JP6940117B2 - オンターゲットおよびオフターゲットの多標的システムを用いた標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法およびその利用 - Google Patents
オンターゲットおよびオフターゲットの多標的システムを用いた標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法およびその利用 Download PDFInfo
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Description
WO2015−123339
WO2014−093661
WO2014−204724
KR10−2016−0058703
2. Anderson, E.M.ら、2015年、Systematic analysis of CRISPR−Cas9 mismatch tolerance reveals low levels of off−target activity、J. Biotechnol. 211、56−65
3. Frock, R.L.ら、2015年、Genome−wide detection of DNA double−stranded breaks induced by engineered nucleases、Nat. Biotechnol. 33(2)、179−186
4. Bauer, D.E.ら、2015年、Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9、J. Vis. Exp. 95
5. Brinkman, E.K.ら、2014年、Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition、Nucleic Acids Res. 42(22)、e168
6. Cho, S.W.ら、2014年、Analysis of off−target effects of CRISPR/Cas−derived RNA−guided endonucleases and nickases、Genome Res. 24 (1)、132−141
7. Christian, M.ら、2010年、Targeting DNA double−strand breaks with TAL effector nucleases、Genetics 186 (2)、757−761
8. Cradick, T.J.ら、2013年、CRISPR/Cas9 systems targeting β−globin and CCR5 genes have substantial off−target activity、Nucleic Acids Res. 41 (20)、9584−9592
9. Crosetto, N.ら、2013年、Nucleotide−resolution DNA double−strand break mapping by next−generation sequencing、Nat. Methods 10 (4)、361−365
10. Dahlem, T.J.ら、2012年、Simple methods for generating and detecting locus−specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome、PLoS Genet. 8 (8)、e1002861
11. Doench, J.G.ら、2016年、Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off−target effects of CRISPR−Cas9、Nat. Biotechnol. 34 (2)、184−191
12. Fu, Y.ら、2013a、High frequency off−target mutagenesis induced by CRISPR−Cas nucleases in human cells、Nat. Biotechnol. 31 (9)、822−826
本明細書で用いる場合、「標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステム」という用語は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するのに用いられる組成物およびキット、これを用いるための方法、ならびにそれらのプロセスの間に誘導される様々な中間体の全てを含む概念を指す。
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムまたは組成物であって、
i)標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ii)1つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステムまたは組成物を提供する。
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムまたは組成物であって、
i)標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ii)1つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、1つのオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステムまたは組成物を提供する。
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムまたは組成物であって、
i)標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ii)1つの選択要素を含む複数標的であって、1つのオンターゲットおよび1つのオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステムまたは組成物を提供する。
「標的特異的ヌクレアーゼ」という用語は、所望の(標的のまたは標的とする)ゲノムにおける核酸(DNAまたはRNA)の特定の位置を認識および切断することが可能なヌクレアーゼを指す。本発明において、標的特異的ヌクレアーゼはまた、特定のヌクレアーゼに所望の機能を実行させることを可能とするのに必要な他の要素を含む概念としても用いられる。
本発明は、オンターゲット効果(活性)および/またはオフターゲット効果(活性)を同時に特定することが可能な複数標的システムまたは同時標的システムを用いることを特徴とする。
本発明の「選択要素」という用語は、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出するためのマーカーを指す。よって、「選択要素」は、「選択マーカー」と交換可能に用いることができる。
当該スクリーニングシステムを用いることにより、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを含む細胞が試験ヌクレアーゼから選別され、そこから所望のヌクレアーゼを選択(特定)することができる。
標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
a)スクリーニングシステムのi)成分およびii)成分を細胞に導入する段階と、
b)a)において選択要素が発現するか否かに基づいてオンターゲット効果およびオフターゲット効果を特定することにより細胞を選別する段階と、
c)b)における選別された細胞中に存在するヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法を提供する。
さらに、本発明は、1つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を含む高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキットを提供する。当該キットは、組成物の形態であってよい。
「切断する(cleave)」、「切断(cleavage)」、および/または「切断する(cleaving)」という用語は、特定の核酸に切断を生成する作用を指す。切断(破壊)は、当業者に理解されるように、平滑末端または粘着末端(すなわち、5'または3'オーバーハング)を残すものであってよい。この用語は、一本鎖DNA切断(「ニック」)および二本鎖DNA切断も含む。
[1.スクリーニングシステム]
本発明は、1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的を用いた標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムに関する。本明細書で用いる場合、「標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステム」という用語は、高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするのに用いられる組成物およびキット、これを用いるための方法、ならびにそれらのプロセスの間に誘導される様々な中間体の全てを含む概念を指す。本明細書において用語「システム」として説明される発明は、本発明が所望の標的特異的ヌクレアーゼのスクリーニングに用いられる限りにおいて、組成物または方法として、対応する発明の態様に適するように解釈されてよい。
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニング用組成物であって、
i)標的を認識することが可能な部分、および認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ii)1つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備える組成物である。
「標的特異的ヌクレアーゼ」は、標的を特異的に認識することが可能な部分と、認識された標的を切断または改変することが可能な部分とからなるものであってよい。
ガイドRNAは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合する核酸配列を含んでよい。
CRISPR酵素は、CRISPR酵素をコードする配列を有する核酸であってよい。
CRISPR酵素は、活性CRISPR酵素または不活性CRISPR酵素であってよい。
変異CRISPR酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸(すなわちオンターゲット)に対する切断効果が増大するよう変異したものであってよい。
CRISPR酵素およびガイドRNAは、CRISPR複合体を形成してよい。
標的は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよい。
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合する非標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
本発明の「選択要素」という用語は、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出するためのマーカーを指す。よって、「選択要素」は、「選択マーカー」と交換可能に用いることができる。
スクリーニングシステムを用いて、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングすることができる。
具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼの様々な「多様体」のうちから高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法として利用することができる。
i)1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ii)標的特異的ヌクレアーゼ多様体と
を用いる方法であって、
a)i)成分およびii)成分を細胞に導入する段階と、
b)a)においてオンターゲットのみが改変された細胞を選別する段階と
を含む方法である。
この場合、i)成分はベクターシステムを用いることができ、i)成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
この場合、a)においてi)成分およびii)成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質(RNP)、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってi)成分およびii)成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
a)においてi)成分およびii)成分が導入された細胞群のうち、i)成分のうちのオンターゲットのみがii)成分によって切断された細胞を選別することができる。
別の具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼ「ライブラリ」における高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングするための方法として利用することができる。
i)1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ii)標的特異的ヌクレアーゼライブラリと
を用いる方法であって、
a)i)成分およびii)成分を細胞に導入する段階と、
b)a)においてオンターゲットのみが改変された細胞を選別する段階と
を含む方法である。
この場合、i)成分はベクターシステムを用いることができ、i)成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
この場合、a)においてi)およびii)成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質(RNP)、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってi)成分およびii)成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
a)においてi)成分およびii)成分が導入された細胞群のうち、i)成分のうちのオンターゲットのみがii)成分によって切断された細胞を選別することができる。
[3.標的特異的ヌクレアーゼの選択システム]
当該スクリーニングシステムを用いることにより、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを含む細胞が試験ヌクレアーゼから選別され、さらに、そこから所望のヌクレアーゼを選択(特定)することができる。
この場合、「標的特異的ヌクレアーゼ」は、標的を特異的に認識することが可能な部分と、認識された標的を切断または改変することが可能な部分とからなるものであってよい。
ガイドRNAは、標的とすべき遺伝子または核酸の配列に相補的に結合する核酸配列を含んでよい。
CRISPR酵素は、CRISPR酵素をコードする配列を有する核酸であってよい。
CRISPR酵素は、活性CRISPR酵素または不活性CRISPR酵素であってよい。
変異CRISPR酵素は、標的とすべき遺伝子または核酸(すなわちオンターゲット)に対する切断効果が増大するよう変異したものであってよい。
CRISPR酵素およびガイドRNAは、CRISPR複合体を形成してよい。
この場合、標的は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよい。
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合する非標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
本発明の「選択要素」という用語は、標的の遺伝子または核酸の配列が標的特異的ヌクレアーゼによって切断または改変されたかを検出するためのマーカーを指す。よって、「選択要素」は、「選択マーカー」と交換可能に用いることができる。
選択システムを用いて、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択することができる。
具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼの様々な「多様体」のうちから高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法として利用することができる。
i)1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ii)標的特異的ヌクレアーゼ多様体と
を用いる方法であって、
a)i)成分およびii)成分を細胞に導入する段階と、
b)前記a)において選択要素が発現するか否かに基づいて前記オンターゲット効果および前記オフターゲット効果を特定することにより前記細胞を選別する段階と、
c)b)における選別された細胞中に含まれる前記ヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する前記標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法である。
この場合、i)成分はベクターシステムを用いることができ、i)成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
この場合、a)においてi)成分およびii)成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質(RNP)、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってi)成分およびii)成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
a)においてi)成分およびii)成分が導入された細胞群のうち、i)成分のうちのオンターゲットのみがii)成分によって切断された細胞を選択することができる。
別の具体的実施形態として、
当該方法は、標的特異的ヌクレアーゼ「ライブラリ」における高特異性および高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法として利用することができる。
i)1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と、
ii)標的特異的ヌクレアーゼライブラリと
を用いる方法であって、
a)i)成分およびii)成分を細胞に導入する段階と、
b)a)においてオンターゲットのみが改変された細胞を選別する段階と、
c)b)における選択された細胞を用いてii)成分を特定する段階と
を含む方法である。
この場合、i)成分はベクターシステムを用いることができ、i)成分において、オンターゲットおよびオフターゲットをそれぞれのベクターに含めることができる。
この場合、a)においてi)成分およびii)成分を細胞に導入する場合、
ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質(RNP)、ナノ粒子、およびリポソーム等を用いたトランスフェクション、マイクロインジェクション、ならびにエレクトロポレーション等によってi)成分およびii)成分を細胞に導入することができるが、導入方法はこれらに限定されない。
a)においてi)成分およびii)成分が導入された細胞群のうち、i)成分のうちのオンターゲットのみがii)成分によって切断された細胞を選択することができる。
本発明の別の態様は、1つまたは複数の選択要素を含有する複数標的を含む高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキットに関する。当該キットは、組成物の形態であってよい。
i)1つまたは複数の選択要素を含有する複数標的と、
ii)標的特異的ヌクレアーゼおよび/またはiii)宿主細胞と
からなるものであってよい。
さらに、本発明は、標的特異的ヌクレアーゼをスクリーニングおよび/または選択するための複数標的を含む細胞、および/または当該細胞を生成するための方法を提供する。
標的は、標的特異的ヌクレアーゼの標的となる遺伝子または核酸の配列であってよい。
オンターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが相補的に結合する標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
オフターゲットは、標的特異的ヌクレアーゼが部分的に相補的に結合する非標的の遺伝子または核酸の配列または位置であってよい。
当該細胞を生成するための方法は、複数標的を含むベクターシステムを細胞に導入するための方法を用いることができる。
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。
[1−1 対照実験]
CATCAACATCGAATACATGA NAG(配列番号1)は、K12 E.coliゲノムDNAにおいて見られる反復配列である。この配列は、NGGに類似のPAM配列NAGを含み、そのためCRISPR−CAS9酵素によって切断される効率が低いことが知られている。
対照実験に成功した後、誤差率の低い実験方法を用い、Agilent Technologies, Inc.製Genemorph IIキットを使用して、WT CAS9の配列のPCR増幅によるランダム変異を導入した。PCR生成物を、二重切断されたプラスミドCのバックボーンにライゲーションした。ライゲーションにより生成したプラスミドを高効率エレクトロコンポネントセル(high−efficiency electrocomponent cell)に導入することにより、サイズ1,000,000のライブラリを構築した。このランダムライブラリを、先に調製したプラスミドAおよびBを含むエレクトロコンポネントセルに導入した。その後、この細胞を先の実験と同じように2つの培地中で培養した。結果として、クロラムフェニコールのみを含むLB培地中では約2,500コロニーが特定され、一方でクロラムフェニコール、カナマイシン、アラビノース、およびアンヒドロテトラサイクリンを含むLB培地中では180コロニーが現れた。各コロニーをクロラムフェニコールを含むLB培地中で培養して、ランダム変異を含むプラスミドCを発現させた。培養したコロニーから得られたランダム変異の全配列は、共通(general)のPAM配列であるNGGに対して活性を有し、一方でこの全配列は、類似だが共通でないPAM配列であるNAGに対しては阻害された活性を示す効果的な変異として特定された。
WT EMX1遺伝子における標的位置のガイド配列に関して1つのミスマッチを有する20merのsgRNAは、ミスマッチを有しない、すなわち完全にマッチするsgRNAを用いた場合と比較して、低い活性を有することが以前の研究で確認された。WT EMX1遺伝子は、哺乳類細胞のゲノムDNA中に存在し、哺乳類細胞のゲノムDNA中のWT EMX1遺伝子を含む500merの塩基配列を増幅することにより得られたPCR生成物を、標準的な方法(McKenzie GJら、BMC Microbiol. 2006、6、39)を用いてE.coli(BW25141)のゲノムDNAに挿入した。結果として、得られた株をBW25141−EMX1と名付けてから、これを使用した。
56:gagtccgagcagaaAGagaa(配列番号7)
1718: gaACccgagcagaagaagaa(配列番号8)
7:gagtccgagcagaGgaagaa(配列番号9)および
17:gagCccgagcagaagaagaa(配列番号10)
を、プラスミドBにおけるsgRNAとして用いた。
対照反応のために、WT CAS9を含むプラスミドCまたは陰性対照としての空ベクターを、プラスミドAおよびBを含むエレクトロコンポネントセルに導入した。プラスミドCまたは空ベクターが導入された細胞群を、1,000ng/mlの無水テトラサイクリンを含むSOC培地中で1時間培養した後、培養した細胞群の半数をクロラムフェニコールを含むLB中で培養し、培養した細胞群のもう半数をクロラムフェニコール、カナマイシン、10mMアラビノース、および1,000ng/mlの無水テトラサイクリンを含むLB培地中で培養した。
対照反応のために、WT CAS9を含むプラスミドCまたは陰性対照としての空ベクターを、プラスミドAおよびBを含むエレクトロコンポネントセルに導入した。プラスミドCまたは空ベクターが導入された細胞群を、10ng/mlの無水テトラサイクリンを含むSOC培地中で1時間培養した後、培養した細胞群の半数をクロラムフェニコールを含むLB中で培養し、培養した細胞群のもう半数をクロラムフェニコール、カナマイシン、10mMアラビノース、および10ng/mlの無水テトラサイクリンを含むLB培地中で培養した。
対照実験に成功した後、3つの異なる手段によってランダム変異を導入した。
さらなる改変を含む標準的なシャッフリング方法を用いて、選択によって得られたライブラリをシャッフリング反応に用いた。通常、PCR生成物が1kbよりも大きくなると、シャッフリングの効率が著しく悪化することが知られている。よって、4,300bpsの長さを有するCas9ベクターのシャッフリング反応は、容易には生じない。
56および1718を用いたスクリーニング反応と類似の方式で(7または17を含む)プラスミドAおよび(7または17を含む)プラスミドBを含むEMX1−BW25141を用いることにより、AgilentおよびClontechのキットを用いて調製されたシャッフリングライブラリおよびランダム変異ライブラリを繰り返しスクリーニングした。安定した比率に達するまで、スクリーニング反応を繰り返した。結果として、得られたコロニーを標準的な配列決定方法を用いて解析した。
2つの方法(1ミスマッチ(7または17)スクリーニングによるシャッフリング+1ミスマッチ(7または17)スクリーニングおよび2ミスマッチ(56または1718)スクリーニング)を同時に行うことにより得られた完全な状態のライブラリを用いて、DMD遺伝子およびEMX1遺伝子の各々に対してオンターゲット実験およびオフターゲット実験を行った。
実施例1および2において説明したような実験を、哺乳類細胞を用いて行うことができる。
[項目1]
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングシステムであって、
i)標的を認識することが可能な部分、および上記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ii)1つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備えるスクリーニングシステム。
[項目2]
上記スクリーニングシステムは、上記ヌクレアーゼのオンターゲット効果およびオフターゲット効果を同時に特定することが可能である、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目3]
上記複数標的は、1つのオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目4]
上記複数標的は、ベクター、プラスミドまたは宿主細胞ゲノムに含まれる、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目5]
上記オンターゲットは、ベクターまたはプラスミドに含まれ、上記オフターゲットは、宿主細胞ゲノムに含まれる、項目3に記載のスクリーニングシステム。
[項目6]
上記ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、TALEN(転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ)、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびRGEN(RNA誘導型人工ヌクレアーゼ)からなる群から選択される、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目7]
上記ヌクレアーゼは、上記RGEN(RNA誘導型人工ヌクレアーゼ)である、項目6に記載のスクリーニングシステム。
[項目8]
上記ヌクレアーゼは、CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)−Cas(CRISPR associated protein)システムである、項目7に記載のスクリーニングシステム。
[項目9]
上記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子である、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目10]
上記ヌクレアーゼによる上記オンターゲット効果および上記オフターゲット効果を特定するための上記選択要素として、1つまたは複数の選択要素が用いられる、項目9に記載のスクリーニングシステム。
[項目11]
上記スクリーニングシステムは、E.coli(Escherichia coli)および毒素遺伝子ccdBを用いて行われる、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目12]
上記スクリーニングシステムは、哺乳類細胞および毒素遺伝子HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)を用いて行われる、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目13]
上記スクリーニングシステムは、酵母および毒素遺伝子URA3を用いて行われる、項目1に記載のスクリーニングシステム。
[項目14]
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニング用組成物であって、
i)標的を認識することが可能な部分、および上記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
ii)1つまたは複数の選択要素 を含む複数標的であって、1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的と
を備える組成物。
[項目15]
上記ヌクレアーゼは、上記RGEN(RNA誘導型人工ヌクレアーゼ)である、項目14に記載のスクリーニング用組成物。
[項目16]
上記選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の遺伝子である、項目14に記載のスクリーニング用組成物。
[項目17]
高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法であって、
a)項目1から11のいずれか一項に記載のi)成分およびii)成分を細胞に導入する段階と、
b)上記a)において選択要素が発現するか否かに基づいて上記オンターゲット効果および上記オフターゲット効果を特定することにより上記細胞を選別する段階と、
c)b)における選別された細胞中に含まれる上記ヌクレアーゼを高特異性または高活性を有する上記標的特異的ヌクレアーゼとして選択する段階と
を備える方法。
[項目18]
上記a)においてi)成分およびii)成分を上記細胞に上記導入する段階は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、カチオン系ポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン系リポソームトランスフェクション、イムノリポソームトランスフェクション、非リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、遺伝子銃デリバリー、インペールフェクション、ソノポレーションおよび光トランスフェクションからなる群から選択される1つまたは複数の方法を用いて行われる、項目17に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
[項目19]
上記a)においてi)成分およびii)成分を上記細胞に上記導入する段階は、エレクトロポレーションを用いて行われる、項目17に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
[項目20]
上記b)における上記細胞は、選択要素が発現するか否かに基づく特定に伴い、オンターゲット効果が増大しオフターゲット効果が低下したものが選別される、項目17に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
[項目21]
上記ヌクレアーゼの配列は、上記c)において上記選別された細胞から得られる上記ヌクレアーゼを配列決定することにより取得される、項目17に記載の標的特異的ヌクレアーゼを選択するための方法。
[項目22]
1つまたは複数の選択要素を含む複数標的であって、1つまたは複数のオンターゲットおよび1つまたは複数のオフターゲットを含む複数標的
を備える、高特異性または高活性を有する標的特異的ヌクレアーゼを選択するためのスクリーニングキット。
[項目23]
上記複数標的は、宿主細胞中にある、項目22に記載のスクリーニングキット。
[項目24]
標的特異的ヌクレアーゼを選択するための上記スクリーニングキットは、
標的を認識することが可能な部分、および上記認識された標的を切断または改変することが可能な部分を含むヌクレアーゼと、
宿主細胞と
からなる群から選択される1つまたは複数の成分をさらに備える、
項目22に記載のスクリーニングキット。
Claims (19)
- CRISPR酵素の特異性または活性を評価するための方法であって、前記方法は、
第1プラスミドとゲノムを含む少なくとも1つの細胞を提供する段階であって、
前記細胞はE.coli細胞であり、
前記第1プラスミドは、
第1核酸と、
前記第1核酸に作用可能に連結されている第1選択要素を有し、
前記ゲノムは、前記第1核酸と100%未満の配列相同性を有する第2核酸を含む、前記第1プラスミドと前記ゲノムを含む少なくとも1つの細胞を提供する段階と、
CRISPR複合体を前記第1核酸と前記第2核酸にそれぞれ接触させる段階であって、
前記CRISPR複合体は、ガイドRNAと前記CRISPR酵素を含み、
前記第1核酸は、前記CRISPR複合体のオンターゲットであり、
前記第2核酸は、前記CRISPR複合体のオフターゲットである、前記CRISPR複合体を前記第1核酸と前記第2核酸にそれぞれ接触させる段階と、
個々の細胞について、
前記細胞が死んでいるか否か、および、
前記第1選択要素が発現しているか否か、
これにより、オフターゲット修飾およびオンターゲット修飾が前記細胞内で生じているか否かを特定する段階と、
上記特定の結果に基づいて、前記CRISPR酵素の前記特異性または前記活性を評価する段階と、
を備える方法。 - 前記第1選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1選択要素は、毒素遺伝子であり、
前記毒素遺伝子は、
ccdB遺伝子
である、
請求項1に記載の方法。 - 前記CRISPR酵素は、自然起源でない変異CRISPR酵素である、
請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記CRISPR酵素はCas9である、
請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記Cas9は、
Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9)、Streptococcus thermophiles Cas9(StCas9)、Neisseria meningitides Cas9(NmCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)およびこれらのオーソログからなる群から選択される、
請求項5に記載の方法。 - CRISPR複合体の特異性または活性を評価するための細胞であって、前記細胞は、
第1核酸、および前記第1核酸に作用可能に連結されている第1選択要素を含む、第1プラスミドと、
前記第1核酸と100%未満の配列相同性を有する第2核酸を含むゲノムとを含み、
前記細胞はE.coli細胞であり、
前記第1核酸は前記CRISPR複合体のオンターゲットであり、
前記第2核酸は前記CRISPR複合体のオフターゲットであり、
前記第2核酸は細胞内で内在性ではなく、外因性である、
細胞。 - 前記第1選択要素は、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項7に記載の細胞。
- 前記第1選択要素は、毒素遺伝子であり、
前記毒素遺伝子は、
ccdB遺伝子
である、
請求項7に記載の細胞。 - CRISPR酵素の特異性または活性を評価するための方法であって、前記方法は、
第1プラスミドと第2プラスミドを含む少なくとも1つの細胞を提供する段階であって、
前記第1プラスミドは、
第1核酸と、
前記第1核酸に作用可能に連結されている第1選択要素を有し、
前記第2プラスミドは、
前記第1核酸と100%未満の配列相同性を有する第2核酸、および、前記第2核酸に作用可能に連結されている第2選択要素を含む、前記第1プラスミドと前記第2プラスミドを含む少なくとも1つの細胞を提供する段階と、
CRISPR複合体を前記第1核酸と前記第2核酸にそれぞれ接触させる段階であって、
前記CRISPR複合体は、ガイドRNAと前記CRISPR酵素を含み、
前記第1核酸は、前記CRISPR複合体のオンターゲットであり、
前記第2核酸は、前記CRISPR複合体のオフターゲットであり、
前記第1選択要素および前記第2選択要素は互いに異なる、前記CRISPR複合体を前記第1核酸と前記第2核酸にそれぞれ接触させる段階と、
個々の細胞について、
前記第1選択要素が発現しているか否か、および
前記第2選択要素が発現しているか否か、
これにより、オフターゲット修飾およびオンターゲット修飾が前記細胞内で生じているか否かを特定する段階と、
上記特定の結果に基づいて、前記CRISPR酵素の前記特異性または前記活性を評価する段階と、
を備える方法。 - 前記第1選択要素および前記第2選択要素のそれぞれは、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記第1選択要素は、毒素遺伝子であり、
前記毒素遺伝子は、前記細胞の種に依存し、
前記毒素遺伝子は、
前記細胞がE.coli(Escherichia coli)である場合、ccdB遺伝子、
前記細胞が哺乳類細胞である場合、HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)遺伝子、および
前記細胞が酵母である場合、URA3遺伝子
である、
請求項10に記載の方法。 - 前記CRISPR酵素は、自然起源でない変異CRISPR酵素である、
請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記CRISPR酵素はCas9である、
請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記Cas9は、
Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9)、Streptococcus thermophiles Cas9(StCas9)、Neisseria meningitides Cas9(NmCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)およびこれらのオーソログからなる群から選択される、
請求項14に記載の方法。 - CRISPR複合体の特異性または活性を評価するための細胞であって、前記細胞は、
第1核酸、および前記第1核酸に作用可能に連結されている第1選択要素を含む、第1プラスミドと、
前記第1核酸と100%未満の配列相同性を有する第2核酸、および前記第2核酸に作用可能に連結されている第2選択要素を含む、第2プラスミド、とを含み、
前記第1核酸は前記CRISPR複合体のオンターゲットであり、
前記第2核酸は前記CRISPR複合体のオフターゲットであり、
前記第1選択要素および前記第2選択要素は互いに異なる、
細胞。 - 前記第1選択要素および前記第2選択要素のそれぞれは、毒素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、タギング遺伝子、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項16に記載の細胞。
- 前記第1選択要素は、毒素遺伝子であり、
前記毒素遺伝子は、前記細胞の種に依存し、
前記毒素遺伝子は、
前記細胞がE.coli(Escherichia coli)である場合、ccdB遺伝子、
前記細胞が哺乳類細胞である場合、HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)遺伝子、および
前記細胞が酵母である場合、URA3遺伝子
である、
請求項16に記載の細胞。 - 請求項7から9および16から18のいずれか一項に記載の細胞を含む、CRISPR酵素の特異性または活性を評価するためのキット。
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