CN113272017A

CN113272017A - 抗tim-3抗体

Info

Publication number: CN113272017A
Application number: CN201980086657.5A
Authority: CN
Inventors: 章东; 赵新燕; 安琦; D·南那曼; R·萨娜杰迪诺夫; V·苏德; C·伊夫兰德
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2021-08-17
Also published as: JP2022505925A; US20220081480A1; IL282707A; CA3117429A1; EP3873611A1; AU2019371457A1; WO2020093023A1

Abstract

本发明部分基于发现特异性结合人T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM‑3)的抗体家族。抗体包含基于抗体的CDR的TIM‑3结合位点。抗体可以用作单一疗法的治疗剂或与另一种治疗剂组合使用。当用作治疗剂时，抗体可以经优化，例如，经亲和力成熟，以改善生物化学和/或生物物理特性和/或在给予人患者时减少或消除免疫原性。抗体抑制TIM‑3结合TIM‑3配体，例如，半乳凝素‑9，磷脂酰丝氨酸(PtdSer)和癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)。所公开的抗体可以用于抑制体外或体内肿瘤细胞的增殖。当给予人癌症患者或动物模型时，抗体抑制或减少人患者或动物模型中的肿瘤生长。

Description

抗TIM-3抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月1日提交的美国临时专利申请号62/754,383的优先权和权益，其全部公开通过引用纳入本文。

技术领域

本发明的领域是分子生物学、免疫学和肿瘤学。更具体地，该领域是治疗性抗体。

背景技术

自针对黑色素瘤的

(伊匹单抗，百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb))于2011年获批，免疫检查点抑制剂已成为一种有希望的分子类型用于治疗开发(例如，针对PD-1、PD-L1和CTLA-4的那些)。开发免疫检查点抑制剂药物的多家大型公司包括百时美施贵宝公司、默克公司(Merck&Co.)、罗氏公司(Roche)、阿斯利康公司(AstraZeneca)等。免疫治疗的开发战略和投资连同令人信服的临床疗效一起促成了多个新获批的抗PD(L)-1药物：

(派姆单抗(pembrolizumab)，默克公司)，

(纳武单抗(nivolumab)，百时美施贵宝公司)，

(阿特珠单抗(atezolizumab)，罗氏公司)，

(阿维单抗(avelumab)，默克雪兰诺公司(EMD Serono))，和

(度伐鲁单抗(durvalumab)，阿斯利康公司)。

PD-1/PD-L1检查点抑制剂藉由其令人信服的临床功效和安全性为组合免疫治疗方法奠定了坚实的基础。这些策略包括将PD-1途径抑制剂与T细胞上表达的其他免疫检查点蛋白的抑制剂组合。一种这类检查点蛋白是T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)。

Tim-3最初被鉴定为产生IFN-g的CD4+T辅助1(Th1)和CD8+T细胞毒性1(Tc1)T细胞上选择性表达的分子(Monney等(2002)Nature415(6871):536-41)。TIM-3还表达于许多免疫细胞类型的表面，包括T细胞的某些亚组诸如FOXP3⁺CD4⁺T调节性细胞(Treg)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞和肿瘤相关树突状细胞(TADC)(Clayton等(2014)J.Immunol.192(2):782-791；Jones等(2008)J.Exp.Med.205(12):2763-79；Hastings等(2009)Eur.J.Immunol39(9):2492-2501；Seki等(2008)Clin Immunol127(1):78-88；Ju等(2010)J Hepatol 52(3):322-329；Anderson等(2007)Science 318(5853):1141-1143；Baitsch等(2012)PLOSOne 7(2):e30852；Ndhlovu等(2012)Blood 119(16):3734-3743)。已经报道了TIM-3的推定配体，包括磷脂酰丝氨酸(PtdSer；Nakayama等,(2009)Blood 113(16):3821-30)，半乳凝素-9(Gal-9)(Zhu等(2005)Nat Immunol 6(12):1245-52)，高迁移率族蛋白1(HMGB1)(Chiba等(2012)Nat Immunol 13(9):832-42)，和癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)(Huang等(2015)Nature 517(7534):386-90)。

研究表明TIΜ-3调节免疫应答的各个方面。TIM-3及其配体半乳凝素-9(Gal-9)的相互作用诱导细胞死亡。这种相互作用的体内阻断在实验模型中加剧自身免疫并消除耐受，这表明TIM-3/Gal-9相互作用负调节免疫应答(Zhu等(2005),同上；Kanzaki等(2012)Endocrinology 153(2):612-620)。TIM-3的抑制作用还增强体内实验性自身免疫性脑脊髓炎的病理严重程度(Monney等(2002)Nature 415:536-541；Das,等(2017)Immunol Rev 276(1):97-111)。在使用来自多发性硬化症(Koguchi等(2006)J Exp Med 203(6):1413-1418)、克罗恩病(CD)(Morimoto等(2011)Scand J Gastroenterol 46(6):701-709)和类风湿关节炎(RA)(Liu等(2010)Clin Immunol 137(2):288-295；Li等(2014)PLoS One 9(2):e85784)人患者的材料进行的研究中，观测到T细胞上的Tim-3表达水平与自身免疫疾病进展呈负相关，表明TIM-3对T细胞具有免疫抑制作用。除了对T细胞的作用外，TIM-3/Gal-9相互作用还通过促进胞内病原体的巨噬细胞清除而导致抗微生物活性(Sakuishi等(2011)Trends Immunol 32(8):345-349)，并且TIM-3还可以通过其独特的结合裂隙结合磷脂酰丝氨酸来促进凋亡细胞的清除(DeKruyff等(2010)J Immunol 184(4):1918-1930)。

Tim-3被认为是癌症免疫疗法的潜在候选物，部分是因为其在肿瘤浸润淋巴细胞中上调，包括Foxp3+CD4+Treg和耗竭的CD8+T细胞(构成许多人癌症的肿瘤微环境中免疫抑制的两种重要的免疫细胞群)(McMahan等(2010)J.Clin.Invest.120(12):4546-4557；Jin等(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107(33):14733-8；Golden-Mason等(2009)J Virol 83(18):9122-9130；Fourcade等(2010)J Exp Med 207(10):2175-86；Sakuishi等(2010)JExp Med 207(10):2187-94；Zhou等(2011)Blood 117(17):4501-4510；Ngiow等(2011)Cancer Res.71(10):3540-51,Yan,等(2013)PLoS ONE 8(3):e58006)。假设T细胞失调的分子机制始于CD8+T细胞上Tim-3与肿瘤细胞上其配体半乳凝素-9的相互作用，这导致Tim-3胞质尾在酪氨酸256和263处的磷酸化，进而导致由Tim-3胞质尾释放HLA-B相关转录本3(Bat3)和具有催化活性的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)。Bat3和Lck由Tim-3的解离导致无活性磷酸化Lck的积累，这可能是观察到的T细胞功能失调的原因(Rangachari,等(2012)Nat Med 18(9):1394-400)。

此外，瘤内Tim-3+FoxP3+Treg细胞似乎表达大量Treg效应分子(IL-10、穿孔素和颗粒酶)。Tim-3+Treg被认为可以促进肿瘤环境中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的功能失常表型的发展(Sakuishi,等(2013)OncoImmunology 2(4):e23849)。已经报道了Tim-3在髓样区室中起作用。已经证明Tim-3的T细胞表达将以半乳凝素-9依赖性的方式促进CD11b+Gr-1+髓样抑制细胞(MDSC)(Dardalhon,等(2010)J Immunol 185(3):1383-92)。此外，因为Tim-3在肿瘤相关树突状细胞(TADC)上被特异性上调，所以能够干扰感测释放自经历坏死性细胞死亡的细胞的DNA。Tim-3结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)，从而防止HMGB1结合释放自垂死细胞的DNA以及介导通过针对晚期糖基化末端(RAGE)产物的受体和/或Toll样受体(TLR)2和4路径向先天细胞的递送。Tim-3与HMGB1的结合抑制肿瘤组织中先天免疫应答的激活(Chiba,等(2012),同上)。综上所述，这些数据表明，Tim-3可以通过涉及髓样细胞和不同Tim-3/配体相互作用的T细胞外在机制进一步抑制抗肿瘤T细胞反应。

Tim-3/PD-1共阻断在抑制临床前小鼠肿瘤模型中肿瘤生长中的协同作用表明该共阻断调节功能失调CD8+T细胞和/或Treg的功能表型(Sakuishi等(2010),同上；Ngiow等(2011),同上)。事实上，除了用PD(L)-1进行体内共同阻断外，使用许多其他检查点抑制剂的共阻断增强了许多临床前肿瘤模型中的抗肿瘤免疫力并抑制了肿瘤的生长(Dardalhon等(2010),同上；Nglow等,Cancer Res 2011；Chiba等(2012),同上；Baghdadi等,CancerImmunol Immunother 2013；Kurtulus等(2015)J Clin Invest 125(11):4053-62；Huang等(2015),同上；Sakuishi等(2010),同上；Jing等(2015)J Immunother Cancer 3:2；Zhou等(2011),同上；Komohara等,Cancer Immunology Res.,2015)。

虽然检查点抑制剂诸如

和

和其他是成功的，但是仅部分患者经历到对于这些疗法的持久临床反应在临床试验中，已经证明一些类型的肿瘤对抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1单一疗法的反应很小。这些包括***癌，结肠直肠癌和胰腺癌。因此，对于这些无反应性疾病以及在反应性肿瘤类型内无反应的大多数人，需要改进的抗肿瘤疗法。

发明概述

本发明部分基于发现特异性结合人T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)的抗体家族。抗体包含基于抗体的互补决定区(CDR)的TIM-3结合位点。抗体可以单独用作治疗剂，或者可以与其他治疗剂(如其他免疫检查点抑制剂)联用。当用作治疗剂时，抗体可以经优化，例如，经亲和力成熟，以在给予人患者时改善生化性质(例如，亲和力和/或特异性)，以改善生物物理特性(例如，聚集、稳定性、沉淀和/或非特异性相互作用)，和/或以减少或消除免疫原性。

本文所述的抗体抑制TIM-3结合TIM-3配体，例如，半乳凝素-9，磷脂酰丝氨酸(PtdSer)和癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)。所公开的抗体可以用于抑制体外或体内肿瘤细胞的增殖。当给予人癌症患者或动物模型时，抗体抑制或减少人患者或动物模型中的肿瘤生长。

因此，在一个方面中，本公开涉及结合人TIM-3的分离抗体，其包含：(i)免疫球蛋白重链可变区，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDRH1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDRH2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDRH3；和(ii)免疫球蛋白轻链可变区，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDRL1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDRL2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDRL3。

在另一方面中，本公开涉及结合人TIM-3的分离抗体，其包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区选自下组：SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:34，而免疫球蛋白轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:33。

在另一方面中，本公开涉及结合人TIM-3的分离抗体，其包括包含氨基酸序列SEQID NO:24的免疫球蛋白重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的免疫球蛋白轻链可变区。

在另一方面中，本公开涉及结合人TIM-3的分离抗体，其包含选自下组的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：

(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:22的免疫球蛋白重链，和具有氨基酸序列SEQ IDNO:21的免疫球蛋白轻链；和

(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO:32的免疫球蛋白重链，和具有氨基酸序列SEQ IDNO:31的免疫球蛋白轻链。

在某些实施方式中，本公开涉及包含核苷酸序列的分离的核酸，所述核苷酸序列编码分离抗体的免疫球蛋白重链可变区和/或免疫球蛋白轻链可变区。

在某些实施方式中，本公开涉及包含核酸的表达载体，所述核酸编码分离抗体的免疫球蛋白重链可变区和/或免疫球蛋白轻链可变区。

在某些实施方式中，本公开涉及包含表达载体的细胞，所述表达载体包含核酸，所述核酸编码分离抗体的免疫球蛋白重链可变区和/或免疫球蛋白轻链可变区。

在某些实施方式中，本公开涉及产生包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括(a)在宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使所述宿主细胞生长；和(b)对包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽进行纯化。

在某些实施方式中，本公开涉及产生结合人TIM-3的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，该方法包括(a)在使宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使所述宿主细胞生长，从而产生抗体或抗体的抗原结合片段；和(b)纯化抗体或抗体的抗原结合片段。

在某些实施方式中，通过表面等离振子共振测量，抗体的KD为9.2nM或更低。

在某些实施方式中，本公开涉及分离抗体，其与本文所述的抗体竞争结合人TIM-3上的半乳凝素-9结合位点。

在某些实施方式中，本公开涉及分离抗体，其与本文所述的抗体竞争结合人TIM-3上的PtdSer结合位点。

在某些实施方式中，本公开涉及分离抗体，其与本文所述的抗体竞争结合人TIM-3上的癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)结合位点。

在某些实施方式中，本公开涉及分离抗体，其与本文所述的抗体竞争结合人TIM-3上的半乳凝素-9结合位点、PtdSer结合位点和CEACAM1结合位点。

在某些实施方式中，本公开涉及分离抗体，其结合与本文所述抗体相同的人TIM-3蛋白上的表位，其中所述表位包括人TIM-3蛋白的P59、F61、E62和D120。

在某些实施方式中，本公开涉及下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的方法，所述方法包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的本文所述的抗体，以下调至少一种耗竭标志物。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的第二治疗剂，例如，抗PD-L1抗体。在某些实施方式中，所述耗竭标志物是CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。

在某些实施方式中，本公开涉及增强T细胞活化的方法，所述方法包括将T细胞暴露于有效量的本文所述的抗体，从而增强所述T细胞的活化。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述T细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

在某些实施方式中，本公开涉及抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞暴露于有效量的本文所述的抗体，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

在某些实施方式中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

在某些实施方式中，本公开涉及抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括将哺乳动物暴露于有效量的本文所述的抗体，从而抑制哺乳动物中肿瘤生长。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述哺乳动物暴露于有效量的第二治疗剂。

在某些实施方式中，本公开涉及治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的抗体。在某些实施方式中，所述方法还包括给予哺乳动物有效量的第二治疗剂。在某些实施方式中，所述癌症选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体，用于下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的方法，所述方法包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的抗体，以下调至少一种耗竭标志物。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的第二治疗剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是抗PD-L1抗体。在某些实施方式中，所述耗竭标志物是CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体，用于增强T细胞活化的方法，所述方法包括将T细胞暴露于有效量的抗体，从而增强所述T细胞的活化。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述T细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体，用于抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞暴露于有效量的抗体，从而抑制细胞的增殖。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体，用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括将哺乳动物暴露于有效量的抗体，从而抑制肿瘤的增殖。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述哺乳动物暴露于有效量的第二治疗剂。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体，用于治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给予有效量的抗体。在某些实施方式中，所述方法还包括给予由此需要的哺乳动物有效量的第二治疗剂。在某些实施方式中，所述癌症选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体在制备用于下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是抗PD-L1抗体。在某些实施方式中，所述耗竭标志物是CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体在制备用于增强T细胞活化的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体在制备用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

在某些实施方式中，本公开涉及本文所述的抗体在制备用于治疗哺乳动物中癌症的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。在某些实施方式中，所述癌症选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。

在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。

参考下述附图、详细描述和权利要求，本发明的这些和其它方面以及优势将是容易理解的。如本文所用，“包括/包含”表示不存在限制，并且所引用的示例是非限制性的。

附图说明

本发明的前述内容和其他目的、特征和优点基于诸如附图所示内容的优选实施方式的描述将是显而易见的。相似的参考元素标识相应附图中的共同特征。附图不一定按比例绘制，而是将重点放于阐述本发明的原理，其中：

图1描述了ELISA分析的结果，其显示抗TIM-3抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)结合人、猕猴和狨猴(marmoset)TIM-3-His蛋白。

图2A描述了ELISA竞争试验的结果，其中抗TIM-3抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)产生人半乳凝素-9和人TIM-9之间结合的剂量依赖性阻断，其IC50为2.4nM。图2B描述了ELISA竞争试验的结果，其比较了与半乳凝素-9与多种已知抗TIM-3抗体的竞争。图2C描述了ELISA竞争试验的结果，其中抗TIM-3抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)IgG2h(FN-AQ，322A)-delK(M6903)，而非同种型对照抗体，以浓度依赖性方式抑制huTIM-3-生物素结合huGal-9，其IC₅₀为7.46±0.052nM。图2D描述了ELISA竞争试验的结果，其中抗TIM-3抗体M6903，而非同种型对照抗体，以剂量依赖性方式抑制rhTIM-3-Fc结合His标签标记的CEACAM1，其IC₅₀为0.353±0.383nM(0.053±0.057μg/mL)。

图3A-D显示了与M6903复合的人TIM-3的晶体结构。图3A显示了M6903的Fab部分(上部结构)的概况，其结合TIM-3，以表面形式显示。TIM-3(底部结构)上进行的大量接触显示为TIM-3较亮部分。图3B显示了TIM-3的表位热点残基(例如，P59和F61和E62)。图3C显示了ptdSer(浅色棒)的极性头基团和配位的钙离子(球体)已通过与鼠TIM-3的结构叠加而建模为结合M6903的TIM-3的结构(DeKruyff等(2010),同上)。ptdSer的结合位点与M6903的重链Y59(球体群)的位置重合。点线显示了TIM-3上D120到ptdSer或M6903的氢键。图3D用虚线显示了M6903与TIM-3的CEACAM-1结合残基的极性相互作用。

图4描述了具有抗TIM-3抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)表位图谱的TIM-3的晶体结构模型，其显示了残留在免疫球蛋白折叠的一个β折叠面上的P59、F61、E62、I114、N119和K122残基。

图5提供了显示CD14⁺单核细胞上抗TIM-3抗体M6903的靶标占有率随抗TIM-3浓度增加而增加的图表。用新鲜人全血孵育抗TIM-3抗体M6903的系列稀释液1小时。用抗TIM-3(2E2)-APC(其与抗TIM-3抗体竞争TIM-3结合)通过流式细胞术测量CD14+细胞上未占用的TIM-3。所有10个供体的平均EC50为111.1±85.6ng/ml。该图表显示了10个总供体中的4个代表性供体(KP46233、KP46231、KP46315和KP46318)。

图6提供了显示M6903有效阻断凋亡Jurkat细胞上PtdSer和rhTIM-3的相互作用的图表。在进行流式细胞术分析前，通过用星形孢菌素(Staurosporine)(2μg/mL，18小时)处理在Jurkat细胞中诱导细胞凋亡，导致TIM-3配体PtdSer的表面表达。在用抗HEL IgG2h同种型对照或M6903的系列稀释液预孵育后，通过流式细胞术测量rhTIM-3-Fc的MFI来评估凋亡Jurkat细胞表面上rhTIM-3-Fc PtdSer的结合。虽然同种型对照没有作用，但是M6903阻断rhTIM-3和PtdSer的相互作用，IC₅₀为4.438±3.115nM(0.666±0.467μg/ml)。使用Sigmoid剂量反应方程将非线性拟合线应用于图表。

图7A和7B描述了显示M6903以剂量依赖性方式增加CEF抗原特异性T细胞活化的图表。M6903和必特芙普(bintrafusp)的组合进一步增强了这种活化。在M6903存在的情况下，用40μg/ml CEF病毒肽库处理PBMC(A)6天或(B)4天。在图7A中，通过多次实验计算的IFN-γ产生测得，相较于CEF试验中的同种型对照，M6903剂量依赖性地增强T细胞活化，EC50为1±1.3μg/mL。进行非线性回归分析，并表示平均值和SD。在图7B中，M6903的系列稀释液与10μg/mL同种型对照或必特芙普α组合。与必特芙普α的组合导致IFN-γ产生的进一步增加。表示平均值和SD(p<0.05)。

图8A和8B提供了显示M6903剂量依赖性增强同种异体抗原特异性T细胞活化的图表。处理后2天，通过测量共培养的经辐照的Daudi细胞和人T细胞的上清液中的IFN-γ在同种异体单向MLR试验中评估T细胞活化。在图8A中，用同种型对照或M6903的系列稀释液处理共培养的细胞。M6903剂量依赖性地增强同种异体抗原特异性T细胞活化，EC50为116±117ng/mL。在图8B中，用与10μg/mL同种型对照、阿维单抗或必特芙普组合的M6903的系列稀释液处理共培养的细胞。M6903和阿维单抗或必特芙普的组合进一步增强了T细胞活化。进行非线性回归分析，并表示两个图表的平均值±SD。

图9A和9B提供了证明M6903联合阿维单抗或必特芙普在超级抗原SEB试验中展现出活性增强的图表。使用100ng/mL SEB与单独10mg/mL M6903(或同种型对照)或其与阿维单抗或必特芙普α的组合处理人PBMC9天。然后用培养基洗涤细胞一次，并用SEB和相同抗体再刺激2天。收获上清液并通过IFN-γELISA测量IFN-γ。M6903、阿维单抗和必特芙普α都增加经SEB刺激的T细胞中的IFN-γ产生，并且该作用通过将M6903与其他任何一种抗体结合增强。图9A示显示了评估与阿维单抗或必特芙普α组合的M6903的实验，图9B显示了评价仅与阿伐单抗α组合的M6903的实验。

图10描述了使用M6903、抗-PdtSer和抗Gal9的CEF抗原特异性T细胞试验的结果。在所指示的一种或多种抗体存在的情况下用40μg/ml CEF病毒肽库处理PBMC 5天。抗Gal-9和抗PtdSer的组合具有与单独的M6903相似的活性，这表明抗TIM-3活性可能需要阻断Gal-9和PtdSer(比较方框中列出的数据)。

图11A-11B描述了12个经抗TIM-3抗体染色的肿瘤TMA中通过IHC测量的TIM-3表达的定量分析。在图11A中，通过中值表达对该图表进行排序，而在图11B中，通过去除异常值后的平均表达式对图表进行排序。

图12描述了8种肿瘤组织的mIF染色以鉴定在肿瘤微环境(TME)中表达TIM-3的免疫细胞。CD3和CD68分别用作淋巴细胞和巨噬细胞的标志物。使用mIF分析对整个肿瘤TMA的TIM-3⁺CD3⁺淋巴细胞和TIM-3⁺CD68⁺巨噬细胞百分比定量。

图13描述了使用流式细胞术分析在NSCLC组中的TIM-3表达。在活CD3+细胞中，观察到TIM-3表达在CD8+T细胞上最高，其次是CD4+T细胞和Treg。各点代表单独样品。线代表各免疫亚组的中值。

图14A-C证明了M6903与阿维单抗的组合减少TIL中LAG-3、PD-1和TIM-3的表达。huTIM-3KI小鼠经皮下(s.c.)接种MC38细胞(3x10⁵)，并用同种型对照(20mg/kg)、阿维单抗(7mg/kg)、M6903(10mg/kg)或M6903+阿维单抗处理6天。然后，通过流式细胞术分析肿瘤的活CD45+细胞占总细胞的百分比(图14A)，在CD45+门中的NK、NKT、CD3、CD4、CD8或Treg细胞百分比(图14B)，和共表达CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3的CD45+门内的CD4和CD8细胞百分比(图14C)。对于所示各种情况，从左到右显示的四个柱是：同种型对照、阿维单抗、M6903、M6903+阿维单抗。值表示为平均值±SEM。P值通过未配对的t检验分析计算得出，并表示各组之间相对于同种型对照的显著性差异；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

图15A-C证明了M6903和阿维单抗(作为单一疗法或组合)降低了B-huTIM-3KI小鼠中的MC38肿瘤体积。B-huTIM-3KI小鼠经肋部皮下接种MC38(5x10⁵细胞)，然后经同种型对照(20mg/kg)、M6903(10mg/kg)、阿维单抗(20mg/kg)或M6903+阿维单抗处理。图15A显示了平均肿瘤体积和SEM，而图15B显示了个体肿瘤体积。在图15C中，分析了存活并计算了中值存活。

图16A-B证明了M6903和必特芙普α(作为单一疗法或组合)降低了B-huTIM-3KI小鼠中的MC38肿瘤体积。B-huTIM-3KI小鼠经肋部皮下接种MC38(1x10⁶细胞)，然后经同种型对照(20mg/kg)、M6903(10mg/kg)、必特芙普α(24mg/kg)或M6903+必特芙普α处理。图16A显示了平均肿瘤体积和SEM，而图16B显示了个体肿瘤体积。

具体实施方式

本文公开的抗TIM-3抗体基于已经根据结合和中和人T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)活性选择的某些单克隆抗体的抗原结合位点。抗体包含定义TIM-3结合位点的免疫球蛋白可变区CDR序列。

考虑到这些抗体的中和活性，它们能够用于抑制某些类型的癌细胞的生长和/或增殖。当用作治疗剂时，抗体可以经优化，例如，经亲和力成熟，以改善生物化学特性和/或生物物理特性和/或在给予人患者时减少或消除免疫原性。本发明的各种特征和方面将在下文更详细地讨论。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“抗体”意指完整的抗体(例如，完整单克隆抗体)或抗体的抗原结合片段，包括经优化、工程改造或化学偶联的完整抗体或抗体的抗原结合片段(例如，噬菌体展示抗体，其包括完全人抗体、半合成抗体或完全合成抗体)。已经优化的抗体的示例是亲和力成熟的抗体。已经工程改造的抗体的示例是Fc优化的抗体，抗体融合蛋白和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗原结合片段的示例包括Fab，Fab’，F(ab’)₂，Fv，单链抗体(例如，scFv)，微抗体(minibody)和双抗体(diabody)。偶联毒素部分的抗体是化学偶联的抗体的示例。例如，抗体融合蛋白包括与可溶性配体(如细胞因子)或与细胞受体蛋白的胞外域遗传融合的抗体。

I.结合人TIM-3的抗体

本文所公开的抗体包含：(a)包含CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3的免疫球蛋白重链可变区和(b)包含CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3的免疫球蛋白轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区共同限定用于结合TIM-3蛋白的单结合位点。

在一些实施方式中，抗体包含：(a)包含CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3的免疫球蛋白重链可变区和(b)免疫球蛋白轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区共同限定用于结合TIM-3的单结合位点。CDR_H1包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；CDR_H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；和CDR_H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3序列***免疫球蛋白FR序列(SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)之间。

在一些实施方式中，抗体包含(a)包含CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3的免疫球蛋白轻链可变区和(b)免疫球蛋白重链可变区，其中IgG轻链可变区和IgG重链可变区共同限定用于结合TIM-3的单结合位点。CDR_L1包含氨基酸序列SEQ ID NO:4；CDR_L2包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和CDR_L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3序列***免疫球蛋白FR序列(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)之间。

在一些实施方式中，抗体包含：(a)包含CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3的免疫球蛋白重链可变区和(b)包含CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3的免疫球蛋白轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区共同限定用于结合TIM-3的单结合位点。CDR_H1是氨基酸序列SEQ ID NO:1；CDR_H2是氨基酸序列SEQ ID NO:2；和CDR_H3是氨基酸序列SEQ ID NO:3。CDR_L1是氨基酸序列SEQ ID NO:4；CDR_L2是氨基酸序列SEQ ID NO:5；和CDR_L3是氨基酸序列SEQ ID NO:6。

在其他实施方式中，本文所公开的抗体包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。在一些实施方式中，抗体包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:34。

在一些实施方式中，抗体包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:23和SEQID NO:33。

在一些实施方式中，抗体包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:34，所述免疫球蛋白轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:52、SEQID NO:54、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:33。

在一些实施方式中，抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的免疫球蛋白重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的免疫球蛋白轻链可变区。

在某些实施方式中，本文所公开的抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一些实施方式中，抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链选自下组：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:32。

在其他实施方式中，抗体包含免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白轻链选自下组：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:31。

在一些实施方式中，抗体包含：(i)包含选自下组的氨基酸序列的免疫球蛋白重链：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:32；和(ii)选自下组的免疫球蛋白轻链：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:31。

在一些实施方式中，抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的免疫球蛋白重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的免疫球蛋白轻链。

在某些实施方式中，结合TIM-3的分离抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:32的整个可变区或框架区序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合TIM-3的分离抗体包含免疫球蛋白重链可变区和氨基酸序列，所述免疫球蛋白重链可变区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR_H1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR_H2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR_H3；和与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:32的整个可变区或框架区序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的相同性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，结合TIM-3的分离抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:31的整个可变区或框架区序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合TIM-3的分离抗体包含免疫球蛋白轻链可变区和氨基酸序列，所述免疫球蛋白轻链可变区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR_L1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR_L2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR_L3；和与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:31的整个可变区或框架区序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的相同性的氨基酸序列。

序列相同性可以本领域技术范围内的多种方式确定，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所使用的算法进行BLAST(碱基局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))分析(Karlin等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Altschul,(1993)J.Mol.Evol.36,290-300；Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402，通过引用纳入)经定制用于序列相似性搜索。有关搜索序列数据库中基本问题的讨论，参见Altschul等,(1994)NatureGenetics 6:119-129，其全部内容通过引用纳入本文。本领域技术人员能够确定用于测量比对的合适参数，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。柱状图、描述、比对、期望(即用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数处于默认设置。blastp，blastx，tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919，通过引用完整地纳入)。可以如下调整4个blastn参数：Q＝10(缺口产生罚分(gap creationpenalty))；R＝10(缺口延伸罚分(gap extension penalty))；wink＝1(在查询中每个wink.sup.th位置生成字命中(word hit))；和gapw＝16(设置在其中生成缺口比对的窗口宽度)。等效Blastp参数设置可以为Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索还可以使用NCBI(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))BLAST高级选项参数进行(例如，-G，开放缺口成本(Cost to open gap)[整数]:默认值＝对核苷酸为5/对蛋白质为11；-E，延伸缺口的成本(Cost to extend gap)[整数]:默认值＝对核苷酸为2/对蛋白质为1；-q，核苷酸错配罚分(Penalty for nucleotide mismatch)[整数]:默认值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励(reward for nucleotide match)[整数]:默认值＝1；-e，预期值(expect value)[实数]:默认值＝10；-W，字大小[整数]:默认值＝核苷酸为11/megablast为28/蛋白质为3；-y，以比特计的blast延伸的下降(X)(Dropoff(X)for blastextensions in bits):默认值＝blastn为20/其它为7；-X，缺口比对的X下降值(X dropoffvalue for gapped alignment)(以比特计):默认值＝所有程序为15，不适用于blastn；和–Z，最终X下降值(final X dropoff value for gapped alignment)(以比特计):blastn为50，其它为25)。也可以使用用于成对蛋白质比对的ClustalW(默认参数可能包括，例如Blosum62矩阵和缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.1)。GCG软件包版本10.0中提供的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(缺口产生罚分)和LEN＝3(缺口延伸罚分)，并且蛋白质比较中的等效设置为GAP＝8和LEN＝2。

在前述个实施方式中，本文考虑的是一起结合TIM-3的免疫球蛋白重链可变区序列和/或轻链可变区序列可以包含重链和/或轻链可变区的框架区中的氨基酸改变(例如，至少1、2、3、4、5或10个氨基酸取代、缺失或添加)。在某些实施方式中，氨基酸改变是保守取代。如本文所用，术语“保守取代”指由结构相似的氨基酸取代。例如，保守取代可包括下组内的那些：Ser和Cys；Leu，Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe，Tyr和Trp；和Gln，Asn，Glu，Asp和His。保守取代也可以通过BLAST(碱基局部比对搜索工具)算法，BLOSUM取代矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM取代:p矩阵(例如，PAM 250矩阵)来定义。

在某些实施方式中，抗体结合TIM-3的K_D为20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或更低除非另有说明，否则K_D值通过表面等离振子共振来确定，例如如实施例1.9中所述。

在一些实施方式中，单克隆抗体与本文所公开的任何抗TIM-3抗体(例如，M6903)结合TIM-3上的相同表位。在一些实施方式中，单克隆抗体与本文所公开的任何抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3。例如，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的半乳凝素-9结合结构域。在另一个实例中，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的PtdSer结合结构域。在另一个实例中，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的CEACAM1结合结构域。在进一步的实例中，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的半乳凝素-9结合结构域和PtdSer结合结构域。在进一步的实例中，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的半乳凝素-9结合结构域和PtdSer结合结构域。在另一个实例中，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的PtdSer结合结构域和CEACAM1结合结构域。在另一个实例中，单克隆抗体可以与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合TIM-3的半乳凝素-9结合结构域、PtdSer结合结构域和CEACAM1结合结构域。

本领域已知用于确定抗体是否与本文所述抗TIM-3抗体结合相同的表位，或者与本文所述抗TIM-3抗体竞争结合半乳凝素-9、PtdSer和/或CEACAM1的竞争试验。示例性竞争试验包括免疫试验(例如，ELISA试验、RIA试验)，BIAcore分析，生物层干涉法和流式细胞术。

通常，竞争试验涉及使用结合固体表面或在细胞表面表达的抗原(例如，TIM-3蛋白或其片段)，测试TIM-3结合抗体和参比抗体(例如，抗体M6903)。参比抗体被标记，而测试抗体未被标记。通过确定测试免疫球蛋白存在情况下与固体表面或细胞结合的标记的参比抗体的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗体过量存在(例如，1x，5x，10x，20x或100x)。通过竞争试验鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参比抗体结合相同或相似(例如，重叠)表位的抗体，和结合足够接近参比抗体所结合的表位，从而发生抗体空间位阻的邻近表位的抗体。

在示例性竞争试验中，使用商购可及的试剂将参比TIM-3抗体(例如，抗体M6903)生物素化。生物素化的参比抗体与测试抗体或未标记参考抗体(自我竞争对照)的系列稀释液混合，得到测试抗体(或未标记的参比抗体)与标记的参比抗体的各种摩尔比(例如，1x、5x、10x、20x或100x)的混合物。将抗体混合物添加到TIM-3(例如，TIM-3胞外域)多肽涂覆的ELISA板。然后洗涤板，并将HRP(辣根过氧化物酶)-链霉亲和素添加到板上作为检测试剂。添加本领域熟知的生色底物(例如，TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)或ABTS(2,2”-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐))后，检测与靶抗原结合的标记的参比抗体的量。使用SpectraMax M2光谱仪(分子仪器公司(Molecular Devices))测量光密度读数(OD单位)。由没有任何竞争抗体的孔确定对应0％抑制的OD单位。由没有任何标记的参比抗体或测试抗体的孔确定对应100％抑制的OD单位，即试验背景。各浓度下测试抗体(或未标记的参比抗体)对TIM-3标记的参比抗体的抑制百分比如下所示计算：抑制％＝(1-(OD单位–100％抑制)/(0％抑制–100％抑制))*100。本领域技术人员将理解的是可以使用本领域熟知的多种检测***进行竞争试验。

可以在两个方向上进行竞争试验，以确保标记物的存在不会干扰或以其他方式抑制结合。例如，在第一方向上，参比抗体被标记而测试抗体未被标记，而在第二方向上，测试抗体被标记而参比抗体未被标记。

如果过量的一种抗体(例如1x、5x、10x、20x或100x)抑制另一种抗体的结合，例如在竞争结合试验中测量为至少50％、75％、90％、95％或99％，那么测试抗体与参比抗体竞争与抗原的特异性结合。

如果抗原中基本上所有减少或消除一个抗体结合的氨基酸突变都减少或消除了另一种抗体的结合，可以确定两个抗体结合同一表位。如果减少或消除一个抗体结合的氨基酸突变中只有部分减少或消除了另一种抗体的结合，可以确定两个抗体结合重叠表位。

II.抗体的生产

本领域已知用于产生抗体的方法，诸如本文公开的那些。例如，可以使用本文提供的序列信息化学合成编码轻链可变区和/或重链可变区的DNA分子。可以将合成DNA分子与其他合适的核苷酸序列连接，包括例如恒定区编码序列和表达控制序列，以产生编码所需抗体的常规基因表达构建体。产生确定的基因构建体在本领域常规技术范围内。

可以将编码所需抗体的核酸纳入(连接)到表达载体中，该表达载体可以通过常规转染或转化技术引入宿主细胞中。示例性宿主细胞是大肠杆菌细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾293(HEK 293)细胞，HeLa细胞，仓鼠幼崽肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和此外不会产生IgG蛋白的骨髓瘤细胞。转化的宿主细胞可以在允许宿主细胞表达编码免疫球蛋白轻链和/或重链可变区的基因的条件下生长。

特定表达和纯化条件将根据所采用的表达***而变化。例如，如果基因将在大肠杆菌中表达，那么首先通过将工程改造的基因置于合适的细菌启动子(例如，Trp或Tac)和原核信号序列的下游来克隆到表达载体中。表达的分泌蛋白累积在折射体或包涵体中，并且可以在通过法式压榨或超声处理破坏细胞后收获。然后使折射体溶解，并且通过本领域已知的方法将蛋白质重折叠和切割。

如果该工程改造的基因将在真核宿主细胞(例如，CHO细胞)中表达，那么首先将其***表达载体中，所述表达载体包含合适的真核启动子，分泌信号，多聚A序列和终止密码子，和任选地，可以包含增强子和各种内含子。任选地，该表达载体包含编码全部或部分恒定区的序列，能够使全部或部分重链或轻链表达。可以使用常规技术将基因构建体引入真核宿主细胞。宿主细胞表达V_L或V_H片段，V_L-V_H异二聚体，V_H-V_L或V_L-V_H单链多肽，完整的重或轻免疫球蛋白链，或其部分，其各自可以连接具有其他功能(例如，细胞毒性)的部分。在一些实施方式中，用表达多肽的单一载体转染宿主细胞，所述多肽表达全部或部分重链(例如，重链可变区)或轻链(例如，轻链可变区)。在一些实施方式中，用单一载体转染宿主细胞，所述单一载体编码(a)包含重链可变区的多肽和包含轻链可变区的多肽，或(b)整个免疫球蛋白重链和整个免疫球蛋白轻链。在其他实施方式中，用超过一种表达载体(例如，一种表达载体，其表达包含整个或部分重链或重链可变区的多肽，和另一种表达表达载体，其表达包含整个或部分轻链或轻链可变区的多肽)共转染宿主细胞。

包含免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区的多肽可以通过这样产生：在允许多肽表达的条件下使经编码这类可变区的表达载体转染的宿主细胞生长(培养)。表达后，可以使用本领域熟知的技术，例如亲和标签，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸标签，来收获和纯化或分离多肽。

结合人TIM-3的单克隆抗体或该抗体的抗原结合片段可以通过生长(培养)宿主细胞来产生，所述宿主细胞经下述内容转染：(a)编码完整或部分免疫球蛋白重链的表达载体，和编码完整或部分免疫球蛋白轻链的单独的表达载体；或(b)编码两条链(例如，全部或部分重链和轻链)的单一表达载体，在允许两条链表达的条件下。使用本领域熟知的技术，例如蛋白A，蛋白G，亲和标签，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸标签，可以收获和纯化或分离完整抗体(或抗原结合片段)。本领域普通技术人员能够由单一表达载体或两个单独的表达载体表达重链和轻链。

III.抗体修饰

人单克隆抗体可以分离自或选自噬菌体展示库，包括免疫库，原初和合成库。本领域已知抗体噬菌体展示文库，参加例如，Hoet等,Nature Biotech.23:344-348,2005；Soderlind等,Nature Biotech.18:852-856,2000；Rothe等,J.Mol.Biol.376:1182-1200,2008；Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86,2000；和Krebs等,J.Immunol.Meth.254:67-84,2001。当用作治疗剂时，通过噬菌体展示分离的人抗体可以经优化，例如，经亲和力成熟，以改善生化性质(例如，亲和力和/或特异性)，以改善生物物理特性(例如，聚集、稳定性、沉淀和/或非特异性相互作用)，和/或以减少免疫原性。亲和力成熟过程在本领域普通技术人员的范围内。例如，可以通过DNA改组，链改组，CDR改组，随机诱变和/或位点特异性诱变将多样性引入免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链。

在一些实施方式中，分离的人抗体在框架区包含一个或多个体细胞突变。在这些情况中，可以将框架区修饰为人种系序列以优化抗体(即称为种系化(germlining)的过程)。

通常，优化的抗体对抗原的亲和力与衍生其的非优化的(或亲本)抗体至少相同或基本相同。优选地，相较于亲本抗体，优化的抗体对抗原具有更高的亲和力。

抗体片段

本发明的蛋白质和多肽还可包括抗体的抗原结合片段。示例性抗体片段包括scFv、Fv、Fab、F(ab’)₂和单域VHH片段，例如来自骆驼科动物的那些。

单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)，是重组多肽，它们通常结合抗原或受体；这些片段包含用或不用一个或多个互连接头相连的至少一个抗体可变轻链序列(V_L)片段和至少一个抗体可变重链氨基酸序列(V_H)片段。这样的接头可以是短的柔性肽，选来确保VL和VH结构域相连后正确的三维折叠，从而保留作为单链抗体片段来源的全抗体的靶分子结合特异性。通常，V_L或V_H序列的羧基末端通过这样的肽接头共价连接至互补V_L和V_H序列的氨基酸末端。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体文库展示或类似技术来产生。这些蛋白质可以在真核细胞中也可以在原核细胞(包括细菌)中生产。

单链抗体片段包含具有本文所述完整抗体可变区或互补决定区(CDR)中至少其一的氨基酸序列，但缺失那些抗体的全部或部分恒定域。这些恒定域对于抗原结合来说不是必需的，但是构成完整抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服采用包含部分或全部恒定区的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于不在生物分子与重链恒定区之间发生不希望有的相互作用或其他不希望有的生物活性。此外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可具有比完整抗体更高的毛细血管通透性，这令单链抗体片段能够更高效地寻址并结合至靶抗原结合位点。并且，抗体片段可以在原核细胞中以相对大的规模产生，从而促进其生产。此外，单链抗体片段相对较小使得它们比完整抗体更不会在接受者中引发免疫反应。

还可以有与完整抗体具有相同或相当的结合特征的抗体片段。这样的片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab’)₂片段。抗体片段可包含完整抗体的全部六个CDR，但包含少于全部这些区域、例如含三、四或五个CDR的片段同样具有功能。

恒定区

除非另行指明，恒定区抗体氨基酸残基根据Kabat,E.A..等(《免疫相关蛋白序列》(Sequences of proteins of immunological interest).第5版-美国卫生与公共服务部(US Department of Health and Human Services),NIH出版号91-3242,页码662,680,689(1991))中的Kabat EU索引编号。如本文所述的抗体及其片段(例如，亲本和优化的变体)可以经工程改造以包含具有或缺乏特定效应功能(例如，抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的某些恒定(即Fc)区。本领域已知人恒定区。

本发明的蛋白质和肽(例如，抗体)可包括免疫球蛋白的恒定区或恒定区片段、类似物、变体、突变体或衍生物。优选实施方式中，恒定区源自人免疫球蛋白重链，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。实施方式之一中，恒定区包括CH2结构域。另一实施方式中，恒定区包括CH2和CH3结合域或包括铰链-CH2-CH3。或者，恒定区可包括全部或部分铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。

实施方式之一中，恒定区包含降低对Fc受体亲和力或降低Fc效应功能的突变。例如，恒定区可包含消除IgG重链恒定区中糖基化位点的突变。一些实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297或Pro331的突变、缺失或***(氨基酸根据Kabat EU索引编号)。具体实施方式之一中，恒定区在对应于IgG1 Asn297的氨基酸位置含有突变。另一实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344或Pro378的突变、缺失或***。

一些实施方式中，恒定区含有源自人IgG2或IgG4重链的CH2结构域。优选地，CH2结构域包含消除CH2结构域中糖基化位点的突变。实施方式之一中，突变改变IgG2或IgG4重链CH2结构域内Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:98)氨基酸序列内的天冬酰胺。优选地，突变将天冬酰胺变成谷氨酰胺。或者，突变改变Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:98)氨基酸序列内苯丙氨酸和天冬酰胺两者。在实施方式之一中，Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:98)氨基酸序列被Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:99)氨基酸序列取代。Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:98)氨基酸序列内的天冬酰胺对应于IgG1的Asn297(Kabat EU索引)。

另一实施方式中，恒定区包括CH2结构域和至少部分铰链区。铰链区可以是源自免疫球蛋白重链例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。优选地，铰链区源自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他合适的类。更优选地，铰链区源自人IgG1重链。实施方式之一中，IgG1铰链区Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:100)氨基酸序列中的半胱氨酸被改变。一优选实施方式中，Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:100)氨基酸序列被Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys(SEQ ID NO:101)氨基酸序列取代。实施方式之一中，恒定区包括源自第一抗体同种型的CH2结构域和源自第二抗体同种型的铰链区。具体实施方式之一中，CH2结构域源自人IgG2或IgG4重链，而铰链区源自经改变的人IgG1重链。

抗体Fc部分与非Fc部分或Fc融合蛋白连接处附近的氨基酸改变可以显著提高Fc融合蛋白的血清半衰期(PCT公开文本WO 01/58957，其公开内容通过引用纳入本文)。因此，本发明蛋白质或多肽的连接区可含有相对于免疫球蛋白重链天然序列的改变，优选距连接点约10个氨基酸以内。这些氨基酸改变会引起疏水性增强。实施方式之一中，恒定区源自IgG序列，其中C末端的赖氨酸残基被替换。优选地，IgG序列的C末端赖氨酸被替换成非赖氨酸的氨基酸(例如丙氨酸或亮氨酸)以进一步提高血清半衰期。另一实施方式中，恒定区源自IgG序列，其中，恒定区C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:102)氨基酸序列具有消除潜在接合性T细胞表位的改变。例如，实施方式之一中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:102)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:103)氨基酸序列取代。其他实施方式中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:102)段内的氨基酸被例如甘氨酸或脯氨酸等其他氨基酸替换。在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或他类免疫球蛋白分子的C-末端附近产生Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:102)段氨基酸取代的方法可详见美国专利公开文本2003/0166877，其公开内容通过引用纳入本文。

本发明的适宜铰链区可源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他免疫球蛋白类别。IgG1铰链区有三个半胱氨酸，其中两个参与免疫球蛋白两重链之间的二硫键。这些半胱氨酸使得Fc部分之间二硫键的形成高效且一致。所以，本发明的优选铰链区源自IgG1，更优选源自人IgG1。优选实施方式中，人IgG1铰链区内的第一个半胱氨酸突变为其他氨基酸，优选丝氨酸。IgG2同种型铰链区有四个二硫键，它们倾向于促成重组***分泌期间的寡聚化和可能不正确的二硫键。适宜的铰链区可源自IgG2铰链，优选其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。已知IgG4的铰链区形成链间二硫键不大有效。然而，本发明的合适铰链区可以源自IgG4铰链区，优选含有增强重链衍生部分之间正确形成二硫键的突变(Angal S等，(1993)Mol.Immunol.,30:105-8)。

根据本发明，恒定区可包含源自不同抗体同种型的CH2和/或CH3结构域和铰链区，即杂交(hybrid)恒定区。例如，实施方式之一中，恒定区含有源自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和源自IgG1的突变铰链区。或者，杂交恒定区中可采用源自其他IgG亚类的突变铰链区。例如，可以采用能够有效形成两重链间二硫键的IgG4铰链突变形式。突变型铰链也可源自IgG2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。杂交恒定区的组装可见美国专利公开2003/0044423，其公开内容通过引用纳入本文。

根据本发明，恒定区可包含一处或多处本文所述的突变。Fc部分中突变的组合对延长血清半衰期和提高分子体内效力具有累加或协同效应。因此，示例性实施方式之一中，恒定区可包含(i)衍生自IgG序列的区域，其中Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:102)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:103)氨基酸序列替换；(ii)C-末端丙氨酸残基代替赖氨酸；(iii)衍生自不同抗体同种型的CH2结构域和铰链区，例如IgG2 CH2结构域和改变的IgG1铰链区；和(iv)消除IgG2衍生的CH2结构域内的糖基化位点的突变，例如IgG2衍生的CH2结构域内的Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:99)氨基酸序列而不是Gln-Phe-Asn-Ser(SEQID NO:98)氨基酸序列。

如果抗体用作治疗剂，那么可以使用标准体外偶联化学将其与效应剂诸如小分子毒素或放射性核素偶联。如果效应剂是多肽，那么抗体可以化学偶联效应剂或作为融合蛋白连接效应剂。融合蛋白的构建在本领域普通技术人员的范围内。

IV.抗体的使用

本公开的抗体可以用于下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的方法，所述方法包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的抗TIM-3抗体，以下调至少一种耗竭标志物，诸如CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。实施例6.2描述了测量耗尽标志物下调的方法。在某些实施方式中，该方法可以进一步包括将肿瘤微环境暴露于有效量的第二治疗剂，诸如免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂的示例包括靶向PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂，诸如抗PD-L1抗体(例如阿维单抗)。

本文所述的抗体也可以用于增强T细胞活化的方法中。该方法可以包括将T细胞暴露于有效量的抗TIM-3抗体，从而增强T细胞活化。在某些实施方式中，该方法进一步包括将T细胞暴露于有效量的第二治疗剂，例如免疫检查点抑制剂。用于测量T细胞活化的方法述于实施例5.3，并且可以包括测量来自通过暴露于CEF抗原而激活的人PBMC的IFN-γ产生。在某些实施方式中，该方法可以进一步包括将肿瘤微环境暴露于有效量的第二治疗剂，例如抗PD-L1抗体(例如阿维单抗)。

本文所公开的抗体可以用于治疗各种形式的癌症。在某些实施方式中，所述肿瘤或癌症可以选自下组：结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***癌、肾癌、***、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。在某些实施方式中，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。在某些实施方式中，癌症是转移性或局部晚期实体瘤。在某些实施方式中，不存在治疗癌症的标准疗法和/或癌症由至少一种先前治疗中复发和/或难治。癌细胞暴露于治疗有效量的抗体，以抑制癌细胞的增殖。在一些实施方式中，抗体抑制至少40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或100％的癌细胞增殖。

在一些实施方式中，抗TIM-3抗体用于治疗。例如，该抗体可以用于抑制哺乳动物(例如，人患者)中的肿瘤生长。在一些实施方式中，使用抗体抑制哺乳动物中肿瘤生长包括向哺乳动物给予治疗有效量的抗体。在其他实施方式中，抗TIM-3抗体可以用于抑制肿瘤细胞增殖。

在一些实施方式中，抗TIM-3抗体与另一治疗剂，诸如辐照(例如，立体定向辐照)或免疫检查点抑制剂(例如，靶向PD-1，PD-L1，或CTLA-4)联合给予。在一些实施方式中，抗TIM-3抗体与一种或多种下述治疗剂联合给予：抗PD1/抗PD-L1抗体，包括

(派姆单抗(pembrolizumab)，默克公司)，

(纳武单抗(nivolumab)，百时美施贵宝公司)，

(阿特珠单抗(atezolizumab)，罗氏公司)，

(阿维单抗(avelumab)，默克雪兰诺公司)，

(度伐鲁单抗(durvalumab)，阿斯利康公司)，TGF-β途径靶向剂，包括高鲁尼替(galunisertib)(LY2157299一水合物，小分子TGF-βRI的激酶抑制剂)，LY3200882(Pei等(2017)Cancer Res 77(13增刊):摘要955公开的小分子激酶抑制剂TGF-βRI)，麦特丽珠单抗(Metelimumab)(靶向TGF-β1的抗体，参见Colak等(2017)Trends Cancer3(1):56-71)，弗雷索单抗(Fresolimumab)(GC-100；靶向TGF-β1和TGF-β2的抗体)，XOMA 089(靶向TGF-β1和TGF-β2的抗体；参见Mirza等(2014)InvestigativeOphthalmology&Visual Science 55:1121)，AVID200(TGF-β1和TGF-β3阱，参见Thwaites等(2017)Blood 130:2532)，曲贝森(Trabedersen)/AP12009(TGF-β2反义寡核苷酸，参见Jaschinski等(2011)Curr Pharm Biotechnol.12(12):2203-13)，Belagen-pumatucel-L(靶向TGF-β2的肿瘤细胞疫苗，参见例如，Giaccone等(2015)Eur J Cancer 51(16):2321-9)；Colak等(2017),同上中所述TGB-β途径靶向剂，包括Ki26894、SD208、SM16、IMC-TR1、PF-03446962、TEW-7197和GW788388；国际专利公开号WO2011/109789中描述的任何免疫调节抗体和融合蛋白，包括具有这样免疫调节部分的那些，所述免疫调节部分结合TGF-β，TGF-βR，PD-L1，PD-L2，PD-1，核因子-κB受体激活剂(RANK)配体(RANKL)，和核因子-κB受体激活剂(RANK)，诸如抗HER2/neu抗体和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:1和0(下述列表中述及的SEQ ID No是国际专利公开号WO 2011/109789中公开的序列标识)，抗EGFR1抗体和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:2和71，抗CD20和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:3和72，抗VEGF抗体和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:4和73，抗CTLA-4抗体和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:5和74，抗IL-2Fc和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:6和/或7，抗CD25抗体和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ IDNo:8和75；抗CD25(巴斯利昔单抗(Basiliximab))和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ IDNo:9和76；PD-1胞外域，Fc和TGFβRII ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:11和/或12，TGFβRII胞外域，Fc和RANK胞外域融合单笔，其包含SEQ ID No:13和/或14，抗HER2/neu抗体和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:15和70，抗EGFR1抗体和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:16和71，抗CD20和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:17和72，抗VEGF抗体和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:18和73，抗CTLA-4抗体和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:19和74，抗CD25抗体和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:20和75；抗CD25(巴斯利昔单抗)和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:21和76；IL-2，Fc和PD-1胞外域融合单笔，其包含SEQ ID NO:16和/或23，抗CD4抗体和PD-1胞外结构域融合蛋白，其包含SEQ ID No:24和77，PD-1胞外域，Fc，RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID NO:16和/或23，抗HER2/neu抗体和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:27和70，抗EGFR1抗体和RANKECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:28和71，抗CD20和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:29和72，抗VEGF抗体和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:30和73，抗CTLA-4抗体和RANKECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:31和74，抗CD25抗体和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ IDNo:32和75；抗CD25(巴斯利昔单抗)和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:33和76，IL-2，Fc和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:34和/或35，抗CD4抗体和RANK ECD融合蛋白，其包含SEQ ID No:36和77，抗TNFα抗体和PD-1配体1或PD-1配体2融合蛋白，其包含SEQ IDNo:37和78，TNFR2胞外结合结构域，Fc和PD-1配体融合蛋白，其包含SEQ ID NO:38和/或39，抗CD20和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ ID No:40和72，抗CD25抗体和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ ID No:41和75，抗CD25(巴斯利昔单抗)和PD-1胞外域融合蛋白，其包含SEQ ID No:42和76，IL-2，Fc和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ ID No:43和/或44，抗CD4抗体和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ ID No:45和77，CTLA-4ECD，Fc(IgG Cγ1)和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ IDNo:46和/或47，TGF-β，Fc(IgG Cγ1)和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ ID No:48和/或49，抗TNF-α抗体和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:50和77，TNFR2胞外结合结构域，Fc和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:51和/或52，抗CD20和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:53和72，抗CD25抗体和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:54和75，抗CD25(巴斯利昔单抗)和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:55和76，IL-2，Fc和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:56和/或57，CTLA-4ECD，Fc(IgG Cγ1)和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:59和/或60，抗TNF-α抗体和RANK融合蛋白，其包含SEQ ID No:61和78，TNFR2胞外结合结构域，Fc和RANK融合蛋白，其包含SEQ ID No:62和/或63，CTLA-4ECD，Fc(IgG Cγ1)和RANK融合蛋白，其包含SEQ ID No:64和/或65，RANK，Fc和TGF-β融合蛋白，其包含SEQ ID No:66和/或67，和RANK，Fc和PD-L1融合蛋白，其包含SEQ ID No:68和/或69。

抗PD-L1抗体

本文所述抗TIM-3抗体可与本领域中所描述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段联合给予。抗PD-L1抗体是可购得的，例如29E2A3抗体(Biolegend，批号329701)。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段包括Fab、F(ab’)2、scFv和Fv片段，详见后文。

示例性抗体可见PCT公开文本WO 2013/079174，其描述了阿维单抗。这些抗体可包含含有CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3序列的重链可变区多肽，其中：

(a)CDR_H1序列是X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO:58)；

(b)CDR_H2序列是SIYPSGGX₄TFYADX₅VKG(SEQ ID NO:59)；

(c)CDR_H3序列是IKLGTVTTVX₆Y(SEQ ID NO:60)；

并且其中：X₁是K、R、T、Q、G、A、W、M、I或S；X₂是V、R、K、L、M或I；X₃是H、T、N、Q、A、V、Y、W、F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D。

实施方式之一中，X₁是M、I或S；X₂是R、K、L、M或I；X₃是F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D。

另一个实施方式中，X₁是M、I或S；X₂是L、M或I；X₃是F或M；X₄是I；X₅是S或T；X₆是D。

另一个实施方式中，X₁是S；X₂是I；X₃是M；X₄是I；X₅是T；X₆是D。

另一方面中，所述多肽还包含位于CDR之间的可变区重链框架(FR)序列，如下所示：

(HC-FR1)-(CDR_H1)-(HC-FR2)-(CDR_H2)-(HC-FR3)-(CDR_H3)-(HC-FR4)。

另一个方面，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

另一方面中，所述框架序列至少之一如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:61)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:62)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:63)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:64)。

另一方面中，重链多肽进一步与包括CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3的可变区轻链组合，其中：

(a)CDR_L1序列是TGTX₇X₈DVGX₉YNYVS(SEQ ID NO:65)；

(b)CDR_L2序列是X₁₀VX₁₁X₁₂RPS(SEQ ID NO:66)；

(c)CDR_L3序列是SSX₁₃TX₁₄X₁₅X₁₆X₁₇RV(SEQ ID NO:67)；

并且其中：X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是I、N或S；X₁₂是D、H或N；X₁₃是F或Y；X₁₄是N或S；X₁₅是R、T或S；X₁₆是G或S；X₁₇是I或T。

另一实施方式中，X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是N或S；X₁₂是N；X₁₃是F或Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是G或S；X₁₇是T。

另一实施方式中，X₇是S；X₈是S；X₉是G；X₁₀是D；X₁₁是S；X₁₂是N；X₁₃是Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是S；X₁₇是T。

另一方面中，所述轻链还包含位于CDR之间的可变区轻链框架序列，如下所示：(LC-CDR_L1)-(LC-FR2)-(CDR_L2)-(LC-FR3)-(CDR_L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述轻链框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

另一方面中，所述框架序列至少其一如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:68)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:69)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:70)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:71)。

另一实施方式中，本发明提供抗PD-L1抗体或包含重链和轻链可变区序列的抗原结合片段，其中：

(a)重链包含CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3，并且其中：(i)CDR_H1序列是X₁YX₂MX³(SEQ ID NO:72)；(ii)CDR_H2序列是SIYPSGGX₄TFYADX₅VKG(SEQ ID NO:73)；(iii)CDR_H3序列是IKLGTVTTVX₆Y(SEQ ID NO:74)，和；

(b)轻链包含CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3，并且其中：(iv)CDR_L1序列是TGTX₇X₈DVGX₉YNYVS(SEQ ID NO:75)；(v)CDR_L2序列是X₁₀VX₁₁X₁₂RPS(SEQ ID NO:76)；(vi)CDR_L3序列是SSX₁₃TX₁₄X₁₅X₁₆X₁₇RV(SEQ ID NO:77)；其中：X₁是K、R、T、Q、G、A、W、M、I或S；X₂是V、R、K、L、M或I；X₃是H、T、N、Q、A、V、Y、W、F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D；X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是I、N或S；X₁₂是D、H或N；X₁₃是F或Y；X₁₄是N或S；X₁₅是R、T,或S；X₁₆是G或S；X₁₇是I或T。

实施方式之一中，X₁是M、I或S；X₂是R、K、L、M或I；X₃是F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D；X₇是N或S；X₈是T，R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是N或S；X₁₂是N；X₁₃是F或Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是G或S；X₁₇是T。

另一实施方式中，X₁是M、I或S；X₂是L、M或I；X₃是F或M；X₄是I；X₅是S或T；X₆是D；X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是N或S；X₁₂是N；X₁₃是F或Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是G或S；X₁₇是T。

在另一个实施方式中，X₁是S；X₂是I；X₃是M；X₄是I；X₅是T；X₆是D；X₇是S；X₈是S；X₉是G；X₁₀是D；X₁₁是S；X₁₂是N；X₁₃是Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是S；X₁₇是T。

在另一方面中，重链可变区包含位于CDR之间的一个或多个框架序列诸如：

(HC-FR1)-(CDR_H1)-(HC-FR2)-(CDR_H2)-(HC-FR3)-(CDR_H3)-(HC-FR4)，而轻链可变区包含位于CDR之间的一个或多个框架序列诸如：(LC-FR1MCDR_L1)-(LC-FR2)-(CDR_L2)-(LC-FR3)-(CDR_L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系序列。

另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:61)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:62)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:63)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:64)。

另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:68)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:69)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:70)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:71)。

另一方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含至少C_H1结构域。

在一更具体的方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含C_H1、C_H2和C_H3结构域。

另一方面中，可变区轻链、抗体或抗体片段还包含C_L结构域。

另一方面中，抗体还包括C_H1、C_H2、C_H3和C_L结构域。

另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。

在另一个方面中，人恒定区选自下组：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4。

在一更具体的方面中，人或鼠恒定区是lgG1。

另一实施方式中，本发明的特征包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)重链包含CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3，其各自分别与SYIMM(SEQ ID NO:78)、SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:79)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:80)具有至少80％总体序列相同性，和

(a)轻链包含CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3，其各自分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO:81)、DVSNRPS(SEQ ID NO:82)和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:83)具有至少80％总体序列相同性。

在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

(a)重链包含CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3，其各自分别与MYMMM(SEQ ID NO:84)、SIYPSGGITFYADSVKG(SEQ ID NO:85)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:80)具有至少80％总体序列相同性，和

(a)轻链包含CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3，其各自分别与TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO:86)、DVSNRPS(SEQ ID NO:82)和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:83)具有至少80％总体序列相同性。

另一方面中，本发明的抗体或抗体片段中，相比CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)在CDR_H1中：SYIMM(SEQ ID NO:78)，

(b)在CDR_H2中：SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:79)，

(c)在CDR_H3中：IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:80)；

并且其中，相比CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)CDR_L1中：TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO:81)

(b)CDR_L2中：DVSNRPS(SEQ ID NO:82)

(c)CDR_L3中：SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:83)。

(HC-FR1)-(CDR_H1)-(HC-FR2)-(CDR_H2)-(HC-FR3)-(CDR_H3)-(HC-FR4)，而轻链可变区包含位于CDR之间的一个或多个框架序列诸如：

(LC-FR1)-(CDR_L1)-(LC-FR2)-(CDR_L2)-(LC-FR3)-(CDR_L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述框架序列源自人种系序列。

另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:61)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:62)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:63)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:64)。

另一方面中，所述轻链框架序列源自λ轻链序列。

另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:68)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:69)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:70)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:71)。

另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。

另一个实施方式中，本发明的特征包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:87)，和

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSN

RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:88)。

在一具体的方面中，所述序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一实施方式中，本发明提供一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEVWSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:89)，和

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNR

PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:90)。

在一具体方面中，所述序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

抗PD-L1/TGFβ阱融合蛋白

本文所述抗TIM-3抗体可与本领域中所描述的任何抗PD-L1/TGFβ阱联合给予。抗PD-L1/TGFβ阱指抗PD-L1抗体-TGFβ受体II胞外域(ECD)融合蛋白。

在一个实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱包含如本文(例如，在上述标题为“抗PD-L1抗体”的部分中)所述的抗PD-L1抗体。

在一个实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱是具有必特芙普α的氨基酸序列的蛋白质，如国际专利公开号WO 2015/118175中所述并且由CAS登记号1918149-01-5给出的氨基酸序列所反映。必特芙普α包含与抗PD-L1抗体(SEQ ID NO:91)的轻链相同的轻链。必特芙普α还包含融合多肽，该融合多肽具有由抗PD-L1抗体的重链(SEQ ID NO:92)构成的对应SEQ IDNO:93的序列，其中重链的C末端赖氨酸残基被突变为丙氨酸，经柔性(Gly₄Ser)₄Gly接头(SEQ ID NO:97)与可溶性TGFβ受体II的N末端(SEQ ID NO:96)遗传融合。必特芙普α由SEQID NO:94(编码抗PD-L1轻链的DNA)和SEQ ID NO:95(编码抗PD-L1/TGFβ受体II的DNA)编码。

在一个实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱是必特芙普α，具有必特芙普α的氨基酸序列的蛋白质以及由CHO细胞中产生的蛋白质所致的糖基化形式，其中重链在Asn-300、Asn-518、Asn-542和Asn-602处经糖基化(即SEQ ID NO:93)(参见，《世卫组织药物信息》(WHODrug Information)，2018年第32卷第2期，第293页)。

分泌的抗PD-L1的LC的肽序列

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQID NO:91)

分泌的抗PDL1的H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:92)

分泌的抗PDL1/TGFβ阱H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO:93)

抗PD-L1λ轻链从翻译起始密码子到翻译终止密码子的DNA序列(VL之前的前导序列是来自尿激酶纤溶酶原激活物的信号肽)

atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggcCAGTCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTGggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatccaggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaagaccgtcgcccccaccgagtgctcaTGA(SEQ ID NO:94)

从翻译起始密码子至翻译终止密码子的DNA序列(mVK SP前导序列：小写下划线；VH：大写字母；含K至A突变的IgG1m3：小写字母；(G4S)x4-G接头：粗体大写字母；TGFβRII：粗体下划线小写字母；两个终止密码子：粗体下划线大写字母)

人TGFβRII同种型B胞外域多肽

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ IDNO:96)

(Gly₄Ser)₄Gly接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:97)

能够用于本发明的抗PD-L1/TGFβ阱分子可以包含与如上所述SEQ ID NO:91-96中的任何一项具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列相同性的序列。

在一些实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱是WO 2018/205985中公开的抗PD-L1/TGFβ阱分子。例如，抗PD-L1/TGFβ阱是WO 2018/205985表2中列出的构建体之一，诸如其中的构建体9或15。

在其他实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱是异四聚体，其包含各自具有对应WO 2018/205985的SEQ ID NO:12的轻链序列的两个多肽和两个融合蛋白组成，所述两个融合蛋白各自具有对应WO 2018/205985的SEQ ID NO:11的重链，通过接头序列(G₄S)_xG(其中x可以是4或5)(SEQ ID NO:117)与对应WO 2018/205985的SEQ ID NO:14(其中接头序列的“x”是4)或SEQ ID NO:15(其中接头序列的“x”是5)的TGFβRII胞外域序列融合。

在某些实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱分子包括第一和第二多肽。所述第一多肽包括：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段(例如可溶性片段)。第二多肽包括：能够结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区，其中，第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)。在某些实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱分子是异四聚体，其包含抗PD-L1的两个免疫球蛋白轻链和两个重链，所述重链包含通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头(例如，(G₄S)_xG，其中x可以是4或5(SEQ ID NO:117))与人TGFβRII胞外域遗传融合的抗PD-L1的重链。

SEQ ID NO:104

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNI IFSEEYNTSNPD(与WO 2018/205985中SEQ IDNO:14相同)

SEQ ID NO:105

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

(与WO 2018/205985中SEQ ID NO:15相同)

SEQ ID NO:106

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

SEQ ID NO:107

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

SEQ ID NO:108

突变的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

VTDNAGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:109

抗PD-L1抗体重链可变区的多肽序列

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO:110

抗PD-L1抗体轻链可变区的多肽序列

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:111

抗PD-L1抗体重链可变区的多肽序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:112

抗PD-L1抗体轻链可变区的多肽序列

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:113

抗PD-L1抗体重链的多肽序列

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:114

抗PD-L1抗体轻链的多肽序列

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:115

抗PD-L1抗体重链的多肽序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA

(与WO 2018/205985的SEQ ID NO:11相同)

SEQ ID NO:116

抗PD-L1抗体轻链的多肽序列

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(与WO 2018/205985的SEQ ID NO:12相同)

能够用于本发明的抗PD-L1/TGFβ阱分子可以包含与如上所述SEQ ID NO:104-116中的任何一项具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％序列相同性的序列。

治疗方法

如本文所用，“治疗”、“处理”和“疗法”意指治疗/处理哺乳动物(例如人)的疾病。这包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病状态的消退。

通常，本文所述的抗TIM-3抗体或另一治疗剂的治疗有效量(单独或与另一治疗组合，例如第二治疗剂)的范围为0.1mg/kg-100mg/kg，例如，1mg/kg-100mg/kg，例如，1mg/kg-10mg/kg。在某些实施方式中，本文所述的抗TIM-3抗体或另一治疗剂的治疗有效量可以这样的剂量给予：约0.1-约1mg/kg、约0.1-约5mg/kg、约0.1-约10mg/kg、约0.1-约25mg/kg、约0.1-约50mg/kg、约0.1-约75mg/kg、约0.1-约100mg/kg、约0.5-约1mg/kg、约0.5-约5mg/kg、约0.5-约10mg/kg、约0.5-约25mg/kg、约0.5-约50mg/kg、约0.5-约75mg/kg、约0.5-约100mg/kg、约1-约5mg/kg、约1-约10mg/kg、约1-约25mg/kg、约1-约50mg/kg、约1-约75mg/kg、约1-约100mg/kg、约5-约10mg/kg、约5-约25mg/kg、约5-约50mg/kg、约5-约75mg/kg、约5-约100mg/kg、约10-约25mg/kg、约10-约50mg/kg、约10-约75mg/kg、约10-约100mg/kg、约25-约50mg/kg、约25-约75mg/kg、约25-约100mg/kg、约50-约75mg/kg、约50-约100mg/kg、约75-约100mg/kg。给予的量将取决于变量，诸如待治疗的疾病或适应症的类型和程度，患者的整体健康状况，抗体的体内效力，药物制剂和给药途径。为了快速达到所需血液水平或组织水平，可以将初始剂量增加到上限以上。或者，初始剂量可以小于最佳剂量，并且在治疗过程中可以逐渐增加剂量。可以优化人剂量，例如在设计为运行0.5mg/kg-30mg/kg的常规I期剂量递增研究中。

在某些实施方式中，本文所述的抗TIM-3抗体或另一种治疗剂(单独或与另一治疗组合，例如第二治疗剂)可以以平(固定)剂量(而非与哺乳动物的体重成比例，即mg/kg剂量)给予。治疗有效量的抗TIM-3抗体可以是约5mg-约3500mg的平剂量(固定剂量)。例如，剂量可以是约5-约250mg、约5-约500mg、约5-约750mg、约5-约1000mg、约5-约1250mg、约5-约1500mg、约5-约1750mg、约5-约2000mg、约5-约2250mg、约5-约2500mg、约5-约2750mg、约5-约3000mg、约5-约3250mg、约5-约3500mg、约250-约500mg、约250-约750mg、约250-约1000mg、约250-约1250mg、约250-约1500mg、约250-约1750mg、约250-约2000mg、约250-约2250mg、约250-约2500mg、约250-约2750mg、约250-约3000mg、约250-约3250mg、约250-约3500mg、约500-约750mg、约500-约1000mg、约500-约1250mg、约500-约1500mg、约500-约1750mg、约500-约2000mg、约500-约2250mg、约500-约2500mg、约500-约2750mg、约500-约3000mg、约500-约3250mg、约500-约3500mg、约750-约1000mg、约750-约1250mg、约750-约1500mg、约750-约1750mg、约750-约2000mg、约750-约2250mg、约750-约2500mg、约750-约2750mg、约750-约3000mg、约750-约3250mg、约750-约3500mg、约1000-约1250mg、约1000-约1500mg、约1000-约1750mg、约1000-约2000mg、约1000-约2250mg、约1000-约2500mg、约1000-约2750mg、约1000-约3000mg、约1000-约3250mg、约1000-约3500mg、约1250-约1500mg、约1250-约1750mg、约1250-约2000mg、约1250-约2250mg、约1250-约2500mg、约1250-约2750mg、约1250-约3000mg、约1250-约3250mg、约1250-约3500mg、约1500-约1750mg、约1500-约2000mg、约1500-约2250mg、约1500-约2500mg、约1500-约2750mg、约1500-约3000mg、约1500-约3250mg、约1500-约3500mg、约1750-约2000mg、约1750-约2250mg、约1750-约2500mg、约1750-约2750mg、约1750-约3000mg、约1750-约3250mg、约1750-约3500mg、约2000-约2250mg、约2000-约2500mg、约2000-约2750mg、约2000-约3000mg、约2000-约3250mg、约2000-约3500mg、约2250-约2500mg、约2250-约2750mg、约2250-约3000mg、约2250-约3250mg、约2250-约3500mg、约2500-约2750mg、约2500-约3000mg、约2500-约3250mg、约2500-约3500mg、约2750-约3000mg、约2750-约3250mg、约2750-约3500mg、约3000-约3250mg、约3000-约3500mg或约3250-约3500mg。可以优化人剂量，例如在设计为运行5mg-3200mg平(固定)剂量的常规I期剂量递增研究中。

给药频率可以根据多种因素而变化，例如给药途径、剂量、抗体的血清半衰期和进行治疗的疾病。示例性给药频率是每周一次，每两周一次，每三周一次和每四周一次。在一些实施方式中，给药是每两周一次。优选的给药途径是肠胃外给药，例如，静脉内输注。基于单克隆抗体的药物的制剂在本领域普通技术人员能力范围内。在一些实施方式中，抗体是冻干的，并且在给药之时，在缓冲盐水中重建。

对于治疗用途，优选将抗体与药学上可接受的运载体组合。如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”指这样的缓冲液、运载体和赋形剂，其适用于与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激、***反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。所述运载体应当是“可接受的”，这意味着它与该制剂的其它成分相容，并且对受体无害。药学上可接受的运载体包括与药物给药相容的缓冲液、溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。

含有抗体(如本文公开的那些)的药物组合物可以以剂量单位形式存在并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应当配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的示例是静脉内(IV)，皮内，吸入，透皮，局部，透粘膜和直肠给药。克隆抗体的优选给药途径是静脉内输注。有用的制剂可以通过药学领域众所周知的方法制备。例如，参见《雷明顿药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版(麦克出版公司(Mack PublishingCompany),1990)。适合肠胃外给药的制剂组分包括无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如EDTA；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内给药，合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛ELTM(巴斯夫(BASF)，新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。该运载体在制造和储存条件下应保持稳定，并应防止微生物侵害。运载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。

药物制剂优选是无菌的。灭菌可以例如通过无菌滤膜过滤来完成。在组合物冻干的情况下，可以在冻干和重建之前或之后进行过滤器灭菌。

用于在哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中的本公开的静脉内药物递送制剂可以包含在袋，笔或注射器中。在某些实施方式中，袋可以连接包括管和/或针的通道。在某些实施方式中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方式中，制剂可以冷冻干燥(冻干)并保存。在某些实施方式中，约40mg-约100mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，制剂可以是包含如本文所述的TIM-3抗体的蛋白质产物的液体制剂，并以约250mg/小瓶-约2000mg/小瓶保存。

液体制剂

本公开提供了液体水性药物制剂，其于缓冲溶液中包含治疗有效量的本公开的蛋白质(例如，抗TIM-3抗体)，形成制剂用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法。

这些用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的组合物可用常规灭菌技术灭菌或可进行无菌过滤。所得水性溶液可包装成原样使用(“use as-is”)型产品或冻干，冻干制剂在给药之前与无菌水性运载体合并。制剂的pH通常在3至11之间，5至9之间或6至8之间更好，7至8之间例如7至7.5之间最好。得到的固体形式的组合物可以包装成多个单剂量单位，每个单剂量单位含有固定量的上述一种或多种药剂。固体形式的组合物也可以包装在容器中以获得灵活的量。

在某些实施方式中，本公开提供了用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的具有延长的保质期的制剂，所述制剂包含本公开的蛋白质(例如，抗TIM-3抗体)与甘露醇，柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，氯化钠，聚山梨醇酯80，水和氢氧化钠的组合。

在某些实施方式中，制备用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法中使用的水性制剂，其在pH缓冲液中包含本发明的蛋白质(例如，抗TIM-3抗体)。本发明的缓冲液的pH可以为约4至约8，例如约4至约8，约4.5至约8，约5至约8，约5.5至约8，约6至约8，约6.5至约8，约7至约8，约7.5至约8，约4至约7.5，约4.5至约7.5，约5至约7.5，约5.5至约7.5，约6至约7.5，约6.5至约7.5，约4至约7，约4.5至约7，约5至约7，约5.5至约7，约6至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约5至约6.5，约5.5至约6.5，约4至约6.0，约4.5至约6.0，约5至约6，或约4.8至约5.5，或可具有约5.0至约5.2的pH。上述pH的中间范围也是本公开的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在该范围内的缓冲剂的示例包括乙酸盐(例如乙酸钠)，琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)，葡糖酸盐，组氨酸，柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

在某些实施方式中，用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐以将pH维持在约4至约8的范围内的缓冲***。在某些实施方式中，pH范围可以为约4.5至约6.0，或约pH4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，缓冲***包括柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方式中，缓冲***包含约1.3mg/mL柠檬酸(例如，1.305mg/mL)，约0.3mg/mL柠檬酸钠(例如，0.305mg/mL)，约1.5mg/mL二水合磷酸氢二钠(例如，1.53mg/mL)，约0.9mg/mL二水合磷酸二氢钠(例如，0.86mg/mL)，和约6.2mg/mL氯化钠(例如，6.165mg/mL)。在某些实施方式中，缓冲***包含约1-1.5mg/mL柠檬酸，约0.25至约0.5mg/mL柠檬酸钠，约1.25至约1.75mg/mL二水合磷酸氢二钠，约0.7至约1.1mg/mL二水合磷酸二氢钠，和6.0至6.4mg/mL氯化钠。在某些实施方式中，用氢氧化钠调节制剂的pH。

用作调理剂并可稳定抗体的多元醇也可包括在制剂中。多元醇加入到制剂中的量可以根据制剂的所需等渗性而不同。在某些实施方式中，水性制剂可以是等渗的。加入的多元醇的量也可以相对于多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以加入较低量的单糖(例如甘露醇)。在某些实施方式中，可以在制剂中用作张力剂的多元醇是甘露醇。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约5至约20mg/mL。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约7.5至约15mg/mL。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约10至约14mg/mL。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约12mg/mL。在某些实施方式中，制剂中可包含多元醇山梨糖醇。

清洁剂或表面活性剂也可以加入到制剂中。示例性清洁剂包括非离子清洁剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的清洁剂的量使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。在某些实施方式中，制剂可包括表面活性剂聚山梨醇酯。在某些实施方式中，制剂可含有清洁剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80用于表示聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(参见Fiedler，《辅料百科》(Lexikon der Hilfsstoffe)，Editio Cantor Verlag Aulendorf出版，第4版，1996)。在某些实施方式中，制剂可含有约0.1mg/mL至约10mg/mL，或约0.5mg/mL至约5mg/mL的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在制剂中加入约0.1％的聚山梨醇酯80。

除聚集外，脱酰胺是肽和蛋白质的常见产物变体，可发生于发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物/药物产品储存期间和样品分析期间。脱酰胺作用是蛋白质中丢失NH₃形成可水解的琥珀酰亚胺中间体。琥珀酰亚胺中间体导致亲本肽质量减少17u。随后的水解导致质量增加18u。由于在水性条件下的不稳定性，难以分离琥珀酰亚胺中间体。因此，脱酰胺通常可测知为1u质量增加。天冬酰胺脱酰胺形成天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH，温度，溶剂介电常数，离子强度，一级序列，局部多肽构象和三级结构。肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn后的Gly和Ser导致更易脱酰胺。

在某些实施方式中，本公开用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的液体制剂可以在pH和湿度条件下保存以防止蛋白质产物脱酰胺。

本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(对人给药安全无毒)并且可用于制备液体制剂。示例性运载体包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。

特定情况下，静脉内(IV)制剂可以是优选的给药途径，例如当患者在移植后在医院中通过IV途径接受所有药物时。在某些实施方式中，在给药前用0.9％氯化钠溶液稀释液体制剂。在某些实施方式中，用于注射的稀释药物产品是等渗的并且适于通过静脉内输注给药。

在某些实施方式中，盐或缓冲组分可以约10mM-约200mM的量加入。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。

在一个实施方式中，液体制剂包含10mg/mL M6903，8％(w/v)海藻糖，10mM L-组氨酸和0.05％pH 5.5的聚山梨酯20。在通过静脉内输注给予M6903前，将溶液用无菌的0.9％氯化钠稀释。

冻干制剂

本公开用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的冻干制剂包含抗TIM-3分子和冻干保护剂。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方式中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包含缓冲剂，表面活性剂，填充剂和/或防腐剂中的一种或多种。

可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以是至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖重量比。在某些实施方式中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。

在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。

在冻干之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以调节为约6至约8之间。在某些实施方式中，冻干药物产品的pH范围可以为约7至约8。

在某些实施方式中，可以约10mM-约200mM的量加入盐或缓冲组分。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。

在某些实施方式中，可以添加“填充剂”。“填充剂”是这样一种化合物，它增加冻干混合物的量并有助于冻干块体的物理结构(例如，有助于生产保持开孔结构的基本上均匀的冻干饼体)。示例性填充剂包括甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有此类填充剂。

在某些实施方式中，用于哺乳动物中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的冻干药物产品可以用水性运载体来复溶。本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(例如对人给药安全无毒)并且可在冻干后用于制备液体制剂。示例性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干药物产品用无菌注射用水，USP(SWFI)或0.9％氯化钠注射液，USP重建。在重建过程中，冻干粉末溶解成溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干蛋白质产物溶于约4.5mL注射用水并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

通过前述示例将更充分地理解本发明的实施方式，上述示例在本文中仅出于说明性目的给出，并且不应以任何方式解释为对本发明的限制。

实施例

实施例1–抗TIM-3抗体的生成和表征

1.1生成表达人和cyno TIM-3的瞬时和稳定细胞系

使用本领域标准的方法来生成表达膜锚着的TIM-3的细胞系。简言之，为了生成huTIM-3-Expi293F细胞(也称之为293F-hTIM-3)或cynoTIM-3-Expi293F细胞(也称之为293F-cynoTIM-3)，通从头基因合成获得分别编码人TIM-3(基于NCBI参考NP_116171(SEQID NO:41))或cynoTIM-3(基于NCBI参考XP_005558438(SEQ ID NO:42))的胞外结构域(ECD)的cDNA，引入表达载体，然后使用Expifectamine(赛墨飞世尔科学公司(ThermoFischer Scientific))将相应的DNA转染到Expi293F细胞中。空载体用作对照。3天后，通过FACS评估人TIM-3或cynoTIM-3细胞表面表达(对于人TIM-3：抗人TIM-3抗体(R&D***公司，目录号FAB2365P)和大鼠IgG2对照–PE(R&D***公司，目录号IC006P)；对于cynoTIM-3：抗人TIM-3抗体(百乐津公司，目录号345010)和小鼠IgG1对照(西格玛公司，目录号M9269))，并生成细胞库。解冻的细胞未显示人或cynoTIM-3表面表达降低(数据未显示)。

为了生成huTIM-3-CHO-S细胞(也称为CHO-S-hTIM3)，使用Nucleofector II装置(Amaxa生物***公司(Amaxa Biosystems))以上述相同的载体转染CHO-S细胞，并用潮霉素B进行选择。使用FACS筛选微型池中人TIM-3的细胞表面表达。通过FACS对来自最佳微型池的单细胞进行分选，扩增，并选择人TIM-3表达最高的克隆(数据未显示)。

为了生成达重组可溶TIM-3的细胞系，通过从头基因合成获得编码猕猴(“cyno”)TIM-3的ECD的cDNA，基于对应SEQ ID NO:42的NCBI参考XP_005558438，并将其与编码鼠Fc或6-His标签的DNA融合，并使用标准重组DNA技术制备了包含cynoTIM-3-muFc和cynoTIM-3-His6构建体的表达载体。使用PEI将DNA转染到HEK293细胞用于瞬时表达。

1.2蛋白质试剂

cynoTIM-3ECD蛋白通过蛋白质A亲和力(cynoTIM-3-muFc)或镍螯合亲和力柱纯化自细胞上清液，并用咪唑(cynoTIM-3-His6)洗脱。对纯化的蛋白质进行QC分析：在还原和非还原条件下进行SDS PAGE，SEC用于确定纯度和表观MW，UV光谱用于浓度确定；鲎阿米巴样细胞裂解物试验用于测量内毒素污染。

具有6-His标签的人TIM-3 ECD(hu TIM-3-His6)购自Novoprotein公司(目录号C356，SEQ ID NO:43)，与人Fc-6His融合的人TIM-3ECD(hu TIM-3-FcHis6)购自Novoprotein公司(目录号CD71，SEQ ID NO:44)，与人IgG1 Fc结构域融合的人TIM-3ECD(huTIM-3-Fc)购自R&D***公司(#2365-TM)，具有6-His标签的狨猴TIM-3ECD(绒猴TIM-3-His6)购自Novoprotein公司(目录号CM64，SEQ ID NO:45)，与人Fc融合的小鼠TIM-3 ECD(小鼠TIM-3-Fc)购自R&D***公司(#1523-TM)，基于NCBI参考NP_599011(SEQ ID NO:46)，具有6-His标签的人TIM-1 ECD(huTIM-1-His6，#1750-TM)和具有6-His标签的人TIM-4 ECD(huTIM-4-His6；#2929-TM)购自R&D***公司。

1.3动物

使用表达人抗体基因：人轻链(VLCL或VKCK)和人VH，同时表达重链的大鼠恒定区的转基因大鼠(来自开放单克隆技术公司(Open Monoclonal Technologies,Inc.)/配体药物公司(Ligand Pharmaceutical Inc.)的获批的OmniRats^TM)生成抗TIM-3人单克隆抗体(Geurts等.(2009)SCIENCE325(5939):433，Menoret等2010，Ma等2013,Osborn等2013)。

1.4由B细胞克隆生成抗TIM-3抗体

为了生成TIM-3的完全人单克隆抗体，用TIM-3-His6(Novoprotein公司，目录号C356)免疫OmniRats^TM。将常规免疫方案用于多个位点进行标准免疫或重复免疫(也称为RIMMS)。8至12周龄大鼠每两周用hu TIM-3-His6免疫四次，并通过FACS监测huTIM-3-Expi293F细胞的血清免疫反应。简言之，在4℃下用血清的稀释液孵育细胞20分钟，离心，洗涤并用在4℃下FITC偶联的山羊抗大鼠IgG1(Bethyl公司#A110-106F)和FITC偶联的山羊抗大鼠IgG2b(Bethyl公司#A110-111F)的混合物孵育20分钟。然后将细胞离心，再悬浮于7-AAD染料(BD生命科学公司)以标记垂死或死亡细胞，并使用Guava阅读器(西格玛密理博公司(MilliporeSigma))进行分析。

从收集自具有高血清免疫反应的大鼠的淋巴细胞中进行单B细胞分选。简言之，用抗大鼠CD32(克隆D34-485，BD生命科学公司)孵育细胞5分钟，然后用hu TIM-3-His6在4℃下孵育1小时。然后将细胞洗涤并用FITC偶联的小鼠抗大鼠IgM(克隆MARM-4，赛默飞世尔科技公司)，PE-Cy7偶联的小鼠抗大鼠CD45R(克隆HIS 24，eBioscience公司)和APC偶联的小鼠抗His(克隆AD1.1.10R，R&D公司)抗体的混合物在4℃下孵育30分钟。将单TIM-3阳性B细胞分选到在BD FACS Aria III流式细胞仪上的96孔板中的各孔中，各孔包含4μl裂解缓冲液(0.1M DTT，40U/ml RNA酶抑制剂，英杰公司，目录号10777-019)。将板用Microseal‘F’膜(伯乐公司(BioRad))密封并立即在干冰上冷冻，然后储存于-80℃。

使用由公开的文献(Tiller等，2008，J Imm Methods 329)修改的方案进行单分选的B细胞的Ig可变(V)区基因克隆。简言之，按照生产商方案，在具有无核酸酶的水(英杰公司，目录号AM9935)的原始96孔分选板中，使用最终量/浓度为150ng的随机六聚体引物(pd(N)6，应用生物学公司，P/N N808-0127)和50U Superscript III逆转录酶(英杰公司，目录号18080-044)对来自单分选的B细胞的总RNA进行逆转录，最终体积为14μl/孔。引物根据之前公开的文献(Max等,1981；Weiss和Wu,1987；Sanchez等,1990；Solin和Kaartinen,1992；Kantor等,1997a；Thiebe等,1999；Wang等,2000；Brekke和Garrard,2004；Ye,2004；Ehlers等,2006；Johnston等,2006；Casellas等,2007)进行修改和/或通过通过检查

国际ImMuno-GeneTics information

(参见网站www.imgt.org；(Lefranc等,2009)和NCBI(参见网站www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)数据库中已公开的Ig基因区段核苷酸序列进行设计。人Igh、Igk和Igl V基因转录本通过两轮巢式(Igh、Igk和Igl)PCR独立地扩增，以3.5μl的cDNA作为模板开始。所有PCR反应在96孔板中进行，各孔总体积为40μl，使用AccuPrime Taq DNA聚合酶高保真试剂盒(英杰公司，目录号12346-094)，按照生产商方案进行。第一轮PCR这样进行：95℃下2分钟，然后40个循环在94℃下30秒，50℃下30秒，72℃下40秒，并在72℃下最终孵育5分钟。

巢式第二轮PCR这样进行：5μl未纯化的第一轮PCR产物在95℃下2分钟，然后5个循环在94℃下30秒，42℃下30秒，72℃下45秒，然后50个循环在94℃下30秒，55℃下30秒，72℃下45秒，并在72℃下最终孵育5分钟。将PCR产物克隆到IgG表达载体，用于Ig表达和功能筛选。

分选总共352个TIM-3阳性B细胞，并将Ig V克隆到IgG表达载体中用于筛选。分离74个独特的克隆，其中VH-和VL基因成对存在。通过ELISA和流式细胞术试验确认了74个克隆为人TIM-3结合物，并且这些克隆中的10个被确认为猕猴杂交(cyno-cross)反应性细胞结合物。

1.5抗体表达和纯化

将抗体重链和轻链单独亚克隆至pTT5载体中并在使用ExpiFectamine转染试剂转染后在Expi293F细胞中瞬时共表达。将细胞于5％CO2加湿培养箱中在37℃下振荡孵育7天。收获并离心条件培养基以除去细胞碎片。通过使用标准方法的蛋白质A亲合力色谱法由培养上清液纯化抗体。在还原和非还原条件下通过SDS PAGE评估纯化的蛋白质的质量，使用SEC-HPLC确定纯度和表观MW，并通过UV光谱确定浓度。

1.6通过ELISA结合人、猕猴、小鼠TIM-3、人TIM-1和人TIM-4

为了进一步确认抗体的种间反应性和选择性(针对家族成员TIM-1和TIM-4)，与TIM-3的结合，通过ELISA测试了74个纯化的抗体克隆。简言之，384孔板用huTIM-3-His6，cynoTIM-3-muFc或cynoTIM-3-His6，小鼠TIM-3-Fc，huTIM-1-His6和huTIM-4-His6过夜包被。用3％牛血清白蛋白封闭后，将1或0.1μg/ml抗TIM-3抗体在室温下孵育1小时。洗涤步骤后，将结合的抗体在室温下孵育1小时，使用过氧化物酶affiniPure F(ab’)2片段山羊抗人F(ab')₂片段特异性(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories)#109-036-097)，并使用TMB HRP底物溶液(BioFx Lab公司，#TMBW-1000-01)进行检测。确认所有纯化的抗体克隆结合人TIM-3，10个与cynoTIM-3强烈结合，且没有抗体克隆结合小鼠TIM-3、人TIM-1或人TIM-4(数据未显示)。

1.7抗TIM-3抗体基于细胞的结合试验

通过流式细胞术评估74个纯化的抗TIM-3抗体克隆与细胞系的结合。简言之，将大约1x 10⁵个CHO-S-hTIM3细胞，亲本CHO-S细胞，293F-cynoTIM-3细胞和亲本Expi293F重悬于含抗TIM-3抗体(10μg/ml和1ug/ml)的流式细胞术缓冲液(具有1％FBS的DPBS)，并在冰上孵育30分钟。洗涤细胞并在含有FITC-偶联的山羊抗人IgG Fc抗体(杰克逊免疫研究实验室公司#109-096-098)的流式细胞术缓冲液中于冰上重悬30分钟。然后将细胞离心，并重悬于包含7-AAD和1％中性缓冲***的流式细胞术缓冲液中。在Guava EasyCyte仪器(西格玛密理博公司)上进行分析。计算各抗体浓度的门控的单活细胞的平均荧光强度(MFI)。总计62个抗体克隆以10和1ug/ml特异性地结合CHO-S-hTIM3细胞，并且12个抗体克隆以10和1ug/ml特异性地结合293F-cynoTIM-3细胞(数据未显示)。根据ELISA和基于细胞的结合试验数据，选择了10个抗TIM-3抗体克隆进行进一步的测试和分析。

1.8通过流式细胞术和ELISA测量选定的抗TIM3抗体克隆的EC50

通过流式细胞术和ELISA进一步测试选定的抗TIM-3抗体克隆，以计算其EC 50值，从而对其进行排序。对于流式细胞术，使用实施例1.7中所述方案测试抗体，使用从600nM开始针对表达人和cynoTIM-3的细胞的抗体的系列稀释液。针对抗体浓度绘制平均荧光强度(MFI)，并使用GraphPad Prism计算EC50。结果总结于表1。

对于ELISA，按照实施例1.6中描述的方案，使用从20nM开始的系列稀释液，测试抗体与huTIM-3-His6、cynoTIM-3-His6和cynoTIM-3-muFc的结合。针对抗体浓度绘制光密度，并使用GraphPad Prism计算EC50。结果总结于表1。

表1中针对选定克隆的数据显示对CHO-S-hTIM3细胞的细胞结合的EC50大约为1nM，而对293F-cynoTIM-3细胞的细胞结合的EC50为2nM-183nM，这取决于抗体克隆。这些抗体克隆通过ELISA与重组人TIM-3结合，EC50约为0.01nM；与重组cynoTIM-3结合，EC50为0.01-1nM。

1.9通过表面等离子体共振(SPR)确定选定抗TIM-3抗体的动力学常数

如下使用GE Healthcare Biacore 4000仪器通过表面等离子体共振(SPR)测量选定抗TIM-3抗体与人TIM-3和cynoTIM-3的结合亲和力。按照生产商所述过程，首先使用与游离氨基直接偶联来将山羊抗人Fc抗体(杰克逊免疫研究实验室公司#109-005-098)固定在BIAcore羧甲基化葡聚糖CM5芯片上。然后将抗体捕获在CM5生物传感器芯片上，以实现约200个响应单位(RU)。使用运行中的HBS-EP+缓冲液进行结合测量。在25℃下以30μl/分钟的流速注射开始在100nM His-标签标记的TIM-3蛋白质，huTIM-3-His6和cynoTIM-3-His6的2倍稀释系列。使用简单的1：1Langmuir结合模型(Biacore 4000评价软件)计算结合速率(kon，M-1s-1)和解离速率(koff，s-1)。平衡解离常数(KD，M)以koff/kon的比率计算。所选克隆结合huTIM-3-His6的亲和力为3.5-9.2nM(表1)。一些选定的克隆结合cynoTIM-3-His6的亲和力为12-99nM(表1)。在测试的cynoTIM-3-His6的浓度范围内(100nM和更低)，一些克隆不存在可检测到的或可确定的特异性结合动力学曲线(表1中的NB)，这表明这些条件下与cynoTIM-3-His6的结合弱或没有结合。注意，表1中所示的所有选定的克隆在ELISA或细胞结合流式细胞术条件下与cynoTIM-3-His6具有一些结合。

1.10CHO-S-hTIM3靶细胞的ADCC

还使用铬释放试验，使用稳定转染的CHO-S-hTIM3靶细胞和具有同种异型V/F的供体效应细胞来测试所选克隆的ADCC活性。

简言之，CHO-S-hTIM3细胞首先经⁵¹Cr标记45分钟，然后在37℃下用起始浓度为33nM的抗TIM-3抗体的5倍系列稀释液孵育15分钟。以1:100的比例添加效应细胞，并在37℃下孵育4小时。将细胞转移至Lumaplate 96孔DryPlates过夜，并使用伽玛计数器测量放射性。将裂解百分比计算为((计数-Spont)/(100％裂解-Spont))x100的比值，其中Spont是仅使用CHO-S-hTIM3细胞(在没有抗体和效应细胞的情况下)计数的放射性，并通过用去污剂裂解CHO-S-hTIM3细胞来计算100％裂解。该试验使用两个同种异型V/F的供体进行。所有选定的抗体克隆诱导CHO-S-hTIM3靶细胞的ADCC，EC50为约0.1-0.3nM(表1)。

表1.选定的抗hTIM3抗体克隆的细胞结合EC50、ELISA EC50、亲和力和ADCC活性的示例

NB＝在SPR检测的cynoTIM3分析物的浓度范围内不存在可测定的结合实施例2-抗 Tim-3抗体3903E11的优化

2.1重链和轻链可变区变体

通过改变重链和轻链可变区中的框架区和CDR序列来分别修饰3903E11重链(3903E11(VH1.0)；SEQ ID NO:34)可变区和3903E11轻链(3903E11(VL1.0；SEQ ID NO:33)可变区的氨基酸序列。这些序列改变的目的是将框架氨基酸残基突变为在该位置发现的最同源的人种系残基，从而通过防止Asp异构化，Asn脱酰胺和Met氧化来改善分子的可制造性，或者耗竭计算机鉴定的人T细胞表位的抗体，从而降低或消除人免疫原性。

3个重链可变区变体3903E11(VH1.1)(SEQ ID NO:53)、3903E11(VH1.2)(SEQ IDNO:24)和3903E11(VH1.3)(SEQ ID NO:55)在人IgG1重链同种型主链上构建，分别产生重链变体3903E11(VH1.1)-g1(SEQ ID NO:16)、3903E11(VH1.2)-g1(SEQ ID NO:18)和3903E11(VH1.3)-g1(SEQ ID NO:20)。引入下述突变(根据IMGT编号方案；带下划线的残基位于CDR之一内或与之毗邻)：

3903E11(VH1.1):M39L

3903E11(VH1.2):Q6E

3903E11(VH1.3):Q6E,M39L

3个轻链可变区变体3903E11(VL1.1)(SEQ ID NO:52)、3903E11(VL1.2)(SEQ IDNO:54)和3903E11(VL1.3)(SEQ ID NO:23)在人λ链背景上构建，分别产生轻链变体3903E11(VL1.1)-CL(SEQ ID NO:15)、3903E11(VL1.2)-CL(SEQ ID NO:17)和3903E11(VL1.3)-CL(SEQ ID NO:19)。引入下述突变(根据IMGT编号方案)：

3903E11(VL1.1):S1Q,Y2S,E3A

3903E11(VL1.2):F55Y

3903E11(VL1.3):S1Q,Y2S,E3A,F55Y

亲本和变体重链和轻链以所有可能的成对组合方式组合，以进一步生成完全人抗TIM-3抗体。根据它们与TIM-3的结合活性(通过FACS和SPR)以及与FR位置上最同源的人种系残基的相似性来选择优化的候选物。所有优化的抗体都是功能性的并且保持结合CHO-S-hTIM3细胞和重组人和cynoTIM-3蛋白(参见表2)。相对于亲本3903E11重链，与3903E11(VH1.2)IgG1的组合导致抗体与CHO-S-hTIM3细胞的结合增加，并且对重组huTIM-3-His6和cynoTIM-3-His6的固有亲和力(KD)增加(参见表2)。此外，轻链变体3903E11(VL1.3)CL比其他轻链变体与最同源的种系序列更相似。因此，选择包含重链可变区变体3903E11(VH1.2)和轻链可变区变体3903E11(VL1.3)的抗体作为先导抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)IgG1进行进一步表征。

表2.序列优化的变体的表征

实施例3-抗体产生和表征

3.1生物产生、净化和纯化

抗3903E11(VL1.3,VH1.2)由CHO-S细胞产生。细胞在补充了葡萄糖的CHO补料分批生长培养基中在37℃下生长。在接种后第3、5、7和10天，用补料组分的混合物向培养物进料。

使用2.2m2 Millistak+Pod D0HC(密理博公司(Millipore)MD0HC10FS1)和1.1m2Millistak+Pod X0HC(密理博公司#MX0HC01FS1)过滤器净化来自生物反应器运行的粗制条件培养基，然后使用Millipore Opticap XL3 0.5/0.2μm过滤器(密理博公司#KHGES03HH3)进行终端过滤。

然后使用标准方法纯化抗体，并在10mM组氨酸，8％海藻糖，pH 5.5和0.05％吐温20中配制。

3.2序列优化的抗TIM3抗体3903(VL1.3，VH1.2)的结合亲和力

作为非限制性示例，对抗TIM3抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)进行进一步的表征。按照实施例1.6和1.8中所述的ELISA方案，测试抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)结合huTIM3-His6、cynoTIM3-His6和狨猴TIM3-His6蛋白。通过ELISA，3903E11(VL1.3，VH1.2)具有与人、猕猴和狨猴TIM3-His蛋白相似的结合(图1和表3)。

还通过流式细胞术测试3903E11(VL1.3，VH1.2)抗体与CHO-hTIM-3细胞的细胞结合，并通过SPR确定与人、猕猴和狨猴TIM-3的结合亲和力(方案述于实施例1.8和1.9)。与CHO-hTIM-3细胞结合的EC50为2.6nM，并且通过SPR确定平衡解离常数(KD)亲和力为2.4nM(人TIM3-His6)、14nM(cynoTIM3-His6)和11nM(狨猴TIM3-His6)(表3)。

表3.抗TIM-3抗体3903E11(VL1.3，VH1.2)的细胞结合EC50、ELISA EC50和亲和力

3.3.3903E11(VL1.3，VH1.2)有效阻断huTIM-3和半乳凝素-9的相互作用

进一步测试3903E11(VL1.3，VH1.2)抗体对TIM-3和半乳凝素-9之间结合相互作用的抑制作用。使用竞争ELISA来测试抗TIM-3抗体对半乳凝素-9与TIM-3结合的影响。简言之，将96孔板用重组人半乳凝素-9蛋白(R&D***公司，#2045-GA)包被过夜，然后洗涤并用3％牛血清白蛋白封闭。使用硫代-NHS-LC-生物素标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司，#21327)对HuTIM-3Fc进行生物素化。将人TIM3-生物素(1μg/ml)与3903E11(VL1.3，VH1.2)抗体或同种型对照抗体在133nM开始的系列稀释液混合，在室温下孵育1小时，然后将抗体/人-TIM3-生物素混合物添加到用人半乳凝素-9包被的板上，并在室温下孵育2小时。将平板洗涤，并通过在室温下与HRP-链霉亲和素(杰克逊免疫研究实验室公司#016-030-084)孵育1小时检测结合的人TIM-3-生物素，并使用TMB HRP底物溶液(BioFx Lab公司#TMBW-1000-01)显影。使用GraphPad Prism软件绘制数据并计算IC50值。同种型对照抗体对huTIM-3结合人半乳凝素-9没有影响，而3903E11(VL1.3，VH1.2)抗体在人半乳凝素-9与huTIM-3之间产生剂量依赖性的结合阻断，IC 50为2.4nM(参见图2A)。

用其他抗TIM-3抗体(ABTIM3-h03和AB TIM3-h11，ABTIM3-mAB 15和ABTIM327.12E1)重复该实验，结果总结在图2B中。除ABTIM3-mAB 15外，只有3903E11(VL1.3，VH1.2)抗体强烈地阻断了半乳凝素-9与huTIM-3的结合。

3.4M6903抗体的构建

设计了效应物阴性同种型抗体，相较于人IgG1同种型，其不结合FcγR，但与FcRn仍然正常结合。该抗体被称为“抗TIM-3-3903E11(VL1.3,VH1.2)-IgG2h(FN-AQ,322A)-delK”抗体，并且也称为M6903，具有λ轻链和工程改造的IgG2同种型。重链CH2区包含旨在取代效应功能的两个氨基酸取代：N297Q(Kabat EU索引)以消除重链N-糖基化，从而降低FcγR结合亲和力和ADCC，和K322A(Kabat EU索引)，以消除C1q结合和废除CDC。还引入了F296A突变(Kabat EU索引)以降低潜在免疫原性。此外，将人IgG2铰链区替换为具有C220S取代的人IgG1铰链(Kabat EU索引)以改善蛋白质稳定性，并删除C端重链赖氨酸以减少异质性(“IgG2h(FN-AQ,322A)-delK”)。M6903在IgG2h(FN-AQ,322A)-delK背景中包含可变轻链VL1.3和可变重链VH1.2(在实施例2.1中描述)。

3.5.M6903有效阻断huTIM-3和半乳凝素-9的相互作用

在基于竞争的ELISA中，M6903，诸如3903E11(VL1.3，VH1.2)抗体(请参阅上文第3.3节)以浓度依赖性方式抑制huTIM-3-生物素与huGal-9的结合(图2C)，IC50为7.46±0.052nM。计算阻断百分率表明，M6903阻断了在抗体不存在的情况下获得的高达55％的TIM-3/Gal-9结合信号。

具体地，将重组人Gal-9蛋白(R&D)以2μg/ml包被于ELISA分析板上，然后用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。用EZ-Link硫代-NHS-LC-生物素化试剂盒(赛默飞世尔科技公司，21327)对重组人TIM-3-Fc嵌合蛋白(R&D，2365-TM)进行生物素化。将生物素化的人TIM-3-Fc(huTIM-3-Fc-生物素)添加到Gal-9包被的试验板，最终浓度为0.5μg/ml huTIM-3-Fc-生物素/试验缓冲液，并用链亲和素标签过氧化物酶偶联抗体(杰克逊免疫研究公司)和TMBHRP底物(BioFX/SurModics IVD，TMBS-1000-01)检测。为了测试抗体对Gal-9与TIM-3结合的抑制，将huTIM-3-Fc-生物素与抗体以50μg/ml起始浓度的11点1:3稀释系列混合，各种抗体一式四份，并在室温下孵育50分钟。在该孵育步骤之后，将huTIM-3-Fc-生物素+抗体混合物添加到Gal-9包被的ELISA分析板上，并在室温下孵育75分钟，然后洗涤并用检测试剂显影和读出OD(450nm)。

3.6.M6903有效阻断huTIM-3和CEACAM1的相互作用

在ELISA结合试验中，通过将可溶重组His-标签标记的CEACAM1蛋白与板结合的重组TIM-3-Fc(rhTIM-3-Fc)孵育来测量TIM-3与CEACAM1的结合。将平板结合的rhTIM-3与M6903一起预孵育以剂量依赖性方式降低了rhTIM-3-Fc结合His标签标记的CEACAM1，IC50为0.353±0.383nM(0.053±0.057μg/mL)，而与同种型对照的预孵育对结合没有影响(图2D)。

具体地，在10mM CaCL2(西格玛公司(Sigma)，C3306-100G)存在的情况下，通过基于ELISA的试验检测到TIM-3与CEACAM1之间的相互作用。在平底96孔MaxiSorp板中，将含10mM CaCL2(Ca2+)的1xTBS(赛默飞世尔科技公司，28358)中的0.5μg rhTIM-3-IgG1-Fc添加到各孔中，并将板在4℃孵育过夜。然后在室温用2％BSA TBS(Ca2+)振荡封闭板1小时。去除上清液后，将TBS(Ca 2+)中的M6903或同种型对照(抗HEL IgG2)添加到各孔中，并将板在室温下孵育1小时，然后将TBS(Ca 2+)中的CEACAM1-多聚His(ARCO，CE1-H5220)添加到各孔中，并将板在室温下振荡孵育1小时。然后洗涤板，并将TBS(Ca 2+)中的抗6XHis-HRP(百乐津公司(Biolegend)，652504)添加到各孔中，然后在室温下振荡孵育1小时。洗涤后，将TMB添加到各孔中，然后在室温下摇动平板20分钟，并向各孔中添加终止溶液。立即使用EnVision酶标仪读取光密度(450nm和570nm)。

3.7测量抗TIM3抗体结合FcγR和FcRn

测量M6903的FcγR和FcRn结合特性，并藉由体外FcγR和FcRn结合试验与合适的对照抗体进行比较。

在Octet Red96(ForteBio)仪器上测量抗体与FcγR和FcRn的结合。具体地，为了测量与FcγR的结合，将200nM浓度的抗体加载至抗人Fab-CH1第二代(FAB2G)传感器尖端(ForteBio部件编号：18-5125)。对于高亲和力FcγR，结合条件为：100nM至1.56nM范围内滴定的FcγR，7点1:2稀释系列；上样300秒，结合180秒，解离300秒。对于低亲和力FcγR，结合条件为：4000nM至62.5nM范围内滴定，7点1:2稀释系列；上样300秒，结合60秒，解离300秒。工作缓冲液包含1％BSA，0.05％吐温-20，PBS pH7.4。FcγR蛋白购自R&D***公司。将以前表征为不存在FcγR结合或效应功能的效应物阴性抗体hu14.18-IgG2h(FN-AQ，K322A)用作传感器扣除(sensor subtraction)的阴性对照。FcγR结合KD值使用Fortebio数据分析软件7.1.0.36版获得。

如所预期，IgG1和效应物阴性同种型“IgG2h(FN-AQ,K322A-delK)”的对照抗体和M6903抗体具有与FcRn的等效结合，范围为620nM至850nM(表4)。抗TIM-3-IgG1(3903E11)结合亲和力KD：100nM(CD16a)、630nM(CD32a)和1.7nM(CD64)。抗GD2 hu14.18-huIgG1结合亲和力KD：215nM(CD16a)、670nM(CD32a)和1.8nM(CD64)。

效应物阴性同种型“IgG2h(FN-AQ,K322A-delK)”的对照抗体和M6903抗体对FcγR没有可检测到的结合(表4)。

这些结果证明，M6903抗TIM-3没有可检测到的FcγR结合活性，但是具有正常的FcRn结合，这是抗TIM3_3903E11(VL1.3,VH1.2)抗体的效应物阴性同种型的关键特性。

表4：测量M6903和对照抗体结合FcγR和FcRn

NB＝无结合

由结合动力学确定的亲和力KD，KD＝kd/ka

稳态KD由稳态结合相对FcγR或FcRn浓度图的分析确定

KD值是2个独立测定值的平均值。

实施例4–表位作图

4.1TIM-3与3903E11(VL1.3，VH1.2)Fab的共结晶

确定TIM-3 ECD和3903E11(VL1.3,VH1.2)(重链：SEQ ID NO:47；轻链SEQ ID NO:48)的Fab片段的复合物的晶体结构。人TIM-3(SEQ ID NO:49(氨基酸)；SEQ ID NO:50(核苷酸))在大肠杆菌包涵体中表达，重折叠并通过亲和力和尺寸排阻色谱法纯化。3903E11(VL1.3，VH1.2)的Fab片段在Expi293F细胞中以His标签标记的构建体表达，并通过亲和层析纯化。形成TIM-3和3903E11(VL1.3，VH1.2)Fab片段的复合物，并通过凝胶过滤色谱法纯化，得到纯度大于95％的均质蛋白质。

通过在4℃使用悬滴蒸汽扩散法将0.75μl蛋白质溶液(在20mM TrisHCL pH 8.0，100mM NaCl中21.8mg/mL)与0.5μl储库溶液(20％PEG400(v/v)，0.1M Tris HCl pH 8.0)混合来生长与人TIM-3复合的Fab 3903E11(VL1.3，VH1.2)的晶体。

将晶体急速冷冻并在100K的温度下测量。X射线衍射数据使用冷冻条件在SWISSLIGHT SOURCE(SLS，瑞士维利根)收集。晶体属于C 2 2 21空间群。使用程序XDS和XSCALE处理数据。

通过分子置换获得确定和分析结构所需的相信息。将已公开的结构PDB-ID 5F71和1NL0分别用作TIM3和Fab片段的搜索模型。根据标准方案使用软件包CCP4和COOT进行了后续模型构建和完善。为了计算自由R因子(free R-factor)(对最终模型的正确性进行交叉验证的度量)，将约0.9％的反射测量值由优化过程中剔除(参见表5)。进行TLS优化(使用REFMAC5，CCP4)，这导致了较低的R因子和较高质量的电子密度图。配体参数化和相应库文件的生成分别使用CHEMSKETCH和LIBCHECK(CCP4)进行。使用COOT的“Find waters”算法构建水模型：通过将水分子放置在3.0轮廓化的Fo-Fc图的峰中，然后用REFMAC5进行优化，并使用COOT验证工具检查所有水。可疑水(suspicious water)列表的标准是：B-因子大于

2Fo-Fc图小于

距离最近接触小于

或大于

可疑水分子和在配体结合位点中的那些(与配体的距离小于

)经人工检查。最终模型的拉马钱德兰图(Ramachandran Plot)显示：所有残基中的85.4％处于在最有利区域中，13.9％处于另外允许的区域中，并且0.2％的处于通常允许区域中。在拉马钱德兰图不允许的区域存在残基Arg81(A)，Arg81(B)，Val53(L)，Asp153(L)，Val53(M)，Asp153(M)，Val53(N)，Val53(O)和Asp153(O)。它们要么通过电子密度图确认，要么无法以另一种合理的构象来建模。

表5.TIM3的数据收集和处理统计信息

¹SWISS LIGHT SOURCE(SLS，瑞士维利根)

²括号中的值是指最高分辨率

3

其中I_h，i是h的第i

个测量值的强度值

⁴

其中I_h，i是h的第i个测量值的强度值

⁵用独立的反射计算

表位残基定义为在3903E11(VL1.3，VH1.2)Fab的重原子的5埃内具有重原子的TIM-3的所有残基。使用BioPython软件包由最终晶体坐标测量距离。仅报告存在于不对称单元的4个复合物中的3个中的接触(表6)。表6列出了TIM-3和3903E11(VL1.3，VH1.2)之间的相互作用。TIM-3残基如Uniprot编码Q8TDQ0-1(SEQ ID NO:51)编号。抗体残基参考SEQID NO:47(重链，“H”)和SEQ ID NO:48(轻链，“L”)编号。此处列出的残基在穿过界面的重原子的5埃内具有至少一个重原子。

表6：huTIM-3和mAb 3903E11(VL1.3，VH1.2)之间的相互作用

图3A-D显示了与M6903复合的人TIM-3的晶体结构。图3A显示了M6903的Fab部分(上部结构)的概况，其结合TIM-3，以表面形式显示。TIM-3(底部结构)上进行的大量接触显示为TIM-3较亮部分。大部分接触发生在M6903重链和轻链的第三个互补决定区(CDR-L3)。图3B显示了TIM-3的表位热点残基(例如，P59和F61和E62)。残基与M6903形成广泛的疏水和静电相互作用。图3C显示了ptdSer(浅色棒)的极性头基团和配位的钙离子(球体)已通过与鼠TIM-3的结构叠加而建模为结合M6903的TIM-3的结构(DeKruyff等(2010),同上)。ptdSer的结合位点与M6903的重链Y59(球体群)的位置重合。点线显示了TIM-3上D120到ptdSer或M6903的氢键。图3D用虚线显示了M6903与TIM-3的CEACAM-1结合残基的极性相互作用。

4.2诱变

为了鉴定对结合有力贡献的表位残基，将人TIM-3中选定的残基突变为丙氨酸(大到小)或甘氨酸，如果选定的残基为丙氨酸或切换侧链的电荷。如实施例1.9中所述，设计了总共11种人TIM-3点突变体，在HEK细胞中表达和纯化，并使用表面等离振子共振测试与M6903的结合。确定该抗体对野生型和各突变体的亲和力。结果总结于表7。

将突变体与野生型TIM-3(hu TIM-3)进行比较。给出了野生型和突变蛋白的荧光监测的热变性的温度中点。给出了通过分析性SEC确定的单体百分比。对于KD和T1/2，给出n>1时的平均值和标准差。重要的是要确认缺少对特定点突变体的结合的确是由于残基相互作用的丧失而不是该抗原的整体展开。使用荧光监测的热解折叠(FMTU)试验确认突变蛋白质的结构完整性，其中将蛋白与染料孵育，所述染料在水溶液中淬灭但在通过暴露于疏水残基而结合时发出荧光。随着温度的升高，蛋白质热变性使疏水性核心残基暴露，而这可以通过染料荧光的增强来监控。解链曲线通过方程式1中概述的波尔兹曼方程(Boltzmannequation)(改进自(Bullock等1997))拟合到数据，以确定曲线拐点处的温度(T1/2)。计算的T1/2记录在表7中。

方程式1：

表7：TIM-3变体与抗体结合的总结

NB＝无可检测到的结合；nd＝未确定用于数据质量控制；*＝潜在的构象不稳定或间接接触

M6903显示了TIM-3单点突变体P59A、F61A、E62A、I114A、N119A和K122A结合的减少或丧失(参见表7)。残基P59A、F61A、E62A、I114A、N119A和K122A驻留在免疫球蛋白折叠的一个β折叠的面上，如模型所示(参见图4)，并且存在于人TIM-3的CC’和FG环中，已经证明环与Ptd-Ser结合有关。M6903与Ile-114侧链的接触并不明显；突变引起的中度有害作用被解释为环区域的局部不稳定。Lys-122最接近的交叉界面(cross-interface)接触是

并与抗体的骨架羰基发生。在此距离上可能发生水桥(water-bridging)相互作用，但鉴于晶体结构的分辨率可能无法观察到。如果通过水桥桥接了缺口，那么可以解释K122A突变的有害作用。

通过SEC，FMTU评估，TIM-3突变体R111和F123显示出低稳定性，并且观察到的R111和F123突变体的任何结合降低可能是由于蛋白质的不稳定而不是与抗体的关键相互作用所致。因此，表7指示用于M6903结合包括P59A，F61A和E62A的热点残基(也参见图4)。

使用已知抗体ABTIM3-h03 ABTIM3-mAB 15和27.12E12重复实验。结果示于表7和图8。对于已知抗体mAb h03，残基P59A、I114A、M118A和K122A被鉴定为结合界面中对结合产生影响的残基。特别地，证明K122和F123为mAb h03的热点。这些位置在mAb h03所报告的结合足迹中(US20150218274A1，hum21是h03的Fab形式)。因此，虽然一些突变hu TIM-3蛋白导致与M6903和ABTIM3-h03的结合丧失，但是其他huTIM-3突变体仅导致与M6903的结合丧失，这表明这两种抗体具有部分重叠但不同的表位。

尽管在表位分箱实验中观察到竞争，但是其他已知抗体27.12E12和mab15在这组TIM-3变体蛋白中没有发现热点，这表明M6903和ABTIM-3-mab15具有不重叠的表位。

表8：突变扫描鉴定M6903表位中的热点残基

ND＝无可检测到的结合

*＝潜在的构象不稳定或间接接触

实施例5–抗TIM-3抗体的药理学研究

以下研究涉及抗TIM3抗体M6903。M6903在

IgG2h(FN-AQ,322A)-delK背景中包含3903E11(VL1.3，VH1.2)的轻链和重链可变区(抗TIM3-3903E11(VL1.3,VH1.2)-IgG2h(FN-AQ,322A)-delK)。M6903的轻链和重链分别对应SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。

5.1抗TIM-3的靶标占用率

使用抗TIM-3(A16-019-1)(其与M6903相同，但是在Expi293F而不是在CHOK1SV细胞中产生)证明M6903结合TIM-3的能力。使用人全血样品通过流式细胞术测量CD14+单核细胞上抗TIM-3(A16-019-1)的靶标占有率。样品与抗TIM-3(A16-019-1)，然后是TIM-3(2E2)-APC(已经证明其与抗TIM-3(A16-019-A)竞争结合CD14+单核细胞上的TIM-3)的系列稀释液孵育。如所预期，靶占有率％随着抗TIM-3(A16-019-1)浓度增加而增加，并且在所有10个供体的平均EC50为111.1±85.6ng/ml(参见图5)。最高剂量显示达到饱和。

5.2M6903有效阻断凋亡Jurkat细胞上PtdSer和rhTIM-3的相互作用

通过基于流式细胞术的结合试验确定了M6903阻断TIM-3与其配制之一PtdSer相互作用的能力。凋亡Jurkat细胞用作PtdSer的来源，因为诱导细胞凋亡导致PtdSer暴露于这些细胞的细胞膜上。具体地，在进行流式细胞术分析前，通过用星形孢菌素(2μg/mL，18小时)处理在Jurkat细胞中诱导细胞凋亡，导致TIM-3配体PtdSer的表面表达。在用M6903或抗HEL IgG2h同种型对照的系列稀释液预孵育后，通过流式细胞术测量rhTIM-3-Fc AF647的平均荧光强度(MFI)来评估细胞凋亡Jurkat细胞表面上rhTIM-3-Fc PtdSer的结合。用M6903预孵育rhTIM-3AF647导致TIM-3-Fc对凋亡Jurkat细胞的结合降低，而用同种型对照预孵育对rhTIM-3-Fc结合没有影响(参见图6)。因此，M6903能够以剂量依赖性方式有效阻断TIM-3与PtdSer之间的相互作用，IC50为4.438±3.115nM(0.666±0.467μg/mL)。使用Sigmoid剂量反应方程将非线性拟合线应用于图表。据推测，这种TIM-3/PtdSer相互作用的阻断可能导致抑制性TIM-3信号转导的抑制，并因此增强了免疫细胞活化。

5.3M6903作为单一疗法或与阿维单抗或必特芙普α联用时对T细胞回忆反应和活化的影响

M6903处理增加人PBMC的IFN-γ产生，所述人PBMC通过暴露于CEF抗原激活，其特异性地引发先前感染CEF的供体的PBMC中的CEF抗原特异性T细胞回忆反应。在存在M6903连续稀释液的情况下，用40μg/ml CEF病毒肽库处理PBMC(A)6天或(B)4天。如图7A所示，使用人IFN-γELISA试剂盒通过多次实验计算的IFN-γ产生测得，相较于CEF试验中的同种型对照，M6903剂量依赖性地增强T细胞活化，EC50为1±1.3μg/mL。进行非线性回归分析，并表示平均值和SD。

如图7B所示，M6903的系列稀释液与10μg/mL同种型对照或必特芙普α组合。。在M6903和必特芙普α的组合存在的情况下，IFN-γ的产生被进一步增强，这表明组合可能导致T细胞活化的进一步增强。图7B表示平均值和SD(p<0.05)。

使用IL-2将经辐照的Daudi肿瘤细胞与人T细胞共培养7天，以诱导同种异体反应性T细胞扩增。然后收获T细胞并与新鲜辐照的Daudi细胞共培养，并用M6903抗体或同种型对照处理2天。T细胞活化通过IFN-γELISA测量，并且相较于同种型对照，M6903在这些细胞中显示出剂量依赖性增强IFN-γ产生，EC 50＝116±117ng/mL(参见图8)。添加阿维单抗或必特芙普α进一步增强了M6903对T细胞活化的作用(参见图8)。

M6903处理增加了通过暴露于超抗原SEB而激活的人PBMC中的IFN-γ产生，所述超抗原SEB通过使T细胞受体(TCR)和MHC II类分子交联非特异性地激活CD4+T细胞。将M6903(10μg/mL)与100ng/mL SEB单独或与阿维单抗或必特芙普α(10μg/mL)组合孵育9天，然后将细胞用培养基洗涤一次，并用100ng/mL SEB和具有相同浓度的抗体溶液再刺激2天。通过使用人IFN-γELISA试剂盒测量上清液中的人IFN-γ。M6903处理增强IFN-γ产生(参见图9A和9B)。当M6903处理与阿维单抗或必特芙普α组合时，IFN-γ的产生进一步增强(参见图9A和9B)。

5.4需要双重阻断Gal-9/PtdSer以增强与M6903活性相关联的T细胞活性

刺激PBMC：用40μg/ml CEF(巨细胞病毒、EB病毒和流感病毒)病毒肽库(AnaSpec，AS-61036-025)刺激4天，在具有5％人AB血清(山谷生物医学公司(Valley Biomedical)，HP1022)的AIM-V培养基(英杰公司#12055-091)中，存在10μg/ml M6903，10μg/ml抗Gal-9(9M1-3；百乐津公司，348902)或10μg/ml抗PtdSer(巴维昔单抗(Bavituximab)；创新生物实验室公司(Creative Biolabs)TAB-175)，或者用抗体浓度为10μg/ml的M6903和10μg/ml的抗Gal-9，10μg/ml的M6903和10μg/ml抗PtdSer，或10μg/ml的抗Gal-9和10μg/ml的抗PtdSer。通过胸苷纳入测量增殖。通过ELISA(R&D***公司，DY285B)测量培养上清液中的IFN-γ，并将结果示于图10(代表至少3个实验；p<0.05。如图所示，抗Gal-9和抗PtdSer的组合(而非任一单独的抗体)在CEF试验中显示出对M6903相似的活性，这表明在该试验中抗TIM-3活性可能需要阻断Gal-9和PtdSer对TIM-3的结合。此外，M6903与抗Gal-9或抗PtdSer的组合不能进一步增加IFNγ产生，这表明M6903完全阻断了Gal-9和PtdSer与TIM-3的结合。

5.5对正常人组织和肿瘤中TIM-3受体和配体表达概况

然后使用发色IHC和mIF验证的试验探索TIM-3及其配体的表达。然后使用代表人体中35种不同组织的FDA正常组织微阵列(TMA)评估正常人类组织中的TIM-3表达。在大多数组织中都观察到了TIM-3的表达，并且对免疫细胞具有特异性，除了在肾皮质中，其中在上皮细胞中也观察到了特异性TIM-3表达。在免疫组织脾脏、扁桃体和***以及免疫丰富的器官肺、胎盘和肝组织中观察到最高的免疫反应性。在免疫器官中，TIM-3表达主要在巨噬细胞(和可能DC)上观察到，但在淋巴细胞上未观察到(数据未显示)。仅在发炎的组织中观察到淋巴细胞上的TIM-3表达(数据未显示)。

对代表12种不同肿瘤类型的15种肿瘤TMA的染色模式的综述显示，TIM-3表达主要在除了肾细胞癌(RCC)以外的所有适应症的浸润性免疫细胞上观察到。从表型上看，T细胞和髓样细胞对TIM-3染色呈阳性(数据未显示)。TIM-3的肿瘤细胞表达仅在RCC中可见(数据未显示)。当使用来自这些肿瘤TMA的数字图像分析染色对TIM-3⁺细胞的频率进行定量时，RCC显示出最高频率的TIM-3阳性(参见图11A和11B)，这可能是由于RCC中肿瘤细胞上的TIM-3表达，而非其它肿瘤类型所致。这样分析这些数据：(1)计算平均表达并通过递增中值表达绘制数据(图11A)和(2)计算剔除异常值后的平均表达，并通过递减中值表达绘制数据(图11B)。具有高TIM-3水平的其它适应症包括NSCLC，胃腺癌(STAD)，三阴性乳腺癌(TNBC)和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)(参见图11A和11B)。

然后使用mIF分析对肿瘤TMA进行染色以鉴定在TME中表达TIM-3的免疫细胞。发现TIM-3在CD3⁺淋巴细胞和CD68⁺巨噬细胞的子集上表达。数字定量显示，虽然在所有分析的适应症中巨噬细胞形成了大部分TIM-3⁺细胞，但是仅在NSCLC和STAD肿瘤中观察到了高频率的TIM-3⁺T细胞(参见图12)。这些结果在13个NSCLC肿瘤样本组中的流式细胞术分析中得到了证实；在活CD3⁺群中，CD8⁺T细胞具有最高中值百分比的TIM-3⁺细胞(5.126±2.331％)，然后是CD4⁺效应细胞(3.398±0.732％)和CD4⁺Treg(1.316±0.310％)(参见图13)。

最后，在TCGA RNASeq数据和mIF分析中评估了TIM-3表达与配体Gal-9、CEACAM-1和HMGB1的相关性(参见表9)。TIM-3表达与配体(mRNA和蛋白质)表达的皮尔逊相关性表明Gal-9表达在多种适应症中呈正相关。对于CEACAM-1和HMGB1表达不是这样。接近1的值是最正相关的，而接近-1的值是最负相关的，接近0的值表示几乎没有相关性。

表9：使用mIF分析检测TIM-3和其配体

5.6抑制平台

由于人TIM-3蛋白与小鼠TIM-3蛋白缺少交叉反应性，因此体内模型不易用于询问M6903的抗肿瘤活性。因此，为了确定M6903是否具有任何抗肿瘤功效，使用了CANscriptTM人肿瘤微环境(TME)平台(由MITRA Biotech开发)。CANscriptTM平台是一种功能试验，其复制患者的个人肿瘤微环境，包括免疫区室。使用多种生化和表型试验读出应用于肿瘤组织碎片的药物治疗的体外反应。这些肿瘤反应通过CANscriptTM技术的算法整合到一个可以预测药物功效的‘M’-评分中。

使用该平台，在来自20名头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者的样品中以单一疗法或与必特芙普α联用的形式对M6903进行了测试。M-评分根据给定肿瘤标本的多个输入参数预测治疗结果。阳性反应预测与大于25的M评分相关联(表10中的粗体数字)。阴性反应预测与25或更低的M评分相关联。对于对照治疗没有M-评分，因为M-评分值源自相对于对照未处理的样品的参数。

使用M评分作为功效的读出，在3/20(15％)用M6903治疗的肿瘤样品，7/20(35％)用必特芙普α治疗的肿瘤样品和9/20(45％)用M6903和必特芙普α组合治疗的肿瘤样品中观察到阳性预测反应(参见表9)，这表明M6903具有抗肿瘤活性，其在与必特芙普结合联用时增强。

表10：累积SCCHN肿瘤的M评分分析

实施例6–体内抗TIM-3抗体研究

6.1动物

使用了两种TIM-3敲入小鼠模型。7-12周龄雌性和雄性“hu-TIM-3KI”小鼠(C57BL/6背景)获自南京银河生物药业公司(Nanjing Galaxy Biopharma)，而6-8周龄雌性“B-hu-TIM-3KI”小鼠(C57BL/6背景)获自北京生物细胞源有限公司(Beijing Biocytogen Co.,Ltd.)。两种人源化小鼠模型都是通过在C57BL/6遗传背景下将小鼠中TIM-3受体的鼠胞外域替换为TIM-3受体的人胞外域而开发的。南京银河生物药业公司通过使用Loxp-PGK/Neo-Loxp盒重组将鼠TIM-3受体胞外和跨膜结构域(外显子2-5)替换为人TIM-3受体相应的结构域来生成hu-TIM-3KI小鼠。生物细胞源公司(Biocytogen)使用CRISPR/Cas9重组技术通过仅将小鼠IgV胞外域(外显子2)替换为相应的人结构域开发了B-hu-TIM-3KI小鼠，从而保留了小鼠TIM-3受体其余胞内和胞质结构域的完整。

6.2huTIM-3KI小鼠中生长的M6903/阿维单抗处理的MC38肿瘤的免疫概况

为了测试用M6903单药疗法或与阿维单抗联用治疗的体内效果，将MC38结直肠癌细胞皮下植入人源化的TIM-3敲入小鼠(huTIM-3KI)。在开始用M6903、阿维单抗或两者的组合治疗后6天，通过流式细胞术分析huTIM-3KI小鼠中建立的MC38肿瘤中的免疫细胞群。尽管在治疗组之间活CD45+细胞的百分比没有差异(图14A)，但是CD45+群内的免疫细胞群的百分比受到治疗的影响。具体地，相对于同种型对照,CD3+细胞百分比在用阿维单抗(7mg/kg)单药疗法(P＝0.0232)或M6903和阿维单抗的组合(P＝0.0445)处理的肿瘤中显著增加(参见图14B)。用阿维单抗单药疗法(P＝0.0092)或双重组合疗法(P＝0.0127)还显著增加CD8+T细胞，并且相对于同种型对照，阿维单抗单药疗法(P＝0.0172)增加NK细胞(参见图14B)。然而，相对于用阿维单抗单药疗法治疗的肿瘤，肿瘤浸润CD3+白细胞或CD8+T细胞的百分比在用联合疗法治疗的肿瘤中没有显著差异。

为了评估经治疗的具有耗竭的表型的肿瘤内的T细胞百分比，分析共表达免疫检查点抑制剂CTLA-4、LAG-3、PD-1和TIM-3的CD4+和CD8+T细胞百分比。M6903单药疗法显著增加CD4+PD-1+(P＝0.0062)，并且用阿维单抗单药疗法治疗增加CD4+PD-1+(P＝0.0026)和CD8+TIM-3+(P＝0.0069)细胞的百分比。然而，M6903和阿维单抗的组合对这些T细胞亚群具有协同作用并显著降低了共表达LAG-3(P＝0.0012)、PD-1(P＝0.0001)和TIM-3(P＝0.0018)的CD4+细胞百分比，以及共表达LAG-3(P<0.0001)、PD-1(P<0.0001)和TIM-3(P<0.0001)的CD8+细胞百分比(参见图14C)。这些结果表明，M6903和阿维单抗的双重组合协同减少肿瘤微环境中的耗竭的T细胞。

6.3具有MC38肿瘤的B-huTIM-3KI小鼠中M6903/阿维单抗的抗肿瘤功效

在皮下植入MC38肿瘤的B-huTIM-3KI小鼠模型中测试了M6903和阿维单抗联合疗法的抗肿瘤功效。用同种型对照(20mg/kg；静脉内(i.v)；在第0、3、6天)，阿维单抗(20mg/kg；静脉内；在第0、3、6天)，M6903(10mg/kg；腹膜内；q3dx7)或阿维单抗和M6903的组合治疗小鼠(N＝10/组)。治疗开始27天后，相对于同种型对照，发现用阿维单抗单药疗法(T/C＝34.3％，TGI＝67.3％，P<0.0001)或M6903单药疗法(T/C＝80.4％，TGI＝20％，P＝0.0038)具有显著的抗肿瘤活性(参见图15A)。相对于M6903单药疗法，组合M6903和阿维单抗进一步增强抗肿瘤活性(T/C＝30.4％，TGI＝71.2％)(P<0.0001)，虽然相对于阿维单抗单药疗法不显著(参见图15A，B)。此外，相对于同种型对照(31天)和M6903(32.5天)和阿维单抗(38天)单药疗法，组合疗法略微提高中值存活率(41天)(参见图15C)。

6.4具有MC38肿瘤的B-huTIM-3KI小鼠中M6903/必特芙普α的抗肿瘤功效

在皮下植入MC38肿瘤的B-huTIM-3KI小鼠模型中测试了M6903和必特芙普α联合疗法的抗肿瘤功效。用同种型对照(20mg/kg；静脉内；在第0、3、6天)，必特芙普α(24mg/kg；静脉内；在第0、3、6天)，M6903(10mg/kg；腹膜内；q3dx7)或必特芙普α和M6903的组合治疗小鼠(N＝10/组)。治疗开始28天后，相对于同种型对照，发现用必特芙普α单药疗法(TGI＝25.7％，P＝0.0054)或M6903单药疗法(TGI＝18.2％，P＝0.0281)具有显著的抗肿瘤活性(参见图16A)。相对于M6903(P＝0.0011，第28天)和必特芙普α(P＝0.0018，第28天)单药疗法，组合M6903和必特芙普α进一步增强抗肿瘤活性(TGI＝54.6％)(参见图16A，B)。未观察到显著的治疗相关体重减轻(数据未显示)。

通过引用纳入

本文提及的每篇专利文献和科学论文的全部公开内容通过援引纳入本文用于所有目的。

等同形式

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。因此，前述实施例在所有方面都被认为是说明性的而不限制本文所述的发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而非以上说明来指示，并且涵盖权利要求含义和等同范围内的所有改换形式。

序列表

抗TIM3抗体：优化

M6903(抗TIM3-3903E11(VL1.3,VH1.2)-huIgG2h(FN-AQ,K322A)-delK):氨基酸

M6903(抗TIM3-3903E11(VL1.3,VH1.2)-huIgG2h(FN-AQ,K322A)-delK):核苷酸

TIM3序列(和其他)

SEQ ID NO:41:人TIM-3胞外域(氨基酸序列,NP_116171)

SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIG

SEQ ID NO:42:cynoTIM-3胞外域(氨基酸序列,XP_005558438)

SEVEYIAEVGQNAYLPCSYTPAPPGNLVPVCWGKGACPVFDCSNVVLRTDNRDVNDRTSGRYWLKGDFHKGDVSLTIENVTLADSGVYCCRIQIPGIMNDEKHNVKLVVIKPAKVTPAPTLQRDLTSAFPRMLTTGEHGPAETQTPGSLPDVNLTQIFTLTNELRDSGATIRTA

SEQ ID NO:43:人TIM-3 ECD带His标签(氨基酸序列,Novoprotein目录号C356)

SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRVDHHHHHH

SEQ ID NO:44:人TIM-3 ECD带His标签(氨基酸序列,Novoprotein目录号CD71)

SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRVDDIEGRMDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH

SEQ ID NO:45:狨猴(marmoset)TIM-3ECD(氨基酸序列,Novoprotein目录号CM64)

EEYIVEVGQNAYLPCFYTLDTPGNLVPVCWGKGACPVFECGDVVLRTDERDVSYRTSSRYWLNGDFHKGNVTLAIGNVTLEDSGIYCCRVQIPGIMNDKKFNLKLVIKPAKVTPAPTLPRDSTPAFPRMLTTEDHGPAETQTLEILHDKNLTQLSTLANELQDAGTTIRIHHHHHH

SEQ ID NO:46:小鼠TIM-3胞外域(氨基酸序列,NP_599011)

RSLENAYVFEVGKNAYLPCSYTLSTPGALVPMCWGKGFCPWSQCTNELLRTDERNVTYQKSSRYQLKGDLNKGDVSLIIKNVTLDDHGTYCCRIQFPGLMNDKKLELKLDIKAAKVTPAQTAHGDSTTASPRTLTTERNGSETQTLVTLHNNNGTKISTWADEIKDSGETIRTA

SEQ ID NO:47:用于结晶的3903E11 Fab片段的HC

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISVSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKANWGFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCAAAHHHHHH

SEQ ID NO:48:用于结晶的3903E11 Fab片段的LC

SYELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIFDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYADSVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:49:人TIM-3 ECD(表达于大肠杆菌中用于晶体学分析)

MSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIK

SEQ ID NO:50:人TIM-3 ECD的核苷酸序列(表达于大肠杆菌中用于晶体学分析)

ATGAGCGAGGTGGAATATCGGGCCGAAGTGGGCCAGAACGCCTACCTGCCTTGCTTCTACACACCAGCCGCCCCTGGCAACCTGGTGCCTGTGTGTTGGGGAAAGGGCGCCTGCCCTGTGTTCGAGTGCGGCAACGTGGTGCTGAGAACCGACG

AGCGGGACGTGAACTACTGGACCAGCCGGTACTGGCTGAACGGCGACTTCAGAAAGGGCGACGTGTCCCTGACCATCGAGAACGTGACCCTGGCCGACAGCGGCATCTACTGCTGCAGAATCCAGATCCCCGGCATCATGAACGACGAGAAGTTCAACCTGAAGCTCGTGATCAAGTAA

SEQ ID NO:51人TIM-3同种型1(Uniprot代码Q8TDQ0-1)

MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP

Claims

1.一种结合人TIM-3的分离抗体，其包含

(i)免疫球蛋白重链可变区，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR_H1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR_H2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR_H3；和

(ii)免疫球蛋白轻链可变区，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR_L1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR_L2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR_L3。

2.一种包含核苷酸序列的分离核酸，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的免疫球蛋白重链可变区。

3.一种包含核苷酸序列的分离核酸，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的免疫球蛋白轻链可变区。

4.一种表达载体，其包含权利要求2所述的核酸。

5.一种表达载体，其包含权利要求3所述的核酸。

6.如权利要求4所述的表达载体，还包含权利要求3所述的核酸。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的表达载体。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的表达载体。

10.如权利要求7所述的宿主细胞，还包含权利要求5所述的表达载体。

11.一种产生包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括：

(a)在权利要求7或8所述的宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使所述宿主细胞生长；和

(b)对包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽进行纯化。

12.一种产生结合人TIM-3的抗体或所述抗体的抗原结合片段的方法，所述方法包括：

(a)在权利要求9或10所述的宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使所述宿主细胞生长，从而产生所述抗体或所述抗体的抗原结合片段；和

(b)对所述抗体或所述抗体的抗原结合片段进行纯化。

13.一种结合人TIM-3的分离抗体，其包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区选自下组：SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:34，而所述免疫球蛋白轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:23和SEQ ID NO:33。

14.一种结合人TIM-3的分离抗体，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的免疫球蛋白重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的免疫球蛋白轻链可变区。

15.一种包含核苷酸序列的分离核酸，所述核苷酸序列编码权利要求13或14中所述的免疫球蛋白重链可变区。

16.一种包含核苷酸序列的分离核酸，所述核苷酸序列编码权利要求13或14中所述的免疫球蛋白轻链可变区。

17.一种表达载体，其包含权利要求15所述的核酸。

18.一种表达载体，其包含权利要求16所述的核酸。

19.如权利要求18所述的表达载体，还包含权利要求15所述的核酸。

20.一种宿主细胞，其包含权利要求17所述的表达载体。

21.一种宿主细胞，其包含权利要求18所述的表达载体。

22.一种宿主细胞，其包含权利要求19所述的表达载体。

23.如权利要求21所述的宿主细胞，还包含权利要求17所述的表达载体。

24.一种产生包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括：

(a)在权利要求20或21所述的宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使所述宿主细胞生长；和

25.一种产生结合人TIM-3的抗体或所述抗体的抗原结合片段的方法，所述方法包括：

(a)在权利要求22或23所述的宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的多肽的条件下使所述宿主细胞生长，从而产生所述抗体或所述抗体的抗原结合片段；和

(b)对所述抗体或所述抗体的抗原结合片段进行纯化。

26.一种结合人TIM-3的分离抗体，其包含选自下组的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的免疫球蛋白重链，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的免疫球蛋白轻链；和

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的免疫球蛋白重链，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的免疫球蛋白轻链。

27.一种包含核苷酸序列的分离核酸，所述核苷酸序列编码权利要求26所述的免疫球蛋白重链。

28.一种包含核苷酸序列的分离核酸，所述核苷酸序列编码权利要求26所述的免疫球蛋白轻链。

29.一种表达载体，其包含权利要求27所述的核酸。

30.一种表达载体，其包含权利要求28所述的核酸。

31.如权利要求30所述的表达载体，还包含权利要求27所述的核酸。

32.一种宿主细胞，其包含权利要求29所述的表达载体。

33.一种宿主细胞，其包含权利要求30所述的表达载体。

34.一种宿主细胞，其包含权利要求31所述的表达载体。

35.如权利要求33所述的宿主细胞，还包含权利要求29所述的表达载体。

36.一种产生包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的方法，所述方法包括：

(a)在权利要求32或33所述的宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的条件下使所述宿主细胞生长；和

(b)对包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽进行纯化。

37.一种产生结合人TIM-3的抗体或所述抗体的抗原结合片段的方法，所述方法包括：

(a)在权利要求34或35所述的宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的多肽的条件下使所述宿主细胞生长，从而产生所述抗体或所述抗体的抗原结合片段；和

(b)对所述抗体或所述抗体的抗原结合片段进行纯化。

38.如权利要求1、13或26中任一项所述的抗体，其中，通过表面等离子体共振测得所述抗体的K_D为9.2nM或更低。

39.一种分离抗体，其与权利要求1所述的抗体竞争结合人TIM-3上的半乳凝素-9结合位点。

40.一种分离抗体，其与权利要求1所述的抗体竞争结合人TIM-3上的PtdSer结合位点。

41.一种分离抗体，其与权利要求1所述的抗体竞争结合人TIM-3上的癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)。

42.一种分离抗体，其与权利要求1所述抗体结合人TIM-3蛋白上的相同表位，其中所述表位包括人TIM-3蛋白的P59、F61、E62和D120。

43.一种下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的方法，所述方法包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的权利要求1、13或26中任一项所述的抗体以下调至少一种耗竭标志物。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述方法还包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的第二治疗剂。

45.如权利要求44所述的方法，其中，所述第二治疗剂是抗PD-L1抗体。

46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中，所述耗竭标志物是CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。

47.一种增强T细胞活化的方法，所述方法包括将T细胞暴露于有效量的权利要求1、13或26中任一项所述的抗体，从而增强所述T细胞的活化。

48.如权利要求47所述的方法，其中，所述方法还包括将所述T细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

49.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1、13或26中任一项所述的抗体，以抑制所述肿瘤细胞增殖。

50.如权利要求49所述的方法，其中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

51.一种抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括将所述哺乳动物暴露于有效量的权利要求1、13或26中任一项所述的抗体，以抑制所述哺乳动物中的肿瘤生长。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述方法还包括将所述哺乳动物暴露于有效量的第二治疗剂。

53.一种治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括给予有此需要的哺乳动物有效量的如权利要求1、13或26中任一项所述的抗体。

54.如权利要求53所述的方法，其中，所述方法还包括将有效量的第二治疗剂给予所述哺乳动物。

55.如权利要求53或54所述的方法，其中，所述癌症选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。

56.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。

57.用于下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的方法的权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体，所述方法包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的所述抗体，以下调至少一种耗竭标志物。

58.如权利要求57所述的抗体，其中，所述方法还包括将所述肿瘤微环境暴露于有效量的第二治疗剂。

59.如权利要求58所述的抗体，其中，所述第二治疗剂是抗PD-L1抗体。

60.如权利要求57-59中任一项所述的抗体，其中，所述耗竭标志物是CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。

61.用于增强T细胞活化的方法的权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体，所述方法包括将T细胞暴露于有效量的所述抗体，从而增强所述T细胞的活化。

62.如权利要求61所述的抗体，其中，所述方法还包括将所述T细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

63.用于抑制肿瘤细胞增殖的方法的权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的所述抗体，以抑制所述肿瘤细胞增殖。

64.如权利要求63所述的抗体，其中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞暴露于有效量的第二治疗剂。

65.用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法的权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体，所述方法包括将所述哺乳动物暴露于有效量的所述抗体，以抑制所述肿瘤增殖。

66.如权利要求65所述的抗体，其中，所述方法还包括将所述哺乳动物暴露于有效量的第二治疗剂。

67.用于治疗哺乳动物中癌症的方法的权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体，所述方法包括将有效量的所述抗体给予有此需求的哺乳动物。

68.如权利要求67所述的抗体，其中，所述方法还包括将有效量的第二治疗剂给予所述哺乳动物。

69.如权利要求67或68所述的抗体，其中，所述癌症选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。

70.如权利要求57-69中任一项所述的抗体，其中，所述哺乳动物是人。

71.权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体在制备用于下调肿瘤微环境中至少一种耗竭标志物的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

72.如权利要求71所述的用途，其中，所述第二治疗剂是抗PD-L1抗体。

73.如权利要求71或72所述的用途，其中，所述耗竭标志物是CTLA-4、LAG-3、PD-1或TIM-3。

74.权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体在制备用于增强T细胞活化的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

75.权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

76.权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体在制备用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

77.权利要求1、13、26或38-42中任一项所述的抗体在制备用于治疗哺乳动物中癌症的药物中的用途，任选地，与第二治疗剂联用。

78.如权利要求77所述的用途，其中，所述癌症选自下组：弥漫性大B细胞淋巴瘤，肾细胞癌(RCC)，非小细胞肺癌(NSCLC)，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，三阴性乳腺癌(TNBC)或胃/胃腺癌(STAD)。

79.如权利要求71-78中任一项所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。