CN112159838B - 一种检测脱靶效应方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种检测脱靶效应方法及其应用。所述方法涉及一套可以检测CRISPR‑Cas脱靶效应的建库流程，内容包括转染试剂的更换，ODN序列的优化，Adaptors的改进，Primers的改善和PCR方法的简化，以及所述方法在CRISPR/Cas基因编辑***中的应用。一种检测CRISPR/Cas***脱靶效应的方法，可以实现低门槛，高通量，适合更多普通实验室使用，其测序仪器不再限制于Miseq，可以是通量更大的Hiseq或Novaseq平台。CRISPR/Cas基因编辑***脱靶效应检测方法可以实现各种CRISPR核酸酶(包括高保真等)的特异性检测。

Description

一种检测脱靶效应方法及其应用
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，具体涉及一种检测脱靶效应方法及其应用。
背景技术
CRISPR-Cas基因编辑工具是当前应用最热、最广的技术，在临床上具有无限的应用潜能。但其“脱靶”效应的存在，并由此可能引发的安全性问题，严重阻碍了该技术在临床上的进一步应用。为了评估CRISPR-Cas***基因编辑时在全基因组水平的“脱靶效应”，目前已有多种方法被开发，大概可以概括为以下几类：第一类，如BLESS/DSBCapture/BLISS/End-seq等；第二类，如Digenome-seq/SITE-seq/CIRCLE-seq/CHANGE-seq等；第三类，如Chip-seq/DISCOVER-Seq等；第四类，如WGS/GOTI-seq等；第五类，如IDLV Capture/GUIDE-seq/iGUIDE/TTISS等。这些方法各有优缺点，第一类可以直接反映细胞收集时的双链DNA断裂(DSB)情况，即可能的脱靶位点。但该类方法一般操作较复杂，耗时，需要对细胞进行固定，多次离心(易引入人为DSB)等步骤来最终完成样品制作；第二类为纯体外的DSB检测，将基因组DNA提取后进行核酸酶的消化，然后进行可能的脱靶分析，此方法容易得到假阳性结果，因为忽略基因组的空间结构及表观遗传学因素影响；第三类是通过捕捉DSB修复关键蛋白如γH2AX、MRE11等来间接反映DSB，它要求蛋白抗体有很高的特异性，容易丢失一些假阴性结果；第四类则通过全基因测序检测indel情况来反应脱靶，但其灵敏度较低。最后一类为通过转入外源性物质，如DNA等，来追踪检测其在基因组发生DSB时可能整合入基因组的位置，从而间接反映可能的脱靶位点。该方法操作相对简单，易于实施，灵敏度也较高。其中典型的代表便是GUIDE-seq，它还允许在活体细胞一段时间内监测细胞的DSB断裂累计情况。
目前，GUIDE-seq技术已被广泛应用于各类植物、动物及人细胞中进行CRISPR-Cas脱靶分析。虽然GUIDE-seq普适性较高，但它对实验平台和仪器具有较高的要求，需要具备LONZA核转染仪(4D)及超声波降解仪等，更重要的还需Illumina的Miseq平台及包一整条通道(lane)来测序以产生GUIDE-seq分析所需的Index1，Index2文件。而对于一些小型实验室或课题组，常因为缺少仪器或是测序平台等因素限制了GUIDE-seq技术的普及。
发明内容
本申请的第一个目的是提供一种新的，高通量，低门槛，经济实用、可商业化的无偏检测脱靶效应的方法。
为了达到上述目的，本申请所采用的技术方案为，一种检测脱靶效应方法，所述方法包括如下步骤：
1)对GUIDE-seq的ODN序列进行Tag更改；
2)对GUIDE-seq的转染试剂进行更改；
3)对Adaptors进行更改；
4)对基因组的打断进行更改；
5)对Tag标签序列的PCR引物进行更改；
6)将PCR样品进行多合一PCR。
本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤1)中对GUIDE-seq的ODN序列更改Tag后使得GC含量为45.7％。
本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤2)中更改后的转染试剂为阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI。
本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤3)中将Sample Barcode以及UMI设置于Read 1Primer之后。
本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤4)对基因组的打断由机器超声打断改为酶法处理，省去对机器设备的要求。
本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤5)中在Tag标签序列的PCR引物中预留可以用于识别非特异性扩增假阳性Reads问题的接头碱基。
本申请提供的另一种实施方式为：所述Tag的Read 2序列中Tag与基因组DNA接头还具有接头碱基GAT或CA特征。
本申请提供的另一种实施方式为：所述步骤3)中Adaptors包括引物和寡核苷酸。
本申请的第二个目的是提供一种检测脱靶效应方法应用，其特征在于，将权利要求1～7中所述的检测脱靶效应方法应用于检测细胞中脱靶情况。
本申请提供的另一种实施方式为：所述方法应用于在HEK293T及MCF7细胞中检测AsCpf1-Site6的脱靶情况。
本申请提供的另一种实施方式为：所述方法应用于在HEK239T细胞中检测野生型SpCas9、eSpCas9高保真版本和Cas9-HF高保真版本在基因位点EMX1的脱靶情况；
所述方法应用于在HEK239T细胞中检测另一类核酸酶AsCpf1和LbCpf1在基因位点CCR5中的脱靶情况。
所述方法应用于在HEK239T细胞中检测同时编辑25个sgRNA的脱靶情况，实现多基因多位点高通量脱靶检测。
与现有技术相比，本申请的优势在于：
本申请提供的检测脱靶效应方法，在基于GUIDE-seq基础上，开发了一种低门槛，经济实惠，可同时实现CRIPSR/Cas编辑技术多基因多位点高通量脱靶检测的方法。为CRISPR基因编辑技术的特异性检测提供更具普适性的方法，推动基因编辑技术的临床应用。
本申请提供的检测脱靶效应方法，既可用于检测CRISPR-Cas脱靶效应的建库流程，同时可适于优化该流程中所用到的转染试剂、ODN序列、Adaptors和Primers，以及简化PCR方法等，同时实现多基因多位点脱靶效应检测。另外，测序平台也不再局限于Miseq，可以是商业公司的Hiseq和Novaseq等高通量平台。，真正达到真正的低门槛，高通量，经济实惠，可商业化目的。
本申请提供的检测脱靶效应方法，为一种低门槛可商业化无偏检测脱靶效应方法。
附图说明
图1为本申请的Tag-seq工作流程示意图；
图2为本申请的PEI转染浓度5，10，20，40nM的ODN/Tag效率检测示意图；
图3为本申请的同时转入10nM的ODN和Tag在编辑位点CCR5，Site6，EMX1，CTLA4等基因整合效率检测示意图；
图4为本申请的Tag-seq的Adaptors改进模式图；
图5为本申请的Tag-seq的PCR Primers改进模式图；
图6为本申请的Tag-seq的PCR方法优化改进模式图；
图7为本申请的Tag-seq在HEK293T和MCF7检测AsCpf1-Site6位点的脱靶情况示意图；
图8为本申请的Tag-seq分别使用Normal PCR和All in one PCR方法在HEK293T检测AsCpf1-CCR5位点的脱靶情况示意图；
图9为本申请的应用Tag-seq在HEK293T和MCF7中检测EMX1位点的脱靶情况示意图；
图10为本申请的Tag-seq在HEK293T细胞中检测野生型Cas9和高保真核酸酶eCas9,Cas9-HF对EMX1位点编辑的脱靶情况示意图；
图11为本申请的Tag-seq在HEK293细胞中检测AsCpf1和LbCpf1对CCR5位点编辑的脱靶情况示意图；
图12为本申请的Tag-seq在HEK239T细胞中检测同时编辑25个sgRNA的脱靶情况示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请做进一步详细的说明，但本申请并不限于以下实施例。除非特别说明，下面实施例中所用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术，所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
参见图1～12，本申请提供一种检测脱靶效应方法，所述方法包括如下步骤：
1)对GUIDE-seq的ODN序列进行Tag更改；
2)对GUIDE-seq的转染试剂进行更改；
3)对Adaptors进行更改；
4)对基因组的打断进行更改；
5)对Tag标签序列的PCR引物进行更改；
6)将PCR样品进行多合一PCR。
进一步地，所述步骤1)中对GUIDE-seq的ODN序列更改Tag后使得GC含量为45.7％。
进一步地，所述步骤2)中更改后的转染试剂为阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI。
进一步地，所述步骤3)中将Sample Barcode及UMI位于Read 1Primer之后。
进一步地，所述步骤4)对基因组的打断由机器超声打断改为酶法处理，省去对机器设备的要求。
进一步地，所述步骤5)中在Tag标签序列的PCR引物中预留可以用于识别非特异性扩增假阳性Reads问题的接头碱基。
进一步地，所述Tag的Read 2序列中Tag与基因组DNA接头还具有接头碱基GAT或CA特征。
进一步地，所述步骤3)中Adaptors包括引物和寡核苷酸。
本申请还提供一种检测脱靶效应方法应用，将权利要求1～7中所述的检测脱靶效应方法应用于检测细胞中脱靶情况。
进一步地，所述方法应用于在HEK293T和MCF7细胞中检测AsCpf1-Site6以及Cas9-EMX1的脱靶情况。
进一步地，所述方法应用于在HEK239T细胞中检测野生型SpCas9、eSpCas9高保真版本和Cas9-HF高保真版本在基因位点EMX1的脱靶情况以及另一类核酸酶AsCpf1和LbCpf1在基因位点CCR5中的脱靶情况。
进一步地，所述方法应用于在HEK239T细胞中检测同时编辑25个sgRNA的脱靶情况，实现同时多基因多位点高通量脱靶检测。
1、Tag-seq方法原理：在活细胞体内过量转入一段已知序列寡核苷酸DNA(即标签Tag)，当核酸酶诱导基因组双链断裂时，由于胞内存在大量Tag DNA片段，DNA修复机制之一非同源末端连接(NHEJ)有可能将此Tag片段整合进基因组DNA中，通过寻找Tag序列在基因组中的***位置便可确定曾经发生基因组DNA断裂位点，即可能的潜在脱靶位点。其工作流程示意图如图1所示。
1)ODN序列及转染试剂的优化改进：
原GUIDE-seq的ODN序列：
F:P-G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T；
R:P-A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C
其GC含量26.5％，为了改善GC含量偏低问题我们进行更改Tag(GC＝45.7％)：
Tag-F：P-A*T*CTCTGAGCCTTATGCGAAATGCGTGTTATCG*C*A；
Tag-R：P-T*G*CGATAACACGCATTTCGCATAAGGCTCAGAG*A*T
注：P表示磷酸化修饰；*表示硫代磷酸酯键修饰。
另外，原GUIDE-seq所用转染试剂为LONZA Kit(4D)的核转试剂，该试剂费用较高，而且需要专属的LONZA核转染仪器(4D)来实现质粒的转染表达。为了实现经济实惠、低门槛目的，本方法对转染试剂进行了更换(替换为阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI，一种普通实验室常用转染试剂)，结果如图2所示，在293T细胞中使用1μg/ml的PEI作为转染介质，梯度浓度5，10，20，40nM的ODN或Tag对转染效率呈不同程度影响，其中10nM浓度效果基本与未转ODN/Tag时效率等同，图2，表明该浓度不影响PEI的转染效率，选取为最佳的实施浓度。
进一步深度测序结果表明，相比于ODN的基因组整合，Tag***基因组效率更高，而且不像ODN具有明显的***偏向性，图3。
2)Adaptors的改进：
原GUIDE-seq测序仪器为Miseq平台，其Sample Barcode及UMI(unique molecularidentifier)设计位于Read 1Primer之前，这样一来需要进行额外的操作以及手动设置来产生数据分析所需的Index1，Index2文件。为解决这个问题，设计Sample Barcode及UMI位于Read 1Primer之后，这样一来，Sample Barcode及UMI可以直接从Read 1序列中直接获取而不需要额外的Index文件提供，如图4所示。测序平台不再局限于Miseq，可以适配到商业公司的Hiseq和Novaseq等高通量平台，同时也可实现散样测序。Adaptors具体序列见附加1(实验所用到的全部引物及寡核苷酸)。
3)PCR Primers的改善：
原GUIDE-seq PCR引物设计并不能区分由引物直接结合基因组DNA引起的非特异性扩增(假阳性Reads)问题，为了解决这个问题，对Tag标签序列的PCR引物进行改进，预留了可以用于识别非特异性扩增假阳性Reads问题的接头碱基，如图所示，在Tag-seq的Read2序列中Tag与基因组DNA接头应还具有接头碱基GAT或CA等特征。
4)PCR方法的简化：
原GUIDE-seq PCR，在进行第二轮PCR时需要对第一轮PCR产物进行纯化，这对于多样品操作显得非常繁琐。对此，对PCR方法进行了改进，省略中间纯化步骤，将PCR样品进行多合一PCR(All in one)，如图所示，以求省时、简便目的。
2.Tag-seq具体操作及流程如下：
(1)Tag寡核苷酸和Adaptors退火：
Tag-F 10μl(100μM)
Tag-R 10μl(100μM)
TE buffer 80μl
将上述样品混合均匀置于PCR仪器中，热盖104℃，95℃5min，slow ramp down(0.1℃/S)4℃hold。Store in-20℃
(2)Adaptors退火：
Adapter-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNWNNWNNTAGATCGCACTACTAATACGAC*T
Adapter-2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNWNNWNNCTCTCTATACTACTAATACGAC*T
Adapter-3:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNWNNWNNTATCCTCTACTACTAATACGAC*T
Adapter-4:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNWNNWNNAGAGTAGAACTACTAATACGAC*T
Adapter-R:GTCGTATTAGTA*G*T(*表示硫代磷酸酯键修饰)
Adaptor-X 10μl(100μM)(X＝1,2,3,4…)
Adaptor-R 10μl(100μM)
TE buffer 80μl
将上述样品混合均匀置于PCR仪器中，热盖104℃，95℃for 1s，60℃for 1s，slowramp down(0.1℃/S)4℃hold。Store in-20℃
(3)操作流程：
①细胞转染(293T或MCF7细胞，24孔板为例子，培养基500μl)：
a.转染前一天，用胰酶消化生长状态良好的对数期HEK293T/MCF7细胞，并接种于24孔板中，待细胞贴壁密度达到70％-80％时进行PEI(Sigma)转染操作，体系如下：
Figure BDA0002713683650000071
将A液与B液混匀，室温静置10min后，加到细胞培养上清中。
b.隔天行细胞换液，之后72h收集细胞并应用血液基因组DNA提取试剂盒(天根)按照其说明书操作提取基因组DNA，最后溶于TE buffer并用核酸仪进行浓度测定。
②取基因组DNA 800ng行Fragmentation,End Preparation&dA-tailing等步骤，然后加入2μl退火好的Adapter-X进行Adapter Ligation连接反应，最后将产物应用0.7×DNA beads进行纯化并溶于20μl l TE buffer。具体操作步骤如下(以下所有步骤必须于冰盒上操作)：
a.Fragmentation,End Preparation&dA-tailing一步法反应(Vazyme,ND617)
DNA 800ng
FEA buffer 5μL
加水至 40μL
将上述样品混合均匀后，立即加入FEA Enzyme Mix 10μl，置于PCR仪中，热盖104℃,37℃5min，60℃30min，4℃hold。
b.Adapter Ligation反应(Vazyme,ND617)
Figure BDA0002713683650000072
将上述样品混合均匀后，置于PCR仪中，热盖104℃，20℃40min，4℃hold。
c.将最终产物应用0.7倍的Hieff NGSTM DNA Selection Beads(YEASEN)按照说明书进行纯化，最后产物洗脱于20μl的TE buffer中。
③Tag-seq Library构建：
将20μl纯化DNA产物各取10ul分别进行Library(L)及Library(R)构建，PCR具体条件如下：
引物：
P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Tag-L-F1：CGCTTCTCGATAACACGCATTTCGCATAAG
Tag-R-F1：CGCTTATTCTGAGCCTTATGCGAAATGCGT
1st PCR：
Figure BDA0002713683650000081
1st PCR条件(30μL体系)：
94℃for 5min,
14cycles of[94℃30s,68℃(-1℃/cycle)2min,68℃30s],
9cycles of[94℃30s,55℃1min,68℃30s],
68℃5min,4℃hold.
2nd PCR:直接在1st PCR的产物中加入以下混合物
引物：
P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Tag-L-F2：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGCATTTCGCATAAGGCTCAGA
Tag-R-F2：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTATGCGAAATGCGTGTTATCG
P7-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-3:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-4:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-5:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-6:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Figure BDA0002713683650000091
2nd PCR条件(50μL体系)：
94℃for 5min,
14cycles of[94℃30s,68℃(-1℃/cycle)2min,68℃30s],
9cycles of[94℃for 30s,55℃1min,68℃30s],
68℃5min,4℃hold
将最终PCR产物应用0.7倍的Hieff NGSTM DNA Selection Beads(YEASEN)按照说明书进行纯化，最后产物洗脱于12μl的TE buffer中。
④将Library送至公司应用Hiseq/Novaseq平台进行PE 150测序.
(4)Tag-seq数据生物信息学分析。
a.Read1(R1)的分析：R1序列中含sample barcode(用于多样品区分)和UMI(用于PCR重复扩张的去重)。
b.Read2(R2)的分析：R2含Tag序列，用于确定***基因组位置，即潜在脱靶位置。其中存在以下4种情况：Library(L)中，Tag正向***和反向***；Library(R)中，Tag正向***和反向***。
(5)潜在脱靶的确定如下：
a.该位点不存在于Control库中；
b.该位点出现上述4种情况种最少2种；
c.该位点的前后50bp与目标sgRNA具有一定相似性(少于7个mismatch)
符合以上条件方确定为潜在的脱靶位点，进一步应用Deep-seq进行验证。
方法验证例子1：
在HEK293T细胞中检测AsCpf1的Site6脱靶情况，分别应用Tag-seq的Normal PCR和All in one PCR方法应用Hiseq和Novaseq平台测序1G,2G,3G Raw data/Library分析比较脱靶情况。结果表明，在293T细胞中Normal和All in one方法都能成功检测出AsCpf1-Site6的脱靶效应，而且位点相当，脱靶位点测出能力随着测序深度增加提高。另外，将Allin one PCR方法及Hiseq/Novaseq平台测序3G Raw data/Library应用MCF7细胞的同样位点site6也得到类似相当结果图，充分证实了方法的有效性及重现性。
进一步，将All in one PCR方法及Hiseq/Novaseq平台测序1G Raw data/Library应用于细胞系HEK293T的CCR5位点中也证实Normal和All in one方法具有相当的检测能力，图8。
以上结果表明，Tag-seq是一种相对简便，经济实用、可商业化，无偏检测脱靶效应的方法。
方法验证例子2：
为了验证方法的普适性，选择另一种常用核酸酶Cas9以及另一个常用测试位点EMX1进行考究，结果表明，应用All in one PCR方法应用Novaseq平台测序3G Raw data/Library，无论在HEK293T还是MCF7都可以成功检测EMX1的脱靶位点，这与已经报道的结果是一致的，图9。
Tag-seq方法应用实例1：
应用优化的Tag-seq方法检测CRIPSR***的特异性问题，选择HEK239T细胞中检测，野生型SpCas9和两种高保真版本(eSpCas9和Cas9-HF)在基因位点EMX1的脱靶情况，结果野生型SpCas9存在明显的脱靶位点，而当使用高保真的eSpCas9或Cas9-HF后，其脱靶效应明显消失，这与之前报道的结果是相符合的，提示Tag-seq的可行性及有效性。
Tag-seq方法应用实例2：
进一步，应用Tag-seq方法检测另一类核酸酶Cpf1的特异性问题，以验证其普适性。选择HEK239T细胞中检测，AsCpf1和LbCpf1对临床疾病治疗潜在基因CCR5敲除的特异性，结果表明，与已有的报道相一致，AsCpf1对基因的编辑能力稍微弱于LbCpf1，但是其脱靶效应相对较低，成功证实Tag-seq技术具有很好的临床应用性。
Tag-seq方法应用实例3：
进一步，应用Tag-seq方法检测同时编辑25个sgRNA的脱靶情况，证实其可实现多基因多位点高通量脱靶效应检测。在HEK293T细胞同时转入AsCpf1核酸酶和靶向PD1，CTLA4，SIRPa，CD47，CCR5，CXCR4，EMX1，DNMT1，RUNX1，HBG，MYOD，IL1RN等基因的多位点(共25个，具体见图12)，结果表明，应用Tag-seq技术可以实现同时检测这些位点的脱靶效应情况，证实Tag-seq具有高通量检测脱靶效应特性。
图7中由于脱靶太多，位点未完全列出。
作为技术可行性的验证，选取了基因Cas9-EMX1,AsCpf1-SITE6等常用位点进行方法学验证，作为技术应用的测试选择高保真核酸酶特异性的评估，而作为技术高通量特性应用测试，选择同时靶向25个位点进行脱靶效应检测。实验过程包括一系列的步骤，建库、测序、结果分析等，最后可视化展示与靶sgRNA的相似性来确定脱靶位点。结果表明，该方法简单方便、灵敏度高，而且试剂仪器要求较低，同时可以应用在当前主流Hiseq、Novaseq等高通量测序平台，并且也可以实现个体样品的检测，真正实现了低门槛，高通量，经济实惠，可商业化目的。
本申请中序列里的*表示相应位置的磷酸戊糖骨架是硫代修饰的，为了提高DNA的稳定性。
以上仅是本申请的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本申请的限制，本申请的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> 一种检测脱靶效应方法及其应用
<130> CP120010171C
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atctctgagc cttatgcgaa atgcgtgtta tcgca 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcgataaca cgcatttcgc ataaggctca gagat 35
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcttctcga taacacgcat ttcgcataag 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagacgtgtg ctcttccgat ctcgcatttc gcataaggct caga 44
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgcttattct gagccttatg cgaaatgcgt 30
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagacgtgtg ctcttccgat ctcttatgcg aaatgcgtgt tatcg 45
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtcgtattag tagt 14
<210> 8
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
wnnwnntaga tcgcactact aatacgact 89
<210> 9
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
wnnwnnctct ctatactact aatacgact 89
<210> 10
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
wnnwnntatc ctctactact aatacgact 89
<210> 11
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
wnnwnnagag tagaactact aatacgact 89
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agatctagta cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agatttctgc ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caagcagaag acggcatacg agatgctcag gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caagcagaag acggcatacg agataggagt ccgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agatcatgcc tagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66

Claims (2)

1.一种检测脱靶效应方法，其特征在于，所述方法包括细胞转染，对所述转染细胞基因组DNA进行提取，采用所述提取的DNA构建Tag-seq文库，分析所述Tag-seq文库的生物信息找出潜在脱靶位点；
①细胞转染：
a.转染前一天，用胰酶消化生长状态良好的对数期HEK293T/MCF7细胞，并接种于孔板中，待细胞贴壁密度达到70％～80％时进行阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI转染操作，体系如下：
Figure FDA0003637983020000011
其中，Tag的核苷酸序列为：
Tag-F：P-A*T*CTCTGAGCCTTATGCGAAATGCGTGTTATCG*C*A；
Tag-R：P-T*G*CGATAACACGCATTTCGCATAAGGCTCAGAG*A*T
其中，P表示磷酸化修饰；*表示硫代磷酸酯键修饰；
将A液与B液混匀，室温静置10分钟后，加到细胞培养上清中；
b.隔天进行细胞换液之后72小时，收集细胞并应用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA后，溶于TE buffer并用核酸仪进行浓度测定；
②取基因组DNA 800ng：
a.进行Fragmentation,End Preparation&dA-tailing一步法反应，体系如下：
DNA 800ng
FEA buffer 5μL
加水至 40μL
将上述样品混合均匀后，立即加入FEA Enzyme Mix 10μl，置于PCR仪中进行反应；
b.进行Adapter Ligation反应，体系如下：
Figure FDA0003637983020000021
将上述样品混合均匀后，置于PCR仪中进行反应；
c.将最终产物进行纯化，最后产物洗脱于20μl的TE buffer中；
③Tag-seq文库构建：
将纯化DNA产物分别进行文库-L及文库-R构建，PCR具体条件如下：
引物：
P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Tag-L-F1：CGCTTCTCGATAACACGCATTTCGCATAAG
Tag-R-F1：CGCTTATTCTGAGCCTTATGCGAAATGCGT
进行第一轮PCR，体系如下：
Figure FDA0003637983020000022
进行第二轮PCR:直接在第一轮PCR的产物中加入以下混合物
引物：
P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
Tag-L-F2：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGCATTTCGCATAAGGCTCAGA
Tag-R-F2：CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTATGCGAAATGCGTGTTATCG
P7-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-3:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-4:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-5:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
P7-6:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
第二轮PCR体系如下：
Figure FDA0003637983020000031
将最终PCR产物进行纯化，最后产物在TE buffer中洗脱；
④对文库进行PE 150测序；
Tag-seq数据生物信息学分析；
a.Read1-R1的分析：R1序列中含sample barcode，用于多样品区分，R1序列中含UMI，用于PCR重复扩张的去重；
b.Read2-R2的分析：R2含Tag序列，用于确定***基因组位置，即潜在脱靶位置；其中存在以下4种情况：文库-L中，Tag正向***和反向***；文库-R中，Tag正向***和反向***；
潜在脱靶位点的确定如下：
a.被检测位点不存在于Control库中；
b.被检测位点出现所述4种情况中2种以上；
c.被检测位点的前后50bp与目标sgRNA比对少于7个碱基错配；
符合以上条件则确定为潜在的脱靶位点，进一步应用Deep-seq进行验证。
2.一种检测脱靶效应方法应用，其特征在于，将权利要求1中所述的检测脱靶效应方法应用于检测细胞中脱靶情况；
所述方法应用于在HEK293T及MCF7细胞中检测AsCpf1-Site6的脱靶情况；
所述方法应用于在HEK239T细胞中检测野生型SpCas9、eSpCas9和Cas9-HF高保真版本在基因位点EMX1的脱靶情况；
所述方法应用于在HEK239T细胞中检测另一类核酸酶AsCpf1和LbCpf1在基因位点CCR5中的脱靶情况。
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Shengdar Q Tsai等.GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.《Nature biotechnology》.2015,第33卷(第2期), *

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