｍｇ、約２５０～約１０００ｍｇ、約２５０～約１２５０ｍｇ、約２５０～約１５００ｍｇ、約２５０～約１７５０ｍｇ、約２５０～約２０００ｍｇ、約２５０～約２２５０ｍｇ、約２５０～約２５００ｍｇ、約２５０～約２７５０ｍｇ、約２５０～約３０００ｍｇ、約２５０～約３２５０ｍｇ、約２５０～約３５００ｍｇ、約５００～約７５０ｍｇ、約５００～約１０００ｍｇ、約５００～約１２５０ｍｇ、約５００～約１５００ｍｇ、約５００～約１７５０ｍｇ、約５００～約２０００ｍｇ、約５００～約２２５０ｍｇ、約５００～約２５００ｍｇ、約５００～約２７５０ｍｇ、約５００～約３０００ｍｇ、約５００～約３２５０ｍｇ、約５００～約３５００ｍｇ、約７５０～約１０００ｍｇ、約７５０～約１２５０ｍｇ、約７５０～約１５００ｍｇ、約７５０～約１７５０ｍｇ、約７５０～約２０００ｍｇ、約７５０～約２２５０ｍｇ、約７５０～約２５００ｍｇ、約７５０～約２７５０ｍｇ、約７５０～約３０００ｍｇ、約７５０～約３２５０ｍｇ、約７５０～約３５００ｍｇ、約１０００～約１２５０ｍｇ、約１０００～約１５００ｍｇ、約１０００～約１７５０ｍｇ、約１０００～約２０００ｍｇ、約１０００～約２２５０ｍｇ、約１０００～約２５００ｍｇ、約１０００～約２７５０ｍｇ、約１０００～約３０００ｍｇ、約１０００～約３２５０ｍｇ、約１０００～約３５００ｍｇ、約１２５０～約１５００ｍｇ、約１２５０～約１７５０ｍｇ、約１２５０～約２０００ｍｇ、約１２５０～約２２５０ｍｇ、約１２５０～約２５００ｍｇ、約１２５０～約２７５０ｍｇ、約１２５０～約３０００ｍｇ、約１２５０～約３２５０ｍｇ、約１２５０～約３５００ｍｇ、約１５００～約１７５０ｍｇ、約１５００～約２０００ｍｇ、約１５００～約２２５０ｍｇ、約１５００～約２５００ｍｇ、約１５００～約２７５０ｍｇ、約１５００～約３０００ｍｇ、約１５００～約３２５０ｍｇ、約１５００～約３５００ｍｇ、約１７５０～約２０００ｍｇ、約１７５０～約２２５０ｍｇ、約１７５０～約２５００ｍｇ、約１７５０～約２７５０ｍｇ、約１７５０～約３０００ｍｇ、約１７５０～約３２５０ｍｇ、約１７５０～約３５００ｍｇ、約２０００～約２２５０ｍｇ、約２０００～約２５００ｍｇ、約２０００～約２７５０ｍｇ、約２０００～約３０００ｍｇ、約２０００～約３２５０ｍｇ、約２０００～約３５００ｍｇ、約２２５０～約２５００ｍｇ、約２２５０～約２７５０ｍｇ、約２２５０～約３０００ｍｇ、約２２５０～約３２５０ｍｇ、約２２５０～約３５００ｍｇ、約２５００～約２７５０ｍｇ、約２５００～約３０００ｍｇ、約２５００～約３２５０ｍｇ、約２５００～約３５００ｍｇ、約２７５０～約３０００ｍｇ、約２７５０～約３２５０ｍｇ、約２７５０～約３５００ｍｇ、約３０００～約３２５０ｍｇ、約３０００～約３５００ｍｇ、又は約３２５０～約３５００ｍｇであり得る。ヒト投与量は、例えば、５ｍｇ～３２００ｍｇの一定（固定）投与量で行うように設計された従来の第Ｉ相投与量増加試験で最適化することができる。
[00196] 投与頻度は、投与経路、投与量、抗体の血清半減期、及び処置される疾患などの因子に応じて異なり得る。例示的な投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、及び４週間に１回である。いくつかの実施形態では、投与は、２週間に１回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。モノクローナル抗体ベースの薬物の製剤化は、当業者の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、抗体は、投与時に凍結乾燥され、次いで、緩衝生理食塩水中で再構成される。
[00197] 治療的使用のために、抗体は、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わせられる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、合理的なリスク・ベネフィット比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題や合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した緩衝液、担体、及び賦形剤を意味する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合性があり、レシピエントに有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。医薬的に許容される担体には、医薬投与と適合性のある緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤、及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当分野で公知である。
[00198] 本明細書に開示されるような抗体を含む医薬組成物は、単位剤形で提示することができ、任意の適切な方法によって調製することができる。医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化するべきである。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）投与、皮内投与、吸入投与、経皮投与、局所投与、経粘膜、及び直腸投与である。モノクローナル抗体の好ましい投与経路はＩＶ注入である。有用な製剤は、製薬分野で周知の方法によって調製することができる。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。非経口投与に適した製剤成分には、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩；及び張性を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースが含まれる。
[00199] 静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォアＥＬＴＭ（BASF, Parsippany, NJ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、製造及び保管の条件下で安定している必要があり、微生物に対して保護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。
[00200] 医薬製剤は、好ましくは無菌である。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、フィルター滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に行うことができる。
[00201] 癌を処置する方法又は哺乳動物の腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、又は注射器に含めることができる。特定の実施形態では、バッグは、チューブ及び／又は針を含むチャネルに接続することができる。特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤又は液体製剤であり得る。特定の実施形態では、製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）させて含めることができる。特定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇのフリーズドライ製剤は、１つのバイアルに含めることができる。特定の実施形態では、製剤は、本明細書に記載の抗ＴＩＭ－３抗体を含み、約２５０ｍｇ／バイアル～約２０００ｍｇ／バイアルとして保存されるタンパク質製品の液体製剤であり得る。
液体製剤
[00202] 本開示は、癌を処置する又は哺乳類の腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための製剤を形成する緩衝液中に治療有効量の本開示のタンパク質（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）を含む水性液体製剤を提供する。
[00203] 哺乳動物において癌を処置する又は腫瘍増殖を阻害する方法で使用するためのこれらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよいし、又は滅菌濾過してもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装してもよいし、又は凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１であり、より好ましくは５～９又は６～８であり、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５である。得られた固形の組成物は、それぞれ固定量の１つ又は複数の上記の薬剤を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固形の組成物はまた、量を変更可能にするために容器に包装することができる。
[00204] 特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物において癌を処置する又は腫瘍増殖を阻害する方法に使用するために、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせられる本開示のタンパク質（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）を含む保存期間が延長された製剤を提供する。
[00205] 特定の実施形態では、哺乳動物において癌を処置する又は腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための水性製剤は、ｐＨ緩衝液中に本開示のタンパク質（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）を含めて調製される。本発明の緩衝液は、約４～約８の範囲のｐＨ、例えば、約４～約８、約４．５～約８、約５～約８、約５．５～約８、約６～約８、約６．５～約８、約７～約８、約７．５～約８、約４～約７．５、約４．５～約７．５、約５～約７．５、約５．５～約７．５、約６～約７．５、約６．５～約７．５、約４～約７、約４．５～約７、約５～約７、約５．５～約７、約６～約７、約４～約６．５、約４．５～約６．５、約５～約６．５、約５．５～約６．５、約４～約６．０、約４．５～約６．０、約５～約６、若しくは約４．８～約５．５のｐＨを有し得る、又は約５．０～約５．２のｐＨを有し得る。上記のｐＨの中間の範囲もまた、本開示の一部であることを意図している。例えば、上記の値のいずれかの組み合わせを上限及び／又は下限として使用する値の範囲が含まれることも意図している。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸塩ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝液が含まれる。
[00206] 特定の実施形態では、哺乳動物において癌を処置する又は腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための製剤は、ｐＨを約４～約８の範囲に維持するためのクエン酸塩及びリン酸塩を含む緩衝系を含む。特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５～約６．０、又は約ｐＨ４．８～約５．５、又は約５．０～約５．２のｐＨ範囲であり得る。特定の実施形態では、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／又はリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍＬ（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）のクエン酸、約０．３ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）のクエン酸ナトリウム、約１．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）のリン酸二ナトリウム二水和物、約０．９ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．８６ｍｇ／ｍＬ）のリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び約６．２ｍｇ／ｍＬ（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）の塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、緩衝系は、約１～１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、約０．２５～約０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、約１．２５～約１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、約０．７～約１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０～６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
[00207] 等張剤として作用し、抗体を安定化させることができるポリオールも製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性によって異なり得る量で製剤に添加される。特定の実施形態では、水性製剤は等張性であり得る。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に対して変化し得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較してより少量の単糖（例えば、マンニトール）を添加することができる。特定の実施形態では、等張化剤として製剤で使用することができるポリオールはマンニトールである。特定の実施形態では、マンニトール濃度は、約５～約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５～約１５ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０～約１４ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めることができる。
[00208] 洗剤又は界面活性剤もまた、製剤に添加することができる。例示的な洗剤には、非イオン性洗剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）が含まれる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減し、及び／又は製剤中の粒子の形成を最小限にし、及び／又は吸着を低減するような量である。特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。特定の実施形態では、製剤は、洗剤ポリソルベート８０又はTween 80を含み得る。Tween 80は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを説明するために使用される用語である（Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996を参照）。特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ又は約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含み得る。特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０を製剤に添加することができる。
[00209] 凝集に加えて、アミド分解は、発酵、採取／細胞の浄化、精製、原薬／医薬品の貯蔵中、及び試料分析中に起こり得るペプチド及びタンパク質の一般的な産物の変異である。アミド分解は、加水分解を受け得る中間体スクシンイミドを形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドが１７単位質量減少する。その後の加水分解により、１８単位質量増加する。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下では不安定であるため困難である。そのため、アミド分解は、典型的には、質量が１単位増加すると検出可能である。アスパラギンのアミド分解により、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸のいずれかが生じる。アミド分解の速度に影響を与えるパラメーターには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチドコンフォメーション、及び三次構造が含まれる。ペプチド鎖のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、アミド分解率に影響を与える。タンパク質配列のＡｓｎに続くＧｌｙ及びＳｅｒは、アミド分解に対して感受性が高くなる。
[00210] 特定の実施形態では、本開示の哺乳動物において癌を処置する又は腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための液体製剤は、タンパク質製品のアミド分解を防止するためのｐＨ及び湿度の条件下で保存することができる。
[00211] 本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に対して安全且つ無毒である）、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液、又はデキストロース溶液が含まれる。
[00212] 細菌作用を低減するために、防腐剤を本明細書の製剤に任意選択により添加することができる。防腐剤の添加は、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
[00213] 静脈内投与（ＩＶ）製剤は、特定の場合、例えば、患者が移植後にＩＶ経路を介してすべての薬物が投与されて入院している場合に、好ましい投与経路であり得る。特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈される。特定の実施形態では、注射用の希釈された製剤は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。
[00214] 特定の実施形態では、塩又は緩衝液成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加することができる。塩及び／又は緩衝液は、薬学的に許容され、「塩基形成」金属又はアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）から誘導される。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であり得、その場合、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はアンモニウムイオンは、対イオンとして役立ち得る。
[00215] 一実施形態では、液体製剤は、１０ｍｇ／ｍＬのＭ６９０３、８％（ｗ／ｖ）のトレハロース、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、及び０．０５％のポリソルベート２０、ｐＨ５．５を含む。静脈内注入によるＭ６９０３の投与の前に、溶液は、０．９％の滅菌塩化ナトリウムで希釈される。
凍結乾燥製剤
[00216] 本開示の哺乳動物において癌を処置する方法又は腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための凍結乾燥製剤は、抗ＴＩＭ－３抗体分子及び凍結保護剤を含む。凍結保護剤は、糖、例えば、二糖であり得る。特定の実施形態では、凍結保護剤は、スクロース又はマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、及び／又は防腐剤のうちの１つ又は複数を含み得る。
[00217] 凍結乾燥製剤の安定化に有用なスクロース又はマルトースの量は少なくとも１：２のタンパク質対スクロース又はマルトースの重量比であり得る。特定の実施形態では、タンパク質対スクロース又はマルトースの重量比は、１：２～１：５であり得る。
[00218] 特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／又は塩基の添加によって設定することができる。特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。
[00219] 凍結乾燥の前に、本開示のタンパク質を含む溶液のｐＨは、約６～約８の間で調整することができる。特定の実施形態では、凍結乾燥製剤のｐＨ範囲は約７～約８であり得る。
[00220] 特定の実施形態では、塩又は緩衝液成分は、約１０ｍＭ～約２００ｍＭの量で添加することができる。塩及び／又は緩衝液は、薬学的に許容され、「塩基形成」金属又はアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）から誘導される。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であり得、その場合、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はアンモニウムイオンは、対イオンとして役立ち得る。
[00221] 特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する化合物である（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの生成を容易にする）。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含み得る。
[00222] 細菌作用を低減するために、防腐剤を本明細書の製剤に任意選択により添加することができる。防腐剤の添加は、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
[00223] 特定の実施形態では、哺乳動物における癌を処置する又は腫瘍増殖を阻害する方法で使用するための凍結乾燥製剤は水性担体で構成することができる。本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に対して安全且つ無毒である）、凍結乾燥後の液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液、又はデキストロース溶液が含まれる。
[00224] 特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）、又は０．９％の塩化ナトリウム注射、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成中に、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
[00225] 特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、注射用の約４．５ｍＬの水で再構成され、０．９％の生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
[00226] 本発明の実施は、例示のみを目的として本明細書に提示されている前述の例からより完全に理解され、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
実施例１－抗ＴＩＭ－３抗体の作製及び特性評価
１．１ ヒト及びカニクイザルＴＩＭ－３を発現する一過性で安定した細胞株の作製
[00227] 当技術分野で標準的な方法を使用して、膜固定ＴＩＭ－３を発現する細胞株を作製した。簡単に説明すると、ｈｕＴＩＭ－３－Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２９３Ｆ－ｈＴＩＭ－３とも呼ばれる）又はｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２９３Ｆ－ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３とも呼ばれる）を作製するために、ヒトＴＩＭ－３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿１１６１７１（配列番号４１）に基づく）又はｃｙｎｏ ＴＩＭ－３（ＮＣＢＩ参照番号ＸＰ＿００５５５８４３８（配列番号４２）に基づく）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ、デノボ遺伝子合成によって得、これを発現ベクターに導入し、それぞれのＤＮＡを、Expifectamine（ThermoFischer）を使用してＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。空のベクターを対照として使用した。３日後、ヒトＴＩＭ－３又はｃｙｎｏ ＴＩＭ－３細胞表面発現を、ＦＡＣＳ（ヒトＴＩＭ－３の場合：抗ヒトＴＩＭ－３抗体（R&D Systems cat# FAB2365P）及びラットＩｇＧ２対照－ＰＥ（R&D Systems cat# IC006P）；ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３の場合：抗ヒトＴＩＭ－３抗体（Biolegend, cat# 345010）及びマウスＩｇＧ１対照（Sigma, cat# M9269））によって評価し、細胞バンクを作成した。解凍した細胞は、ヒト又はｃｙｎｏ ＴＩＭ－３表面発現の低下を示さなかった（データは示されていない）。
[00228] ｈｕＴＩＭ－３－ＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３とも呼ばれる）を作製するために、ＣＨＯ－Ｓ細胞を、Nucleofector II Device（Amaxa Biosystems）を使用して、上記と同じベクターでトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢで選択した。ミニプールを、ＦＡＣＳを使用してヒトＴＩＭ－３の細胞表面発現についてスクリーニングした。最良のミニプールの単一細胞をＦＡＣＳで選別し、増殖させ、ヒトＴＩＭ－３の発現が最も高いクローンを選択した（データは示されていない）。
[00229] 組換え可溶性ＴＩＭ－３を発現する細胞株を作製するために、配列番号４２に対応するＮＣＢＩ参照番号ＸＰ＿００５５５８４３８に基づくカニクイザル（「ｃｙｎｏ」）ＴＩＭ－３のＥＣＤをコードするｃＤＮＡをデノボ遺伝子合成によって得、マウスＦｃ又は６－ＨｉｓタグのいずれかをコードするＤＮＡに融合し、ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－ｍｕＦｃ及びｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６構築物を含む発現ベクターを、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製した。一過性発現のためにＰＥＩを使用してＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
１．２ タンパク質試薬
[00230] ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３ ＥＣＤタンパク質を、プロテインＡ親和性（ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－ｍｕＦｃ）又はニッケルキレート親和性カラム及びイミダゾールでの溶出（ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６）のいずれかによって細胞上清から精製した。ＱＣ分析：還元及び非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥ、純度及び見かけのＭＷの決定のためのＳＥＣ、濃度決定のためのＵＶ分光法、及びエンドトキシン汚染の測定のためのLimulus Amebocyte Lysateアッセイを精製タンパク質に対して行った。
[00231] ６－Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＭ－３ ＥＣＤ（ｈｕ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６）をNovoprotein（C at# C356、配列番号４３）から購入し、ヒトＦｃ－６Ｈｉｓに融合したヒトＴＩＭ－３ ＥＣＤ（ｈｕ ＴＩＭ－３－ＦｃＨｉｓ６）をNovoprotein（C at# CD71、配列番号４４）から購入し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合したヒトＴＩＭ－３ＥＣＤ（ｈｕＴＩＭ－３－Ｆｃ）をR&D Systems（# 2365-TM）から購入し、６－Ｈｉｓタグ付きマーモセットＴＩＭ－３ ＥＣＤ（マーモセットＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６）をNovoprotein（Cat # CM64、配列番号４５）から購入し、ヒトＦｃに融合したマウスＴＩＭ－３ ＥＣＤ（マウスＴＩＭ－３－Ｆｃ）を、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ ５９９０１１（配列番号４６）に基づいてR&D Systems（#1523-TM）から購入し、６－Ｈｉｓタグ付きのヒトＴＩＭ－１ ＥＣＤ（ｈｕＴＩＭ－１－Ｈｉｓ６、#1750-TM）及び６－Ｈｉｓタグ付きのヒトＴＩＭ－４ ＥＣＤ（ｈｕＴＩＭ－４－Ｈｉｓ６；#2929-TM）をR&DSystemsから購入した。
１．３ 動物
[00232] 抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子：ヒト軽鎖（ＶＬＣＬ又はＶＫＣＫ）及びヒトＶＨを発現すると共にラットの重鎖定常領域も発現するトランスジェニックラット（Open Monoclonal Technologies, Inc./Ligand Pharmaceutical Inc.からライセンス供与されたOmniRats（商標））を使用して作製した（Geurts et al. (2009) Science 325(5939):433, Menoret et al. 2010, Ma et al. 2013, Osborn et al. 2013）。
１．４ Ｂ細胞クローニングからの抗ＴＩＭ－３抗体の作製
[00233] ＴＩＭ－３に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、OmniRats（商標）をｈｕ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６（Novoprotein, cat# C356）で免疫した。一般的な免疫スキームを、複数の部位での標準的な免疫又は反復免疫（ＲＩＭＭＳとも呼ばれる）のいずれかに使用した。８～１２週齢のラットを、ｈｕ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６を用いて隔週で４回免疫し、血清免疫応答をｈｕＴＩＭ－３－Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対するＦＡＣＳによってモニタリングした。簡単に説明すると、細胞を血清の希釈液と共に４℃で２０分間インキュベートし、遠心分離し、洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ１（Bethyl #A110-106F）とＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ（Bethyl #A110-111F）の混合物と共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、７－ＡＡＤ色素（BD Biosciences）に再懸濁して、瀕死の細胞又は死細胞を標識し、Guavaリーダー（Millipore Sigma）を使用して分析した。
[00234] 単一Ｂ細胞の選別を、高い血清免疫応答を有するラットから収集したリンパ球から行った。簡単に説明すると、細胞を抗ラットＣＤ３２（クローンＤ３４－４８５、BD Biosciences）と５分間インキュベートした後、ｈｕ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６と４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合マウス抗ラットＩｇＭ（クローンＭＡＲＭ－４、ThermoFisher）、ＰＥ－Ｃｙ７結合マウス抗ラットＣＤ４５Ｒ（クローンＨＩＳ ２４、eBioscience）、及びＡＰＣ結合マウス抗Ｈｉｓ（クローンＡＤ１．１．１０Ｒ、R&D）抗体の混合物と共に４℃で３０分間インキュベートした。単一ＴＩＭ－３陽性Ｂ細胞を、BD FACS Aria IIIフローサイトメーターで４μＬの溶解緩衝液（０．１Ｍ ＤＴＴ、４０ Ｕ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ阻害剤、Invitrogen, Cat# 10777-019）を含む９６ウェルプレートの各ウェルに選別した。プレートをMicroseal ‘F’ Film（BioRad）で密封し、ドライアイスで急速凍結してから－８０℃で保存した。
[00235] 選別した単一Ｂ細胞からのＩｇ可変（Ｖ）領域遺伝子クローニングを、公開された参考文献（Tiller et al., 2008, J Imm Methods 329）から修正されたプロトコルを用いて行った。簡単に説明すると、選別された単一Ｂ細胞からの全ＲＮＡを、製造プロトコルに従って、１５０ｎｇの最終量／濃度のランダムヘキサマープライマー（pd(N)6, Applied Biosystems, P/N N808-0127）及び50U Superscript III逆転写酵素（Invitrogen, Cat# 18080-044）を使用して、ヌクレアーゼフリー水（Invitrogen, Cat# AM9935）を含む元の９６ウェル選別プレートの最終容量１４μｌ／ウェルで逆転写した。プライマーは、以前の出版物に基づいて修正し（Max et al., 1981;Weiss and Wu, 1987; Sanchez et al., 1990; Solin and Kaartinen, 1992; Kantor et al., 1997a; Thiebe et al., 1999;Wang et al., 2000; Brekke and Garrard, 2004; Ye, 2004; Ehlers et al., 2006; Johnston et al., 2006; Casellas et al., 2007）、及び／又はＩＭＧＴ（登録商標）、国際的なImMuno- GeneTics information system（登録商標）（website www.imgt.org; (Lefranc et al., 2009)を参照）から公開されたＩｇ遺伝子セグメントヌクレオチド配列及びＮＣＢＩ（website www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/を参照）データベースを調べることによって設計した。ヒトＩｇｈ、Ｉｇｋ、及びＩｇｌ Ｖ遺伝子転写産物を、鋳型として３．５μｌのｃＤＮＡから開始する２回のネスト化（Ｉｇｈ、Ｉｇｋ、及びＩｇｌ）ＰＣＲによって個別に増幅した。すべてのＰＣＲ反応は、製造プロトコルに従って、AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelityキット（Invitrogen, Cat# 12346-094）を使用して、ウェル当たり４０μｌの総量の９６ウェルプレートで行った。１回目のＰＣＲを、９５℃で２分間、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間、最後に７２℃で５分間のインキュベーションを４０サイクル行った。
[00236] ２回目のネスト化ＰＣＲを、５μｌの未精製の１回目のＰＣＲ産物を用いて、９５℃で２分間、続いて９４℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、７２℃で４５秒間、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間、最後に７２℃で５分間のインキュベートを５サイクル行った。ＰＣＲ産物を、Ｉｇ発現及び機能的スクリーニングのためのＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。
[00237] 合計３５２個のＴＩＭ－３陽性Ｂ細胞を選別し、スクリーニングのためにＩｇ ＶをＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。対になったＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子の両方で７４のユニークなクローンを単離した。７４のクローンが、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーアッセイによってヒトＴＩＭ－３結合剤として確認され、これらのクローンのうちの１０がｃｙｎｏ交差反応性細胞結合剤として確認された。
１．５ 抗体の発現及び精製
[00238] 抗体の重鎖及び軽鎖を別々にｐＴＴ５ベクターにサブクローニングし、ExpiFectamineトランスフェクション試薬を使用したトランスフェクション後にExpi293F細胞で一過性に共発現させた。細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で３７℃で振とうしながら７日間インキュベートした。馴化培地を回収し、遠心分離して細胞デブリを除去した。抗体を、標準的な方法を使用するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。精製されたタンパク質の質を、還元及び非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって評価し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して純度及び見かけのＭＷを決定し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。
１．６ ＥＬＩＳＡによるヒト、ｃｙｎｏ、マウスＴＩＭ－３、ヒトＴＩＭ－１、及びヒトＴＩＭ－４への結合
[00239] 抗体の（ファミリーメンバーＴＩＭ－１及びＴＩＭ－４に対する）ＴＩＭ－３への結合、種間反応性、及び選択性をさらに確認するために、７４個の精製された抗体クローンをＥＬＩＳＡによって試験した。簡単に説明すると、３８４ウェルプレートを、ｈｕＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６、ｃｙｎｏＴＩＭ－３－ｍｕＦｃ、又はｃｙｎｏＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６、マウスＴＩＭ－３－Ｆｃ、ｈｕＴＩＭ－１－Ｈｉｓ６、及びｈｕＴＩＭ－４－Ｈｉｓ６で一晩コーティングした。３％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、１又は０．１μｇ／ｍｌの抗ＴＩＭ－３抗体を室温で１時間インキュベートした。洗浄ステップの後、結合した抗体をペルオキシダーゼａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的（Jackson ImmunoResearch Laboratories #109-036-097）と共に室温で１時間インキュベートし、ＴＭＢ ＨＲＰ基質溶液（BioFx Lab # TMBW-1000-01）を使用して検出を行った。すべての精製抗体クローンは、ヒトＴＩＭ－３に結合することが確認され、そのうちの１０個はｃｙｎｏ ＴＩＭ－３に強く結合し、マウスＴＩＭ－３、ヒトＴＩＭ－１、又はヒトＴＩＭ－４に結合する抗体クローンはなかった（データは示されていない）。
１．７ 抗ＴＩＭ－３抗体の細胞ベースの結合アッセイ
[00240] ７４個の精製された抗ＴＩＭ－３抗体クローンの細胞株への結合をフローサイトメトリーによって評価した。簡単に説明すると、約１×１０５のＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞、親ＣＨＯ－Ｓ細胞、２９３Ｆ－ｃｙｎｏＴＩＭ－３細胞、及び親Ｅｘｐｉ２９３Ｆを、抗ＴＩＭ－３抗体（１０μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）を含むフローサイトメトリー緩衝液（１％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories#109-096-098）を含むフローサイトメトリー緩衝液に氷上で３０分間再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、７－ＡＡＤ及び１％中性緩衝ホルマリンを含むフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁した。Guava EasyCyte機器（MilliporeSigma)で分析を行った。ゲート単一生細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各抗体濃度で計算した。合計６２個の抗体クローンが、１０及び１μｇ／ｍｌの両方でＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞に特異的に結合し、１２個の抗体クローンが、１０及び１μｇ／ｍｌの両方で２９３Ｆ－ｃｙｎｏＴＩＭ－３細胞に特異的に結合した（データは示されていない）。ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースの結合アッセイデータに基づいて、１０個の抗ＴＩＭ－３抗体クローンをさらなる試験及び分析のために選択した。
１．８ 選択された抗ＴＩＭ３抗体クローンのフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡによるＥＣ５０測定
[00241] 選択された抗ＴＩＭ－３抗体クローンを、それらのＥＣ５０値を計算して順位付けするために、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡによってさらに試験した。フローサイトメトリーの場合、抗体は、ヒト及びｃｙｎｏ ＴＩＭ－３を発現する細胞に対して６００ｎＭで開始する抗体の段階希釈を使用して、実施例１．７に記載のプロトコルを用いて試験した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を抗体濃度に対してプロットし、GraphPad Prismを使用してＥＣ５０を計算した。結果は表１にまとめている。
[00242] ＥＬＩＳＡの場合、抗体は、実施例１．６に記載のプロトコルに従って、２０ｎＭで開始する段階希釈を使用して、ｈｕＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６、ｃｙｎｏＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６、及びｃｙｎｏＴＩＭ－３－ｍｕＦｃへの結合を試験した。光学密度を抗体濃度に対してプロットし、GraphPad Prismを使用してＥＣ５０を計算した。結果は表１にまとめている。
[00243] 選択されたクローンについての表１のデータは、抗体クローンに応じて、ＥＣ５０が約１ｎＭのＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞、及び２ｎＭ～１８３ｎＭのＥＣ５０を有する２９３Ｆ－ｃｙｎｏＴＩＭ－３細胞への細胞結合を示す。これらの抗体クローンは、ＥＬＩＳＡによって、ＥＣ５０が約０．０１ｎＭの組換えヒトＴＩＭ－３と、ＥＣ５０が０．０１～１ｎＭの組換えｃｙｎｏ ＴＩＭ－３に結合した。
１．９ 選択された抗ＴＩＭ－３抗体の速度定数の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による決定
[00244] 選択された抗ＴＩＭ－３抗体のヒトＴＩＭ－３及びｃｙｎｏ ＴＩＭ－３に対する結合親和性は、以下のようにGE Healthcare Biacore 4000機器を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。最初に、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories # 109-005-098）を、製造業者が説明した手順に従って、遊離アミノ基への直接結合を使用してBIAcoreカルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップに固定した。次いで、抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに捕捉して、約２００反応単位（ＲＵ）を達成した。結合測定は、電気泳動用ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を使用して行った。１００ｎＭのＨｉｓタグ付きＴＩＭ－３タンパク質、ｈｕＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６、及びｃｙｎｏＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６から開始する２倍希釈系列を、２５℃、３０μｌ／分の流速で注入した。結合速度（kon, M-1s-1）及び解離速度（koff, s-1）を、単純な１：１ラングミュア結合モデル（Biacore 4000 Evaluation Software）を使用して計算した。平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）を、koff／konの比率として計算した。ｈｕＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６に結合するために選択されたクローンの親和性は３．５～９．２ｎＭであった（表１）。いくつかの選択されたクローンは、１２～９９ｎＭのｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６への結合に親和性を有していた（表１）。試験したｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６の濃度範囲内（１００ｎＭ以下）では、いくつかのクローンは、検出可能又は決定可能な特異的結合の反応速度曲線がなく（表１のＮＢ）、これらの条件下でｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６への結合が弱いか存在しないことを示している。表１に示されているすべての選択されたクローンは、ＥＬＩＳＡ又は細胞結合フローサイトメトリー条件下でｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６にある程度結合したことに留意されたい。
１．１０ ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３標的細胞を用いたＡＤＣＣ
[00245] 選択されたクローンを、クロム放出アッセイを使用して、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３標的細胞及びアロタイプＶ／Ｆを有するドナーエフェクター細胞を用いてＡＤＣＣ活性についても試験した。
[00246] 簡単に説明すると、ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞は、最初に５１Ｃｒで４５分間標識し、次いで３３ｎＭの開始濃度で抗ＴＩＭ－３抗体の５倍段階希釈液と共に３７℃で１５分間インキュベートした。エフェクター細胞を、１：１００の比率で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞を、Lumaplate96ウェルドライプレートに一晩移し、ガンマカウンターを使用して放射能を測定した。溶解率を、（（Count－Spont）／（１００％Lysis－Spont））×１００の比率として計算し、式中、Spontは、ＣＨＯ－Ｓ－ ｈＴＩＭ３細胞のみ（抗体及びエフェクター細胞が存在しない）でカウントされた放射能であり、ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞を洗剤で溶解することによって１００％の溶解を計算した。アッセイは、アロタイプＶ／Ｆの２人のドナーで行った。選択されたすべての抗体クローンは、約０．１～０．３ｎＭの範囲のＥＣ５０でＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３標的細胞のＡＤＣＣを誘導した（表１）。
Figure 2022505925000027
実施例２－抗Ｔｉｍ－３抗体３９０３Ｅ１１の最適化
２．１ 重鎖及び軽鎖可変領域変異体
[00247] ３９０３Ｅ１１重鎖の可変領域（３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．０）；配列番号３４）及び３９０３Ｅ１１軽鎖の可変領域（３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．０；配列番号３３）のアミノ酸配列を、重鎖及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域とＣＤＲ配列の両方を変更することによって別々に改変した。これらの配列変更の目的は、Ａｓｐの異性化、Ａｓｎのアミド分解、及びＭｅｔの酸化を防止することによって分子の製造可能性を改善するため、又はコンピュータで同定されたヒトＴ細胞エピトープの抗体を枯渇させ、それによってヒトの免疫原性を低下又は無効にするために、フレームワークアミノ酸残基を、その位置に見られる最も相同なヒト生殖系列残基に突然変異させることであった。
[00248] ３つの重鎖可変領域変異体３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．１）（配列番号５３）、３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．２）（配列番号２４）、及び３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．３）（配列番号５５）を、ヒトＩｇＧ１重鎖アイソタイプ骨格上に構築し、それぞれ重鎖変異体３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．１）－ｇ１（配列番号１６）、３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．２）－ｇ１（配列番号１８）、及び３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．３）－ｇ１（配列番号２０）を得た。以下の変異を導入した（ＩＭＧＴ付番規定によると；下線が引かれている残基は、ＣＤＲの１つに位置するか、その境界にある）：
Figure 2022505925000028
[00249] ３つの軽鎖可変領域変異体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．１）（配列番号５２）、３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．２）（配列番号５４）、及び３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３）（配列番号２３）を、ヒトラムダ鎖バックグラウンド上に構築し、それぞれ軽鎖変異体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．１）－ＣＬ（配列番号１５）、３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．２）－ＣＬ（配列番号１７）、及び３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３）－ＣＬ（配列番号１９）を得た。以下の変異を導入した（ＩＭＧＴ付番規定による）：
３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．１）：Ｓ１Ｑ、Ｙ２Ｓ、Ｅ３Ａ
３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．２）：Ｆ５５Ｙ
３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３）：Ｓ１Ｑ、Ｙ２Ｓ、Ｅ３Ａ、Ｆ５５Ｙ
[00250] 親及び変異体の重鎖及び軽鎖を、すべての可能な対の組み合わせで組み合わせて、さらなる完全ヒト抗ＴＩＭ－３抗体を作製した。最適化された候補を、ＴＩＭ－３への結合活性（ＦＡＣＳ及びＳＰＲによる）及びＦＲ位置で最も相同なヒト生殖細胞系残基との類似性に基づいて選択した。最適化されたすべての抗体は機能的であり、ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞並びに組換えヒト及びｃｙｎｏ ＴＩＭ－３タンパク質への結合を保持していた（表２を参照）。親３９０３Ｅ１１重鎖と比較して、３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．２）ＩｇＧ１との組み合わせにより、ＣＨＯ－Ｓ－ｈＴＩＭ３細胞への結合が増加し、組換えｈｕＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６とｃｙｎｏ ＴＩＭ－３－Ｈｉｓ６の両方に対する生得的親和性（ＫＤ）が増加した抗体が得られた（表２を参照）。さらに、軽鎖変異体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３）ＣＬは、他の軽鎖変異体よりも最も相同な生殖細胞系列配列に類似していた。従って、重鎖可変領域変異体３９０３Ｅ１１（ＶＨ１．２）及び軽鎖可変領域変異体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３）を含む抗体を、リード抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）ＩｇＧ１としてのさらなる特性評価のために選択した。
Figure 2022505925000029
実施例３－抗体の生産及び特性評価
３．１ 生物生産、清澄化、及び精製
[00251] 抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）をＣＨＯ－Ｓ細胞から産生させた。細胞を、３７℃でグルコースを添加したＣＨＯ流加培養増殖培地で増殖させた。接種の３日後、５日後、７日後、及び１０日後に培養物に飼料成分の混合物を与えた。
[00252] バイオリアクターの運転による粗馴化培地を、2.2 m2 Millistak+Pod D0HC（Millipore MD0HC10FS1）及び1.1 m2 Millistak+Pod X0HC（Millipore#MX0HC01FS1）フィルターを使用して清澄化し、続いてMillipore Opticap XL3 0.5/0.2 μmフィルター（Millipore #KHGES03HH3）で最終的な濾過を行った。
[00253] 次いで、抗体を標準的な方法を使用して精製し、０．０５％のTween 20を用いて１０ｍＭのヒスチジン、８％のトレハロース、ｐＨ５．５に製剤化した。
３．２ 配列最適化抗ＴＩＭ３抗体３９０３（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）の結合親和性
[00254] 非限定的な例として、抗ＴＩＭ３抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）についてさらなる特性評価を行った。抗体３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）を、実施例１．６及び１．８に記載されるＥＬＩＳＡプロトコルに従って、ｈｕＴＩＭ３－Ｈｉｓ６、ｃｙｎｏＴＩＭ３－Ｈｉｓ６、及びマーモセットＴＩＭ３－Ｈｉｓ６タンパク質への結合について試験した。３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）は、ＥＬＩＳＡによると、ヒト、ｃｙｎｏ、及びマーモセットＴＩＭ３－Ｈｉｓタンパク質に対して同様の結合を有していた（図１及び表３）。
[00255] ３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）抗体も、フローサイトメトリーによってＣＨＯ－ｈＴＩＭ－３細胞への細胞結合について試験し、ヒト、ｃｙｎｏ、及びマーモセットＴＩＭ－３への結合親和性を、ＳＰＲ（実施例１．８及び１．９に記載されるプロトコル）によって決定した。ＣＨＯ－ｈＴＩＭ－３細胞への結合のＥＣ５０は２．６ｎＭであり、ＳＰＲによって決定された平衡解離定数（ＫＤ）親和性は、２．４ｎＭ（ヒトＴＩＭ３－Ｈｉｓ６）、１４ｎＭ（ｃｙｎｏＴＩＭ３－Ｈｉｓ６）、及び１１ｎＭ（マーモセットＴＩＭ３－Ｈｉｓ６）であった）（表３）。
Figure 2022505925000030
３．３． ３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）はｈｕＴＩＭ－３とガレクチン－９との相互作用を効率的に遮断した
[00256] ３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）抗体を、ＴＩＭ－３とガレクチン－９との間の結合相互作用の阻害についてさらに試験した。競合ＥＬＩＳＡを使用して、ＴＩＭ－３へのガレクチン－９の結合に対する抗ＴＩＭ－３抗体の効果を試験した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートを、組換えヒトガレクチン－９タンパク質（R&D Systems#2045-GA）で一晩コーティングし、次いで洗浄し、そして３％のウシ血清アルブミンでブロックした。ＨｕＴＩＭ－３Ｆｃを、Sulfo-NHS-LC-Biotin標識キット（ThermoFisher Scientific # 21327）でビオチン化した。ヒト－ＴＩＭ３－ビオチン（１μｇ／ｍｌ）を、１３３ｎＭから開始する段階希釈で３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）抗体又はアイソタイプ対照抗体と混合し、室温で１時間インキュベートし、次いで抗体／ヒト－ＴＩＭ３－ビオチン混合物をヒトガレクチン－９でコーティングしたプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したヒト－ＴＩＭ－３－ビオチンを、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch Laboratories # 016-030-084）との室温で１時間のインキュベーションによって検出し、ＴＭＢ ＨＲＰ基質溶液（BioFx Lab # TMBW-1000-01）を使用して発色させた。GraphPad Prismを使用してデータをプロットし、ＩＣ５０値を計算した。アイソタイプ対照抗体は、ｈｕＴＩＭ－３のヒトガレクチン－９への結合に影響を与えなかったが、３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）抗体は、２．４ｎＭのＩＣ５０で、ヒトガレクチン－９とｈｕＴＩＭ－３との間の結合の用量依存的遮断をもたらした（図２Ａを参照）。
[00257] 実験は、他の抗ＴＩＭ－３抗体（ＡＢＴＩＭ３－ｈ０３及びＡＢ ＴＩＭ３－ｈ１１、ＡＢＴＩＭ３－ｍＡＢ１５、及びＡＢＴＩＭ３ ２７．１２Ｅ１）を用いて繰り返し、結果は図２Ｂにまとめた。ＡＢＴＩＭ３－ｍＡＢ １５を除いて、３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）抗体のみが、ｈｕＴＩＭ－３へのガレクチン－９の結合を強力にブロックした。
３．４ Ｍ６９０３抗体の構築
[00258] エフェクター陰性アイソタイプ抗体を、ヒトＩｇＧ１アイソタイプと比較して、ＦｃγＲに結合しないが、それでもＦｃＲｎに正常に結合するように設計した。この抗体は、「抗ＴＩＭ－３－３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）－ＩｇＧ２ｈ（ＦＮ－ＡＱ、３２２Ａ）－ｄｅｌＫ」抗体と呼ばれ、またＭ６９０３とも呼ばれ、ラムダ軽鎖及びエンジニアリングされたＩｇＧ２アイソタイプを有する。重鎖ＣＨ２領域には、エフェクター機能を無効にするように設計された２つのアミノ酸置換：重鎖Ｎ－グリコシル化を排除し、それによってＦｃγＲ結合親和性及びＡＤＣＣを低下させるＮ２９７Ｑ（Kabat EUインデックス）、並びにＣ１ｑ結合を排除してＣＤＣを無効にするＫ３２２Ａ（Kabat EUインデックス）が含まれる。潜在的な免疫原性を低下させるために、Ｆ２９６Ａ突然変異（Kabat EUインデックス）も導入した。加えて、タンパク質の安定性を向上させるために、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を、Ｃ２２０Ｓ置換（Kabat EUインデックス）でヒトＩｇＧ１ヒンジに置き換え、Ｃ末端重鎖リジンを除去して不均一性を低減した（「ＩｇＧ２ｈ（ＦＮ－ＡＱ、３２２Ａ）－ｄｅｌＫ」）。Ｍ６９０３は、ＩｇＧ２ｈ（ＦＮ－ＡＱ、３２２Ａ）－ｄｅｌＫバックグラウンドに可変軽鎖ＶＬ１．３及び可変重鎖ＶＨ１．２（実施例２．１に記載）を含む。
３．５． Ｍ６９０３は、ｈｕＴＩＭ－３とガレクチン－９との相互作用を効率的に遮断した
[00259] 競合ベースのＥＬＩＳＡでは、３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）抗体（上記のセクション３．３を参照）のようなＭ６９０３は、７．４６±０．０５２ｎＭのＩＣ５０で、ｈｕＴＩＭ－３－ビオチンのｈｕＧａｌ－９への結合を濃度依存的に阻害した（図２Ｃ）。遮断率を計算すると、Ｍ６９０３は、抗体の非存在下で得られたＴＩＭ－３／Ｇａｌ－９結合シグナルの最大５５％を遮断することが明らかになった。
[00260] 具体的には、組換えヒトＧａｌ－９タンパク質（R&D）を、ＥＬＩＳＡアッセイプレート上に２μｇ／ｍｌでコーティングし、次いで、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。組換えヒトＴＩＭ－３－Ｆｃキメラタンパク質（R&D, 2365-TM）を、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylationキット（Thermo Scientific, 21327）でビオチン化した。ビオチン化ヒトＴＩＭ－３－Ｆｃ（ｈｕＴＩＭ－３－Ｆｃ－ビオチン）を、アッセイ緩衝液中、最終濃度０．５μｇ／ｍｌのｈｕＴＩＭ－３－Ｆｃ－ビオチンでＧａｌ－９コーティングアッセイプレートに添加し、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ結合抗体（Jackson ImmunoResearch）及びTMB HRP基質（BioFX/ SurModics IVD, TMBS-1000-01）で検出した。Ｇａｌ－９結合のＴＩＭ－３への阻害について抗体を試験するために、ｈｕＴＩＭ－３－Ｆｃ－ビオチンを、各抗体について４連で５０μｇ／ｍｌ開始濃度からの１１点の１：３の希釈系列で抗体と混合し、室温で５０分間インキュベートした。このインキュベーションステップに続いて、ｈｕＴＩＭ－３－Ｆｃ－ビオチン＋抗体混合物をＧａｌ－９コーティングＥＬＩＳＡアッセイプレートに添加し、室温で７５分間インキュベートし、次いで洗浄し、検出試薬で発色させ、ＯＤ（４５０ｎＭ）を読み取った。
３．６． Ｍ６９０３は、ｈｕＴＩＭ－３とＣＥＡＣＡＭ１との相互作用を効率的に遮断した
[00261] ＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、ＴＩＭ－３のＣＥＡＣＡＭ１との結合を、可溶性組換えＨｉｓタグ付きＣＥＡＣＡＭ１タンパク質をプレート結合組換えＴＩＭ－３－Ｆｃ（ｒｈＴＩＭ－３－Ｆｃ）とインキュベートすることによって測定した。プレート結合ｒｈＴＩＭ－３のＭ６９０３とのプレインキュベーションにより、０．３５３±０．３８３ｎＭ（０．０５３±０．０５７μｇ／ｍＬ）のＩＣ５０で、ｒｈＴＩＭ－３－ＦｃのＨｉｓタグ付きＣＥＡＣＡＭ１への結合が用量依存的に減少したが、アイソタイプ対照とのプレインキュベーションでは、結合に影響を及ぼさなかった（図２Ｄ）。
[00262] 具体的には、ＴＩＭ－３とＣＥＡＣＡＭ１との間の相互作用を、１０ｍＭ ＣａＣＬ２（Sigma, C3306-100G）の存在下でのＥＬＩＳＡベースのアッセイによって検出した。平底９６ウェルMaxiSorpプレートに、１０ｍＭ ＣａＣＬ２（Ｃａ２＋）を含む１×ＴＢＳ（Thermo Scientific, 28358）中、０．５μｇのｒｈＴＩＭ－３－ＩｇＧ１－Ｆｃを各ウェルに添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、室温で１時間振とうしながら２％ＢＳＡ ＴＢＳ（Ｃａ２＋）でブロックした。上清を除去した後、ＴＢＳ（Ｃａ２＋）中、Ｍ６９０３又はアイソタイプ対照（抗ＨＥＬ ＩｇＧ２）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳ（Ｃａ２＋）中、ＣＥＡＣＡＭ１－ｐｏｌｙ Ｈｉｓ（ARCO, CE1-H5220）を各ウェルに添加し、プレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、ＴＢＳ（Ｃａ２＋）中、抗６ＸＨｉｓ－ＨＲＰ（Biolegend, 652504）を各ウェルに添加し、続いて振とうしながら室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢを各ウェルに添加し、続いてプレートを室温で２０分間振とうし、各ウェルに停止溶液を添加した。EnVisionプレートリーダーを使用して、光学密度（４５０ｎｍ及び５７０ｎｍ）を直ちに読み取った。
３．７ ＦｃγＲ及びＦｃＲｎの抗ＴＩＭ３抗体結合の測定
[00263] Ｍ６９０３のＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合特性を測定し、インビトロＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合アッセイを用いて適切な対照抗体と比較した。
[00264] ＦｃγＲ及びＦｃＲｎへの抗体の結合を、Octet Red96（ForteBio）機器で測定した。具体的には、ＦｃγＲへの結合を測定するために、２００ｎＭ濃度の抗体をAnti-Human Fab-CH1第２世代（FAB2G）センサーチップ（ForteBio Part No: 18-5125）にロードした。高親和性ＦｃγＲの場合、結合条件：７点の１：２希釈系列で１００ｎＭ～１．５６ｎＭの範囲の漸増ＦｃγＲ、ローディングが３００秒、結合が１８０秒、解離が３００秒。低親和性ＦｃγＲの場合、結合条件：７点の１：２希釈系列で４０００ｎＭ～６２．５ｎＭの範囲の漸増、ローディングが３００秒、結合が６０秒、解離が３００秒。作業緩衝液は、１％ＢＳＡ、０．０５％Tween-20、ＰＢＳ ｐＨ７．４を含んでいた。ＦｃγＲタンパク質はR&D Systemsから購入した。ＦｃγＲ結合もエフェクター機能もないと以前に特徴づけられた、エフェクター陰性抗体ｈｕ１４．１８－ＩｇＧ２ｈ（FN-AQ, K322A）を、センサーサブトラクション（sensor subtraction）の陰性対照として使用した。ＦｃγＲ結合ＫＤ値を、Fortebio Data Analysis Software ver. 7.1.0.36を使用して得た。
[00265] 予想通り、ＩｇＧ１及びエフェクター陰性アイソタイプ「ＩｇＧ２ｈ（FN-AQ, K322A-delK）」の両方のＭ６９０３抗体及び対照抗体は、６２０ｎＭ～８５０ｎＭの範囲のＦｃＲｎへの同等の結合を有していた（表４）。抗ＴＩＭ－３－ＩｇＧ１（３９０３Ｅ１１）結合親和性ＫＤ：１００ｎＭ（ＣＤ１６ａ）、６３０ｎＭ（ＣＤ３２ａ）、及び１．７ｎＭ（ＣＤ６４）。抗ＧＤ２ ｈｕ１４．１８－ｈｕＩｇＧ１結合親和性ＫＤ：２１５ｎＭ（ＣＤ１６ａ）、６７０ｎＭ（ＣＤ３２ａ）、及び１．８ｎＭ（ＣＤ６４）。
[00266] エフェクター陰性アイソタイプ「ＩｇＧ２ｈ（FN-AQ, K322A-delK）」のＭ６９０３抗体及び対照抗体は、ＦｃγＲへの検出可能な結合を有していなかった（表４）。
[00267] これらの結果は、Ｍ６９０３抗ＴＩＭ－３が検出可能なＦｃγＲ結合活性を有していないが、通常のＦｃＲｎ結合を有することを実証し、これは、抗ＴＩＭ３＿３９０３Ｅ１１（ＶＦ１．３、ＶＨ１．２）抗体のエフェクター陰性アイソタイプの重要な特性である。
Figure 2022505925000031
実施例４－エピトープマッピング
４．１ ＴＩＭ－３と３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）Ｆａｂの共結晶化
[00268] ＴＩＭ－３ ＥＣＤと３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）（重鎖：配列番号４７；軽鎖：配列番号４８）のＦａｂ断片との複合体の結晶構造を決定した。ヒトＴＩＭ－３（配列番号４９（アミノ酸）；配列番号５０（ヌクレオチド））を大腸菌（E.coli）封入体で発現させ、リフォールディングし、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）のＦａｂ断片を、Expi293F細胞でＨｉｓタグ付き構築物として発現させ、親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＴＩＭ－３と３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）Ｆａｂ断片との複合体を形成し、ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製し、９５％を超える純度の均質なタンパク質を得た。
[00269] ヒトＴＩＭ－３と複合体を形成したＦａｂ ３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）の結晶を、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して、４℃で、０．７５μｌのタンパク質溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＬ ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中、２１．８ｍｇ／ｍＬ）を０．５μｌのリザーバー溶液（２０％のＰＥＧ４００（ｖ／ｖ）、０．１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０）と混合することによって成長させた。
[00270] 結晶をフラッシュ凍結し、１００Ｋ（約３７．８℃）の温度で測定した。Ｘ線回折データを、極低温条件を使用してSWISS光源（SLS, Villigen, Switzerland）で収集した。結晶は空間群Ｃ２２２１に属している。プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥを使用してデータを処理した。
[00271] 構造を決定及び分析するために必要な相情報を分子置換によって得た。公開された構造ＰＤＢ－ＩＤ５Ｆ７１及び１ＮＬ０をそれぞれ、ＴＩＭ３及びＦａｂ断片の検索モデルとして使用した。その後のモデルの構築及び改良は、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用いて標準プロトコルに従って行った。最終モデルの正しさを相互検証するための尺度であるfree R-factorの計算では、測定した反射の約０．９％を改良手順から除外した（表５を参照）。ＴＬＳ改良（ＲＥＦＭＡＣ５、ＣＣＰ４を使用）を行うと、R-factorが低くなり、電子密度マップの質が高くなった。リガンドのパラメーター化及び対応するライブラリファイルの作成はそれぞれ、ＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨ及びＬＩＢＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）を使用して行った。３．０で輪郭が示されたＦｏ－Ｆｃマップのピークに水分子を配置し、続いて、ＲＥＦＭＡＣ５で改良し、そしてＣＯＯＴの検証ツールですべての水をチェックすることによって、水モデルをＣＯＯＴのアルゴリズム「Find waters」を使用して構築した。疑わしい水のリストの基準は次の通りであった：B-factorが８０Å（８ｎｍ）を超える、２ＦＯ－ＦＣマップが１．２Å（０．１２ｎｍ）未満、最も近い接触距離が２．３Å（０．２３ｎｍ）未満又は３．５Å（０．３５ｎｍ）を超える。疑わしい水分子とリガンド結合部位（リガンドまでの距離が１０Å（１ｎｍ）未満）の水分子を手動でチェックした。最終モデルのRamachandranプロットは、最も好ましい領域ですべての残基の８５．４％、追加で許可された領域で１３．９％、寛大に許可された領域で０．２％を示している。残基Ａｒｇ８１（Ａ）、Ａｒｇ８１（Ｂ）、Ｖａｌ５３（Ｌ）、Ａｓｐ１５３（Ｌ）、Ｖａｌ５３（Ｍ）、Ａｓｐ１５３（Ｍ）、Ｖａｌ５３（Ｎ）、Ｖａｌ５３（Ｏ）、及びＡｓｐ１５３（Ｏ）はRamachandranプロットの許可されていない領域で見られる。それらは、電子密度マップによって確認できるが、別の実用的な立体配座にモデル化することはできない。
Figure 2022505925000032
[00272] エピトープ残基は、３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）Ｆａｂの重原子の５オングストローム（０．５ナノメートル）以内に重原子を有するＴＩＭ－３のすべての残基として定義される。距離は、BioPythonパッケージを使用して最終的な結晶学的座標から測定した。非対称ユニットの４つの複合体のうち３つに存在する接触のみが報告されている（表６）。表６は、ＴＩＭ－３と３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）との間の相互作用を一覧にしたものである。ＴＩＭ－３残基は、Uniprot Code Q8TDQ0-1（配列番号５１）として付番されている。抗体残基は、配列番号４７（重鎖、「Ｈ」）及び配列番号４８（軽鎖、「Ｌ」）を基準に付番されている。ここに列挙されている残基は、界面を横切る重原子から５オングストローム（０．５ナノメートル）以内に少なくとも１つの重原子を有する。
Figure 2022505925000033
Figure 2022505925000034
[00273] Ｍ６９０３と複合体を形成したヒトＴＩＭ－３の結晶構造を図３Ａ～３Ｄに示す。図３Ａは、表面表現として示される、ＴＩＭ－３に結合したＭ６９０３（上部構造）のＦａｂ部分の概要を示す。ＴＩＭ－３（下部構造）での広範囲の接触は、ＴＩＭ－３のより明るい部分として示されている。接触の大部分は、Ｍ６９０３の重鎖及び軽鎖の３番目の相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ３）に存在する。図３Ｂは、ＴＩＭ－３のエピトープホットスポット残基（例えば、Ｐ５９、Ｆ６１、及びＥ６２）を示す。残基は、Ｍ６９０３に対して広範囲の疎水性及び静電相互作用を形成する。図３Ｃは、ｐｔｄＳｅｒ（明るい色の棒）の極性頭部基を示し、配位カルシウムイオン（球）が、マウスＴＩＭ－３の構造との重ね合わせによってＭ６９０３結合ＴＩＭ－３の構造にモデル化されている（DeKruyff et al. (2010), supra）。ｐｔｄＳｅｒの結合部位は、Ｍ６９０３の重鎖のＹ５９（球の基）の配置と一致する。ＴＩＭ－３のＤ１２０からｐｔｄＳｅｒ又はＭ６９０３への水素結合はそれぞれ、点線で示されている。図３Ｄは、破線で示されているＭ６９０３とＴＩＭ－３のＣＥＡＣＡＭ－１結合残基との極性相互作用を示す。
４．２ 突然変異誘発
[00274] ヒトＴＩＭ－３における選択された残基の結合にエネルギー的に寄与するエピトープの残基を識別するために、アラニン（大から小）若しくはグリシン（選択された残基がアラニンである場合）のいずれかに突然変異させる、又は側鎖の電荷を切り替えるために突然変異させた。合計１１個のヒトＴＩＭ－３点突然変異体を設計し、ＨＥＫ細胞で発現させて精製し、そして実施例１．９に記載されているように表面プラズモン共鳴を使用してＭ６９０３への結合を試験した。野生型及び各突然変異体に対する抗体の親和性を決定した。結果は表７にまとめている。
[00275] 突然変異体を野生型ＴＩＭ－３（ｈｕＴＩＭ－３）と比較した。蛍光モニタリングされた熱変性の温度中心点は、野生型及び突然変異型タンパク質について示されている。分析ＳＥＣによって決定された単量体のパーセントが示されている。ＫＤ及びＴ１／２の場合、平均及び標準偏差は、ｎ＞１の場合に示される。特定の点突然変異体に対する結合の欠如が、抗原の全体的なアンフォールディングではなく、残基相互作用の喪失によるものであることを確認することが重要であった。突然変異タンパク質の構造的完全性は、水溶液中でクエンチされるが、露出した疎水性残基によって結合されると蛍光を発する色素と共にタンパク質がインキュベートされる蛍光モニタリング熱変性（ＦＭＴＵ）アッセイを使用して確認した。温度が上昇すると、タンパク質の熱変性により、疎水性コア残基が露出する。これは、色素の蛍光の増加によってモニタリングすることができる。融解曲線を、（Bullock et al. 1997）から適合された式１に概説されているボルツマン方程式を用いてデータに適合させて曲線の変曲点（Ｔ１／２）での温度を決定する。計算したＴ１／２を表７に示す。
式１：
Figure 2022505925000035
Figure 2022505925000036
[00276] Ｍ６９０３は、ＴＩＭ－３単一点突然変異体Ｐ５９Ａ、Ｆ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｉ１１４Ａ、Ｎ１１９Ａ、及びＫ１２２Ａへの結合の減少又は喪失を示した（表７を参照）。残基Ｐ５９Ａ、Ｆ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｉ１１４Ａ、Ｎ１１９Ａ、及びＫ１２２Ａは、モデルで示されているように免疫グロブリンフォールドの１つのベータシートの表面に存在し（図４を参照）、ヒトＴＩＭ－３のＣＣ’及びＦＧループ、Ｐｔｄ－Ｓｅｒ結合に関与することが示されているループに存在する。Ｍ６９０３によるＩｌｅ－１１４の側鎖との接触は明らかではなく；突然変異による中程度の有害な影響は、ループ領域の局所的な不安定化として説明される。Ｌｙｓ－１２２の最も近い交差界面接触は４．７Å（０．４７ｎｍ）であり、抗体の骨格カルボニルで発生する。この距離では水架橋相互作用が可能であるが、結晶構造の解像度では観察できなかった。Ｋ１２２Ａ突然変異の有害な影響は、ギャップが水架橋によって埋められている場合に説明され得る。
[00277] ＴＩＭ－３突然変異体Ｒ１１１及びＦ１２３は、ＳＥＣ、ＦＭＴＵ、及び抗体との重要な相互作用ではなくタンパク質の不安定化による可能性が高いためにＲ１１１及びＦ１２３突然変異体で観察されたあらゆる結合の低下によって評価される低い安定性を示した。従って、表７は、Ｐ５９Ａ、Ｆ６１Ａ、及びＥ６２Ａを含むようにＭ６９０３が結合するためのホットスポット残基を示している（図４も参照）。
[00278] 既知の抗体ＡＢＴＩＭ３－ｈ０３ ＡＢＴＩＭ３－ｍＡＢ１５及び２７．１２Ｅ１２を使用して実験を繰り返した。結果を表７及び表８に示す。既知の抗体ｍＡｂｈ０３の場合、残基Ｐ５９Ａ、Ｉ１１４Ａ、Ｍ１１８Ａ、及びＫ１２２Ａが、結合への影響が与えられた結合界面の残基として識別される。特に、Ｋ１２２及びＦ１２３は、ｍＡｂ ｈ０３のホットスポットとして示されている。これらの位置は、ｍＡｂ ｈ０３の報告された結合フットプリントにある（米国特許出願公開第２０１５０２１８２７４Ａ１号、ｈｕｍ２１はｈ０３のＦａｂ形態である）。従って、いくつかの変異体ｈｕ ＴＩＭ－３タンパク質は、Ｍ６９０３及びＡＢＴＩＭ３－ｈ０３への結合の喪失をもたらしたが、他のｈｕＴＩＭ－３変異体は、Ｍ６９０３のみへの結合の喪失をもたらし、２つの抗体が、部分的に重複しているが異なるエピトープを有することを示唆している。
[00279] 他の既知の抗体、２７．１２Ｅ１２及びｍａｂｌ５は、エピトープビニング実験で観察された競合にもかかわらず、このＴＩＭ－３変異体タンパク質のセットの中で明らかにされたホットスポットを有しておらず、Ｍ６９０３及びＡＢＴＩＭ－３－ｍａｂｌ５が重複しないエピトープを有することを示唆している。
Figure 2022505925000037
実施例５－抗ＴＩＭ－３抗体の薬理学的研究
[00280] 以下の研究は、抗ＴＩＭ３抗体Ｍ６９０３についてである。Ｍ６９０３には、ＩｇＧ２ｈ（FN-AQ, 322A）－ｄｅｌＫバックグラウンド（抗ＴＩＭ３－３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）－ＩｇＧ２ｈ（FN-AQ, 322A）－ｄｅｌＫ）に３９０３Ｅ１１（ＶＬ１．３、ＶＨ１．２）の軽鎖及び重鎖可変領域が含まれている。Ｍ６９０３の軽鎖及び重鎖はそれぞれ、配列番号２１及び配列番号２２に対応する。
５．１ 抗ＴＩＭ－３の目標占有率
[00281] ＴＩＭ－３に結合するＭ６９０３の能力を、Ｍ６９０３と同一であるが、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞ではなくＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で産生される抗ＴＩＭ－３（Ａ１６－０１９－１）を使用して実証した。ＣＤ１４＋単球上の抗ＴＩＭ－３（Ａ１６－０１９－１）の目標占有率を、ヒト全血試料を使用したフローサイトメトリーによって測定した。試料を、抗ＴＩＭ－３（Ａ１６－０１９－１）の段階希釈物と共にインキュベートし、続いて抗ＴＩＭ－３（２Ｅ２）－ＡＰＣの段階希釈物と共にインキュベートした。抗ＴＩＭ－３（２Ｅ２）－ＡＰＣは、ＣＤ１４＋単球上のＴＩＭ－３への結合を抗ＴＩＭ－３（Ａ１６－０１９－１）と競合することが示されている。予想通り、目標占有率は、抗ＴＩＭ－３（Ａ１６－０１９－１）の濃度の増加と共に増加し、１０人のドナーすべての平均ＥＣ５０は、１１１．１±８５．６ｎｇ／ｍｌであった（図５を参照）。最も高い用量は飽和することが示された。
５．２ Ｍ６９０３は、アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞上でのｒｈＴＩＭ－３とＰｔｄＳｅｒとの相互作用を効率的に遮断した
[00282] ＴＩＭ－３と、そのリガンドである場合はＰｔｄＳｅｒとの相互作用を遮断するＭ６９０３の能力を、フローサイトメトリーに基づく結合アッセイによって決定した。アポトーシスの誘導がアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞の細胞膜へのＰｔｄＳｅｒの曝露をもたらしたため、これらの細胞をＰｔｄＳｅｒの供給源として使用した。具体的には、フローサイトメトリー分析の前に、スタウロスポリン（２μｇ／ｍＬ、１８時間）での処理によってＪｕｒｋａｔ細胞にアポトーシスを誘導し、ＴＩＭ－３リガンドであるＰｔｄＳｅｒの表面発現を生じさせた。アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞の表面へのｒｈＴＩＭ－３－Ｆｃ ＰｔｄＳｅｒの結合を、Ｍ６９０３又は抗ＨＥＬ ＩｇＧ２ｈアイソタイプ対照の段階希釈物とのプレインキュベーション後のｒｈＴＩＭ－３－Ｆｃ ＡＦ６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって、フローサイトメトリーで評価した。ｒｈＴＩＭ－３ ＡＦ６４７をＭ６９０３とプレインキュベーションすると、ＴＩＭ－３－ＦｃのアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞への結合が減少したが、アイソタイプ対照とのプレインキュベーションは、ｒｈＴＩＭ－３－Ｆｃ結合に影響を与えなかった（図６を参照）。従って、Ｍ６９０３は、４．４３８±３．１１５ｎＭ（０．６６６±０．４６７μｇ／ｍＬ）のＩＣ５０で、ＴＩＭ－３とＰｔｄＳｅｒとの間の相互作用を用量依存的に効率的に遮断することができた。非線形適合線を、シグモイド用量反応式を使用してグラフに適用した。このＴＩＭ－３／ＰｔｄＳｅｒ相互作用の遮断は、抑制性ＴＩＭ－３シグナル伝達の抑制につながり、その結果、免疫細胞の活性化が促進される可能性があるとの仮説が立てられている。
５．３ 単剤療法として又はアベルマブ又はビントラファスプαとの併用療法でのＴ細胞のリコール応答及び活性化に対するＭ６９０３の効果
[00283] Ｍ６９０３処理は、ＣＥＦ抗原への曝露によって活性化されたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ産生を増加させ、これが、以前にＣＥＦに感染したドナーからのＰＢＭＣにおいてＣＥＦ抗原特異的Ｔ細胞リコール応答を特異的に誘発する。ＰＢＭＣを、Ｍ６９０３の段階希釈物の存在下で、４０μｇ／ｍｌのＣＥＦウイルスペプチドプールで（Ａ）６日間又は（Ｂ）４日間処理した。図７Ａに示されるように、Ｍ６９０３は、複数の実験から計算した、１±１．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０で、ヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＡキットを使用したＩＦＮ－γ産生によって測定するＴ細胞活性化を、ＣＥＦアッセイにおけるアイソタイプ対照と比較して用量依存的に増強した。非線形回帰分析を行い、平均及びＳＤを示す。
[00284] 図７Ｂに示されているように、Ｍ６９０３の段階希釈物を、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照又はビントラファスプαのいずれかと組み合わせた。ＩＦＮ－γの産生を、Ｍ６９０３とビントラファスプαとの組み合わせの存在下でさらに増強し、この組み合わせがＴ細胞活性化のさらなる増強をもたらす可能性があることを示唆している。平均及びＳＤを図７Ｂに示す（ｐ＜０．０５）。
[00285] 照射されたDaudi腫瘍細胞を、ＩＬ－２を使用してヒトＴ細胞と７日間共培養して、同種反応性Ｔ細胞増殖を誘導した。次いで、Ｔ細胞を回収し、新たに照射したDaudi細胞と共培養し、Ｍ６９０３抗体又はアイソタイプ対照で２日間処理した。Ｔ細胞の活性化を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡによって測定し、Ｍ６９０３は、ＥＣ５０＝１１６±１１７ｎｇ／ｍＬで、アイソタイプ対照と比較してこれらの細胞におけるＩＦＮ－γ産生を用量依存的に増強することを示した（図８を参照）。アベルマブ又はビントラファスプαの添加は、Ｔ細胞活性化に対するＭ６９０３の効果をさらに増強した（図８を参照）。
[00286] Ｍ６９０３処理は、架橋Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＭＨＣクラスＩＩ分子を介して非特異的にＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するスーパー抗原ＳＥＢへの曝露によって活性化されたヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γ産生を増加させた。Ｍ６９０３（１０μｇ／ｍＬ）を、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと単独で、又はアベルマブ若しくはビントラファスプα（１０μｇ／ｍＬ）と組み合わせて９日間インキュベートし、次いで細胞を培地で１回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ及び同じ濃度の抗体溶液でさらに２日間再刺激した。上清中のヒトＩＦＮ－γを、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。Ｍ６９０３処理はＩＦＮ－γ産生を増強した（図９Ａ及び図９Ｂを参照）。Ｍ６９０３処理をアベルマブ又はビントラファスプαと組み合わせると、ＩＦＮ－γの産生がさらに増強された（図９Ａ及び図９Ｂを参照）。
５．４ Ｔ細胞活性を高めるためにはＧａｌ－９／ＰｔｄＳｅｒの二重ブロックが必要であり、Ｍ６９０３活性と相関する
[00287] ＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌのＭ６９０３、１０μｇ／ｍｌの抗Ｇａｌ－９（9M1-3; Biolegend, 348902）若しくは１０μｇ／ｍｌの抗ＰｔｄＳｅｒ（bavituximab; Creative Biolabs, TAB-175）の存在下で、５％のヒトＡＢ血清（Valley Biomedical, HP1022）を含むＡＩＭ－Ｖ培地（Invitrogen #12055-091）中で４日間、４０μｇ／ｍｌのＣＥＦ（サイトメガロウイルス、エプスタインバー、及びインフルエンザ）ウイルスペプチドプール（AnaSpec, AS-61036-025）で刺激した、又は１０μｇ／ｍｌのＭ６９０３と１０μｇ／ｍｌの抗Ｇａｌ－９、１０μｇ／ｍｌのＭ６９０３と１０μｇ／ｍｌの抗ＰｔｄＳｅｒ、若しくは１０μｇ／ｍｌの抗Ｇａｌ－９と１０μｇ／ｍｌの抗ＰｔｄＳｅｒの抗体の組み合わせで刺激した。増殖を、チミジンの取り込みによって測定した。培養上清中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡ（R&D Systems, DY285B）で測定し、その結果を図１０に示す（代表的な少なくとも３回の実験；ｐ＜０．０５）。図示されているように、どちらの抗体も単独ではない、抗Ｇａｌ－９と抗ＰｔｄＳｅｒとの組み合わせは、ＣＥＦアッセイでＭ６９０３と同様の活性を示し、Ｇａｌ－９とＰｔｄＳｅｒの両方のＴＩＭ－３への結合をブロックすることが、このアッセイにおいて抗ＴＩＭ－３活性に必要である可能性があることを示唆している。加えて、Ｍ６９０３と抗Ｇａｌ－９又は抗ＰｔｄＳｅｒとの組み合わせは、ＩＦＮγ産生をさらに増加させなかったことから、Ｍ６９０３がＧａｌ－９とＰｔｄＳｅｒの両方のＴＩＭ－３への結合を完全にブロックしたことが示唆される。
５．５ 正常なヒト組織及び腫瘍におけるＴＩＭ－３受容体及びリガンド発現のプロファイリング
[00288] 次いで、ＴＩＭ－３及びそのリガンドの発現を、発色ＩＨＣ及びｍＩＦの有効なアッセイを使用して調べた。次いで、正常なヒト組織におけるＴＩＭ－３発現を、人体の３５の異なる組織を表すＦＤＡ正常組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用して評価した。ＴＩＭ－３の発現が、腎皮質を除いて、ほとんどの組織で観察され、免疫細胞に特異的であり、特異的なＴＩＭ－３発現も上皮細胞で観察された。最も高い免疫反応性は、免疫組織：脾臓、扁桃腺、及びリンパ節、並びに免疫の強い臓器：肺、胎盤、及び肝臓組織で観察された。免疫器官では、ＴＩＭ－３発現は、主にマクロファージ（及び場合によってはＤＣ）で観察されたが、リンパ球では観察されなかった（データは示されていない）。リンパ球でのＴＩＭ－３発現は、炎症を起こした組織でのみ観察された（データは示されていない）。
[00289] １２の異なる腫瘍型を表す１５の腫瘍ＴＭＡ全体の染色パターンの確認により、ＴＩＭ－３発現が、腎細胞癌（ＲＣＣ）を除くすべての症状にわたって浸潤性免疫細胞で主に観察されたことが示された。表現型的には、Ｔ細胞と骨髄細胞の両方をＴＩＭ－３に対して陽性に染色した（データは示されていない）。ＴＩＭ－３の腫瘍細胞発現は、ＲＣＣのみで確認された（データは示されていない）。これらの腫瘍ＴＭＡのデジタル画像分析染色を使用してＴＩＭ－３＋細胞の頻度を定量化した場合、ＲＣＣは、おそらく、他の腫瘍型ではなくＲＣＣの腫瘍細胞でのＴＩＭ－３の発現のために、最も高い頻度のＴＩＭ－３陽性を示した（図１１Ａ及び図１１Ｂを参照）。データは、（１）平均発現を計算して、発現の中央値を昇順にすることによってデータをプロットすること（図１１Ａ）、及び（２）異常値を除外した後の平均発現を計算して、発現の中央値を降順にすることによってデータをプロットすること（図１１Ｂ）によって分析した。ＴＩＭ－３レベルが高い他の症状には、ＮＳＣＬＣ、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、及び扁平上皮細胞頭頸部癌（ＳＣＣＨＮ）が含まれていた（図１１Ａ及び図１１Ｂを参照）。
[00290] 次いで、腫瘍ＴＭＡを染色して、ｍＩＦ分析を使用してＴＭＥでＴＩＭ－３を発現する免疫細胞を識別した。ＴＩＭ－３は、ＣＤ３＋リンパ球及びＣＤ６８＋マクロファージのサブセットで発現することが分かった。デジタル定量により、マクロファージが、分析したすべての症状でＴＩＭ－３＋細胞のかなりの部分を構成した一方、高頻度のＴＩＭ－３＋Ｔ細胞はＮＳＣＬＣ及びＳＴＡＤ腫瘍のみで観察された（図１２を参照）。これらの結果は、１３個のＮＳＣＬＣ腫瘍試料のコホートにおけるフローサイトメトリー分析で確認され；生ＣＤ３＋の集団内では、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＴＩＭ－３＋細胞の最も高い中央値パーセンテージを有し（５．１２６±２．３３１％）、続いて、ＣＤ４＋細胞エフェクター細胞であり（３．３９８±０．７３２％）、そしてＣＤ４＋Ｔｒｅｇである（１．３１６±０．３１０％）（図１３を参照）。
[00291] 最後に、ＴＩＭ－３発現とリガンド、Ｇａｌ－９、ＣＥＡＣＡＭ－１、及びＨＭＧＢ１との相関を、ＴＣＧＡ ＲＮＡＳｅｑデータ及びｍＩＦ分析の両方で評価した（表９を参照）。ＴＩＭ－３発現とリガンド（ｍＲＮＡ及びタンパク質）の発現とのピアソン相関は、Ｇａｌ－９発現が複数の症状で正に相関していることを示した。これは、ＣＥＡＣＡＭ－１及びＨＭＧＢ１の発現には当てはまらなかった。１に近い値は最も正の相関があり、－１に近い値は最も負に相関し、０に近い値は、ほとんど又はまったく相関を示していない。
Figure 2022505925000038
５．６ 外植片プラットフォーム
[00292] ヒトＴＩＭ－３タンパク質とマウスＴＩＭ－３タンパク質との交差反応性が欠如しているため、インビボモデルは、Ｍ６９０３の抗腫瘍活性を調べるために容易に利用可能ではない。従って、Ｍ６９０３が抗腫瘍効果を有するか否かを判断するために、CANscriptTMヒト腫瘍微小環境（ＴＭＥ）プラットフォーム（MITRA Biotechで開発された）を使用した。CANscriptTMプラットフォームは、免疫区画を含む患者の個人的な腫瘍微小環境を再現する機能アッセイである。インビトロで腫瘍組織片に適用された薬物処置に対する反応を、複数の生化学的及び表現型アッセイを使用して読み取る。これらの腫瘍反応を、CANscriptTMテクノロジーのアルゴリズムによって、薬物の有効性を予測できる単一「Ｍ」スコアに統合する。
[00293] このプラットフォームを使用して、Ｍ６９０３を、単剤療法として又はビントラファスプαとの併用療法で、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）を有する２０人の患者からの試料で試験した。Ｍスコアは、所与の腫瘍標本の複数の入力パラメーターに基づいて処理結果を予測する。応答の陽性予測は、２５を超えるＭスコアと相関する（表１０の太字の数字）。応答の陰性予測は、２５以下のＭスコアと相関する。Ｍスコア値は、対照の未処理試料に関連するパラメーターから導出されるため、対照処理のＭスコアは存在しない。
[00294] 有効性の読み出しとしてＭスコアを使用して、陽性予測応答が、Ｍ６９０３で処理された腫瘍試料の３／２０（１５％）、ビントラファスプαで処理された腫瘍試料の７／２０（３５％）、及びＭ６９０３とビントラファスプαの組み合わせで処理された腫瘍試料の９／２０（４５％）で観察され（表９を参照）、Ｍ６９０３が、ビントラファスプとの組み合わせで増加する抗腫瘍活性を有することを示唆している。
Figure 2022505925000039
実施例６－インビボ抗ＴＩＭ－３抗体研究
６．１ 動物
[00295] ２匹のＴＩＭ－３ノックインマウスモデルを使用した。７～１２週齢の雌雄「ｈｕ－ＴＩＭ－３ ＫＩ」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）をNanjing Galaxy Biopharmaから入手し、６～８週齢の雌「Ｂ－ｈｕ－ＴＩＭ－３ ＫＩ」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）をBeijing Biocytogen Co., Ltdから入手した。両方のヒト化マウスモデルを、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的バックグラウンドのマウスにおいて、ＴＩＭ－３受容体のマウス細胞外ドメインをＴＩＭ－３受容体のヒト細胞外ドメインに置き換えることによって開発した。Nanjing Galaxy BioPharmaが、Loxp-PGK/Neo-Loxpカセット組換えを使用して、マウスＴＩＭ－３受容体（エクソン２～５）の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをヒトＴＩＭ－３受容体の対応するドメインに置き換えることによってｈｕ－ＴＩＭ－３ ＫＩマウスを作製した。Biocytogenが、マウスＴＩＭ－３受容体の残りの細胞内ドメイン及び細胞質ドメインをインタクトに維持する、マウスのIgV細胞外ドメイン（エクソン２）のみの対応するヒトドメインでの置き換えによってCRISPR/Cas9組換え技術を使用してＢ－ｈｕ－ＴＩＭ－３ ＫＩマウスを開発した。
６．２ ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスで増殖したＭ６９０３／アベルマブ処理ＭＣ３８腫瘍の免疫プロファイル
[00296] Ｍ６９０３単剤療法又はアベルマブとの併用療法での処理のインビボ効果を試験するために、ＭＣ３８大腸癌細胞を、ヒト化ＴＩＭ－３ノックインマウス（ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩ）に皮下移植した。ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスで樹立されたＭＣ３８腫瘍の免疫細胞集団を、Ｍ６９０３、アベルマブ、又はその２つの組み合わせでの処理の開始から６日後にフローサイトメトリーによって分析した。生ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは処理群間で異ならなかったが（図１４Ａ）、ＣＤ４５＋集団内の免疫細胞集団のパーセンテージは処理による影響を受けた。具体的には、ＣＤ３＋細胞のパーセンテージは、アイソタイプ対照と比較して、アベルマブ（７ｍｇ／ｋｇ）単剤療法（Ｐ＝０．０２３２）又はＭ６９０３とアベルマブとの組み合わせ（Ｐ＝０．０４４５）で処理された腫瘍で有意に増加した（図１４Ｂを参照）。また、アイソタイプ対照と比較して、アベルマブ単剤療法（Ｐ＝０．００９２）又は二重併用療法（Ｐ＝０．０１２７）のいずれかで処理されたＣＤ８＋Ｔ細胞が有意に増加し、アベルマブ単剤療法（Ｐ＝０．０１７２）による処理でＮＫ細胞が増加した（図１４Ｂを参照）。しかしながら、アベルマブ単剤療法で処理されたものと比較して、併用療法で処理された腫瘍における腫瘍浸潤ＣＤ３＋白血球又はＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージに有意差はなかった。
[00297] 疲弊した表現型を有する処理された腫瘍内のＴ細胞のパーセンテージを評価するために、免疫チェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、及びＴＩＭ－３を共発現するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを分析した。Ｍ６９０３単剤療法は、ＣＤ４＋ＰＤ－１＋（Ｐ＝０．００６２）を有意に増加させ、アベルマブ単剤療法による処理は、ＣＤ４＋ＰＤ－１＋（Ｐ＝０．００２６）及びＣＤ８＋ＴＩＭ－３＋（Ｐ＝０．００６９）細胞のパーセンテージを増加させた。しかしながら、Ｍ６９０３とアベルマブとの組み合わせは、これらのＴ細胞サブセットに相乗効果をもたらし、ＬＡＧ－３（Ｐ＝０．００１２）、ＰＤ－１（Ｐ＝０．０００１）、及びＴＩＭ－３（Ｐ＝０．００１８）を共発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ、及びＬＡＧ－３（Ｐ＜０．０００１）、ＰＤ－１（Ｐ＜０．０００１）、及びＴＩＭ－３（Ｐ＜０．０００１）を共発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージを有意に低下させた（図１４Ｃを参照）。これらの結果は、Ｍ６９０３とアベルマブとの二重組み合わせが相乗作用して腫瘍微小環境における疲弊したＴ細胞を減少させたことを示唆している。
６．３ ＭＣ３８担癌Ｂ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスにおけるＭ６９０３／アベルマブの抗腫瘍効果
[00298] Ｍ６９０３とアベルマブの併用療法の抗腫瘍効果を、ＭＣ３８腫瘍が皮下移植されたＢ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスモデルで試験した。マウス（Ｎ＝１０／群）を、アイソタイプ対照（２０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．；０日目、３日目、６日目）、アベルマブ（２０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．；０日目、３日目、６日目）、Ｍ６９０３（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．；ｑ３ｄ×７）、又はアベルマブとＭ６９０３との組み合わせのいずれかで処理した。処理開始から２７日後にアイソタイプ対照と比較して、アベルマブ単剤療法（Ｔ／Ｃ＝３４．３％、ＴＧＩ＝６７．３％、Ｐ＜０．０００１）又はＭ６９０３単剤療法（Ｔ／Ｃ＝８０．４％、ＴＧＩ＝２０％、Ｐ＝０．００３８）で有意な抗腫瘍活性が見られた（図１５Ａを参照）。Ｍ６９０３とアベルマブの組み合わせは、Ｍ６９０３単剤療法（Ｐ＜０．０００１）と比較して抗腫瘍活性をさらに増強したが（Ｔ／Ｃ＝３０．４％、ＴＧＩ＝７１．２％）、アベルマブ単剤療法と比較して有意ではない（図１５Ａ及び図１５Ｂを参照）。加えて、併用療法は、生存率中央値（４１日）が、アイソタイプ対照（３１日）及びＭ６９０３（３２．５日）及びアベルマブ（３８日）単剤療法と比較してわずかに上昇していた（図１５Ｃを参照）。
６．４ ＭＣ３８担癌Ｂ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスにおけるＭ６９０３／ビントラファスプαの抗腫瘍効果
[00299] Ｍ６９０３とビントラファスプの併用療法の抗腫瘍効果を、ＭＣ３８腫瘍が皮下移植されたＢ－ｈｕＴＩＭ－３ ＫＩマウスモデルで試験した。マウス（Ｎ＝１０／群）を、アイソタイプ対照（２０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．；０日目、３日目、６日目）、ビントラファスプα（２４ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｖ．；０日目、３日目、６日目）、Ｍ６９０３（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．；ｑ３ｄ×１２）、又はビントラファスプαとＭ６９０３との組み合わせのいずれかで処理した。治療開始から２８日後にアイソタイプ対照と比較して、ビントラファスプ単剤療法（ＴＧＩ＝２５．７％、Ｐ＝０．００５４）又はＭ６９０３単剤療法（ＴＧＩ＝１８．２％、Ｐ＝０．０２８１）で有意な抗腫瘍活性が見られた（図１６Ａを参照）。Ｍ６９０３とビントラファスプαとの組み合わせは、Ｍ６９０３（Ｐ＝０．００１１、２８日目）及びビントラファスプα（Ｐ＝０．００１８、２８日目）の単剤療法と比較して、抗腫瘍活性（ＴＧＩ＝５４．６％）をさらに増強した（図１６Ａ及び図１６Ｂを参照）。体重減少に関連する有意な処理は観察されなかった（データは示されていない）。
参照による組み込み
[00300] 本明細書で参照される特許及び科学文献のそれぞれの開示全体が、すべての目的のために参照により援用される。
同等物
[00301] 本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、すべての面で例示的であると見なされるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び同等の範囲内にあるすべての変更は、本発明に含まれることを意図している。
配列表：
Figure 2022505925000040
Figure 2022505925000041
Figure 2022505925000042
Figure 2022505925000043
Figure 2022505925000044
Figure 2022505925000045
ＴＩＭ３配列（及びその他）
配列番号４１：ヒトＴＩＭ－３細胞外ドメイン（アミノ酸配列、ＮＰ＿１１６１７１）
Figure 2022505925000046
配列番号４２：ｃｙｎｏ ＴＩＭ－３細胞外ドメイン（アミノ酸配列、ＸＰ＿００５５５８４３８）
Figure 2022505925000047
配列番号４３：Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＭ－３ ＥＣＤ（アミノ酸配列、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｔ＃Ｃ３５６）
Figure 2022505925000048
配列番号４４：Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＭ－３ ＥＣＤ（アミノ酸配列、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｔ＃ＣＤ７１）
Figure 2022505925000049
配列番号４５：マーモセットＴＩＭ－３ ＥＣＤ（アミノ酸配列、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｔ＃ＣＭ６４）
Figure 2022505925000050
配列番号４６：マウスＴＩＭ－３細胞外ドメイン（アミノ酸配列、ＮＰ＿５９９０１１）
Figure 2022505925000051
配列番号４７：結晶化のための３９０３Ｅ１１ Ｆａｂ断片のＨＣ
Figure 2022505925000052
配列番号４８：結晶化のための３９０３Ｅ１１ Ｆａｂ断片のＬＣ
Figure 2022505925000053
配列番号４９：ヒトＴＩＭ－３ ＥＣＤ（結晶学のために大腸菌（e.coli）で発現させられた）
Figure 2022505925000054
配列番号５０：ヒトＴＩＭ－３ ＥＣＤのヌクレオチド配列（結晶学のために大腸菌（e.coli）で発現させられた）
Figure 2022505925000055
配列番号５１ ヒトＴＩＭ－３アイソフォーム１（Uniprot Code Q8TDQ0-1）
Figure 2022505925000056

Claims (79)

  1. ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体であって、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；並びに
    （ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、抗体。
  2. 請求項１に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  3. 請求項１に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  4. 請求項２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  5. 請求項３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  6. 請求項３の核酸をさらに含む、請求項４に記載の発現ベクター。
  7. 請求項４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  8. 請求項５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  9. 請求項６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  10. 請求項５に記載の発現ベクターをさらに含む、請求項７に記載の宿主細胞。
  11. 免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する方法であって：
    （ａ）請求項７又は８に記載の宿主細胞を、当該宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で増殖させること；及び
    （ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを精製することを含む、方法。
  12. ヒトＴＩＭ－３に結合する抗体又は当該抗体の抗原結合断片を生産する方法であって：
    （ａ）請求項９又は１０に記載の宿主細胞を、当該宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で増殖させ、それにより抗体又は抗体の抗原結合断片を生産すること；並びに
    （ｂ）抗体又は抗体の抗原結合断片を精製することを含む、方法。
  13. 配列番号５３、配列番号２４、配列番号５５、配列番号３４からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに配列番号５２、配列番号５４、配列番号２３、及び配列番号３３からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体。
  14. 配列番号２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体。
  15. 請求項１３又は請求項１４に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  16. 請求項１３又は請求項１４に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  17. 請求項１５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  18. 請求項１６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  19. 請求項１５に記載の核酸をさらに含む、請求項１８に記載の発現ベクター。
  20. 請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  21. 請求項１８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  22. 請求項１９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  23. 請求項１７に記載の発現ベクターをさらに含む、請求項２１に記載の宿主細胞。
  24. 免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する方法であって：
    （ａ）請求項２０又は２１に記載の宿主細胞を、当該宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で増殖させること；及び
    （ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを精製することを含む、方法。
  25. ヒトＴＩＭ－３に結合する抗体又は当該抗体の抗原結合断片を生産する方法であって：
    （ａ）請求項２２又は２３に記載の宿主細胞を、当該宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で増殖させ、それにより抗体又は抗体の抗原結合断片を生産すること；並びに
    （ｂ）抗体又は抗体の抗原結合断片を精製することを含む、方法。
  26. ヒトＴＩＭ－３に結合する単離された抗体であって：
    （ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；並びに
    （ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、抗体。
  27. 請求項２６に記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  28. 請求項２６に記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  29. 請求項２７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  30. 請求項２８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  31. 請求項２７に記載の核酸をさらに含む、請求項３０に記載の発現ベクター。
  32. 請求項２９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  33. 請求項３０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  34. 請求項３１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  35. 請求項２９に記載の発現ベクターをさらに含む、請求項３３に記載の宿主細胞。
  36. 免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを生産する方法であって：
    （ａ）請求項３２又は３３に記載の宿主細胞を、当該宿主細胞が免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを発現するような条件下で増殖させること；及び
    （ｂ）免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを精製することを含む、方法。
  37. ヒトＴＩＭ－３に結合する抗体又は当該抗体の抗原結合断片を生産する方法であって：
    （ａ）請求項３４又は３５に記載の宿主細胞を、当該宿主細胞が免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを発現するような条件下で増殖させ、それにより抗体又は抗体の抗原結合断片を生産すること；並びに
    （ｂ）抗体又は抗体の抗原結合断片を精製することを含む、方法。
  38. 前記抗体が、表面プラズモン共鳴によって測定される９．２ｎＭ以下のＫＤを有する、請求項１、１３、又は２６のいずれか一項に記載の抗体。
  39. ヒトＴＩＭ－３上のガレクチン－９結合部位への結合を請求項１に記載の抗体と競合する、単離された抗体。
  40. ヒトＴＩＭ－３上のＰｔｄＳｅｒ結合部位への結合を請求項１に記載の抗体と競合する、単離された抗体。
  41. ヒトＴＩＭ－３上の癌胎児性抗原細胞接着関連分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）結合部位への結合を請求項１に記載の抗体と競合する、単離された抗体。
  42. 請求項１に記載の抗体と同じヒトＴＩＭ－３タンパク質上のエピトープに結合する単離された抗体であって、前記エピトープが、前記ヒトＴＩＭ－３タンパク質のＰ５９、Ｆ６１、Ｅ６２、及びＤ１２０を含む、単離された抗体。
  43. 腫瘍微小環境において少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートする方法であって、腫瘍微小環境を、請求項１、１３、又は２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートすることを含む、方法。
  44. 前記腫瘍微小環境を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 第２の治療薬が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項４４に記載の方法。
  46. 疲弊マーカーが、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. Ｔ細胞活性化を増強する方法であって、Ｔ細胞を、請求項１、１３、又は２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露し、それによりＴ細胞の活性化を増強することを含む、方法。
  48. Ｔ細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該細胞を請求項１、１３、又は２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
  50. 腫瘍細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 哺乳動物の腫瘍増殖を阻害する方法であって、哺乳動物を請求項１、１３、又は２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、哺乳動物の腫瘍増殖を阻害することを含む、方法。
  52. 哺乳動物を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 哺乳動物の癌を処置する方法であって、請求項１、１３、又は２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
  54. 有効量の第２の治療薬を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 癌が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃／胃腺癌（ＳＴＡＤ）からなる群から選択される、請求項５３又は請求項５４に記載の方法。
  56. 哺乳動物がヒトである、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 腫瘍微小環境において少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートする方法に使用するための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体であって、前記方法が、腫瘍微小環境を有効量の前記抗体に曝露して少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートすることを含む、抗体。
  58. 前記方法が、前記腫瘍微小環境を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項５７に記載の抗体。
  59. 第２の治療薬が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項５８に記載の抗体。
  60. 疲弊マーカーが、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３である、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の抗体。
  61. Ｔ細胞活性化を増強する方法に使用するための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体であって、前記方法が、Ｔ細胞を有効量の前記抗体に曝露し、それによりＴ細胞の活性化を増強することを含む、抗体。
  62. 前記方法が、Ｔ細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項６１に記載の抗体。
  63. 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に使用するための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体であって、前記方法が、前記細胞を有効量の前記抗体に曝露して腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、抗体。
  64. 前記方法が、腫瘍細胞を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項６３に記載の抗体。
  65. 哺乳動物の腫瘍増殖を阻害する方法に使用するための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体であって、前記方法が、哺乳動物を有効量の前記抗体に曝露して腫瘍の増殖を阻害することを含む、抗体。
  66. 前記方法が、哺乳動物を有効量の第２の治療薬に曝露することをさらに含む、請求項６５に記載の抗体。
  67. 哺乳動物の癌を処置する方法に使用するための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体であって、前記方法が、有効量の前記抗体を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、抗体。
  68. 前記方法が、有効量の第２の治療薬を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項６７に記載の抗体。
  69. 癌が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃／胃腺癌（ＳＴＡＤ）からなる群から選択される、請求項６７又は６８に記載の抗体。
  70. 哺乳動物がヒトである、請求項５７～６９のいずれか一項に記載の抗体。
  71. 任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、腫瘍微小環境において少なくとも１つの疲弊マーカーをダウンレギュレートするための薬剤の製造のための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  72. 第２の治療薬が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項７１に記載の使用。
  73. 疲弊マーカーが、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、又はＴＩＭ－３である、請求項７１又は請求項７２に記載の使用。
  74. 任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、Ｔ細胞活性化を増強するための薬剤の製造のための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  75. 任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬剤の製造のための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  76. 任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、哺乳動物の腫瘍増殖を阻害するための薬剤の製造のための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  77. 任意選択により第２の治療薬と組み合わせられる、哺乳動物の癌を処置するための薬剤の製造のための、請求項１、１３、２６、又は３８～４２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  78. 癌が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は胃／胃腺癌（ＳＴＡＤ）からなる群から選択される、請求項７７に記載の使用。
  79. 哺乳動物がヒトである、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の使用。
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