JP2021521786A

JP2021521786A - 核酸を結合、修飾、および切断する物質の基質選択性および部位のためのｉｎｖｉｔｒｏでの高感度アッセイ

Info

Publication number: JP2021521786A
Application number: JP2020557220A
Authority: JP
Inventors: ジョン，ジェイ．キース; パッタナヤク，ヴィクラム; ペトリ，カール; マイケルゲールケ，ジェイソン; エスターササキ，カナエ
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-08-30
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: EP3781585A1; WO2019204378A1; CN112313241A; CA3097044A1; US20200010889A1; JP7460539B2; US20240200130A1; US11976324B2; US20210071248A1; US20210155984A1; US11845987B2; EP3781585A4; US11898203B2; AU2019256287A1

Abstract

高感度アッセイをｉｎｖｉｔｒｏで実施して、核酸を結合、修飾、および切断する物質の基質選択性およびオフターゲット部位を特定するための方法および組成。

Description

連邦支援による研究および開発
本発明は、国防高等研究計画局（Defense Advanced Research Projects Agency、ＤＡＲＰＡ）により与えられた認可番号ＨＲ００１１−１７−２−００４２の下、政府の援助により行われた。政府は、本発明における特定の権利を有する。

高感度アッセイをｉｎｖｉｔｒｏで実施して、核酸を結合、修飾、および切断する物質の基質選択性およびオフターゲット部位を特定するための方法および組成を本明細書において提供する。

オフターゲット活性は、カスタマイズ可能なＤＮＡ結合活性を有するタンパク質（ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系タンパク質を含むが、これらに限定されない）の臨床、産業、および研究環境における、安全または有効な使用についての主要な課題である。

酵素による切断、修飾、または結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するための方法を本明細書において提供する。方法は、（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の少なくとも２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つの５’および３’末端に存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）部位特異的ヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾タンパク質、およびＤＮＡ結合ドメインから選択される酵素の存在下、切断、修飾、または結合が生じるのに十分な条件下で、上記複数をインキュベートするステップと、（ｉｉｉ）切断、修飾、または結合を受けるオリゴヌクレオチドを選択し、任意選択で、濃縮するステップと、（ｉｖ）切断、修飾、または結合を受ける、選択されたオリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、酵素による切断、修飾、または結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップとを含む。

また、酵素による切断、修飾、または結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するための方法を本明細書において提供する。方法は、（ｉ）既知の配列の最初の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）部位特異的ヌクレアーゼ、修飾タンパク質、およびＤＮＡ結合ドメインから選択される酵素の存在下、切断、修飾、または結合が生じるのに十分な条件下で、上記複数をインキュベートするステップと、（ｉｉｉ）切断、修飾、または結合を受けないオリゴヌクレオチドを選択するステップと、（ｉｖ）切断、修飾、または結合を受けない、選択されたオリゴヌクレオチドの配列を決定するステップと、（ｖ）切断、修飾、または結合を受けない、選択されたオリゴヌクレオチドの配列を、既知の配列の事前濃縮した最初の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列と比較するステップとを含み、選択されなかった最初の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドが、酵素による切断、修飾、または結合を受けるものと同定される。

さらに、塩基編集酵素（例えば、デオキシシチジンをデオキシウリジンに変換するシチジンデアミナーゼ、またはデオキシアデニンをデオキシイノシンに変換するアデニン塩基編集酵素）による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するための方法を本明細書において提供する。方法は、（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）塩基編集酵素の存在下、修飾が生じるのに十分な条件下で、複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートするステップと、（ｉｉｉ）編集された塩基対を正準塩基対の等量混合物に変換するポリメラーゼ（例えば、ｄＵ：ｄＧ塩基対をｄＴ：ｄＡおよびｄＣ：ｄＧ塩基対の等量混合物に、またはｄＩ：ｄＴ塩基対をｄＡ：ｄＴおよびｄＧ：ｄＣ塩基対の等量混合物に変換するウラシル許容性ポリメラーゼ）を用いて、ＤＮＡ合成において、オリゴヌクレオチドを増幅し（すなわち、この場合、ｄＡＴＰヌクレオチドが、ｄＵの向かい側に組み込まれるか、またはｄＣＴＰヌクレオチドが、ｄＩの向かい側に組み込まれる）、これにより、塩基編集酵素による修飾を受けたオリゴヌクレオチドが、処理前ライブラリー由来のオリジナルのバーコード結合配列の混合物として、および置換（例えば、ｄＣ−＞ｄＴまたはｄＡ−＞ｄＧ）を含む修飾配列としても増幅される、ステップと、（ｉｖ）増幅したオリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップとを含む。

加えて、シチジンをウリジンに変換し、ニックを逆鎖に生成するシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するための方法を本明細書において提供する。方法は、（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）塩基編集酵素の存在下、修飾が生じるのに十分な条件下で、複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートし、次いで、ウリジンヌクレオチドを有する部位において１本鎖切断端（ニック）を生成する酵素の存在下で、複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートし、これにより、５’リン酸を有する２つのニックを両鎖に含むｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成し、これによりオーバーハングを生成するステップと、（ｉｉｉ）オーバーハングから５’リン酸化平滑末端を生成するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼもしくはＰｈｕｓｉｏｎＵＤＮＡポリメラーゼ）とともにｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートするステップと、（ｉｖ）プライマー配列を含む２本鎖ＤＮＡアダプターを有するリン酸化平滑末端を捕捉するステップと、（ｖ）アダプターに対して特異的な１つのプライマーおよび共通配列骨格に対して特異的な１つのプライマーを使用して配列を増幅するステップと、（ｖｉ）任意選択で、増幅の前または後に小型の切断断片についてサイズ選択を実施することにより追加の選択を実施するステップと、（ｉｖ）増幅したオリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップとを含む。

さらに、デオキシアデニンをデオキシイノシンに変換し、ニックを逆鎖に生成するアデニン塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するための方法を本発明において提供する。方法は、（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）塩基編集酵素の存在下、修飾が生じるのに十分な条件下で、複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートし、次いで、エンドヌクレアーゼＶ酵素の存在下で複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートして、イノシンヌクレオチドを有する部位において１本鎖切断端（ニック）を生成し、これにより、５’リン酸を有する２つのニックを両鎖に含むｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成し、これによりオーバーハングを生成するステップと、（ｉｉｉ）オーバーハングから５’リン酸化平滑末端を生成するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼもしくはＰｈｕｓｉｏｎＵＤＮＡポリメラーゼ）とともにｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートするステップと、（ｉｖ）プライマー配列を含む２本鎖ＤＮＡアダプターを用いてリン酸化平滑末端をライゲートするステップと、（ｖ）アダプターに対して特異的な１つのプライマーおよび共通配列骨格に対して特異的な１つのプライマーを使用して配列を増幅するステップと、（ｖｉ）任意選択で、増幅の前または後に小型の切断断片についてサイズ選択を実施することにより追加の選択を実施するステップと、（ｉｖ）増幅したオリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップとを含む。

デオキシアデニンをデオキシイノシンに変換し、ニックを逆鎖に生成するアデニン塩基編集酵素、またはシチジンをウリジンに変換し、ニックを逆鎖に生成するシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakarensis）由来のエンドヌクレアーゼＭＳ（ＴｋｏＥｎｄｏＭＳ）の存在下で、複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートして、基質ＤＮＡの脱アミノ部位において２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導して、脱アミノ部位を中心とする１本鎖で５塩基対のオーバーハング末端を有するＤＮＡ断片を生成するステップと、（ｉｉｉ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを用いてＤＮＡ断片を処理して、ＤＮＡ断片の末端からデオキシウラシル塩基を除去するステップと、（ｉｖ）ＤＮＡ断片の末端を末端修復および／またはＡテーリングするステップと、（ｖ）アダプターオリゴヌクレオチド（好ましくは、ハイスループットシーケンシングにおける使用のための配列を含む）を末端にライゲートするステップと、（ｖｉ）ＤＮＡ断片をシーケンシングするステップとを含む方法。

加えて、選択されたｇＲＮＡまたは別のＤＮＡ結合ドメインの存在下で、触媒的に不活性のＣａｓ９による結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するための方法を本明細書において提供する。方法は、（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに上記複数におけるオリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、（ｉｉ）結合が生じるのに十分な条件下で、磁気ビーズに結合させた（例えば、共有結合または親和性ハンドルにより結合している）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ｓｇＲＮＡまたは別のＤＮＡ結合ドメインと複合したＣａｓ９酵素の存在下で、上記複数をインキュベートするステップと、（ｉｉｉ）ビーズプルダウンの１つまたは複数のセットにより、結合を受けるオリゴヌクレオチドを選択して任意選択で濃縮し、非結合分子の上清中への解離を促進する適切なバッファーにより洗浄した後、任意の結合したＤＮＡの解離を促進する適切なバッファー、またはビーズに結合したタンパク質を分解して結合したＤＮＡを遊離するプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫを含むバッファーのいずれかに、結合したＤＮＡを溶出するステップと、（ｉｖ）選択されたオリゴヌクレオチドの切断された配列を決定し、これにより、ＤＮＡ結合ドメインによる結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップとを含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載する方法において使用する直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、（ｉ）同定されたオンターゲット部位と比較して一定数までのミスマッチを有する参照ゲノムにおける、すべての潜在的オフターゲット配列のセット（ゲノムＤＮＡライブラリーに類似する）、（ｉｉ）一定数までのミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位の包括的セット（ランダム塩基置換ライブラリーに類似する）、（ｉｉｉ）規定された集団由来の変異ゲノムのセットに存在する潜在的オフターゲット配列のライブラリー（すなわち、個体集団に存在するＤＮＡ配列変異体を反映するようにデザインされたゲノムＤＮＡライブラリー）、または（ｉｖ）潜在的オフターゲット部位（例えば、癌遺伝子ホットスポットまたは腫瘍抑制遺伝子由来の配列）の別の適切な規定されたセットを含む。

一部の実施形態では、事前濃縮した直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーは、例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上で個々の１本鎖ＤＮＡ配列として最初に合成され、１本鎖ＤＮＡ配列は、任意選択で、チップから遊離する前または後に、共通配列に対するプライミングにより２本鎖ＤＮＡ分子に変換される。

一部の実施形態では、事前濃縮した直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーは、１）オンターゲット部位と比較して一定数までのミスマッチを有する参照ゲノムにおける、すべての潜在的オフターゲット配列のセット（ゲノムＤＮＡライブラリーに類似する）、２）一定数までのミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位の包括的セット（ランダム塩基置換ライブラリーに類似する）、３）規定された集団由来の変異ゲノムのセットに存在する潜在的オフターゲット配列のライブラリー（すなわち、個体集団に存在するＤＮＡ配列変異体を反映するようにデザインされたゲノムＤＮＡライブラリー）、または４）潜在的オフターゲット部位（例えば、癌遺伝子ホットスポットまたは腫瘍抑制遺伝子由来の配列）の他の適切な規定されたセットを表す。

一部の実施形態では、事前濃縮した直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーは、少なくとも１，０００、２５００、５０００または１０，０００および最大１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０または１０^１１塩基の種々の配列、例えば、１０〜１００ｋ塩基の種々の配列を含む。

一部の実施形態では、事前濃縮した直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーは、５０〜５００、例えば、１００〜４００、例えば、１５０〜３００ｂｐの長さ、例えば、２００〜２８０ｂｐの長さの配列を含む。

他に定義しない限り、本明細書において使用する、すべての技術および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書において記載し、当技術分野において既知の他の適する方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、制限することを意図しない。本明細書において言及する、すべての公表文献、特許出願、特許、配列、データベースの登録事項、および他の参照は、これらの全体を参照により組み込む。矛盾する場合は、定義を含む本明細書により規制する。本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および図、ならびに特許請求の範囲により明らかとなる。

塩基置換ライブラリー（配列番号１〜６、１および７〜１１）およびゲノムＤＮＡライブラリー（配列番号１および１２〜１６）におけるライブラリー複雑性の違いを示す図である。ゲノムライブラリーでは、オンターゲット部位（この例における赤色の囲み）は、大まかには約３０億の他のゲノム配列に対する類似性をほとんど保持しない。塩基置換ライブラリーでは、選択前ライブラリーは、ゲノムに必ずしも存在しないが、目的とする標的部位に類似する部位を濃縮する。置換は、小文字により示す。例となる方法の例示的概要を示す図である。潜在的ＤＮＡ基質のユーザー定義のセット（典型的には、１０，０００〜１００，０００塩基の配列であるが、これに限定されない）を、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上に合成により生成し、次いで、２本鎖とする。使用する配列のセットの３つの潜在的な例としては、ヒトゲノムに最大６つのミスマッチを有するすべての配列、ヒトエクソームに８つのミスマッチを有するすべての配列、または最大３つのミスマッチを有するすべての潜在的ＤＮＡ配列のセットが挙げられる。次いで、２本鎖ＤＮＡライブラリーは、配列修飾についてのスクリーニング、配列欠失についてのスクリーニング、または配列の修飾および／もしくは切断についての選択において使用することができる。黒色の線は、ライブラリーのすべてのメンバーに存在し、増幅ステップおよび生物情報学処理においてプライマー結合部位に使用する、定常配列を示す。標的部位ライブラリーは、切断のために選択する（戦略１）か、または切断配列の欠失についてスクリーニングする（戦略２）ことができることを示す図である。黒色の線は、ライブラリーのすべてのメンバーに存在し、増幅ステップおよび生物情報学処理においてプライマー結合部位に使用する、定常配列を示す。配列番号１７〜２２を示す。ランダム塩基置換ライブラリーからの選択によるＣａｓ９切断部位の濃縮を示す図である。目的とする標的部位（配列番号２３）をヒートマップの下に列挙する。黒色の各囲みは、下に列挙する標的部位ヌクレオチドに対応する位置における特定のヌクレオチド（左に表す）の存在量を表し、黒色は、位置毎に最も大量に存在するヌクレオチドを表し、白色は、存在しないことを表す。ランダム塩基置換ライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングによるオンターゲット配列の同定を示す図である。基質プロファイリングライブラリー、およびゲノムに刺激されたライブラリーにおいてより少数の変異を有する基質（より小さい数ｍにより示され、ここで、（ｍ＿ｄ＿ｉ）−＞ｍ＝変異の数、ｉ＝挿入の数、ｄ＝欠失の数である）、ここで、Ｘｍ０は、いかなる挿入も有しないｍ対のミスマッチを表し、ＲＮＡｍｄは、この部位の残りの塩基対にｍ対のミスマッチを有する長さｄの標的部位欠失を示し、ＤＮＡｍｉは、この部位の残りの塩基対にｍ対のミスマッチを有する長さＩの標的部位挿入を示す。代表的ゲノムＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーの組成を示す図である。個々のゲノム部位の数をミスマッチおよびバルジの数に従って列挙する。他に明示しない限り、このようなライブラリーは、引き続く図において概要を述べる実験に利用した。ライブラリーの特性決定を示す図である。均一性の測定基準およびドロップアウト率を、オリゴヌクレオチド合成、ライブラリー増幅、およびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング後のそれぞれのライブラリーについて示す。９０パーセンタイルシーケンシング数は、リードの増加に関して順序付けた場合、９０パーセンタイルのライブラリーメンバーについて得たシーケンシングリードの数を指す。９０／１０比は、１０パーセンタイルライブラリーメンバーによって割った９０パーセンタイルライブラリーメンバーについてのシーケンシングリード数の比率であり、ライブラリー均一性の測定基準である。ドロップアウトは、シーケンシングし増幅したライブラリーに表れなかった配列の数を指す。既知のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ部位の濃縮を示す図である。本明細書に記載する方法（この例は、ＯＮＥ−ｓｅｑ方法と呼ばれる）を使用した代表的切断選択についてのスウォームプロットを示す。それぞれの円は、所与のガイドＲＮＡ選択（上部に列挙する）のオンターゲット配列に対して正規化した凝集リード数を、個々のライブラリーメンバーについて表す。黒色の星は、オンターゲットライブラリーメンバーを示す。塗潰した円は、公開されているＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験により同定された部位を表す。公開されているＲＮＦ２ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ部位は存在しなかった。高度に濃縮されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位の濃縮を示す図である。ＯＮＥ−ｓｅｑ方法を使用した代表的切断選択についてのスウォームプロットを示す。それぞれの円は、所与のガイドＲＮＡ選択（上部に列挙する）のオンターゲット配列に対して正規化した凝集リード数を、個々のライブラリーメンバーについて表す。黒色の星は、オンターゲットライブラリーメンバーを示す。塗潰した円は、公開されているＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験により同定された、リード数＞１００を有する部位を表す。公開されているＲＮＦ２ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ部位は存在しなかった。中程度に濃縮されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位の濃縮を示す図である。ＯＮＥ−ｓｅｑ方法を使用した代表的切断選択についてのスウォームプロットを示す。それぞれの円は、所与のガイドＲＮＡ選択（上部に列挙する）のオンターゲット配列に対して正規化した凝集リード数を、個々のライブラリーメンバーについて表す。黒色の星は、オンターゲットライブラリーメンバーを示す。塗潰した円は、公開されているＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験により同定された、リード数１０〜９９を有する部位を表す。低度に濃縮されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位の濃縮を示す図である。ＯＮＥ−ｓｅｑ方法を使用した代表的切断選択についてのスウォームプロットを示す。それぞれの円は、所与のガイドＲＮＡ選択（上部に列挙する）のオンターゲット配列に対して正規化した凝集リード数を、個々のライブラリーメンバーについて表す。黒色の星は、オンターゲットライブラリーメンバーを示す。塗潰した円は、公開されているＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ実験により同定された、リード数１〜９を有する部位を表す。例となる方法（濃色の円）により、１％のオンターゲットＯＮＥ−ｓｅｑ凝集リード数のカットオフを使用して、６つのＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの高度に濃縮された（＞１００リード）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位（淡色の円）６２種のうちの全６０種が同定されることを示すベン図である。１％のＯＮＥ−ｓｅｑカットオフを越えない２つの部位は、真正なオフターゲット配列を必ずしも表さず、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ方法において偽陽性であり得る。ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでは、このようなガイドＲＮＡについてＯＮＥ−ｓｅｑ同定部位４７８種を同定しない。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑまたはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑではなくＯＮＥ−ｓｅｑにより同定された３つのＦＡＮＣＦオフターゲット部位の検証結果を示す図である。標的化アンプリコンシーケンシングを、ＳｐＣａｓ９：ＦＡＮＣＦｓｇＲＮＡ構築物発現の上位デシルについて選別したＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＯＮＥ−ｓｅｑにより同定された、最も高度に濃縮された新規オフターゲット候補５つのうちの３つについて実施した。左には、挿入欠失含有（編集された）配列リードの合計数および参照リードの合計数を示し、ともに編集率および非編集候補オフターゲット配列を示す。右には、３つの別々の選別および対照（無処理）実験からの個々のデータを示す（配列番号２４〜３９は順に表す）。変異ライブラリーにおける濃縮スコアの再現性を示す図である。ＥＭＸ１ゲノムオフターゲットライブラリーおよびＥＭＸ１ゲノム変異オフターゲットライブラリーについてＯＮＥ−ｓｅｑ選択を実施した。濃縮スコア（オンターゲット配列と比較した）を、両ライブラリーにより共有されるライブラリーメンバーについて示す。上に重ねた線は、両選択からの等しい濃縮スコアに対応する。ＯＮＥ−ｓｅｑにより、参照ゲノムではなく集団に存在する候補オフターゲット部位が同定されることを示す図である。正規化凝集リード数（ここで、１．０はオンターゲット部位である）を、参照ゲノムから同定されたオフターゲット候補、および１０００ゲノム集団に見出されるＳＮＰを含む対のオフターゲット候補について示す。集団の＞４０％に存在する変異体を、塗潰した円により示す。上に重ねた線は、対のライブラリーメンバーの両方からの等しい濃縮スコアに対応する。塩基編集物質スクリーニング戦略を示す図である。ＥＭＸ１標的部位のためにデザインしたランダム塩基置換ライブラリーをｉｎｖｉｔｒｏでＢＥ１とともにインキュベートし、ＤＮＡ合成においてＵ：Ｇ塩基対をＴ：ＡおよびＣ：Ｇ塩基対の等量混合物に変換するカッパＨｉＦｉウラシル＋ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅した（ｄＡＴＰヌクレオチドがｄＵの向かい側に組み込まれる）。したがって、シーケンシングする場合、ＢＥ１により修飾され得る任意のライブラリーメンバーは、処理前ライブラリーからオリジナルのバーコード結合配列の混合物として、またＣ−＞Ｔ置換（および他のまれな置換）を含む修飾配列としてシーケンシングする。塩基編集物質スクリーニングにより、ＮＧＧを含む部位の濃縮が実証され、標的部位（配列番号２３）のＰＡＭ近位端における高い特異性、およびＰＡＭ遠位端における低い特異性が実証されることを示す図である。ヒートマップは、図４と同様に解釈する。ＢＥ３選択戦略を示す図である。この戦略では、標的部位ライブラリーは、ＢＥ３酵素に曝露し、ウリジンヌクレオチド（ＵＳＥＲによる）およびニック（ＢＥ３による）を有する部位における２本鎖切断端生成により修飾メンバーを濃縮する。ＯＮＥ−ｓｅｑによるＢＥ３オフターゲット部位の濃縮を示す図である。正規化凝集リード数（ここで、１．０はオンターゲット部位に対応する）を、ゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーに対する８回のＯＮＥ−ｓｅｑ選択について示す。０．０１以上のスコアを有する部位（１％のオンターゲット濃縮）のみを示す。黒色の星は、オンターゲットライブラリーメンバーを表す。黒色で塗潰した円は、新たに検証されたオフターゲット部位を、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑと比較して（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑにより試験しなかったＡＢＥ部位１８を除いて）表す。塗潰さない黒縁の円は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ候補部位を表す。新たに同定および検証されたＢＥ３オフターゲット部位を示す図である。指示するＢＥ３：ｓｇＲＮＡ複合体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のゲノムＤＮＡの標的化アンプリコンシーケンシングからのデータを、無処理対照と比較して示す。実験は、３つの複製物において実施した。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑと比較した、新たに同定および検証されたＢＥ３オフターゲット部位２８種のみを示す。ＡＢＥ選択戦略を示す図である。この実施例では、アデニン塩基編集物質（ＡＢＥ）を使用する。ＡＢＥは、ＤＮＡにおけるＡ−＞Ｉの変異を生成する。ＡＢＥのオフターゲット部位を特定するために発明者らが本発明において使用する方法は、エンドヌクレアーゼが異なることを除いて実施例３において使用する方法と類似し、エンドヌクレアーゼＶを使用して、ＤＮＡのデオキシイノシン部位にニックを生成する。塩基置換ライブラリーについてのＡＢＥ選択を示す図である。ヒートマップは、図４と同様に解釈する。選択からのデータは、図４のＳｐＣａｓ９切断選択および図８のＢＥ３選択と比較して、ＮＧＧＰＡＭの濃縮だけでなく、５番目にＡを含む配列の濃縮をも実証し、活性を実証するＡＢＥの特定の編集ウインドウにおけるＡの必要性を実証する（配列番号２３）。ＯＮＥ−ｓｅｑによるＡＢＥ７．１０オフターゲット部位の濃縮を示す図である。正規化凝集リード数（ここで、１．０はオンターゲット部位に対応する）を、ゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーに対する８回のＯＮＥ−ｓｅｑ選択について示す。黒色の星は、オンターゲットライブラリーメンバーを表す。塗潰した円は、検証されたオフターゲット部位を表す。塗潰さない濃色の円は、検証試験においてシーケンシングされたオフターゲット候補を表す。検証されたＡＢＥオフターゲット部位を示す図である。指示するＡＢＥｍａｘ：ｓｇＲＮＡ複合体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のゲノムＤＮＡの標的化アンプリコンシーケンシングからのデータを、無処理対照と比較して示す。実験は、３つの複製物において実施した。Ｇ：ＵＤＮＡミスマッチについてのＴｋｏＥｎｄｏＭＳエンドヌクレアーゼ活性の特異性をｉｎｖｉｔｒｏで実証する、実験からのキャピラリー電気泳動データを示す図である。８００塩基対ＰＣＲアンプリコンを、精製したＢＥタンパク質および可変ｓｇＲＮＡとともに２時間インキュベートして、部位特異的脱アミノ化を誘導した。精製後、脱アミノ化ＰＣＲアンプリコンを、精製したＴｋｏＥｎｄｏＭＳタンパク質とともに７分間インキュベートして、Ｇ：Ｕミスマッチにおいて２本鎖切断を誘導した。次いで、ＤＮＡを、キャピラリー電気泳動を用いてサイズにより分別し、撮像した。プルダウンによる結合部位の濃縮の概要を示す図である。この方法では、ｄＣａｓ９でコーティングしたビーズを、潜在的オフターゲット部位のライブラリーとともにインキュベートする。結合しないライブラリーメンバーは、上清に洗い流し、結合したライブラリーメンバーは、プロテイナーゼＫを用いてビーズに結合したタンパク質を分解することにより溶出する。結果として生じる溶出されたライブラリーは、増幅してプルダウンの追加のラウンドに供するか、またはハイスループットシーケンシングによる分析に供し得る。プルダウン条件により、オンおよびオフターゲット部位を識別することができることを示す図である。異なる長さを有する３つの２本鎖ＤＮＡの混合物を、ｄＣａｓ９：ＥＭＸ１ｓｇＲＮＡでコーティングしたビーズを用いた結合部位プルダウンに供した。オンターゲット部位は、２８０塩基対のＤＮＡに存在し、２つのオフターゲット部位のうちの１つ（ＯＴ２またはＯＴ４）は、２２０塩基対のＤＮＡに存在した。オンおよびオフターゲット部位のいずれをも含まない第３の２００ｂｐ（「ランダム」）ＤＮＡも混合物中に存在した。ＤＮＡの濃縮は、ＱＩＡｘｃｅｌ上で実行した。レーンＡ３は、サイズラダーを表す。レーンＡ１は、標的部位の２８０塩基対の選択的プルダウンを示すが、ＯＴ２部位または２００ｂｐのＤＮＡのプルダウンは示さない。レーンＡ２は、ＯＴ４部位が、方法において、なお結合可能であることを示し、プルダウンにおいて使用した条件により、ｄＣａｓ９：ＥＭＸ１ｓｇＲＮＡにより結合可能なオフターゲット配列を濃縮することができることを実証する（配列番号２３、４０〜４１は順に表す）。プルダウンによるゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーの濃縮を示す図である。５０μｇ／ｍｌのヘパリンの存在下でＦＡＮＣＦライブラリーについて行ったプルダウンにより、最も大量に存在するプルダウン後ライブラリーメンバーへのオンターゲット部位（黒色の星）の濃縮が生じる。Ｉ−ＰｐｏＩの選択後ライブラリー組成を示す図である。目的とするＩ−ＰｐｏＩ標的部位の正規化リード数の少なくとも１％を有する配列についてのシーケンスロゴを示す。５’から３’末端の部位における位置は、横軸に示し、重なった文字の高さは、各位置についての情報量（ビットによる）を表す。個々のヌクレオチドそれぞれの高さは、このヌクレオチドの、この位置の情報量に対する相対的寄与を強調する。２、１３および１４番目は、最も高度に明示されている（情報量が最も高い）。１５番目は、最も低く示されている（情報量が最も低い）。

ＤＮＡ結合ドメインのオンおよびオフターゲット活性の理解に対するｉｎｖｉｔｒｏ／生化学的戦略は、一般に、２つの型に分類される（図１）。第１の型では、適切な規定された系（例えば、ヒトゲノム）におけるＤＮＡ配列のセットを、オフターゲット切断現象について調べる。この戦略を利用する方法の例としては、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ（Tsai et al., Nat Meth. 14: 607 (2017)）、ＳＩＴＥ−ｓｅｑ（Cameron et al. Nat Meth. 14: 600 (2017)）およびＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（Kim et al. Nat Meth. 12: 237 (2015)）が挙げられる。このようなゲノム規模の方法の範囲は、試験において使用する特定のゲノムＤＮＡに存在するオフターゲット部位に制限される。対照的に、第２の型の戦略では、特定の塩基の位置が、すべての潜在的代替塩基とランダムに置換される（第１の戦略の場合のように塩基置換の限定されたセットのみではなく）、結合部位のライブラリーを包括的に調べることにより、さらに不偏的な方法で、ＤＮＡ結合／修飾タンパク質の基質選択性をアッセイする。このような「ゲノムＤＮＡ」および「ランダム塩基置換ライブラリー」方法は、種々のヌクレアーゼ（ＺＦＮ（Pattanayak et al. Nat Meth. 8: 765 (2011)）、ＴＡＬＥＮ（Guilinger et al. Nat Meth. 11: 429 (2014)）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（Pattanayak et al. Nat Biotech. 31: 839 (2013)））についてｉｎｖｉｔｒｏで行われており、このようなヌクレアーゼの生化学的機能および特異性への見識をもたらす。

オフターゲット活性を試験するための両方の型の戦略は、真正なオフターゲット部位を同定するこれらの能力に影響する制限を有する。ゲノム規模の選択では、数十から数百の切断したオフターゲット部位を、切断されていない数十億の他の部位のバックグラウンドから濃縮しなければならない（ヒトゲノムは、約３０億塩基対の長さを有し、これにより約６０億のアッセイすべき部位を含む）。例えば、濃縮方法およびシーケンシング結果におけるノイズのため、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ方法は、オンターゲット部位と比較して６つ以下のミスマッチを有する部位の検出に制限され、これは、アッセイ中に存在するゲノム物質のたった約０．００２％を表す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑのような一部の方法は、ヌクレアーゼで処理したＤＮＡライブラリーのマッシブオーバーシーケンシング（massive over sequencing）に依存するが、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑのような方法では、典型的に、編集された配列の濃縮ステップを組み込む。この濃縮ステップは、細胞内（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）またはｉｎｖｉｔｒｏ（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）において実施することができる。これは、オフターゲットスクリーニングの他の方法よりも実質的に高感度であるが、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ方法は、各実験試料について、非常に大型のゲノムＤＮＡインプット（２５μｇ）を必要とする。

偏りがない塩基置換ライブラリーについてのｉｎｖｉｔｒｏでの選択は、ライブラリーのサイズ（実際にアッセイ可能な配列のセット）により制限される。例えば、ＳｐＣａｓ９標的部位は、２２対の潜在的に特定される塩基対（２０対はガイドＲＮＡとのハイブリダイゼーション由来、２対はＰＡＭ配列由来）を含む。塩基置換のすべての潜在的組合せをすべての位置において有する、すべての潜在的標的部位をアッセイするために、少なくとも４^２２〜１０^１３個のユニークなＤＮＡ分子を生成して調べる必要があり、これらのいずれにも現在の技術を使用することが不可能である。例えば、ライブラリー構築方法は、現在、１０^１１〜１０^１２個のユニークなＤＮＡ分子の生成に制限されている。さらに、ライブラリー構築方法が改良されたとしても、１０^１２個のＤＮＡ分子をシーケンシングすることは、実現可能とは言い難い。この制限を克服するために、ドープしたオリゴヌクレオチド合成が、二項分布に従う塩基置換を有する部位のライブラリーの生成に伝統的に使用されており、これにより、オンターゲット部位が、単一変異を有するライブラリーの各変異部位よりもコピー中に存在し、これらのそれぞれが、二重変異部位等を有するライブラリーの各変異部位よりもコピー中に存在する。したがって、このようなランダム塩基置換ライブラリーを用いて実施された選択は、１）完全に偏りがないライブラリーを生成することは不可能であり（すなわち、これらが目的とするオンターゲット部位配列に重度に偏っている）、２）潜在的配列空間を均一に表すライブラリーを生成することは不可能であるという事実により制限される。さらに、選択前ライブラリー（６または７つの置換に対応する１０^１２塩基の配列に制限される）または選択後ライブラリー（シーケンシング能力により１０^７〜８塩基の配列に制限される）に、すべての適切なゲノム配列が網羅されることが保証されているとは限らないため、規定されたライブラリーのアウトプットを使用すると、ゲノム配列におけるオフターゲット部位を予測または同定するアッセイでは、外挿法を必要とすることが多い（Sander et al. Nucleic Acids Res. 41: e181 (2013)）。

ＤＮＡの結合、修飾、または切断部位を同定する方法
本明細書において、発明者らは、ＤＮＡ修飾タンパク質／タンパク質複合体（エフェクタードメインと融合したｄＣａｓ９、Ｃａｓ９をベースとした塩基編集物質、または活性Ｃａｓ９タンパク質を含むが、これらに限定されない）のオンおよびオフターゲット結合、修飾、または切断部位の同定を可能とし、「ゲノムＤＮＡ」および「ランダム塩基置換ライブラリー」の両方法の不利益を克服する改良方法（図２）を提供する。この方法により、特定のユーザー指定配列からなる直鎖ＤＮＡの事前濃縮したライブラリーは、高密度オリゴヌクレオチド合成により生成し、次いで、配列特異的タンパク質またはタンパク質複合体により結合、修飾または切断可能な配列について調べる。少なくともこの方法は、修飾作用により核酸の配列修飾、結合、または切断が生じ得る任意の物質の潜在的基質である配列の同定を可能とする。

事前濃縮した直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーは、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上に、それぞれがユニークな識別子／バーコードを有する、個々の１本鎖ＤＮＡ配列として最初に合成し、これは、オリゴヌクレオチドの両端に存在／重複する（図２）。合成したオリゴヌクレオチドは、チップから遊離し、チップ上に合成したすべてのＤＮＡ分子に存在する共通配列に対するプライミングにより２本鎖ＤＮＡ分子に変換される。次いで、この保存されたライブラリーは、部位特異的ヌクレアーゼ、修飾タンパク質、または目的のＤＮＡ結合ドメインとともにインキュベートして、選択フォーマットにより切断、修飾、または結合配列を濃縮するか（実施例１、３、４を参照）、または修飾についてスクリーニングする（実施例２を参照）。次いで、切断された部位のＤＮＡ配列は、このような部位に元々隣接し、２つの分子に今や分離している、同一のバーコードのいずれかから再構築することができる。

合成した分子は、１）オンターゲット部位と比較して一定数までのミスマッチを有する参照ゲノムにおける、すべての潜在的オフターゲット配列のセット（ゲノムＤＮＡライブラリーに類似する）、２）一定数までのミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位の包括的セット（ランダム塩基置換ライブラリーに類似する）、３）規定された集団由来の変異ゲノムのセットに存在する潜在的オフターゲット配列のライブラリー（すなわち、個体集団に存在するＤＮＡ配列変異体を反映するようにデザインされたゲノムＤＮＡライブラリー）、または４）潜在的オフターゲット部位（例えば、癌遺伝子ホットスポットまたは腫瘍抑制遺伝子由来の配列）の他の適切な規定されたセットを表すと特定することができる。この戦略は、このようなライブラリーの構築における重要な利点を有する。ランダム塩基置換ライブラリーでは、規定数の置換におけるすべての配列は、同等に表すことができ、現在の次世代シーケンシング方法を用いて容易に採取することができる。ゲノムまたはエクソームＤＮＡライブラリーでは、最も適切であると思われる部位（例えば、６つ以下の置換を有するすべての潜在的オフターゲット部位）のみが含まれ、これは、基質ではない部位の約９９．９９８％により付与されるノイズを除去する。重要なことには、この方法により、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）結合タンパク質の潜在的オフターゲット部位の濃縮されたセットの２本鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡ）ライブラリーの生成が生じるため、これは、ヌクレアーゼだけでなく、核酸を結合または修飾する他のタンパク質の特異性およびオフターゲット部位をも特定するのに使用することができ、カスタマイズ可能な塩基編集酵素（Komor et al. Nature 533: 420, 2016, Gaudelli et al. Nature. 551: 464 (2017)）、転写活性化因子（Mali et al, Nat Biotech. 31: 833 (2013), Chavez et al. Nat Meth. 12: 326 (2015)）、転写抑制因子（Bikard et al, Nucleic Acids Res, 41: 7429 (2013), Thakore et al. Nat Meth. 12: 1143 (2015)）およびエピゲノム編集酵素（Zentner and Henikoff. Nat Biotech. 33: 606 (2015)に総説が記載されている）を含むが、これらに限定されない。特定された認識部位に隣接する同一のバーコードを特定する能力は、ライブラリーのメンバーの配列が、ＤＮＡプールの個々の各メンバーの少なくとも３つの位置においてコードされるため、これまでのｉｎｖｉｔｒｏでのプロファイリング方法（米国特許第９，３２２，００６号、米国特許第９，１６３，２８４号）を越える大幅な進歩を表す。情報のこの冗長性は、標的配列を修飾するＤＮＡ修飾活性（例えば、塩基編集）を定義しようとする場合、特に有利である。オリジナルの配列情報は、ライブラリーメンバーの実際のＤＮＡ配列それ自体が修飾されていても、隣接するバーコードに含まれる情報内容から得ることができる。また、２つのバーコードおよび認識部位における情報の冗長性は、複数のコピーではなく（米国特許第９，３２２，００６号、米国特許第９，１６３，２８４号）、１ライブラリーメンバーあたり単一のコピーに存在する潜在的切断部位上で行われる、エンドヌクレアーゼ切断選択（または対塩基修飾＋切断選択）を可能とする。切断により、切断部位の両端の空間が分離されるため（上図、右下、青色領域）、本発明のバーコード戦略なしには、認識部位において切断されるライブラリーメンバーの配列は、再構成することができない。

本発明は、以下の実施例においてさらに記載し、これらは、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限しない。

以下の実施例において使用する標的部位：

[実施例１]
ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１によるＤＮＡ切断選択
この実施例では、ヒトＥＭＸ１遺伝子におけるオンターゲット部位に対してデザインしたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（以後、ＥＭＸ１ｇＲＮＡおよびＥＭＸ１標的部位と呼ぶ）を用いてプログラムしたＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのためにデザインしたランダム塩基置換ライブラリー、およびヒト参照ゲノム由来の潜在的ＥＭＸ１ｇＲＮＡオフターゲット部位のライブラリーを、ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ１による切断のために選択した。

この実施例では（図３）、選択（戦略１）およびスクリーニング（戦略２）の両方を利用することができる。戦略１では、約５０，０００種の保存したライブラリーにより、ライブラリーメンバーをバーコード化した（ＥＭＸ１ＳｐＣａｓ９オンターゲット部位の３つのミスマッチにおいてすべての潜在的配列を含むランダム塩基置換ライブラリー、またはＥＭＸ１ＳｐＣａｓ９オンターゲット部位の６つのミスマッチにおいてｈｇ１９ヒト参照ゲノム由来のすべての潜在的配列を含むゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーのいずれか−ライブラリーの詳細のための方法を参照）。

戦略１を使用して１：１：１のＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡライブラリー（ＥＭＸ１標的部位）比によるランダム塩基置換ライブラリーについて実施した選択では、切断され得る配列の濃縮を実証した（図４）。標的部位の位置は、横軸上である（オンターゲット塩基を下に列挙する）。ライブラリーにおける潜在的塩基（置換またはオンターゲット）は、縦軸上に示す。データを保存してヒートマップにまとめた。ここでは、濃黒色の四角形は、縦軸の対応する塩基を含む選択後ライブラリーにおける高い割合の部位を示す。原理の証明として、このヒートマップは、ＮＧＧＰＡＭ配列のＮが特定されず、標的部位のＰＡＭ遠位端における特異性がＰＡＭ近位端のそれよりも低いことを実証する、これまでの試験と一致する。

戦略２を使用し、ランダム塩基置換ライブラリーを用いて実施したスクリーニングでは、同様の結果を得た（図５）。基質プロファイリングライブラリー、およびゲノムに刺激されたライブラリーにおいてより少数の変異を有する基質（より小さい数ｍにより示され、ここで、（ｍ＿ｄ＿ｉ）−＞ｍ＝変異の数、ｉ＝挿入の数、ｄ＝欠失の数である）、ここで、Ｘｍ０は、いかなる挿入も有しないｍ対のミスマッチを表し、ＲＮＡｍｄは、この部位の残りの塩基対にｍ対のミスマッチを有する長さｄの標的部位欠失を示し、ＤＮＡｍｉは、この部位の残りの塩基対にｍ対のミスマッチを有する長さＩの標的部位挿入を示す。

ゲノムライブラリーは、一般に、オンターゲット配列と比較して０〜６対のミスマッチ、１つまたは２つのヌクレオチドのＤＮＡバルジと組み合わせた最大４対のミスマッチ、および１つのヌクレオチドのＲＮＡバルジとの最大４対のミスマッチ、ならびに２つのヌクレオチドのＲＮＡバルジとの最大３対のミスマッチを有するｈｇ１９参照ヒトゲノムにおける、すべての潜在的オフターゲット部位からなる（図６）。品質測定基準を評価する、選択前ライブラリーのシーケンシング（図７）では、低いドロップアウト率（０．２０％以下）および高い均一性（９０／１０比＞−２）を実証した。このような測定基準は、発明者らの知る限り、他の特異的方法に対しては算出されていないため、直接比較することはできない。

戦略１（ＯＮＥ−ｓｅｑと呼ばれる）を使用し、ゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーを用いて、比較的少ない予想オフターゲット配列を有する６つの無差別でないガイドＲＮＡ（ＨＢＢ、ＲＮＦ２、ＨＥＫ２、ＨＥＫ３、ＦＡＮＣＦおよびＥＭＸ１）について選択を実施した。オンターゲット配列（図８、黒色の星）は、試験した６つの無差別でないガイドＲＮＡが、数万のライブラリーメンバーのうちの最も濃縮されたメンバーであるか、または最も濃縮されたメンバーの上位３つのいずれかであった。６つの無差別でないガイドＲＮＡについてまとめると、ＯＮＥ−ｓｅｑでは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより同定されたオフターゲット部位１６３種すべてを濃縮し（図８、塗潰した円）、選択後のリード数は、オンターゲット配列の１１％〜１２０％の範囲であった。また、この方法では、高度に濃縮されたＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位（配列リード＞１００を有するものであると本明細書において定義する、図９）を濃縮し、中程度に濃縮されたか（１０〜９９リード、図１０）または低度に濃縮された（１〜９リード、図１１）ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位を、程度は低いが適切に濃縮する。本明細書に記載するＯＮＥ−ｓｅｑ方法において、カットオフが１％のオンターゲット濃縮である場合、ＯＮＥ−ｓｅｑでは、高濃縮ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位６２種のうち６０種を同定し（図１２）、一方、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑでは、高濃縮ＯＮＥ−ｓｅｑ候補４７８種の同定に失敗する。注目すべきことには、ＯＮＥ−ｓｅｑにより高度に濃縮されていない、高濃縮ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ部位２つは、ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ方法において偽陽性であり得る。新規であり、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑまたはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑにより同定されないＯＮＥ−ｓｅｑ部位の検証は、ＳｐＣａｓ９：ＦＡＮＣＦｓｇＲＮＡ発現の上位デシルにおけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を選別することにより実証した（図１３）。このような結果は、本明細書に記載する方法が、既存の方法と少なくとも同等に高感度であり、さらに高感度であり得ることを実証する。

加えて、この方法は、核酸配列の任意のライブラリー／規定されたセットに一般化することができる。例えば、１０００ゲノムプロジェクトの公開されているデータを使用して、ＥＭＸ１ゲノムオフターゲット部位ライブラリーについてのＯＮＥ−ｓｅｑ選択を実施し、天然に存在する配列の多様性を集団規模で説明した。この例となるライブラリーでは、オリジナルのＥＭＸ１ライブラリー（図６）に存在し、１０００ゲノムデータベースにＳＮＰを含む、参照ｈｇ１９ヒトゲノム集合体由来のすべての配列を含んだ。加えて、配列を含むＳＮＰはまた、その個体が、参照ゲノムに含まれていないオフターゲット配列を有し得る可能性を説明する、追加のライブラリーメンバーとして含まれた。このＳＮＰ含有ＥＭＸ１ライブラリーについて実施したＯＮＥ−ｓｅｑ切断選択では、参照ｈｇ１９ゲノムに存在するオフターゲット候補の再現可能な濃縮をもたらす（図１４）。変異ライブラリーについてのＯＮＥ−ｓｅｑ切断選択では、ＥＭＸ１ガイドＲＮＡのオフターゲット部位の候補のセットに対する、集団に存在する数万の変異体の評価を実証し、差次的に濃縮されたいくつか（図１５、黒色の円）を同定する。

[実施例２]
ＢＥ１による塩基編集スクリーニング
この実施例（図１６）では、スクリーニング戦略を使用して、ＢＥ１酵素により生じた塩基修飾を同定し（Komor et al. Nature 533: 420, 2016）、これは、規定されたＤＮＡウインドウにおいてＣ−＞Ｕの変異を正準として生じる。

上記のプロトコールに従う、ＢＥ１を用いた塩基編集スクリーニングは、ＥＭＸ１標的部位に適用し、基質プロファイリングライブラリーにより、耐性オフターゲット部位の予想プロファイルの濃縮がもたらされた（図１７）。

[実施例３]
ＢＥ３を用いた塩基編集物質による選択
この実施例（図１８）では、選択戦略を使用して、ＢＥ３酵素による修飾を受ける部位を濃縮した。ＢＥ３酵素により認識され得るライブラリーメンバー（Komor et al. Nature 533: 420, 2016）は、Ｃ−＞Ｕ修飾およびニックの両方を逆鎖において示すはずである。ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ社）を使用して、ＢＥ３基質であるライブラリーメンバーの２本鎖切断を、ｄＵヌクレオチドをニックと置換することにより達成した。したがって、結果として生じる修飾ライブラリーメンバーは、５’リン酸を有する２つのニックを両鎖に含み、このようなＤＮＡオーバーハングを平滑末端化し得るＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ）とともにインキュベートする。結果として生じるリン酸化平滑末端は、２本鎖ＤＮＡアダプターにより捕捉した後、アダプターに対して特異的な１つのプライマー、およびライブラリー骨格に対して特異的な１つのプライマーを使用して増幅／選択する（実施例１のように）。

追加の選択ストリンジェンシーは、増幅の前または後に小型の切断断片についてのサイズ選択を実施することにより得ることができる。

この方法を使用して、発明者らは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによりこれまでに試験されているＢＥ３標的全７つを含む（Kim et al. Nat. Biotech. 35:475, 2017）８つの標的部位に対して、ゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーを用いて、ＢＥ３標的化について調べた。ＯＮＥ−ｓｅｑ選択の結果により、全８回の選択について、数万のライブラリーメンバーのうちの上位１３種への目的とする標的部位の濃縮が明らかとなった（図１９、黒色の星）。８回の選択のうちの３回では、目的とする標的部位は、最も濃縮された部位であった。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによりこれまでに検証されているオフターゲット部位全４２種は、濃縮された選択後ライブラリーに存在し（図１９、塗潰さない黒縁の円）、４２種のうちの４０種は、各選択において、上位６１種の間であった。本発明のＯＮＥ−ｓｅｑの結果をさらに検証するために、発明者らは、各選択から上位にランクする部位およそ２０〜４０種を、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から増幅およびシーケンシングした。本発明の結果により、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑにより候補として同定されていなかった、ＢＥ３オフターゲット部位２８種の検証が実証された（図１９、塗潰した黒色の円）。新たな部位２８種のうちの６つは、細胞内において１％を超える編集率を（図２０）２３．９％の高い編集率で有し、弱いオフターゲット部位だけでなく高頻度オフターゲット部位をも検出するための高いレベルのＯＮＥ−ｓｅｑ感度を示唆した。

[実施例４]
ＡＢＥを用いた塩基編集物質による選択
この実施例（図２１）では、発明者らは、アデニン塩基編集物質（ＡＢＥ；Gaudelli et al. Nature. 551: 464 (2017)）を使用して、ＥＭＸ１ｇＲＮＡならびに塩基置換プロファイリングライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーを用いて選択を実施した。ＡＢＥは、デオキシアデノシンのデオキシイノシンへの変換を触媒し得る、タンパク質ドメインと融合したｓｇＲＮＡガイドＣａｓ９ニッカーゼである。この実施例では、選択前ライブラリーの２本鎖切断は、２つのステップにより達成する（図２１）。第１には、ＡＢＥ酵素およびガイドＲＮＡとインキュベートすると、ガイドＲＮＡとハイブリダイズする、認識されたライブラリーメンバーの鎖のニックが形成される。第２には、ＡＢＥ活性から生じ得るライブラリーメンバーのデオキシイノシンの３’にニックを生成する酵素である、エンドヌクレアーゼＶとともに引き続いてインキュベートすると、ハイブリダイズされないＤＮＡ鎖にニックが形成され、オーバーハングを有する２本鎖切断端が生じる。引き続いて２本鎖切断端をＤＮＡポリメラーゼによりフィルインすると、平滑末端が形成され、これは、実施例１でＣａｓ９ヌクレアーゼの場合について記載したように選択することができる。

塩基置換ライブラリーの選択では、ＮＧＧを有する基質の濃縮を実証する。加えて、予想したように、この実施例（図２２）では、標的部位の５番目にＡを有する基質の濃縮を実証し（ここで、１は、ＰＡＭから最も遠位の塩基対である）、正準ＥＭＸ１標的部位に存在するものよりもＰＡＭから遠位のＡの修飾に対するＡＢＥの選択性を反映する。注目すべきことには、選択後ライブラリーに最も大量に存在する配列１００種の中でも、９５種は、５番目にＡを有した。このような結果により、本発明の戦略が、ＡＢＥのオフターゲット部位を濃縮および同定するように機能することが実証される。

また、発明者らは、ＥＭＸ１ゲノムＤＮＡライブラリーについて上記の選択を実施した（表２）。これにより、ＥＭＸ１オンターゲット部位（強調したもの；９６番目の最も大量に存在する選択後ライブラリー配列）および最も高いオフターゲット認識を有するＥＭＸ１オフターゲット部位（太字にアスタリスクを付けたもの；９番目の最も大量に存在する選択後ライブラリー配列）の濃縮を実証する。

発明者らは、６つのガイドＲＮＡのオフターゲット配列を同定するためにデザインしたゲノムＤＮＡライブラリーについて上記の選択をさらに実施した（図２３）。改良ＯＮＥ−ｓｅｑ選択プロトコールをＡＢＥ標的６つへ適用すると、試験した無差別でないガイド５つについて（ＨＥＫ４は、既知の無差別ガイドＲＮＡである）、選択後ライブラリーの上位３つへの目的とするオンターゲット部位の濃縮が明らかになった。上位候補部位（各選択からそれぞれ約２０種）の適切なＡＢＥ７．１０：ｓｇＲＮＡ対を個々にトランスフェクトしたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＤＮＡのアンプリコンシーケンシングによる検証では、６つの標的部位にわたって、確認された細胞性オフターゲット部位全１２種を同定した。このセットは、ＯＮＥ−ｓｅｑおよびＥｎｄｏＶ−ｓｅｑの両方（Liang et al. Nature Communications. 10: 67 (2019)）またはＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（Kim et al. Nature Biotechnology. 37: 430 (2019)）により試験して、２つのガイドＲＮＡについて同定された、３つの検証済オフターゲット部位、ならびにこのような方法のいずれによっても潜在的候補として同定されなかった、９つの新たに検証されたオフターゲット部位を含む。１２種の部位のうちの９つは、１％未満のオフターゲット修飾率を有するか、または単一のヌクレオチド置換の証拠を示すのみのいずれかであり、このいずれも、シーケンシングリードをストリンジェントな品質で選別し（リード対のすべての位置は、品質スコア＞Ｐｈｒｅｄ３０を有しなければならない）三重に検証したにもかかわらず、シーケンシングエラーにより生じた可能性があった。このような部位が真正なオフターゲット部位であるという本発明の信頼度を高めるために、発明者らは、ＡＢＥ７．１０のコドン最適化バージョンであるＡＢＥｍａｘおよびＧＦＰの両方を発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞を用いて検証実験の第２ラウンドを実施し、細胞を選別して上位デシルのＧＦＰを濃縮し、これによりＡＢＥを発現させた（図２４）。選別直後、さらに増殖させずに、ゲノムＤＮＡの抽出を実施した。選別した検証セットでは、オンターゲット修飾頻度は、６１％〜９４％の範囲であり、対照的に、非選別の検証セットでは、３１％〜５６％であった。非選別検証セットのオフターゲットのうちの全１２種は、選別した検証セットでは高頻度で修飾され、これらが真正なオフターゲットであり、追加のオフターゲット部位５つが１％未満の修飾頻度で同定されたことが確認された。オンターゲット部位と比較して単一のミスマッチを含む１つのＡＢＥ＿１４オフターゲット部位は、選別した検証のＤＮＡの８５％において修飾され（非選別検証においては１８％）、一部のＡＢＥオフターゲット部位が、高頻度で修飾され得ることを示唆した。

[実施例５]
修飾された位置に２本鎖切断端を生成する酵素を使用してＡＢＥまたはＢＥ３を用いた塩基編集物質による選択
この実施例では、デオキシイノシンを含む修飾したライブラリーメンバーに、ＴｋｏＥｎｄｏＭＳタンパク質の作用により２本鎖平滑末端を生成することができた（Ishino et al, Nucleic Acids Res. 44: 2977 (2016)）。ＴｋｏＥｎｄｏＭＳを使用して、ＡＢＥによるｄＡ−＞ｄＩの編集から生じるｄＩ：ｄＴ塩基対に２本鎖切断端を生成することができる。次いで、２本鎖切断端を有するＤＮＡを、実施例１と同一の下流ステップに供し、ニッキング活性のない塩基編集酵素を使用する場合、アダプターをリン酸化平滑末端化ＤＮＡとライゲートする。ニッキング活性を有する塩基編集酵素を使用する場合、実施例４および５のような、平滑末端生成ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４またはＰｈｕｓｉｏｎ）による末端のポリッシングを使用して、切断ライブラリーメンバーの両端を濃縮させる。

発明者らは、ＴｋｏＥｎｄｏＭＳにより、ｄＣ−＞ｄＵの編集（この実施例では、ＢＥ１による）から生じるｄＧ：ｄＵミスマッチ塩基対に２本鎖切断端をも生成可能であることを実証し、ＢＥ１、ＢＥ３、およびＤＮＡ結合後にｄＣ−＞ｄＵの変異を生じる他の酵素に対する、この追加の適用性を実証した（ＵＳＳＮ６２／５７１，２２２および図２５を参照）。これは、発明者らが、本発明の合成したＤＮＡ部位ライブラリーにＴｋｏＥｎｄｏＭＳを使用して、Ｃａｓ９誘導ニックも存在するかどうかにかかわらず、ｄＣからｄＵへの編集を誘導する種々の塩基編集物質により生じたオフターゲット塩基編集を同定可能であることを強力に示唆する。

[実施例６]
プルダウンによるＤＮＡ結合部位の濃縮
ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの選択的進化）は、ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合特異性を特定するために使用されている（最初は、Oliphant et al., Mol Cell Biol. 9: 2944, 1989による）。ＳＥＬＥＸ方法では、ランダム化したＤＮＡ配列のライブラリーを、複数ラウンドのプルダウンおよび目的の固定化ＤＮＡ結合ドメインによる濃縮に供して、目的のＤＮＡに結合し得る最初のプール内の配列を同定する。ＳＥＬＥＸ方法は、ＺＦＮのジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ部分（Perez et al., Nat Biotech. 26: 808 (2008)）およびＴＡＬＥN（Miller et al. Nat Biotech. 29: 143 (2011)）に適用されているが、Ｃａｓ９タンパク質についてのＳＥＬＥＸ試験の報告は存在しない。発明者らは、ＮＧＧＰＡＭを固定する場合、塩基対標的部位２０種に対応する、ユニークな分子＞１０^１３個または最小限１０^１２個の分子を含まなければならない、大型ライブラリーから塩基対標的部位２２種を選択的に濃縮する必要性があるため、Ｃａｓ９タンパク質についてのＳＥＬＥＸ試験は、困難であると推測した。

この実施例では、発明者らは、所与のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体（または予測可能な結合モチーフを有する他のＤＮＡ結合ドメイン）により最も結合すると思われる部位についての本発明の選択前ライブラリーの事前濃縮を利用した。発明者らは、事前濃縮したライブラリーについてのＤＮＡプルダウン実験の連続的ラウンドを実施することにより、Ｃａｓ９ＤＮＡ結合選択性および特異性を評価した（図２６）。これは、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を磁気ビーズに繋留することにより達成した。ｄＣａｓ９を磁気ビーズに化学的に結合させるために、発明者らは、いわゆるＳＮＡＰタグを有するＣａｓ９タンパク質を利用した。ＳＮＡＰタグを有するタンパク質は、ベンジルグアニンを有する基質分子、例えば、磁気ビーズに共有結合することができる。発明者らは、ビーズ結合ＳＮＡＰタグ化ｄＣａｓ９を有する、いずれかの型のオリゴヌクレオチドライブラリーをインキュベートし、結合配列の磁気ビーズ捕捉による、Ｃａｓ９に対する高結合親和性を有するＤＮＡ基質を濃縮し、非結合配列を洗い流すことを計画する。このプロセスは、溶出したライブラリーメンバーを増幅し、結果として生じる濃縮ＤＮＡライブラリーを、ビーズをベースとした選択のための出発ライブラリーとして使用することにより、複数サイクルで反復し得る。単一サイクルのこの方法を使用して、発明者らは、オンターゲット部位のｄＣａｓ９：ＥＭＸ１ｓｇＲＮＡによる選択的プルダウンを、オフターゲット部位と比較して生じ得る条件を実証した（図２７）。さらに、ＦＡＮＣＦゲノムＤＮＡに刺激されたライブラリーのプルダウンにより、オンターゲット部位の最大の濃縮が、他の部位と比較して生じる（図２８）。オンターゲット部位、Ｃａｓ９結合の詳細な知識は、遺伝子改変したＣａｓ９変異体、例えば、高忠実度Ｃａｓ９の向上した特性を機構的に試験するのに特に有用である。重要なことには、エフェクタードメインおよびＤＮＡ結合ドメインの相互依存が制限されたＣａｓ９融合タンパク質（または他のＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質）のオフターゲットパターンは、融合タンパク質のＤＮＡ結合特性により主に定義され得る。したがって、事前濃縮したオリゴヌクレオチドライブラリーについてのＤＮＡプルダウン実験の実施は、融合タンパク質のオフターゲット分布についての発明者らの理解に寄与し得る。さらに、Ｃａｓ９（または他のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン）のＤＮＡ結合試験を、複雑性を制限したライブラリーについて行うことにより、バックグラウンドノイズがほとんどない高品質結合データを得ることができ、引き続いて、これを使用して、より複雑なライブラリー、例えば、細胞のゲノムの結合を推定および予測することができる。

[実施例７]
ホーミングエンドヌクレアーゼによる選択
ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｉ−ＰｐｏＩは、制限酵素の大多数よりも長い塩基認識モチーフを有する、天然に存在するヌクレアーゼの一群を代表する。ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼとも呼ばれる）は、容易に初期化可能な特異性を有しないが、これらが目的のゲノム配列を標的とする場合、研究、商業、または臨床に有用であり得る。ここで、発明者らは、本発明のｉｎｖｉｔｒｏでの選択を、Ｉ−ＰｐｏＩホーミングエンドヌクレアーゼの特異性プロファイルを分析するように適応させることができたことを示す。発明者らは、最大３つのミスマッチおよび単一のＤＮＡ／ＲＮＡバルジを有するすべての部位を含む、潜在的Ｉ−ＰｐｏＩオフターゲットの不変性ライブラリーを生成した。Ｉ−ＰｐｏＩライブラリーは、１５５３３種のメンバーを含んだ。Ｉ−ＰｐｏＩ選択により、１５５３３種のライブラリーメンバーのうちの５０１種が濃縮され（表３）、一方、目的とするオンターゲット部位は、選択の上位近く（１５５３３種のうちの２８位）にランクした。１つのミスマッチまたは１つの挿入を有する配列は、最も濃縮されたライブラリーメンバーであった。上位スコアのＩ−ＰｐｏＩオフターゲット候補におけるミスマッチの位置分析により、認識モチーフにおける特定の位置が、他よりもＩ−ＰｐｏＩ切断に重要であることが明らかとなった（図２９）。特には、２、１３および１４番目は、高度に保存されており、Ｉ−ＰｐｏＩにより媒介されるＤＮＡ切断に最も重要であると思われた。ｉｎｖｉｔｒｏでの選択のホーミングエンドヌクレアーゼへの適応では、切断されて付着末端を曝露するもの（例えば、Ｉ−ＰｐｏＩおよびＣａｓ１２ａ）を含む、多様なヌクレアーゼのオフターゲットプロファイルの分析に、選択が、広範に使用可能であることを実証する。Ｉ−ＰｐｏＩは、既存の方法、例えば、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑまたはＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑによるオフターゲット検出の効率を低下させることが知られている、ＤＮＡ末端配置である、４ｂｐの３’オーバーハングを残す。したがって、発明者らは、ｉｎｖｉｔｒｏでの選択を使用して、ＤＮＡ切断端のねじれを誘導するヌクレアーゼを分析することができることを実証する。

主に、厳密に適合したオフターゲット候補は、選択の上位に濃縮された。しかし、選択では、Ｉ−ＰｐｏＩオフターゲット候補が大量に存在することを実証した。

方法：ライブラリー生成
高密度チップアレイ上でのオリゴヌクレオチドライブラリー合成をＡｇｉｌｅｎｔ社から購入した。

基質プロファイリングライブラリー：
１）５０％ＧＣ含量を有し、潜在的正準ＰＡＭ配列（化膿レンサ球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９のＮＧＧ）を有しない、オリゴヌクレオチド骨格を形成した。
２）少なくとも２つの置換を他のすべてのバーコードから除去し、４０〜６０％ＧＣであり、最小限に偏りがないライブラリーのいかなる正準ＰＡＭ配列をも含まない、１３〜１４塩基対のバーコードを生成した：
３）ＳｐＣａｓ９標的部位（これは変化し得る）の置換、挿入、および欠失の潜在的なすべての組合せについて潜在的オフターゲット部位を生成した：

４）全ｉ種のオフターゲット部位（Ｉ〜５０，０００種）のバーコード／潜在的オフターゲット部位を骨格に組み合わせた：
ＧＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴ（バーコードｉ）ＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＧＴ（潜在的オフターゲット部位ｉ）ＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＣＧＣＧＣＡＧＴＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡ（バーコードｉ）ＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＣ（配列番号１２７）

ゲノムに刺激されたライブラリー：
１）ＣａｓＯｆｆＦｉｎｄｅｒを用いて、以下の表（このようなパラメータは変化し得る）に従って潜在的オフターゲット部位を生成し、２０〜１１３ｂｐ（これは変化し得る）のゲノム隣接配列を加えた。

ＥＭＸ１部位では、上記のパラメータを所与として、存在する配列の数の例をここに示す。

２）最大のゲノム隣接構成を有する最小限に偏りがないライブラリーについて、全ｉ種のオフターゲット部位（ｉ〜５０，０００種）のバーコード／潜在的オフターゲット部位を骨格に組み合わせた：
ＧＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＧＴ（バーコードｉ）（隣接ゲノムコンテキストｉ）（潜在的オフターゲット部位ｉ）（隣接ゲノムコンテキストｉ）（バーコードｉ）ＴＧＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＣ（配列番号１２８）

定常骨格配列は、隣接ゲノムコンテキストが変化するにつれて増大させることができる。

例えば、１０ｂｐのゲノム隣接配列を両端に用いる：
ＧＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴ（バーコードｉ）ＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴ（隣接ゲノムコンテキストｉ）（潜在的オフターゲット部位ｉ）（隣接ゲノムコンテキストｉ）ＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＣＧＣＧＣＡＧＴＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡ（バーコードｉ）ＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＣ（配列番号１２９）

他のライブラリー生成戦略：
− 集団をベースとするＳＮＰをゲノム配列に組み込む
− コードするＤＮＡ配列のみに基づいてライブラリーを生成する
− 癌遺伝子ホットスポットまたは腫瘍抑制遺伝子である部位のライブラリーを生成する

以下は、上記の原理を使用して構築したオフターゲットライブラリーを使用する方法の例である。

切断されたライブラリーメンバーのｉｎｖｉｔｒｏでの選択のための方法
１．ライブラリー増幅
発明者らは、すべてのライブラリーメンバーに見出される定常隣接領域に結合させるプライマーを使用して、オリゴヌクレオチドライブラリーを増幅する。このようなプライマーは、追加の長さおよびユニークな分子識別子を導入する５’プライムオーバーハングを含む。ライブラリーは、５ｎＭのインプットライブラリー２μｌを使用した次のプロトコールを使用して増幅する。

２．ＤＮＡ精製：
製造者のプロトコールに従い、試料：ビーズ比０．９×でＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを用いたＤＮＡ精製。

３．酵素的インキュベーション：
変化する酵素濃度およびインキュベーション時間における、目的のタンパク質を用いたチップ合成ライブラリー３００ｎｇのインキュベーション。ほとんどの場合（Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ＨＦ、ＢＥ３、ＡＢＥ）では、これは、オリゴヌクレオチドライブラリー３００ｎｇについて、タンパク質、ｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ基質をそれぞれ１０：１０：１のモル濃度比で、活性バッファー中の酵素によるインキュベーションを１〜２時間実施するのに十分である。特定のタンパク質の機能に応じて、このようなパラメータを最適化する必要があり得る。

４．任意選択によるＤＮＡニッキング：
分析したタンパク質に応じて、酵素的インキュベーションにより、ＤＮＡ２本鎖切断端（ＤＳＢ）の生成が生じない可能性がある。ＢＥ３およびＡＢＥの場合では、両方の酵素によりＤＮＡの鎖が単にニッキングされ、一方、他方が塩基編集される。ＵＳＥＲ酵素またはエンドヌクレアーゼＶをＢＥ３およびＡＢＥにそれぞれ利用することにより、このＤＮＡニックをねじれたＤＳＢに変換することが可能となる（図８および９を参照）。これを達成するために、ステップ４のビーズ精製したＤＮＡを、ＵＳＥＲ酵素またはエンドヌクレアーゼＶとともに、これらそれぞれの活性バッファー中３７℃で１時間インキュベートする。

５．ＤＮＡ精製：
製造者のプロトコールに従い、試料：ビーズ比１．５×でのＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを用いたＤＮＡ精製。

６．任意選択によるＤＮＡ平滑末端化：
追加のニッキングステップ（５）が必要である場合、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いた７２℃で２０分間のインキュベーションにより、ねじれたＤＳＢを平滑末端化し、次いで、４℃まで冷却する。

７．ＤＮＡ精製：
製造者のプロトコールに従い、試料：ビーズ比１．５×でのＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを用いたＤＮＡ精製。

８．アダプターライゲーション：
次いで、半機能性Ｙ型アダプターをステップ７の平滑末端化ＤＮＡにライゲートする。これを達成するために、発明者らは、１０倍モル超過ライブラリー断片にアダプターを供給し、ＮＥＢクイックライゲーションキットを使用してライゲートして、反応物を２５℃で１０分間インキュベートする。

９．ゲル精製：
次いで、発明者らは、２．５％のアガロースゲルを利用することにより、ライゲーション反応物のゲル精製を実施する。電気泳動は、１２０ボルトで１時間実施する。１時間後、レーンを含む試料を、約１８０ｂｐの断片サイズに切り取り、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して、製造者のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出する。

１０．ＰＣＲ増幅：
引き続いて、ステップ９の溶出物を、２つのＰＣＲ反応のためのインプットとして使用し、これにより、切断ライブラリーメンバーのプロトスペーサー隣接およびＰＡＭ隣接部位を増幅する。このＰＣＲに使用するプライマーは、５’オーバーハングを含み、これを引き続き使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングバーコードを付加することができる。任意選択で、ＱＰＣＲを実施して、必要とされるＰＣＲサイクルの最小数を決定することができる。ＰＣＲは、次のパラメータを使用して実施する。

１１．ＤＮＡ精製：
製造者のプロトコールに従い、試料：ビーズ比１．５×でのＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを用いたＤＮＡ精製。

１２．キャピラリー電気泳動を使用した品質管理：
品質管理は、キャピラリー電気泳動によりＰＣＲ生成物を調べることによって実施する。

１３．ＰＣＲをベースとしたＮＧＳライブラリーの調製：
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターを含むプライマーを用いたＰＣＲを実施することにより、シーケンシングアダプターをステップ１２のＰＣＲ生成物に付加する。ＰＣＲは、次のパラメータを使用して実施する：

１４．ＤＮＡ精製：
製造者のプロトコールに従い、試料：ビーズ比１．５×でのＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズを用いたＤＮＡ精製。

１５．Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーについての次世代シーケンシング：
デジタルドロップレットＰＣＲによりステップ１４のＤＮＡライブラリーを定量し、製造者のプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーについてシーケンシングする。

プルダウンによるＤＮＡ結合部位の濃縮のための方法
１）ＳｎａｐＣａｐｔｕｒｅＢｅａｄｓ（ＮＥＢ社）を再懸濁する
２）ビーズ８０μＬを新たな１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにピペットで移す
３）磁気粒子分離器にチューブを置き、上清を廃棄する
４）固定化バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５）１ｍＬを加え、穏やかにボルテックスする
５）磁気粒子分離器にチューブを置き、上清を廃棄する
６）タンパク質を調製する：ＥｎｇｅｎＳｐｙｄＣａｓ９（ＳＮＡＰタグ）（ＮＥＢ社）（１プルダウン反応あたり２０μＭを４．５μＬ）を固定化バッファー５００μＬに加える
７）希釈したタンパク質をビーズに加え、ピペット操作により十分に混合する
８）室温で振盪しながら１時間インキュベートする
９）磁気粒子分離器にチューブを置き、上清を廃棄する
１０）ビーズを洗浄する。固定化バッファー１ｍＬを加え、ピペットで十分混合し、次いで、磁気粒子分離器にチューブを置き、上清を廃棄する
１１）ステップ１０をさらに２回反復し、合計３回洗浄する。１０μｇ／ｍＬのヘパリンを加えた固定化バッファーにより最後の洗浄を実施する
１２）１プルダウンあたり固定化バッファー４５μＬにビーズを再懸濁する
１３）以下を混合する

１４）２５℃で１０分間インキュベートする
１５）０．９ｐｍｏｌのライブラリーを加える
１６）３７℃で３０分間インキュベートする
１７）磁気ビーズ分離器にチューブを置き、上清を廃棄する
１８）１０μｇ／ｍＬのヘパリンを加えた固定化バッファー２００μＬによりビーズを５回洗浄する
１９）水５０μＬおよびプロテイナーゼＫを２μＬ加え、振盪しながら室温で１０分間インキュベートする
２０）ＤＮＡ精製ビーズ（例えば、Ａｍｐｕｒｅ）によりプルダウン生成物を精製し、０．１×バッファーＥＢ（ＱＩＡＧＥＮ社）１０μＬに溶出する

他の実施例
本発明は、この発明を実施するための形態とともに記載されているが、前述の記載は、例示を意図しており、添付の特許請求の範囲により定義される、本発明の範囲を制限しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および修飾形態は、以下の特許請求の範囲内に存在する。

Claims

酵素による切断、修飾、または結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の少なくとも２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つの５’および３’末端に存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）部位特異的ヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾タンパク質、およびＤＮＡ結合ドメインから選択される酵素の存在下、切断、修飾、または結合が生じるのに十分な条件下で、前記複数をインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）切断、修飾、または結合を受けるオリゴヌクレオチドを選択し、任意選択で、濃縮するステップと、
（ｉｖ）切断、修飾、または結合を受ける、選択された前記オリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、酵素による切断、修飾、または結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップと
を含む方法。
酵素による切断、修飾、または結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の最初の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）部位特異的ヌクレアーゼ、修飾タンパク質、およびＤＮＡ結合ドメインから選択される酵素の存在下、切断、修飾、または結合が生じるのに十分な条件下で、前記複数をインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）切断、修飾、または結合を受けないオリゴヌクレオチドを選択するステップと、
（ｉｖ）切断、修飾、または結合を受けない、選択された前記オリゴヌクレオチドの配列を決定するステップと、
（ｖ）切断、修飾、または結合を受けない、選択された前記オリゴヌクレオチドの配列を、既知の配列の事前濃縮した最初の前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列と比較するステップと
を含み、選択されなかった最初の前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドが、酵素による切断、修飾、または結合を受けるものと同定される、方法。
塩基編集酵素（例えば、デオキシシチジンをデオキシウリジンに変換するシチジンデアミナーゼ、またはデオキシアデニンをデオキシイノシンに変換するアデニン塩基編集酵素）による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）塩基編集酵素の存在下、修飾が生じるのに十分な条件下で、前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）編集された塩基対を正準塩基対の等量混合物に変換するポリメラーゼ（例えば、ｄＵ：ｄＧ塩基対をｄＴ：ｄＡおよびｄＣ：ｄＧ塩基対の等量混合物に、またはｄＩ：ｄＴ塩基対をｄＡ：ｄＴおよびｄＧ：ｄＣ塩基対の等量混合物に変換するウラシル許容性ポリメラーゼ）を用いて、ＤＮＡ合成において、前記オリゴヌクレオチドを増幅し（すなわち、この場合、ｄＡＴＰヌクレオチドが、ｄＵの向かい側に組み込まれるか、またはｄＣＴＰヌクレオチドが、ｄＩの向かい側に組み込まれる）、これにより、前記塩基編集酵素による修飾を受けたオリゴヌクレオチドが、処理前ライブラリー由来のオリジナルのバーコード結合配列の混合物として、および置換（例えば、ｄＣ−＞ｄＴまたはｄＡ−＞ｄＧ）を含む修飾配列としても増幅される、ステップと、
（ｉｖ）増幅した前記オリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、前記塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップと
を含む方法。
シチジンをウリジンに変換し、ニックを逆鎖に生成するシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）塩基編集酵素の存在下、修飾が生じるのに十分な条件下で、前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートし、次いで、ウリジンヌクレオチドを有する部位において１本鎖切断端（ニック）を生成する酵素の存在下で、前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートし、これにより、５’リン酸を有する２つのニックを両鎖に含むｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成し、これによりオーバーハングを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記オーバーハングから５’リン酸化平滑末端を生成するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼもしくはＰｈｕｓｉｏｎＵＤＮＡポリメラーゼ）とともに前記ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートするステップと、
（ｉｖ）プライマー配列を含む２本鎖ＤＮＡアダプターを有する前記リン酸化平滑末端を捕捉するステップと、
（ｖ）前記アダプターに対して特異的な１つのプライマーおよび前記共通配列骨格に対して特異的な１つのプライマーを使用して前記配列を増幅するステップと、
（ｖｉ）任意選択で、増幅の前または後に小型の切断断片についてサイズ選択を実施することにより追加の選択を実施するステップと、
（ｉｖ）増幅した前記オリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、前記塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップと
を含む方法。
デオキシアデニンをデオキシイノシンに変換し、ニックを逆鎖に生成するアデニン塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）塩基編集酵素の存在下、修飾が生じるのに十分な条件下で、前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートし、次いで、エンドヌクレアーゼＶ酵素の存在下で前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートして、イノシンヌクレオチドを有する部位において１本鎖切断端（ニック）を生成し、これにより、５’リン酸を有する２つのニックを逆鎖に含むｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成し、これによりオーバーハングを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記オーバーハングから５’リン酸化平滑末端を生成するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼもしくはＰｈｕｓｉｏｎＵＤＮＡポリメラーゼ）とともに前記ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートするステップと、
（ｉｖ）プライマー配列を含む２本鎖ＤＮＡアダプターを用いて前記リン酸化平滑末端をライゲートするステップと、
（ｖ）前記アダプターに対して特異的な１つのプライマーおよび前記共通配列骨格に対して特異的な１つのプライマーを使用して前記配列を増幅するステップと、
（ｖｉ）任意選択で、増幅の前または後に小型の切断断片についてサイズ選択を実施することにより追加の選択を実施するステップと、
（ｉｖ）増幅した前記オリゴヌクレオチドの配列を決定し、これにより、前記塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップと
を含む方法。
デオキシアデニンをデオキシイノシンに変換し、ニックを逆鎖に生成するアデニン塩基編集酵素、またはシチジンをウリジンに変換し、ニックを逆鎖に生成するシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素による修飾を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakarensis）由来のエンドヌクレアーゼＭＳ（ＴｋｏＥｎｄｏＭＳ）の存在下で、前記複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをインキュベートして、前記基質ＤＮＡの脱アミノ部位において２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導して、前記脱アミノ部位を中心とする１本鎖で５塩基対のオーバーハングの末端を有するＤＮＡ断片を生成するステップと、
（ｉｉｉ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを用いて前記ＤＮＡ断片を処理して、前記ＤＮＡ断片の末端からデオキシウラシル塩基を除去するステップと、
（ｉｖ）前記ＤＮＡ断片の末端を末端修復および／またはＡテーリングするステップと、
（ｖ）アダプターオリゴヌクレオチド（好ましくは、ハイスループットシーケンシングにおける使用のための配列を含む）を前記末端にライゲートするステップと、
（ｖｉ）前記ＤＮＡ断片をシーケンシングするステップと
を含む方法。
選択されたｇＲＮＡまたは別のＤＮＡ結合ドメインの存在下で、触媒的に不活性のＣａｓ９による結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定する方法であって、
（ｉ）既知の配列の複数の直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、各オリゴヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドの３’および５’の両末端またはこれらの付近にユニークな識別配列の２つのコピー、ならびに前記複数における前記オリゴヌクレオチドの１つ１つに存在する共通配列を有する、ステップと、
（ｉｉ）結合が生じるのに十分な条件下で、磁気ビーズに結合させた（例えば、共有結合または親和性ハンドルにより結合している）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ｓｇＲＮＡまたは別のＤＮＡ結合ドメインと複合したＣａｓ９酵素の存在下で、前記複数をインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ビーズプルダウンの１つまたは複数のセットにより、結合を受けるオリゴヌクレオチドを選択して任意選択で濃縮し、非結合分子の上清中への解離を促進する適切なバッファーにより洗浄した後、任意の結合したＤＮＡの解離を促進する適切なバッファー、またはビーズに結合したタンパク質を分解して結合したＤＮＡを遊離するプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫを含むバッファーのいずれかに、結合したＤＮＡを溶出するステップと、
（ｉｖ）選択された前記オリゴヌクレオチドの切断された配列を決定し、これにより、前記ＤＮＡ結合ドメインによる結合を受ける２本鎖ＤＮＡ配列を同定するステップと
を含む方法。
前記直鎖ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドが、
（ｉ）同定されたオンターゲット部位と比較して一定数までのミスマッチを有する参照ゲノムにおける、すべての潜在的オフターゲット配列のセット（ゲノムＤＮＡライブラリーに類似する）、
（ｉｉ）一定数までのミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位の包括的セット（ランダム塩基置換ライブラリーに類似する）、
（ｉｉｉ）規定された集団由来の変異ゲノムのセットに存在する潜在的オフターゲット配列のライブラリー（すなわち、個体集団に存在するＤＮＡ配列変異体を反映するようにデザインされたゲノムＤＮＡライブラリー）、または
（ｉｖ）潜在的オフターゲット部位（例えば、癌遺伝子ホットスポットまたは腫瘍抑制遺伝子由来の配列）の別の適切な規定されたセット
を含む、請求項１〜７に記載の方法。
事前濃縮した前記直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーが、例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上で個々の１本鎖ＤＮＡ配列として最初に合成され、前記１本鎖ＤＮＡ配列が、任意選択で、チップから遊離する前または後に、前記共通配列に対するプライミングにより２本鎖ＤＮＡ分子に変換される、請求項１〜７に記載の方法。
事前濃縮した前記直鎖ＤＮＡライブラリーのメンバーが、１）オンターゲット部位と比較して一定数までのミスマッチを有する参照ゲノムにおける、すべての潜在的オフターゲット配列のセット（ゲノムＤＮＡライブラリーに類似する）、２）一定数までのミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位の包括的セット（ランダム塩基置換ライブラリーに類似する）、３）規定された集団由来の変異ゲノムのセットに存在する潜在的オフターゲット配列のライブラリー（すなわち、個体集団に存在するＤＮＡ配列変異体を反映するようにデザインされたゲノムＤＮＡライブラリー）、または４）潜在的オフターゲット部位（例えば、癌遺伝子ホットスポットまたは腫瘍抑制遺伝子由来の配列）の他の適切な規定されたセットを表す、請求項１〜７に記載の方法。
事前濃縮した前記直鎖ＤＮＡライブラリーメンバーが、１，０００〜１０^１１塩基の異なる配列を含む、請求項１〜１０に記載の方法。
事前濃縮した前記直鎖ＤＮＡライブラリーメンバーが、５０〜５００ｂｐの長さの配列を含む、請求項１〜１１に記載の方法。