CN114293264A - 酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于其步骤包括：采用随机切口酶Nt.CviPII对样本DNA目标序列的PAM区域进行切口；含BbsI酶切位点的接头磁珠连接片段化的DNA；BbsI切割释放DNA；随机引物延伸；连接含MmeI酶切位点的sgRNA骨架；MmeI切割释放原间隔区域；连接T7启动子序列；扩增获得含T7启动子的sgRNA文库模板；体外转录获得sgRNA文库。本发明的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，可以一次性制备随机覆盖目标区域的所有sgRNA组，具有成本低、制作简单、覆盖均一、偏好性小、不受靶序列长度限制和无需大批量设计sgRNA等优点，在靶基因的捕获和去除上具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
CRISPR基因编辑技术自从被开发出来就被广泛应用在基因治疗、体外诊断、基因捕获和靶基因去除等各个领域，并获得2020年诺贝尔生理医学奖，是一种高效且实用的技术。实用型CRISPR***主要有两个部分组成，一个是具有两个核酸内切酶活性位点的Cas蛋白，负责切割靶位点DNA的两条链；另一个是具有与靶位点处DNA配对序列和Cas蛋白结合序列的引导RNA(sgRNA)，负责募集Cas蛋白并引导Cas蛋白结合到互补配对的靶位点上。在CRISPR***中，Cas蛋白先与sgRNA结合形成Cas-sgRNA复合物，并在DNA上进行检索。当检索到与sgRNA互补配对的区域(原间隔区域，ProtoSpacer)，并且ProtoSpacer区域的3’端存在NGG序列(PAM序列)时，Cas蛋白将靶位点进行解旋，使得解开的双链DNA进入到Cas蛋白的DNA切割活性结构域，Cas蛋白对双链DNA进行切割，产生双链DNA断裂。断裂的DNA通过同源重组修复HR或者非同源末端连接NHEJ等DNA损伤修复方式完成靶基因的编辑。目前用于商业化应用的Cas蛋白主要有Cas9、Cas12、Cas13和Cas14及其变体，不同的Cas蛋白识别的PAM序列和要求，ProtoSpacer的长度也不同。因此，不同的CRISPR***的具有不同的应用场景。
除Cas蛋白的纯化和制备外，sgRNA的体外构建和合成也是CRISPR商业化应用的重要环节。常规的方法需要利用引物合成的方式合成含T7启动子的靶标sgRNA引物，再利用重叠PCR获得全长sgRNA骨架模板，并利用体外转录的方法获得需要的sgRNA。这种方法耗时短、成本低、可控性高，已经大规模商业化，成为sgRNA体外制备的主要形式，但仍存在通量低的问题。基因捕获或者去除通常需要对大区域的基因组进行捕获或者去除，需要覆盖长度达1M bp甚至整个完整的基因组DNA。这需要设计和合成千万级别条数的sgRNA。在sgRNA的设计合成上，无论成本还是技术都是很大的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法。
本发明采取的技术方案为：一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)采用随机切口酶Nt.CviPII处理样本DNA，Nt.CviPII对目标序列的PAM区域进行切口获得片段化的双链DNA，对双链DNA进行变性处理，获得片段化的单链DNA，所述的变性处理采用常规的高温变形即可；
(2)在步骤(1)的反应体系中加入含BbsI酶切位点的接头磁珠，接头的3’端连接片段化的单链DNA；
(3)将磁珠连接的DNA采用BbsI酶切割，释放出单链DNA；
(4)随机引物延伸，使单链DNA形成双链DNA；
(5)在双链DNA的3’端上连接含有MmeI酶切位点的sgRNA骨架；
(6)采用MmeI切割步骤(5)的连接产物，释放原间隔区域；
(7)在原间隔区域上的5’端连接T7启动子序列；
(8)扩增获得含T7启动子的sgRNA文库模板；
(9)体外转录获得sgRNA文库。
优选的，所述样本DNA为基因组DNA、PCR产物或者DNA文库。
优选的，步骤(2)中接头磁珠的接头正向序列为/biotin/-TTTTTGAAGA，反向序列为/NH2C6/-NNNNNNNHGGTCTTCAAAAA-/NH2C6/，两个序列在等摩尔浓度下进行退火，磁珠为链亲和霉素磁珠。
优选的，步骤(2)中采用T4 DNA连接酶或者E.coli DNA连接酶将片段化的DNA连接到接头上。
优选的，步骤(4)的随机引物为6碱基随机引物，延伸采用Klenow DNA聚合酶。
优选的，步骤(5)的sgRNA骨架为两条单链DNA互补配对形成的双链DNA，其中正向序列为/rApp/-NNNCGGTTGGAGCTAGAAATAGCAAGTCAACCTAACGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-/NH2C6/；反向序列为/NH2C6/-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCGTTAGGTTGACTTGCTATTTCTAGCTCCAACC-/ddG/。
优选的，步骤(5)中使用T4 DNA连接酶突变体K159L连接sgRNA骨架与双链DNA。
优选的，步骤(7)采用T4 DNA连接酶，T7启动子正向序列为/NH2C6/-TTCTAATACGACTCACTATAGGNN，反向序列为/ddC/-CTATAGTGAGTCGTATTAGAA-/NH2C6/。
优选的，步骤(8)的扩增反应采用的引物对的正向序列为TTCTAATACGACTCACTATAGG，反向序列为AAAAGCACCGACTCGGTGCC。
优选的，步骤(9)采用T7 RNA聚合酶进行转录，采用RNA回收磁珠回收sgRNA文库。
本发明的有益效果为：
本发明的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法ERSP(Enzymatical RandomsgRNA Preparation)，可以一次性制备随机覆盖目标区域的所有sgRNA组。ERSP的原理和流程如下：使用随机切口酶Nt.CviPII对目标序列的PAM区域进行切口；DNA变性，磁珠连接含BbsI识别位点的接头；BbsI切割，释放DNA；连接含MmeI的sgRNA骨架；MmeI切割，获得原间隔区域序列；连接T7启动子；扩增获得带T7启动子的sgRNA文库；体外转录获得靶序列sgRNA文库。ERSP具有成本低、制作简单、覆盖均一、偏好性小、不受靶序列长度限制和无需大批量设计sgRNA等优点，在靶基因的捕获和去除上具有重要的应用价值。
附图说明
图1 ERSP技术的原理和流程示意图。
图2不同Nt.CviPII投入量对DNA片段化的影响。左边泳道是0.5U，中间泳道是1U，右边泳道是2U。
图3连接sgRNA骨架后的DNA电泳图。左边是18S/28S DNA，右边是人全基因组DNA。
图4 ERSP构建18S/28S DNA(左)和人全基因组DNA(右)的全覆盖sgRNA库的扩增产物电泳图。
图5 ERSP构建18S/28S DNA(左)和人全基因组DNA(右)的全覆盖sgRNA库的扩增产物体外转录制备sgRNA库电泳图。
图6 18S rRNA的DNA上Nt.CviPII酶切位点分布情况(阴影区域)。
图7 18S/28S ERSP库在CRISPR去除rRNA上是效果检测。
图8人全基因组ERSP库在CRISPR去除人类宿主基因组上的效果检测。
具体实施方式
为了进一步描述使本发明的具体内容，以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例所涉及的操作方法及试剂为业内技术人员所熟知，应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用于对发明进行详细说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。本实施例所使用的接头序列及修饰如表1所示，N为A、T、C、G中的任意碱基。ERSP的流程如图1所示。
表1接头序列及修饰
实施例1：ERSP的流程
(1)制备含Bbs接头的磁珠
BbsI-F和BbsI-R用100mM NaCl溶解成100μM，等摩尔浓度混合后，95℃反应5min，每分钟降低1℃。反应结束后，用水将退火好的接头稀释至10μM。取20μL稀释好的接头，加入5μL链霉亲和素磁珠C1(Thermo)，室温旋转混合30min。100mM NaCl清洗磁珠3次。
(2)识别PAM序列的限制酶切割：
表2限制酶酶切体系
| 组分 | 用量 |
| 人基因组DNA | 1μg |
| 10×rCutSmart buffer | 1μL |
| Nt.CviPII(NEB) | 0.5-2U |
| 补水至 | 10μL |
37℃反应30min，98℃反应10min，立即置于冰上。不同Nt.CviPII投入量对DNA片段化的影响如图2所示。
表3含BbsI酶切位点的接头磁珠连接
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 10μL |
| 50％PEG8000 | 8μL |
| 10×T4 Ligase Reaction Buffer | 5μL |
| 补水至 | 50μL |
将配制含的反应体系重悬磁珠，加入2000U T4 DNA Ligase(NEB)混匀后，20℃连接1h，每3min震荡15s，转速为1000rpm/min。反应结束后，100mM NaCl清洗磁珠3次。按照说明书配制BbsI(NEB)反应体系30μL(10U)，重悬磁珠，37℃消化1h，每3min震荡15s，转速为1000rpm/min。反应结束后，取上清。94℃反应10min，立即置于冰上。
表4随机引物延伸体系
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 30μL |
| 1mM N6 | 1μL |
| 10×NEBuffer<sup>TM</sup>2 | 3μL |
| Klenow fragment(NEB) | 10U |
| 补水至 | 60μL |
37℃反应20min。60℃反应5min。
(3)含旁切活性限制酶酶切位点的sgRNA骨架连接。
骨架退火：sg-F和sg-R用100mM NaCl溶液溶解至100μM，等摩尔浓度混合后，95℃反应5min，每分钟降低1℃。反应结束后，用水将退火好的骨架稀释至10μM。
表5骨架连接体系
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 60μL |
| 10μM sgRNA骨架接头 | 5μL |
| 10×T4 Ligase Reaction Buffer | 5μL |
| 50％PEG8000 | 10μL |
| T4 DNA Ligase(K159L) | 2000U |
| 补水至 | 100μL |
20℃反应30min。反应结束后，加入50μL Ampure DNA beads回收DNA。22μL水洗脱。DNA凝胶回收140bp以上的序列。连接sgRNA骨架后的DNA电泳图如图3所示。
(5)MmeI酶切
表6
37℃反应2h。反应结束后，加入70μL Ampure DNA beads回收DNA。42μL水洗脱。
(6)T7启动子连接。
接头退火：T7-F和T7-R用100mM NaCl溶液溶解至100μM，取10μL T7-F和10μL T7-R于PCR管中。95℃反应5min，每分钟降低1℃。反应结束后，用水将退火好的接头稀释至10μM。
表7接头连接体系：
| 组分 | 用量 |
| 上述回收的DNA | 40μL |
| 10μM T7接头 | 5μL |
| 10×T4 Ligase Reaction Buffer | 5μL |
| T4 DNA Ligase | 2000U |
| 补水至 | 50μL |
20℃反应1h。反应结束后，加入22.5μL Ampure DNA beads回收DNA，去除掉未连接的接头。22μL水洗脱。
(5)sgRNA库扩增
表8 sgRNA库扩增体系
| 组分 | 用量 |
| 上述回收的DNA | 20μL |
| 10μM sgPCR-F/R | 5μL |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix | 25μL |
| 补水至 | 50μL |
在98℃变性3min后，通过98℃10s变性、60℃20s退火和72℃10s延伸进行文库循环扩增。扩增产物使用70μL Ampure DNA beads进行回收，22μL DEPC水洗脱。扩增产物电泳图如图4所示。
(6)sgRNA库体外转录
表9
37℃反应4h后，加入10U DNase I(TAKARA)，37℃反应1h。加入50μL Ampure RNAbeads(Beckman)回收RNA。琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA大小。
扩增产物体外转录制备sgRNA库电泳图如图5所示。
实施例2：ERSP在rRNA和宿主基因组去除上的应用。
在本实施例中，我们先按照实施例1中的ERSP方法，以人RNA为模板制备了覆盖18SrRNA和28S rRNA的随机sgRNA库；以人基因组DNA为模板，制备了覆盖人类基因组DNA的随机sgRNA库，简称ERSP库，并应用在rRNA去除和宿主基因组去除上。具体实施方式如下：
表10 sgRNA库与Cas9蛋白预组装：
| 组分 | 用量 |
| ERSP库 | 2-10μg |
| Cas9(NEB) | 0.2-0.5μg |
| 500mM氯化钠 | 1μL |
| 总体积 | 5μL |
37℃30min。
表11 CRISPR切割
| 组分 | 用量 |
| Cas9-sgRNA库 | 5μL |
| RNA或DNA文库 | 1-100ng |
| 10×NEB buffer 3.1 | 1μL |
| 总体积 | 10μL |
37℃30-90min，90℃10min。
(5)文库扩增
表12
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 10μL |
| Index Primer F/R(Yeasen,12610) | 5μL |
| 2×Canace PCR mix | 25μL |
| 补水至 | 50μL |
在98℃变性3min后，通过98℃10s变性、60℃30s退火和72℃30s延伸进行文库循环扩增。扩增产物使用45μL Ampure DNA beads进行回收，22μL DEPC水洗脱。
制备好的文库经过Qsep100质检后，在Illumina的NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。
Nt.CviPII酶切位点在18S rRNA上具有广泛的随机分布(见图6)。
RNA建库测序结果如图7所示，ERSP方法制备的sgRNA文库能够有效去除18S和28SrRNA。DNA建库测序结果如图8所示，ERSP方法制备的sgRNA文库能够有效去除DNA建库过程中的人类宿主基因组DNA。
综上，本发明公布了一种酶法靶序列随机sgRNA的制备方法ERSP(EnzymaticalRandom sgRNA Preparation)，可以一次性制备随机覆盖目标区域的所有sgRNA组。ERSP的原理和流程如下：使用随机切口酶Nt.CviPII对目标序列的PAM区域进行切口；DNA变性，磁珠连接含BbsI识别位点的接头；BbsI切割，释放DNA；连接含MmeI的sgRNA骨架；MmeI切割，获得原间隔区域序列；连接T7启动子；扩增获得带T7启动子的sgRNA文库；体外转录获得靶序列sgRNA文库。ERSP具有成本低、制作简单、覆盖均一、偏好性小、不受靶序列长度限制和无需大批量设计sgRNA等优点，在靶基因的捕获和去除上具有重要的应用价值。
Claims (10)
1.一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)采用随机切口酶Nt.CviPII处理样本DNA，Nt.CviPII对目标序列的PAM区域进行切口获得片段化的双链DNA，对双链DNA进行变性处理，获得片段化的单链DNA；
(2)在步骤(1)的反应体系中加入含BbsI酶切位点的接头磁珠，接头的3’端连接片段化的单链DNA；
(3)将磁珠连接的DNA采用BbsI酶切割，释放出单链DNA；
(4)随机引物延伸，使单链DNA形成双链DNA；
(5)在双链DNA的3’端连接含有MmeI酶切位点的sgRNA骨架；
(6)采用MmeI切割步骤(5)的连接产物，释放原间隔区域；
(7)在原间隔区域的5’端连接T7启动子序列；
(8)扩增获得含T7启动子的sgRNA文库模板；
(9)体外转录获得sgRNA文库。
2.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于：所述样本DNA为基因组DNA、PCR产物或者DNA文库。
3.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(2)中接头磁珠的接头正向序列为/biotin/-TTTTTGAAGA，反向序列为/NH2C6/-NNNNNNNHGGTCTTCAAAAA-/NH2C6/，两个序列在等摩尔浓度下进行退火，磁珠为链亲和霉素磁珠。
4.根据权利要求3所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(2)中采用T4 DNA连接酶或者E.coli DNA连接酶将片段化的DNA连接到接头上。
5.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(4)的随机引物为6碱基随机引物，延伸采用Klenow DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(5)的sgRNA骨架为两条单链DNA互补配对形成的双链DNA，其中正向序列为/rApp/-NNNCGGTTGGAGCTAGAAATAGCAAGTCAACCTAACGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-/NH2C6/；反向序列为/NH2C6/-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCGTTAGGTTGACTTGCTATTTCTAGCTCCAACC-/ddG/。
7.根据权利要求6所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(5)中使用T4 DNA连接酶连接sgRNA骨架与双链DNA。
8.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(7)采用T4 DNA连接酶，T7启动子的正向序列为/NH2C6/-TTCTAATACGACTCACTATAGGNN，反向序列为/ddC/-CTATAGTGAGTCGTATTAGAA-/NH2C6/。
9.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(8)的扩增反应采用的引物对的正向序列为TTCTAATACGACTCACTATAGG，反向序列为AAAAGCACCGACTCGGTGCC。
10.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(9)采用T7 RNA聚合酶进行转录，采用RNA回收磁珠回收sgRNA文库。
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