JP2021509585A - 組換えヒトシアリダーゼ、シアリダーゼ融合タンパク質およびそれらの使用方法 - Google Patents

組換えヒトシアリダーゼ、シアリダーゼ融合タンパク質およびそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は一般的に、組換えヒトシアリダーゼおよび組換えシアリダーゼ融合タンパク質に関し、ここで該シアリダーゼは任意に、野生型ヒトシアリダーゼと比較して、1つ以上の変異、例えば少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または付加を含む。本発明はまた、シアリダーゼおよび抗体またはその一部を含む抗体コンジュゲートを提供する。本発明はさらに、癌を治療するために、シアリダーゼ融合タンパク質または抗体コンジュゲートを使用する方法に関する。

Description

関連出願についての相互参照
本願は、2018年1月3日に出願された米国仮特許出願第62/613,363号および2018年11月2日に出願された米国仮特許出願第62/755,279号の利益および優先権を主張し、上記出願のそれぞれの全開示は、それらの全体において参照により本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は一般的に、組換えヒトシアリダーゼおよび組換えシアリダーゼ融合タンパク質、ならびに癌の治療におけるそれらの使用に関する。
背景
増加する一連の証拠は、腫瘍進行の種々の病理生理学的段階でのグリカンおよび特にシアログリカンについての役割を支持する。グリカンは、腫瘍増殖、侵入、血行性の転移および新脈管形成を制御する(Fuster et al. (2005) NAT. REV. CANCER 5(7): 526-42)。細胞表面糖コンジュゲートのシアリル化(sialylation)は、癌において頻繁に変化し、シアリル化腫瘍関連炭水化物抗原の発現を生じる。腫瘍細胞によるシアリル化グリカンの発現は時々、腫瘍の攻撃性および転移能力の増加と関連する。
最近では、シアル酸結合レクチンのファミリーであるSiglec(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン)は、過シアリル化癌細胞に結合してNK細胞受容体の活性化由来のシグナルの抑制を媒介し、それによりNK細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷を抑制することにより、癌免疫抑制において役割を担うことが明らかになっている(Jandus et al. (2014) J. CLIN. INVEST. 124: 1810-1820；Laeubli et al. (2014) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 111: 14211-14216；Hudak et al. (2014) NAT. CHEM. BIOL. 10: 69-75)。同様に、シアリダーゼを用いた処置によるシアル酸の酵素的除去は、NK細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷を高め得る(Jandus, 上述；Hudak, 上述；Xiao et al. (2016) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 113(37): 10304-9)。
PD-1/PD-L1経路を阻害する抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤を用いた癌免疫療法は、多くの癌患者の結果を向上した。しかしながら、今日までになされた進歩に関わらず、多くの患者は現在利用可能な免疫チェックポイント阻害剤に応答しない。したがって、免疫抑制性腫瘍微小環境を克服し、過シアリル化癌細胞に関連する癌を治療するための効果的な介入の必要性が依然としてある。
発明の概要
本発明は、部分的に、癌細胞の表面からシアル酸および/またはシアル酸含有分子を除去し、および/または腫瘍微小環境からシアル酸および/またはシアル酸含有分子を除去し、および/または腫瘍微小環境においてシアル酸および/またはシアル酸含有分子の濃度を低減することに有用であるように、適切な基質特異性および活性を有するヒトシアリダーゼ酵素の組換え変異体形態ならびにかかる酵素を含む融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートを作製することが可能であるという発見に基づく。
一局面において、本発明は、少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換を含む組換え変異体ヒトシアリダーゼを提供し、ここで該置換は、シアリダーゼの(a)発現、(b)安定性および(c)活性の少なくとも1つまたは(a)と(b)の組合せ、(a)と(c)の組合せ、(b)と(c)の組合せまたは(a)、(b)と(c)との組合せを増加する。
別の局面において、本発明は、N末端およびC末端を含み、かつ：(a)少なくとも1つの野生型システイン残基の置換；(b)少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加し、および/またはシアリダーゼの疎水性を減少する；(c)シアリダーゼのN末端でN末端アミノ酸と共有結合する少なくとも2アミノ酸残基長のペプチド；(d)少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのNおよびC末端の間の疎水性相互作用および/または水素結合を増加する；または(e)シアリダーゼのN末端でのN末端メチオニンの置換もしくは欠失；あるいは前述のいずれかの組合せを含む、組換え変異体ヒトシアリダーゼ酵素を提供する。例えば、組換え変異体シアリダーゼ酵素は、先に同定された特徴の組合せ、すなわち(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を含み得、例えば：(a)と(b)；(a)と(c)；(a)と(d)；(a)と(e)；(b)と(c)；(b)と(d)；(b)と(e)；(c)と(d)；(c)と(e)；(d)と(e)；(a)と(b)と(c)；(b)と(c)と(d)；(a)と(c)と(d)；(a)と(b)と(d)；(a)と(b)と(e)；(a)と(c)と(e)；(a)と(d)と(e)；(b)と(c)と(e)；(b)と(d)と(e)；(c)と(d)と(e)；(a)と(b)と(c)と(d)；(a)と(b)と(c)と(e)；(a)と(c)と(d)と(e)；(b)と(c)と(d)と(e)；および(a)と(b)と(c)と(d)と(e)から選択される組み合わせを含み得る。ある態様において、シアリダーゼは、Neu1、Neu2、Neu3およびNeu4から選択され、例えばシアリダーゼはNeu2である。
ある態様において、シアリダーゼは、少なくとも1つの野生型システイン残基、例えば遊離システイン残基の置換を含む。システイン残基は、例えばセリン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシンまたはアラニンにより置換され得る。ある態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の332位に対応する位置でシステイン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトNeu2の332位に対応する位置のシステイン残基は、アラニンにより置換される(C332A)。ある態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の352位に対応する位置でシステイン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトNeu2の352位に対応する位置のシステイン残基は、ロイシンにより置換される(C352L)。ある態様において、シアリダーゼは、C332AおよびC352Lの置換の両方を含む。ある態様において、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼ、例えばNeu2またはNeu3に通常存在する2、3、4、5または6個のシステインでのアミノ酸置換を含む。
ある態様において、シアリダーゼは、少なくとも1つの野生型アミノ酸残基、例えば溶媒露出野生型アミノ酸残基の置換を含み、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加し、および/またはシアリダーゼの疎水性を減少する。ある態様において、野生型アミノ酸は、リジン、アルギニンまたはヒスチジンにより置換され、例えば野生型アミノ酸はリジンにより置換される。ある態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の2位に対応する位置でアラニン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトNeu2の2位に対応する位置で、アラニン残基はリジンにより置換される(A2K)。
ある態様において、シアリダーゼは、例えばペプチド結合により、シアリダーゼのN末端に融合された、例えばシアリダーゼのN末端アミノ酸残基に融合された少なくとも2アミノ酸残基長のペプチドを含む。ある態様において、該ペプチドは、2アミノ酸残基長〜20アミノ酸残基長である。ある態様において、該ペプチドは、少なくとも2、3、4または5アミノ酸残基長である。ある態様において、該ペプチドは、野生型マウス胸腺Neu2(配列番号:2)由来のアミノ酸配列を含み、例えばある態様において、該ペプチドは、EDLRP(配列番号:3)またはMEDLRP(配列番号:4)を含む。
ある態様において、シアリダーゼは、少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換を含み、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのNおよびC末端の間の疎水性相互作用および/または水素結合を増加する。例えば、ある態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の6位に対応する位置でバリン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトNeu2の6位に対応する位置で、バリン残基はチロシンにより置換される(V6Y)。
ある態様において、シアリダーゼは、シアリダーゼのN末端でN末端メチオニンの置換または欠失を含む。例えば、ある態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の1位に対応する位置でメチオニン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトNeu2の1位に対応する位置で、メチオニンはアラニン(M1A)またはアスパラギン酸により置換される(M1D)。
ある態様において、シアリダーゼは、対応する野生型シアリダーゼとは異なる基質特異性を有する。例えば、ある態様において、シアリダーゼは、α2,3、α2,6および/またはα2,8連結を切断し得る。ある態様において、シアリダーゼは、α2,3およびα2,8連結を切断し得る。
ある態様において、シアリダーゼは、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72または配列番号:73を含む。
別の局面において、本発明は、(a)シアリダーゼ酵素；ならびに(b)免疫グロブリンFcドメインおよび/または免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む融合タンパク質を提供し、ここでシアリダーゼならびにFcドメインおよび/または抗原結合ドメインは、ペプチド結合またはアミノ酸リンカーにより連結される。ある態様において、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼ、例えば本明細書に開示される組換え変異体ヒトシアリダーゼである。ある態様において、融合タンパク質はさらに、シアリダーゼ酵素ならびにFcドメインおよび/または抗原結合ドメインを連結するリンカー、例えばアミノ酸リンカーを含む。ある態様において、免疫グロブリン抗原結合ドメインは第2の免疫グロブリン抗原結合ドメインと結合(例えば共有結合または非共有結合)して、抗原結合部位を生じる。
ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgM Fcドメインに由来し、例えば免疫グロブリンFcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fcドメインに由来し、例えば免疫グロブリンFcドメインはヒトIgG1 Fcドメインに由来する。
ある態様において、免疫グロブリン抗原結合ドメインは、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブおよびリツキシマブから選択される抗体に由来する。ある態様において、免疫グロブリン抗原結合ドメインはトラスツズマブに由来する。
ある態様において、融合タンパク質は、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:63、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78もしくは配列番号:79、または配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:63、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78もしくは配列番号:79に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の局面において本発明は、前述の融合タンパク質のいずれかを含む抗体コンジュゲートを提供する。ある態様において、抗体コンジュゲートは単一のシアリダーゼを含む。他の態様において、抗体コンジュゲートは同じであり得るかまたは異なり得る2つのシアリダーゼを含む。ある態様において、抗体コンジュゲートは2つの同一のシアリダーゼを含む。ある態様において、抗体コンジュゲートは単一の抗原結合部位を含む。他の態様において、抗体コンジュゲートは、同じであり得るかまたは異なり得る2つの抗原結合部位を含む。ある態様において、抗体コンジュゲートは2つの同一の抗原結合部位を含む。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、約135kDa〜約165kDaの分子量を有するか、または抗体コンジュゲートは、約215kDa〜約245kDaの分子量を有する。
ある態様において、抗体コンジュゲートは：(a)免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；(b)免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；ならびに(c)免疫グロブリンFcドメインおよびシアリダーゼを含む第3のポリペプチドを含み；ここで第1および第2のポリペプチドは、共有結合して一緒になり、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり、ここで第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって抗原結合部位を画定する。第3のポリペプチドは、例えばN末端からC末端の方向でシアリダーゼおよび免疫グロブリンFcドメインを含み得る。第1のポリペプチドは、例えば配列番号:49を含み得、第2のポリペプチドは、例えば配列番号:50を含み得、および/または第3のポリペプチドは、例えば配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78もしくは配列番号:79を含み得る。
ある態様において、抗体コンジュゲートは：(a)第1の免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；(b)第1の免疫グロブリン重鎖および第1のシアリダーゼを含む第2のポリペプチド；(c)第2の免疫グロブリン重鎖および第2のシアリダーゼを含む第3のポリペプチド；ならびに(d)第2の免疫グロブリン軽鎖を含む第4のポリペプチドを含み；ここで第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり、第3および第4のポリペプチドは共有結合して一緒になり、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり、ここで第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって、第1の抗原結合部位を画定し、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドは一緒になって第2の抗原結合部位を画定する。第2および第3のポリペプチドは、例えばN末端からC末端の方向で第1および第2の免疫グロブリン重鎖ならびに第1および第2のシアリダーゼのそれぞれを含み得る。
ある態様において、抗体コンジュゲートは：(a)第1のシアリダーゼ、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1の一本鎖可変断片(scFv)を含む第1のポリペプチド；ならびに(b)第2のシアリダーゼ、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび任意の第2の一本鎖可変断片(scFv)を含む第2のポリペプチドを含み；ここで第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり、ここで第1のscFvは第1の抗原結合部位を画定し、第2のscFvは、存在する場合、第2の抗原結合部位を画定する。第1のポリペプチドは、例えばN末端からC末端の方向で、第1のシアリダーゼ、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1のscFvを含み得る。第2のポリペプチドは、例えばN末端からC末端の方向で、第2のシアリダーゼ、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび任意の第2のscFvを含み得る。第1のポリペプチドは、例えば配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74もしくは配列番号:75を含み得、および/または第2のポリペプチドは、例えば配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74もしくは配列番号:75を含み得る。
別の局面において、本発明は、前述の組換え変異体ヒトシアリダーゼのいずれか、前述の融合タンパク質のいずれかまたは前述の抗体コンジュゲートのいずれかの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。別の局面において、本発明は、前述の核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。別の局面において、本発明は、前述の発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
別の局面において、本発明は、前述の組換え変異体ヒトシアリダーゼのいずれか、前述の融合タンパク質のいずれかまたは前述の抗体コンジュゲートのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法を提供する。該方法は、前述のシアリダーゼのいずれか、前述の融合タンパク質のいずれか、前述の抗体コンジュゲートのいずれかまたは前述の医薬組成物のいずれかの有効量を被験体に投与する工程を含む。ある態様において、癌は、上皮癌、例えば子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、ファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器(urinary)癌、膀胱(bladder)癌、頭頸部癌、口腔癌および肝臓癌である。
別の局面において、本発明は、細胞または組織において、HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2またはIL-6の発現を増加する方法を提供する。該方法は、細胞または組織を、前述のシアリダーゼのいずれか、前述の融合タンパク質のいずれか、前述の抗体コンジュゲートのいずれかまたは前述の医薬組成物のいずれかの有効量と接触させる工程を含む。ある態様において、該細胞は、樹状細胞および末梢血単核細胞(PBMC)から選択される。
本発明のこれらおよび他の局面および特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において説明される。
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
図1は、非還元および還元条件下での組換えヒトNeu1、Neu2、Neu3およびネズミチフス菌(St-シアリダーゼ)を示すSDS-PAGEゲルを示す。単量体および二量体の種が示される。 図2は、組換えヒトNeu1、Neu2およびNeu3の酵素活性を示す棒グラフである。 図3は、示されるpHでの組換えヒトNeu2およびNeu3についての基質濃度の関数として、酵素活性を示す折れ線グラフである。 図4Aは、野生型Neu2のSEC-HPLCトレースである。図4Bは、Neu2-M38(C332AおよびC352L置換を含む)のSEC-HPLCトレースである。単量体および凝集物の種の量が示される。 図5Aは、野生型Neu2のSEC-HPLCトレースであり、図5Bは、Neu2-M62(A2K置換を含む)のSEC-HPLCトレースであり、図5Cは、Neu2-M71(A2KおよびV325置換を含む)のSEC-HPLCトレースである。単量体および凝集物の種の量が示される。 図6Aは、野生型Neu2のSEC-HPLCトレースであり、図6Bは、Neu2-M76(N-末端に挿入されたMEDLRP(配列番号:4)を含んだ)のSEC-HPLCトレースである。単量体および凝集物の種の量が示される。 図7Aは、示されるpHでのNeu2-M76についての基質濃度の関数としての酵素活性を示す折れ線グラフである。図7Bは、Neu2-M76によるα2-3、α2-6またはα2-8基質の切断を示す。 図8Aは野生型Neu2のSEC-HPLCトレースであり、図8Bは、Neu2-M79(V6Y置換を含む)のSEC-HPLCトレースである。単量体および凝集物の種の量が示される。 図9A〜9Dは、シアリダーゼ酵素、例えばヒトシアリダーゼ酵素および抗原結合部位を含む特定の抗体コンジュゲート構築物の模式的表示を示す。1つより多く(例えば2つ)のシアリダーゼを含むそれぞれの抗体コンジュゲート構築物について、それぞれのシアリダーゼは同じであり得るかまたは異なり得る。1つより多く(例えば2つ)の抗原結合部位を含むそれぞれの抗体コンジュゲート構築物について、それぞれの抗原結合部位は同じであり得るかまたは異なり得る。 図9E〜9Iは、シアリダーゼ酵素、例えばヒトシアリダーゼ酵素および抗原結合部位を含む特定の抗体コンジュゲート構築物の模式的表示を示す。1つより多く(例えば2つ)のシアリダーゼを含むそれぞれの抗体コンジュゲート構築物について、それぞれのシアリダーゼは同じであり得るかまたは異なり得る。1つより多く(例えば2つ)の抗原結合部位を含むそれぞれの抗体コンジュゲート構築物について、それぞれの抗原結合部位は同じであり得るかまたは異なり得る。 図10A〜Cは、Raptor抗体シアリダーゼコンジュゲート(図10A)、Janus抗体シアリダーゼコンジュゲート(図10B)およびLobster抗体シアリダーゼコンジュゲート(図10C)と称される融合タンパク質コンジュゲートの模式的表示である。 図11Aは、Raptor(左)およびJanus(右)形態のネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを使用して作製された抗体-シアリダーゼコンジュゲート(ASC)を示すSDS-PAGEゲルである。図11Bは、トラスツズマブ(上)ならびにJanus(中)およびRaptor(下)形態のSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを使用して作製されたASCのSEC-HPLCトレースである。 図12Aは、St-シアリダーゼならびにRaptorおよびJanus形態のSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを使用して作製されたASCについての酵素活性を示す折れ線グラフ(上)および棒グラフ(下)である。図12Bは、トラスツズマブ(上)、ならびにRaptor(中)およびJanus(下)形態のSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを使用して作製されたASCについての、ForteBio Octetにより決定された場合のHer2への結合を示す。 図13A〜Cは、Janus形態のSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを使用して作製されたASCを示すSDS-PAGEゲル(図13A)、Janus形態のNeu2-M76(N末端に挿入されたMEDLRP(配列番号:4)を含んだ)およびトラスツズマブを使用して作製されたASCを示すSDS-PAGEゲル(図13B)、ならびにLobster形態のNeu2-M85(M1の欠失ならびにV6YおよびI187K変異を含んだ)およびトラスツズマブ由来のscFvを使用して作製されたASCを示すSDS-PAGEゲル(図13C)を示す。 図14A〜Cは、Janus形態のNeu2-M76(N末端に挿入されたMEDLRP(配列番号:4)を含んだ)およびトラスツズマブを使用して作製されたASC(図14A)、野生型Neu2(図14B)、ならびにLobster形態のNeu2-M85(M1の欠失ならびにV6YおよびI187K変異を含んだ)およびトラスツズマブ由来のscFvを使用して作製されたASC(図14C)についての基質濃度の関数としての酵素活性を示す折れ線グラフを示す。 図15A〜Bは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおける抗体シアリダーゼコンジュゲートの種々の配置(configuration)の試験を示す。マウスを、黒い三角で記された日に、10mg/kgのそれぞれの試験物の腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録する。それぞれの線は個々のマウスを示す。マウスをトラスツズマブ(図15A)、Raptor(図15B)、Janus(図15C)またはLobster(図15D)のいずれかで処置した。 図15C〜Dは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおける抗体シアリダーゼコンジュゲートの種々の配置の試験を示す。マウスを、黒い三角で記された日に、10mg/kgのそれぞれの試験物の腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録する。それぞれの線は個々のマウスを示す。マウスをトラスツズマブ(図15A)、Raptor(図15B)、Janus(図15C)またはLobster(図15D)のいずれかで処置した。 図16A〜Bは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおけるJanus抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスを、黒い三角で記された日に、10mg/kgのJanusの腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。マウスはまた、Janusと同じ日に、ナチュラルキラー細胞を枯渇するために抗マウスNK1.1(10mg/kg)(図16A)、マクロファージを枯渇するためにクロドロン酸リポソーム(0.5mg/マウス、1週間に3回を2週間)(図16B)、またはCD8+ T細胞を枯渇するために抗マウスCD8α(10mg/kg)(図16C)のいずれかで処置した。それぞれの線は個々のマウスを示す。図16Dは、実施例8からの示された処置群の、エラーバーを有する平均腫瘍体積を示す。 図16C〜Dは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおけるJanus抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスを、黒い三角で記された日に、10mg/kgのJanusの腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。マウスはまた、Janusと同じ日に、ナチュラルキラー細胞を枯渇するために抗マウスNK1.1(10mg/kg)(図16A)、マクロファージを枯渇するためにクロドロン酸リポソーム(0.5mg/マウス、1週間に3回を2週間)(図16B)、またはCD8+ T細胞を枯渇するために抗マウスCD8α(10mg/kg)(図16C)のいずれかで処置した。それぞれの線は個々のマウスを示す。図16Dは、実施例8からの示された処置群の、エラーバーを有する平均腫瘍体積を示す。 図17A〜Bは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞の第2の供給源を使用したマウス同系同所(orthogonal)腫瘍モデルにおけるJanus抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスは、黒い三角で記された日に、10mg/kgのそれぞれの試験物の腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録する。それぞれの線は個々のマウスを示す。マウスを、ビヒクル、トラスツズマブ、JanusまたはJanusロスオブファンクション(loss of function)のいずれかで処置する(▼)(図17A)。図17Bは、元のEMT6-Her2腫瘍の完全後退を有する図17AからのJanusで処置した3匹のマウス(治癒マウス)またはナイーブマウスのいずれかの再負荷(rechallenge)実験を示す。治癒マウスに、EMT6-Her2細胞または親EMT6細胞のいずれかを、左および右の下側腹領域に接種した。ナイーブマウスにEMT6-Her2細胞を接種した。 図18A〜Bは、抗マウスPD1と組み合わせたマウス同系同所腫瘍モデルにおけるJanus抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスは、黒い三角(▼)で記された日に、10mg/kgの抗マウスPD1単独(図18A)またはJanusおよび抗マウスPD1(それぞれ10mg/kg、図18B)のいずれかの腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録する。それぞれの線は個々のマウスを示す。 図19は、ヒトHer2を発現するB16黒色腫細胞株を注射したマウス同系腫瘍モデルにおける種々の試験物の試験を示す。マウスは、黒い三角(▼)で記された日に、Janus、トラスツズマブまたは抗マウスPD1と抗マウスCTLA4(それぞれ10mg/kg)の組合せのいずれかの10mg/kgの腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録する。それぞれの線は個々のマウスを示す。 図20は、示された処置後のFACS染色によりアッセイされた場合の腫瘍細胞に対するMAL IIおよびPNAレクチンの結合を示す。MAL IIおよびPNA染色は、腫瘍細胞からの末端シアル酸の切断を示し、MAL II染色は、細胞表面シアル酸の消失の際に減少すると予想され、PNA染色は、細胞表面シアル酸の消失に伴って増加すると予想される。 図21は、示される処置後のフローサイトメトリーでアッセイした場合の、樹状細胞(DC)活性化マーカーHLA-DR、CD86およびCD83の細胞表面発現を示す。AはSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを用いて作製したJanus ASCを示し、BはSt-シアリダーゼを用いて作製した非Her2結合Janus ASCを示し、 CはロスオブファンクションSt-シアリダーゼ変異体およびトラスツズマブを用いて作製したJanus ASCを示す。* P≦0.05、** P≦0.01、*** P≦0.001および**** P≦0.0001。 図22A〜Dは、ΔM1、V6Y、I187KおよびC332A変異を有するヒトNeu2ならびにトラスツズマブを含むJanus ASCを用いた処置後の、IFNγ(図22A)、IL-1b(図22B)、IL-6(図22C)およびTNFα(図22D)の放出を示す。新たに単離したヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、示される濃度(μg/mlで示す)で24時間、Janusとインキュベートした。IL-2またはLPSを有するPHA-Lを、サイトカイン放出を刺激するための陽性対照として使用した。トラスツズマブ(Tras)を陰性対照として使用した。 図23A〜Dは、ΔM1、V6Y、I187KおよびC332A変異を有するヒトNeu2ならびにトラスツズマブを含むJanus ASCを用いた処置後の、IL-2(図23A)、IL-4(図23B)、IL-10(図23C)およびIL-13(図23D)放出を示す。新たに単離したヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、示される濃度(μg/mlで示す)で24時間、Janusとインキュベートした。IL-2またはLPSを有するPHA-Lを、サイトカイン放出を刺激するための陽性対照として使用した。トラスツズマブ(Tras)を陰性対照として使用した。 図24は、JanusおよびJanus LOFの、BioMAP VascHT29共培養腫瘍微小環境モデルへの添加後の示されるマーカーの相対的発現を示す。ビヒクル応答の歴史上の範囲を、ゼロベースラインに沿って影をつけた領域で表す。それぞれの測定についての値は、ビヒクル対照に対する試験物の比の対数により表す。歴史上の範囲を超える統計学的に意味のある値を有する分析物に注釈をつける。 図25は、JanusおよびペンブロリズマブのBioMAP VascHT29共培養腫瘍微小環境モデルへの添加後の示されるマーカーの相対的発現を示す。ビヒクル応答の歴史上の範囲を、ゼロベースラインに沿って影をつけた領域で表す。それぞれの測定についての値は、ビヒクル対照に対する試験物の比の対数により表す。歴史上の範囲を超える統計学的に意味のある値を有する分析物に注釈をつける。 図26A〜Bは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおけるJanus抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスは、黒い三角(▼)で記された日に、ビヒクルに対して、10mg/kgのJanus、トラスツズマブまたは非Her2結合Janusの腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。図26Aは、それぞれの処置群についての平均腫瘍体積を示す。図26Bは、それぞれの処置群における個々のマウスについての腫瘍体積を示す。完全応答(CR、試験の間の任意の時点での触診の限界未満の後退として定義)も示す。 図27A〜Bは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおけるヒトLobster抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスは、黒い三角(▼)で記された日に、10mg/kgのトラスツズマブ(図27B)、ヒトLobster 1(図27C)、ヒトLobster 2(図27D)およびビヒクル(図27A)の腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。グラフは、示される処置についての個々のマウスを示す。完全応答(CR、試験の間の任意の時点での触診の限界未満の後退として定義)も示す。 図27C〜Dは、ヒトHer2を発現するように作り変えられたEMT6マウス乳癌細胞を使用したマウス同系腫瘍モデルにおけるヒトLobster抗体シアリダーゼコンジュゲートの試験を示す。マウスは、黒い三角(▼)で記された日に、10mg/kgのトラスツズマブ(図27B)、ヒトLobster 1(図27C)、ヒトLobster 2(図27D)およびビヒクル(図27A)の腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。グラフは、示される処置についての個々のマウスを示す。完全応答(CR、試験の間の任意の時点での触診の限界未満の後退として定義)も示す。
詳細な説明
本発明の種々の特徴および局面を以下により詳細に記載する。本発明は、野生型ヒトシアリダーゼに対して少なくとも1つの変異、例えば少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または付加(挿入)を含む組換えヒトシアリダーゼを提供する。該変異、または変異の組合せは、シアリダーゼの発現、活性または発現と活性の両方を向上し得、癌の診断および/または治療におけるその使用を向上し得る。
本発明はさらに、シアリダーゼ酵素および抗体またはその一部、例えば免疫グロブリンFcドメインおよび/または抗原結合ドメインを含む融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートに関する。融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートのシアリダーゼ酵素部分は、野生型ヒトシアリダーゼに対して少なくとも1つの変異を含み得る。
本発明はさらに、癌、例えば上皮細胞癌を治療するための融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートを使用する医薬組成物および方法に関する。
I. 組換えヒトシアリダーゼ
本明細書で使用する場合、用語「シアリダーゼ」は、基質、例えば糖タンパク質または糖脂質から末端シアル酸残基を切断する任意の酵素またはその機能性断片をいう。用語、シアリダーゼは、野生型シアリダーゼ配列に対して1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入を有するバリアント、および/またはシアリダーゼを含む融合タンパク質もしくはコンジュゲートを含む。シアリダーゼはノイラミニダーゼとも称され、そうではないと示されない限り、2つの用語は本明細書において交換可能に使用される。本明細書で使用する場合、シアリダーゼの用語「機能性断片」は、対応する全長の天然に存在するシアリダーゼの酵素活性の例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または100%を保持する全長シアリダーゼの断片をいう。シアリダーゼ酵素活性は、例えば蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル-N-アセチルノイラミン酸(4MU-NeuAc)からのシアル酸の放出を測定することを含む当該技術分野で公知の任意の方法によりアッセイされ得る。ある態様において、機能性断片は、全長の天然に存在するシアリダーゼ中に存在する少なくとも100、150、200、250、300、310、320、330、340、350、360または370の連続したアミノ酸を含む。
4つのシアリダーゼがヒトゲノム中に発見されており、Neu1、Neu2、Neu3およびNeu4と称される。
ヒトNeu1は、β-ガラクトシダーゼおよびカテプシンAとの複合体で機能するリソソームノイラミニダーゼ酵素である。ヒトNeu1のアミノ酸配列は配列番号:7に示され、ヒトNeu1をコードするヌクレオチド配列は配列番号:23に示される。
ヒトNeu2はサイトゾルシアリダーゼ酵素である。ヒトNeu2のアミノ酸配列は配列番号:1に示され、ヒトNeu2をコードするヌクレオチド配列は配列番号:24に示される。
ヒトNeu3は、ガングリオシドに特異的な活性を有する形質膜シアリダーゼである。ヒトNeu3は、2つのアイソフォーム：アイソフォーム1およびアイソフォーム2を有する。ヒトNeu3、アイソフォーム1のアミノ酸配列は配列番号:8に示され、ヒトNeu3、アイソフォーム1をコードするヌクレオチド配列は配列番号:25に示される。ヒトNeu3、アイソフォーム2のアミノ酸配列は配列番号:9に示され、ヒトNeu3、アイソフォーム2をコードするヌクレオチド配列は配列番号:34に示される。
ヒトNeu4は2つのアイソフォームを有し、アイソフォーム1は表在膜タンパク質であり、アイソフォーム2はリソソーム内腔に局在する。ヒトNeu4、アイソフォーム1のアミノ酸配列は配列番号:10に示され、ヒトNeu4、アイソフォーム1をコードするヌクレオチド配列は配列番号:26に示される。ヒトNeu4、アイソフォーム2のアミノ酸配列は配列番号:11に示され、ヒトNeu4、アイソフォーム2をコードするヌクレオチド配列は配列番号:35に示される。
4つのシアリダーゼはマウスゲノム中でも発見されており、Neu1、Neu2、Neu3およびNeu4と称される。マウスNeu1のアミノ酸配列は配列番号:83に示され、マウスNeu1をコードするヌクレオチド配列は配列番号:87に示される。マウスNeu2のアミノ酸配列は配列番号:84に示され、マウスNeu2をコードするヌクレオチド配列は配列番号:88に示される。マウスNeu3のアミノ酸配列は配列番号:85に示され、マウスNeu3をコードするヌクレオチド配列は配列番号:89に示される。マウスNeu4のアミノ酸配列は配列番号:86に示され、マウスNeu4をコードするヌクレオチド配列は配列番号:90に示される。
例示的な原核生物シアリダーゼとしては、ネズミチフス菌およびコレラ菌由来のシアリダーゼが挙げられる。ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)のアミノ酸配列は配列番号:30に示され、ネズミチフス菌シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は配列番号:80に示される。コレラ菌シアリダーゼのアミノ酸配列は配列番号:81に示され、コレラ菌シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は配列番号:82に示される。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、対応する(または鋳型の)野生型ヒトシアリダーゼの酵素活性の約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%または100%より多くを有する。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは対応する野生型ヒトシアリダーゼと同じ基質特異性を有する。他の態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは対応する野生型ヒトシアリダーゼとは異なる基質特異性を有する。例えば、ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、α2,3、α2,6および/またはα2,8連結を切断し得る。ある態様において、シアリダーゼは、α2,3およびα2,8連結を切断し得る。
ある態様において、哺乳動物細胞、例えばHEK293細胞、CHO細胞、マウス骨髄腫細胞(NS0、Sp2/0)またはヒト線維肉腫細胞(HT-1080)、例えばHEK293細胞における組換え変異体ヒトシアリダーゼの発現収率は、対応する野生型ヒトシアリダーゼの発現収率の約10%、約20%、約50%、約75%、約100%、約150%、約200%、約250%、約300%、約400%、約500%、約600%、約700%、約800%、約900%または約1,000%より高い。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、対応する野生型ヒトシアリダーゼの酵素活性の約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%または100%より高い酵素活性を有し、哺乳動物細胞、例えばHEK293細胞における組換え変異体ヒトシアリダーゼの発現収率は、対応する野生型ヒトシアリダーゼの発現収率の約10%、約20%、約50%、約75%、約100%、約150%、約200%、約250%、約300%、約400%、約500%、約600%、約700%、約800%、約900%または約1,000%より高い。
a. システイン残基の置換
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、少なくとも1つのシステイン(cys、C)残基の置換を含む。シアリダーゼ中の特定のシステイン残基は、タンパク質凝集の結果として機能性タンパク質の発現を阻害し得ることが発見されている。したがって、ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、遊離システイン(例えばNeu1(配列番号:7)について、C111、C117、C171、C183、C218、C240、C242およびC252；Neu2(配列番号:1)について、C125、C196、C219、C272、C332およびC352；Neu3(配列番号:8)について、C7、C90、C99、C106、C127、C136、C189、C194、C226、C242、C250、C273、C279、C295、C356、C365、C368、C384、C383、C394およびC415；ならびにNeu4(配列番号:10)について、C88、C125、C126、C186、C191、C211、C223、C239、C276、C437、C453、C480およびC481)の少なくとも1つの変異を含む。遊離システインは任意のアミノ酸により置換され得る。ある態様において、遊離システインは、セリン(ser、S)、イソロイシン(iso、I)、バリン(val、V)、フェニルアラニン(phe、F)、ロイシン(leu、L)またはアラニン(ala、A)で置換される。Neu2における例示的なシステイン置換としては、C125A、C125I、C125S、C125V、C196A、C196L、C196V、C272S、C272V、C332A、C332S、C332V、C352LおよびC352Vが挙げられる。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは2つ以上のシステイン置換を含む。Neu2における例示的な二重または三重の置換としては：C125SおよびC332S；C272VおよびC332A；C272VおよびC332S；C332AおよびC352L；C125SおよびC196L；C196LおよびC352L；C196LおよびC332A；C332AおよびC352L；ならびにC196L、C332AおよびC352Lが挙げられる。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼはNeu2シアリダーゼであり、置換C322AおよびC352Lを含む(配列番号:5)。
ある態様において、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼ、例えばNeu2またはNeu3中に通常存在する2、3、4、5または6個のシステインでアミノ酸置換を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、本明細書以下の表2に列挙される置換または置換の組合せに対応する置換または置換の組合せを含む。
b. pIを増加するためおよび/または疎水性を減少するための残基の置換
タンパク質の等電点(pI)は、正味の電荷がゼロであるpHである。pIはまた、タンパク質が最小の可溶性であり、タンパク質を発現および精製する能力に影響するpHを示す。一般的に、タンパク質は、そのpIが溶液のpHよりも2単位高い場合に良好な溶解性を有する。ヒトNeu2は、7.5の予想pIを有する。したがって、ヒトNeu2は、中性pHの周囲で最小の可溶性であり、発現系および生理学系は中性pHにあるのでこれは望ましくない。対照的に、良好な溶解性および組み換え発現を示すネズミチフス菌由来のシアリダーゼ(St-シアリダーゼ)は、9.6のpIを有する。したがって、ヒトNeu2または他のヒトシアリダーゼの発現を増加するために、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、1つ以上のアミノ酸置換(1つまたは複数)を含むように設計され得、ここで該置換(1つまたは複数)は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのpIを増加する。さらに、シアリダーゼの表面上の疎水性アミノ酸の数の減少は、例えば凝集を低減することによりシアリダーゼの発現を向上し得る。したがって、ヒトNeu2または他のヒトシアリダーゼの発現を増加するために、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、1つ以上のアミノ酸置換(1つまたは複数)を含むように設計され得、ここで該置換(1つまたは複数)は、置換(1つまたは複数)を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの表面の疎水性を減少する。
したがって、ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加し、および/またはシアリダーゼの疎水性を減少する。これは、1つ以上の荷電アミノ酸、例えば正または負に荷電したアミノ酸を、組換えシアリダーゼに導入することにより達成され得る。ある態様において、アミノ酸置換は、荷電アミノ酸、例えば正に荷電したアミノ酸、例えばリジン(lys、K)、ヒスチジン(his、H)もしくはアルギニン(arg、R)、または負に荷電したアミノ酸、例えばアスパラギン酸(asp、D)もしくはグルタミン酸(glu、E)に対するものである。ある態様において、アミノ酸置換はリジン残基に対するものである。ある態様において、該置換は、シアリダーゼのpIを、約7.75、約8、約8.25、約8.5、約8.75、約9、約9.25、約9.5または約9.75まで増加する。
ある態様において、アミノ酸置換は、表面露出DもしくはEアミノ酸で、ヘリックスもしくはループ中で、またはSt-シアリダーゼの対応する位置にKもしくはRを有する位置において起こる。ある態様において、アミノ酸置換は、触媒部位から離れたもしくはそうでなければ触媒に含まれないアミノ酸、他のヒトNeuタンパク質もしくはSt-シアリダーゼもしくはクロストリジウムNanHにより保存されないアミノ酸、または機能に重要なドメイン(例えばAsp-ボックスまたはβストランド)内に位置しないアミノ酸で起こる。
置換を有さないシアリダーゼに対してシアリダーゼの等電点(pI)を増加するおよび/またはシアリダーゼの疎水性を減少するNeu2中の例示的なアミノ酸置換としては、A2E、A2K、D215K、V325E、V325K、E257KおよびE319Kが挙げられる。ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、例えばA2KおよびV325E、A2KおよびV325K、E257KおよびV325K、A2KおよびE257K、ならびにE257KおよびA2KおよびV325Kを含む2つ以上のアミノ酸置換を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、置換または本明細書中以下の表3に列挙される置換の組合せに対応する置換または置換の組合せを含む。
c. N末端ペプチドおよびNまたはC末端置換の付加
2つ以上のアミノ酸のペプチド配列の、ヒトシアリダーゼのN末端への付加は、シアリダーゼの発現および/または活性を向上し得ることが発見されている。ある態様において、ペプチドは、少なくとも2アミノ酸長、例えば2〜20、2〜10、2〜5または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20アミノ酸長である。ある態様において、ペプチドは、αへリックス形成し得るかまたはαヘリックスを形成するための傾向を有し得る。
マウスにおいて、胸腺に見られるNeu2アイソフォーム(B型)は、骨格筋に見られるNeu2のカノニカルアイソフォームに存在しない6個のアミノ酸を含む。本明細書のある態様において、マウス胸腺Neu2アイソフォームのN末端6アミノ酸、MEDLRP(配列番号:4)またはその変形は、ヒトNeu、例えばヒトNeu2に付加され得る。ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、シアリダーゼのN末端アミノ酸と共有結合した少なくとも2アミノ酸残基長のペプチドを含む。ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、シアリダーゼのN末端アミノ酸と共有結合したペプチドMEDLRP(配列番号:4)またはEDLRP(配列番号:3)を含む。ある態様において、シアリダーゼはさらに、ペプチド、例えばMEDLRP(配列番号:4)またはEDLRP(配列番号:3)とシアリダーゼの残りの間に位置する切断部位、例えばタンパク質分解性切断部位を含み得る。ある態様において、ペプチド、例えばMEDLRP(配列番号:4)またはEDLRP(配列番号:3)は、シアリダーゼの残りから翻訳後に切断され得る。
N末端付加とは代替的に、またはN末端付加と組み合わせて、組換え変異体ヒトシアリダーゼの12アミノ酸N末端領域の1〜5アミノ酸が除去され得、例えばN末端メチオニンが除去され得る。ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼがNeu2である場合、N末端メチオニンは除去され得るか、最初の5アミノ酸(MASLP；配列番号:12)が除去され得るか、または第2〜第4アミノ酸(ASLP；配列番号:13)が除去され得る。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼの12アミノ酸N末端領域の1〜5アミノ酸は、MEDLRP(配列番号:4)、EDLRP(配列番号:3)またはTVEKSVVF(配列番号:14)と置換される。例えば、ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼがNeu2である場合、アミノ酸MASLP(配列番号:12)、ASLP(配列番号:13)またはMは、MEDLRP(配列番号:4)、EDLRP(配列番号:3)またはTVEKSVVF(配列番号:14)と置換される。
ヒトシアリダーゼは、中心軸の周囲に赤道面方向に配置される6枚羽根形状のβシートを特徴とするβプロペラ構造を有する。一般的に、N末端とC末端の羽根の間などのβプロペラの羽根の間での疎水性相互作用は安定性を高める。したがって、ヒトNeu2または他のヒトシアリダーゼの発現を増加するために、シアリダーゼのN末端とC末端のβプロペラの羽根の間で疎水性相互作用および/または水素結合を増加するアミノ酸置換を含む組換え変異体ヒトシアリダーゼが設計され得る。
したがって、ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換を含み、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのN末端とC末端の間で疎水性相互作用および/または水素結合を増加する。ある態様において、野生型アミノ酸は、アスパラギン(asn、N)、リジン(lys、K)、チロシン(tyr、Y)、フェニルアラニン(phe、F)またはトリプトファン(trp、W)で置換される。N末端とC末端の間で疎水性相互作用および/または水素結合を増加するNeu2における例示的な置換としては、L4N、L4K、V6Y、L7N、L4NおよびL7N、L4NおよびV6YおよびL7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6FまたはV6Wが挙げられる。ある態様において、シアリダーゼはV6Y置換を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、上記の置換の組合せを含む。例えば、組換え変異体ヒトNeu2シアリダーゼは、N末端にさらなるアミノ酸MEDLRP(配列番号:4)、EDLRP(配列番号:3)またはTVEKSVVF(配列番号:14)を含み得、それと組み合わせて、少なくとも1つのL4N、L4K、V6Y、L7N、L4NおよびL7N、L4NおよびV6YおよびL7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6FまたはV6W置換を含み得る。ある態様において、組換え変異体ヒトNeu2シアリダーゼのアミノ酸MASLP(配列番号:12)、ASLP(配列番号:13)またはMは、MEDLRP(配列番号:4)、EDLRP(配列番号:3)またはTVEKSVVF(配列番号:14)で置き換えられ、組換え変異体ヒトNeu2シアリダーゼはまた、少なくとも1つのL4N、L4K、V6Y、L7N、L4NおよびL7N、L4NおよびV6YおよびL7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6FまたはV6W置換を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、置換または以下の本明細書中の表4または5に列挙される置換の組合せに対応する置換または置換の組合せ、を含む。
さらに、ある態様において、シアリダーゼは、シアリダーゼのN末端でN末端メチオニンの置換もしくは欠失を含む。例えば、ある態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の1位に対応する位置にメチオニン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトNeu2の1位に対応する位置でメチオニンはアラニン(M1A)またはアスパラギン酸(M1D)により置換される。他の態様において、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の1位に対応する位置でのメチオニン残基の欠失(ΔM1)を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、置換または以下の本明細書中の表6に列挙される置換の組合せに対応する置換または置換の組合せを含む。
d. 他の置換および置換の組合せ
本発明はさらに、以下の置換：I187K、A328E、K370NまたはH210Nの少なくとも1つを含む組換え変異体ヒトNeu2シアリダーゼを提供する。ある態様において、組換え変異体ヒトNeu2は、アミノ酸SMDQGSTW(配列番号:16)またはSTDGGKTW(配列番号:17)によるアミノ酸GDYDAPTHQVQW(配列番号:15)の置換を含む。ある態様において、組換え変異体ヒトNeu2は、アミノ酸QTPLEAAC(配列番号:19)によるアミノ酸PRPPAPEA(配列番号:18)の置換を含む。ある態様において、組換え変異体ヒトNeu2は、アミノ酸SQNDGES(配列番号:21)によるアミノ酸NPRPPAPEA(配列番号:20)の置換を含む。
本発明はさらに、V212、A213、Q214、D215、T216、L217、E218、C219、Q220、V221、A222、E223、V224、E225またはT225に対応する位置で少なくとも1つの置換を含む組換え変異体ヒトNeu2シアリダーゼを提供する。
本発明はさらに、本明細書において企図される変異のいずれかの組合せを含む組換え変異体ヒトNeu2シアリダーゼを提供する。例えば、組換え変異体シアリダーゼ酵素は、本明細書において企図される変異の2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の組合せを含み得る。例えば、組換え変異体シアリダーゼ酵素は、M1欠失(ΔM1)、M1A置換、M1D置換、V6Y置換、I187K置換、C332A置換または前述のいずれかの組合せを含み得る。例えば、組換え変異体シアリダーゼ酵素は：M1AおよびV6Y；M1AおよびI187K；M1AおよびC332A；M1DおよびV6Y；M1DおよびI187K；M1DおよびC332A；ΔM1およびV6Y；ΔM1およびI187K；ΔM1およびC332A；V6YおよびI187K；V6YおよびC332A；I187KおよびC332A；M1A、V6YおよびI187K；M1A、V6YおよびC332A；M1A、I187KおよびC332A；M1D、V6YおよびI187K；M1D、V6YおよびC332A；M1D、I187KおよびC332A；ΔM1、V6YおよびI187K；ΔM1、V6YおよびC332A；ΔM1、I187KおよびC332A；V6Y、I187KおよびC332A；M1A、V6Y、I187KおよびC332A；M1D、V6Y、I187KおよびC332A；ならびにΔM1、V6Y、I187KおよびC332Aから選択される変異の組合せを含み得る。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、置換または以下の本明細書の表7に列挙される置換の組合せに対応する置換または置換の組合せを含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72もしくは配列番号:73のアミノ酸配列、または配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72もしくは配列番号:73に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、
Figure 2021509585
 (配列番号:100)のアミノ酸配列を含み、ここでX1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Valであるか、または存在せず、X2は、AlaまたはLysであり、X3は、AsnまたはLeuであり、X4は、Phe、Trp、TyrまたはValであり、X5は、Ala、Cys、Ile、SerまたはValであり、X6は、Arg、IleまたはLysであり、X7は、Ala、Cys、LeuまたはValであり、X8は、GluまたはLysであり、X9は、CysまたはValであり、X10は、LysまたはValであり、X11は、Ala、Cys、SerまたはValであり、X12は、Cys、LeuまたはValであり、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)に対して少なくとも1つの変異を含む。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、
Figure 2021509585
 (配列番号:91)のアミノ酸配列を含み、ここでX1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Valであるかまたは存在せず、X2は、Phe、Trp、TyrまたはValであり、X3は、Arg、IleまたはLysであり、X4は、Ala、Cys、SerまたはValであり、シアリダーゼは、野生型ヒトNeu2(配列番号:1)に対して少なくとも1つの変異を含む。ある態様において、X1は、Ala、Asp、Metであるかまたは存在せず、X2は、TyrまたはValであり、X3は、IleまたはLysであり、X4は、AlaまたはCysである。
ある態様において、組換え変異体ヒトシアリダーゼは、本明細書に開示される組換え変異体ヒトシアリダーゼ配列に対して保存性の置換を含む。本明細書で使用する場合、用語「保存性の置換」は、構造的に類似のアミノ酸での置換をいう。例えば、保存性の置換としては、以下の群：SerおよびCys；Leu、IleおよびVal；GluおよびAsp；LysおよびArg；Phe、TyrおよびTrp；ならびにGln、Asn、Glu、AspおよびHis内のものが挙げられ得る。保存性の置換はまた、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)アルゴリズム、BLOSUM置換マトリックス(例えばBLOSUM 62マトリックス)またはPAM置換:pマトリックス(例えばPAM 250マトリックス)により定義され得る。
配列同一性は、当業者の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアを使用して決定され得る。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるアルゴリズムを使用したBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)分析(Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402、本明細書において参照により援用される)は、配列類似性の検索のために調整される。配列データベースの検索における基本的な問題の議論については、本明細書において参照により十分に援用されるAltschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129参照。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大の整列(alignment)を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定し得る。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、エクスペクト(すなわちデータベース配列に対する適合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルト設定にある。blastp、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックスである(Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919、本明細書において参照により十分に援用される)。4つのblastnパラメーターは以下の通りに調整され得る：Q=10(ギャップ生成ペナルティー)；R=10(ギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty))；wink=1(クエリに沿ってwink.sup.thの位置毎にワードヒットを生じる)；およびgapw=16(ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する)。同等のblastpパラメーター設定は、Q=9；R=2；wink=1；およびgapw=32であり得る。検索はまた、NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST Advanced Optionパラメーターを使用して実施され得る(例えば：-G、オープンギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11；-E、伸長ギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1；-q、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー[整数]：デフォルト=-3；-r、ヌクレオチド適合についての報酬(reward)[整数]：デフォルト=1；-e、予測値[実数]：デフォルト=10；-W、ワードサイズ[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3；-y、ビットでのblast伸長についてのドロップオフ(X)：デフォルト=blastnについて20/その他について7；-X、ギャップのあるアラインメントについてのXドロップオフ値(ビット(in bit))：デフォルト=全てのプログラムについて15であるがblastnには適用可能ではない；および-Z、ギャップのあるアラインメントについての最終Xドロップオフ値(ビット)：blastnについて50、その他について25)。ペアワイズタンパク質アラインメントについてのClustalWも使用され得る(デフォルトパラメータは、例えばBlosum62マトリックスおよびギャップオープンペナルティー(Gap Opening Penalty)=10およびギャップ伸長ペナルティー=0.1を含み得る)。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間の最適合比較はDNAパラメーターGAP=50(ギャップ生成ペナルティー)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティー)を使用する。最適合タンパク質比較における同等の設定はGAP=8およびLEN=2である。
II. 融合タンパク質/抗体コンジュゲート
過シアリル化された癌細胞上および/または腫瘍微小環境中のシアル酸の選択的な除去を促進するために、本明細書に記載されるようなシアリダーゼをかかる細胞またはかかる腫瘍微小環境に標的化することが有用であり得る。さらに、被験体におけるシアリダーゼによるシアル酸の除去を促進するために、被験体におけるシアリダーゼの血漿半減期を延長することが有用であり得る。これらは、融合タンパク質および/または抗体コンジュゲート(例えば化学的にコンジュゲートされたコンジュゲート)においてシアリダーゼを含むことにより達成され得る。
したがって、本発明はさらに、シアリダーゼ酵素、またはその機能性断片、および抗体の一部または断片、例えば免疫グロブリンFcドメイン(本明細書においてFcドメインとも称される)、または免疫グロブリン抗原結合ドメイン(本明細書において抗原結合ドメインとも称される)を含む融合タンパク質を提供する。ある態様において、シアリダーゼおよび抗体またはその一部(例えば免疫グロブリンFcドメインまたは抗原結合ドメイン)は、ペプチド結合またはアミノ酸リンカーにより連結される。
本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「融合タンパク質」は、2つ以上の別々のタンパク質またはポリペプチド鎖に基づくアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖をいうと解され、ここで2つのアミノ酸配列は、直接または介在リンカー配列を介して、例えば介在アミノ酸リンカーを介して融合して一緒になり得る。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば従来の組換えDNA技術を使用して作製され得る。
ある態様において、融合タンパク質は、タグ、例えばStrepタグ(例えばStrep IIタグ)、Hisタグ(例えば10x Hisタグ)、mycタグまたはFLAGタグを含む。タグは、融合タンパク質のC末端またはN末端に配置され得る。ある態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端の方向で、免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドに連結されるシアリダーゼ部分を含み、ここで該シアリダーゼ部分は、MEDLRP(配列番号:4)のN末端付加を含み、Strep IIタグは、免疫グロブリン重鎖のC末端またはシアリダーゼ部分のN末端に配置される。
a. シアリダーゼ部分
本明細書に記載される融合タンパク質のシアリダーゼ部分は、任意のシアリダーゼ、例えば真菌、細菌、非ヒト哺乳動物またはヒトのシアリダーゼであり得る。ある態様において、シアリダーゼ部分は、野生型ヒトシアリダーゼに対して、少なくとも1つの変異、例えば上述のような少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または付加を含む組換えヒトシアリダーゼである。
ある態様において、シアリダーゼは、本明細書に開示される任意の組換え変異体ヒトシアリダーゼまたはその機能性断片である。
ある態様において、シアリダーゼ部分は、C332AおよびC352Lの変異を含む。ある態様において、シアリダーゼは、MEDLRP(配列番号:4)またはEDLRP(配列番号:3)のN末端付加を含む。ある態様において、シアリダーゼ部分は、N末端にLSHSLST(配列番号:22)ペプチドを含む。ある態様において、シアリダーゼ部分は、MEDLRP(配列番号:4)のN末端付加およびA2K置換を含む。ある態様において、シアリダーゼ部分は、MEDLRP(配列番号:4)のN末端付加およびC332A置換を含む。ある態様において、シアリダーゼ部分は、MEDLRP(配列番号:4)のN末端付加、C332A置換およびC352L置換を含む。
ある態様において、シアリダーゼ部分は、M1欠失(ΔM1)、M1A置換、M1D置換、V6Y置換、I187K置換、C332A置換、または前述のいずれかの組合せを含む。例えば、シアリダーゼ部分は：M1AおよびV6Y；M1AおよびI187K；M1AおよびC332A；M1DおよびV6Y；M1DおよびI187K；M1DおよびC332A；ΔM1およびV6Y；ΔM1およびI187K；ΔM1およびC332A；V6YおよびI187K；V6YおよびC332A；I187KおよびC332A；M1A、V6YおよびI187K；M1A、V6YおよびC332A；M1A、I187KおよびC332A；M1D、V6YおよびI187K；M1D、V6YおよびC332A；M1D、I187KおよびC332A；ΔM1、V6YおよびI187K；ΔM1、V6YおよびC332A；ΔM1、I187KおよびC332A；V6Y、I187KおよびC332A；M1A、V6Y、I187KおよびC332A；M1D、V6Y、I187KおよびC332A；ならびにΔM1、V6Y、I187KおよびC332Aから選択される変異の組合せを含み得る。
ある態様において、シアリダーゼ部分は、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72もしくは配列番号:73のアミノ酸配列、または配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72もしくは配列番号:73に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
b. 抗体部分
本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「抗体」は、完全(intact)な抗体(例えば完全なモノクローナル抗体)、またはその断片、例えば抗体のFc断片(例えばモノクローナル抗体のFc断片)、または抗体の抗原結合断片(例えばモノクローナル抗体の抗原結合断片)、例えば改変されたか、作り変えられたかまたは化学的にコンジュゲートされた完全な抗体、抗原結合断片またはFc断片を意味すると解される。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、単鎖抗体(例えばscFv)、ミニボディおよびダイアボディが挙げられる。改変されたかまたは作り変えられた抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体および多重特異性的抗体(例えば二重特異的抗体)が挙げられる。化学的にコンジュゲートされた抗体の例は、毒素部分にコンジュゲートされた抗体である。
ある態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリンFcドメインを含む。本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「免疫グロブリンFcドメイン」は、単独または第2の免疫グロブリンFcドメインとの組合せのいずれかで、Fc受容体に結合し得る免疫グロブリン重鎖定常領域の断片をいう。免疫グロブリンFcドメインは、例えば免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインを含み得る。免疫グロブリンFcドメインは、例えば免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインならびに免疫グロブリンヒンジ領域を含み得る。免疫グロブリンヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインの間の境界は当該技術分野で周知であり、例えばPROSITEデータベース(prosite.expasy.orgでワールドワイドウェブ上で利用可能)において見られ得る。
ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEおよびIgM Fcドメインに由来する。単一のアミノ酸置換(KabatナンバリングによるとS228P；IgG4Proと示される)は、組換えIgG4抗体において観察される異質性を破壊するために導入され得る。Angal, S. et al. (1993) MOL. IMMUNOL. 30:105-108参照。
ある態様において、免疫グロブリンFcドメインはヒトIgG1アイソタイプまたは抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)および/または補体媒介細胞傷害性(CDC)を誘発する別のアイソタイプに由来する。ある態様において、免疫グロブリンFcドメインはヒトIgG1アイソタイプ(例えば配列番号:31または配列番号:69)に由来する。
ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、ヒトIgG4アイソタイプまたは抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)および/または補体媒介細胞傷害性(CDC)をほとんどまたは全く誘発しない別のアイソタイプに由来する。ある態様において、免疫グロブリンFcドメインはヒトIgG4アイソタイプに由来する。
ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、第2のポリペプチドとのヘテロ二量体化のために「(knob」変異、例えばT366Yまたは「hole」変異、例えばY407T(EUナンバリングによる残基番号、Kabat, E.A., et al. (1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, FIFTH EDITION, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)のいずれかを含む。
ある態様において、融合タンパク質は免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む。かかるドメインを含むことにより、融合タンパク質のシアリル化癌細胞および/または腫瘍微小環境への標的化が向上され得る。本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「免疫グロブリン抗原結合ドメイン」は、単独または別の免疫グロブリン抗原結合ドメインとの組合せで、抗原結合部位を画定するポリペプチドをいう。例示的な免疫グロブリン抗原結合ドメインとしては、例えば免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域が挙げられ、ここで可変領域は一緒になって、抗原結合部位を画定する。
免疫グロブリン抗原結合ドメインおよび/または抗原結合部位は、例えば、アデカツムマブ、アスクリンバクマブ(ascrinvacumab)、シクスツムマブ(cixutumumab)、コナツムマブ(conatumumab)、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ヅリゴツマブ(duligotumab)、デュルバルマブ、ドゥシギツマブ(dusigitumab)、エンホルツマブ、エノチクマブ(enoticumab)、エプラツズマブ(epratuxumab)、フィギツムマブ(figitumumab)、ガニツマブ(ganitumab)、グレンバツムマブ(glembatumumab)、インテツムマブ(intetumumab)、イピリムマブ、イラツムマブ、イクルクマブ(icrucumab)、レクサツムマブ、ルカツムマブ(lucatumumab)、マパツムマブ、ナルナツマブ(narnatumab)、ネシツムマブ、ネスバクマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、プリツムマブ(pritumumab)、ラドレツマブ(radretumab)、ラムシルマブ(ramucirumab)、リロツムマブ(rilotumumab)、ロバツムマブ(robatumumab)、セリバンツマブ(seribantumab)、タレクスツマブ(tarextumab)、テプロツムマブ、トベツマブ(tovetumab)、バンチクツマブ(vantictumab)、ベセンクマブ(vesencumab)、ボツムマブ(votumumab)、ザルツムマブ(zalutumumab)、フランボツマブ(flanvotumab)、アルツモマブ、アナツモマブ(anatumomab)、アルシツモマブ(arcitumomab)、ベクツモマブ(bectumomab)、ブリナツモマブ、デツモマブ(detumomab)、イブリツモマブ、ミンレツモマブ(minretumomab)、ミツモマブ(mitumomab)、モクセツモマブ、ナプツモマブ、ノフェツモマブ(nofetumomab)、ペムツモマブ(pemtumomab)、ピンツモマブ(pintumomab)、ラコツモマブ(racotumomab)、サツモマブ(satumomab)、ソリトマブ(solitomab)、タプリツモマブ(taplitumomab)、テナツモマブ(tenatumomab)、トシツモマブ、トレメリムマブ、アバゴボマブ(abagovomab)、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、イゴボマブ(igovomab)、オレゴボマブ、カプロマブ、エドレコロマブ、ナコロマブ(nacolomab)、アマツキシマブ(amatuximab)、バビツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、デルロツキシマブ(derlotuximab)、ジヌツキシマブ、エンシツキシマブ(ensituximab)、フツキシマブ(futuximab)、ギレンツキシマブ、インダツキシマブ(indatuximab)、イサツキシマブ、マルゲツキシマブ(margetuximab)、リツキシマブ、シルツキシマブ、ウブリツキシマブ(ublituximab)、エクロメキシマブ(ecromeximab)、アビツズマブ(abituzumab)、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ(bivatuzumab)、ブロンチクツズマブ(brontictuzumab)、カンツズマブ(cantuzumab)、カンツズマブ、シタツズマブ(citatuzumab)、クリバツズマブ、ダセツズマブ、デムシズマブ(demcizumab)、ダロツズマブ、デニンツズマブ(denintuzumab)、エロツズマブ、エマクツズマブ(emactuzumab)、エミベツズマブ、エノブリツズマブ(enoblituzumab)、エタラシズマブ、ファーレツズマブ(farletuzumab)、フィクラツズマブ、ゲムツズマブ、イムガツズマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、リファスツズマブ、リンツズマブ、リリルマブ(lirilumab)、ロルボツズマブ(lorvotuzumab)、ルムレツズマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、モクセツモマブ、ニモツズマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オトレツズマブ(otlertuzumab)、オナルツズマブ、オポルツズマブ(oportuzumab)、パルサツズマブ(parsatuzumab)、ペルツズマブ、ピジリズマブ(pidilizumab)、ピナツズマブ(pinatuzumab)、ポラツズマブ(polatuzumab)、シブロツズマブ(sibrotuzumab)、シムツズマブ(simtuzumab)、タカツズマブ、ティガツズマブ(tigatuzumab)、トラスツズマブ、ツコツズマブ(tucotuzumab)、ウレルマブ(urelumab)、バンドルツマブ、バヌシズマブ、ベルツズマブ(veltuzumab)、ボルセツズマブ、ソフィツズマブ、カツマキソマブ(catumaxomab)、エルツマキソマブ(ertumaxomab)、デパツキシズマブ、オンツキシズマブ(ontuxizumab)、ブロンツベトマブ(blontuvetmab)、タムツベトマブ(tamtuvetmab)、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、エプラツズマブ、MEDI9447、ウレルマブ(urelumab)、ウトミルマブ(utomilumab)、hu3F8、hu14.18-IL-2、3F8/OKT3BsAb、リリルマブ、BMS-986016 ピディリズマブ(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、BMS-936559、アテゾリズマブおよびアベルマブから選択される抗体に由来し得る。ある態様において、免疫グロブリン抗原結合ドメインは、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブおよびリツキシマブから選択される抗体に由来し得る。
ある態様において、免疫グロブリン抗原結合ドメインはトラスツズマブに由来する。トラスツズマブ重鎖アミノ酸配列は配列番号:40に示され、トラスツズマブ軽鎖アミノ酸配列は配列番号:41に示される。トラスツズマブ由来の例示的なscFvのアミノ酸配列は配列番号:42に示される。
免疫グロブリン抗原結合ドメインおよび/または抗原結合部位は、例えばアデノシンA2a受容体(A2aR)、Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP4)、B黒色腫抗原(BAGE)、刷り込み部位の調節因子の兄弟(brother of the regulator of imprinted sites) (BORIS)、ブレークポイントクラスター領域(breakpoint cluster region) Abelson チロシンキナーゼ(BCR/ABL)、CA125、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD52、CD73、CD137、癌胎児性抗原(CEA)、CS1、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)、エストロゲン受容体結合部位関連抗原9(EBAG9)、上皮成長因子(EGF)、上皮成長因子受容体(EGFR)、EGF様モジュール受容体2(EMR2)、上皮細胞接着分子(EpCAM) (17-1A)、FR-α、G抗原(GAGE)、ジシアロガングリオシド(disialoganglioside) GD2 (GD2)、糖タンパク質100(gp100)、ヒト上皮成長因子受容体2 (Her2)、肝細胞成長因子(HGF)、ヒトパピローマウイルス16(HPV-16)、熱ショックタンパク質105(HSP105)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1型(IDH1)、イディオタイプ(NeuGcGM3)、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO1)、IGF-1、IGF1R、IGG1K、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、リンパ球抗原6複合体K(LY6K)、マトリックスメタロプロテイナーゼ16(MMP16)、メラノトランスフェリン(MFI2)、黒色腫抗原3(MAGE-A3)、黒色腫抗原C2(MAGE-C2)、黒色腫抗原D4(MAGE-D4)、T細胞により認識される黒色腫抗原1(Melan-A/MART-1)、N-メチル-N'-ニトロソ-グアニジンヒト骨肉腫形質転換遺伝子(MET)、ムチン1(MUC1)、ムチン4(MUC4)、ムチン16(MUC16)、ニューヨーク食道扁平上皮癌(New York esophageal squamous cell carcinoma) 1 (NY-ESO-1)、前立腺酸性(prostatic acid)ホスファターゼ(PAP)、プログラム細胞死受容体1(PD-1)、プログラム細胞死受容体リガンド1(PD-L1)、ホスファチジルセリン、黒色腫の優先的に発現される抗原(PRAME)、前立腺特異的抗原(PSA)、プロテインチロシンキナーゼ7(PTK7、結腸癌キナーゼ4(CCK4)としても公知)、受容体チロシンキナーゼオーファン受容体1 (ROR1)、散乱因子(scatter factor)受容体キナーゼ、シアリル-Tn、***関連抗原9 (SPAG-9)、滑膜肉腫X染色体切断点(X chromosome breakpoint)1(SSX1)、サーバイビン、テロメラーゼ、T-細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3(TIM-3)、血管内皮成長因子(VEGF)(例えばVEGF-A)、血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2)、T細胞活性化のVドメイン免疫グロブリン含有サプレッサー(VISTA)、ウィルムス腫瘍1(WT1)、X染色体抗原1b(XAGE-1b)、5T4、メソテリン、グリピカン3 (GPC3)、葉酸塩受容体α(FRα)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、cMET、CD38、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD123、CLDN6、CLDN9、LRRC15、PRLR (プロラクチン(Prolactin)受容体)、RINGフィンガータンパク質43 (RNF43)、Uroplakin-1 B (UPK1 B)、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー9(TNFSF9)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー21(TNFSRF21)、骨形成タンパク質受容体-1B型(BMPR1B)、クリングルドメイン含有膜貫通タンパク質2(KREMEN2)、デルタ様タンパク質3 (DLL3)、Siglec7およびSiglec9から選択される癌抗原に結合する抗体に由来し得る。さらなる例示的な癌抗原としては、癌幹細胞上で見られるもの、例えばSSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA1、CD133 (AC133)、CD90 (Thy-1)、CD326 (EpCAM)、Cripto-1 (TDGF1)、PODXL-1 (ポドカリキシン様タンパク質1)、ABCG2、CD24、CD49f (インテグリンα6)、Notch2、CD146 (MCAM)、CD10 (Neprilysin)、CD117 (c-KIT)、CD26 (DPP-4)、CXCR4、CD34、CD271、CD13 (アラニンアミノペプチダーゼ)、CD56 (NCAM)、CD105 (エンドグリン)、LGR5、CD114 (CSF3R)、CD54 (ICAM-1)、CXCR1,2、TIM-3 (HAVCR2)、CD55 (DAF)、DLL4 (デルタ様リガンド4)、CD20 (MS4A1)およびCD96が挙げられる。
本発明はさらに、本明細書において開示される融合タンパク質の1つ以上を含む抗体コンジュゲートを提供する。本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「抗体コンジュゲート」は、さらなる機能性部分にコンジュゲートされた(例えば共有結合)、抗原結合活性および/またはFc受容体結合活性を含む抗体またはその機能性断片をいうと解される。ある態様において、抗体または機能性抗体断片は、シアリダーゼ酵素、例えば本明細書において開示される組換え変異体ヒトシアリダーゼ酵素にコンジュゲートされる。ある態様において、抗体コンジュゲートは、単一のポリペプチド鎖を含む。ある態様において、抗体コンジュゲートは、共有結合的または非共有結合的に結合して一緒になって多量体複合体、例えば二量体、三量体または四量体複合体を生じる、2、3、4またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む。
表1は、本発明による使用に適切な抗体および抗体-薬物コンジュゲート、該抗体または抗体-薬物コンジュゲートにより結合される抗原、ならびに特定の抗体について、該抗体または抗体-薬物コンジュゲートにより標的化される癌の型を示す。
Figure 2021509585
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c. リンカー
ある態様において、融合タンパク質のシアリダーゼ部分は、融合タンパク質の抗体部分(例えば免疫グロブリンFcドメインおよび/または免疫グロブリン抗原結合ドメイン)に直接、連結または融合し得る。他の態様において、シアリダーゼ部分は、リンカーにより抗体部分に共有結合され得る。
リンカーは、1つ以上の天然のアミノ酸、シアリダーゼまたはそれらの機能性断片、および抗体部分または断片と連結し得、ここでアミノ酸(例えばシステインアミノ酸)は、部位誘導性突然変異誘発により導入され得る。リンカーは、1つ以上の非天然のアミノ酸を含み得る。特定の状況において、例えば1つ以上のスルフヒドリル反応性基(例えばマレイミド)を含むリンカーは、天然に存在するシステイン残基であるかまたは部位特異的突然変異誘発の産物であるシアリダーゼ部分または抗体部分中のシステインと共有結合し得ることが企図される。
リンカーは、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーであり得る。任意にまたはさらに、リンカーは可撓性リンカーまたは非可撓性リンカーであり得る。
リンカーは、シアリダーゼおよび抗体部分が互いからの立体障害なく連結されることを可能にするのに十分な長さであり、融合タンパク質の目的の活性を保持するのに十分な短さであるべきである。リンカーは、好ましくは融合タンパク質の不安定性を回避するかまたは最小化するのに十分に親水性である。リンカーは、好ましくは融合タンパク質の不溶性を回避するかまたは最小化するのに十分に親水性である。リンカーは、融合タンパク質がインビボで操作性され得るように、インビボで、十分に安定(例えば血清、酵素等で切断されない)であるべきである。
リンカーは、約1オングストローム(Å)〜約150Åの長さ、または約1Å〜約120Åの長さ、または約5Å〜約110Åの長さ、または約10Å〜約100Åの長さであり得る。リンカーは、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30オングストロームもしくはそれ以上より長い長さおよび/または約110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31Åもしくはそれ以下未満の長さであり得る。さらに、リンカーは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110および120Åの長さであり得る。
ある態様において、リンカーは、融合タンパク質のシアリダーゼ部分を、融合タンパク質の抗体部分(例えば免疫グロブリンFcドメインおよび/または免疫グロブリン抗原結合ドメイン)に連結または融合させるポリペプチドリンカーを含む。例えば、直接または間接的に(例えばアミノ酸含有リンカーを介して)抗体部分に連結されるシアリダーゼ部分をコードする遺伝子は、従来の組換えDNA技術を使用して作製され得、発現され得ることが企図される。例えば、シアリダーゼ部分のアミノ末端は、抗体部分の軽鎖または重鎖のいずれかのカルボキシ末端に連結され得る。例えば、Fab断片につて、シアリダーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端は、抗体重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)に連結され得る。リンカーを使用する場合、リンカーは、親水性アミノ酸残基、例えばGln、Ser、Gly、Glu、Pro、HisおよびArgを含み得る。ある態様において、リンカーは、1〜25アミノ酸残基、1〜20アミノ酸残基、2〜15アミノ酸残基、3〜10アミノ酸残基、3〜7アミノ酸残基、4〜25アミノ酸残基、4〜20アミノ酸残基、4〜15アミノ酸残基、4〜10アミノ酸残基、5〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、5〜15アミノ酸残基または5〜10アミノ酸残基を含むペプチドである。例示的なリンカーとしては、グリジンおよびセリンリッチリンカー、例えば(GlyGlyPro)nまたは(GlyGlyGlyGlySer)nが挙げられ、ここでnは1〜5である。ある態様において、リンカーは(Gly4Ser)2である。さらなる例示的なリンカー配列は、例えばGeorge et al. (2003) PROTEIN ENGINEERING 15:871-879、ならびに米国特許第5,482,858号および同5,525,491号に開示される。
d. 抗体コンジュゲート
本発明はさらに、本明細書に開示される融合タンパク質を含む抗体コンジュゲートを提供する。抗体コンジュゲートは、単一のポリペプチド鎖(すなわち本明細書に開示される融合タンパク質)を含み得るか、または抗体コンジュゲートは、さらなるポリペプチド鎖(例えば1、2または3のさらなるポリペプチド鎖)を含み得る。例えば、抗体コンジュゲートは、組換え変異体ヒトシアリダーゼ酵素および免疫グロブリン重鎖を含む第1のポリペプチド(融合タンパク質)、ならびに免疫グロブリン軽鎖を含む第2のポリペプチドを含み得、ここで例えば該免疫グロブリン重鎖および軽鎖は一緒になって、単一の抗原結合部位を画定する。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、単一のシアリダーゼを含み得る。他の態様において、抗体コンジュゲートは、1つより多く(例えば2つ)のシアリダーゼを含み得る。1つより多くのシアリダーゼが含まれる場合、シアリダーゼは同じであり得るかまたは異なり得る。ある態様において、抗体コンジュゲートは、単一の抗原結合部位を含み得る。他の態様において、抗体コンジュゲートは、1つより多く(例えば2つ)の抗原結合部位を含み得る。2つの抗原結合部位が使用される場合、それらは同じであり得るかまたは異なり得る。ある態様において、抗体コンジュゲートは、免疫グロブリンFc断片を含む。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、1つまたは2つの免疫グロブリン重鎖、またはその機能性断片を含む。ある態様において、抗体コンジュゲートは、1つまたは2つの免疫グロブリン軽鎖、またはその機能性断片を含む。ある態様において、抗体コンジュゲートは、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のN末端またはC末端に融合されたシアリダーゼを含む。
図9は、1つ以上のシアリダーゼ酵素を含む例示的な抗体コンジュゲート構築物を示す。例えば、図9Aにおいて、第1の抗原結合部位は10として示され、第2の抗原結合部位は20として示され、シアリダーゼは30として示され、Fabは40として示される。図9A〜9Iに示される構築物のそれぞれにおいて、Fcは、例えば図9Bにおいて50で示されるような例えばKnob-into-Hole型技術を使用して、いくつかの様式で任意に改変され得ることが理解される。図9を通して、同様の構造は同様の模式的表示により示される。
図9Aは、第1の免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；第1の免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；第2の免疫グロブリン重鎖を含む第3のポリペプチド；および第2の免疫グロブリン軽鎖を含む第4のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは、共有結合して一緒になり得、第3および第4のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって10として示される第1の抗原結合部位を画定し、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドは一緒になって20として示される第2の抗原結合部位を画定する。30として示されるようなシアリダーゼ酵素は、第1および第2の免疫グロブリン軽鎖または第1および第2の免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Bは、第1の免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；第1の免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；第2の免疫グロブリン重鎖を含む第3のポリペプチド；および第2の免疫グロブリン軽鎖を含む第4のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは、共有結合して一緒になり得、第3および第4のポリペプチドは、共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって第1の抗原結合部位を画定し、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドは一緒になって第2の抗原結合部位を画定する。シアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリン軽鎖または第1の免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Cは、免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；および免疫グロブリンFcドメインを含む第3のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって抗原結合部位を画定する。シアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリン軽鎖または第1の免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Dは、免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；ならびに免疫グロブリンFcドメインおよび第1のシアリダーゼ酵素を含む第3のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。第3のポリペプチドは、N末端からC末端の方向でシアリダーゼおよび免疫グロブリンFcドメインを含む。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって抗原結合部位を画定する。任意の第2のシアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリン軽鎖または第1の免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Eは、免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；ならびに免疫グロブリンFcドメインおよび第1のシアリダーゼ酵素を含む第3のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。第3のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で免疫グロブリンFcドメインおよびシアリダーゼを含む。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって抗原結合部位を画定する。任意の第2のシアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリン軽鎖または第1の免疫グロブリン重鎖のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Fは、第1の免疫グロブリンFcドメインを含む第1のポリペプチド、および第2の免疫グロブリンFcドメインを含む第2のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。シアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリンFcドメインのN末端もしくはC末端、または第2の免疫グロブリンFcドメインのN末端もしくはC末端にコンジュゲートされ得る。任意の第2のシアリダーゼ酵素は第1の免疫グロブリンFcドメインのN末端もしくはC末端、または第2の免疫グロブリンFcドメインのN末端もしくはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Gは、免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；および免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第2のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって抗原結合部位を画定する。シアリダーゼ酵素は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖可変領域のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Hは、第1の免疫グロブリンFcドメインを含む第1のポリペプチド、および第2の免疫グロブリンFcドメインを含む第2のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。シアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリンFcドメインまたは第2の免疫グロブリンFcドメインのN末端にコンジュゲートされ得る。任意の第2のシアリダーゼ酵素は、第2の免疫グロブリンFcドメインまたは第1の免疫グロブリンFcドメインのそれぞれのN末端にコンジュゲートされ得る。一本鎖可変断片(scFv)は、第1の免疫グロブリンFcドメインまたは第2の免疫グロブリンFcドメインのC末端にコンジュゲートされ得る。任意の第2の一本鎖可変断片(scFv)は、第1の免疫グロブリンFcドメインまたは第2の免疫グロブリンFcドメインのそれぞれのC末端にコンジュゲートされ得る。
図9Iは、それぞれのscFvが免疫グロブリン抗原結合断片、例えばFabで置き換えられる以外は、図9Hに示されるものと同様の抗体コンジュゲート構築物を示す。例えば、図9Iは、第1の免疫グロブリンFcドメインを含む第1のポリペプチド、および第2の免疫グロブリンFcドメインを含む第2のポリペプチドを含む抗体コンジュゲート構築物を示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。シアリダーゼ酵素は、第1の免疫グロブリンFcドメインまたは第2の免疫グロブリンFcドメインのN末端にコンジュゲートされ得る。任意の第2のシアリダーゼ酵素は、第2の免疫グロブリンFcドメインまたは第1の免疫グロブリンFcドメインのそれぞれのN末端にコンジュゲートされ得る。抗体断片(Fab)は、第1の免疫グロブリンFcドメインまたは第2の免疫グロブリンFcドメインのC末端にコンジュゲートまたは融合され得る。任意の第2の抗体断片(Fab)は、第2の免疫グロブリンFcドメインまたは第1の免疫グロブリンFcドメインのそれぞれのC末端にコンジュゲートまたは融合され得る。融合の場合、FcドメインのC末端は、免疫グロブリン抗原結合断片を画定する第1のポリペプチド鎖に(結合またはアミノ酸リンカーのいずれかにより)結合される。単一の可変領域により画定される抗原結合部位を有する抗体の場合、これは、標的抗原への結合親和性を与えるのに十分であり得る。他の例において、例えばヒト抗体の場合、免疫グロブリン抗原結合断片を画定する第1のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン抗原結合断片を画定する第2のポリペプチド鎖にコンジュゲート(例えばジスルフィド結合を介して例えば共有結合的にコンジュゲート)され得、ここで該2つの抗原結合断片は一緒になって、標的抗原に結合するための抗原結合部位を画定する。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、第1の免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；第1の免疫グロブリン重鎖および第1のシアリダーゼを含む第2のポリペプチド；第2の免疫グロブリン重鎖および第2のシアリダーゼを含む第3のポリペプチド；ならびに第2の免疫グロブリン軽鎖を含む第4のポリペプチドを含む。この態様の例を図10Aに示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第3および第4のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって第1の抗原結合部位を画定し、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドは一緒になって第2の抗原結合部位を画定する。ある態様において、第2および第3のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1および第2の免疫グロブリン重鎖ならびに第1および第2のシアリダーゼのそれぞれを含む。ある態様において、第2および第3のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1および第2のシアリダーゼならびに第1および第2の免疫グロブリン重鎖のそれぞれを含む。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；ならびに免疫グロブリンFcドメインおよびシアリダーゼを含む第3のポリペプチドを含む。この態様の例を図10Bに示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得、第2および第3のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは一緒になって、抗原結合部位を画定する。ある態様において、第3のポリペプチドは、N末端からC末端の方向でシアリダーゼおよび免疫グロブリンFcドメイン、またはN末端からC末端の方向で免疫グロブリンFcドメインおよびシアリダーゼを含む。
ある態様において、第1のポリペプチドは、配列番号:49のアミノ酸配列、または配列番号:49に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第2のポリペプチドは、配列番号:50のアミノ酸配列、または配列番号:50に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第3のポリペプチドは、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:63、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78もしくは配列番号:79のアミノ酸配列、または配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:63、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78もしくは配列番号:79に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、第3のポリペプチドは、
Figure 2021509585
 (配列番号:101)のアミノ酸配列を含み、ここでX1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Valであるかまたは存在せず、X2は、AlaまたはLysであり、X3はAsnまたはLeuであり、X4はPhe、Trp、TyrまたはValであり、X5はAla、Cys、Ile、SerまたはValであり、X6はArg、IleまたはLysであり、X7は、Ala、Cys、LeuまたはValであり、X8はGluまたはLysであり、X9はCysまたはValであり、X10はLysまたはValであり、X11はAla、Cys、SerまたはValであり、X12はCys、LeuまたはValである。
ある態様において、第3のポリペプチドは、
Figure 2021509585
Figure 2021509585
 (配列番号:92)のアミノ酸配列を含み、ここでX1はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Valであるかまたは存在せず、X2はPhe、Trp、TyrまたはValであり、X3はArg、IleまたはLysであり、X4はAla、Cys、SerまたはValである。ある態様において、X1はAla、Asp、Metであるかまたは存在せず、X2はTyrまたはValであり、X3はIleまたはLysであり、X4はAlaまたはCysである。
ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:51を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:52を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:53を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:54を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:63を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:76を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:77を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:78を含む。ある態様において、第1のポリペプチドは配列番号:49を含み、第2のポリペプチドは配列番号:50を含み、第3のポリペプチドは配列番号:79を含む。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、第1のシアリダーゼ、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1の一本鎖可変断片(scFv)を含む第1のポリペプチド(scFvは、免疫グロブリン抗原結合断片の第1のポリペプチド鎖、例えばFab断片により置き換えられ得ることも理解される)；ならびに第2のシアリダーゼ、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび第2の一本鎖可変断片(scFv)を含む第2のポリペプチド(scFvは、免疫グロブリン抗原結合断片の第2のポリペプチド鎖、例えばFab断片により置き換えられ得ることも理解される)を含む。この態様の例を図10Cに示す。第1および第2のポリペプチドは共有結合して一緒になり得る。共有結合はジスルフィド結合であり得る。ある態様において、第1のscFvは第1の抗原結合部位を画定し、第2のscFvは第2の抗原結合部位を画定する。ある態様において、第1のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシアリダーゼ、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1のscFvを含む。ある態様において、第1のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のscFv、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1のシアリダーゼを含む。ある態様において、第2のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第2のシアリダーゼ、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび第2のscFvを含む。ある態様において、第2のポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第2のscFv、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび第2のシアリダーゼを含む。
ある態様において、第1のポリペプチドは、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74もしくは配列番号:75のアミノ酸配列、または配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74もしくは配列番号:75に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第2のポリペプチドは、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74もしくは配列番号:75のアミノ酸配列、または配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74もしくは配列番号:75に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、第1および/または第2のポリペプチドは、
Figure 2021509585
Figure 2021509585
 (配列番号:102)のアミノ酸配列を含み、ここでX1はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Valであるかまたは存在せず、X2はAlaまたはLysであり、X3はAsnまたはLeuであり、X4はPhe、Trp、TyrまたはValであり、X5はAla、Cys、Ile、SerまたはValであり、X6はArg、IleまたはLysであり、X7はAla、Cys、LeuまたはValであり、X8はGluまたはLysであり、X9はCysまたはValであり、X10はLysまたはValであり、X11はAla、Cys、SerまたはValであり、X12はCys、LeuまたはValである。
ある態様において、第1および/または第2のポリペプチドは、
Figure 2021509585
 (配列番号:93)のアミノ酸配列を含み、ここでX1はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Valであるかまたは存在せず、X2はPhe、Trp、TyrまたはValであり、X3はArg、IleまたはLysであり、X4はAla、Cys、SerまたはValである。ある態様において、X1はAla、Asp、Metであるかまたは存在せず、X2はTyrまたはValであり、X3はIleまたはLysであり、X4はAlaまたはCysである。
ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:43を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:44を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:45を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:46を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:47を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:48を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:74を含む。ある態様において、第1および第2のポリペプチドは配列番号:75を含む。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、約135kDa〜約165kDa、例えば約140kDaの分子量を有する。他の態様において、抗体コンジュゲートは、約215kDa〜約245kDa、例えば約230kDaの分子量を有する。
ある態様において、抗体コンジュゲートは、それぞれが免疫グロブリンFcドメインを含む2つのポリペプチドを含み、第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドとのヘテロ二量体化のために「knob」変異、例えばT366Yまたは「hole」変異、例えばY407Tのいずれかを有し、第2のポリペプチドは、第1のポリペプチドとのヘテロ二量体化のためにそれぞれ「knob」変異、例えばT366Yまたは「hole」変異、例えばY407Tのいずれかを有する(EUナンバリングによる残基番号、Kabat, E.A., et al. (1991)上述)。例えば、ある態様において、抗体は、それぞれがヒトIgG1 Fcドメイン由来の免疫グロブリンFcドメインを含む2つのポリペプチドを含み、第1のポリペプチドは、Y407T変異(例えば第1のポリペプチドは配列番号:32を含む)を含み、第2のポリペプチドはT366Y変異(例えば第2のポリペプチドは配列番号:33を含む)を含む。
本明細書で使用する場合、用語「多特異的抗体」は、少なくとも2つの異なる抗原に特異的に結合する抗体、すなわち少なくとも2つの異なる抗原に結合する少なくとも2つの抗原結合部位を含む抗体を意味すると解される。本明細書で使用する場合、用語「二重特異的抗体」は、2つの異なる抗原に特異的に結合する抗体、すなわちそれぞれが別々の異なる抗原に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体を意味すると解される。換言すると、第1の結合部位は第1の抗原に結合し、第2の結合部位は第2の異なる抗原に結合する。多特異的または二重特異的抗体は、例えばヒトもしくはヒト化抗体、および/または全長抗体もしくは抗体断片(例えばF(ab')2二重特異的抗体)であり得る。
本発明は、従来の手段、例えば酵素消化、または組換え技術により作製され得る抗体断片を含む抗体コンジュゲートを包含する。特定の抗体断片の総説について、Hudson et al. (2003)上述参照。
ある態様において、抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質は、生物学的改変因子(biological modifier)と共有結合的または非共有結合的に結合し得、ここで該生物学的改変因子は、抗体の溶解性を高めるため、結合特異性を増加するため、免疫原性もしくは毒性を減少するためまたは抗体の薬物動力学的プロフィールを改変するために使用され得る。例えば、生物学的改変因子は、抗体の分子量を増加してその循環半減期を増加するために使用され得る。
抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質は、1つ以上(例えば2、3、4、5、6、8、9、10またはそれ以上)の直鎖または分岐鎖のポリマーを含み得る生物学的改変因子に共有結合され得ることが企図される。例示的な生物学的改変因子としては、例えば米国特許第7,842,789号に記載されるものなどの種々のポリマーが挙げられ得る。ポリアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール(PEG)およびその誘導体(例えばアルコキシポリエチレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコール、エトキシポリエチレングリコール等)；ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマー(Pluronics)；ポリメタクリレート；カルボマー；ならびに糖モノマー、例えばD-マンノース、D-およびL-ガラクトース、フコース、フルクトース、D-キシロース、L-アラビノースおよびD-グルクロン酸を含む分岐または非分岐の多糖が特に有用である。
他の態様において、生物学的改変因子は、親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン(PVP)型ポリマーであり得る。生物学的改変因子は、官能基化ポリビニルピロリドンであり得、例えばポリマーの1つ(または両方)の末端でカルボキシまたはアミン官能基化され得る(PolymerSourceから入手可能)。代替的に、生物学的改変因子としては、ポリN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)、または官能基化HPMA(アミン、カルボキシ等)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)または官能基化ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)が挙げられ得る。代替的に、生物学的改変因子としては、ポリN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)、または官能基化HPMA(アミン、カルボキシ等)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)または官能基化ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)が挙げられ得る。コンジュゲーション前の改変体は水溶性である必要ないが、好ましくは水溶性であり、しかしながら最終コンジュゲートは水溶性であるべきである。
一般に、生物学的改変因子は、約2kDa〜約5kDa、約2kDa〜約10kDa、約2kDa〜約20kDa、約2kDa〜約30kDa、約2kDa〜約40kDa、約2kDa〜約50kDa、約2kDa〜約60kDa、約2kDa〜約70kDa、約2kDa〜約80kDa、約2kDa〜約90kDa、約2kDa〜約100kDa、約2kDa〜約150kDa、約5kDa〜約10kDa、約5kDa〜約20kDa、約5kDa〜約30kDa、約5kDa〜約40kDa、約5kDa〜約50kDa、約5kDa〜約60kDa、約5kDa〜約70kDa、約5kDa〜約80kDa、約5kDa〜約90kDa、約5kDa〜約100kDa、約5kDa〜約150kDa、約10kDa〜約20kDa、約10kDa〜約30kDa、約10kDa〜約40kDa、約10kDa〜約50kDa、約10kDa〜約60kDa、約10kDa〜約70kDa、約10kDa〜約80kDa、約10kDa〜約90kDa、約10kDa〜約100kDa、約10kDa〜約150kDa、約20kDa〜約30kDa、約20kDa〜約40kDa、約20kDa〜約50kDa、約20kDa〜約60kDa、約20kDa〜約70kDa、約20kDa〜約80kDa、約20kDa〜約90kDa、約20kDa〜約100kDa、約20kDa〜約150kDa、約30kDa〜約40kDa、約30kDa〜約50kDa、約30kDa〜約60kDa、約30kDa〜約70kDa、約30kDa〜約80kDa、約30kDa〜約90kDa、約30kDa〜約100kDa、約30kDa〜約150kDa、約40kDa〜約50kDa、約40kDa〜約60kDa、約40kDa〜約70kDa、約40kDa〜約80kDa、約40kDa〜約90kDa、約40kDa〜約100kDa、約40kDa〜約150kDa、約50kDa〜約60kDa、約50kDa〜約70kDa、約50kDa〜約80kDa、約50kDa〜約90kDa、約50kDa〜約100kDa、約50kDa〜約150kDa、約60kDa〜約70kDa、約60kDa〜約80kDa、約60kDa〜約90kDa、約60kDa〜約100kDa、約60kDa〜約150kDa、約70kDa〜約80kDa、約70kDa〜約90kDa、約70kDa〜約100kDa、約70kDa〜約150kDa、約80kDa〜約90kDa、約80kDa〜約100kDa、約80kDa〜約150kDa、約90kDa〜約100kDa、約90kDa〜約150kDaまたは約100kDa〜約150kDaの分子量を有し得る。
抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質は、約10以下のポリマー分子(例えば9、8、7、6、5、4、3、2または1)と結合され、それぞれのポリマー分子は少なくとも約20,000Dまたは少なくとも約30,000Dまたは少なくとも約40,000Dの分子量を有することが企図される。
生物学的改変因子として種々のポリマーが使用され得るが、本明細書に記載される抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質はポリエチレングリコール(PEG)ポリマーに結合され得ることが企図される。一態様において、本明細書に記載される抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質は、少なくとも約20,000Dの実際のMWを有する少なくとも1つのPEGに共有結合される。別の態様において、本明細書に記載される抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質は、少なくとも約30,000Dの実際のMWを有する少なくとも1つのPEGに共有結合される。別の態様において、本明細書に記載される抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質は、少なくとも約40,000Dの実際のMWを有する少なくとも1つのPEGに共有結合される。ある態様において、PEGはメトキシPEG(5000)-スクシンイミジルプロピオネート(mPEG-SPA)、メトキシPEG(5000)スクシンイミジルスクシネート(mPEG-SS)である。かかるPEGは、Nektar TherapeuticsまたはSunBiowestから市販される。
生物学的改変因子についての抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質上の結合部位は、N末端アミノ基およびリジン残基上に見られるεアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水性基を含む。ポリマーは、化学を使用した、当該技術分野で使用される多官能性(通常は二官能性)架橋剤の公知の使用ありまたはなしで、抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質に直接共有結合され得る。例えばスルフヒドリル基は、マレイミド置換PEG(例えばアルコキシ-PEGアミン+スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、またはShearwater Polymers, Inc., Huntsville, Ala.から市販されるPEG-マレイミド)にカップリングすることにより誘導体化され得る。
III. 組換えヒトシアリダーゼ、融合タンパク質または抗体コンジュゲートを作製する方法
組換えヒトシアリダーゼ、融合タンパク質、例えば本明細書に開示されるもの、抗体または抗体コンジュゲート、例えば本明細書に開示されるものを作製するための方法は当該技術分野で公知である。例えば、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域をコードするDNA分子は、化学的にまたは組換えDNA方法論により合成し得る。例えば、該抗体の配列は、適切な合成核酸プライマーを使用して、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術によりハイブリドーマからクローニングされ得る。目的の可変領域をコードする得られたDNA分子を、例えば定常領域コーディング配列および発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列にライゲーションして、所望の抗体をコードする従来の遺伝子発現構築物(すなわち発現ベクター)を作製し得る。所定の」遺伝子構築物の作製は当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
所望の組換えヒトシアリダーゼ、融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートをコードする核酸を、発現ベクターに組み込み得(ライゲーションし得)、これを従来のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞に導入し得る。例示的な宿主細胞は、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児性腎臓293(HEK 293)細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)および他の方法ではIgGタンパク質を産生しない骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞を、宿主細胞が免疫グロブリン軽鎖および/または重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現する条件下で増殖させ得る。
特定の発現および精製条件は、使用する発現系に応じて変化する。例えば、遺伝子が大腸菌において発現される場合、該遺伝子は最初に、適切な細菌性プロモーター、例えばTrpまたはTacおよび原核細胞シグナル配列の下流に作り変えられた遺伝子を配置することにより発現ベクター内にクローニングされる。発現されたタンパク質は分泌され得る。発現されたタンパク質は、屈折体(refractile)または封入体内に蓄積し得、フレンチプレスまたは超音波処置による細胞の破壊後に回収され得る。次いで屈折体を可溶化して、当該技術分野で公知の方法により、タンパク質を再度折り畳み得るかおよび/または切断し得る。
作り変えられた遺伝子が真核生物宿主細胞、例えばCHO細胞中で発現される場合、該遺伝子は最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ポリA配列および停止コドンを含む発現ベクターに挿入される。任意に、ベクターまたは遺伝子構築物はエンハンサーおよびイントロンを含み得る。抗体またはその一部を含む融合タンパク質を含む態様において、発現ベクターは任意に、重鎖または軽鎖の全体または一部が発現されることを可能にする定常領域の全部または一部をコードする配列を含む。遺伝子構築物は、従来技術を使用して真核生物宿主細胞に導入され得る。
宿主細胞は、組換えヒトシアリダーゼもしくは融合タンパク質および/またはシアリダーゼおよびVLもしくはVH断片、VL-VHヘテロ二量体、VH-VLもしくはVL-VH単鎖ポリペプチド、それぞれが別の機能(例えば細胞傷害性)を有する部分に結合され得る完全な免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの一部を含む抗体コンジュゲートを発現する。融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートを含むいくつかの態様において、宿主細胞は、シアリダーゼおよび重鎖(例えば重鎖可変領域)の全体もしくは一部またはシアリダーゼおよび軽鎖(例えば軽鎖可変領域)を発現するポリペプチド、または重鎖(例えば重鎖可変領域)もしくは軽鎖(例えば軽鎖可変領域)の全体もしくは一部を発現するポリペプチドを発現する単一のベクターでトランスフェクトされる。いくつかの態様において、宿主細胞は、(a)重鎖可変領域を含むポリペプチドおよび軽鎖可変領域を含むポリペプチド、または(b)免疫グロブリン重鎖全体および免疫グロブリン軽鎖全体をコードする単一のベクターでトランスフェクトされ、ここで(a)または(b)において、該ポリペプチドはまた、シアリダーゼを含み得る。いくつかの態様において、宿主細胞は、1つより多くの発現ベクター(例えば重鎖または重鎖可変領域の全体または一部を含み、任意にそれに融合されたシアリダーゼを含むポリペプチドを発現する1つの発現ベクター、および軽鎖または軽鎖可変領域の全体または一部を含み、任意にそれに融合されたシアリダーゼを含むポリペプチドを発現する別の発現ベクター)により共トランスフェクトされる。
シアリダーゼを含むポリペプチドまたは融合タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む融合タンパク質は、かかる可変領域をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させる(培養する)ことにより産生され得る。発現後、該ポリペプチドは当該技術分野で公知の技術、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはヒスチジンタグなどの親和性タグを用いて回収および精製または単離され得る。
融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートが作製される態様において、モノクローナル抗体、該抗体のFcドメインまたは抗原結合ドメインに融合されたシアリダーゼは：(a)完全なもしくは一部の免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクター、および完全なもしくは一部の免疫グロブリン軽鎖をコードする別の発現ベクター；または(b)両方の鎖(例えば完全なまたは一部の重鎖および軽鎖)をコードする単一の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、両方の鎖の発現を可能にする条件下で増殖させる(培養する)ことにより、産生され得る。シアリダーゼは該鎖の1つ以上に融合される。完全な融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートは、当該技術分野で公知の技術、例えばプロテインA、プロテインG、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはヒスチジンタグなどの親和性タグを用いて、回収および精製または単離され得る。単一の発現ベクターまたは2つの別々の発現ベクターから重鎖および軽鎖を発現させることは当該技術の通常の技術の範囲内である。
ある態様において、タンパク質、例えば組換えヒトシアリダーゼを分泌されたタンパク質として発現するために、タンパク質の天然のN末端シグナル配列を、例えばMDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号:28)で置き換える。ある態様において、タンパク質、例えば組換えヒトシアリダーゼを分泌されたタンパク質として発現するために、N末端シグナル配列、例えばMDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号:28)を付加する。さらなる例示的なN末端シグナル配列としては、インターロイキン2、CD-5、IgGκ軽鎖、トリプシノーゲン、血清アルブミンおよびプロラクチン由来のシグナル配列が挙げられる。ある態様において、タンパク質、例えば組換えヒトシアリダーゼを分泌されたタンパク質として発現するために、C末端リソソームシグナルモチーフ、例えばYGTL(配列番号:29)を除去する。
抗体および抗体断片の抗原性を低減または除去するための方法は当該技術分野で公知である。抗体をヒトに投与する場合、ヒトにおける抗原性を低減または除去するために、抗体は、好ましくは「ヒト化」される。好ましくは、それぞれのヒト化抗体は、抗原について、それが由来する非ヒト化マウス抗体と同じまたは実質的に同じ親和性を有する。
1つのヒト化のアプローチにおいて、マウス免疫グロブリン定常領域をヒト免疫グロブリン定常領域で置き換えたキメラタンパク質が作製される。例えばMorrison et al.,1984, PROC. NAT. ACAD. SCI. 81:6851-6855；Neuberger et al., 1984, NATURE 312:604-608; 米国特許第6,893,625号(Robinson)；同5,500,362号(Robinson)；および同4,816,567号(Cabilly)参照。
CDR移植として公知のアプローチにおいて、軽鎖および重鎖可変領域のCDRは、別の種由来のフレームワークに移植される。例えば、マウスCDRをヒトFRに移植し得る。いくつかの態様において、抗体の軽鎖および重鎖可変領域のCDRをヒトFRまたはコンセンサスヒトFRに移植する。コンセンサスヒトFRを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のFRを整列してコンセンサスアミノ酸配列を同定する。CDR移植は、米国特許第7,022,500号(Queen)；同6,982,321号(Winter)；同6,180,370号(Queen)；同6,054,297号(Carter)；同5,693,762号(Queen)；同5,859,205号(Adair)；同5,693,761号(Queen)；同5,565,332号(Hoogenboom)；同5,585,089号(Queen)；同5,530,101号(Queen)；Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525；Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327；Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536；およびWinter (1998) FEBS LETT 430: 92-94に記載される。
「SUPERHUMANIZATIONTM」と称されるアプローチにおいて、ヒトCDR配列は、ヒトCDRとヒト化されるマウス抗体のCDRの構造的類似性に基づいて、ヒト生殖細胞遺伝子から選択される。例えば米国特許第6,881,557号(Foote)；およびTan et al., 2002, J. IMMUNOL. 169:1119-1125参照。
免疫原性を低減するための他の方法としては、「作り直し(reshaping)」、「過剰キメラ化(hyperchimerization)」および「張り合わせ(veneering)/表面付け替え(resurfacing)」が挙げられる。例えば、Vaswami et al., 1998, ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81:105；Roguska et al., 1996, PROT. ENGINEER 9:895-904；および米国特許第6,072,035号(Hardman)参照。張り合わせ/表面付け替えアプローチにおいて、マウス抗体中の表面接触可能(surface accessible)アミノ酸残基を、ヒト抗体中の同じ位置により頻度高く見られるアミノ酸残基により置き換える。この種類の抗体表面付け替えは、例えば米国特許第5,639,641号(Pedersen)に記載される。
マウス抗体をヒトにおける医学的使用に適した形態に変換するための別のアプローチは、ACTIVMABTM技術として知られ(Vaccinex, Inc., Rochester, NY)、これは哺乳動物細胞において抗体を発現するためのワクシニアウイルスに基づくベクターを含む。高レベルのコンビナトリアルな多様性のIgG重鎖および軽鎖が作製され得る。例えば、米国特許第6,706,477号(Zauderer)；同6,800,442号(Zauderer)；および同6,872,518号(Zauderer)参照。マウス抗体をヒトにおける使用に適切な形態に変換するための別のアプローチは、KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA)により商業的に実施される技術である。この技術は、抗体選択のための「エピトープ焦点化(epitope focused)」ライブラリを作成するための連続のヒト「アクセプター」ライブラリの使用を含む。マウス抗体をヒトにおける医学的使用に適した形態に改変するための別のアプローチは、HUMAN ENGINEERINGTM技術であり、これはXOMA (US) LLCにより商業的に実施される。例えば国際(PCT)公開番号WO 93/11794および米国特許第5,766,886号(Studnicka)；同5,770,196号(Studnicka)；同5,821,123号(Studnicka)；ならびに同5,869,619号(Studnicka)参照。
上述のアプローチのいずれかを含む任意の適切なアプローチを使用して、抗体のヒト免疫原性を低減または除去し得る。
また、マウス中で完全なヒト抗体を作製することが可能である。任意の非ヒト配列を欠く完全なヒトmAbは、例えばLonberg et al., NATURE 368:856-859, 1994；Fishwild et al., NATURE BIOTECHNOLOGY 14:845-851, 1996；およびMendez et al., NATURE GENETICS 15:146-156, 1997において参照される技術によりヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製され得る。完全なヒトモノクローナル抗体はまた、例えばKnappik et al., J. MOL. BIOL. 296:57-86, 2000；およびKrebs et al., J. IMMUNOL. METH. 254:67-84 2001)において参照される技術によりファージディスプレイライブラリから調製され得最適化され得る。
本発明は、酵素消化または組み換え技術などの従来の手段により作製され得る抗体断片を含む融合タンパク質を包含する。特定の抗体断片の総説について、Hudson et al. (2003) NAT. MED. 9:129-134参照。
抗体断片の作製のために種々の技術が開発されている。伝統的に、これらの断片は、完全な抗体のタンパク質分解性消化によりもたらされた(例えばMorimoto et al. (1992) JOURNAL OF BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL METHODS 24:107-117；およびBrennan et al. (1985) SCIENCE 229:81参照)。しかしながら、現在では、これらの断片は、組換え宿主細胞により直接産生され得る。Fab、FvおよびScFv抗体断片は全て、大腸菌中で発現されて分泌され得るので、大量のこれらの断片の容易な作製が可能である。抗体断片は、抗体ファージライブラリから単離され得る。代替的に、Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収され得、F(ab')2断片を形成するように化学的に連結され得る(Carter et al. (1992) BIO/TECHNOLOGY 10:163-167)。別のアプローチによると、F(ab')2断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加されたFabおよびF(ab')2断片は、米国特許第5,869,046号に記載される。抗体断片の作製のための他の技術は、当業者に明らかである。ある態様において、抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。米国特許第5,571,894号および同5,587,458号参照。
二重特的抗体を作製するための方法は当該技術分野において公知である。Milstein and Cuello (1983) NATURE 305:537、国際(PCT)公開番号WO93/08829、およびTraunecker et al. (1991) EMBO J., 10:3655参照。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細について、例えばSuresh et al. (1986) METHODS ENZYMOL. 121:210参照。二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」または「ヘテロ二量体」の抗体を含む。例えば、ヘテロ二量体中の抗体の1つはアビジンに、他方はビオチンに連結され得る。ヘテロ二量体抗体は、任意の便利な架橋法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許第4,676,980号に開示される。
ヘテロ二量体または非対称なIgG様分子の例としては、限定されないが、以下の技術を用いて、または以下の形式を使用して得られるものが挙げられる：Triomab/Quadroma、Knobs-into-Holes、CrossMabs、静電的適合抗体、LUZ-Y、Strand Exchange Engineered Domain body、BiclonicおよびDuoBody。
抗体断片(例えばF(ab)およびF(ab')2断片)を使用することの利点としては、抗体のFc部分と細胞(例えばマクロファージ、樹状細胞、好中球、NK細胞およびB細胞)上のFc受容体の間の非特異的結合の除去が挙げられる。また断片は、それらのより小さいサイズのために、より効率的に組織に浸透することができ得る。
ヘテロ二量体抗体または非対照抗体は、種々の薬物を抗体アームに結合させるためのより大きな柔軟性および新規の形式を可能にする。ヘテロ二量体抗体を作製するための一般的な形式の1つは、「knobs-into-holes」形式である。この形式は、抗体の定常領域の重鎖部分に特異的である。「knob」部分は、小さなアミノ酸を、「hole」に適合するより大きなアミノ酸で置き換えることにより作り変えられ、holeは、大きなアミノ酸をより小さなアミノ酸で置き換えることにより作り変えられる。「knob」を「hole」に連結するものはそれぞれの鎖の間のジスルフィド結合である。「knobs-into-holes」形状は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性を容易にする。単鎖可変断片(scFv)は、短いリンカーペプチドを介して重鎖および軽鎖の可変ドメインに連結される。リンカーは、リンカーにより大きな柔軟性を付与するグリジン、およびリンカーに特異性を付与するセリン/トレオニンに富む。2つの異なるscFv断片は一緒になって、ヒンジ領域を介して、重鎖の定常ドメインまたは軽鎖の定常ドメインに連結され得る。これは、抗体に二重特性を付与し、2つの異なる抗原への結合特異性を可能にする。「knobs-into-holes」形式は、ヘテロ二量体形成を増大するが、ホモ二量体形成を抑制しない。
ヘテロ二量体化を支持するいくつかのアプローチは、例えば国際(PCT)公開番号WO96/27011、WO98/050431、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954およびWO2013/096291、ならびに欧州特許公開番号EP1870459に記載されている。典型的に、当該技術分野において公知のアプローチにおいて、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインは両方、相補的な様式で作り変えられるので、1つの作り変えられたCH3ドメインを含む重鎖は、同じ構造の別の重鎖ともはやホモ二量体化し得ない(例えばCH3作り変え第1重鎖は、別のCH3作り変え第1重鎖ともはやホモ二量体化し得ず；CH3作り変え第2重鎖は、別のCH3作り変え第2重鎖とはもはやホモ二量体化し得ない)。それにより、1つの作り変えられたCH3ドメインを含む重鎖は、相補的な様式で作り変えられるCH3ドメインを含む別の重鎖と強制的にヘテロ二量体化される。結果的に、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインは、第1の重鎖と第2の重鎖が強制的にヘテロ二量体化するようにアミノ酸置換により相補的な様式で作り変えられ、一方で第1の重鎖と第2の重鎖はもはやホモ二量体化し得ない(例えば立体的な理由による)。
IV. 医薬組成物
治療的用途のために、組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートは、好ましくは薬学的に許容され得る担体と組み合される。用語「薬学的に許容され得る」は、本明細書で使用する場合、正常な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なく、妥当な利益/リスク比に釣り合って、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物および/または剤型をいう。
用語「薬学的に許容され得る担体」は、本明細書で使用する場合、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なく、妥当な利益/リスク比に釣り合って、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適したバッファ、担体および賦形剤をいう。薬学的に許容され得る担体としては、リン酸緩衝化食塩水溶液、水、エマルジョン(例えば油/水または水/油エマルジョンなど)、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかが挙げられる。該組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。担体、安定化剤およびアジュバントの例について、例えば、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]参照。薬学的に許容され得る担体としては、薬学的投与に適合性のバッファ、溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および薬剤の使用は当該技術分野において公知である。
ある態様において、医薬組成物は、例えば組成物のpH、容量オスモル濃度、粘度、清澄さ、色、等張性、臭い、滅菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または浸透力を改変、維持または保存するための製剤材料を含み得る。かかる態様において、適切な製剤材料としては、限定されないが、アミノ酸(グリジン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど)；抗菌剤：酸化防止剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど)；バッファ(ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など)；増量剤(マンニトールまたはグリジンなど)；キレート剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)など)；錯体化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-βシクロデキストリンなど)；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物(グルコース、マンノースまたはデキストリンなど)；タンパク質(血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど)；着色剤、矯味矯臭剤(flavoring agent)および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンなど)；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン(ナトリウムなど)；保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など)；溶媒(グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど)；糖アルコール(マンニトールまたはソルビトールなど)；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤(プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン(triton)、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール(tyloxapal)など)；安定性増強剤(スクロースまたはソルビトールなど)；等張性増強剤(アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトールなど)；送達ビヒクル：希釈剤；賦形剤および/または医薬アジュバント(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990参照)、が挙げられる。
ある態様において、医薬組成物は、ナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、リポソームまたはミセルを含み得る(Anselmo et al. (2016) BIOENG. TRANSL. MED. 1: 10-29参照)。
ある態様において、医薬組成物は、持続または制御送達製剤を含み得る。持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体腐食性(bio-erodible)マイクロ粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射剤を調製するための技術はまた、当業者に公知である。持続放出調製物は、例えば形作られた物品の形態の多孔質ポリマー性マイクロ粒子または半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルムまたはマイクロカプセルを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート(inethacrylate))、エチレンビニルアセテート、またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含み得る。持続放出組成物はまた、当該技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得るリポソームを含み得る。
本明細書に開示される組換えヒトシアリダーゼ、組換えヒトシアリダーゼ融合タンパク質または抗体コンジュゲートを含む医薬組成物は、単位剤型で存在し得、任意の適切な方法により調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように調製されるべきである。投与経路の例は、静脈内(IV)、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、鞘内および経直腸の投与である。ある態様において、本明細書に開示される組換えヒトシアリダーゼ、組換えヒトシアリダーゼ融合タンパク質または抗体コンジュゲートは、IV注入により投与される。ある態様において、本明細書に開示される組換えヒトシアリダーゼ、組換えヒトシアリダーゼ融合タンパク質または抗体コンジュゲートは、腫瘍内注射により投与される。有用な製剤は、医薬の分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)参照。非経口投与に適切な製剤構成要素は、滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばEDTA；バッファ、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含む。
静脈内投与について、適切な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。担体は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)を含む溶媒または分散媒体、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。
好ましくは、医薬製剤は滅菌したものである。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌濾過膜を通した濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥および再構成の前後に濾過滅菌を行い得る。
本明細書に記載される組成物は、局所または全身に投与され得る。投与は一般的に非経口投与である。好ましい態様において、医薬組成物は皮下投与され、さらにより好ましい態様においては静脈内投与である。非経口投与のための調製物は、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。
一般的に、活性構成要素、例えば組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートの治療有効量は、0.1mg/kg〜100mg/kg、例えば1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜10mg/kgの範囲である。投与量は、治療される疾患または徴候の種類および程度、患者の全体的な健康、抗体のインビボ効力、医薬製剤および投与経路などの変数に依存する。所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期用量は、上限を超えて増加され得る。代替的に、初期用量は、最適よりも小さくあり得、日用量は治療経過の間に段々に増加され得る。ヒト用量は、例えば0.5mg/kgから20mg/kgまで行うように設計された従来の第I相用量段階的拡大試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートの血清半減期、および治療されている疾患などの要因に応じて変化し得る。例示的な投与頻度は、1日に1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。好ましい投与経路は非経口、例えば静脈内注入である。ある態様において、組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質および/または抗体コンジュゲートは、凍結乾燥され、次いで投与の時点で、緩衝化食塩水中で再構成される。
V. 治療用途
本明細書に開示される組成物および方法は、被験体において種々の形態の癌を治療するためまたは被験体において癌の増殖を阻害するために使用され得る。本発明は、被験体において癌を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質および/または抗体コンジュゲート、例えば本明細書に開示される組換えヒトシアリダーゼ、融合タンパク質または抗体コンジュゲートの有効量を、単独または別の治療剤と組み合わせて投与して、被験体において癌を治療する工程を含む。用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、有益または所望の結果をもたらすのに十分な活性剤(例えば本発明の組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質)の量をいう。有効量は1つ以上の投与、適用または用量において投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
本明細書で使用する場合、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、被験体、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、(a)疾患を阻害すること、すなわちその進展を止めること；および(b)疾患を軽減すること、すなわち疾患状態の後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。好ましくは、かかる生物としては限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
癌の例としては、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、血液の腫瘍および転移性の病変が挙げられる。血液の腫瘍の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞、T細胞またはFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、例えば変形(transformed)CLL、びまん性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、骨髄異形成症候群(myelodyplastic syndrome)(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫またはリクター症候群(リクター形質転換(Richter's Transformation))が挙げられる。固形腫瘍の例としては悪性疾患、例えば種々の臓器系の肉腫、腺癌および癌腫、例えば頭頸部(咽頭を含む)、甲状腺、肺(小細胞または非小細胞肺癌(NSCLC))、***、リンパ系、胃腸(例えば口腔、食道、胃、肝臓、膵臓、小腸、結腸および直腸、肛門管)、生殖器および尿生殖器管(例えば腎臓、尿路上皮、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸、子宮内膜、前立腺、精巣)、CNS(例えば神経細胞またはグリア細胞、例えば神経芽腫または神経膠腫)、または皮膚(例えば黒色腫)が冒されるものが挙げられる。
ある態様において、癌は、上皮癌、例えばシアリル化グリカンの発現を上方制御する上皮癌である。例示的な上皮癌としては、限定されないが、子宮内膜癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌またはファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌および肝臓癌が挙げられる。上皮癌としてはまた、癌腫、例えば小葉癌、腺房細胞癌(acinous carcinoma)、腺嚢癌腫(adenocystic carcinoma)、腺様嚢胞癌、腺癌腫(carcinoma adenomatosum)、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞の癌(carcinoma basocellulare)、類基底細胞癌、基底扁平上皮癌(basosquamous cell carcinoma)、細気管支肺胞癌(bronchioalveolar carcinoma)、細気管支癌、肺癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌、粘液癌(colloid carcinoma)、コメド癌、子宮体癌(corpus carcinoma)、篩状癌(cribriform carcinoma)、鎧状癌、皮膚の癌(carcinoma cutaneum)、柱状癌(cylindrical carcinoma)、柱状細胞癌(cylindrical cell carcinoma)、腺管癌、硬性癌、胎生期癌、脳様癌、類表皮癌(epiermoid carcinoma)、上皮アデノイド癌(carcinoma epitheliale adenoids)、外向発育癌(exophytic carcinoma)、潰瘍癌(carcinoma ex ulcere)、線維性癌(carcinoma fibrosum)、膠様癌(gelatiniforni carcinoma)、コロイド癌腫(gelatinous carcinoma)、巨細胞癌、巨細胞の癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌(hair-matrix carcinoma)、血液様癌腫(hematoid carcinoma)、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子体癌(hyaline carcinoma)、副腎様癌(hypemephroid carcinoma)、小児胎児性癌(infantile embryonal carcinoma)、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、クロムペッヘル癌(Krompecher's carcinoma)、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌(lenticular carcinoma)、レンズ状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪癌腫(lipomatous carcinoma)、リンパ上皮癌、髄様癌(carcinoma medullare)、髄様癌(medullary carcinoma)、黒色癌(melanotic carcinoma)、軟癌腫(carcinoma molle)、粘液性癌腫、粘液腺癌(carcinoma muciparum)、粘液細胞性腺癌(carcinoma mucocellulare)、粘液性類表皮癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液性癌(mucous carcinoma)、粘液腫様癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽腔癌、えん麦細胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、類骨癌(osteoid carcinoma)、乳頭状癌、門脈周囲癌(periportal carcinoma)、前浸潤癌(preinvasive carcinoma)、有棘細胞癌(prickle cell carcinoma)、粥状癌(pultaceous carcinoma)、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌(reserve cell carcinoma)、肉腫様癌腫(carcinoma sarcomatodes)、シュナイダー癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、陰嚢癌腫(carcinoma scroti)、印環細胞癌、単純癌腫(carcinoma simplex)、小細胞癌、ソラノイド癌腫(solanoid carcinoma)、球状細胞癌腫(spheroidal cell carcinoma)、紡錘体細胞癌、海綿様癌腫(carcinoma spongiosum)、扁平上皮癌(squamous carcinoma)、扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、ストリング癌腫(string carcinoma)、毛細血管拡張性癌腫(carcinoma telangiectaticum)、毛細血管拡張性癌腫(carcinoma telangiectodes)、移行上皮癌、結節癌腫(carcinoma tuberosum)、結節状癌(tuberous carcinoma)、ゆうぜい癌および絨毛癌腫(carcinoma villosum)が挙げられる。
ある態様において、癌は乳癌である。ある態様において、癌は腺癌である。ある態様において、癌は転移性の癌である。ある態様において、癌は難治性の癌である。
ある態様において、癌は、抗体、例えばADCC活性を有する抗体、例えばトラスツズマブを用いた治療に抵抗性または非応答性である。
本明細書に記載される方法および組成物は、単独または他の治療剤および/または様相(modality)と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」投与されるは、2つ(またはそれ以上)の異なる治療が、障害を有する被験体の苦痛の過程において患者に対する治療の効果が時間内の時点で重複するように、被験体に送達されることを意味すると理解される。ある態様において、1つの治療の送達は、第2の送達が始まる際に依然行われているので、投与期間の重複がある。これは時々、本明細書において「同時(simultaneous)」または「同時送達(concurrent delivery)」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のある態様において、治療は、組み合わされた投与のためにより効果的である。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療により同等の効果が見られるか、または第2の治療は、第2の治療が第1の治療の非存在下で投与される場合に見られるよりも大きな程度に症状を低減し、あるいは第1の治療により同等の状況が見られる。ある態様において、送達は、症状または障害に関連する他のパラメーターの低減が、1つの治療が他の治療の非存在下で送達されることにより観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であり得か、全体的に相加的であり得かまたは相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が第2の治療を送達した際に依然として検出可能であるようなものであり得る。
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、1つ以上のさらなる治療、例えば手術、放射線療法または別の治療製剤の投与と組み合わせて投与される。ある態様において、さらなる治療は、化学療法、例えば細胞傷害性剤を含み得る。ある態様において、さらなる治療は、標的化された治療、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤を含み得る。ある態様において、さらなる治療は、抗炎症、抗脈管形成、抗線維症または抗増殖性の化合物、例えばステロイド、生物学的免疫調整剤、モノクローナル抗体、抗体断片、アプタマー、siRNA、アンチセンス分子、融合タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、気管支拡張剤、スタチン、抗炎症剤(例えばメトトレキサート)またはNSAIDを含み得る。ある態様において、さらなる治療は、異なる部類の治療薬の組合せを含み得る。
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。チェックポイント阻害剤は、例えばPD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニスト、CTLA-4アンタゴニスト、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、B7-H3アンタゴニスト、B7-H4アンタゴニスト、BTLAアンタゴニスト、KIRアンタゴニスト、LAG3アンタゴニスト、TIM-3アンタゴニスト、VISTAアンタゴニストまたはTIGITアンタゴニストから選択され得る。
ある態様において、チェックポイント阻害剤は、PD-1またはPD-L1阻害剤である。PD-1は、過活動免疫応答を予防するために、適切な時点でT細胞の活性を阻害するかまたはそうでなければT細胞活性を調節する免疫系のチェックポイントとして働くT細胞の表面上に存在する受容体である。しかしながら、癌細胞は、例えばT細胞の表面上のPD-1と相互作用してT細胞活性を遮断または調節するリガンド、PD-L1を発現することにより、このチェックポイントの利点を受け得る。例示的なPD-1/PD-L1に基づく免疫チェックポイント阻害剤としては、抗体に基づく治療剤が挙げられる。PD-1/PD-L1に基づく免疫チェックポイント阻害を使用する例示的な治療方法は、米国特許第8,728,474号および同9,073,994号、ならびに欧州特許第1537878B1号に記載され、例えば抗PD-1抗体の使用を含む。例示的な抗PD-1抗体は、例えば米国特許第8,952,136号、同8,779,105号、同8,008,449号、同8,741,295号、同9,205,148号、同9,181,342号、同9,102,728号、同9,102,727号、同8,952,136号、同8,927,697号、同8,900,587号、同8,735,553号および同7,488,802号に記載される。例示的な抗PD-1抗体としては、例えばニボルマブ(Opdivo(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Co.)、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標)、Merck Sharp & Dohme Corp.)、PDR001 (Novartis Pharmaceuticals)およびピジリズマブ(pidilizumab) (CT-011、Cure Tech)が挙げられる。例示的な抗PD-L1抗体は、例えば米国特許第9,273,135号、同7,943,743号、同9,175,082号、同8,741,295号、同8,552,154号および同8,217,149号に記載される。例示的な抗PD-L1抗体としては、例えばアテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標)、Genentech)、デュバルマブ(duvalumab) (AstraZeneca)、MEDI4736、アベルマブおよびBMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.)が挙げられる。
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、CTLA-4阻害剤と組み合わせて投与される。CTLA-4経路において、T細胞上のCTLA-4と、抗原提示細胞(癌細胞ではない)の表面上のそのリガンド(例えばCD80、B7-1およびCD86としても公知)との相互作用は、T細胞阻害を引き起こす。例示的なCTLA-4に基づく免疫チェックポイント阻害法は、米国特許第5,811,097号、同5,855,887号、同6,051,227号に記載される。例示的な抗CTLA-4抗体は、米国特許第6,984,720号、同6,682,736号、同7,311,910号、同7,307,064号、同7,109,003号、同7,132,281号、同6,207,156号、同7,807,797号、同7,824,679号、同8,143,379号、同8,263,073号、同8,318,916号、同8,017,114号、同8,784,815号および同8,883,984号、国際(PCT)公開番号WO98/42752、WO00/37504およびWO01/14424、ならびに欧州特許EP 1212422 B1に記載される。例示的なCTLA-4抗体としては、イピリムマブまたはトレメリムマブが挙げられる。
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、(i)PD-1またはPD-L1阻害剤、例えば本明細書に開示されるPD-1またはPD-L1阻害剤、および(ii)CTLA-4阻害剤、例えば本明細書に開示されるCTLA-4阻害剤と組み合わせて投与される。
ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、IDO阻害剤と組み合わせて投与される。例示的なIDO阻害剤としては、1-メチル-D-トリプトファン(インドキシモド(indoximod)として公知)、エパカドスタット(epacadostat) (INCB24360)、ナボキシモド(GDC-0919)およびBMS-986205が挙げられる。
本明細書に記載される方法または組成物と組み合わせて投与され得る例示的な細胞傷害性剤としては、例えば微小管阻害薬(antimicrotubule agents)、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、タンパク質合成および分解阻害剤、有糸***阻害剤、アルキル化剤、プラチナ製剤(platinating agents)、核酸合成の阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDAC阻害剤、例えばボリノスタット(SAHA、MK0683)、エンチノスタット(MS-275)、パノビノスタット(LBH589)、トリコスタチンA (TSA)、モセチノスタット(MGCD0103)、ベリノスタット(PXD101)、ロミデプシン(FK228、デプシペプチド))、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン、アルキルスルホネート、トリアゼン、葉酸アナログ、ヌクレオシドアナログ、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサン、エポチロン、インターカレート剤(intercalating agents)、シグナル伝達経路を妨害し得る薬剤、アポトーシスを促進する薬剤および放射線、または毒性剤を送達するために表面タンパク質に結合する抗体分子コンジュゲートが挙げられる。一態様において、本明細書に記載される方法または組成物と共に投与され得る細胞傷害性剤は、白金系薬剤(例えばシスプラチン)、シクロホスファミド、ダカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ヒドロキシ尿素、トポテカン、イリノテカン、アザシチジン、ボリノスタット、イキサベピロン、ボルテゾミブ、タキサン(例えばパクリタキセルまたはドセタキセル)、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、コルヒチン、アントラサイクリン(例えばドキソルビシンまたはエピルビシン) ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、アドリアマイシン、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、リジンまたはマイタンシノイドである。
本発明はまた、細胞または組織においてHLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2またはIL-6の発現を増加する方法を提供する。該方法は、細胞または組織と、組換えヒトシアリダーゼまたはその融合タンパク質および/または抗体コンジュゲート、例えば本明細書に開示される組換えヒトシアリダーゼ、融合タンパク質または抗体コンジュゲートの有効量を接触させる工程を含む。ある態様において、細胞は、樹状細胞および末梢血単核細胞(PBMC)から選択される。
ある態様において、該細胞または組織におけるHLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2またはIL-6の発現は、組換えヒトシアリダーゼ、融合タンパク質または抗体コンジュゲートと接触されなかった同様またはそうでなければ同一の細胞または組織に対して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約400%、少なくとも約500%、少なくとも約600%、少なくとも約700%、少なくとも約800%、少なくとも約900%または少なくとも約1,000%だけ増加される。遺伝子発現は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法により、例えばELISAにより、または本明細書の実施例13に記載されるようなLuminex multiplexアッセイにより測定され得る。
明細書を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、含む(including)もしくは含む(comprising)と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含むもしくは含むと記載される場合、さらに、記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物があること、ならびに記載されるプロセス工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法があることが企図される。
本願において、要素もしくは構成要素が記載される要素もしくは構成要素のリストに含まれるおよび/またはそれから選択されるといえる場合、該要素もしくは構成要素は、記載される要素もしくは構成要素のいずれか1つであり得るか、または該要素もしくは構成要素は、記載される要素もしくは構成要素の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
さらに、本明細書に記載される組成物もしくは方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的であろうと黙示的であろうと、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の方法で組み合され得ることが理解されるべきである。例えば、特定の化合物について参照がなされる場合、化合物は、文脈からそうではないと理解されない限り、本発明の組成物の種々の態様および/または本発明の方法において使用され得る。すなわち、本願において、態様は、明確および簡潔な適用を記載および図示し得る方法で記載されて示されているが、態様は、本教示および発明(1つまたは複数)から逸脱することなく種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され、理解される。例えば、本明細書に記載および示される全ての特徴は、本明細書に記載および示される発明(1つまたは複数)の全ての局面に適用可能であり得ることが理解される。
表現「少なくとも1つの」は、文脈および用途からそうではないと理解されない限り、該表現の後に記載されるもののそれぞれを個々におよび記載されるものの2つ以上の種々の組合せを含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載されるものに関して、表現「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。
用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、その文法的な同等物を含めて、文脈にそうではないと具体的に記されないかまたは文脈からそうではないと具体的に理解されない限り、例えば記載されていないさらなる要素または工程を排除することなく、一般的に、開放型および非限定として理解されるべきである。
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、本発明は、そうではないと具体的に記載されない限り、具体的な量的値自体も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されないかまたは推測されない限り、名目上の値から±10%の変動をいう。
工程の順序または特定の行為を実行するための順序は、本発明が実施可能なままである限りは重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つ以上の工程または行為は同時に実施されてもよい。
本明細書における任意および全ての例または例示的な用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、単に本発明をよりよく説明するために意図され、特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を与えない。明細書における用語は、本発明の実施に必須のものとして、任意の特許請求されない要素を示すように解釈されるべきではない。
実施例
以下の実施例は単なる説明であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することは意図しない。
実施例1
この実施例には、発現を高めるおよび/または凝集を低減するためのシステイン残基の置換を有する組換えヒトシアリダーゼ(Neu1、Neu2およびNeu3)の構築が記載される。
ヒトシアリダーゼNeu1、Neu2、Neu3(アイソフォーム1)、およびNeu4(アイソフォーム1)を、10xHisタグを有する分泌されたタンパク質として発現させた。分泌されたタンパク質としてNeu1を発現するために、天然のN末端シグナルペプチド(MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFAAIFLLLSLAASWSKA；配列番号:27)をMDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号:28)により置き換え、C末端リソソームシグナルモチーフ(YGTL；配列番号:29)を除去した。分泌されたタンパク質としてNeu2、Neu3およびNeu4を発現するために、N末端シグナルペプチドMDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(配列番号:28)をそれぞれに付加した。
24ウェルプレート中、N末端6xHisタグを有するpCEP4哺乳動物発現ベクターを使用した、HEK293Fヒト細胞の200mLトランスフェクションにおいてシアリダーゼを発現させた。Ni-NTAカラムを使用してシアリダーゼを精製し、UV-Vis分光計(NanoDrop)を用いて定量し、図1に示されるようにSDS-PAGEにより調査した。Neu1は約3μg/mlの収率を有して十分に発現され、主に単量体の形態で存在した。Neu2およびNeu3発現はそれぞれ約0.15μg/mLの収率を生じ、それぞれ主に二量体の形態で存在した。Neu4は、NanoDropで測定した場合に検出可能な発現収率を有さなかった。発現についての陽性対照として使用したネズミチフス菌由来の細菌性シアリダーゼ(St-シアリダーゼ；配列番号:30)は、Neu1と同等の収率を生じ、主に単量体の形態で存在した。
蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル-N-アセチルノイラミン酸(4MU-NeuAc)からのシアル酸の放出を測定して、組換え発現したシアリダーゼの活性をアッセイした。図2に示されるように、Neu1は酵素なし対照を超える検出可能な活性を有さず、これは、Neu1は、β-ガラクトシダーゼおよび保護的タンパク質/カテプシンA(PPCA)と複合体化しない限り、不活性であることを示す以前の報告と矛盾しない。Neu2およびNeu3は活性であった。Neu2およびNeu3を用いて酵素動力学的アッセイを行った。1nMの固定濃度の酵素を、4000μM〜7.8μMの範囲の濃度の蛍光発生基質4MU-NeuAcとインキュベートした。酸性(pH5.6)および中性(pH7)条件の両方でアッセイを行った。図3に示されるように、Neu2およびNeu3の両方は、酸性および中性の条件で活性であり、以前に報告されたものと同等の酵素動力学を示した。
組換え発現されたシアリダーゼのほとんどは、非還元SDS-PAGEゲル上で凝集物または二量体と同様に移動した(ran)。還元剤ジチオトレイトール(DTT)を用いたその後の処置は、還元SDS-PAGEゲル上42kDaで移動した酵素の単量体形態を生じた(図1)。したがって、シアリダーゼ中の遊離システイン残基は、凝集、二量体化および/または低発現を生じ得る。そのため、Neu2の6個の遊離システイン残基(125、196、219、272、332、352)のそれぞれを、部位特異的突然変異誘発を使用してアミノ酸S、I、V、F、LまたはAで置換した。得られた変異体シアリダーゼを、Expi293F細胞中、pCEP4哺乳動物発現ベクターを使用して、N末端ヒトFcタグを有する分泌されたタンパク質として、24ウェルプレート中で発現させた。発現は、抗ヒトFcセンサーを用いたForteBio Octetおよびウエスタンブロットを使用してアッセイし、酵素活性は、上述のように蛍光発生基質4MU-NeuAcを使用してアッセイした。変異体シアリダーゼについての発現および活性レベルを表2に示す。
表2において、酵素活性は、野生型Neu2と同等の活性を示す「++」、野生型Neu2より低い活性を示す「+」、または検出可能な活性がないことを示す「-」として表示し、発現は、野生型Neu2より>6倍高い発現を示す「+++」、野生型Neu2より2〜5倍高い発現を示す「++」、野生型Neu2と同等の発現を示す「+」、または検出可能な発現がないことを示す「-」として表示する。
Figure 2021509585
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表2に示されるように、システイン219の変異は、発現を大きく高めるが、酵素活性には負に影響する。これは、触媒に対して求核剤として作用する重要な触媒性残基であると考えられる隣接するアミノ酸グルタミン酸218に対するシステイン219変異の効果のためであり得る。他の5個のシステイン(125、196、272、332および352)の個々の変異は、発現に対して最小の影響を有した。しかしながら、広範囲のコンビナトリアル突然変異誘発により、C332AおよびC352L置換の両方を有する変異体シアリダーゼ(Neu2-M38)は、向上された発現および維持された酵素活性(野生型に対して酵素活性は低減されるが)を有すると同定された。これらの結果を確認するために、震盪フラスコ内100mLトランスフェクション中でNeu2-M38を発現させ、プロテインAカラムを用いて精製した。Neu2-M38は、同じ条件下で野生型Neu2よりも2倍高い発現およびSEC-HPLCにより特徴付けられた際に向上された単量体含有量(12% 対 7%)を有した(図4Aおよび4B)。まとめると、これらの結果は、ヒトシアリダーゼにおける遊離システイン残基を変異させることは、分泌組換えヒトシアリダーゼを作製することおよび組換えヒトシアリダーゼの発現を向上することに有利であり得ることを示す。
実施例2
この実施例には、ヒトシアリダーゼの表面露出残基を作り変えることにより、シアリダーゼの等電点(pI)を増加し得および/またはシアリダーゼ上の表面の疎水性を低減して可溶性を向上し得および/またはタンパク質凝集を減少し得ることが示される。
ヒトNeu2は、ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)の9.6のpIと比較して7.5の推定pIを有する。さらに、利用可能な結晶構造を使用したNeu2の表面疎水性の分析により、主にNeu2のN末端アミノ酸、例えばA2およびV325を含むNeu2の表面の大きな露出疎水性パッチが明らかになった。これらの結果は、中性水性条件ではタンパク質安定性および溶解性に関して最適に及ばなくあり得、おそらく分子間疎水性相互作用のための凝集の結果であり得る。
Neu2の表面残基を、以下の基準：表面露出DまたはE残基；表面疎水性パッチに寄与する疎水性残基；触媒に関与しない残基；ヒトNeu1、3、4、St-シアリダーゼの間で十分に保存されない残基；および他のシアリダーゼにおいて相同なKまたはRを有する位置の残基に従って、可溶性および/または発現を増加するための置換の候補として選択した。これらの基準を使用して、Neu2中の酸性アミノ酸E72、D215およびE257をリジンに変異させてpIを増加し、Neu2中の疎水性アミノ酸A2およびV325をリジンまたはグルタミン酸に変異させて予想Neu2表面疎水性パッチの疎水性を低減した。得られた変異体シアリダーゼを、Expi293F細胞中、pCEP4哺乳動物発現ベクターを使用して、ヒトFcタグを有する分泌タンパク質として24ウェルプレート中で発現させ、実施例1に上述されるように発現および活性についてアッセイした。
変異体シアリダーゼの発現および活性レベルを表3に示す。表3において、酵素活性は、野生型Neu2と同等の活性を示す「++」、野生型Neu2より低い活性を示す「+」、または検出可能な活性がないことを示す「-」として表示し、発現は、野生型Neu2よりも>6倍高い発現を示す「+++」、野生型Neu2よりも2〜5倍高い発現を示す「++」、野生型Neu2と同等の発現を示す「+」、または検出可能な発現がないことを示す「-」として表示する。
Figure 2021509585
表3に示されるように、Neu2-M62 (A2K)、Neu2-M68 (A2K+E257K)およびNeu2-M71 (A2K+V325K)変異体シアリダーゼは、野生型Neu2と比較して向上された発現および同等または低減された酵素活性を示した。これらの結果を確認するために、Neu2-M62およびNeu2-M71変異体シアリダーゼを、震盪フラスコ内、100mLトランスフェクション中で発現させ、プロテインAカラムを用いて精製した。Neu2-M62は、 SEC-HPLCにより特徴付けた際に、野生型Neu2よりも約4.4倍高い発現(4.4μg/mL 対 1μg/mL)および同様の単量体含有量(8% 対 7%)を有した(図5Aおよび5B)。Neu2-M71は、野生型Neu2よりも約12倍高い発現(12μg/mL 対 1μg/mL)およびSEC-HPLCにより特徴付けた際に、向上された単量体含有量(17% 対 7%)を有した(図5Aおよび5C)が、酵素活性は有さなかった。
まとめると、これらの結果は、ヒトシアリダーゼ中の表面露出残基を変異させることにより、シアリダーゼの等電点(pI)を増加させ得および/またはシアリダーゼの表面の疎水性を低減して、溶解性を向上し得、タンパク質凝集を減少し得および/または組換えヒトシアリダーゼの発現を向上し得ることを示す。
実施例3
この実施例には、ヒトシアリダーゼのN末端への短いペプチドの付加により、シアリダーゼの発現および/または活性を増加し得ることが示される。
相同性に基づく工学を使用して、本発明者らは、オーバーラッピングPCRにより、マウス胸腺Neu2由来のN末端配列(MEDLRP；配列番号:4)のバリアントをヒトNeu2に移植した。Expi293F細胞中、pCEP4哺乳動物発現ベクターを使用して、得られた変異体シアリダーゼを、ヒトFcタグを有する分泌されたタンパク質として24ウェルプレート中で発現させ、実施例1に記載されるように発現および活性についてアッセイした。
変異体シアリダーゼについての発現および活性レベルを表4に示す。表4において、酵素活性は、野生型Neu2よりも高い活性を示す「+++」、野生型Neu2と同等の活性を示す「++」、野生型Neu2よりも低い活性を示す「+」、または活性がないことを示す「-」として表示し、発現は、野生型Neu2よりも>6倍高い発現を示す「+++」、野生型Neu2よりも2〜5倍高い発現を示す「++」、または野生型Neu2と同等の発現を示す「+」として表示する。
Figure 2021509585
表4に示されるように、MEDLRP(配列番号:4)N末端配列を含む試験した全てのバリアントは、野生型Neu2に対して、増加した発現および活性の両方を有した。
これらの結果を確認するために、変異体Neu2-M76(N末端に挿入されたMEDLRP(配列番号:4)を含む)を、震盪フラスコ内、100mLトランスフェクション中で発現させ、プロテインAカラムを用いて精製した。24ウェル形式と比較して、Neu2-M76のみは、発現において野生型Neu2よりも約1.5倍高い適度な向上(1.5μg/mL 対 1μg/mL)と共にSEC-HPLCにより特徴付けられた際に、向上された単量体含有量(12.5% 対 7%)を示した(図6Aおよび6B)。
精製されたNeu2-M76を用いて酵素動力学的測定を行った。100nMの固定濃度のNeu2-M76を、4000μM〜7.8μMの範囲の濃度の蛍光発生基質4MU-NeuAcとインキュベートした。図7Aに示されるように、このバリアントは、野生型Neu2(約867μMのKM)よりも5倍強い約175μMのKMを有した。さらに、図7Bに示されるように、Neu2-M76はまた、pH5でα2,8連結を有するシアル酸(コロミン酸(colominic acid))を切断し、一方で野生型Neu2はかかる活性を有さなかったので、野生型Neu2に対して変化した基質特異性を有した。
まとめると、これらの結果は、ヒトシアリダーゼのN末端への短いペプチドの付加は、シアリダーゼの発現を増加し得、活性を増加し得および/または基質特異性を改変し得ることを示す。
実施例4
この実施例には、N末端とC末端の間の疎水性相互作用および/または水素結合を増加するようにヒトシアリダーゼのNまたはC末端における残基を変異させることにより、シアリダーゼの安定性および/または発現を増加し得ることが示される。
Neu2の結晶構造に基づいて、残基L4、V6、L7およびL12を、Neu2のN末端とC末端の間で疎水性相互作用または水素結合を促進するように変異させた。得られた変異体シアリダーゼを、Expi293F細胞中、pCEP4哺乳動物発現ベクターを使用して、24ウェルプレート中で、ヒトFcタグを有する分泌されたタンパク質として発現させ、実施例1に記載されるように発現および活性についてアッセイした。
変異体シアリダーゼについての発現および活性を表5に示す。表5において、酵素活性は、野生型Neu2と同等の活性を示す「++」、野生型Neu2より低い活性を示す「+」、または検出可能な活性がないことを示す「-」として表示し、発現は、野生型Neu2よりも>6倍高い発現を示す「+++」、野生型Neu2よりも2〜5倍高い発現を示す「++」、野生型Neu2と同等の発現を示す「+」または検出可能な発現がないことを示す「-」として表示する。
Figure 2021509585
表5に示されるように、V6Y置換(Neu2-M79)は、野生型Neu2と比較して、向上した発現および酵素活性を生じた。
これらの結果を確認するために、Neu2-M79を、震盪フラスコ内100mLのトランスフェクション中で発現させ、プロテインAカラムを用いて精製した。Neu2-M79は、野生型Neu2よりも約10倍高い発現を有し(10μg/mL 対 1μg/mL)、SEC-HPLCにより特徴付けられた際に実質的に向上した単量体含有量を有し(78% 対 7%)(図8A および 8B)、野生型Neu2と同様に活性であった。
まとめると、これらの結果は、N末端とC末端の間で疎水性相互作用および/または水素結合を増加するようにヒトシアリダーゼのN末端またはC末端における残基を変異させることにより、シアリダーゼの安定性および/または発現を増加し得ることを示す。
実施例5
この実施例には、ヒトシアリダーゼのN末端メチオニンを変異させることにより、シアリダーゼの安定性および/または発現を増加し得ることが示される。
ヒトNeu2の第1の残基(M1)を欠失させたかまたはR、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、V、L、FおよびYに変異させた。全ての変異体は、V6YおよびI187K置換と組み合わせて試験した。得られた変異体シアリダーゼを、Expi293F細胞中、pCEP4哺乳動物発現ベクターを使用して、ヒトFcタグを有する分泌されたタンパク質として震盪フラスコ内で発現させた。タンパク質は、プロテインAカラムを用いて精製し、Nanodropにより定量し、実施例1に記載されるように酵素活性について特徴付けた。
変異体シアリダーゼについての発現および活性レベルを表6に示す。表6において、酵素活性は、野生型Neu2と同等の活性を示す「++」、野生型Neu2より低い活性を示す「+」、または検出可能な活性がないことを示す「-」として表示し、発現は、野生型Neu2よりも>6倍高い発現を示す「+++」、野生型Neu2よりも2〜5倍高い発現を示す「++」、野生型Neu2と同等の発現を示す「+」、または検出可能な発現がないことを示す「-」として表示する。
Figure 2021509585
表6に示されるように、V6YおよびI187K置換と組み合わせたM1の欠失またはM1のR、H、K、D、E、T、N、Q、G、A、V、LもしくはFへの変異は、シアリダーゼの発現を増加し、M1H、M1D、M1LおよびM1F変異は、発現および酵素活性の増加を生じた。まとめると、これらの結果は、ヒトシアリダーゼのN末端メチオニンを変異させることにより、シアリダーゼの安定性および/または発現を増加し得ることを示す。
実施例6
この実施例には、変異および変異の組合せは、シアリダーゼの安定性および/または発現を増加し得ることが示される。
ヒトNeu2を表7に示されるように変異させた。得られた変異体シアリダーゼを、Expi293F細胞中、pCEP4哺乳動物発現ベクターを使用して、ヒトFcタグを有する分泌されたタンパク質として、震盪フラスコ内で発現させた。タンパク質は、プロテインAカラムを用いて精製し、Nanodropにより定量し、実施例1に記載されるように酵素活性について特徴付けた。
変異体シアリダーゼについての発現および活性レベルを表7に示す。表7において、酵素活性は、野生型Neu2と同等の活性を示す「++」、野生型Neu2より低い活性を示す「+」、または検出可能な活性がないことを示す「-」として表示し、発現は、野生型Neu2よりも>6倍高い発現を示す「+++」、野生型Neu2よりも2〜5倍高い発現を示す「++」、野生型Neu2と同等の発現を示す「+」、または検出可能な発現がないことを示す「-」として表示する。
Figure 2021509585
実施例7
この実施例には、抗体-シアリダーゼ遺伝子的融合タンパク質ならびに細菌性および変異体ヒトシアリダーゼを有する融合タンパク質を含む抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)の構築および発現が記載される。
この実施例で使用される3種類のASCについての構造を図10に示す。「Raptor」と称される第1の型のASCは、抗体の各重鎖のC末端に融合したシアリダーゼを有する抗体(2つの重鎖および2つの軽鎖を有する)を含む。「Janus」と称される第2の型のASCは、1つの抗体アーム(1つの重鎖および1つの軽鎖を有する)、およびFcのN末端に融合したシアリダーゼを有する1つのシアリダーゼ-Fc融合体を含む。Janus ASC中のそれぞれのFcドメインポリペプチドは、ヘテロ二量体化のための「knob」(T366Y)または「hole」(Y407T)変異のいずれかを含む(EUナンバリングによる残基番号、Kabat, E.A., et al. (1991)上述)。「Lobster」と称される第3の型のASCは、それぞれ、FcのN末端で融合したシアリダーゼおよびFcのC末端で融合したscFvを有する2つのFcドメインポリペプチドを含む。
以下のASCは、発現され、SDS-PAGEおよびSEC-HPLCを使用して純度について特徴付けられ、実施例1に記載されるように4MU-NeuAcを使用して酵素についてアッセイされた：(i)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；(ii)St-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むRaptor ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1および第4のポリペプチド鎖、ならびにヌクレオチド配列配列番号:60によりコードされるアミノ酸配列配列番号:59を有する第2および第3のポリペプチド鎖を含む)；ならびに(iii)2つのロスオブファンクション変異D100VとG231Vを有するSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むJanus ASC(「Janus-LOF」、ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:62によりコードされるアミノ酸配列配列番号:61を有する第3のポリペプチド鎖を含む)。
ASCは、抗Fcセンサー上に捕捉されたASCを有するForteBio Octetを使用してHisタグ付Her2の連続希釈(1:2希釈で50〜0.78nM)に浸漬することにより、抗原(Her2)結合について試験された。ASCは、30μg/mLの収率および高い純度を有する良好な発現を有し、コンジュゲートされないSt-シアリダーゼと同様に活性であり、トラスツズマブと同等の結合親和性でHer2に結合した(図11および12)。Janus-LOF変異体は、予測されるようにシアリダーゼ活性を破壊し、親Janus ASCと同様の生化学特性を有して十分に発現された。
Janus ASCは、Neu2-M76(N末端に挿入されたMEDLRP(配列番号:4)を含む)およびトラスツズマブを使用して作製された。このJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:64によりコードされるアミノ酸配列配列番号:63を有する第3のポリペプチド鎖を含む)は、発現され、SDS-PAGEを使用して純度についておよび実施例1に記載されるように4MU-NeuAcを使用して酵素活性について特徴付けられた。Janus ASCは、精製後に良好な純度を有して約5μg/mLの発現収率を有し(図13)、Janus ASC 野生型コンジュゲートNeu2と比較して向上された活性を示した(図14)。
さらに、Lobster ASCは、Neu2-M85(M1の欠失ならびに変異V6YおよびI187Kを含む)およびトラスツズマブ由来のscFvを使用して作製された。このLobster ASC(ヌクレオチド配列配列番号:66によりコードされるアミノ酸配列配列番号:65を有する第1および第2のポリペプチド鎖を含む)は、発現され、SDS-PAGEを使用して純度についておよび実施例1に記載されるように4MU-NeuAcを使用して酵素活性について特徴付けられた。Lobster ASCは、精製後に良好な純度を有して、約5μg/mLの発現収率(図13)および172.6μMのKm(図14)を有した。
実施例8
この実施例には、細菌性シアリダーゼを含む抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)のインビボ投与が記載される。
以下のASCを作製して、この実施例において試験した：(i)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；(ii)St-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むRaptor ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1および第4のポリペプチド鎖、ならびにヌクレオチド配列配列番号:60によりコードされるアミノ酸配列配列番号:59を有する第2および第3のポリペプチド鎖を含む)；ならびに(iii)St-シアリダーゼおよびトラスツズマブに由来するscFvを含むLobster ASC(ヌクレオチド配列配列番号:104によりコードされるアミノ酸配列配列番号:103を有する第1および第2のポリペプチド鎖を含む)。ASCは実施例7に記載されるように作製した。
これらのASCを、ヒトHer2を発現するマウス乳癌細胞株(EMT6-hHer2細胞)を注射したマウス同系腫瘍モデルにおいて、トラスツズマブと比較した。雌BALB/cマウス、6〜8週齢に、腫瘍発症のために、0.1mlのPBS中EMT6-Her2腫瘍細胞(5x105)を、右下側腹部の皮下に接種した。腫瘍が50〜100mm3、平均約75〜100mm3に達した際に、マウスを無作為に8群に振り分けた。処置群を無作為化後の投与スケジュールを示す表8に記載する。抗マウスNK1.1(クローン：PK136; BioXcell, 621717N1)、抗マウスCD8α(クローン：53-6.7; BioXcell, BE0004-1)およびクロドロン酸リポソーム(FormuMax Scientific, Inc.)を、示されるように処置群に含めた。
Figure 2021509585
トラスツズマブ、ならびにRaptor、JanusおよびLobster ASCを用いた処置の結果を図15A、15B、15Cおよび15Dのそれぞれに示す。見られ得るように、トラスツズマブは、処置された際に、8個体のマウスにおいて完全応答を生じなかった(試験の持続の間の任意の点での触診の限界未満の後退として定義、図15A)。これは、8匹中2匹の動物が完全応答を有することを示したRaptor(図15B)、8匹中3匹の動物が完全応答を有することを示したJanus(図15C)および8匹中2匹の動物が完全応答を有することを示したLobster(図15D)とは対照的である。
NK枯渇(抗マウスNK1.1)、マクロファージ枯渇(クロドロン酸リポソーム)およびCD8 T細胞枯渇(抗マウスCD8α)を有するJanusの投与の結果を図16に示す。見られ得るように、8匹中3匹の動物で完全応答があったJanus処置単独(図15C)と比較して、NK枯渇は、完全応答の数を8匹中1匹の動物まで低減した(図16A)。マクロファージ枯渇も、完全応答の数を8匹中1匹の動物まで低減した(図16B)。CD8 T細胞枯渇は、Janusの効果を完全に逆転し、完全応答を示す動物はなかった(図16C)。図16Dは、ビヒクル、Janus単独、トラスツズマブ単独ならびにNK枯渇、マクロファージ枯渇およびCD8 T細胞枯渇を伴うJanusについての平均腫瘍体積を示す。これらの結果は、先天免疫(NKおよびマクロファージ依存的)および適応免疫(CD8 T細胞)がインビボASC活性に寄与することを示す。
実施例9
この実施例には、細菌性シアリダーゼを有する抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)のインビボ投与が記載される。
この実施例において、以下のASCを作製して、試験した：(i)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；ならびに(ii)2つのロスオブファンクション変異D100VとG231Vを有するSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むJanus ASC(「Janus-LOF」、ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:62によりコードされるアミノ酸配列配列番号:61を有する第3のポリペプチド鎖を含む)。ASCは、実施例7に記載されるように作製した。
これらのASCは、ヒトHer2を発現する非依存的EMT6細胞株(D'Amico et al. (2016) ANNALS OF ONCOLOGY, Volume 27, Issue suppl_8, 41Pに記載されるEMT6-hHer2細胞を注射したマウス同系同所腫瘍モデルにおいて試験した。雌BALB/cマウス、6〜8週齢に、EMT6-Her2腫瘍細胞(5x106)を***内(intra mammary)植込みにより接種した。腫瘍が約250mm3に達した際に、マウスを無作為に6群に振り分けた。処置群を無作為化後の投与スケジュールを示す表9に記載する。抗マウスPD1はBioXcellから入手した(RMP1-14, Cat. # 665418F1)。JanusおよびJanusロスオブファンクション(Janus LOF)は実施例7において上述される。
Figure 2021509585
群1〜4(ビヒクル、トラスツズマブ、JanusおよびJanus LOF)の結果を図17Aに示す。見られ得るように、Janusで処置した6匹中3匹の動物は、腫瘍増殖の完全後退を有した。特に、Janus LOFおよびトラスツズマブは共に、ビヒクル処置動物と同等であった。
完全後退を有する3匹のマウス(「治癒マウス」)に、最初に使用した同じEMT6-Her2細胞または親のEMT6細胞(作り変えられたヒトHer2発現を欠く)のいずれかを再負荷した。全ての3匹の治癒マウスの腫瘍発症のために、0.1mlのPBS中のEMT6細胞およびEMT6-Her2細胞(5x105)を、右または左下の側腹部領域のそれぞれに皮下で接種した。EMT6-Her2細胞は、対照としてナイーブマウスにも皮下で接種した。図17Bに見られ得るように、EMT6-Her2細胞も親EMT6細胞もいずれも治癒マウスにおいて腫瘍増殖を生じなかったが、ナイーブマウスではEMT6-Her2細胞は、予想されたとおりに腫瘍に進展した。これらの結果は、本発明の抗体シアリダーゼコンジュゲートは、腫瘍に対して長期記憶を誘導し得ることを示唆する。さらに、長期記憶は腫瘍細胞に対するものであり、元の標的化癌抗原(この場合はHer2)に非依存的である。
群1、5および6(ビヒクル、抗マウスPD1およびJanusと組み合わせた抗マウスPD1)についての結果を図18Aおよび図18Bに示す。抗マウスPD1は良好な活性を有し、6匹中4匹のマウスが完全後退を示した(6匹中3匹のマウスが完全後退を示したJanus単独と同様、図17A参照)が、抗マウスPD1とJanusの組合せは、6匹すべてのマウスにおいて腫瘍増殖の完全後退を示した(図18B)。この組合せを与えた動物のいずれにおいても体重消失はなかった。
実施例10
この実施例には、細菌性シアリダーゼを有する抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)のインビボ投与が記載される。
ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)は、実施例7に記載されるように作製した。
ASCは、ヒトHer2を発現するB16黒色腫細胞株(B16D5-Her2、Surana et al. CANCER IMMUNOL RES, 2(11): 1103-1112)を注射したマウス同系腫瘍モデルにおいて試験した。雌C57BL/6マウス、6〜8週齢に、B16D5-Her2腫瘍細胞(5x105)を、右下側腹部領域に、皮下で接種した。腫瘍が約50〜100mm3に達した際に、マウスを無作為に3群に振り分けた。処置群を無作為化後の投与スケジュールを示す表10に記載する。BioXcellから入手した抗マウスPD1 (RMP1-14, Cat. No. 665418F1)およびBioXcellから入手した抗マウスCTLA4(9D9, Cat. # BE0164)を組み合わせて使用した。
Figure 2021509585
B16黒色腫マウスモデルは、免疫-癌アプローチを用いて治療することが困難な腫瘍モデルであると考えられる。抗マウスPD1と抗マウスCTLA4の組合せに対してJanusの比較を行った。結果を図19に示す。抗マウスCTLA4と組み合わせた抗マウスPD1は、B16D5-Her2腫瘍増殖に対して影響を有したが、この組合せは、処置動物において有意な重量消失も示した。比較により、Janusは、有意な重量消失を有さない、より頑丈な抗腫瘍活性を示した。トラスツズマブ単独は、このモデルにおいて下限に近い(marginal)活性を示した。
実施例11
この実施例には、抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)による腫瘍細胞からの末端シアル酸の標的化切断が記載される。
この実施例において、以下のASCを作製して、試験した：(i)St-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むRaptor ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1および第4のポリペプチド鎖、ならびにヌクレオチド配列配列番号:60によりコードされるアミノ酸配列配列番号:59を有する第2および第3のポリペプチド鎖を含む)；(ii)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；(iii)St-シアリダーゼおよびトラスツズマブ由来のscFvを含むLobster ASC(ヌクレオチド配列配列番号:104によりコードされるアミノ酸配列配列番号:103を有する第1および第2のポリペプチド鎖を含む)；(iv)2つのロスオブファンクション変異D100VとG231Vを有するSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むJanus ASC(「Janus-LOF」、ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:62によりコードされるアミノ酸配列配列番号:61を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；ならびに(v)St-シアリダーゼおよび呼吸器シンシチウムウイルス(respiratory syncytial virus)Fタンパク質を認識する抗体を含む非Her2結合Janus ASC(「Janus非Her2」；ヌクレオチド配列配列番号:95によりコードされるアミノ酸配列配列番号:94を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:97によりコードされるアミノ酸配列配列番号:96を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)。ASCは、実施例7に記載されるように作製した。
SKBR-3細胞(Her2 +++)またはBT-20細胞(Her2 +)を、トラスツズマブまたは示されるASCとインキュベートして、MAL IIを用いてFACS染色を行い、PNAを使用してシアル酸除去の程度を測定した(図20参照)。MAL IIは、シアル酸に対して高い親和性を有するレクチンであるので、MAL II染色は、ASCによる切断後の細胞表面シアル酸の消失の際に減少することが予想された。PNAは、末端ガラクトース残基に高い親和性を有するレクチンであるので、PNA染色は、ASCによる切断後、細胞表面ガラクトース連結シアル酸の消失に伴い増加することが予想された。トラスツズマブと比較して、Janus、RaptorおよびLobster ASCを用いた処置は、高または低レベルのHer2を有する癌細胞(SKBR-3およびBT-20細胞それぞれ)上でシアル酸レベルを減少した。Janus LOF構築物についてシアル酸切断は観察されず、Janus 非Her2結合構築物について実質的に低減されたシアル酸切断が観察された。
実施例12
この実施例には、抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)による樹状細胞(DC)活性化の癌細胞媒介阻害の低減が記載される。
DCは、免疫応答の開始および持続において主要な役割を担う。DCは、(腫瘍部位を含む)組織において抗原を探す。一旦DCが抗原に遭遇すると、DCは、プロセシングされた抗原のT細胞への提示のために成熟し、活性化し、排出リンパ節(draining lymph node)を移動する。DC活性化のこのプロセスは、癌細胞上の過シアリル化タンパク質とDCの表面上のSiglecの相互作用により阻害され得る。ASCによる癌細胞上の過シアリル化タンパク質の脱シアリル化は、この阻害を低減する可能性があり得、DCの活性化の増加を生じ得る。
これを試験するために、SKBR-3細胞(高レベルのHer2を発現する)を、最初に：(i)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；(ii)2つのロスオブファンクション変異D100VとG231Vを有するSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むJanus ASC(「Janus-LOF」、ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:62によりコードされるアミノ酸配列配列番号:61を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；または(iii)St-シアリダーゼおよび呼吸器シンシチウムウイルスFタンパク質を認識する抗体を含む非Her2結合Janus ASC(「Janus 非Her2」；ヌクレオチド配列配列番号:95によりコードされるアミノ酸配列配列番号:94を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:97によりコードされるアミノ酸配列配列番号:96を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)のいずれかとインキュベートした。ASCは実施例7に記載されるように作製した。次いで細胞を洗浄して、リポ多糖(LPS；DC活性化シグナル)の存在下または非存在下で、DCと16時間共培養した。DC表面活性化マーカーをフローサイトメトリーにより評価した。
図21に見られ得るように、DCとLPSの共培養により、表面活性化マーカーHLA-DR、CD86およびCD83のレベルが増加した。しかしながら、この増加は、SKBR-3癌細胞の存在下で減少し、癌細胞によるDC活性化の阻害を反映した。Janusを用いたSKBR-3細胞株の処置により、DC上のHLA-DR、CD86およびCD83の細胞表面発現の増加により明らかにされるように、SKBR-3媒介性のDCの阻害が遮断された。該効果は、Janus非Her2について低減されASCのJanus LOFバージョンについて完全に非存在であり、これによりASCにおける活性なおよび標的化されたシアリダーゼ活性の両方は、最適な効果のために必要であることが示された。
これらの結果は、ASCによる癌細胞の標的化された脱シアリル化は、樹状細胞(DC)活性化の癌細胞媒介性の阻害を低減し得ることを示す。したがって、ASCを用いた処置は、DCによる腫瘍抗原の提示を増強することにより、腫瘍抗原の免疫原性を増強するための有効な戦略であり得る。
実施例13
この実施例には、ヒトシアリダーゼを有する抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)による末梢血単核細胞(PBMC)における前炎症性サイトカインの誘導が記載される。
M1D、V6Y、I187KおよびC332A変異を有するNeu2ならびにトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:98によりコードされるアミノ酸配列配列番号:54を有する第3のポリペプチド鎖を含む)を構築した。
ヒトPBMCを新たに単離し、2回洗浄して、培養培地(RPMI 1640+L-glut、10% FBS、1% P/S)中、1ウェル当たり250,000PBMCで平板培養した。PBMCを、100μg/mlの最大濃度を有する2.5X連続希釈のJanus ASCと4連でインキュベートした。37℃で24時間後、遠心分離により細胞を除去し、製造業者の指示書に従ってLuminex multiplexアッセイを使用したサイトカイン測定のために上清を回収した。
陽性対照として、IL-2(10U/mL)またはLPS(10ng/mL)を有する植物性血球凝集素-L(PHA-L；5μg/mL)を使用して、サイトカイン放出を刺激した。陰性対照として、トラスツズマブ(10μg/mL)を使用した。図22に見られるように、ヒトJanus ASCは、PBMCにおいて前炎症性サイトカイン分泌を誘導した(例えばINFγ、IL-1b、IL-6およびTNFα)。図23は、前炎症性サイトカインIL-2、抗炎症性サイトカインIL-4およびIL-10、ならびに前および抗炎症性サイトカインIL-13のPBMC分泌に対するヒトJanus ASCの効果を示す。
これらの結果は、PBMCにおいてASCが前炎症性サイトカインの分泌を誘導し得ることを示す。
実施例14
この実施例には、宿主-腫瘍微小環境モデル系への抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)の添加後の免疫関連活性の増加が記載される。
BioMAP Oncology Panels (Eurofins, Fremont, CA)は、癌誘導免疫抑制を模倣する、腫瘍細胞株および初期継代始原ヒト細胞(内皮細胞/線維芽細胞およびPBMC)の複雑な共培養物である。特定の状況において、BioMAPの結果は、臨床結果に相関する。例えば、ペンブロリズマブは、該モデルにおいて免疫応答を増加することが示されているが、IDO阻害剤は効果を有さなかった。
以下の構築物を、BioMAP VascHT29共培養系を使用した盲検で試験した：(i)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；(ii)2つのロスオブファンクション変異D100VとG231Vを有するSt-シアリダーゼおよびトラスツズマブを含むJanus ASC(「Janus-LOF」、ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:62によりコードされるアミノ酸配列配列番号:61を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；(iii)アイソタイプ対照；(iv)トラスツズマブ；または(v)ペンブロリズマブ。全てのASCは、実施例7に記載されるように作製した。
ある範囲の濃度(50、17、5.6および1.9μg/ml)で48時間、試験試薬を試験した。露出後、図24および図25に記載されるようにいくつかのパラメーターを分析した。両方の図において、ビヒクル応答の歴史上の範囲は、ゼロベースラインに沿った影のつけられた面積で表される。それぞれの測定についての値は、ビヒクル対照に対する試験物の比の対数で表される。歴史上の範囲を超える統計的に有意な値を有する分析物に注釈をつける。
図24は、この試験においてJanusは試験された濃度で細胞傷害性ではないことを示す。Janusは、可溶性IL-17A、IL-6、IL-2およびIFNγの増加を含む多くの免疫関連活性、ならびにTNFαの増加により見られる炎症関連活性の用量依存的な増加を示した。この試験においてJanus LOFは試験された濃度で細胞傷害性ではなく、IFNγの増加に伴う適度な免疫関連活性およびCEACAM5の低下に伴う腫瘍関連活性を示した。図25は、ペンブロリズマブに対するJanusの比較である。図25に見られ得るように、Janusは、この腫瘍微小環境モデルにおいてペンブロリズマブと同様の活性を有する。
実施例15
この実施例には、細菌性シアリダーゼを含む抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)のインビボ投与が記載される。
この実施例において、以下のASCを作製して試験した：(i)ネズミチフス菌シアリダーゼ(St-シアリダーゼ)およびトラスツズマブを含むJanus ASC(ヌクレオチド配列配列番号:68によりコードされるアミノ酸配列配列番号:67を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:58によりコードされるアミノ酸配列配列番号:57を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)；ならびに(ii)St-シアリダーゼおよび呼吸器シンシチウムウイルスFタンパク質を認識する抗体を含む非Her2結合Janus ASC(「Janus 非Her2」；ヌクレオチド配列配列番号:95によりコードされるアミノ酸配列配列番号:94を有する第1のポリペプチド鎖、ヌクレオチド配列配列番号:97によりコードされるアミノ酸配列配列番号:96を有する第2のポリペプチド鎖、およびヌクレオチド配列配列番号:56によりコードされるアミノ酸配列配列番号:55を有する第3のポリペプチド鎖を含む)。ASCは、実施例7に記載されるように作製した。
マウス同系腫瘍モデルにおいてASCをトラスツズマブと比較した。雌BALB/cマウス、6〜8週齢に、腫瘍進展のために、0.1ml PBS中のヒトHer2を発現するマウス乳癌細胞株(EMT6-hHer2細胞；5x105細胞)を右下側腹部領域で皮下に接種した。腫瘍が50〜100mm3、平均約75〜100mm3に達した際に、マウスを無作為に、各8匹の動物の4群に振り分けた。
マウスを、10mg/kgのJanus、トラスツズマブまたは非Her2結合Janusの腹腔内注射により処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。図26Aは、それぞれの処置群についての平均腫瘍体積を示す。図26Bは、それぞれの処置群における個々のマウスについての腫瘍体積を示す。完全応答(CR、試験中の任意の時点での触診の限界未満の後退と定義される)も示される。トラスツズマブおよびビヒクル対照は、同様の腫瘍増殖曲線およびCRがないことを示した。対照的に、Janusは、ビヒクルと比較して腫瘍増殖の低減を示し、8匹中3匹のマウスがCRを示した。非Her2結合Janusは、ビヒクルと比較して腫瘍増殖の低減を示し、8匹中1匹のマウスがCRを示した。これらの結果は、ASCにより標的化される腫瘍抗原の低発現レベルを有する腫瘍に対して、ASCは活性であり得ることを示す。さらに、これらの結果は、非標的化ASC、例えばシアリダーゼ-Fc融合タンパク質は、特定の腫瘍関連抗原を欠く腫瘍に対して活性であり得ることを示唆する。
実施例16
この実施例には、ヒトシアリダーゼを含む抗体シアリダーゼコンジュゲート(ASC)のインビボ投与が記載される。
この実施例において、以下のASCを作製して試験した：(i)ΔM1、V6YおよびI187K変異を有するNeu2ならびにトラスツズマブ由来のscFvを含むLobster ASC(ヌクレオチド配列配列番号:66によりコードされるアミノ酸配列配列番号:65を有する第1および第2のポリペプチド鎖を含み、この実施例において「Lobster 1」と称される)；ならびに(ii)V6YおよびI187K変異を有するNeu2ならびにトラスツズマブ由来のscFvを含むLobster ASC(ヌクレオチド配列配列番号:99によりコードされるアミノ酸配列配列番号:74を有する第1および第2のポリペプチド鎖を含み、この実施例において「Lobster 2」と称される)。ASCは実施例7に記載されるように作製した。
ヒトHer2を発現するマウス乳癌細胞株(EMT6-hHer2細胞)を注射したマウス同系腫瘍モデルにおいてこれらのASCをトラスツズマブと比較した。雌BALB/cマウス、6〜8週齢に、腫瘍進展のために、0.1mlのPBS中のEMT6-Her2腫瘍細胞(5x105)を右下側腹部領域に、皮下で接種した。腫瘍が50〜100mm3、平均約75〜100mm3に達した際に、マウスを無作為に、各5匹の動物の4群に振り分けた。
10mg/kgのヒトLobster 1、ヒトLobster 2またはトラスツズマブのいずれかの腹腔内注射によりマウスを処置し、腫瘍体積(mm3)を記録した。図27A〜Dは、示される処置についての個々のマウスについての平均腫瘍体積を示す。完全応答(CR、試験中の任意の時点での触診の限界未満の後退として定義される)を示す。トラスツズマブおよびビヒクル対照はCRがないことを示した。対照的に、ヒトLobster 1およびヒトLobster 2の両方は、ビヒクルと比較して腫瘍増殖の低減を示し、両方の群において5匹中1匹のマウスがCRを示した。この実施例は、ヒトシアリダーゼに基づくASCがインビボ腫瘍モデルにおいて有効性を示すことを示す。
参照による援用
本明細書で言及される特許文献および科学論文のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実現され得る。そのため、前述の態様は、全ての局面において本明細書に記載される発明の限定ではなく、例示としてみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の同等物の意味および範囲内にある全ての変更が本発明に包含されることが意図される。
配列表
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Claims (89)

  1. 組換え変異体ヒトシアリダーゼ酵素であって、シアリダーゼが、N末端およびC末端を含み、かつ：
    (a) 少なくとも1つの野生型システイン残基の置換；
    (b) 少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加し、および/またはシアリダーゼの疎水性を減少する；
    (c) シアリダーゼのN末端でN末端アミノ酸と共有結合する少なくとも2アミノ酸残基長のペプチド；
    (d) 少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのN末端およびC末端の間で疎水性相互作用および/または水素結合を増加する；および/または
    (e) シアリダーゼのN末端でのN末端メチオニンの置換もしくは欠失
    を含む、酵素。
  2. 組換え変異体ヒトシアリダーゼ酵素であって、シアリダーゼが、N末端およびC末端を含み、かつ：
    (a) 少なくとも1つの野生型システイン残基の置換;
    (b) 少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加しおよび/またはシアリダーゼの疎水性を低減する；
    (c) シアリダーゼのN末端でN末端アミノ酸と共有結合する少なくとも2アミノ酸残基長のペプチド；および/または
    (d) 少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換、ここで該置換は、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのN末端およびC末端の間で、疎水性相互作用および/または水素結合を増加する、
    を含む、酵素。
  3. Neu1、Neu2、Neu3およびNeu4から選択される、請求項１または２記載のシアリダーゼ。
  4. Neu2である、請求項３記載のシアリダーゼ。
  5. システイン残基の置換を含む、請求項１〜４いずれか記載のシアリダーゼ
  6. システイン残基が遊離システイン残基である、請求項５記載のシアリダーゼ。
  7. システイン残基が、セリン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、ロイシンまたはアラニンにより置換される、請求項５または６記載のシアリダーゼ。
  8. 野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の332位に対応する位置でシステイン残基の置換を含む、請求項５〜７いずれか記載のシアリダーゼ。
  9. 野生型ヒトNeu2の332位に対応する位置で、システイン残基がアラニンにより置換される(C332A)、請求項８記載のシアリダーゼ。
  10. 野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の352位に対応する位置でシステイン残基の置換を含む、請求項５〜９いずれか記載のシアリダーゼ。
  11. 野生型ヒトNeu2の352位に対応する位置で、システイン残基がロイシンにより置換される(C352L)、請求項１０記載のシアリダーゼ。
  12. C332AおよびC352L置換を含む、請求項９または１１記載のシアリダーゼ。
  13. シアリダーゼが少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換を含み、該置換が、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加しおよび/またはシアリダーゼの疎水性を減少する、請求項１〜１２いずれか記載のシアリダーゼ。
  14. シアリダーゼが野生型アミノ酸残基の置換を含み、該置換が、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの等電点(pI)を増加する、請求項１３記載のシアリダーゼ。
  15. シアリダーゼが野生型アミノ酸残基の置換を含み、該置換が、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼの疎水性を減少する、請求項１３または１４記載のシアリダーゼ。
  16. 野生型アミノ酸残基が、溶媒接近可能なアミノ酸残基である、請求項１３〜１５いずれか記載のシアリダーゼ。
  17. 野生型アミノ酸が、リジン、アルギニンまたはヒスチジンにより置換される、請求項１３〜１６いずれか記載のシアリダーゼ。
  18. 野生型アミノ酸がリジンにより置換される、請求項１７記載のシアリダーゼ。
  19. 野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の2位に対応する位置でアラニン残基の置換を含む、請求項１３〜１８いずれか記載のシアリダーゼ。
  20. 野生型ヒトNeu2の2位に対応する位置でアラニン残基がリジンにより置換される(A2K)、請求項１９記載のシアリダーゼ。
  21. シアリダーゼのN末端に融合される少なくとも2アミノ酸残基長のペプチドを含む、請求項１〜２０記載のシアリダーゼ。
  22. ペプチドが、シアリダーゼのN末端アミノ酸残基に融合される、請求項２１記載のシアリダーゼ。
  23. ペプチドが、2アミノ酸残基長〜20アミノ酸残基長である、請求項２１または２２記載のシアリダーゼ。
  24. ペプチドが、少なくとも5アミノ酸残基長である、請求項２１〜２３いずれか記載のシアリダーゼ。
  25. ペプチドが、野生型マウス胸腺Neu2由来のアミノ酸配列(配列番号:2)を含む、請求項２１〜２４いずれか記載のシアリダーゼ。
  26. ペプチドが、EDLRP(配列番号:3)を含む、請求項２１〜２５いずれか記載のシアリダーゼ。
  27. ペプチドが、MEDLRP(配列番号:4)を含む、請求項２１〜２６いずれか記載のシアリダーゼ。
  28. シアリダーゼが、少なくとも1つの野生型アミノ酸残基の置換を含み、該置換が、置換を有さないシアリダーゼに対して、シアリダーゼのN末端およびC末端の間の疎水性相互作用および/または水素結合を増加する、請求項１〜２７いずれか記載のシアリダーゼ。
  29. 野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の6位に対応する位置でバリン残基の置換を含む、請求項２８記載のシアリダーゼ。
  30. 野生型ヒトNeu2の6位に対応する位置のバリン残基がチロシンにより置換される(V6Y)、請求項２９記載のシアリダーゼ。
  31. シアリダーゼのN末端で、N末端メチオニンの置換または欠失を含む、請求項１〜３０いずれか記載のシアリダーゼ。
  32. 野生型ヒトNeu2(配列番号:1)の1位に対応する位置でメチオニン残基の置換を含む、請求項３１記載のシアリダーゼ。
  33. 野生型ヒトNeu2の1位に対応する位置でのメチオニン残基が、アラニンにより置換される(M1A)、請求項３２記載のシアリダーゼ。
  34. 野生型ヒトNeu2の1位に対応する位置でのメチオニン残基が、アスパラギン酸により置換される(M1D)、請求項３２記載のシアリダーゼ。
  35. 対応する野生型シアリダーゼとは異なる基質特異性を有する、請求項１〜３４いずれか記載のシアリダーゼ。
  36. α2,3、α2,6および/またはα2,8連結を切断し得る、請求項３５記載のシアリダーゼ。
  37. α2,3およびα2,8連結を切断し得る、請求項３６記載のシアリダーゼ。
  38. 配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72または配列番号:73を含む、請求項１〜３７いずれか記載のシアリダーゼ。
  39. 配列番号:5、配列番号:6、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38または配列番号:39を含む、請求項１〜３７いずれか記載のシアリダーゼ。
  40. 配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72または配列番号:73を含む、請求項１〜３７いずれか記載のシアリダーゼ。
  41. 配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38または配列番号:39を含む、請求項１〜３７いずれか記載のシアリダーゼ。
  42. 配列番号:5または配列番号:6を含む、請求項１〜３７いずれか記載のシアリダーゼ。
  43. 表2、3、4、5、6または7のいずれか1つに記載されるシアリダーゼを含む、変異体シアリダーゼ酵素。
  44. (a) シアリダーゼ酵素；ならびに
    (b) 免疫グロブリンFcドメインおよび/または免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む、融合タンパク質であって、
    シアリダーゼならびに免疫グロブリンFcドメインおよび/または免疫グロブリン抗原結合ドメインが、ペプチド結合またはアミノ酸リンカーにより連結される、融合タンパク質。
  45. シアリダーゼがヒトシアリダーゼである、請求項４４記載の融合タンパク質。
  46. シアリダーゼが、請求項１〜４３いずれか記載の組換え変異体ヒトシアリダーゼである、請求項４４または４５記載の融合タンパク質。
  47. 免疫グロブリンFcドメインを含む、請求項４４〜４６いずれか記載の融合タンパク質。
  48. 免疫グロブリンFcドメインが、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgMのFcドメインに由来する、請求項４７記載の融合タンパク質。
  49. 免疫グロブリンFcドメインが、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のFcドメインに由来する、請求項４８記載の融合タンパク質。
  50. 免疫グロブリンFcドメインが、ヒトIgG1 Fcドメインに由来する、請求項４９記載の融合タンパク質。
  51. 免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む、請求項４４〜５０いずれか記載の融合タンパク質。
  52. 免疫グロブリン抗原結合ドメインが、第2の免疫グロブリン抗原結合ドメインに結合されて、抗原結合部位を生じる、請求項５１記載の融合タンパク質。
  53. 免疫グロブリン抗原結合ドメインが、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブおよびリツキシマブから選択される抗体に由来する、請求項５１または５２記載の融合タンパク質。
  54. 免疫グロブリン抗原結合ドメインがトラスツズマブに由来する、請求項５３記載の融合タンパク質。
  55. 配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:63、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78または配列番号:79を含む、請求項４４〜５４いずれか記載の融合タンパク質。
  56. 配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53または配列番号:54を含む、請求項４４〜５４いずれか記載の融合タンパク質。
  57. 請求項４４〜５６いずれか記載の融合タンパク質を含む、抗体コンジュゲート。
  58. 単一のシアリダーゼを含む、請求項５７記載の抗体コンジュゲート。
  59. 2つのシアリダーゼを含む、請求項５８記載の抗体コンジュゲート。
  60. 2つのシアリダーゼが同一である、請求項５９記載の抗体コンジュゲート。
  61. 単一の抗原結合部位を含む、請求項５７〜６０いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  62. 2つの抗原結合部位を含む、請求項５７〜６１いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  63. 2つの抗原結合部位が同一である、請求項６２記載の抗体コンジュゲート。
  64. 約135kDa〜約165kDaの分子量を有する、請求項５７〜６３いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  65. 約215kDa〜約245kDaの分子量を有する、請求項５７〜６３いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  66. 抗体コンジュゲートが、
    (a) 免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；
    (b) 免疫グロブリン重鎖を含む第2のポリペプチド；ならびに
    (c) 免疫グロブリンFcドメインおよびシアリダーゼを含む第3のポリペプチド
    を含み、
    第1および第2のポリペプチドが一緒になって共有結合し、第2および第3のポリペプチドが一緒になって結合し、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが一緒になって抗原結合部位を画定する、請求項５７〜６５いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  67. 第3のポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、シアリダーゼおよび免疫グロブリンFcドメインを含む、請求項６６記載の抗体コンジュゲート。
  68. 第1のポリペプチドが配列番号:49を含む、請求項６６または６７記載の抗体コンジュゲート。
  69. 第2のポリペプチドが配列番号:50を含む、請求項６６〜６８いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  70. 第3のポリペプチドが、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78または配列番号:79を含む、請求項６６〜６９いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  71. 第3のポリペプチドが、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53または配列番号:54を含む、請求項６６〜６９いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  72. 融合タンパク質が：
    (a) 第1の免疫グロブリン軽鎖を含む第1のポリペプチド；
    (b) 第1の免疫グロブリン重鎖および第1のシアリダーゼを含む第2のポリペプチド；
    (c) 第2の免疫グロブリン重鎖および第2のシアリダーゼを含む第3のポリペプチド；ならびに
    (d) 第2の免疫グロブリン軽鎖を含む第4のポリペプチド
    を含み、
    第1および第2のポリペプチドが一緒になって共有結合し、第3および第4のポリペプチドが一緒になって共有結合し、第2および第3のポリペプチドが一緒になって共有結合し、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが一緒になって第1の抗原結合部位を画定し、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドが一緒になって第2の抗原結合部位を画定する、請求項５７〜６５いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  73. 第2および第3のポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1および第2の免疫グロブリン重鎖ならびに第1および第2のシアリダーゼのそれぞれを含む、請求項７２記載の抗体コンジュゲート。
  74. 融合タンパク質が：
    (a) 第1のシアリダーゼ、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1の一本鎖可変断片(scFv)を含む第1のポリペプチド；ならびに
    (b) 第2のシアリダーゼ、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび第2の一本鎖可変断片(scFv)を含む第2のポリペプチド
    を含み、
    第1および第2のポリペプチドが一緒になって共有結合し、第1のscFvが第1の抗原結合部位を画定し、第2のscFvが第2の抗原結合部位を画定する、
    請求項５７〜６５いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  75. 第1のポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシアリダーゼ、第1の免疫グロブリンFcドメインおよび第1のscFvを含み、第2のポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第2のシアリダーゼ、第2の免疫グロブリンFcドメインおよび第2のscFvを含む、請求項７４記載の抗体コンジュゲート。
  76. 第1のポリペプチドが、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74または配列番号:75を含む、請求項７４または７５記載の抗体コンジュゲート。
  77. 第1のポリペプチドが、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47または配列番号:48を含む、請求項７４または７５記載の抗体コンジュゲート。
  78. 第2のポリペプチドが、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:74または配列番号:75を含む、請求項７４〜７７いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  79. 第2のポリペプチドが、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47または配列番号:48を含む、請求項７４〜７７いずれか記載の抗体コンジュゲート。
  80. 請求項１〜４３いずれか記載の組換え変異体ヒトシアリダーゼ、請求項４４〜５６いずれか記載の融合タンパク質、または請求項５７〜７９いずれか記載の抗体コンジュゲートの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  81. 請求項８０記載の核酸を含む発現ベクター。
  82. 請求項８１記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  83. 請求項１〜４３いずれか記載の組換え変異体ヒトシアリダーゼ、請求項４４〜５６いずれか記載の融合タンパク質、または請求項５７〜７９いずれか記載の抗体コンジュゲートを含む、医薬組成物。
  84. 癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法であって、該方法が、該被験体に、請求項１〜４３いずれか記載の組換え変異体ヒトシアリダーゼ、請求項４４〜５６いずれか記載の融合タンパク質、請求項５７〜７９いずれか記載の抗体コンジュゲート、または請求項８３記載の医薬組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
  85. 癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法であって、該方法が、該被験体に、請求項４４〜５６いずれか記載の融合タンパク質、請求項５７〜７９いずれか記載の抗体コンジュゲート、または請求項８３記載の医薬組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
  86. 癌が上皮癌である、請求項８５記載の方法。
  87. 上皮癌が、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、ファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌および肝臓癌から選択される、請求項８６記載の方法。
  88. 細胞または組織においてHLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2またはIL-6の発現を増加する方法であって、該方法が、該細胞または組織と、請求項１〜４３いずれか記載の組換え変異体ヒトシアリダーゼ、請求項４４〜５６いずれか記載の融合タンパク質、請求項５７〜７９いずれか記載の抗体コンジュゲート、または請求項８３記載の医薬組成物の有効量を接触させる工程を含む、方法。
  89. 細胞が、樹状細胞および末梢血単核細胞(PBMC)から選択される、請求項８８記載の方法。
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