CN112118869A

CN112118869A - 靶向糖蛋白vi的抗体

Info

Publication number: CN112118869A
Application number: CN201980032205.9A
Authority: CN
Inventors: K·乌兰; J·诺伊格鲍尔; S·伦滋
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys AG
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2020-12-22
Also published as: KR20210013090A; JP2021532732A; US20210214435A1; CA3097253A1; US11542329B2; JP7080352B2; WO2019219765A1; EP3793596A1; AU2019270342A1

Abstract

本公开提供了对GPVI特异的抗体或抗体片段。具体而言，本公开涉及具有组合的有益性质并因此可用于治疗或预防GPVI相关病症或病况，例如血栓形成性或血管性病症的抗体或抗体片段。

Description

靶向糖蛋白VI的抗体

技术领域

本申请涉及结合糖蛋白VI(GPVI)的抗体或抗体片段(例如Fab)。本公开还涉及能够表达所述抗体或抗体片段的核酸、载体和宿主细胞，包含所述抗体或抗体片段的药物组合物，以及所述抗体或抗体片段用于治疗特定病症的用途。

背景技术

血小板活化在动脉血栓形成性和心血管性病症的发展中是至关重要的。患有这些病症的患者通常用抗血小板药物治疗，所述抗血小板药物通过靶向该过程中的晚期事件而干扰血栓形成。这些药物的一个严重副作用是延长的出血，这限制了它们的使用。

GPVI是一种主要的胶原蛋白受体，只在血小板和巨核细胞上表达。GPVI与胶原蛋白(其是内皮下基质的最重要的血栓形成组分之一(Lockyer S等，Thromb Res.2006；118(3)：371-80))的结合诱导受体聚簇和随后的血小板活化。因此，GPVI在血小板活化的早期事件中是至关重要的，并因此是干扰该机制的主要靶标(Nieswandt B和Watson SP，Blood.2003Jul 15；102(2)：449-61)。

GPVI的抗血小板和抗血栓形成作用已经在使用小鼠和人血小板的体外和体内研究中有描述。例如，GPVI缺陷型血小板不对胶原蛋白产生应答。此外，GPVI缺陷的小鼠在损伤的血管壁处显示有效抑制动脉血栓形成，而不增加对自发性出血的易感性。所有这些数据表明，GPVI是治疗人血栓形成和血管病症的有效且安全的靶标。

现有技术中已经描述了针对GPVI的抑制性或中和性单克隆抗体能够干扰GPVI-胶原蛋白相互作用。参见，例如EP1224942(EP1228768)(Nieswandt，Bernhard)、WO 2001/000810(MILLENNIUM PHARMACEUTICALS)、WO2003/054020A3(CAMBRIDGE UNIVERSITYTECHNICAL SERVICES LTD，GB)、EP1538165A1(Procorde GmbH/GSF-Forschungcentum füelmew und Gesundheit GmbH)、WO2005/111083(EP1745076B1)(OTSUKA PHARMACEUTICALCO.，LTD.)、WO2006/118350(EP1876240)(MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.LTD.，JP)、WO2008/049928(INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE(INSERM)，FR)、WO2011/073954(SANOFI)。

然而，大多数报道的对GPVI特异的抗体似乎并不适合于人的临床开发和治疗用途，尤其是归因于它们的动物来源(这使得它们在人患者中具有免疫原性)、缺乏与相关动物物种的交叉反应性、它们的亲和力相当弱、它们的半衰期短或由于不利的功能性质，例如诱导GPVI从血小板表面耗尽。GPVI耗尽可指示受体活化，且由于其不可控制且为不可逆的，因此应避免。

目前，只有一种对GPVI特异的单克隆Fab抗体ACT-017(参见WO2017/021539)似乎正处于治疗缺血性中风的临床开发中。然而，该抗体是较早公开的抗体9012.2(参见WO2001000810)的人源化形式，并且因此缺乏与啮齿类GPVI的交叉反应性，所述啮齿类GPVI是体内研究常用的相关模型。此外，ACT-017具有被患者血清中的抗Fab抗体识别的风险，这归因于其位于Fab重链C末端的结构。这种免疫应答可能导致不希望的血小板中二价GPVI结合和GPVI活化的恢复。

因此，需要进一步改进的对GPVI特异的抗体或抗体片段，其适于临床开发和治疗用途，与现有技术的中和抗体相比，其在人类中表现出更好的亲和力、功效和安全性。

因此，本发明提供了优于现有技术已知的对GPVI特异的抗体的新抗体和抗体片段(特别是Fab片段)。特别地，本公开的抗体是也与非人灵长类动物(例如食蟹猴)以及啮齿类动物(例如大鼠和/或小鼠)GPVI结合的人抗体或抗体片段，其显示高亲和力并且组合了之前从未观察到的有利的功能和安全性质。

在这方面，本发明的对GPVI特异的抗体片段也可包含Fab重链C末端的修饰(例如经修饰的重链恒定区)。本申请的发明人证实，通过阻止Fab被患者血清中存在的(预先存在的)抗Fab抗体识别，这种修饰可进一步降低Fab通过与血小板表面GPVI交联而诱导血小板活化的能力。如上所述，这种识别可以导致二价或多价GPVI结合的恢复，导致GPVI在血小板表面上聚簇，这与其天然激动剂配体如胶原蛋白的活性相似。

因此，本发明的对GPVI特异的抗体提供了对缺血事件的特别安全的治疗。

这些特征使得非常期望本公开的抗体和抗体片段用于治疗用途，例如用于预防和/或治疗血栓形成性和血管性病症。

发明内容

本公开提供了新的抗体或抗体片段。具体而言，本发明提供了对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：11的HCDR1区、SEQ ID NO：12的HCDR2区、SEQ ID NO：13的HCDR3区、SEQ ID NO：14的LCDR1区、SEQ ID NO：15的LCDR2区和SEQ ID NO：16的LCDR3区，或

b)SEQ ID NO：22的HCDR1区、SEQ ID NO：23的HCDR2区、SEQ ID NO：24的HCDR3区、SEQ ID NO：25的LCDR1区、SEQ ID NO：26的LCDR2区和SEQ ID NO：27的LCDR3区，或

c)SEQ ID NO：33的HCDR1区、SEQ ID NO：34的HCDR2区、SEQ ID NO：35的HCDR3区、SEQ ID NO：36的LCDR1区、SEQ ID NO：37的LCDR2区和SEQ ID NO：38的LCDR3区，或

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区、SEQ ID NO：45的HCDR2区、SEQ ID NO：46的HCDR3区、SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区和SEQ ID NO：49的LCDR3区。

本发明基于以下认识：本发明的对GPVI特异的抗体或抗体片段的新序列中经修饰的恒定重链提供了免疫原性降低的人抗体或抗体片段。此外，本文公开的抗体或抗体片段结合人GPVI，并且还结合食蟹猴、小鼠和大鼠的GPVI。

本发明的抗体或抗体片段中和GPVI的活性。

此外，所公开的抗体或抗体片段以27nM或更低的IC₅₀浓度抑制人、小鼠和食蟹猴GPVI与胶原蛋白的结合。在优选的实施方案中，所公开的抗体或抗体片段以9nM或更低的IC₅₀浓度抑制人、小鼠和食蟹猴GPVI与胶原蛋白的结合。此外，所公开的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。

如本文所公开和举例说明的，这些抗体或抗体片段被证明在血栓形成小鼠模型体内是有效的。

因此，本公开的抗体或抗体片段在有效性方面是优越的，并且提供了用于治疗患有例如血栓形成性或血管性病症的人的非常适合和有希望的化合物。

本公开提供了具有本文公开的表1-4的CDR区的结合人GPVI的抗体或抗体片段。

本公开还提供了具有本文公开的表1-4的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的抗体或抗体片段。

本公开还提供了具有本文公开的表1-4的重链(HC)和轻链(LC)的抗体或抗体片段。

本公开还提供了本公开的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是Fab。

本公开还提供了包含本文所公开的修饰的重链恒定区的Fab，其中修饰的重链恒定区防止或抑制受试者血清中存在的抗Fab抗体对所述抗体或抗体片段的识别。

本公开还提供了与本文所公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段竞争的抗体或抗体片段。

本公开还提供了与本文公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段结合相同表位的抗体或抗体片段。

本公开还提供了分离的本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段，其用于药物中。

本公开还提供通过向患有例如血栓形成性或血管性病症等病症的受试者施用有效量的本发明的对GPVI特异的抗体或抗体片段，治疗所述受试者的方法。优选地，所述受试者或患者是人。

本公开还提供了药物组合物，其包含分离的本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。

本公开还提供了编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的核酸组合物。

本公开还提供了包含核酸组合物的载体组合物，所述核酸组合物编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抗体。

本公开还提供包含载体或核酸组合物的宿主细胞，所述载体或核酸组合物编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段。

在要求保护的抗体或抗体片段中存在效用。此外，在要求保护的鉴定这样的抗体或片段的方法中存在效用。利用要求保护的抗体或抗体片段是为了改变人GPVI的生物活性。

特别地，要求保护的抗体或抗体片段用于治疗用途，例如治疗血栓形成性或血管性病症。

附图简要说明

图1：A-D)Fab#1、Fab#2、Fab#3、Fab#4(包含修饰的重链恒定区)与在获自高达3个供体的富血小板血浆(PRP)的人、食蟹猴和小鼠血小板的细胞表面上表达的GPVI结合。显示了一个示例性供体的结果(图1A、1B和1C)或3个供体的平均值±标准偏差(SD)(图1D)。

图2：在静态条件下，通过Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4(包含修饰的重链恒定区)体外抑制重组人胶原蛋白VitroCol(A)和食蟹猴主动脉胶原蛋白(B)诱导了人血小板聚集。在

设备中，以六分钟时间过程中增加阻抗来测量血小板聚集。显示了来自4-7个供体的血样的平均值±SD。

图3：在静态条件下，通过Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4(包含修饰的重链恒定区)体外抑制人动脉粥样硬化斑块诱导了人血小板聚集。在

设备中，以六分钟时间过程中增加阻抗来测量血小板聚集。显示了来自6个供体的血液样品的平均值±SD。

图4：A-D)在流动条件下，通过Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4(包含修饰的重链恒定区)体外抑制人动脉粥样硬化斑块诱导了人血小板粘附/聚集；图4E)乙酰水杨酸(ASA)和替格瑞洛的组合的抑制作用；图4F)阴性对照Fab的抑制作用。数据点记录为1帧/秒。显示了来自14个供体的血液样品实验的每个数据点(黑色)的平均值+SD(灰色)。

图5：抗GPVI Fab#3(包含修饰的重链恒定区)(图5A)和阴性对照Fab(图5B)在3mg/kg IV推注施用后，对动脉血栓形成小鼠模型(结扎诱导的血栓形成模型)中体内血栓形成的影响。通过活体视频显微镜检测荧光血小板，使血栓形成可视化，并记录20分钟/血管。显示了每组六只小鼠在不同时间点的结果。

图6：抗GPVI Fab#3(包含修饰的人重链恒定区)(图6A)和阴性对照Fab(图6B)在3mg/kg IV推注施用后，对动脉血栓形成小鼠模型(结扎诱导的血栓形成模型)中体内血栓形成的影响。Y轴表示作为荧光血小板的荧光强度的函数的血栓面积/血管面积关系(％)。显示了每组六只小鼠在不同时间点的结果。

图7：基于FACS表征了Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4通过人血浆样品中预先存在的抗Fab抗体诱导GPVI受体活化的潜力。Fab用野生型人重链恒定区(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)或用本公开的包含SEQ ID NO：113的修饰的人重链恒定区(Fab#1mod HC、Fab#2modHC、Fab#3mod HC和Fab#4mod HC)进行测试。血小板活化由相对于PBS对照的CD62P表达进行标准化的人血小板上的相对CD62P表面表达表示。显示了来自55个供体的PRP样品的平均值±SD。

图8：抗GPVI Fab(包含修饰的重链恒定区)(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)介导GPVI阻断对出血时间的影响。通过用解剖刀刀片切开尾部远端2mm并将尾部浸入温PBS中，在C57BL/6J小鼠中诱导尾部出血。记录出血时间，直到血液停止从尾尖流出且30秒内不重新开始流动。左图描述了没有同时施用ASA的出血时间。右图描述了与ASA共同施用的出血时间。显示了每个处理组3-6只小鼠的平均出血时间±SD。

图9：A-D)在将10mg/kg抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区)(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)i.v.推注施用至C57BL/6J小鼠后，抗GPVI Fab对血小板计数的影响。显示了每个处理组1-6只小鼠在不同时间点的平均血小板数±SD。

图10：A-D)在i.v.推注施用10mg/kg抗GPVI Fab(包含修饰的人重链恒定区)(Fab#1、Fab#2、Fab#3或Fab#4)至CD-1小鼠后，评价小鼠血小板上GPVI表面表达。显示了每个处理组4-6只小鼠在不同时间点的平均GPVI拷贝数±SD。

发明详述

本公开涉及多个识别人GPVI的抗体或抗体片段。

定义

术语“GPVI”是指称为糖蛋白VI的蛋白。

人GPVI-1A(1-339)具有以下氨基酸序列(Uniprot:Q9HCN6-1，单体型'a')

信号肽/细胞外结构域/

食蟹猴GPVI(1-318)具有以下氨基酸序列(UniProt B0I1T7)：

MSPSPTTLFCLGLCLGHVPAQRGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRHLAGRYRCSYQNGSLWSPPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSGDPYLWSAPSDPLELMVTEFSEATTELTVSLTNKVFTTETSRSITASPKEPGSPAGPARQYYTKGNLVRICLGAVILILLAGFLAEDWHSRRKRLRHRVRAVQRPLPPLPPTRKSHGDQDGGRPDVHSRGLCS(SEQ ID NO:2)

鼠GPVI(1-313)具有以下氨基酸序列(UniProt P0C191)：

MSPASPTFFCIGLCVLQVIQTQSGPLPKPSLQAQPSSLVPLGQSVILRCQGPPDVDLYRLEKLKPEKYEDQDFLFIPTMERSNAGRYRCSYQNGSHWSLPSDQLELIATGVYAKPSLSAHPSSAVPQGRDVTLKCQSPYSFDEFVLYKEGDTGSYKRPEKWYRANFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSSSPYLWSAPSDPLVLVVTGLSATPSQVPTEESFPVTESSRRPSILPTNKISTTEKPMNITASPEGLSPPFGFAHQHYAKGNLVRICLGATIIIILLGLLAEDWHSRKKCLQHRMRALQRPLPPLPLA(SEQ ID NO:3)

人GPVI-1A的细胞外结构域(21-269位)具有以下氨基酸序列(Uniprot:Q9HCN6-1，单体型'a')：

QSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGN(SEQ ID NO:4)

人GPVI-1B的细胞外结构域(21-269位)具有以下氨基酸序列(Uniprot:Q9HCN6-1，单体型'b')：

QSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSPVAEFSEATAELTVSFTNEVFTTETSRSITASPKESDSPAGPARQYYTKGN(SEQ ID NO:5)

人GPVI-2A的细胞外结构域(21-251位)具有以下氨基酸序列(Uniprot:Q9HCN6-2，单体型'a')：

QSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGN(SEQ ID NO:6)

术语“GPVI-1”和“GPVI-2”是指公开的GPVI的同种型。后缀“A”和“B”分别是指所描述的高频率等位基因“a”(包含氨基酸S219、K237、T249)和低频率等位基因“b”(包含氨基酸Pro219、Glu237、Ala249)(Joutsi-Korhonen等,2003)。

人GPVI的细胞外结构域包含两个Ig-样C2-型结构域，称为Dl结构域和D2结构域，通铰链-域间连接。D1结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基21至109。D2结构域包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基114-207。

食蟹猴GPVI的细胞外结构域(21-249位)具有以下氨基酸序列(Uniprot:B0I1T7)：

QRGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRHLAGRYRCSYQNGSLWSPPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSGDPYLWSAPSDPLELMVTEFSEATTELTVSLTNKVFTTETSRSITASPKEPGSPAGPARQYYTK(SEQ ID NO:7)

鼠GPVI的细胞外结构域(21-266位)具有以下氨基酸序列(Uniprot:P0C191)：

QSGPLPKPSLQAQPSSLVPLGQSVILRCQGPPDVDLYRLEKLKPEKYEDQDFLFIPTMERSNAGRYRCSYQNGSHWSLPSDQLELIATGVYAKPSLSAHPSSAVPQGRDVTLKCQSPYSFDEFVLYKEGDTGSYKRPEKWYRANFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSSSPYLWSAPSDPLVLVVTGLSATPSQVPTEESFPVTESSRRPSILPTNKISTTEKPMNITASPEGLSPPFGFAHQHYAKGN(SEQ ID NO:8)

大鼠GPVI的细胞外结构域(21-269位)具有以下氨基酸序列(Uniprot:XP_008757241.2)：

QHGPLPKPSLQAQPSSLVPLGHPVTLRCLGPSDADLYRLEKVKPGKLIFIDQDFLFIPIMEINNAGRYRCSYQNESHWSLPSDQLELIATGVYSKPSLSAHPSSAIPPGRDVTLKCQSQYSFDEFVLYKEGDTRPYKRPEKWYRANFPVITVTAAHSGTYRCYSFSSSSPYLWSAPSDPLVVVVTGPSATPSQVPTEVPSPMTEASRRPSMLLTNKISTTEKPMNITVSPEGPSPPFGFAHQHYAKGN(SEQ ID NO:9)

用于产生GPVI-ECD-Fc融合蛋白的人IgG1-Fc结构域(K105-K330)具有以下氨基酸序列：

DIKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)

数字之前的术语“约”表示所述数字的值加或减10％。

如本文所用，的术语“抗体”指与抗原相互作用的包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白。每条重链(HC)包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链(LC)包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体和嵌合抗体。抗体可以是任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。轻链和重链都被分成结构和功能同源区。

如本文所用，短语“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原特异性相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定空间分布)的能力。结合片段的实例包括但不限于Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；Fab'片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域和免疫球蛋白铰链区的N端部分组成的单价片段；F(ab)₂片段，其是包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够被制成单链蛋白，其中VL和VH配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，(1988)Science 242:423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在术语“抗体片段”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗体片段也可引入单结构域抗体、最大抗体(maxibodies)、微型抗体(inibodies)、胞内抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triaboidies)、四抗体tetrabodies、v-NAR和双scFv(参见例如Hollinger和Hudson，(2005)NatureBiotechnology 23:1126-1136)。抗体片段可被移植到基于例如纤维连接蛋白III型(Fn3)的多肽的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤维连接蛋白多肽单体)。抗体片段可以引入到包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，所述片段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合位点(Zapata等，(1995)Protein Eng.8:1057-1062；和美国专利号5,641,870)。

如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的抗体重链的区域。铰链区可细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux等，J.Immunol.1998161:4083)。

术语“CH1结构域”指将可变结构域与铰链区连接的抗体的重链恒定结构域。术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域和其天然存在的同种异型之一及其变体。

如本文所用，“人抗体”或“人抗体片段”包括具有其中框架区和CDR区都来自人来源的序列的可变区的抗体和抗体片段。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这样的序列。人来源包括例如人种系序列，或人种系序列的突变形式，或含有来自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等，(2000)J Mol Biol 296:57-86中所述。免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置可以使用众所周知的编号方案来定义，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案或Kabat和Chothia的组合(参见例如Sequences ofProteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and HumanServices(1991)，Kabat等编辑；Lazikani等，(1997)J.Mol.Bio.273:927-948)；Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publicationno.91-3242U.S.Department of Health and Human Services；Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等，(1989)Nature 342:877-883；和Al-Lazikani等，(1997)J.Mol.Biol.273:927-948。人抗体也可从合成文库或转基因小鼠(例如，异种小鼠)中分离，只要相应***产生的抗体的可变区中的框架区和CDR区均源自人来源的序列。

术语“嵌合抗体”或“嵌合抗体片段”在本文中定义为具有来源于或对应于一个物种中发现的序列的抗体恒定区和来源于另一个物种的抗体可变区的抗体分子。优选地，抗体恒定区衍生自或对应于在人中发现的序列，并且抗体可变区(例如VH、VL、CDR或FR区)衍生自在非人动物如小鼠、大鼠、兔或仓鼠中发现的序列。

“人源化抗体”或“人源化抗体片段”在本文中定义为具有来源于人源序列的抗体恒定区和来源于另一物种的抗体可变区或其部分或仅CDR的抗体分子。例如，人源化抗体可以是CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人来源，而可变结构域的一个或多个构架是人来源的，且恒定结构域(如果有的话)是人来源的。

术语“分离的”指的是基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体或抗体片段的化合物，所述化合物可以例如是抗体或抗体片段。此外，分离的抗体或抗体片段可基本上不含其他细胞材料和/或化学品。因此，在一些实施方案中，所提供的抗体或抗体片段是分离自具有不同特异性的抗体的分离的抗体或抗体片段。分离的抗体可以是单克隆抗体或抗体片段。分离的抗体或抗体片段可以是重组单克隆抗体或抗体片段。然而，与靶的表位、亚型或变体特异结合的分离的抗体或抗体片段可能与其他相关抗原(例如来自其他物种)(例如，物种同源物)具有交叉反应性。

如本文所用，术语“重组抗体”或“重组抗体片段”包括通过自然界中不存在的方式制备、表达、创制或分离的所有抗体或抗体片段。例如，从转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，从重组的组合人抗体文库选择和分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因、序列的全部或一部分剪接到其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、创制或分离的抗体，或从就人免疫球蛋白基因而言是转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体。优选地，这类重组抗体具有可变区，其中框架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库中。重组抗体可以是单克隆抗体。在一个实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段分离自

抗体文库，如US 13/321,564或US 13/299,367中所公开，两者均通过引用引入本文。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体片段”指衍生自包括任何真核、原核或噬菌体克隆的单个克隆的抗体或抗体片段，而不是指产生它的方法。本文公开的单克隆抗体或抗体片段可以通过Kohler等，Nature，256:495((1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以使用例如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它方法是本领域公知的(参见，例如，第11章：Short Protocols in MolecularBiology，(2002)5th Ed.，Ausubel等编辑，John Wiley and Sons，New York)。

如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性于”或“特异性识别”等是指，可测量的和可再现的相互作用，例如靶标与抗体或抗体片段之间的结合，其在包括生物分子的异源分子群存在下用于确定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以是抗原或抗原的表位)的抗体或抗体片段是与其结合其他靶标相比以更大的亲和力(affinity)、亲合力(avidity)、更容易地和/或以更长的持续时间结合该靶标的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合蛋白上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白中是保守的。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。本文公开的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI。优选地，所公开的人对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合另一物种的GPVI，如来自小鼠、大鼠和/或食蟹猴的GPVI。甚至更优选地，本文公开的抗体或抗体片段特异性于人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI。用于确定两种分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，并且包括例如标准ELISA测定。评分可以通过标准显色(例如，用具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行。通过光密度，例如在450nm处的光密度，对某些孔中的反应进行评分。典型的背景(＝阴性反应)可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。这意味着阳性/阴性的差异可以大于5倍。通常，结合特异性的测定不是通过使用单一参照抗原，而是使用一组三至五个不相关的抗原，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等进行的。

如本文所用，术语“亲和力”是指多肽与其靶标在单个位点上的相互作用强度。在每个位点内，多肽的结合区通过弱的非共价力在多个位点与其靶标相互作用；相互作用越多，亲和力越强。

如本文所用，术语“KD”是指由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得的解离常数，并用摩尔浓度(M)表示。抗原结合部分(例如单克隆抗体)的KD值可使用本领域成熟的方法来确定。用于测定抗原结合部分(如单克隆抗体)的KD的方法有SET(可溶性平衡滴定法)或使用生物传感器***(如

***)的表面等离子体共振法。在本公开中，特异于GPVI的抗体的离解速率常数(KD)(koff/kon)小于5x10^-2M，小于1x10^-2M，小于5x10^-3M，小于1x10^-3M，小于5x10^-4M，小于1x10^-4M，小于5x10^-5M，小于1x10^-5M，小于5x10^-6M，小于1x10^-6M，小于5x10^-7M，小于1x10^-7M，小于5x10^-8M，小于1x10^-8M，小于5x10^-9M，小于1x10^-9M，小于5x10^-10M，小于1x10^- ¹⁰M，小于5x10^-11M，小于1x10^-11M，小于5x10^-12M，小于1x10^-12M，小于5x10^-13M，小于1x10^-13M，小于5x10^-14M，小于1x10^-14M，小于5x10^-15M，或者小于1x10^-15M或更低。

本公开的组合物可用于治疗性或预防性应用。因此，本公开包括含有本文公开的抗体或抗体片段和用于其的药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在相关的实施方案中，本公开提供了用于治疗血栓形成性或血管性病症的方法。该方法包括向有需要的个体施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含本文所述的对GPVI特异的抗体或抗体片段。

本公开提供治疗方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”是指引发所需生物学反应所必需的对GPVI特异的抗体或抗体片段的量。根据本公开，治疗有效量是治疗和/或防止(例如预防)病症所必需的对GPVI特异的抗体或抗体片段的量。

“施用”和“处理”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。“施用”和“处理”可以指例如治疗方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。“施用”和“处理”也指用试剂、诊断组合物、结合组合物或另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医或研究受试者时，是指治疗性处理、预防性或防止性措施，指研究和诊断应用。“处理”当应用于人、兽医或研究受试者或细胞、组织或器官时，包括试剂与动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。“细胞处理”还包括试剂接触PILR的情况，例如，在流动相或胶体相，以及激动剂或拮抗剂不接触细胞或受体的情况。

术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。

术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，特定的多肽序列也暗含其保守修饰的变体。

如本文所用，术语“EC₅₀”是指在测定中诱导基线和最大值之间一半反应的抗体或抗体片段的浓度。因此，它代表观察到50％最大效应时的抗体浓度。

如本文所用，术语“IC₅₀”是指在测定中抑制最大反应和基线之间一半反应的抗体或抗体片段的浓度。它表示将给定反应降低50％的抗体浓度。

术语“抑制”或“减少”或“中和”是指任何表型特征(例如结合、生物活性或功能)的减少或停止，或指该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。“抑制”、“减少”或“中和”不需要是完全的，只要它是使用适当的测定可检测的。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起20％或更多的减少的能力。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起50％或更多的减少的能力。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起75％、85％、90％、95％或更大的总体减少的能力。

如本文所用，术语“拮抗性”抗体或抗体片段指与GPVI相互作用并部分或完全抑制或中和GPVI的生物活性或功能或任何其它表型特征的抗体或抗体片段。

“交叉竞争”是指抗体或抗体片段或其它抗原结合部分在标准竞争性结合测定中干扰其它抗体、抗体片段或抗原结合部分与特定抗原结合的能力。抗体、抗体片段或其它抗原结合部分能够干扰另一抗体、抗体片段或抗原结合部分与特定抗原结合的能力或程度，并且因此可以使用标准竞争性结合测定来确定其是否可以被称为本发明的交叉竞争。一种合适的测定包括使用Biacore技术(例如，通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，瑞典))，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种测定交叉竞争的方法是使用基于ELISA的方法。基于抗体的交叉竞争的“表位聚类”(epitope binning)抗体的高通量方法描述于国际专利申请号WO2003/48731。如果所研究的抗体或抗体片段将表1-4中公开的抗体或抗体片段之一与GPVI的结合降低60％或更多，特别是70％或更多，更特别是80％或更多，并且如果表1-4中描述的抗体之一将所述抗体或抗体片段与GPVI的结合降低60％或更多，特别是70％或更多，更特别是80％或更多，则存在交叉竞争。

术语“表位”包括被抗体或其片段或T细胞受体特异性识别或以其它方式与分子相互作用的任何蛋白区域。通常，表位具有分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链，并且通常可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本领域技术人员将理解的，实际上抗体可以特异性结合的任何物质均可以是表位。

“结合相同表位”是指当使用相同表位作图技术比较抗体时，抗体或抗体片段结合特定抗原并结合与示例性抗体相同表位的能力。示例性抗体和其它抗体的表位可以使用表位作图技术来确定。表位作图技术是本领域公知的。例如，构象表位可通过测定氨基酸的空间构象而容易地鉴定，例如通过氢/氘交换、X射线晶体学和二维核磁共振。

如本文所用，术语“工程化的”或“修饰的”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的一些组合)对核酸或多肽分子的操作。优选地，本公开的抗体或抗体片段被工程化或修饰，包括例如人源化和/或嵌合抗体，以及已经被工程化以改善一种或多种性质的抗体，所述性质诸如抗原结合、稳定性/半衰期、效应子功能、免疫原性、安全性等。

“野生型”蛋白或其部分是天然发现的蛋白的形式。野生型蛋白如重链恒定区的氨基酸序列是天然存在的蛋白的氨基酸序列。归因于同种异型差异，野生型蛋白可以有多于一个的氨基酸序列。例如，天然存在的人IgG1重链恒定区有几种同种异型(参见，例如Jeffries等(2009)mAbs 1:1)。

“同种异型”指在特定的同种型组中天然存在的变体，这些变体在几个氨基酸上不同(参见，例如，Jefferies等人(2009)Mabs 1:1)。本文所述的抗体可以具有任何同种异型。

如本文所用，术语“预先存在的”抗体是指正常存在于受试者或生物体中的抗体。

实施方案

序列

在一个实施方案中，本公开涉及对糖蛋白VI(GPVI)特异的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开涉及对糖蛋白VI(GPVI)特异的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段，其包含表1-4中公开的抗体中任一种的可变重链(VH)和可变轻链(VL)，在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段，其包含表1-4中公开的抗体中任一种的重链(HC)和轻链(LC)。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段，其包含表1-4中公开的任何一种抗体的由Kabat定义的6个CDR。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段，其包含表1-4中公开的任何一种抗体的6个CDR。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含

a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的可变重链CDR1(HCDR1)区、包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的可变重链CDR2(HCDR2)区、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的可变重链CDR3(HCDR3)区、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的可变轻链CDR1(LCDR1)区、包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列的可变轻链CDR2(LCDR2)区和包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的可变轻链CDR3(LCDR3)区，或

b)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的LCDR2区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的LCDR3区，或

c)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的LCDR2区和包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的LCDR3区，或

d)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的LCDR2区、和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的LCDR3区。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆人抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体片段选自Fab、Fab'、Fv、scFv。在一个实施方案中，所述抗体片段是Fab。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区、SEQ ID NO：45的HCDR2区、SEQ ID NO：46的HCDR3区、SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的LCDR3区。

a)SEQ ID NO：11的HCDR1区、SEQ ID NO：12的HCDR2区、SEQ ID NO：13的HCDR3区、SEQ ID NO：14的LCDR1区、SEQ ID NO：15的LCDR2区和SEQ ID NO：16的LCDR3区，并且还包括SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：16的VL，或

b)SEQ ID NO：22的HCDR1区、SEQ ID NO：23的HCDR2区、SEQ ID NO：24的HCDR3区、SEQ ID NO：25的LCDR1区、SEQ ID NO：26的LCDR2区和SEQ ID NO：27的LCDR3区，并且还包括SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL，或

c)SEQ ID NO：33的HCDR1区、SEQ ID NO：34的HCDR2区、SEQ ID NO：35的HCDR3区、SEQ ID NO：36的LCDR1区、SEQ ID NO：37的LCDR2区和SEQ ID NO：38的LCDR3区，并且还包括SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL，或

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区、SEQ ID NO：45的HCDR2区、SEQ ID NO：46的HCDR3区、SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的LCDR3区，并且还包含SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：11的HCDR1区、SEQ ID NO：12的HCDR2区、SEQ ID NO：13的HCDR3区、SEQ ID NO：14的LCDR1区、SEQ ID NO：15的LCDR2区和SEQ ID NO：16的LCDR3区。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：22的HCDR1区、SEQ ID NO：23的HCDR2区、SEQ ID NO：24的HCDR3区、SEQ ID NO：25的LCDR1区、SEQ ID NO：26的LCDR2区和SEQ ID NO：27的LCDR3区。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：33的HCDR1区、SEQ ID NO：34的HCDR2区、SEQ ID NO：35的HCDR3区、SEQ ID NO：36的LCDR1区、SEQ ID NO：37的LCDR2区和SEQ ID NO：38的LCDR3区。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：44的HCDR1区、SEQ ID NO：45的HCDR2区、SEQ ID NO：46的HCDR3区、SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区和SEQ ID NO：49的LCDR3区。

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

与SEQ ID NO：17、28、39或50的VH和与SEQ ID NO：18、29、40或51的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的VH和VL。

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同的活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同的活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同的活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同的活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同活性的序列。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC组成。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC组成。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC组成。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC组成。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的轻链LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的轻链LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：42的HC和SEQ IDNO：41的轻链LC组成。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同的活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：43的HC和SEQ IDNO：41的LC组成

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC组成。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC，或与这些序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性但保留与所述抗体或抗体片段相同的活性的序列。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段由SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC组成。

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的前述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆人抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体片段选自Fab、Fab'、Fv、scFv。在一个实施方案中，所述抗体片段是Fab。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段包含人重链恒定区和人轻链恒定区。

格式(format)

在某些实施方案中，本公开的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。

在本公开的一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段是人、人源化、嵌合或合成抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是人或人源化抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是人抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是嵌合抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段是分离的重组抗体或抗体片段。在进一步的实施方案中，所述分离的重组人抗体或抗体片段是分离的重组人抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段是IgG。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是IgG1同种型。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段是单价抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述单价抗体或抗体片段选自全长抗体、scFv、Fv、Fab和Fab'。在优选的实施方案中，所述单价抗体片段是Fab。

核酸-载体-细胞

在一个实施方案中，本公开涉及包含编码对GPVI特异的抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列的核酸组合物，其中所述抗体或抗体片段包含

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的抗体或抗体片段的重链序列和/或轻链序列的分离的核酸或多个核酸序列，所述核酸包含

a)SEQ ID NO：55的HCDR1区、SEQ ID NO：56的HCDR2区、SEQ ID NO：57的HCDR3区、SEQ ID NO：58的LCDR1区、SEQ ID NO：59的LCDR2区和SEQ ID NO：60的LCDR3区，或

b)SEQ ID NO：66的HCDR1区、SEQ ID NO：67的HCDR2区、SEQ ID NO：68的HCDR3区、SEQ ID NO：69的LCDR1区、SEQ ID NO：70的LCDR2区和SEQ ID NO：71的LCDR3区，或

c)SEQ ID NO：77的HCDR1区、SEQ ID NO：78的HCDR2区、SEQ ID NO：79的HCDR3区、SEQ ID NO：80的LCDR1区、SEQ ID NO：81的LCDR2区和SEQ ID NO：82的LCDR3区，或

d)SEQ ID NO：88的HCDR1区，SEQ ID NO：89的HCDR2区，SEQ ID NO：90的HCDR3区，SEQ ID NO.：91的LCDR1区、SEQ ID NO.：92的LCDR2和SEQ ID NO：92的LCDR3区的序列。

a)包含SEQ ID NO：55的核酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：56的核酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：57的核酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO：58的核酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：59的核酸序列的LCDR2区和包含SEQ ID NO：60的核酸序列的LCDR3区，或

b)包含SEQ ID NO：66的核酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：67的核酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：68的核酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO：69的核酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：70的核酸序列的LCDR2区和包含SEQ ID NO：71的核酸序列的LCDR3区，或

c)包含SEQ ID NO：77的核酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：78的核酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：79的核酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO：80的核酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：81的核酸序列的LCDR2区和包含SEQ ID NO：82的核酸序列的LCDR3区，或

d)包含SEQ ID NO：88的核酸序列的HCDR1区、包含SEQ ID NO：89的核酸序列的HCDR2区、包含SEQ ID NO：90的核酸序列的HCDR3区、包含SEQ ID NO.：91的核酸序列的LCDR1区、包含SEQ ID NO：92的核酸序列的LCDR2区和包含SEQ ID NO：93的核酸序列的LCDR3区。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：61的VH和/或SEQ ID NO：62的VL，或者与SEQ ID NO：61的VH和SEQ ID NO：62的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的VH和/或VL。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：72的VH和/或SEQ ID NO：73的VL，或者与SEQ ID NO：72的VH和SEQ ID NO：73的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的VH和/或VL。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：83的VH和/或SEQ ID NO：84的VL，或者与SEQ ID NO：83的VH区和SEQ ID NO：84的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的VH和/或VL。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：94的VH和/或SEQ ID NO：95的VL，或者与SEQ ID NO：94的VH区和SEQ ID NO：95的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的VH和/或VL。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：64的HC和/或SEQ ID NO：63的LC，在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述一个核酸或多个核酸序列包含SEQ ID NO：65的HC和/或SEQ ID NO：63的LC。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：75的HC和/或SEQ ID NO：74的LC。在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：76的HC和/或SEQ ID NO：74的LC。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：86的HC和/或SEQ ID NO：85的LC，在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：87的HC和/或SEQ ID NO：85的LC。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：97的HC和/或SEQ ID NO：96的LC。在另一个实施方案中，本公开涉及编码对GPVI特异的分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含SEQ ID NO：98的HC和/或SEQ ID NO：96的LC。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码分离的单克隆抗体或片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含表1-4中公开的抗体中任一种的VH和/或VL。

在另一个实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的抗体或抗体片段，其由表1-4中公开的任一核酸序列或多个核酸序列编码。

在某些实施方案中，本公开提供了编码表1-4中公开的抗体或抗体片段中任一种的核酸序列或多个核酸序列。

在另一个实施方案中，本公开提供了编码特异性结合GPVI的本公开抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码分离的单克隆抗体或抗体片段的核酸序列或多个核酸序列，其中所述核酸序列或多个核酸序列包含表1-4中公开的抗体或抗体片段中任一种的HC和/或LC。

载体

在一个实施方案中，本公开涉及包含一个载体或多个载体的载体组合物，所述载体包含编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的一个核酸序列或多个核酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及包含一个载体或多个载体的载体组合物，所述载体包含编码表1-4中公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的一个核酸序列或多个核酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及包含一个载体或多个载体的载体组合物，所述载体包含表1-4中公开的一个核酸序列或多个核酸序列。

在一个实施方案中，本公开提供了包含编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的核酸的载体。

在一个实施方案中，本公开提供了包含表1-4中公开的核酸的载体。

在一个实施方案中，本公开提供了包含编码表1-4中公开的抗体或抗体片段的核酸的载体。

宿主细胞

在一个实施方案中，本公开涉及含有包含一个载体或多个载体载体的组合物的宿主细胞，所述载体含有编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的一个核酸序列或多个核酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及含有包含一个载体或多个载体的组合物的宿主细胞，所述载体含有编码表1-4中公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的一个核酸序列或多个核酸序列。

在一个实施方案中，本公开提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的核酸。

在一个实施方案中，本公开提供宿主细胞，其包含编码本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的核酸。

在另一个实施方案中，本公开提供了包含载体的分离的宿主细胞，所述载体包含表1-4中公开的核酸。

在一个实施方案中，所述宿主细胞能够表达由载体编码的多肽。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞是分离的细胞。在进一步的实施方案中，所述分离的宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

在本公开的某些实施方案中，将另外的氨基酸残基、多肽或部分加入本公开的抗体或抗体片段中，例如以帮助表达或纯化本公开的Fab或提高其稳定性。

本公开的抗体或抗体片段的重链和轻链的编码序列可以是重组DNA分子，其通过将DNA有效连接至基因表达所需的必需表达控制区(例如调控区)而被引入表达载体中。本领域技术人员将意识到，编码重链或轻链的多核苷酸可被克隆到不同载体或同一载体中。在优选的实施方案中，所述多核苷酸被克隆到同一载体中。载体可通过本领域熟知的方法(参见例如“Current Protocols in Molecular Biology”，Ausubel等(编)，GreenePublishing Assoc和John Wiley Interscience，New York，1989和1992)引入到合适的宿主细胞，如原核(例如细菌)或真核(例如酵母或哺乳动物)细胞中。本领域技术人员已知多种克隆载体，并且选择合适的克隆载体是选择的问题。基因可置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(本文统称为“控制”元件)的控制下，以便编码所需蛋白的DNA序列在由含有该表达构建体的载体转化的宿主细胞中转录成RNA。编码序列可以含有或不含有信号肽或前导序列。在宿主细胞中表达后，获得本公开的抗体或抗体片段。如本领域技术人员所知，这些步骤可以以不同的方式实现。总体上，这些步骤通常包括用编码抗体或抗体片段的核酸或载体或感染性颗粒转化或转染合适的宿主细胞。此外，这些步骤通常包括在适于所述宿主细胞增殖(增加、生长)的条件下培养所述宿主细胞，以及在适于产生(表达、合成)所编码的抗体或抗体片段的条件下培养步骤。在适于增殖或表达的条件下培养宿主细胞通常在包含适于细胞生长或诱导表达的组分的培养基存在下完成。在具体实施方案中，用于产生本公开的抗体或抗体片段的方法还包括从宿主细胞或培养基分离产生的抗体或抗体片段的步骤。根据所选择的表达***和宿主，通过在表达目的蛋白的条件下培养由上述表达载体转化的宿主细胞来产生本公开的抗体或抗体片段。然后从宿主细胞中分离蛋白并纯化。如果表达***将蛋白分泌到生长培养基中，则可直接从培养基中纯化蛋白。如果蛋白不分泌，则从细胞裂解物中分离或从细胞膜级分中回收。合适的生长条件和回收方法的选择在本领域技术范围内。然后，本公开的抗体或抗体片段可以通过本领域技术人员已知的多种技术纯化。

结合

在一个实施方案中，本公开涉及人对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，本公开涉及对包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的人GPVI的亚型和单倍型特异的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对由SEQ ID NO：1的氨基酸序列编码的人GPVI特异。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的氨基酸序列编码的人GPVI的细胞外结构域特异。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽特异。在一个实施方案中，本公开涉及对由SEQ ID NO：1编码的多肽特异的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽特异的所述抗体或抗体片段是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段与GPVI的胞外结构域结合。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段结合人GPVI细胞外结构域的D1结构域。在另一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段结合人GPVI细胞外结构域的D2结构域。

本公开的抗体或抗体片段与食蟹猴和啮齿动物GPVI，例如小鼠或大鼠GPVI交叉反应。在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段与另一物种的GPVI，如来自小鼠、大鼠和/或食蟹猴的GPVI交叉反应。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPIV和大鼠GPVI特异。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对食蟹猴GPVI特异。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对小鼠GPVI特异。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对大鼠GPVI特异。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对人GPVI和小鼠GPVI特异。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段对人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI特异。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合人GPVI和食蟹猴GPVI。在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合人GPVI和啮齿动物GPVI。在一个实施方案中，所述啮齿动物GPVI是小鼠和大鼠GPVI。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPIV和大鼠GPVI。

在另一个实施方案中，本公开提供了对人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPIV和大鼠GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：

在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

与SEQ ID NO：17、28、39或50的VH和SEQ ID NO：18、29、40或51的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的同一性的VH和VL。

在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单价抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述单价抗体或抗体片段选自scFv、Fv、Fab和Fab'。在一个优选的实施方案中，所述单价抗体或抗体片段是Fab。

亲和力

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与GPVI具有单价亲和力，解离速率常数(K_D)小于5x10^-2M、小于1x10^-2M、小于5x10^-3M、小于1x10^-3M、小于5x10^-4M、小于1x10^-4M、小于5x10^-5M、小于1x10^-5M、小于5x10^-6M、小于1x10^-6M、小于5x10^-7M、小于1x10^-7M、小于5x10^-8M、小于1x10^-8M、小于5x10^-9M、小于1x10^-9M、小于5x10^-10M、小于1x10^-10M、小于5x10^-11M、小于1x10^-11M、小于5x10^-12M、小于1x10^-12M、小于5x10^-13M、小于1x10^-13M、小于5x10^-14M、小于1x10^-14M、小于5x10^-15M或小于1x10^-15M。

在某些实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与GPVI具有单价亲和力，解离速率常数(K_D)小于1x10^-7M、1x10^-8M、1x10^- ⁹M、1x10^-10M、1x10^-11M、1x10^-12M或1x10^-13M。

在某些实施方案中，本公开涉及表1到4中公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以10nM或更小、更优选1nM或更小且仍更优选0.5nM或更小的单价亲和力结合GPVI。

在进一步的实施方案中，本公开涉及以70pM或更小的单价亲和力结合人GPVI的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段以90pM或更小的单价亲和力结合食蟹猴GPVI。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段以100pM或更低的单价亲和力结合人GPVI和食蟹猴GPVI。

在又一个实施方案中，本公开涉及以30nM或更小、优选9nM或更小、优选1nM或更小的单价亲和力结合小鼠GPVI的分离的抗体或抗体片段。在又一个实施方案中，本公开涉及以100pM或更低的单价亲和力结合人和食蟹猴GPVI并以9000pM或更低，优选1000pM或更低的单价亲和力结合小鼠GPVI的分离的抗体或抗体片段。

在进一步的实施方案中，本公开涉及本公开的分离的抗体或抗体片段，其以100pM或更低的单价亲和力结合人GPVI并以1000pM或更低的单价亲和力结合小鼠GPVI。在实施方案中，所述单价亲和力以Fab格式测定。

在一个实施方案中，所述分离的抗体或抗体片段的单价亲和力通过如本文实施例5中所述的溶液平衡滴定(SET)使用可溶性GPVI来测定。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段包含：

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单价抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述单价抗体或抗体片段选自scFv、Fv、Fab和Fab'。在优选的实施方案中，所述单价抗体或抗体片段是Fab。

在某些实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离抗体或抗体片段，其中如ELISA测定确定的，所述抗体或抗体片段以60nM或更小、50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.4nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小的EC₅₀浓度结合GPVI。

在某些实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如ELISA测定确定的，所述抗体或抗体片段以10nM或更低的EC₅₀浓度结合人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI。在某些实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如ELISA测定确定的，所述抗体或抗体片段以1nM的EC₅₀浓度结合人GPVI和食蟹猴GPVI、以10nM或更低的EC₅₀浓度结合小鼠GPVI和以60nM或更低的EC₅₀浓度结合大鼠GPVI。在优选实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如ELISA测定确定的，所述抗体或抗体片段以1nM的EC₅₀浓度结合人GPVI和食蟹猴GPVI、以5nM或更低的EC₅₀浓度结合小鼠GPVI和以20nM或更低的EC₅₀浓度结合大鼠GPVI。在某些实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如ELISA测定确定的，所述抗体或抗体片段以16nM或更低的EC₅₀浓度结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI。在某些实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，如ELISA测定确定的，其以2nM或更低的EC₅₀特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI。

在另一个实施方案中，所述GPVI涂覆在板的表面上。

在一个实施方案中，所述EC₅₀浓度使用可溶性GPVI/Fc通过如本文实施例3中所述的ELISA测定确定。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段包含：

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

与SEQ ID NO：17、28、39或50的VH和SEQ ID NO：18、29、40或51的VL具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的VH和VL。

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

在某些实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如在细胞-ELISA测定中确定的，所述抗体或抗体片段以15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、5nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.4nM或更小、0.2nM或更小或者0.1nM或更小的EC₅₀浓度结合GPVI。

在一个实施方案中，所述EC₅₀浓度在如实施例4所述的细胞-ELISA测定中确定。

在某些实施方案中，本公开提供对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中，如在细胞-ELISA测定中所确定的，所述抗体或抗体片段以15nM或更低、优选6nM或更低的EC₅₀浓度结合人GPVI、食蟹猴GVPI和小鼠GPVI。

在某些实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如细胞-ELISA测定中所确定的，所述抗体或抗体片段以1nM或更低的EC₅₀浓度结合人GPVI、以2nM或更低的EC₅₀浓度结合食蟹猴GPVI且以6nM或更低的EC₅₀浓度结合小鼠GPVI。在某些实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的分离的抗体或抗体片段，其中如细胞-ELISA测定中所确定的，所述抗体或抗体片段以15nM或更小、优选6nM或更小的EC₅₀浓度结合小鼠GPVI。

在另一个实施方案中，所述GPVI存在于细胞表面上。在另一个实施方案中，所述GPVI存在于重组细胞的表面上。在另一个实施方案中，所述GPVI存在于血小板的表面上。在另一个实施方案中，所述GPVI存在于人、食蟹猴或小鼠血小板的表面上。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段包含：

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区，SEQ ID NO：45的HCDR2区，SEQ ID NO：46的HCDR3区，SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区及包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的LCDR3区。

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是分离的单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是单价抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述单价抗体或抗体片段选自scFv、Fv、Fab和Fab'。在优选的实施方案中，所述单价抗体或抗体片段是Fab。在一个实施方案中，所述Fab是人Fab。

功能实施方案

通常，本公开的抗体或抗体片段可用于防止或抑制GPVI与胶原蛋白之间的相互作用，从而防止、抑制或减少由GPVI介导的信号传导途径和/或调节GPVI参与的生物学途径和机制。

在一个实施方案中，本公开涉及对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段能够特异性干扰GPVI介导的信号转导。

测定功能活性的方法可以利用结合测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)和本领域公知的其它方法(参见Hampton，R等(1990；Serological Methods a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN)和Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.158:1211-1216)。或者，测定可测试本公开的抗体或抗体片段在体内或体外因与GPVI结合而引起生物反应的能力。本文描述了此类测定。本领域技术人员将知道其他合适的测定。测量GPVI与胶原蛋白结合的方法并不局限于特定的方法，也可以通过其他常规方法来完成。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段拮抗GPVI活性。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段中和GPVI活性。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段抑制GPVI信号传导。

GPVI-胶原蛋白结合抑制

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段能够抑制GPVI与胶原蛋白的结合。在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制GPVI与胶原蛋白的结合。在实施方案中，所述GPVI选自人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI。

在某些实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制人GPVI、食蟹猴GPVI或小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。在另一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制GPVI与胶原蛋白的结合，其中所述GPVI为小鼠GPVI。在某些实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制GPVI与胶原蛋白的结合，其中所述胶原蛋白为人胶原蛋白、大鼠主动脉胶原蛋白、兔主动脉胶原蛋白或食蟹猴主动脉胶原蛋白。

在某些实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段以小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM、小于1nM、小于100pM、小于90pM、小于80pM、小于70pM、小于60pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于10pM、小于9pM、小于8pM、小于7pM、小于6pM、小于5pM、小于4pM、小于3pM、小于2pM或小于1pM的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。

在实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段以15nM或更低，甚至更优选10nM或更低的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。在某些实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段以10nM或更低的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。

在某些实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段以30nM或更低的IC₅₀浓度、优选以15nM或更低的IC₅₀浓度、优选以10nM或更低的IC₅₀浓度抑制小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并以小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM、小于1nM、小于100pM、小于90pM、小于80pM、小于70pM、小于60pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于10pM、小于9pM、小于8pM、小于7pM、小于6pM、小于5pM、小于4pM、小于3pM、小于2pM或小于1pM的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI并以15nM或更低的IC₅₀浓度、更优选以10nM或更低的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合小鼠GPVI和大鼠GPVI并以15nM或更低的IC₅₀浓度、优选以10nM或更低的IC₅₀浓度抑制小鼠GPVI与胶原蛋白的结合。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制GPVI与胶原蛋白结合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、100％。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段在200nM的浓度下抑制GPVI与胶原蛋白结合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、100％。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段在200nM浓度时抑制GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段在200nM浓度下抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并在200nM浓度下抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并以15nM或更低的IC₅₀浓度、优选以10nM或更低的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合，并抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并以15nM或更低的IC₅₀浓度、优选以10nM或更低的IC₅₀浓度抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白的结合，且在200nM的浓度下抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，且以小于15nM的IC₅₀浓度、优选10nM或更低的IC₅₀浓度，且以具有10nM或更低、优选1nM或更低的解离速率常数(KD)的与GPVI的单价亲和力抑制人GPVI、食蟹猴GPVI和小鼠GPVI与胶原蛋白结合的至少98％。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的所述抗体或抗体片段包含：

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区，SEQ ID NO：45的HCDR2区，SEQ ID NO：46的HCDR3区，SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的LCDR3区。

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

IC₅₀浓度和/或达到的最大抑制效果可通过ELISA、SET、FACS或MSD(中观尺度发现(Meso scale Discovery))来确定。在一个实施方案中，IC₅₀浓度和/或达到的最大抑制效果以本文实施例6所述的受体抑制测定确定，在一个实施方案中，IC₅₀浓度和/或达到的最大抑制效果可通过如本文实施例6所述的方法确定。

细胞粘附

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制表达人GPVI的细胞粘附至GPVI的配体如胶原蛋白。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制表达GPVI的细胞粘附至胶原蛋白。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制表达人GPVI的细胞粘附至胶原蛋白。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制表达人GPVI的细胞粘附在胶原蛋白包被的表面上。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制表达人GPVI的细胞粘附在胶原蛋白包被的表面上。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段以3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小、100pM或更小、90pM或更小、80pM或更小、70pM或更小、60pM或更小、50pM或更小、40pM或更小、30pM或更小、20pM或更小、10pM或更小、9pM或更小、8pM或更小、7pM或更小、6pM或更小、5pM或更小、4pM或更小、3pM或更小、2pM或更小或1pM或更小的IC₅₀浓度抑制表达GPVI的细胞与胶原蛋白的粘附。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段以3nM或更小、优选2nM或更小的IC₅₀浓度抑制表达人GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附。

在另一实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并以3nM或更低，优选2nM或更低的IC₅₀浓度抑制表达人GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制表达GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、基本上100％。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段在200nM浓度下抑制表达GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、100％。

在一个实施方案中，本公开的所述抗体或抗体片段在200nM的浓度下抑制表达人GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附至少85％。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI，并在200nM浓度下抑制表达人GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附至少85％。

在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段特异性结合人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI及大鼠GPVI，并以3nM或更低、优选2nM或更低的IC₅₀浓度抑制表达人GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附，并且在200nM浓度下抑制表达人GPVI的细胞在胶原蛋白上的粘附至少85％。

在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包括：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

IC₅₀浓度和/或达到的最大抑制效果可通过ELISA、SET、FACS或MSD(中观尺度发现)来确定。在一个实施方案中，IC₅₀浓度和/或达到的最大抑制效果以如本文实施例7所述的细胞粘附测定确定。在一个实施方案中，IC₅₀浓度和/或达到的最大抑制效果可通过如本文实施例7所述的方法确定。

聚集

本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段能够抑制由GPVI配体如胶原蛋白诱导的在富含人血小板的血浆和人全血中的血小板聚集。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段抑制应答GPVI配体如胶原蛋白的血小板聚集。在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。在一个实施方案中，所述胶原蛋白是人、兔或食蟹猴胶原蛋白。

在一个实施方案中，当以0.25μg/mL或更高、0.5μg/mL或更高、1μg/mL或更高、2μg/mL或更高、3.3μg/mL或更高、5μg/mL或更高、10μg/mL或更高的浓度使用时，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、100％。在一个实施方案中，当以至少3.3μg/ml的浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、100％。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集为100％。在一个实施方案中，当以10μg/mL或更高的浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集为基本上100％。

在一个实施方案中，当以3.3μg/mL的浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的人血小板聚集至少70％。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段抑制食蟹猴主动脉胶原蛋白诱导的人血小板聚集。在另一个实施方案中，当以至少3.3μg/mL或更高的浓度使用时，优选当以10μg/mL的浓度使用时，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制食蟹猴主动脉胶原蛋白诱导的人血小板聚集。在一个实施方案中，当以10μg/mL的浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制食蟹猴主动脉胶原蛋白诱导的人血小板聚集至少50％。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集，但对由其它血小板聚集诱导物质(例如GPVI的其它激动剂)，如ADP、TRAP或PAR1诱导的血小板聚集没有影响。

此外，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段也能够抑制人动脉粥样硬化斑块物质诱导的血小板聚集。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段抑制人动脉粥样硬化斑块诱导的人血小板聚集为基本上100％。在一个实施方案中，当以2μg/mL或更高的浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制人动脉粥样硬化斑块诱导的人类血小板聚集为100％。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

所实现的对聚集的抑制作用可以通过如本文实施例9或实施例10中所述的阻抗聚集测定法来测定。

本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段还能够抑制处于胶原蛋白包被的表面上的流动下的血小板聚集。此外，本公开的抗体或抗体片段还能够抑制处于人动脉粥样硬化斑块包被的表面上的流动下的人血小板聚集。本公开的抗体或抗体片段还能够抑制处于人动脉粥样硬化斑块包被的表面上的流动下的血小板聚集。本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段也能够抑制流动下的由人动脉粥样硬化斑块诱导的血小板聚集。

在某些实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段抑制流动下人动脉粥样硬化斑块诱导的血小板聚集至少95％。在某些实施方案中，当以2.0μg/mL或更高的浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制流动下人动脉粥样硬化斑块诱导的血小板聚集至少95％。在某些实施方案中，当以2.0μg/mL或更高的抗体浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制流动下人动脉粥样硬化斑块诱导的人血小板聚集至少95％。在某些实施方案中，当以2.0μg/mL或更高的抗体浓度使用时，本公开的抗体或抗体片段抑制流动下随时间的人动脉粥样硬化斑块诱导的血小板聚集至少95％。

在某些实施方案中，当与乙酰水杨酸和替格瑞洛的组合相比时，本公开的抗体或抗体片段抑制在流动下随时间的动脉粥样硬化斑块诱导的血小板的聚集方面更有效。在某些实施方案中，当以2.0μg/mL的抗体浓度使用时，当与乙酰水杨酸和替格瑞洛的组合相比时，本公开的抗体或抗体片段更有效地抑制流动下随时间的动脉硬化斑块诱导的血小板聚集。

在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

对流动条件下的聚集所达到的抑制作用可以通过如本文实施例11中所述来确定。

体内活性

本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段也能够抑制或预防体内血栓形成(例如血小板聚集和粘附)。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段抑制体内血小板响应于胶原蛋白结合而形成血栓的能力。

在本文实施例12所述的方法中，与施用前的值或对照值相比较，本公开的抗体片段具有在3mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.3mg/kg或更低或0.1mg/kg或更低的抗体浓度下，使胶原蛋白诱导的血小板血栓形成减少20％、等于或大于40％、等于或大于60％、等于或大于80％、等于或大于90％或等于或大于95％的活性。

在本文实施例12所述的方法中，与施用前的值或对照值相比，所述抗体片段具有在约3.3mg/kg的抗体浓度下使血小板的血栓形成减少等于20％、等于或大于40％、更优选等于或大于60％、等于或大于80％、等于或大于90％或等于或大于95％的体内活性。

在本文实施例12所述的方法中，抗体片段具有在约3.3mg/kg的抗体浓度下基本上完全防止体内血栓形成的体内活性。

安全性

出血

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段不诱导受试者出血时间的增加。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段基本上不延长或不显著延长受试者的出血时间。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段不延长受试者的出血时间。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段延长受试者出血时间的能力弱。

出血时间可以通过公知的方法测定，具体地，可以应用实施例14中描述的方法。

在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段在治疗有效量，例如0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg下，基本上不延长受试者的出血时间。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段在10mg/kg的浓度下基本上不延长出血时间。

具体地，出血时间小于或等于5倍的施用前值、正常值或对照，优选小于或等于3倍的施用前值、正常值或对照，小于或等于2倍的施用前值、正常值或对照，小于或等于1.5倍的施用前值、正常值或对照，或基本上等于施用前值、正常值或对照。

与单独施用乙酰水杨酸相比，当与乙酰水杨酸共施用时，本公开的抗体或抗体片段在治疗有效量下基本上不延长出血时间。

与单独施用乙酰水杨酸相比，当与乙酰水杨酸(ASA)共施用时，本公开的抗体或抗体片段在治疗有效量，例如0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg下不延长出血时间。

血小板计数

本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段基本上不诱导体内血小板计数的减少。在一个实施方案中，当施用给受试者时，本公开的抗体或抗体片段基本上不诱导体内血小板计数的减少。优选地，本公开的抗体或抗体片段对体内血小板计数无活性。

因此，在一个实施方案中，当施用于受试者时，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段基本上不诱导血小板减少症。在另一个实施方案中，本公开的所述抗体或抗体片段基本上不诱导体内血小板减少症。

体内血小板减少症可以通过在体内施用本公开的抗体或抗体片段后随时间收集血液，用常规方法计算血小板数量，并将该数量与施用前的值或作为对照的个体的血小板数量进行比较来确定。体内血小板减少症可以如本公开的实施例15中所述确定。

在一个实施方案中，当体内施用时，例如当以治疗有效量施用时，本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段不诱导血小板计数的减少，即血小板减少症。在一个实施方案中，当体内施用时，例如当以0.01mg/kg至100mg/kg范围内的量施用时，本公开的抗体或抗体片段不诱导血小板计数的减少，即血小板减少症。在一个实施方案中，当体内施用时，例如当以10mg/kg的浓度施用时，本公开的抗体或抗体片段不诱导血小板计数的减少，即血小板减少症。

当将施用前的值或对照值设定为100％时，由本公开的抗体或抗体片段减少的血小板数量优选等于或大于所述抗体施用前的或对照的血小板数量的50％、等于或大于所述抗体施用前的或对照的血小板数量的70％、等于或大于所述抗体施用前的或对照的血小板数量的90％、或基本上等于所述抗体施用前的或对照的血小板数量。

当将施用前的值或对照值设定为100％并且当以例如0.3mg/kg、优选1mg/kg、更优选3mg/kg、进一步优选10mg/kg的浓度施用抗体时，由本公开的抗体或抗体片段减少的血小板数量等于或大于所述抗体施用前的或对照的血小板数量的50％，等于或大于所述抗体施用前的或对照的血小板数量的70％，等于或大于所述抗体施用前的或对照的血小板数量的90％，或优选几乎等于所述抗体施用前的或对照的血小板数量。

细胞表面表达/脱落/内化

可以下调或耗尽血小板膜或表面的GPVI。GPVI蛋白水平的这种调节可由配体(如胶原蛋白)结合和随后的受体活化触发，导致例如GPVI胞外结构域的切割(例如脱落)或配体诱导的GPVI受体内化。血小板活化也可在衔接模拟配体功能的对GPVI特异的抗体时发生。在对GPVI特异的抗体模拟GPVI激动剂配体的功能的情况下，可将抗体视为GPVI激动剂。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段基本上不活化血小板，优选地不具有活性。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段在体内基本上不活化血小板，优选地不具有活性。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段与血小板表面上的GPVI结合并防止血小板上GPVI途径的活化。

在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段不诱导体内血小板表面的GPVI耗尽。在一个实施方案中，当施用于受试者时，本公开的抗体或抗体片段不诱导血小板表面的GPVI耗尽。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段在体内基本上不耗尽血小板表面的GPVI。在一个实施方案中，当使本公开的抗体或抗体片段与血小板在体内接触时，所述抗体或抗体片段基本上不耗尽血小板表面的GPVI。

在一个实施方案中，当体内施用时，例如当以0.01至500mg范围内的治疗有效量施用时，本公开的抗体或抗体片段不诱导血小板表面GPVI的耗尽。在一个实施方案中，当以10mg/kg的浓度在体内施用时，本公开的抗体或抗体片段不诱导血小板表面GPVI的耗尽。

在一个实施方案中，当使本公开的抗体或抗体片段与血小板接触时，所述抗体或抗体片段基本上不会通过血小板GPVI的脱落、尤其是通过伴随有血小板活化的金属蛋白酶介导的切割导致的血小板GPVI的脱落，而耗尽血小板表面的GPVI。

本公开的抗体或抗体片段基本上不诱导GPVI从血小板表面脱落，特别是通过伴随有血小板活化的金属蛋白酶介导的切割导致的GPVI从血小板脱落。在一个实施方案中，通过使本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段与血小板接触，特别是通过使所述抗体或抗体片段与血小板在体内接触，本公开的抗体或抗体片段不诱导血小板表面GPVI的耗尽。

这种活性可以通过使本公开的抗体或抗体片段与血小板接触给定时间，随后分离血小板，并测定表面上GPVI的表达水平来证实。GPVI的表达水平可以使用FACS等通过常规方法来测量，并且具体方法在实施例16中说明。

与施用于受试者之前的值或对照值相比较，本公开的抗体或抗体片段在0.1mg/kg或更多、0.3mg/kg或更多、1mg/kg或更多、3mg/kg或10mg/kg或更多的浓度时，不诱导GPVI从血小板表面消耗等于或大于20％、等于或大于40％、等于或大于60％、等于或大于80％、等于或大于90％。

通过使血小板与本公开的抗体或抗体片段接触而内化血小板的GPVI，本公开的抗体或抗体片段基本上不耗尽血小板表面上的GPVI。

血小板活化

当作为完整免疫球蛋白存在时，抗体是二价分子，并且因此可以诱导GPVI受体在血小板表面上的聚集，并因此诱导血小板活化，这与其天然激动剂配体如胶原蛋白类似。为了克服这个问题，本公开的发明人开发了对GPVI特异的单价抗体或抗体片段，特别是Fab片段。

然而，在自然界中仅作为免疫球蛋白的降解产物存在的Fab显示出仍以患者特异性方式诱导血小板活化的潜力。这被认为是由Fab的C-末端(C-terminal end，C-terminus)引起的，其形成可被受试者血清中存在的预存抗体识别和特异性结合的表位。然后这些预先存在的抗体由于二价或多价抗体分子的恢复而可以引发免疫应答，导致不希望的血小板活化。形成这种抗Fab抗体表位的氨基酸序列可以称为自身抗原序列(Kormeier等(1968)J.Immunol.100(3)；612-21；Persselin和Stevens(1985)J.Clin.Invest.76；723-30)。因此，如本文所用，术语“非自身抗原序列”是指不是或不形成被受试者中存在的预存抗体识别的表位的氨基酸序列。

为了确定氨基酸序列是否作为自身抗原序列，可以将包含待测特异性序列的肽构建体暴露于人血清，以确定血清中是否存在识别并特异性结合肽构建体的抗体。更具体地说，为了鉴定免疫球蛋白的特定氨基酸序列是否是自身抗原序列，例如可以用一组蛋白酶切割IgG分子，以产生在C-末端区含有不同序列的IgG片段。或者，肽和多肽可以通过肽合成或重组DNA技术来生产，这些技术是根据IgG C-末端区的序列来建模的。在任一情况下，可以筛选人血清以确定是否存在分别结合特定暴露的C-末端氨基酸序列或合成肽的预存抗体。

为了提供安全的治疗局部缺血事件的治疗剂，必须确保所开发的抗体片段如Fab的这种活化潜力不存在或非常弱。因此，在一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的Fab基本上不活化血小板，优选没有活性。血小板的活化可以通过已知方法测量，并且血小板表面抗原，优选CD62P的表达水平可以用作指标。

例如，包括在给定的一段时间后从已施用单价抗体或抗体片段的受试者分离血小板并通过常规方法测量CD62P的表达水平的方法，使本公开的对GPVI特异的单价抗体或抗体片段与从受试者分离的血小板接触并在给定的一段时间后通过常规方法测定CD62P的表达水平的方法等。具体方法见实施例13。

因此，在一个实施方案中，归因于本公开的对GPVI特异的Fab被受试者血清中存在的抗Fab抗体识别，该Fab基本上不活化血小板。在另一个实施方案中，本公开的对GPVI特异的Fab基本上不诱导血小板上的细胞表面活化标记物如CD62P的表达。

本申请的发明人证实，Fab重链C端的修饰可进一步降低、防止或抑制这种Fab诱导血小板活化的可能性，例如通过防止受试者血清中存在的抗Fab抗体识别所述对GPVI特异的Fab。

本文中，“防止识别”或“防止结合“意指本公开的对GPVI特异的Fab不交联血小板表面上的GPVI并活化GPVI信号传导，这归因于受试者血清中存在抗Fab抗体。这种交联可模拟天然配体(如胶原蛋白)的活性，导致GPVI受体活化。换句话说，本公开的Fab可以作为激动剂而不是拮抗剂。中和GPVI受体功能的拮抗性GPVI特异性抗体或抗体片段或激活GPVI功能的激动性GPVI特异性抗体或抗体片段可通过测定反映GPVI功能的体内标志物来评估。

因此，本公开提供了对GPVI特异的抗体片段，其包含修饰的重链恒定区。在一个实施方案中，所述抗体片段是Fab。重链恒定区的这种修饰包括在或向Fab重链的C末端添加或取代一个或多个氨基酸残基。

因此，本公开提供了包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述经修饰的重链恒定区防止或抑制受试者血清中存在的抗Fab抗体对所述Fab的识别。

在本公开的一个实施方案中，可通过添加或取代一个或多个氨基酸，优选通过添加或取代一个以上氨基酸，例如氨基酸序列(例如多肽)，来修饰对GPVI特异的Fab的重链恒定区。此类添加或取代的多肽可以是任何氨基酸序列，只要其在引入本公开的Fab中时能够构成非自身抗原序列，但不干扰所述Fab与GPVI的结合。

如本文所用，“工程化的”或“修饰的”指经遗传工程化以在Fab重链的C-末端含有氨基酸延伸(例如添加)或取代的Fab。

在一个实施方案中，将所述多肽添加至Fab重链的C末端。在一个实施方案中，将所述多肽添加至Fab的CH1结构域的C-末端。或者，如果存在铰链部分，则多肽取代Fab重链C-末端的铰链部分。在一个实施方案中，所述Fab的铰链部分包含氨基酸序列EPKSC(SEQ IDNO：101)或由其组成。

因此，本公开提供了本公开的对GPVI特异的Fab，其包含经修饰的重链恒定区，其中所述经修饰的重链恒定区从N-末端至C-末端依次包含CH1结构域和能够构成非自身抗原序列的多肽，其中所述经修饰的重链恒定区阻止或抑制所述Fab被受试者血清中存在的抗Fab抗体识别。

在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，所述CH1结构域是人CH1结构域。

在一个实施方案中，所述多肽构成非自身抗原序列。在一个实施方案中，所述多肽包含1至100个氨基酸、1至50个氨基酸、1至20个氨基酸、1至15个氨基酸或1至10个氨基酸或1至5个氨基酸或1个氨基酸。

在一个实施方案中，所述多肽仅包含一个半胱氨酸，其允许在Fab的重链和轻链之间形成二硫键，并因此稳定分子。在一个具体实施方案中，所述半胱氨酸是本公开Fab的修饰重链恒定区的最后一个氨基酸残基。在本公开的其他实施方案中，所述半胱氨酸不允许在第一Fab分子的重链恒定区和第二Fab分子的重链恒定区之间形成二硫键。在本公开的另另外的实施方案中，所述非自身抗原序列防止(Fab)₂分子的形成。在本公开的另一个实施方案中，所述多肽含有不超过一个半胱氨酸。

在一个实施方案中，能够构成非自身抗原序列的多肽包括氨基酸序列ERRX2X3GIGHKC(SEQ ID NO：102)，其中X2和X3可以是除半胱氨酸外的任何天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述多肽包含选自ERRNGGIGHKC(SEQ ID NO：103)、EERNGGIGHKC(SEQ ID NO：104)、ERRQGGIGHKC(SEQ ID NO：105)和VPREC(SEQ ID NO：106)的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，所述多肽由氨基酸序列ERRQGGIGHKC(SEQ IDNO：105)组成。能够构成非自身抗原序列的所述多肽可包含额外的氨基酸取代，例如以除去存在于本公开产生的Fab中的潜在翻译后修饰位点或潜在T细胞表位，这在本公开的范围内。

因此，本公开提供了本公开的对GPVI特异的Fab，其包含经修饰的重链恒定区，其中所述经修饰的重链恒定区从N末端到C末端依次包含CH1结构域和当加入到所述Fab的C末端时能构成非自身抗原序列的多肽，其中所述多肽由氨基酸序列ERRQGGIGHKC(SEQ ID NO：105)组成，其中所述经修饰的重链恒定区阻止或抑制受试者血清中存在的抗Fab抗体对所述Fab的识别。

在一个实施方案中，所述CH1结构域选自：人IgG1 CH1结构域、人IgG2 CH1结构域、人IgG3 CH1结构域和人IgG4 CH1结构域。在一个实施方案中，所述CH1结构域是人IgG1 CH1结构域。在实施方案中，所述CH1结构域是野生型人IgG1 CH1结构域，野生型人IgG1 CH1结构域的任何同种异型，或包含与野生型人IgG1 CH1结构域的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述修饰的重链恒定区包含选自以下的氨基酸序列：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKIVPREC(SEQ ID NO:107)，

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVERRNGGIGHKC(SEQ ID NO:108)，

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVEKKVERRNGGIGHKC(SEQ ID NO:109)，

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKGVERRNGGIGHKC(SEQ ID NO:110)，

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRNGGIGHKC(SEQ ID NO:111)，

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEERNGGIGHKC(SEQ ID NO:112)，和

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRQGGIGHKC(SEQ ID NO:113)，

或与SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:113具有最多10个氨基酸的差别或者与这些序列中的任何一个具有至少90％同一性。

在一个实施方案中，本公开提供了本文所公开的包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述经修饰的重链恒定区包含以下氨基酸序列：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKEVERRQGGIGHKC(SEQ ID NO:113)。

在某些实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的Fab，其包含经修饰的重链恒定区和选自以下的VH和VL的组合：

a)SEQ ID NO:17的VH和SEQ ID NO:18的VL，

b)SEQ ID NO:28的VH和SEQ ID N0:29的VL,

c)SEQ ID N0:39的VH和SEQ ID NO.40的VL，和

d)SEQ ID NO:50的VH和SEQ ID NO:51的VL，并且

其中，所述经修饰的重链恒定区由选自SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ IDNO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述经修饰的重链恒定区由SEQ ID NO:113组成。

在某些实施方案中，本公开提供了对GPVI特异的Fab，其中所述Fab包含选自以下的VH和VL的组合：

a)SEQ ID NO:17的VH和SEQ ID NO:18的VL，

b)SEQ ID NO:28的VH和SEQ ID N0:29的VL，

c)SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO.40的VL，和

d)SEQ ID NO:50的VH和SEQ ID NO:51的VL,

并且还包含选自SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：113的经修饰的重链恒定区。在一个优选的实施方案中，所述经修饰的重链恒定区由SEQ ID NO.113组成。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab包含SEQ ID NO：21的重链和SEQ ID NO：19的轻链。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab包含SEQ ID NO：32的重链和SEQ ID NO：30的轻链。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab包含SEQ ID NO：43的重链和SEQ ID NO：41的轻链。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab包含SEQ ID NO：54的重链和SEQ ID NO：52的轻链。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab由SEQ ID NO：21的重链和SEQ ID NO：19的轻链组成。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab由SEQ ID NO：32的重链和SEQ ID NO：30的轻链组成。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab由SEQ ID NO：43的重链和SEQ ID NO：41的轻链组成。

在一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab由SEQ ID NO：54的重链和SEQ ID NO：52的轻链组成。

在另一个实施方案中，本公开涉及包含经修饰的重链恒定区的对GPVI特异的Fab，其中所述Fab包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

在一个实施方案中，本公开提供了包含经修饰的重链恒定区的本公开的对GPVI特异的Fab，其中所述经修饰的重链恒定区按从N末端到C末端的顺序包含CH1结构域和能够构成非自身抗原序列的多肽，其中所述经修饰的重链恒定区阻止或抑制所述Fab被受试者血清中存在的抗Fab抗体识别，且其中所述Fab由SEQ ID NO：43的重链和SEQ ID NO：41的轻链组成。

因此，本公开还提供了当使用对GPVI特异的Fab时，通过存在于受试者血清中的抗Fab抗体来防止血小板活化的方法，其包括：

(a)提供包含重链恒定区和轻链恒定区的对GPVI特异的Fab

(b)添加或取代能够构成针对所述Fab重链恒定区的C末端的非自体抗原的多肽。

交叉竞争/表位

在实施方案中，本公开涉及与表1-4中公开的抗体或抗体片段交叉竞争的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含表1-4中公开的抗体之一的Kabat所定义的6个CDR的抗体或抗体片段交叉竞争。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段交叉竞争，其中HCDR1是SEQ ID NO：11的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：12的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：13的氨基酸序列，LCDR1是SEQ ID NO：14的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：15的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含根据SEQ ID NO：17的VH和根据SEQ ID NO：18的VL的抗体或抗体片段交叉竞争。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段交叉竞争，其中HCDR1是SEQ ID NO：22的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：23的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：24的氨基酸序列，LCDR1是SEQ ID NO：25的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：26的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含根据SEQ ID NO：28的VH和根据SEQ ID NO：29的VL的抗体或抗体片段交叉竞争。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段交叉竞争，其中HCDR1是SEQ ID NO：34的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：34的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：35的氨基酸序列，LCDR1是SEQ ID NO：36的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：37的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含根据SEQ ID NO：39的VH和根据SEQ ID NO：40的VL的抗体或抗体片段交叉竞争。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段交叉竞争，其中HCDR1是SEQ ID NO：44的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：45的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：46的氨基酸序列，LCDR1是SEQ ID NO：47的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：48的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：49的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含根据SEQ ID NO：50的VH和根据SEQ ID NO：51的VL的抗体或抗体片段交叉竞争。

在另一个实施方案中，本公开涉及与表1-4中公开的抗体或抗体片段交叉竞争并且在基于ELISA的交叉竞争测定中使表1-4中公开的任一种抗体与GPVI的结合降低至少60％、70％、80％或90％的抗体或抗体片段。在某个实施方案中，在根据实施例17的基于ELISA的交叉竞争测定中，与表1-4中公开的抗体或抗体片段交叉竞争的抗体或抗体片段将表1-4中描述的抗体之一与GPVI的结合降低至少60％、70％、80％或90％。

在另一个实施方案中，本公开涉及与表1-4中公开的抗体之一结合(例如，通过结合、稳定、空间分布)相同表位的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段与包含表1-4中公开的抗体之一的Kabat所定义的6个CDR的抗体或抗体片段结合(例如，通过结合、稳定、空间分布)相同的表位。在又一个实施方案中，所述抗体或抗体片段与包含表1-4中公开的抗体之一的Kabat所定义的6个CDR的抗体或抗体片段结合(例如，通过结合、稳定、空间分布)相同的GPVI表位。在又一个实施方案中，所述抗体或抗体片段与包含表1-4中公开的抗体之一的Kabat所定义的6个CDR的抗体或抗体片段结合(例如，通过结合、稳定、空间分布)相同的包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽表位。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段结合相同的表位，其中HCDR1是SEQ ID NO：11的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：12的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：13的氨基酸序列，LCDR1是SEQ IDNO：14的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：15的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合与包含根据SEQ ID NO：17的VH和根据SEQ ID NO：18的VL的抗体或抗体片段相同的表位。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段结合相同的表位，其中HCDR1是SEQ ID NO：22的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：23的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：24的氨基酸序列，LCDR1是SEQ IDNO：25的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：26的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合与包含根据SEQ ID NO：28的VH和根据SEQ ID NO：29的VL的抗体或抗体片段相同的表位。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段结合相同的表位，其中HCDR1是SEQ ID NO：34的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：34的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：35的氨基酸序列，LCDR1是SEQ IDNO：36的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：37的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合与包含根据SEQ ID NO：39的VH和根据SEQ ID NO：40的VL的抗体或抗体片段相同的表位。

在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含6个CDR的抗体或抗体片段结合相同的表位，其中HCDR1是SEQ ID NO：44的氨基酸序列，HCDR2是SEQ ID NO：45的氨基酸序列，HCDR3是SEQ ID NO：46的氨基酸序列，LCDR1是SEQ IDNO：47的氨基酸序列，LCDR2是SEQ ID NO：48的氨基酸序列，LCDR3是SEQ ID NO：49的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开涉及抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合与包含根据SEQ ID NO：50的VH和根据SEQ ID NO：51的VL的抗体或抗体片段相同的表位。

可以使用本领域公知的任何数量的表位作图技术鉴定给定多肽的包括表位的区域。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，表位可以通过例如在固体支持物上同时合成大量的肽，所述肽对应于蛋白质分子的各部分，并且在肽仍然附着于支持物时使肽与抗体反应来确定。此类技术是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号4,708,871；Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002；Geysen等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182；Geysen等，(1986)Mol.Immunol.23:709-715。类似地，表位可通过测定氨基酸的空间构象而容易地鉴定，例如通过氢/氘交换、X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols，见上文。蛋白的抗原性区域也可使用标准抗原性和亲水性图鉴定，例如使用如Oxford Molecular Group提供的Omiga1.0版软件程序计算的那些。该计算机程序使用Hopp/Woods方法，Hopp等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828，用于确定抗原性谱，以及Kyte-Doolittle技术，Kyte等，(1982)J.MoI.Biol.157:105-132，用于亲水性图。

在某些实施方案中，与本公开抗体结合GPVI上相同表位的抗体或抗体片段是人单克隆抗体或抗体片段。在某些实施方案中，与本公开抗体或抗体片段结合GPVI上相同线性表位的抗体或抗体片段是人单克隆抗体或抗体片段。在某些实施方案中，与本公开的抗体结合GPVI上相同构象表位的抗体或抗体片段是人单克隆抗体或抗体片段。这样的人单克隆抗体或抗体片段可以如本文所述制备和分离。

治疗方法

本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段可用于预防或治疗与不期望的GPVI的存在相关的血栓形成性或血管性病症或病况。

在一个实施方案中，本公开涉及用于药物的本公开的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开涉及用于治疗有需要的受试者的本公开的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本公开涉及用于制备药物的本公开的抗体或抗体片段。在实施方案中，本文公开的方法包括向有需要的受试者施用本公开的抗体或抗体片段。本公开还涉及本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段用于制备治疗和/或预防与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况的药物的用途。在一个实施方案中，本公开提供了预防或治疗与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况的方法。

在某些实施方案中，本公开提供了用于预防或治疗受试者的血栓形成性或血管性病症的方法。

与GPVI相关的血栓形成性或血管(例如心血管)性病症或病况可包括但不限于例如动脉血栓形成(包括动脉粥样血栓形成)、缺血性事件、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞(心脏病发作)、急性脑血管缺血(中风)、经皮冠状动脉介入、支架血栓形成、缺血性再狭窄、缺血(急性和慢性)、主动脉及其分支的病症(例如主动脉瘤、血栓形成)、外周动脉病症、静脉血栓形成、急性静脉炎和肺栓塞、癌症相关血栓形成(Trousseau综合征)、炎性血栓形成和与感染相关的血栓形成。与不期望的GPVI存在相关的其它病症或病况可以是但不限于出血病症或病况(例如出血倾向和/或延长的出血时间)，例如血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)或免疫性血小板减少症。在另一个实施方案中，与不期望的GPVI存在相关的病症或病况可包括炎症和/或癌症。

在一个实施方案中，本文公开的方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的步骤。在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个备选的实施方案中，所述受试者是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方案中，本公开涉及本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段，其用于治疗与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况。

本公开还涉及抑制GPVI受体功能和下游信号传导，从而预防或治疗与不期望的GPVI存在相关的病症或病况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的抗体或抗体片段。

本公开涉及抑制GPVI受体功能和下游信号传导，同时不影响血小板计数、GPVI在血小板表面的存在或出血时间的方法。

本公开还涉及用于防止或抑制GPVI与胶原蛋白结合从而治疗或预防与不期望的GPVI存在相关的病症或病况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，防止或抑制GPVI与胶原蛋白结合的方法不影响受试者的血小板计数、血小板表面GPVI的存在或出血时间。

本公开还涉及抑制或防止血小板粘附至胶原蛋白从而治疗GPVI相关病况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，防止或抑制GPVI与胶原蛋白粘附的方法不影响受试者的血小板计数、血小板表面GPVI的存在或出血时间。

在另一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段用于抑制血小板聚集。因此，本公开还涉及抑制或防止胶原蛋白诱导的血小板聚集，从而治疗GPVI相关病况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，防止或抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集的方法不影响受试者的血小板计数、血小板表面GPVI的存在或出血时间。

本公开还涉及抑制或防止血小板活化从而治疗GPVI相关病况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，防止或抑制血小板活化的方法不影响受试者的血小板计数、血小板表面GPVI的存在或出血时间。

本公开还涉及用于防止或抑制受试者中响应于胶原蛋白结合的血栓形成的方法，其中所述方法包括向受试者施用本公开的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，防止或抑制个体中响应于胶原蛋白结合的血栓形成的方法不影响个体的血小板计数、血小板表面GPVI的存在或出血时间。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括使血小板与本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段接触。

在一个实施方案中，受试者受与GPVI相关的病症或病况影响，优选被诊断为患有与GPVI相关的病症或病况，优选血栓形成性或血管性病症和/或事件。在一个实施方案中，受试者处于发展与GPVI相关的病症或病况的风险中，优选血栓形成性或血管性病症和/或事件。风险的实例包括但不限于家族史(例如遗传倾向性)、种族、年龄、烟草暴露、高血压(血压高(hypertension))、高胆固醇、肥胖症、身体不活动、糖尿病(特别是2型糖尿病)、不健康的饮食和酒精的有害使用。

在一个实施方案中，在本文公开的方法中施用的所述对GPVI特异的抗体或抗体片段包含：

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区，SEQ ID NO：45的HCDR2区、SEQ ID NO：46的HCDR3区、SEQ ID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区及SEQ ID NO：49的LCDR3区。

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL或

在进一步的实施方案中，所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：54的HC和SEQ ID NO：52的LC。

组合物

本公开的组合物优选是药物组合物，其包含本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，用于预防或治疗血栓形成性或血管性病症。此类载体、稀释剂和赋形剂是本领域熟知的，并且本领域技术人员将发现最适合于用本公开的GPVI抗体或抗体片段治疗受试者的制剂和施用途径。

在一个实施方案中，本公开涉及包含本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

可用于这些组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

在一个实施方案中，所述对GPVI特异的抗体或抗体片段以药学或治疗有效量存在。

在一个实施方案中，本公开涉及包含本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的药物组合物，其用于治疗与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况。在另一个实施方案中，所述与不期望的GPVI的存在相关的病况是血栓形成性或血管性病症。在一个实施方案中，本公开涉及包含本文所公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的所述药物组合物在制备用于治疗与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况的药物中的用途。在另一个实施方案中，所述与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况是血栓形成性或血管性病症。在一个实施方案中，本公开涉及所述药物组合物用于治疗与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况的用途。在另一个实施方案中，所述与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况是血栓形成性或血管性病症。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗受试者的血栓形成性或血管性病症的方法，所述方法包括施用包含治疗有效量的本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的药物组合物。在另一个实施方案中，所述受试者是有需要的受试者。在优选的实施方案中，所述受试者是人。在备选的实施方案中，所述受试者是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方案中，本公开涉及药物组合物，其包含表1-4中公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗或预防血栓形成性或血管性病症。

在另一个实施方案中，本公开涉及用于预防受试者的血栓形成性或血管性病症的方法，所述方法包括施用本公开的抗体或抗体片段或包含此类抗体或抗体片段和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，用于治疗血栓形成性或血管性病况。

本文所用的“预防”是指旨在防止病症发作或延迟病症发作的方法。在一些实施方案中，所述受试者是人。在可选的实施方案中，所述受试者是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。

本文所用的术语“施用”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、脊柱内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。

在一个实施方案中，静脉内施用本公开的包含本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的组合物。优选地，将治疗有效量的本公开的抗体或抗体片段施用至有需要的受试者。

应理解，本公开的抗体或抗体片段、本公开的组合物、药物组合物或药剂的总每日使用法将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定蛋白的活性；所用的具体组合物、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用特定蛋白的***速率；治疗的持续时间；与所用特定蛋白组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。例如，本领域技术人员熟知，化合物的起始剂量水平低于达到所需治疗效果所需的剂量水平，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。然而，抗体或抗体片段的每日剂量可以在0.01至500mg/受试者/天的宽范围内变化。优选地，组合物含有1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg活性成分，用于待治疗患者的剂量的症状性调节。药物通常含有0.01mg至1000mg活性成分，优选1mg至500mg活性成分。

在一个实施方案中，本公开涉及包含本公开的对GPVI特异的抗体或抗体片段的组合物在制备药物制剂中的用途，所述药物制剂用于同时、分别或依次施用来治疗和/或防止和/或预防和/或解除与不期望的GPVI的存在相关的病症或病况或GPVI相关病况。在优选的实施方案中，本公开的组合物优选是包含对GPVI特异的Fab的药物组合物。

鉴定方法

在一个实施方案中，本公开提供鉴定对GPVI特异的拮抗性抗体或抗体片段的方法，其包括以下步骤：

a)将哺乳动物的富血小板血浆与对GPVI特异的抗体或抗体片段接触

b)通过加入胶原蛋白引发血小板的聚集

c)比较步骤(b)中测定的聚集和在不添加步骤(a)的对GPVI特异的抗体或抗体片段的情况下将胶原蛋白添加到富血小板血浆中时获得的聚集，

其中在步骤(a)中所述的抗体或抗体片段存在下血小板聚集的减少表明，所述抗体或抗体片段是本公开的GPVI的抑制剂或拮抗剂。

在一个实施方案中，在步骤(a)中所述的抗体或抗体片段存在下，血小板聚集的降低降低了至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％。

诊断

本公开还涉及本公开的对人GPVI特异的抗体或抗体片段用于检测生物样品中的GPVI的用途。可使用本公开的抗体或抗体片段的测定的实例包括但不限于ELISA、夹心ELISA、RIA、FRCS、组织免疫组织化学、Western印迹和免疫沉淀。在一个实施方案中，本公开的抗体或抗体片段可以被标记用于诊断或检测目的。本文中标记的意思是化合物具有至少一种元素、同位素或化学化合物，其被连接以使得能够检测该化合物。

在本公开的一个实施方案中，对GPVI特异的抗体或抗体片段可用于诊断GPVI表达变化。据描述，GPVI在血小板表面上的表达的变化以及可溶性GPVI(切割的GPVI的胞外结构域)在血浆中的出现和浓度可能与病理生理学状况如急性冠状动脉综合征、短暂性脑缺血发作或中风相关(Bigalke B，等，Eur J Neurol.，2009Jul 21；Bigalke B.等，SeminThromb Hemost.2007Mar；33(2):179-84)。

因此，这些参数的测量可用于鉴定处于上述需要抗血栓形成治疗的病况的风险中并且可能特别易受抗GPVI治疗影响的受试者。因此，本文所述的抗体和抗体片段可用作诊断工具，并且是诊断试剂盒的一部分，所述试剂盒测定血小板表面以及血浆样品中GPVI的存在和定量变化。

用于诊断受试者中GPVI变化的此类方法可包括：

a)将所述患者的血小板或血浆样品与本公开的抗体或抗体片段接触，

b)测量所述抗体或抗体片段与所述样品中存在的细胞的结合，和

c)将步骤(ii)中测量的结合与正常参照受试者或标准的结合进行比较。

本公开的另一个目的是包含至少一种本公开的抗体或抗体片段的试剂盒。“试剂盒”是指包含至少一种用于特异性检测GPVI的表达的试剂(即例如抗体或抗体片段)的任何制品(例如包装或容器)。试剂盒可以作为实施本发明方法的单元进行推广、分发或销售。此外，任何或所有试剂盒试剂均可以提供在保护它们不受外部环境影响的容器内，例如在密封容器中。试剂盒也可以包含描述试剂盒及其使用方法的包装插页。

抗体序列

表1：Fab#1的抗体序列

表2：Fab#2的抗体序列

表3：Fab#3的抗体序列

表4：Fab#4的抗体序列

表13：来源于WO2011073954的RefFab#1的抗体序列

工作实施例

实施例1：抗原产生和质量控制

从公众可得来源(例如Uniprot)检索并内部生产人、食蟹猴、小鼠和大鼠的GPVI的氨基酸序列。

重组的可溶性胞外结构域

可溶性GPVI对应于在其C末端与人Fc序列融合的GPVI的胞外结构域。这种可溶性GPVI可称为GPVI-Fc。

人GPVI-1A(SEQ ID NO：4)、人GPVI-1B(SEQ ID NO：5)、人GPVI-2A(SEQ ID NO：6)、食蟹猴GPVI(SEQ ID NO：7)、小鼠GPVI(SEQ ID NO：8)和大鼠GPVI(SEQ ID NO：9)的胞外结构域(ECD)使用KpnI和EcoRV克隆到表达载体pMAX_vk_Fc2(K105-K330)中，产生C末端Fc2(K105-K330)融合构建体。Fc2(K105-K330)具有SEQ ID NO：10中公开的氨基酸序列。

将人、食蟹猴、小鼠或大鼠GPVI胞外结构域的编码DNA与N末端Vκ前导序列和C末端人IgG Fc-标记符合读框地克隆到pMAX表达载体中，该载体是基于pcDNA3.1(ThermoFisher)的修饰的表达载体。HKB11#52(亲本克隆：美国专利6,136599.J.Biomed.Sci.2002；9:631-638)在加湿的CO2培养箱中于37℃和6％CO2维持在含有2.0mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.1％PF-68的MAC1.0培养基中。根据制造商的说明书，在接种后一天用FectoPro^TM和FectoPro^TMBooster(Polyplus)瞬时转染HKB11#52细胞。将细胞培养3天，并通过离心然后无菌过滤收获条件化的细胞培养物上清液。使用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)通过蛋白A层析纯化抗原。结合和洗涤后，用100mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱蛋白质。所有亲和层析步骤使用

Express(GE Healthcare)层析***进行。随后中和样品(用3M TrispH 8)并使用PD10柱(GE Healthcare)将缓冲液交换到PBS。通过变性、还原或非还原SDS-PAGE、HP-SEC和DLS分析样品的质量。

过表达GPVI的重组细胞

用人GPVI(SEQ ID NO：1)、食蟹猴GPVI(SEQ ID NO：2)或小鼠GPVI(SEQ ID NO：3)稳定转染CHO细胞。

使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)作为转染试剂，用编码人、猕猴或小鼠GPVI全长蛋白的pcDNA5/FRT/TO载体稳定转染Flp-in CHO细胞(Invitrogen)。在含有潮霉素B(Roth)的选择培养基中培养细胞，直至通过如下所述的荧光细胞测定法观察到均一表达GPVI的细胞群体。产生细胞库并用于随后的实验。

使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)作为转染试剂，用编码全长人GPVI的pcDNA3.1载体稳定转染大鼠嗜碱性RBL-2H 3细胞(ACC 312，DSMZ)。将细胞在含有遗传霉素(Gibco)的选择培养基中培养4周。使用FACS aria细胞分选仪(BD Biosciences)进行具有高GPVI表达的细胞的单克隆选择。在选择培养基中扩增单克隆，并通过荧光测定法检查GPVI表达水平。选择GPVI表达最强的细胞克隆用于细胞库产生并用于进一步的实验。

为了对所转染细胞的GPVI表达水平进行荧光细胞计量学评价，将细胞封闭在Superblock(Thermo Scientific)中，并随后与稀释在Superblock中至终浓度为5μg/ml的对GPVI特异的Fab一起在冰上温育60分钟。在用补充有3％胎牛血清(FCS)和0.02％叠氮化钠的PBS洗涤后，将细胞与稀释在Superblock中的缀合PE的抗F(ab')2检测抗体(JacksonImmuno Research)在冰上温育30分钟。再次洗涤细胞，并在FACS阵列(BD Biosciences)中评价细胞。

实施例2：从MorphoSys-Ylanthia^TM文库中选择对GPVI特异的抗体

为了产生抗体，使用MorphoSys

文库来选择针对GPVI的Fab片段。MorphoSys

文库(Tiller等mAbs 5:3，1–26；五月/六月(2013)和美国专利号8,728,981)是商业上可获得的噬菌粒文库，并且使用

技术在噬菌体表面上展示Fab(Lohning等，WO2001/05950)。

为了鉴定对GPVI特异的抗体，使用了不同的淘选策略。每种淘选策略包括至少3轮单独的针对来自不同物种的各种GPVI抗原(作为可溶性ECD-Fc融合物或在CHO细胞上过表达)的淘选，如实施例1所述。使所分离并鉴定的克隆成熟化并工程化以增加亲和力、功能性和安全性。因此，筛选了几百个克隆，并在包括例如以下的体外测定中严格测试了功能性

●□通过ELISA、细胞-ELISA和/或溶液平衡滴定(SET)测定与人、食蟹猴、小鼠和大鼠GPVI的结合

●□抑制GPVI与GPVI的不同胶原蛋白底物的结合。

最后，选择4个先导分子(Fab#1、Fab#2、Fab#3、Fab#4)，并在如下概述的工作实施例中进一步描述。

以两种变体生成并生产了4个先导Fab分子中的每一个；或者具有野生型人Fab重链恒定区，或者具有根据SEQ ID NO：113的经修饰的人重链恒定区。

对于哺乳动物生产，通过亚克隆方法将人Fab片段从细菌形式转化为哺乳动物Fab格式。酶促消化编码抗体的载体，并将所得载体骨架与

哺乳动物表达盒连接，并进一步亚克隆到各自的哺乳动物人Fab载体中。

为了产生本公开的经修饰的重链恒定区，将编码整个设计的重链恒定区的DNA合成为双链DNA片段。随后通过替换亲本Fab重链恒定区，将所得的包含具有同源重叠序列的经修饰的重链恒定区的合成线性DNA片段无缝克隆到相应的哺乳动物人Fab载体中。

为了表达和纯化，用编码Fab重链和轻链的pYMex10真核表达载体DNA转染真核HKB11细胞。转染后第3天收获细胞培养上清，并进行捕获选择IgG-CH1亲和层析(MabSelectSURE，GE Healthcare)用于抗体纯化。所有样品经无菌过滤(0.2μm孔径)。使用Labchip***(Caliper GXII，Perkin Elmer)或在SDS-PAGE上在变性、还原和非还原条件下分析Fab的纯度。通过UV-分光光度法测定蛋白质浓度，并进行HP-SEC以分析天然状态下的IgG制品。

参考对照抗体RefFab#1：编码WO2011073954A2(SANOFI)中公开的人源化GPVI抗体的VH(SEQ ID NO：99)和VL(SEQ ID NO：100)的核苷酸序列作为具有合适的侧翼区(例如合适的限制酶识别位点、接头序列)的线性DNA片段，在内部或通过外部提供商进行基因合成。使用标准分子生物学方法，将所有合成的DNA片段克隆到合适的哺乳动物Fab表达载体(如上所述)中，其中在Fab重链的C末端额外加入甘氨酸-丝氨酸接头(G₄S)₂。

实施例3：通过ELISA测定单价Fab与人、食蟹猴、小鼠和大鼠GPVI的结合

材料和方法

0.5-2nM重组GPVI-Fc融合蛋白(如实施例1所述)在Maxisorp微量滴定板上4℃包被过夜。用补充有0.05％吐温-20的PBS(PBST)洗板，并随后用在PBS中稀释的5％脱脂奶粉(MPBS)在室温(RT)封闭1小时。在用PBST洗涤后，在室温加入Fab(包含经修饰的重链恒定区)1小时，所述Fab在含有5％脱脂奶粉的PBST(MPBST)中连续稀释至浓度范围为600nM-1pM。用PBST洗板。使用稀释在MPBST中的针对人F(ab')2片段的缀合碱性磷酸酶的检测抗体(Jackson Immuno Research)检测结合的Fab。在用补充有0.05％吐温-20的TBS(TBST)洗涤后，加入稀释于ddH2O中的AttoPhos底物(Roche)，并在Tecan Infinite 200Pro读数器上测量荧光强度。EC₅₀值使用Prism 5软件(GraphPad)计算。

用于人、食蟹猴、小鼠和大鼠GPVI胞外结构域的序列描述于SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9。

结果和结论

如表5所示，所有Fab(包含经修饰的重链恒定区)都与人GPVI亚型和单倍型结合，并与食蟹猴GPVI交叉反应。与本公开的Fab#1-Fab#4相反，RefFab#1不结合重组小鼠和大鼠GPVI。

表5：在ELISA中Fab与不同物种的重组GPVI-Fc融合蛋白的结合。显示了两次实验的平均EC₅₀值±标准偏差(SD)。Fab#2只有一组数据可用。nep：不可能进行评价(归因于不完全滴定，没有计算EC₅₀)。

实施例4：通过细胞-ELISA确定单价Fab与重组细胞的细胞表面上表达的人、食蟹猴或小鼠GPVI的结合

材料和方法

将用人、食蟹猴或小鼠GPVI(分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，并且如实施例1中所述)稳定转染的CHO细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔高结合板(MesoScale Discovery)上的生长培养基中，并在37℃和5％CO2下培养过夜。用提供有5％BSA的PBS封闭细胞，然后与Fab(包含经修饰的重链恒定区)温育，所述Fab在提供有0.5％BSA的PBS中连续稀释至300nM至5pM之间的浓度。洗涤后，用缀合ECL的抗人F(ab')2片段的检测抗体(Jackson Immuno Research)检测结合的Fab。在Sector Imager6000(Meso ScaleDiscovery)中读数之前，将MSD读取缓冲液(Meso Scale Discovery)加入细胞。EC₅₀值使用Prism5软件(GraphPad)计算。

结果和结论

如表6所示，Fab#1-Fab#4(包含经修饰的重链恒定区)识别在细胞上表达的人和食蟹猴GPVI并揭示了与细胞表面表达的小鼠GPVI的结合。如ELISA中所观察到的，RefFab#1不结合表达鼠GPVI的细胞。

表6：在细胞ELISA中Fab与来自不同物种的过表达GPVI的CHO细胞的结合。显示了2-3个实验的平均EC₅₀值±SD。nep：不可能进行评价(归因于不完全滴定，没有计算EC₅₀)。

实施例5：通过溶液平衡滴定(SET)测定的单价Fab在GPVI上的亲和力测定

材料和方法

为了测定KD，使用含有至少90％单体含量的Fab蛋白的单体级分(如通过分析型SEC所分析的)。溶液中的亲和力测定基本上按照文献中所述进行(Frigueet等1985)。为了提高SET方法的灵敏度和准确性，将其从经典ELISA转移到基于ECL的技术(Haenel等2005)。

根据制造商的说明书，用MSD Sulfo TAGTM NHS-酯(Meso Scale Discovery│Gaithersburg│MD│USA)标记1mg/mL山羊抗人(Fab)2片段特异性抗体(Dianova)。实验在聚丙烯微量滴定板中进行，并使用含有0.5％BSA和0.02％吐温20的PBS(GIBCO 14190│pH7.0-7.2)作为测定缓冲液。制备未标记的人GPVI-Fc(SEQ ID NO：4)、食蟹猴GPVI-Fc(SEQID NO：7)和小鼠GPVI-Fc(SEQ ID NO：8)(如实施例1中制备)的系列稀释液，起始浓度比预期KD高至少10倍。用不含抗原的孔测定Bmax值；仅含有测定缓冲液的孔用于测定背景。在加入适量的结合剂(抗体浓度类似于或低于预期KD，60μL终体积)后，将混合物于RT温育过夜。分别在标准和链霉抗生物素板上用抗原或生物素化抗原包被MSD板(每孔30μL)。用含0.05％吐温20的PBS洗板后，将平衡的样品转移到板上并温育20分钟。温育后，将每孔30μLMSD-Sulfo-标签标记的检测抗体(抗人(Fab)2│最终稀释度通常为1:2,000)加入到洗涤过的MSD板中，并在Eppendorf摇床上(700rpm)室温温育30分钟。洗涤MSD板并加入30μL/孔含有表面活性剂的MSD读取缓冲液T后，使用Sector Imager 6000(MesoScale Discovery│Gaithersburg│MD│USA)检测电化学发光信号。数据用XLfit(IDBS)软件应用定制的拟合模型进行评价。对于Fab的KD测定，使用根据(Haenel等2005)的拟合模型，该模型根据(Abraham等人)进行了改进。

结果和结论

结果总结于表7中。本公开所有测试的Fab(包含经修饰的重链恒定区)对人和食蟹猴GPVI显示在两位数皮摩尔范围内的亲和力。虽然Fab#1和Fab#2以分别为28nM和7nM的合理的较弱亲和力结合小鼠GPVI，但Fab#4和Fab#3对小鼠GPVI显示亚纳摩尔亲和力。对于RefFab#1，没有测定到对小鼠GPVI的亲和力，这归因于ELISA和细胞ELISA中证实的结合的缺乏。

表7：抗GPVI-Fab对不同GPVI物种的亲和力。显示了1-2个实验的平均KD值±SD。

实施例6：通过FACS测定的单价Fab与人、食蟹猴或小鼠血小板的细胞表面上表达的GPVI的结合

材料和方法

通过将柠檬酸化的全血在150×g无制动条件下离心15分钟，制备来自最多4个供体的富血小板血浆(PRP)。将所得上清液作为PRP转移到新的样品管中，而不干扰下面的富含白细胞的中间相。在补充有前列环素I₂(PGI2；依前列醇-Rotexmedica)的Tyrode缓冲液中仔细洗涤后，将血小板重新悬浮在Tyrode/PGI₂中，并转移到96孔V底微量滴定板中。将血小板掺入在Tyrode/PGI₂中稀释至终浓度为0.015-30μg/ml的Fab(包含经修饰的重链恒定区)，并在RT下温育30分钟。小心洗涤血小板以除去未结合的Fab，然后与缀合藻红蛋白(Phycerythrine)(PE)的检测抗体(Jackson ImmunoResearch)RT温育30分钟。在RT下温育30分钟后，在FACS Canto II(Becton Dickinson)中通过流式细胞术分析血小板。在Fab直接缀合PE的情况下(图1D)，省略与检测抗体的温育。使用FACS Diva软件(BectonDickinson)评价数据。EC₅₀值使用Prism5软件(GraphPad)计算。

结果和结论

图1A-C显示了本公开所有4个Fab(包含经修饰的重链恒定区)在来自一个示例性供体的血小板上的结果。图1D显示了在来自三个人供体的血小板上测定的作为PE-直接缀合物的抗GPVI Fab#3和Fab#4(包含经修饰的重链恒定区)的其它结果。

Fab#1到Fab#4显示与在人、食蟹猴和小鼠血小板的细胞表面上表达的GPVI的特异性但供体依赖性的结合。与Fab#1到Fab#4相反，在RefFab#1中没有观察到与鼠血小板上GPVI的结合，这与ELISA和细胞ELISA中的先前结果一致。

实施例7：单价Fab的竞争性结合-通过ELISA测定的人、食蟹猴和小鼠GPVI与不同胶原蛋白底物的结合抑制

材料和方法

将1或10μg/ml重组GPVI胶原蛋白底物(交联的胶原相蛋白相关肽(CRP-XL(Anaspec，Inc.)、大鼠尾胶原蛋白(Enzo Life Sciences)或VitroCol(AdvancedBioMatrix，Inc)在4℃在MSD-板上包被过夜，用PBST洗涤，用补充有0.05％吐温-20和3％脱脂奶粉的PBS在RT下封闭1小时，随后再次用PBST洗涤。将稀释在PBS中的纯化的重组GPVI抗原(如实施例1中制备的人、猕猴或小鼠GPVI)和在PBS中稀释的不同浓度的Fab(包含经修饰的重链恒定区)(终浓度范围为200-0.3μg/ml)在聚丙烯板中RT温育30分钟。将Fab/GPVI-Fc混合物加入到包被的胶原蛋白底物中，RT持续1小时。在用PBST洗涤后，使用针对人Fc的缀合ECL的检测抗体(Jackson Immuno Research)在RT下检测不同物种的结合GPVI 1小时。在Sector Imager6000(Meso Scale Discovery)中读数之前，添加MSD读取缓冲液(MesoScale Discovery)。Fab抑制GPVI/配体相互作用导致信号降低。

结果和结论

结果总结于表8(对于人GPVI)、表9(对于食蟹猴GPVI)和表10(对于小鼠GPVI)中。指示的是针对不同GPVI胶原蛋白底物的抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区)的IC₅₀值和实现的最大抑制效果。

对于所有测试的Fab，除小鼠GPVI外，在每种GPVI/底物组合中均获得相当的IC₅₀值。这里，归因于缺乏小鼠交叉反应性，与不同底物的结合不能被RefFab#1阻断。

对于GPVI/底物结合的最大抑制，Fab#2和Fab#3在200nM下完全抑制了GPVI与不同胶原蛋白底物的结合，Fab#1和Fab#4没有达到完全抑制。当使用CRP-XL时出现最强的差异：该底物与GPVI的结合被Fab#1和Fab#4抑制47％至77％。

表8：人GPVI-Fc与不同的包被的GPVI胶原蛋白底物的结合的抑制。Fab的效力以IC50值表示，效率以测试的最高Fab浓度下获得的GPVI/底物结合抑制的百分数表示。显示了两次实验的平均值±SD。

表9：食蟹猴GPVI-Fc与不同的包被的GPVI胶原底物的结合的抑制。Fab的效力以IC₅₀值表示，效率以在测试的最高Fab浓度下获得的GPVI/底物结合抑制的百分数表示。显示的是两次实验的平均值±SD。

表10：小鼠GPVI-Fc与不同的包被的GPVI胶原蛋白底物的结合的抑制。Fab的效力以IC₅₀值表示，效率以测试的最高Fab浓度下获得的GPVI/底物结合抑制百分数表示。显示的是两次实验的平均值±SD。无inh.＝无抑制

实施例8：细胞粘附测定

材料和方法

将稀释在碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.6)中的重组GPVI-底物(1μg/ml交联的胶原蛋白相关肽(CRP-XL(Anaspec，Inc.)或10μg/ml VitroCol(AdvancedBioMatrix，Inc.))于4℃在96孔微量滴定Maxisorp平板上过夜包被。用PBS洗涤后，用添加了2％BSA的PBS封闭各孔。将稳定转染了人GPVI的大鼠嗜碱性RBL-2H3细胞从培养瓶中分离，用附着缓冲液(补充有0.5％BSA和10mM HEPES的OptiMEM)洗涤，并在37℃下用2.5μg/ml钙黄绿素-AM(Molecular Probes)染色30分钟。细胞与在附着缓冲液(终浓度范围为100nM至10pM)中稀释的抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区)在96孔聚丙烯微量滴定板中于黑暗中室温振荡温育30分钟。用PBS洗涤包被并封闭的Maxisorp板，并在RT下与细胞-抗体混合物温育30分钟，随后在37℃温育30分钟。进一步温和洗涤后，通过在Tecan InfiniteM1000 Pro读数仪中测量荧光强度(在485nm激发，在530nm发射)，评估结合的细胞。与未处理的对照细胞相比，细胞粘附的抑制导致信号减少。

结果和结论

表11总结了表达人GPVI的RBL-2H3细胞和重组胶原蛋白底物CRP-XL和VitroCol的结果。显示了IC₅₀值和在200nM的抗体浓度下抗GPVI Fab片段所实现的最大抑制作用。

Fab#1至Fab#4(包含经修饰的重链恒定区)强有力地抑制细胞与包被的VitroCol的结合，具有0.57到1.17nM的相当的半数最大浓度。对于CRP-XL，Fab#2和Fab#3获得了相似的结果，而Fab#1和Fab#4对细胞与该底物的结合没有相关影响。

关于效率，Fab#2和Fab#3分别完全(100％)和几乎完全(91-93％)抑制细胞与CRP-XL和VitroCol的结合。Fab#1和Fab#4对VitroCol的最大抑制作用分别为55％和59％。

表11：过表达人GPVI的RBL-2H3细胞结合不同的包被的胶原蛋白底物的抑制。Fab的效力以IC₅₀值表示，效率以在测试的最高Fab浓度下获得的细胞/底物结合的抑制百分数表示。显示了两次实验的平均值±SD。

实施例9：胶原蛋白诱导的人血小板聚集的抑制—

阻抗聚集测定法

材料和方法

水蛭素抗凝固血液用0.9％NaCl在

标准测试细胞(Roche)中1:1稀释，掺入在PBS中预稀释至10、3.3、1.1和0.37μg/ml的抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区)，并在搅拌下在37℃预温育3分钟。随后，通过加入不同的血小板激动剂底物(CRP-XL(1μg/ml；Anaspec，Inc.)、VitroCol(100μg/ml；Advanced BioMatrix，Inc.)、兔主动脉胶原蛋白(4μg/ml；AdvanceCor)、食蟹猴主动脉胶原蛋白(7.4μg/ml；AdvanceCor)、TRAP-6(8μM；TRAPtest，Roche)、ADP(6.5μM；ADPtest，Roche)，诱导血小板聚集。为了评价抗GPVI Fab自身对血小板的内在激动潜力，还研究了Fab在没有激动剂存在下的作用。然后通过测量测试细胞在传感器线之间的阻抗随时间的增加(所述增加由聚集的血小板诱导)，在37℃下在

设备(Roche)中测定血小板聚集六分钟，同时持续搅拌。

结果和结论

表12显示了抗GPVI Fab#1至Fab#4(包含经修饰的重链恒定区)对由GPVI依赖性和GPVI非依赖性激动剂诱导的血小板聚集的抑制活性。GPVI激动剂VitroCol和食蟹猴主动脉胶原蛋白的详细结果分别总结在图2A和2B中。

总之，结果证明，本公开的对GPVI特异的Fab抑制由GPVI依赖性胶原蛋白激动剂诱导的血小板聚集。抑制程度取决于所用的Fab和激动剂。Fab#2和Fab#3显示对人胶原底物CRP-XL和VitroCol诱导的人血小板聚集的最有效的剂量依赖性抑制活性，在Fab浓度为10μg/ml时具有完全抑制人血小板聚集的能力。对于所有测试的胶原蛋白底物，这两种Fab相对于RefFab#1都显示了功能优势。对于GPVI非依赖性激动剂TRAP和ADP没有观察到抑制作用，表明对GPVI特异的作用。此外，在不存在激动剂的情况下，所测试的Fab均不诱导血小板聚集，因此排除了Fab内在的激动活性。

表12：使用

设备通过多电极聚集测定法所评估的，抗GPVI Fab对由不同激动剂或不存在激动剂下诱导的血小板聚集的影响。每种Fab-激动剂组合用4-7个供体的血样进行测试。Fab的聚集抑制程度表示为从“强剂量依赖性抑制”(+++)到“无抑制”(0)的四个类别。

+++强剂量依赖性抑制*GPVI非依赖性激动剂

++中等剂量依赖性抑制

+弱剂量依赖性抑制

0无抑制

实施例10：抑制人动脉粥样硬化斑块诱导的人类血小板聚集–

阻抗聚集测定法

材料和方法

为了评估抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区)对反映相关病症背景的人血小板聚集的抑制活性，根据最近修改的方案(Bampalis等，J Thromb Haemost，2012)，使用如先前所述的

设备(Toth等，Thromb Haemost，2006)，通过多电极聚集测定法(MEA)，在静态***中测量动脉粥样硬化斑块诱导的血小板聚集。人动脉粥样硬化斑块物质获自由于高度颈动脉狭窄而经历动脉内膜切除术的患者。

将抗体在

小格中在用0.3ml盐水稀释的0.3ml抗凝血中以2、1、0.5和0.2μg/ml的浓度在37℃下温育3分钟，然后通过掺入汇集的人斑块匀浆(333μg/ml)诱导聚集。连续六分钟记录电阻的增加。通过非GPVI依赖性激动剂ADP(0.5-2μM)和PAR-1激动剂TRAP(2-10μM)的聚集诱导，来评估抗GPVI抗体的特异性。

结果和结论

图3显示本公开的抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区；具有根据表12的重链和轻链序列)对汇集的人斑块匀浆诱导的血小板聚集的抑制活性。结果证实了所有测试的Fab对人斑块诱导的人血小板聚集的强剂量依赖性抑制活性，在Fab浓度为2μg/ml时几乎完全或完全抑制聚集。

实施例11：在流动条件下对人动脉粥样硬化斑块诱导的人血小板聚集的抑制-流动室

材料和方法

用从由于高度颈动脉狭窄而接受动脉内膜切除术的患者获得的汇集的斑块匀浆(在PBS中1:20稀释)包被玻璃盖玻片。使用0.1Luer粘性载玻片

将盖玻片固定在平行平板流动室中，所述载玻片已用补充有4％人血清白蛋白(HSA)的PBS封闭。将流动室安装在装备有温育室(37℃)的TE2000-E荧光显微镜(Nikon)的载物台上。用PBS灌注斑块包被的流动室，并随后用含有4％HSA的PBS封闭。将水蛭素化人全血中的血小板用1μM DiOC6染色，并与2μg/ml抗GPVI Fab(包含经修饰的重链恒定区)、P2Y12拮抗剂替格瑞洛(ticagrelor)或对照温育10分钟。如所示，在血液收集过程中向血液中加入1mM ASA。以600/秒的剪切速率将血液灌注通过流动室。使用10x物镜和CoolSNAP HQ2 CCD照相机，实时连续记录6分钟(1帧/秒)标记的血小板的粘附和聚集。通过使用NIS-Element3.2软件包(Nikon)定量二元荧光区域部分，来分析血小板覆盖度。

结果和结论

图4A-D显示了抗GPVI Fab Fab#1至Fab#4(包含经修饰的重链恒定区；具有表12的重链和轻链序列)对在生理流动条件下由汇集的人斑块匀浆诱导的血小板聚集的抑制活性。

结果强烈表明，Fab#1到Fab#4在浓度为2μg/ml的人斑块物质存在下能够几乎完全抑制血小板活化/聚集。此外，所有的Fab明显优于ASA和替格瑞洛的护理组合标准(图4E)。

实施例12：体内功效-对GPVI特异的单价Fab在动脉血栓形成小鼠模型中的作用-结扎诱导的血栓形成模型

材料和方法

如前所述进行活体荧光显微术(Seizer等，2015)。简言之，将在C57Bl/6J背景下的基因修饰小鼠(“ROSA”–系)用于血栓形成成像。小鼠是具有绿色荧光血小板的“野生型”小鼠。通过注射咪达***(5mg/kg体重)、美托咪定(0.5mg/kg体重)和芬太尼(0.05mg/kg体重)麻醉小鼠。解剖颈总动脉，随后通过标准化的剧烈结扎5分钟来损伤(Seizer等，2015)。在结扎之前，将3.3mg/kg抗GPVI或对照Fabi.v.施用于尾静脉。在损伤之前和损伤后立即，通过体内视频显微术成像血栓形成，即荧光血小板在受损血管壁的粘附和聚集。每血管的记录时间为20分钟。通过使用AxioVision软件(Carl Zeiss)在指定时间点确定血栓覆盖面积相对于总损伤面积的百分比，进行分析。所有动物实验均根据德国实验动物护理和使用的法律进行，并得到地方当局的批准。

结果和结论

图5和图6说明了与阴性对照Fab相比，抗GPVI Fab Fab#3(包含经修饰的重链恒定区；SEQ ID NO：43的重链序列和SEQ ID NO：41的轻链序列)在7个不同时间点和六只受试动物中对血栓形成的抑制活性。在所有用阴性对照Fab处理的动物中都观察到血栓形成，而静脉内推注施用3.3mg/kg抗GPVI Fab#3显著抑制5/6动物中的血栓形成。在用Fab#3治疗的1/6动物中，确实发生了最初的血栓形成，但不随时间而持续。

实施例13：血小板活化-离体CD62P表面表达

材料和方法

通过荧光计评价血小板活化标记CD62P的细胞表面表达，来评价受体活化和随后的下游信号传导。通过将柠檬酸化的全血在RT下500×g无制动离心15分钟，产生富血小板血浆(PRP)。将所得上清液作为PRP转移到新的样品管中，而不干扰下面的富含白细胞的中间相。将PRP中的血小板与在PBS中稀释的10μg/ml携带修饰的或野生型人重链恒定区的抗GPVI Fab一起在96孔V-底板中温育，并于RT下温育30分钟。随后，加入针对CD62P的缀合藻红蛋白的抗体(BD Pharmingen)，随后在RT避光下温育20分钟。细胞用1％甲醛溶液在4℃固定至少30分钟，并使用BD FACS CANTO^TM II(BD Biosciences)分析。基础CD62P表达通过用PBS代替Fab温育来测定。Fab诱导的GPVI活化表示为相对在PBS存在下的基础表达水平进行标准化的Fab存在下活化标记的表达水平。

结果和结论

结果在图7中说明。相对于抗GPVI IgG，包含经修饰的重链恒定区的抗GPVI Fab(Fab#1mod.HC、Fab#2mod.HC、Fab#3mod.HC和Fab#4mod.HC)诱导CD62P表达至弱得多的程度，这归因于单价结合导致缺少GPVI交联。残存的血小板活化可能是由于GPVI结合的Fab被存在于人血清中的预存抗Fab抗体交联所致。与包含未修饰的人Fab重链恒定区的Fab(Fab#1、Fab#2、Fab#3、Fab#4)相比，使用包含经修饰的重链恒定区的抗GPVI Fab(Fab#1mod HC、Fab#2mod HC、Fab#3mod HC、Fab#4mod HC)进一步降低血小板活化标记CD62P的表达，这提示修饰有效地阻止了人血清中存在的抗Fab抗体与这些Fab的结合。当如针对RefFab#1所述将甘氨酸-丝氨酸接头连接于Fab重链C末端时，未观察到这种效应。表14：测试的人未修饰Fab构建体的重链和轻链序列

表15:具有修饰的人重链恒定区的测试Fab结构的重链和轻链序列

实施例14：体内出血时间-小鼠尾剪断模型

材料和方法

在小鼠尾部剪断模型中评价Fab-介导的GPVI-阻断对出血时间的影响。通过用解剖刀刀片切开尾部远端2mm并将尾部浸入温PBS中，在C57BL/6J小鼠中诱导尾部出血。在尾部横切前大约10分钟，用美托咪定(

0.5mg/kg)、咪达***(

5mg/kg)和芬太尼(芬太尼布仑0.05mg/kg)腹膜内麻醉小鼠。在尾部横切前30分钟，将抗GPVIFab(包含经修饰的重链恒定区)(10mg/kg的PBS溶液)或对照i.v.施用于尾静脉。如所指示，在尾部横切之前60分钟i.v.注射ASA。在横切后立即记录出血时间，并持续直到血液停止从尾尖流出且30秒内不重新开始流动。在研究结束时，通过颈椎脱臼处死麻醉的动物。根据德国实验动物护理和使用的法律进行实验，并得到地方当局的批准。

结果和结论

如图8所示，在小鼠尾剪断模型中，仅包含经修饰的重链恒定区(具有表12的重链和轻链序列)的抗GPVI Fab(Fab#1、Fab#2、Fab#3、Fab#4)不引起出血时间延长。此外，与单独的阿司匹林相比，抗GPVI Fab与ASA的组合没有进一步增加出血时间。这些结果表明用抗GPVI Fab治疗不会导致出血风险增加。

实施例15：血小板计数

材料和方法

为了评估其对血小板计数的影响，将10mg/kg包含经修饰的重链恒定区的抗GPVIFab(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)(具有表12的重链和轻链序列)或对照i.v.施用于C57BL/6J小鼠的尾静脉。在化合物注射之前即刻和之后30分钟，从用于药物施用的静脉对侧的尾静脉收集血样。将血样收集在端对端毛细管25μl K2E管中(Sanguis Counting)，并在Tyrode缓冲液(pH 7.3)中1:50稀释。稀释的血液样品用缀合APC的抗CD41抗体(Biolegend)在黑暗中RT染色10分钟，进一步在Tyrode缓冲液(pH7.3)中1:50稀释，并随后在BD FACSCANTO^TM II(BD Biosciences)中分析。记录25μl CD41阳性事件。血小板计数根据以下等式确定：事件*2500/25＝事件*100[血小板/μl]。

结果和结论

如图9所示，在施用10mg/kg包含经修饰的重链恒定区的抗GPVI Fab(Fab#1、Fab#2、Fab#3或Fab#4)48或72小时后，没有观察到血小板减少的迹象。这表明，用本公开的抗GPVI Fab治疗对稳态没有有害作用，并且与如上所述观察到的不存在出血时间延长相一致(实施例13)。

实施例16：血小板上的GPVI表面表达

材料和方法

用抗GPVI抗体处理血小板可能诱导GPVI内化或其从血小板表面脱落，这可能是化合物的激动活性并因此导致不期望的血小板活化的指示。为了排除这种情况，将10mg/kg包含经修饰的重链恒定区的抗GPVI Fab(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)(包含表12的重链和轻链序列)和对照i.v.注射到CD-1小鼠的尾静脉中。在恰好化合物注射之前和之后的某些时间点，从用于药物施用的静脉对侧的尾静脉收集血液样品。血样收集在端对端毛细管30μlK2E管中(Sanguis Counting)。立即将血液从毛细管转移到含有1μl30x凝血和血小板抑制剂混合物(54mg/ml K2-EDTA，10mg/ml乙酰水杨酸(ASA)、167μg/ml替格瑞洛和3μg/mlPGI2)的试管中。将血液1:20稀释在含有缀合APC的抗CD41抗体(Biolegend)和缀合PE的非竞争性抗GPVI Fab(内部)的Tyrode缓冲液(pH 7.3)中，并在RT下在黑暗中温育10分钟。随后，将样品进一步1:25稀释在PBS中，并在BD FACS CANTO ^TM II(BD Biosciences)中分析。通过使用Quantibrite^TM PE荧光定量试剂盒(BD Biosciences)，将CD41阳性群体的PE信号转化为每血小板GPVI分子的绝对数。

结果和结论

如图10所示，施用10mg/kg包含经修饰的重链恒定区的GPVI Fab(Fab#1、Fab#2、Fab#3、Fab#4)在施用Fab#1、Fab#2和Fab#3后48或72小时内未导致血小板表面GPVI的降低。24小时和48小时后，来自Fab#4处理的小鼠的血小板显示出其细胞表面上GPVI拷贝数略减～20％。这表明所测试的Fab没有或仅轻微诱导GPVI的脱落或内化。与在CD62P血小板活化FACS中观察到的结果(实施例13)一致，这进一步证实了所测试的Fab没有内在的激动性血小板活化能力。

实施例17：基于ELISA的交叉竞争测定

对GPVI特异的抗体或抗体片段或另一种GPVI结合剂的交叉竞争可根据下列标准方法通过使用ELISA测定来检测。

ELISA测定的一般原理包括将对GPVIP特异的抗体或抗体片段(如Fab#1、Fab#2、Fab#3、Fab#4)包被在ELISA板的孔上。然后将过量的第二种潜在的交叉竞争的对GPVI特异的抗体加入溶液中(即未与ELISA板结合)。随后将有限量的GPVI-Fc加入到孔中。

包被在孔上的抗体和溶液中的抗体将竞争结合有限数量的GPVI分子。然后洗涤板以除去未与包被的抗体结合的GPVI分子，并且还除去第二液相抗体以及在第二液相抗体和GPVI之间形成的任何复合物。然后使用合适的GPVI检测试剂测量结合的GPVI的量。因此，GPVI可与标记如Fc、Flag等融合，所述标记可通过合适的标记特异性试剂检测。

溶液中与包被的抗体交叉竞争的抗体将能够导致包被的抗体可以结合的GPVI分子数相对于在不存在第二液相抗体的情况下包被的抗体可以结合的GPVI分子数的减少。

下文进一步更详细地针对称为Ab-X和Ab-Y的两种抗体描述该测定方法。在选择Ab-X作为固定化抗体的情况下，将其包被到ELISA板的孔上，之后用合适的封闭溶液封闭板以使随后加入的试剂的非特异性结合最小化。然后将过量的Ab-Y加入ELISA板中，使得每孔Ab-Y GPVI结合位点的摩尔数比包被ELISA板期间每孔所用的Ab-X GPVI结合位点的摩尔数高至少10倍。加入GPVI以使每孔中加入的GPVI的摩尔数比用于包被每孔的Ab-X GPVI结合位点的摩尔数低至少25倍。在合适的温育期后，洗涤ELISA板，并加入对GPVI抗原特异的检测试剂，以测量被对GPVI特异的包被抗体(在此情况下为Ab-X)特异性结合的GPVI分子的量。测定的背景信号定义为在具有包被抗体(在这种情况下为Ab-X)、第二液相抗体(在这种情况下为Ab-Y)、仅缓冲液(即无GPVI)和检测试剂的孔中获得的信号。测定的阳性对照信号定义为在具有包被抗体(在这种情况下为Ab-X)、仅第二液相抗体缓冲液(即没有第二液相抗体)、GPVI检测试剂的孔中获得的信号。ELISA测定进行的方式需要使阳性对照信号至少是背景信号的6倍。

为了避免由于选择哪种抗体用作包被抗体和哪种抗体用作第二(竞争)抗体而导致的任何假象(例如，Ab-X和Ab-Y对IL-17C的显著不同的亲和力)，需要以两种形式进行交叉阻断测定：1)形式1是其中的Ab-X是包被在ELISA板上的抗体，Ab-Y是溶液中的竞争抗体，2)形式2是其中的Ab-Y是包被在ELISA板上的抗体，Ab-X是溶液中的竞争抗体。

序列表

<110> 莫佛塞斯公司（MORPHOSYS AG）

<120> 靶向糖蛋白VI的抗体

<130> MS281

<140> PCT-17723

<141> 2018-05-16

<160> 113

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 339

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly

1 5 10 15

Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala

20 25 30

Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys

35 40 45

Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser

50 55 60

Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg

65 70 75 80

Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp

85 90 95

Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala

100 105 110

Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala

130 135 140

Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp

145 150 155 160

Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly

165 170 175

Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr

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225 230 235 240

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245 250 255

Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg

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Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala

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Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala

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Ser Asn Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly

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Leu Cys Ser

<210> 2

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<212> PRT

<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）

<400> 2

Met Ser Pro Ser Pro Thr Thr Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly

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His Val Pro Ala Gln Arg Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala

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Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys

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Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala

130 135 140

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Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly

165 170 175

Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Trp Ser

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Thr Ser Arg Ser Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Pro Gly Ser Pro Ala

225 230 235 240

Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys

245 250 255

Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Leu Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp

260 265 270

Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Val Arg Ala Val Gln

275 280 285

Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Thr Arg Lys Ser His Gly Asp Gln

290 295 300

Asp Gly Gly Arg Pro Asp Val His Ser Arg Gly Leu Cys Ser

305 310 315

<210> 3

<211> 313

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 3

Met Ser Pro Ala Ser Pro Thr Phe Phe Cys Ile Gly Leu Cys Val Leu

1 5 10 15

Gln Val Ile Gln Thr Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln

20 25 30

Ala Gln Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Gly Gln Ser Val Ile Leu Arg

35 40 45

Cys Gln Gly Pro Pro Asp Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Lys

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Arg Ser Asn Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser His

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115 120 125

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Val Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Thr Gly Ser Tyr Lys Arg Pro Glu Lys

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Trp Tyr Arg Ala Asn Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser

165 170 175

Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Leu Trp

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Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Val Thr Gly Leu Ser Ala

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Thr Pro Ser Gln Val Pro Thr Glu Glu Ser Phe Pro Val Thr Glu Ser

210 215 220

Ser Arg Arg Pro Ser Ile Leu Pro Thr Asn Lys Ile Ser Thr Thr Glu

225 230 235 240

Lys Pro Met Asn Ile Thr Ala Ser Pro Glu Gly Leu Ser Pro Pro Phe

245 250 255

Gly Phe Ala His Gln His Tyr Ala Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys

260 265 270

Leu Gly Ala Thr Ile Ile Ile Ile Leu Leu Gly Leu Leu Ala Glu Asp

275 280 285

Trp His Ser Arg Lys Lys Cys Leu Gln His Arg Met Arg Ala Leu Gln

290 295 300

Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Ala

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser

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Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro

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Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln

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Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp

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Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu

180 185 190

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210 215 220

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Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn

245

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<211> 249

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

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Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser

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Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro

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Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln

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Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly

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Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser

130 135 140

Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys

145 150 155 160

Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp

165 170 175

Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu

180 185 190

Pro Thr Glu Pro Pro Ser Pro Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala

195 200 205

Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Glu Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser

210 215 220

Arg Ser Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser Pro Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn

245

<210> 6

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser

1 5 10 15

Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro

20 25 30

Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln

35 40 45

Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly

50 55 60

Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser

65 70 75 80

Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu

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Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu

100 105 110

Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu

115 120 125

Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser

130 135 140

Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys

145 150 155 160

Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp

165 170 175

Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala Glu Leu

180 185 190

Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser Arg Ser

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Ile Thr Thr Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser Pro Ala Gly Pro Ala Arg

210 215 220

Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn

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<210> 7

<211> 229

<212> PRT

<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）

<400> 7

Gln Arg Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser

1 5 10 15

Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro

20 25 30

Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln

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Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg His Leu Ala Gly

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Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Pro Pro Ser

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Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu

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Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu

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Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu

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Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser

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Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys

145 150 155 160

Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp

165 170 175

Pro Leu Glu Leu Met Val Thr Glu Phe Ser Glu Ala Thr Thr Glu Leu

180 185 190

Thr Val Ser Leu Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser Arg Ser

195 200 205

Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Pro Gly Ser Pro Ala Gly Pro Ala Arg

210 215 220

Gln Tyr Tyr Thr Lys

225

<210> 8

<211> 246

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 8

Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Gln Pro Ser Ser

1 5 10 15

Leu Val Pro Leu Gly Gln Ser Val Ile Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro

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Asp Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Lys Pro Glu Lys Tyr Glu

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Asp Gln Asp Phe Leu Phe Ile Pro Thr Met Glu Arg Ser Asn Ala Gly

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Asp Gln Leu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Val Tyr Ala Lys Pro Ser Leu

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Ser Ala His Pro Ser Ser Ala Val Pro Gln Gly Arg Asp Val Thr Leu

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Lys Cys Gln Ser Pro Tyr Ser Phe Asp Glu Phe Val Leu Tyr Lys Glu

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Gly Asp Thr Gly Ser Tyr Lys Arg Pro Glu Lys Trp Tyr Arg Ala Asn

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Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys

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Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp

165 170 175

Pro Leu Val Leu Val Val Thr Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ser Gln Val

180 185 190

Pro Thr Glu Glu Ser Phe Pro Val Thr Glu Ser Ser Arg Arg Pro Ser

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Ile Leu Pro Thr Asn Lys Ile Ser Thr Thr Glu Lys Pro Met Asn Ile

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Thr Ala Ser Pro Glu Gly Leu Ser Pro Pro Phe Gly Phe Ala His Gln

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His Tyr Ala Lys Gly Asn

245

<210> 9

<211> 248

<212> PRT

<213> 大家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 9

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Leu Val Pro Leu Gly His Pro Val Thr Leu Arg Cys Leu Gly Pro Ser

20 25 30

Asp Ala Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Val Lys Pro Gly Lys Leu Ile

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Phe Ile Asp Gln Asp Phe Leu Phe Ile Pro Ile Met Glu Ile Asn Asn

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Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Val Tyr Ser Lys Pro

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Ser Leu Ser Ala His Pro Ser Ser Ala Ile Pro Pro Gly Arg Asp Val

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Lys Glu Gly Asp Thr Arg Pro Tyr Lys Arg Pro Glu Lys Trp Tyr Arg

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Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro

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180 185 190

Gln Val Pro Thr Glu Val Pro Ser Pro Met Thr Glu Ala Ser Arg Arg

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Pro Ser Met Leu Leu Thr Asn Lys Ile Ser Thr Thr Glu Lys Pro Met

210 215 220

Asn Ile Thr Val Ser Pro Glu Gly Pro Ser Pro Pro Phe Gly Phe Ala

225 230 235 240

His Gln His Tyr Ala Lys Gly Asn

245

<210> 10

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Asp Ile Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的”

peptide"

<400> 11

Ser His Tyr Met His

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 12

Leu Ile Glu Pro Ser Glu Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Arg Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 13

Asp Ser Ser Arg Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 14

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 15

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 16

Ala Ala Trp Asp Phe Arg Ser Ser Arg Trp Val

1 5 10

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Leu Ile Glu Pro Ser Glu Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Asp Ser Ser Arg Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 18

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Arg Ser

85 90 95

Ser Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

<210> 19

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 19

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Arg Ser

85 90 95

Ser Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 20

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Glu Pro Ser Glu Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Ser Arg Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 21

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Glu Pro Ser Glu Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Ser Arg Ser Tyr Pro Leu Gly Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

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Gly

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<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

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Gln

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<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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<220>

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Gly

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<220>

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Ala Ala Trp Ser Thr Arg Phe Arg Trp Val

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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<220>

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<220>

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210 215 220

<210> 54

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ala Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Glu Pro Thr Gly Ala Ser Thr Leu Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Ile Ala Leu Pro Leu Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Glu Val Glu Arg Arg Gln Gly Gly

210 215 220

Ile Gly His Lys Cys

225

<210> 55

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 55

tcccattaca tgcat 15

<210> 56

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 56

ctgatcgagc cctccgaggg agagactgag tatgctcaac ggttccaagg c 51

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 57

gacagcagcc gtagctaccc tctgggtttc gatatt 36

<210> 58

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 58

agcggcagca gcagcaacat cggcaacaac tacgttagc 39

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 59

gataacaaca aacgcccgag c 21

<210> 60

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 60

gctgcttggg acttccgttc ttctcgttgg gtg 33

<210> 61

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 61

caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc tcccattaca tgcattgggt tcgccaggcc 120

ccaggccagg gtctggaatg gatggggctg atcgagccct ccgagggaga gactgagtat 180

gctcaacggt tccaaggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgagacagc 300

agccgtagct accctctggg tttcgatatt tggggccagg gcaccctggt tactgtctcg 360

agc 363

<210> 62

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 62

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60

agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120

ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180

gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240

accgaagacg aagccgatta ttactgcgct gcttgggact tccgttcttc tcgttgggtg 300

tttggcggcg gtaccaagct gaccgtgctg ggccag 336

<210> 63

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 63

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60

agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120

ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180

gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240

accgaagacg aagccgatta ttactgcgct gcttgggact tccgttcttc tcgttgggtg 300

tttggcggcg gtaccaagct gaccgtgctg ggccagccca aagccgcccc tagcgtgacc 360

ctgttccccc caagcagcga ggaactccag gccaacaagg ccaccctcgt gtgcctgatc 420

agcgacttct accctggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgatagcag ccctgtgaag 480

gccggcgtgg aaaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaaatacgc cgccagcagc 540

tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag tcccacagat cctacagctg ccaggtcaca 600

cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gcccccaccg agtgcagc 648

<210> 64

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 64

caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc tcccattaca tgcattgggt tcgccaggcc 120

ccaggccagg gtctggaatg gatggggctg atcgagccct ccgagggaga gactgagtat 180

gctcaacggt tccaaggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgagacagc 300

agccgtagct accctctggg tttcgatatt tggggccagg gcaccctggt tactgtctcg 360

agcgccagca caaagggacc cagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gtctacatct 420

ggcggaacag ccgccctggg ctgcctcgtg aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 480

tcctggaact ctggcgctct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctccagagc 540

agcggcctgt actctctgag cagcgtcgtg acagtgccca gcagctctct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacaa aggtggacaa gcgggtggaa 660

cccaagtcct gc 672

<210> 65

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 65

caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc tcccattaca tgcattgggt tcgccaggcc 120

ccaggccagg gtctggaatg gatggggctg atcgagccct ccgagggaga gactgagtat 180

gctcaacggt tccaaggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgagacagc 300

agccgtagct accctctggg tttcgatatt tggggccagg gcaccctggt tactgtctcg 360

agcgccagca caaagggacc cagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gtctacatct 420

ggcggaacag ccgccctggg ctgcctcgtg aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 480

tcctggaact ctggcgctct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctccagagc 540

agcggcctgt actctctgag cagcgtcgtg acagtgccca gcagctctct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacaa aggtggacaa ggaagtcgag 660

cgcagacagg gcggcatcgg ccataaatgc 690

<210> 66

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 66

gaccattaca tgagc 15

<210> 67

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 67

agcgttggga gcgagggcaa attcatcgac tatgctgcaa gcgtgaaagg g 51

<210> 68

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 68

cactaccgtg agttccgttg gcactactat tactttgact at 42

<210> 69

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 69

accggcagca gcagcaacat tggcgcaggc tatgatgtgc at 42

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 70

ggcaacagca atcgcccaag c 21

<210> 71

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 71

cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg gtg 33

<210> 72

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 72

caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcgggtt tagcttttcc gaccattaca tgagctggat tcgccaggcc 120

ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc gttgggagcg agggcaaatt catcgactat 180

gctgcaagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300

cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360

gtctcgagc 369

<210> 73

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 73

cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60

agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120

ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180

ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240

caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300

gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccag 339

<210> 74

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 74

cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60

agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120

ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180

ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240

caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300

gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccagc ccaaagccgc ccctagcgtg 360

accctgttcc ccccaagcag cgaggaactc caggccaaca aggccaccct cgtgtgcctg 420

atcagcgact tctaccctgg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgatag cagccctgtg 480

aaggccggcg tggaaaccac cacccccagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 540

agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccaca gatcctacag ctgccaggtc 600

acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag c 651

<210> 75

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 75

caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcgggtt tagcttttcc gaccattaca tgagctggat tcgccaggcc 120

ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc gttgggagcg agggcaaatt catcgactat 180

gctgcaagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300

cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360

gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420

acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480

accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540

cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600

acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaagcgg 660

gtggaaccca agtcctgc 678

<210> 76

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 76

caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcgggtt tagcttttcc gaccattaca tgagctggat tcgccaggcc 120

ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc gttgggagcg agggcaaatt catcgactat 180

gctgcaagcg tgaaagggcg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300

cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360

gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420

acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480

accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540

cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600

acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaaggaa 660

gtcgagcgca gacagggcgg catcggccat aaatgc 696

<210> 77

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 77

gactattacg tgagc 15

<210> 78

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 78

gccattgggg ggtccggttc cgccgtgcaa tacgctgaat ccgtgaaggg c 51

<210> 79

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 79

cactaccgtg agttccgttg gcactactat tactttgact at 42

<210> 80

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 80

accggcagca gcagcaacat tggcgcaggc tatgatgtgc at 42

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 81

ggcaacagca atcgcccaag c 21

<210> 82

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 82

cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg gtg 33

<210> 83

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 83

caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcgggtt tagcttcggc gactattacg tgagctggat tcgccaggcc 120

ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgcc attggggggt ccggttccgc cgtgcaatac 180

gctgaatccg tgaagggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300

cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360

gtctcgagc 369

<210> 84

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 84

cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60

agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120

ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180

ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240

caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300

gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccag 339

<210> 85

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 85

cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60

agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120

ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180

ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240

caagccgaag acgaagccga ttattactgc cagtctcatg acctgggtgc tcatgtttgg 300

gtgtttggcg gcggtaccaa gctgaccgtg ctgggccagc ccaaagccgc ccctagcgtg 360

accctgttcc ccccaagcag cgaggaactc caggccaaca aggccaccct cgtgtgcctg 420

atcagcgact tctaccctgg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgatag cagccctgtg 480

aaggccggcg tggaaaccac cacccccagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 540

agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccaca gatcctacag ctgccaggtc 600

acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag c 651

<210> 86

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 86

caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcgggtt tagcttcggc gactattacg tgagctggat tcgccaggcc 120

ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgcc attggggggt ccggttccgc cgtgcaatac 180

gctgaatccg tgaagggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300

cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360

gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420

acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480

accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540

cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600

acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaagcgg 660

gtggaaccca agtcctgc 678

<210> 87

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 87

caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcgggtt tagcttcggc gactattacg tgagctggat tcgccaggcc 120

ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgcc attggggggt ccggttccgc cgtgcaatac 180

gctgaatccg tgaagggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgtcactac 300

cgtgagttcc gttggcacta ctattacttt gactattggg gtcagggcac cctggttact 360

gtctcgagcg ccagcacaaa gggacccagc gtgttccctc tggcccccag cagcaagtct 420

acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctcgtgaagg actactttcc cgagcccgtg 480

accgtgtcct ggaactctgg cgctctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctc 540

cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 600

acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acacaaaggt ggacaaggaa 660

gtcgagcgca gacagggcgg catcggccat aaatgc 696

<210> 88

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 88

tccagctaca tgcat 15

<210> 89

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 89

attatcgagc ccactggggc atccacactg tacgcacagc ggttccaagg g 51

<210> 90

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 90

actggaatcg cactgcctct gggttttgac ctg 33

<210> 91

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 91

agcggcagca gcagcaacat cggcaacaac tacgttagc 39

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 92

gataacaaca aacgcccgag c 21

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的寡核苷酸”

<400> 93

gccgcttgga gtactcgttt ccgttgggtg 30

<210> 94

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 94

caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag ccagcggcgg cgcatttacc tccagctaca tgcattgggt tcgccaggcc 120

ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt atcgagccca ctggggcatc cacactgtac 180

gcacagcggt tccaagggcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgaactgga 300

atcgcactgc ctctgggttt tgacctgtgg ggccagggca ccctggttac tgtctcgagc 360

<210> 95

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 95

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60

agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120

ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180

gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240

accgaagacg aagccgatta ttactgtgcc gcttggagta ctcgtttccg ttgggtgttt 300

ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cag 333

<210> 96

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 96

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60

agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120

ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180

gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240

accgaagacg aagccgatta ttactgtgcc gcttggagta ctcgtttccg ttgggtgttt 300

ggcggcggta ccaagctgac cgtgctgggc cagcccaaag ccgcccctag cgtgaccctg 360

ttccccccaa gcagcgagga actccaggcc aacaaggcca ccctcgtgtg cctgatcagc 420

gacttctacc ctggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg atagcagccc tgtgaaggcc 480

ggcgtggaaa ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca aatacgccgc cagcagctac 540

ctgagcctga cccccgagca gtggaagtcc cacagatcct acagctgcca ggtcacacac 600

gagggcagca ccgtggaaaa gaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645

<210> 97

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 97

caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag ccagcggcgg cgcatttacc tccagctaca tgcattgggt tcgccaggcc 120

ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt atcgagccca ctggggcatc cacactgtac 180

gcacagcggt tccaagggcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgaactgga 300

atcgcactgc ctctgggttt tgacctgtgg ggccagggca ccctggttac tgtctcgagc 360

gccagcacaa agggacccag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagtc tacatctggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540

ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacacaaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660

aagtcctgc 669

<210> 98

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多核苷酸”

<400> 98

caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag ccagcggcgg cgcatttacc tccagctaca tgcattgggt tcgccaggcc 120

ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt atcgagccca ctggggcatc cacactgtac 180

gcacagcggt tccaagggcg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgaactgga 300

atcgcactgc ctctgggttt tgacctgtgg ggccagggca ccctggttac tgtctcgagc 360

gccagcacaa agggacccag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagtc tacatctggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540

ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacacaaagg tggacaagga agtcgagcgc 660

agacagggcg gcatcggcca taaatgc 687

<210> 99

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 99

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr

20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 100

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 100

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Ser Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Leu Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 101

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 101

Glu Pro Lys Ser Cys

1 5

<210> 102

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(5)

<223> 除半胱氨酸外的任何天然氨基酸残基

<400> 102

Glu Arg Arg Xaa Xaa Gly Ile Gly His Lys Cys

1 5 10

<210> 103

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 103

Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

1 5 10

<210> 104

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 104

Glu Glu Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

1 5 10

<210> 105

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 105

Glu Arg Arg Gln Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

1 5 10

<210> 106

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的肽”

<400> 106

Val Pro Arg Glu Cys

1 5

<210> 107

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 107

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ile Val Pro Arg Glu Cys

100

<210> 108

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 108

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

100 105

<210> 109

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 109

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Glu Lys

85 90 95

Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

100 105

<210> 110

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Gly Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

100 105

<210> 111

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 111

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Glu Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

100 105

<210> 112

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 112

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Glu Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

100 105

<210> 113

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注解=“人工序列描述：合成的多肽”

<400> 113

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Glu Val Glu Arg Arg Gln Gly Gly Ile Gly His Lys Cys

100 105

Claims

1.一种对GPVI特异的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：11的HCDR1区、SEQ ID NO：12的HCDR2区、SEQ ID NO：13的HCDR3区、SEQID NO：14的LCDR1区、SEQ ID NO：15的LCDR2区和SEQ ID NO：16的LCDR3区域，或

b)SEQ ID NO：22的HCDR1区、SEQ ID NO：23的HCDR2区、SEQ ID NO：24的HCDR3区、SEQID NO：25的LCDR1区、SEQ ID NO：26的LCDR2区和SEQ ID NO：27的LCDR3区，或

c)SEQ ID NO：33的HCDR1区、SEQ ID NO：34的HCDR2区、SEQ ID NO：35的HCDR3区、SEQID NO：36的LCDR1区、SEQ ID NO：37的LCDR2区和SEQ ID NO：38的LCDR3区，或

d)SEQ ID NO：44的HCDR1区、SEQ ID NO：45的HCDR2区、SEQ ID NO：46的HCDR3区、SEQID NO：47的LCDR1区、SEQ ID NO：48的LCDR2区和SEQ ID NO：49的LCDR3区。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：18的VL，或

b)SEQ ID NO：28的VH和SEQ ID NO：29的VL，或

c)SEQ ID NO：39的VH和SEQ ID NO：40的VL，或

d)SEQ ID NO：50的VH和SEQ ID NO：51的VL。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含：

a)SEQ ID NO：20的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

b)SEQ ID NO：21的HC和SEQ ID NO：19的LC，或

c)SEQ ID NO：31的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

d)SEQ ID NO：32的HC和SEQ ID NO：30的LC，或

e)SEQ ID NO：42的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

f)SEQ ID NO：43的HC和SEQ ID NO：41的LC，或

g)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC，或

h)SEQ ID NO：53的HC和SEQ ID NO：52的LC。

4.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人的、人源化的、嵌合的或合成的抗体或抗体片段。

5.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是分离的抗体或抗体片段。

6.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是重组的抗体或抗体片段。

7.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。

8.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是单价抗体或抗体片段。

9.根据权利要求8所述的抗体片段，其中所述单价抗体片段是Fab。

10.根据权利要求9所述的抗体或抗体片段，其中所述Fab包含经修饰的重链恒定区，其中所述经修饰的重链恒定区防止或抑制受试者血清中存在的抗Fab抗体识别所述Fab。

11.根据权利要求10所述的抗体或抗体片段，其中所述经修饰的重链恒定区由以下氨基酸序列组成：

12.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对人GPVI、食蟹猴GPVI、小鼠GPVI和大鼠GPVI特异。

13.根据前述权利要求任一项所述的抗体或抗体片段，其用于医药中。

14.根据权利要求1至11所述的抗体或抗体片段，其用于治疗有此需要的受试者。

15.一种核酸组合物，其包含编码根据权利要求1至11所述的抗体或抗体片段的一条核酸序列或多条核酸序列。

16.一种载体组合物，其包含一种或多种包含根据权利要求15所述的一条核酸序列或多条核酸序列的载体。

17.一种宿主细胞，其包含权利要求16的载体组合物。

18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11的分离的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体或赋形剂。