CN111893170B

CN111893170B - 一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法

Info

Publication number: CN111893170B
Application number: CN202010788603.8A
Authority: CN
Inventors: 谢红娴; 兰凯; 程欢; 黄龙
Original assignee: Zhuhai Shutong Medical Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Shutong Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2040-08-07
Also published as: CN111893170A

Abstract

一种在全基因组范围内体外检测CRISPR‑Cas脱靶效应的方法，本发明涉及一种在全基因组范围内体外检测CRISPR‑Cas脱靶效应的方法。本发明的目的是为了解决现有脱靶位点检测时存在假阳性位点以及DNA起始加入量大的问题，本发明随机打断基因组DNA，然后连接茎环接头1，使用核酸外切酶消化单侧连接接头1和未连接接头的线性DNA，剩余的DNA片段用ddNTP封闭。用Cas酶切割DNA，暴露新的DNA断端并连接线性接头2，用链霉亲和素磁珠捕获连接接头2的DNA，用巢式PCR构建NGS文库进行illumina双端测序及生物信息学分析。本发明方法真阳性脱靶位点检出率高。本发明应用于生物技术领域。

Description

一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法

技术领域

本发明涉及一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法。

背景技术

CRISPR-Cas***源自细菌及古生菌的获得性免疫***，由于操作简单高效而成为一种强大的基因编辑工具。该***由sgRNA和Cas蛋白形成RNP复合物，在sgRNA的引导下通过protospacer和PAM(the protospacer adjacent motif)两个区域的序列特异性相互作用识别并结合目标DNA，并由Cas核酸酶靶向剪切该目标DNA，实现对DNA的定点编辑。Protospacer区域通过目标DNA与sgRNA 5’端的20nt spacer区域互补配对并结合；而PAM的识别则通过Cas蛋白C端的氨基酸残基与目标DNA直接相互作用来实现。Cas蛋白耐受protospacer和PAM的碱基错配识别导致了CRISPR-Cas***出现脱靶效应，即切割与靶向序列类似的非靶点区域的DNA序列。

CRISPR-Cas***发挥作用依赖DNA双链断裂(DNAdouble-strand breaks，DSB)的产生。细胞修复DSB时可能引入***或缺失突变(indels)，甚至更大范围的染色体重排。因此，在全基因组范围内检测CRISPR-Cas***的脱靶位点及其突变频率是非常必要的，尤其是在CRISPR-Cas***被广泛用于生物技术应用的情况下。例如基因编辑应用于人类疾病治疗中，完整的脱靶位点分析可以帮助避免采用可能引起不良临床结果的的sgRNA。

现有多种实验技术用于在全基因组范围进行脱靶位点检测，可大致分为两类：1.基于细胞转染技术的脱靶检测方法，包括GUIDE-seq、BLESS、HTGTS、DISCOVER-seq等；2.不依赖细胞技术，体外检测的方法，包括Digenome-seq、SITE-seq和CIRCLE-seq。每种技术均有其局限性。

基于细胞转染技术的体内脱靶检测方法对于不易转染的细胞系缺乏可操作性。GUIDE-seq依赖供体序列dsODN整合入基因组，HTGTS依赖染色体易位，二者均受细胞系DNA修复特异性和时效性、目标位点特异性、细胞周期等因素的影响，同时因切割位点处dsODN未整合或未发生染色体易位而遗漏突变频率低于0.1％的脱靶位点。DISCOVER-Seq利用ChIP-seq的手段检测Cas酶切割后产生的DSB修复因子MRE11在切割位点的富集，从而获取切割位点信息。但是由于Cas酶并不是在同一时间内切割不同位点，而是有时间先后顺序，导致同一时间点MRE11因子富集的差异使检测结果不能真实反映全部切割位点。另外，由于细胞内本身也存在不少的非Cas酶切割产生的DSB，这部分DSB成为了其检测的假阳性位点。

与体内脱靶检测方法相比，体外检测脱靶的方法具有潜在的优势。使用纯化的组分试剂进行体外实验，提高了检测的可重复性，避免了细胞转染效率及细胞修复对检测的影响。另外，体外实验中可大幅度提高sgRNA及Cas酶的浓度，有利于检测出低频突变位点。目前有3种体外全基因组范围脱靶检测的方法，最早的Digenome-seq检测方案是Cas酶体外切割目标DNA，对所有游离断端(无论是否由Cas酶切割产生的DSB)进行加接头处理，高通量全基因组测序后分析出由Cas酶切割产生的在靶和脱靶位点。该方法需要很高的测序深度，有大量非Cas酶切割产生的随机背景信号，缺乏全面检测包含低频位点在内的全部脱靶位点的灵敏度，不适合用于大批量筛选sgRNA。随后出现的SITE-seq检测方案为尽量消除非Cas酶切割产生的DSB，采用高分子量基因组DNA作为Cas酶切割底物，对切割后的基因组DNA进行生物素标记、富集、测序并比对得到全面的切割位点信息。该方法所需的测序深度较Digenome-seq明显下降，但缺点在于高分子量基因组DNA只能来源于新鲜组织和细胞，提取困难，DNA完整性难以保证，在提取DNA过程中可能会产生大量的DSB，最终导致分析结果的假阳性率高。与SITE-seq同期出现的CIRCLE-seq检测方案通过环化DNA作为Cas酶切割底物的方法去除背景DSB。该方法对打断的基因组DNA连接一特殊的发夹样接头后酶切茎环结构，再使用DNA连接酶将DNA首尾自身连接成环状，之后采用Cas酶体外切割该环状DNA，线性化的DNA加测序接头后形成可测序文库进行测序比对。这一脱靶检测方案的缺点在于环化效率低，故而建库需要的基因组DNA起始入量大(25ug)，大大限制了该检测方法在难以培养的原代细胞和珍贵临床标本检测中的应用，另一方面，未能成环的DNA无法彻底去除导致了分析结果中假阳性位点的存在。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有脱靶位点检测时存在假阳性位点以及DNA起始加入量大的问题，提供一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法。

本发明一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，按以下步骤进行：一、收集4-8×10⁶个细胞至离心管，离心，弃去培养基，PBS洗涤一次，再离心，弃去PBS，提取离心后固相物的细胞基因组DNA；二、将步骤一提取的基因组DNA打断成为500bp片段并纯化，然后以DNA纯化磁珠进行纯化；三、对步骤二纯化的DNA进行末端修复、加A尾、加茎环结构接头1，然后采用核酸外切酶处理，再使用ddNTP处理；四、采用Cas酶对步骤三的DNA进行体外切割；五、对体外切割后的DNA进行末端修复、加A尾、加线性接头2，线性接头2的5’端带有生物素修饰；六、将链霉亲和素磁珠混匀，然后加入1×Bind and wash buffer室温旋转混匀洗涤，离心，去除上清，重复洗涤、离心、去除上清3次，利用2×Bind and washbuffer重悬链霉亲和素磁珠，然后加入步骤五处理后的DNA，室温旋转混匀，置于磁力架，去除上清，得到链霉亲和素磁珠吸附的DNA；七、利用USER酶处理链霉亲和素磁珠吸附的DNA，切开接头1的茎环结构，然后以USER酶处理后的DNA为模版，进行回收PCR扩增，然后进行索引PCR，得到待上机文库，进一步进行文库质检及测序；茎环结构接头1核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示；线性接头2的Forward序列如序列表Seq ID No：2所示，线性接头2的Reverse序列如序列表Seq ID No：3所示。

本发明的有益效果为：

本发明与基于细胞转染技术的脱靶检测方法相比，不受细胞系DNA修复特异性和时效性、目标位点特异性、细胞周期等因素的影响，对于不易转染的细胞系仍具备可操作性。

与SITE-seq方法相比，简化了基因组提取方案，无需繁琐的长片段DNA提取；AID-seq方案的起始DNA入量仅为CIRCLE-seq方法的1/5，对于难以培养的原代细胞和珍贵临床标本检测具备可操作性。

本发明经过茎环接头连接、核酸外切酶消化、ddNTP封闭三个步骤处理，尽可能去除Cas酶体外切割底物中可能存在的DSB，有效降低测序结果中的假阳性位点，提高脱靶检测的特异性。

本发明以链霉亲和素磁珠捕获接头2的生物素修饰，将Cas酶切割后连接接头2的DNA自未被切割、未连接接头2、无法测序的背景DNA中分离，有效降低无用数据占比，提高脱靶检测的灵敏度。经验证本发明方法真阳性脱靶位点检出率高。

附图说明

图1为实施例1中HEK293基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，M：marker；

图2为实施例1中Qsep仪检测文库片段分布图；

图3为实施例1中采用AID-seq方法检测人HEK293细胞SITE1 sgRNA的脱靶位点图；

图4为实施例1中针对人HEK293细胞SITE1 sgRNA的脱靶位点Venn图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，按以下步骤进行：一、收集4-8×10⁶个细胞至离心管，离心，弃去培养基，PBS洗涤一次，再离心，弃去PBS，提取离心后固相物的细胞基因组DNA；二、将步骤一提取的基因组DNA打断成为500bp片段并纯化，然后以DNA纯化磁珠进行纯化；三、对步骤二纯化的DNA进行末端修复、加A尾、加茎环结构接头1，然后采用核酸外切酶处理，再使用ddNTP处理；四、采用Cas酶对步骤三的DNA进行体外切割；五、对体外切割后的DNA进行末端修复、加A尾、加线性接头2，线性接头2的5’端带有生物素修饰；六、将链霉亲和素磁珠混匀，然后加入1×Bindand wash buffer室温旋转混匀洗涤，离心，去除上清，重复洗涤、离心、去除上清3次，利用2×Bind and wash buffer重悬链霉亲和素磁珠，然后加入步骤五处理后的DNA，室温旋转混匀，置于磁力架，去除上清，得到链霉亲和素磁珠吸附的DNA；七、利用USER酶处理链霉亲和素磁珠吸附的DNA，切开接头1的茎环结构，然后以USER酶处理后的DNA为模版，进行回收PCR扩增，然后进行索引PCR，得到待上机文库，进一步进行文库质检及测序；茎环结构接头1核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示；线性接头2的Forward序列如序列表Seq ID No：2所示，线性接头2的Reverse序列如序列表Seq ID No：3所示。

本实施方式步骤一中采用Nanodrop测量DNA浓度大于50ng/μl。

本实施方式茎环结构接头1及线性接头2的合成方法：茎环结构接头1序列：/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGTTTAATTGAGTTGTCUATATGTTAATAACGGTATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T

线性接头2Forward序列：

/5Biotin/GTTGACATGCTGGATTGAGACTTCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T

线性接头2Reverse序列：

GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGGAAGTCTCAATCCAGCATGTCAAC

/5Phos/代表5’端磷酸化修饰；*代表3’端硫甙磷酸酯键修饰；/5Biotin/代表5’端生物素化修饰。交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，HPLC方式纯化。

茎环结构接头1及线性接头2的按下述反应体系退火：

退火程序：95℃5min；-1℃/min×70cycles；

制备成40uM接头1、5uM接头2备用，存放于-20℃。

本实施方式与基于细胞转染技术的脱靶检测方法相比，不受细胞系DNA修复特异性和时效性、目标位点特异性、细胞周期等因素的影响，对于不易转染的细胞系仍具备可操作性。

本实施方式经过茎环接头连接、核酸外切酶消化、ddNTP封闭三个步骤处理，尽可能去除Cas酶体外切割底物中可能存在的DSB，有效降低测序结果中的假阳性位点，提高脱靶检测的特异性。

本实施方式以链霉亲和素磁珠捕获接头2的生物素修饰，将Cas酶切割后连接接头2的DNA自未被切割、未连接接头2、无法测序的背景DNA中分离，有效降低无用数据占比，提高脱靶检测的灵敏度。经验证本实施方式方法真阳性脱靶位点检出率高。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二利用仪器Bioruptor进行DNA打断，参数：DNA 50ng/uL；体积100uL；15sON-90sOFF；6-8次循环；打断后的DNA以DNA纯化磁珠进行纯化，洗脱体积37uL。其他与具体实施方式一相同。

本实施方式采用Qubit测量DNA浓度>27ng/uL。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤三中采用DNA建库试剂盒进行DNA末端修复、加A尾、加茎环结构接头1，其中DNA末端修复、加A尾的具体反应体系及反应程序如下：

反应程序：20℃30min；65℃30min，得到末端修复混合物；

加茎环结构接头1的具体反应体系及反应程序如下：

反应程序：22℃1h，然后1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积30uL。其他与具体实施方式一或二相同。

本实施方式DNA建库试剂盒为ABclonal快速DNA建库试剂盒。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中核酸外切酶酶切的反应体系和程序如下：

反应程序：37℃2h；75℃10min，然后用1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积44uL。其他与具体实施方式一至三之一相同。

本实施方式中10×Exonuclease I Buffer、Lambda Exonuclease、ExonucleaseI、ExonucleaseⅢ均购买自NEB公司。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：ddNTP处理的反应体系和程序：

反应程序：75℃，30min；然后用1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积25uL，Qubit测量DNA浓度>6.4ng/uL。其他与具体实施方式一至四之一相同。

本实施方式中10×Thermopolbuffer、Therminator DNA polymerase购买自NEB公司，ddATP购买自罗氏。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四Cas酶体外切割的反应体系和程序如下：

反应程序：室温结合10min，然后加入步骤三处理后的DNA 250ng，以无酶水补齐体积至50uL，37℃孵育1h，再用50uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积37uL。其他与具体实施方式一至五之一相同。

本实施方式10×Cas9 Nuclease Reaction Buffer、Cas9 Nuclease,S.pyogenes购买自NEB公司。体外转录的gRNA的方法为：合成转录模版的DNA序列，然后使用NEB-EnGensgRNA Synthesis Kit按说明书体外转录SITE1 sgRNA，Monarch RNA Cleanup Kit按说明书纯化SITE1 sgRNA，洗脱体积20uL。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤五采用DNA建库试剂盒进行DNA末端修复、加A尾、加线性接头2；DNA末端修复、加A尾的具体反应体系及反应程序如下：

反应程序：20℃反应30min；65℃反应30min，得到末端修复混合物；

加线性接头2的具体反应体系及反应程序如下：

反应程序：22℃反应1h，然后用1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积41uL。其他与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤六中USER酶处理的方法为，加入向步骤五中的DNA中加入USER酶，在37℃下反应30min，然后置于磁力架2min，去除上清，加入10mM Tris-HCl室温旋转混匀洗涤5min，置于磁力架2min，去除上清，共用10mM Tris-HCl洗涤2次；然后加入20uL 10mMTris-HCl重悬。其他与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤七中回收PCR反应体系及反应程序如下。

反应程序：98℃45s；12cycles of(98℃15s,61℃30s,72℃2min),72℃2min,4℃保持，然后置于磁力架2min，将上清转移至新Ep管，取3uL上清液加水稀释50倍备用。其他与具体实施方式一至八之一相同。

本实施方式KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(2x)购买自罗氏。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤七中索引PCR的反应体系和程序：

反应程序：98℃45s；12cycles of(98℃15s,60℃30s,72℃2min),72℃2min,4℃保持，0.7×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积50uL，0.6×-0.2×DNA纯化磁珠双端筛选，洗脱体积20uL，得到200-600bp的DNA文库。其他与具体实施方式一至九之一相同。

本实施方式KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(2x)购买自罗氏。

为验证本发明的有益效果进行了以下实验：

实施例：人HEK293细胞CRISPR/Cas9基因编辑SITE1 sgRNA脱靶位点检测

靶点序列+PAM：GGGAAAGACCCAGCATCCGT+GGG

实施过程：

1、合成接头1序列5OD，接头2Forward、Reverse序列各1OD，以10mMTris-HCl溶解至浓度为100uM，并在200uLPCR管中配置如下体系，退火程序95℃5min；-1℃/min×70循环，制备成40uM接头1、5uM接头2备用，分装存放于-20℃。

2、收集5×^6个HEK293细胞提取细胞基因组DNA，Nanodrop测量DNA浓度为为192ng/μL，质量9.6ug。

3、取5ugHEK293基因组DNA，10mMTris-HCl补齐体积至100uL，Bioruptor参数15sON-90sOFF；8cycles，打断HEK293 DNA为500bp片段并以100uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积37uL，Qubit测量DNA浓度为82ng/μL，质量3.034ug。DNA片段分布见图1，琼脂糖凝胶电泳显示HEK293基因组DNA打断至500bp。M：marker；HEK293genome：HEK293基因组DNA；HEK293500bp：Bioruptor打断仪处理后DNA。

4、将打断后全部DNA进行DNA末端修复、加A尾、加茎环结构接头1、纯化，具体反应体系及反应程序如下。

HEK293 DNA(3.034ug)	37uL
		EndPrep Buffer	10uL
EndPrepEnzymes	3uL
		总体积	50uL

反应程序：20℃30min；65℃30min；

上述末端修复mix	50uL
		LigaseMM	16.5uL
接头1(40μM)	7.5uL
		LigaseMix	3uL
总体积	77uL

反应程序：22℃1h；

以77uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积30uL，Qubit测量DNA浓度为106ng/μL，质量3.18ug。

5、将上述DNA分为4份，每份7.5uL，795ng，加10mMTris-HCl补齐体积至34uL，配置如下反应体系，按4个反应进行核酸外切酶处理。

反应程序：37℃2h；75℃10min，每个反应以50uL DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积44uL。

6、配置如下反应体系，按4个反应进行ddNTP处理。

10×Thermopolbuffer	5uL
		ddATP(10mM)	0.5uL
Therminator DNA polymerase	0.5uL
		步骤5得到的DNA	44uL
总体积	50uL

反应程序：75℃30min；每个反应以50uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积10uL。纯化后Qubit测量DNA浓度为6.75ng/μL，总质量270ng。

7、合成序列A:5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGGGAAAGACCCAGCATCCGTGTTTTAGAGCTAGA-3’，以10mMTris-HCl溶解至浓度为1uM，使用NEB-EnGensgRNA Synthesis Kit按说明书体外转录SITE1 sgRNA，Monarch RNACleanup Kit按说明书纯化SITE1 sgRNA，洗脱体积20uL，Qubit测量浓度为790ng/uL，即24.56uM，取1uLSITE1 sgRNA，加入10mMTris-HCl 7.19uL稀释至3uM。配置如下Cas酶体外切割反应体系。

反应程序：室温结合10min

加入步骤6DNA 250ng，以无酶水补齐体积至50uL，37℃孵育1h，然后用50uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积37uL。

8、DNA末端修复、加A尾、加线性接头2、纯化。具体反应体系及反应程序如下。

步骤7处理后的DNA	37uL
		EndPrep Buffer	10uL
EndPrepEnzymes	3uL
		总体积	50uL

反应程序：20℃30min；65℃30min

上述末端修复mix	50uL
		LigaseMM	16.5uL
接头2(5μM)	8uL
		LigaseMix	3uL
总体积	77.5uL

反应程序：22℃1h，然后用77.5uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积41uL，置于4℃备用。

9、将链霉亲和素磁珠自4℃取出混匀，1×B&W buffer室温旋转混匀洗涤5min，置于磁力架2min，去除上清，共洗涤3次，2×B&W buffer 41uL重悬链霉亲和素磁珠。向链霉亲和素磁珠中加入步骤9DNA混合，室温旋转混匀30min，置于磁力架2min，去除上清。1×B&Wbuffer室温旋转混匀洗涤5min，置于磁力架2min，去除上清，共洗涤2次；10mMTris-HCl室温旋转混匀洗涤5min，置于磁力架2min，去除上清，洗涤1次。47uL10mMTris-HCl重悬。

10、在步骤9DNA中加入3uLUSER酶(1U/uL)，37℃30min。置于磁力架2min，去除上清，10mMTris-HCl室温旋转混匀洗涤5min，置于磁力架2min，去除上清，共洗涤2次。20uL10mMTris-HCl重悬。

11、RecoveryPCR反应体系及反应程序如下。

反应程序：98℃45s；12cycles of(98℃15s,61℃30s,72℃2min),72℃2min,4℃hold。置于磁力架2min，将上清转移至新Ep管，取3uL上清液加水稀释50倍备用。其中RecoveryPCR引物序列：Forward：GGAGTTCAGACGTGTGCTC

Reverse：GTTGACATGCTGGATTGAGACTTC

交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，HPLC方式纯化。

12、稀释RecoveryPCR产物，并进行IndexingPCR，反应体系及反应程序如下。

反应程序：98℃45s；12cycles of(98℃15s,60℃30s,72℃2min),72℃2min,4℃hold

文库纯化：28uLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积50uL；文库片段大小筛选：30uL-10uLDNA纯化磁珠双端筛选，洗脱体积20uL，Qubit测量文库浓度9.13ng/uL。本实施例中10×Exonuclease I Buffer、Lambda Exonuclease、Exonuclease I、ExonucleaseⅢ、10×Thermopolbuffer、Therminator DNA polymerase、10×Cas9 Nuclease Reaction Buffer、Cas9 Nuclease,S.pyogenes均购买自NEB公司。ddATP、KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(2x)购买自罗氏。

13、文库质检及测序。文库片段分布见图2。文库测序可视化结果见图3。与CIRCLE-seq、SITE-seq方法的脱靶检测结果比较见图4。由图2可知，Qsep仪检测文库片段分布，见文库片段集中于492bp处。图3采用AID-seq方法检测人HEK293细胞SITE1sgRNA的脱靶位点。在靶序列显示在顶部第一行，下方显示脱靶的切割位点序列，与目标序列不匹配的碱基以彩色高亮。AID-seq测序的reads数显示在每个位点序列的右侧。图4针对人HEK293细胞SITE1sgRNA的脱靶位点，AID-seq与其他两种体外脱靶检测方法的比较。Venn图中显示了AID-seq与CIRCLE-seq、SITE-seq捕获的重叠位点数，且AID-seq方法捕获的脱靶位点个数最多。

序列表

<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司

<120>一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法

<160>7

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>茎环结构接头1的核苷酸序列。

<400> 2

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacgtttaat tgagttgtcu atatgttaat 60

aacggtatgt gactggagtt cagacgtgt gctcttccga tc*t 103

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>线性接头2Forward的核苷酸序列。

<400> 3

gttgacatgc tggattgaga cttcctacac tctttcccta cacgacgctc ttccgatc*t 59

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>线性接头2Reverse的核苷酸序列。

<400> 3

gatcggaaga gcgtcgtgta gggaaagagt gtaggaagtc tcaatccagc atgtcaac 58

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶点序列+PAM的核苷酸序列。

<400> 4

gggaaagacc cagcatccgt +ggg 23

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成序列A。

<400> 5

ttctaatacg actcactata ggggaaagac ccagcatccg tgttttagag ctaga 55

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> RecoveryPCR的正向引物核苷酸序列。

<400> 6

ggagttcaga cgtgtgctc 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> RecoveryPCR的反向引物核苷酸序列。

<400> 7

gttgacatgc tggattgaga cttc 24

Claims

1.一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、收集4-8×10⁶个细胞至离心管，离心，弃去培养基，PBS洗涤一次，再离心，弃去PBS，提取离心后固相物的细胞基因组DNA；二、将步骤一提取的基因组DNA打断成为500bp片段并纯化，然后以DNA纯化磁珠进行纯化；三、对步骤二纯化的DNA进行末端修复、加A尾、加茎环结构接头1，然后采用核酸外切酶处理，再使用ddNTP处理；四、采用Cas酶对步骤三的DNA进行体外切割；五、对体外切割后的DNA进行末端修复、加A尾、加线性接头2，线性接头2的5’端带有生物素修饰；六、将链霉亲和素磁珠混匀，然后加入1×Bind and washbuffer室温旋转混匀洗涤，离心，去除上清，重复洗涤、离心、去除上清3次，利用2×Bindand wash buffer重悬链霉亲和素磁珠，然后加入步骤五处理后的DNA，室温旋转混匀，置于磁力架，去除上清，得到链霉亲和素磁珠吸附的DNA；七、利用USER酶处理链霉亲和素磁珠吸附的DNA，切开接头1的茎环结构，然后以USER酶处理后的DNA为模版，进行回收PCR扩增，然后进行索引PCR，得到待上机文库，进一步进行文库质检及测序；茎环结构接头1核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示；线性接头2的Forward序列如序列表Seq ID No：2所示，线性接头2的Reverse序列如序列表Seq ID No：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于步骤二利用仪器Bioruptor进行DNA打断，参数：DNA 50ng/μL；体积100μL；15sON-90sOFF；6-8次循环；打断后的DNA以DNA纯化磁珠进行纯化，洗脱体积37μL。

3.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于步骤三中采用试剂盒进行DNA末端修复、加A尾、加茎环结构接头1，其中DNA末端修复、加A尾的具体反应体系及反应程序如下：

试剂盒：ABclonal快速DNA建库试剂盒

反应程序：20℃30min；65℃30min，得到末端修复混合物；

加茎环结构接头1的具体反应体系及反应程序如下：

反应程序：22℃1h，然后1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积30μL。

4.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于步骤三中核酸外切酶酶切的反应体系和程序如下：

反应程序：37℃2h；75℃10min，然后用1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积44μL。

5.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于ddNTP处理的反应体系和程序：

反应程序：75℃，30min；然后用1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积25μL，Qubit测量DNA浓度>6.4ng/μL。

6.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于步骤四Cas酶体外切割的反应体系和程序如下：

反应程序：室温结合10min，然后加入步骤三处理后的DNA250ng，以无酶水补齐体积至50μL，37℃孵育1h，再用50μLDNA纯化磁珠纯化，洗脱体积37μL。

7.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于步骤五采用DNA建库试剂盒进行DNA末端修复、加A尾、加线性接头2；DNA末端修复、加A尾的具体反应体系及反应程序如下：

反应程序：22℃反应1h，然后用1×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积41μL。

8.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于步骤六中USER酶处理的方法为，加入向步骤五中的DNA中加入USER酶，在37℃下反应30min，然后置于磁力架2min，去除上清，加入10mM Tris-HCl室温旋转混匀洗涤5min，置于磁力架2min，去除上清，共用10mM Tris-HCl洗涤2次；然后加入20μL 10mMTris-HCl重悬。

9.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于回收PCR反应体系及反应程序如下：

反应程序：98℃45s；98℃15s，61℃30s，72℃2min，12个循环；72℃2min，4℃保持，然后置于磁力架2min，将上清转移至新Ep管，取3μL上清液加水稀释50倍备用。

10.根据权利要求1所述的一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法，其特征在于索引PCR的反应体系和程序：

反应程序：98℃45s；98℃15s，60℃30s，72℃2min，12个循环；72℃2min,4℃保持，0.7×DNA纯化磁珠纯化，洗脱体积50μL，0.6×-0.2×DNA纯化磁珠双端筛选，洗脱体积20μL，得到200-600bp的DNA文库。