CN102861325A

CN102861325A - 减少细菌携带和中枢神经***侵害的组合物及其使用方法

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Publication number: CN102861325A
Application number: CN2012102907654A
Authority: CN
Inventors: F·W·范金克尔; D·E·布里利斯; J·M·瓦特
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2013-01-09
Also published as: WO2005046721A3; CA2545325A1; US9132179B2; CA2545325C; WO2005046721A2; JP2011160812A; AU2004289295B2; US20070286866A1; KR20110110825A; KR20060126966A; EP1694359A2; IL175499A; IL175499A0; KR101289649B1; AU2004289295A1; BRPI0416376A; CN1909921A; JP2007512006A; ZA200604754B; CN1909921B

Abstract

本发明提供一种用于减少或防止细菌感染(如肺炎球菌感染)、鼻携带、鼻建群和中枢神经***侵害的组合物。提供的组合物包括肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或者神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质的抗原性部分。任选地，该组合物可包括肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或其中任意一个的抗原性部分的任意组合。任选地，该试剂是去毒性的。还提供制备和使用在此公开的组合物的方法。具体提供在受试者中产生抗体的方法，包括给予受试者在此教导的试剂或组合物。还提供了减少或防止受试者中鼻携带或肺炎球菌感染的方法，包括给予受试者在此教导的组合物。

Description

减少细菌携带和中枢神经***侵害的组合物及其使用方法

本申请是申请日为2004年11月10日，申请号为200480040200.4，发明名称为“减少细菌携带和中枢神经***侵害的组合物及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2003年11月10日提交的美国临时申请No.60/518,799的权益，因此其全部内容作为参考文献在此处纳入本文。

致谢

本发明由国家健康学会的DC 04976、AI 21548及P30 DK 54781号资助和国家过敏和传染病学会的NO1 AI 65299号合约的政府支持下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种存在相当广泛的人类病原体，它可感染包括肺部、中枢神经***(CNS)、中耳和鼻道在内的一些器官。这些组织的感染导致诸如支气管炎、肺炎、脑膜炎和鼻窦感染之类的各种症状。肺炎链球菌是人类细菌性脑膜炎的一个主要病因，即使经抗生素治疗仍具有相当高的死亡率和发病率。Quagliarello et al.，(1992)N.Eng.J.Med.327：869-872。肺炎链球菌脑膜炎可引起永久性的神经性后遗症。肺炎链球菌脑膜炎在发达国家和发展中国家中的发病率分别为每10万人1-2和20。Anon，(2000)CDSC European Bacterial Meningitis Surveillance Project。在美国肺炎球菌脑膜炎的致死率大约是18％。Fedson et al.，(1994)Arch.Intern.Med.154：2531-2535。肺炎球菌脑膜炎的最高发病率发生于1-4岁的儿童(占所有细菌性脑膜炎的30％)，然后是15-19岁(14％)和1-11月大的婴儿(13％)。Anon，(2000)CDSC European Bacterial Meningitis Surveillance Project。在发达国家和发展中国家中的老年人也受到链球菌脑膜炎的严重侵袭。Butler et al.，(1999)Drugs Aging 15(Suppl.1)：11-19；Fedson et al.，(1999)Vaccine 17Suppl.1：S11-18。

世界上主要的肺炎球菌病原体库存在于人的鼻携带物。通常从携带者处获得感染并且鼻携带总是在感染之前。鼻咽建群(colonization of the nasopharynx)被认为是肺炎球菌蔓延到下呼吸道、鼻窦和中耳的必要条件。因此，任何防止携带的医疗干预不仅会消除受治个体的患病风险，还可产生群体免疫甚至还能大大降低群体中未治疗成员的感染风险。虽然肺炎链球菌是一种重要的人类病原体，但是人们对肺炎链球菌造成鼻携带或脑膜炎的机理却知之甚少。

一些现有资料显示神经氨酸酶是鼻道的独特致病因子。一个这样的观测来自对NanA缺陷型肺炎链球菌菌株D39的研究，该菌株比其亲本菌株更快地从鼻咽中被消除。Tong et al.，(2002)Infect.Immun.68：921-924。神经氨酸酶切割在宿主细胞表面和体液中的多种糖脂、糖蛋白和寡聚糖的末端唾液酸残基。肺炎球菌脑膜炎患者脑脊液(CSF)中游离唾液酸水平的提高与预后不良相关。O′Toole et al.，(1971)J.Clin.Invest.50：979-985。两个独立的研究发现每个新的临床上的肺炎链球菌分离株都具有神经氨酸酶活性，这进一步说明了这种酶对肺炎链球菌致人生病的重要性。O′Toole et al.，(1971)J.Clin.Invest.50：979-985；Kelly et al.，J.Bacteriol.94：272-273。而且，小鼠传代经常提高肺炎球菌分离株的致病性，它已被报道也会导致神经氨酸酶活性的2-5倍的提高。Vishniakova et al.，(1992)Zhurnal Mikrobiologii，Epidemiologii i Immunobiologii 9-10：26-9。肺炎球菌C-多糖，亦被称为磷壁酸，其结构上与亦被称为脂磷壁酸质的肺炎球菌F-抗原的多糖部分相同。Fischer et al.，(1993)Eur.J.Biochem 215：851-857。这些分子是肺炎链球菌区别于其它革兰氏阳性菌的独特特征。这些分子上的免疫显性决定子是磷酸胆碱(PC)残基，PC的抗体对于腹膜内、静脉内和鼻部的肺炎球菌的攻击有保护作用。Briles et al.，(1984)Eur.J.Immunol.14：1027-1030；Briles et al.，(1981)Nature 294：88-90；Yother et al.，(1982)Infect.Immun.36：184-188；Briles et al.，(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1：305-309。然而，虽然所有这些研究都评估了含药血清对全身感染的保护作用，却没有关于这些抗体对鼻建群的保护作用的可用信息。然而，表面磷酸胆碱残基通常位于呼吸器官细菌的表面。Lysenko，et al.，(2000)Infect.Immun.68：1664-71。

肺炎链球菌引起鼻携带和后续疾病的机理还相对未知。迄今为止还没有研究已经确定了减少或防止鼻携带的机理。由于鼻咽建群被认为是肺炎球菌全身性蔓延到下呼吸道、鼻窦乃至到脑的必要条件，所以本领域需要一种在初始的肺炎球菌建群位置提供粘膜免疫的手段。防止鼻咽中初始的肺炎球菌建群将防止鼻携带并减少肺炎链球菌在个体之间的传播。而且，在鼻咽部的粘膜表面提供免疫能防止或减少由肺炎链球菌引起的后续疾病。

发明内容

在此提供用于减少或防止细菌感染(例如肺炎球菌感染)、鼻携带、鼻建群和中枢神经***侵害的组合物。任选地，该组合物被设计为用于粘膜给药。在此提供去毒的肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质，或这些中任意一个的抗原性部分和包括这些去毒试剂的组合物。

还提供组合物，它包括肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或这些中任意一个的抗原性部分和可药用的载体。任选地，该组合物可包括肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或这些中任意一个的抗原性部分的任意组合。还提供了去毒的肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质，或这些中任意一个的抗原性部分和包括这些去毒试剂的组合物以及使用该试剂的方法。

还提供了在受试者体内产生针对肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质，或肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸质的任意一个的抗原性部分的抗体的方法，包括给予受试者包括试剂的组合物。任选地，该组合物适用于给药至粘膜表面或全身给药。

进一步提供了包括针对肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或这些中任意一个的抗原性部分的抗体和可药用的载体的组合物。任选地，该组合物适用于给药至粘膜表面或全身给药。

进一步提供了在受试者体内减少或防止鼻携带、鼻建群或细菌感染(例如肺炎球菌感染)的方法，包括将在此教导的组合物与受试者的鼻粘膜相接触。

另外的优点一部分将在随后的描述中阐明，还有部分可从描述中显而易见，或者从下述的各方面实践中知道。下述的优点将通过所附的权利要求中具体指出的要素和组合的方式实现和获得。应当理解前述的一般性描述和随后的细节描述仅仅是示例性和解释性的，而非限制性的。

附图说明

纳入说明书中并作为说明书一部分的附图解释了下述的一些方面。

图1显示了将3×10⁶CFU的肺炎球菌的未包膜的R36A菌株或致病性的EF3030菌株经鼻给予xid小鼠。鼻部攻击后1和4天，采集神经组织ON/E、OB、脑和淋巴组织(NALT，CLN和肺)，搅碎并对活肺炎球菌的存在进行分析。示出了log₁₀菌落形成单位(CFU)的平均值+一个标准误差(SE)。Y轴上的0值表示没有可检出的CFU。示出的是每组5只小鼠的平均CFU+SE，代表了三组不同的实验。

图2显示了肺炎链球菌EF3030菌株在鼻部攻击后的CFU器官分布动力学。在第4、11、18、25和39天采集了ON/E、OB、脑、血、NW、NALT、CLN和肺组织并分析肺炎链球菌的存在。3×10⁶CFU的肺炎链球菌的等分试样导致了鼻道建群和随后的OB感染。Y轴上的0值表示没有可检出的CFU。示出的是三个单独实验的平均CFU+SE。除39天的时间点代表5只小鼠之外，每个时间点代表10只小鼠。

图3显示了在与GLS预培养之后肺炎链球菌菌株EF3030的分布。在鼻部使用之前用20μg的无唾液酸基的GM1(a-GMl)或125μg的混合GLS(MG)培养肺炎链球菌的等分试样(3×10⁷CFU)30分钟。在四天之后采集ON/E、OB、脑和NW、NALT和肺，并对肺炎链球菌的数量进行分析。Y轴上的0值表示没有可检出的CFU。示出的是5只小鼠的平均值+一个SE，在统计分析后获得P值。该数据表示两个单独的实验。

图4显示了在鼻部攻击后OB中肺炎链球菌的TIGR4菌株的检测。5×10⁵CFU的等分试样由鼻部和血液给样，攻击后一周分析NW、ON/E、OB和脑组织的建群(分图A和B)。还用PCR分析了这些组织(10μg DNA)中肺炎球菌溶血素基因的存在(分图C)。另外，还用PspA特异性抗体的免疫荧光法观察了对照组(D)或受肺炎链球菌攻击的小鼠的OB肺炎链球菌(分图E和F)。示出的是平均值+一个SE。该数据表示三个单独的实验。

图5显示了分泌型NanA、TIGR4和R6(2型)的基序比较，后者具有用于附着细胞壁的LPXTG(SEQ ID NO：14)基序。TIGR4基因包括一个在编码LPETG(SEQ ID NO：13)基序序列之前的终止密码子。NanA没有这个基序，经由TIGR4分泌到环境中。

图6A显示了在被肺炎链球菌亲代菌株TIGR4(■)或NanA等基因(isogenic)突变体TIGR4/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的鼻洗出物中活性肺炎球菌的动力学。每个点表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液中的细菌总数。与用TIGR4接种的小鼠比较，＊为P＜0.05；＊＊为P＜0.01；＊＊＊为P＜0.005。

图6B显示了被肺炎链球菌亲代菌株TIGR4(■)或NanA等基因突变体TIGR4/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的鼻建群动力学。每个点表示了每只小鼠的每克组织中的细菌总数。与用TIGR4接种的小鼠比较，＊为P＜0.05；＊＊为P＜0.01；＊＊＊为P＜0.005。

图6C显示了被肺炎链球菌亲代菌株TIGR4(■)或TIGR4/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的嗅球中CFU的动力学。每个点表示了每只小鼠的每克组织中的细菌总数。与用TIGR4接种的小鼠比较，＊为P＜0.05；＊＊为P＜0.01；＊＊＊为P＜0.005。

图7A显示了在被肺炎链球菌亲代菌株EF3030(■)或EF3030/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的鼻建群动力学。每个点表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液中的细菌总数。与用EF3030接种的小鼠比较，＊为P＜0.05；＊＊为P＜0.01；＊＊＊为P＜0.005。

图7B显示了在被肺炎链球菌亲代菌株EF3030(■)或EF3030/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的鼻建群动力学。每个点表示了每只小鼠的每克组织中的细菌总数。与用EF3030接种的小鼠比较，＊为P＜0.05；＊＊为P＜0.01；＊＊＊为P＜0.005。

图7C显示了在被肺炎链球菌亲代菌株EF3030(■)或NanA等基因突变体EF3030/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的鼻建群动力学。每个点表示了每只小鼠的每克组织中的细菌总数。与用EF3030接种的小鼠比较，＊为P＜0.05；＊＊为P＜0.01；＊＊＊为P＜0.005。当集合了全部时间点的野生型和突变型的数据时，EF3030和EF3030NanB-的比较是P＝0.001。

图8显示了在被肺炎链球菌亲代菌株TIGR4(■)或TIGR4/nanB-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠在接种4天后的鼻建群动力学。每个点表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液或每克组织中的细菌总数。每组中的TIGR4和TIGR4/nanB-之间均没有统计学上的显著性差异。

图9显示了在被肺炎链球菌亲代菌株TIGR4(■)或TIGR4/nanA-(○)或TIGR4/AB-鼻内感染的CBA/N小鼠在接种4天后的鼻建群动力学。每个点表示了每只小鼠的每毫升鼻洗出液或每克组织中的细菌总数。每组中的TIGR4/nanA-和双突变体TIGR4/nanAB-之间均没有统计学上的显著性差异。

图10显示了在鼻攻击之后抗磷酸胆碱的特异性单克隆抗体对肺炎链球菌鼻建群的抑制。在鼻攻击之后抗磷酸胆碱的特异性单克隆抗体对肺炎链球菌鼻建群的抑制。总共1×10⁶CFU的TIGR4菌株与5μg的IgG3亚类或IgM同种型的抗磷酸胆碱单抗共培养。每只鼻孔的总给药量为5μl。示出的是分别在使用后9和12小时时500μl鼻洗出液中的CFU。示出的是每组5只小鼠的平均值+SD。

具体实施方式

在本化合物、组合物、物品、装置和/或方法公开和描述之前，应当理解下述各方面并不限于特定的合成方法或特定的给药方法，因为它们理所当然地可有多种变化。还应理解在此使用的术语仅是出于描述具体方面的目的而非意在限制。

必须指出，除非上下文中明确指出，否则在说明书和所附的权利要求中使用的单数形式“一”“一个”和“该”包括复数指代物。因而例如提及“一种抗原片段”包括抗原片段的混合物，提及“一种药用载体”或“佐剂”包括两种或更多这样的载体或佐剂的混合物，等等。

正如通篇所使用的，“受试者”意为一个个体。因而，“受试者”可以包括驯养的动物，如猫、狗等，家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)，实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。一方面，受试者为例如灵长类动物或人的哺乳动物。

“任选的”或“任选地”意为后来描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括该事件或情况发生和不发生的实例。例如，短语“任选地该组合物可以包括一个组合”意为该组合物可以包括不同分子的组合或可以不包括组合，以致于该描述包括存在该组合和缺少该组合(即组合的单个成员)。

范围在这里被表述为从“大约”一个具体的值，和/或到“大约”另一个具体的值。当表述这样一个范围时，另一方面包括从一个具体的值和/或到另一个具体的值。类似地，当值通过前面冠以“大约”被表述为近似值时，它应被理解为该具体值形成了另一方面。应进一步理解每一个范围的端点在相关和独立于另一个端点时都是有意义的。

在此提供用于减少或防止细菌感染(例如肺炎球菌感染)、鼻携带、鼻建群和中枢神经***侵害的组合物和方法。肺炎链球菌在鼻道内建群，部分是通过C-多糖-神经节苷脂相互作用穿过上皮细胞屏障，再通过内吞作用进入上皮细胞。C-多糖通过结合神经节苷脂的末端或内部的GalNAcβ1-4Gal序列来结合无唾液酸基GM1、无唾液酸基GM2和岩藻糖基无唾液酸基GM1。虽然无唾液酸神经节苷脂在细胞质膜中含量在正常情况下较低，但在人肺部的肺炎链球菌有两种神经氨酸酶NanA和NanB时例外(Berry et al.，(1996)J.Bacteriol.178：4854-4860)，NanA和NanB可以各自切割N-乙酰神经氨酸的α2，3-和α2，6-键生成半乳糖，及α2，6-键生成N-乙酰半乳糖胺。Scanlon et al.，(1989)Enzyme 41：143-150。神经节苷脂的唾液酸残基以α2，3连接半乳糖。肺炎链球菌的神经氨酸酶去除存在于所有单唾液酸神经节苷脂的尾端唾液酸残基和可见于双-和三唾液酸神经节苷脂中的半乳糖连接的多个唾液酸残基。因此，他们可以暴露发现于最常见的哺乳动物细胞表面的神经节苷脂中的GalNAcβ1-4Gal序列。这些残基是推测的细胞表面的C-多糖结合位点。肺炎链球菌通过使用通常较多与细胞壁相连的NanA和被认为是分泌型的NanB，产生它自己在呼吸道上皮细胞上的附着位点。这样肺炎球菌C-多糖结合无唾液酸神经节苷脂，特别是无唾液酸GM1，和可将大量GM1转化为无唾液酸GM1的神经氨酸酶，可以在ON/E上产生大量的C-多糖结合位点。这种机制为鼻携带提供了便利并使肺炎链球菌可通过鼻嗅觉神经和覆盖鼻甲(ON/E)和嗅球(OB)的上皮组织进入CNS。类似地，中耳炎和其他包括肺炎链球菌的感染也可以类似地通过支配中耳的神经得以进入CNS。除肺炎链球菌以外的其他细菌也有类似的神经氨酸酶，因此同样的机制也发生于其他细菌。因此在此公开的组合物和方法是靶向于多种细菌的这种机制的。在此教导的试剂、组合物和方法涉及阻断这种机制从而减少携带和防止CNS侵害。

任选地，该组合物被设计为用于粘膜给药。例如，在此提供一种组合物，包括肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或这些中任意一个的抗原性部分和可药用的载体，其中的组合物适用于粘膜表面给药。任选地，该组合物可以包括肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质或这些中任意一个的抗原性部分的任意组合。

任选地，组合物的形式是气雾剂、鼻腔雾剂、鼻腔喷剂(nasal spray)、滴鼻剂、喷雾溶液(nebulizer solution)、气雾吸入剂(aerosol inhalant)、栓剂或任何适于粘膜给药的形式(包括口服给药)。任选地，该组合物可存在于用于给药的微球或脂质体中。“给药至粘膜表面”意为给药至包括呼吸***、消化***或泌尿生殖***的任何粘膜表面。粘膜表面的实例包括但不限于鼻腔(属于嗅觉神经上皮)、鼻咽、直肠、***、喉部、口部、咽鼓管、气管、支气管和其他气道以及肠粘膜。

粘膜佐剂可用于粘膜表面给药。该佐剂的给药可伴随本发明的组合物一起、刚刚先于或后于组合物的给药。任选地，该组合物进一步包括佐剂。粘膜佐剂的组成包括例如靶向粘膜诱导位点的试剂。该佐剂可任选地从包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、血管生成因子、细胞凋亡抑制素或它们的组合中选择。当选择细胞因子作为佐剂时，该细胞因子可以从包括但不限于白介素(包括IL-1、IL-lγ、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15和EL-18)；转化生长因子-β(TGF-β)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素-γ(IFN-γ)或其他有佐剂活性的细胞因子中选择。有佐剂活性或其他生物活性的细胞因子的片段或突变体或模拟的细胞因子(或它们的组合)也可以被用于本发明的组合物和方法。

当选择趋化因子作为佐剂时，该趋化因子可以任选地从包括但不限于淋巴细胞趋化因子、RANTES、LARC、PARC、MDC、TARC、SLC和FKN中选择。当选择细胞凋亡抑制素作为佐剂时，该细胞凋亡抑制素可以任选地从包括但不限于半胱天冬酶-8的抑制素和它们的组合中选择。当选择血管生成因子作为佐剂时，该血管生成因子可以任选地从包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、透明质烷(HA)片段和它们的组合中选择。事实上，可选择正型(+)和负型(-)血管生成因子作为佐剂。

本发明的基本上无毒的生物活性粘膜佐剂的其他实例包括激素、酶、生长因子或它们的生物活性部分。这样的激素、酶、生长因子或它们的生物活性部分可以来源于人、牛、猪、羊、犬、猫、马或鸟类，例如，可为肿瘤坏死因子(TNF)、催乳素、表皮生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、***(IGF-1)、促生长素(生长激素)或胰岛素，或其受体在免疫***细胞上表达的任何其他激素或生长因子。

粘膜给药的佐剂也包括细菌毒素，例如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌(E.coli)不耐热毒素(LT)、艰难梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)，或它们的组合、亚基、类毒素、嵌合体或突变体。例如，可使用天然霍乱毒素亚基B(CTB)的纯化制品。这些毒素中任一个的片段、同系物、衍生物和融合体，只要还保持佐剂活性，也是适用的。优选地，使用一个降低毒性的突变体。合适的突变体在例如WO 95/1721l(Arg-7-Lys CT突变体)、WO 96/6627(Arg-192-Gly LT突变体)和WO 95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体)中有所描述。另外可用于本发明的方法和组合物的LT突变体包括例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。其他的佐剂例如RH-3配体；CpG基序寡核苷酸；例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的细菌单磷酸类脂A(MPLA)；皂甙(例如QS21)或聚乳酸乙醇酸交酯(PLGA)微球也可以被用于粘膜给药。可能的其他粘膜佐剂有防御素和包括CpG基序的寡核苷酸。

正如通篇所使用的，“可药用的载体”意为一种生物学或其他方面没有不良效果的材料，即该材料可与所选化合物一起给药至个体而不会产生任何不良生物学效果或与包括该材料的药物组合物的任何其它成分以有害的方式相互作用。

任何在此描述的组合物都可以与一种可药用的载体一起在治疗上使用。在此描述的化合物可以方便地配制成由一种或多种化合物以及可药用载体组成的组合物。见于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，latest edition，by E.W.Martin Mack Pub.Co.，Easton，PA，它公开了制备药物组合物的典型载体和常规方法，这些载体和方法也可用于制备本文所述的化合物制剂，其全部内容作为参考文献在此处纳入本文。最典型情况下，它们是将组合物给药至人体的标准载体。一方面，人类和非人类，包括例如无菌水、盐溶液、生理pH的缓冲溶液的溶液。其他化合物可以按照本领域技术人员使用的标准程序给药。

在此描述的药物组合物除选择的分子之外可包括但不限于载体、增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂等等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分例如抗菌试剂、抗炎试剂、麻醉剂等等。

肺炎球菌神经氨酸酶意为肺炎球菌中发现的任何神经氨酸酶分子，表1示出了几个菌种的神经氨酸酶的序列比对。神经氨酸酶分子还包括例如SP1326。SP1326的氨基酸序列可以通过GenBank登记号No.AAK75424得到。Tettelin，H.，et al.，(2001)Science 293：498-506。由GenBank登记号No.AAK75424提供的包括SP1326的任何氨基酸序列和核酸序列的全部信息完整地作为参考文献在此处纳入本文。正如通篇所定义的，所有氨基酸序列的氨基酸残基根据表1所示的肺炎球菌R6菌株的氨基酸序列进行编号。

表1

ClustalW(v1.4)多序列比对

比对了3个序列比对得分＝6332

***空位＝32保守性相同(Conserved Identities)＝105

配对比对方式：慢

配对比对参数：

开放空位罚分(Open Gap Penalty)＝10.0扩展空位罚分(Extend Gap Penalty)＝0.1

相似性矩阵(Similarity Matrix)：blosum

多序列比对参数：

开放空位罚分(Open Gap Penalty)＝10.0 扩展空位罚分(Extend Gap Penalty)＝0.1

延迟差异(Delay Divergent)＝40％空位距离＝8

相似性矩阵(Similarity Matrix)：blosum

处理时间：3.5秒

R6 NanA 1MSYFRNRDIDIERNSMNRSVQERKCRYSIRKLSVGAVSMIVGAVVFGTSP 50

TIGR4NanA 1 MNRSVQERKCRYSIRKLSVGAVSMIVGAVVNGTSP 35

S.typhimirium 1 0

R6 NanA 51 VLAQEGASEQPLANETQLSGESSTLTDTEKSQPSSETELSGNKQEQERKD 100

TIGR4NanA 36 VLAQEGASEQPLANETQLSGESSTLTDTEKSQPSSETELSGNKQEQERKD 85

S.typhimirium 1 0

R6 NanA 101 KQEEKIPRDYYARDLENVETVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLE 150

TIGR4 NanA 86 KQEEKIPRDYYARDLENVETVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLE 135

S.typhimirium 1 0

R6 NanA 151 NATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSD 200

TIGR4 NanA 136 NATVHMENKPDAKAPAFYNLNSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSD 185

S.typhimirium 1 0

R6 NanA 201 GKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRT 250

TIGR4 NanA 186 GKQNYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRT 235

S.typhimirium 1 MTVEKSVVFKAEG----------EHF 16

**** *

R6 NanA

251 SLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE 300

TIGR4 NanA

236 SLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE 285

S.typhimirium

17 TDQKG---------------------NTIVGS------------------ 27

. .* **. **

R6 NanA 301 VQKRSQLFKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGKPNKDGIKSYRIPA 350

TIGR4 NanA 286 VQKRSQLNKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGNPNKDGIKSYRIPA 335

S .typhimirium 28 --------------------------------GSGG-----TTKYFRIPA 40

*.* * .****

R6 NanA

351 LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLR 400

TIGR4 NanA

336 LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLR 385

S.typhimirium

41 MCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDR 90

. ****.. ** *. .** * ** *.****. ...* * *

R6 NanA

401 DNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRIFSIYDMFPEGKGIFGMSSQKE 450

TIGR4 NanA

386 DNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRINSIYDMFPEGKGINGMSSQKE 435

S.typhimirium

91 VNSKLSR-------------VMDP-------------------------- 101

* * * * **

R6 NanA

451 EAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKP 500

TIGR4 NanA

436 EAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKP 485

S.typhimirium 102 ---------TCIVANIQG-------RE--TILVMVGKWNNN----DKTWG 129

* . .* ** *. ** . *

R6 NanA 501 AYSDKGDLYKGNQLLGNIYFTTNKTSPFRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSA 550

TIGR4 NanA 486 AYSDKGDLYKGDQLLGNIYFTTNKTSPNRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSA 535

S.typhimirium 130 AYRDK--------------------AP---DTDWDLVLYKSTDDGVTFSK 156

** ** .* * * . * *** * *

R6 NanA 551 PQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTTNNVSHLNG 600

TIGR4 NanA 536 PQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTTNNVSHLDG 585

S.tYphimirium 157 VETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLN--DGKLVFPVQMVR-TKNITT 203

. . . . * * *. . *...** ..

R6 NanA 601 SQSSRIIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMNNRRAQNTESTV 650

TIGR4 NanA 586 SQSSRVIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMNNRRAQNTESTV 635

S.tYphimirium 204 VLNTSFIYSTD-GITWSLPSGYCEGFGSE---------NN---------I 234

. *** * * ** .. . ** .

R6 NanA 651 VQLNNGDVKLFMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIKRYPQVKDVYVQMSA 700

TIGR4 NanA 636 VQLNNGDVKLNMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIKRYPQVKDVYVQMSA 685

S.tYphimirium 235 IEFN-ASLVNNIR-NSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVNR------ 276

.. * . .* .* . .** * ** .*

R6 NanA 701 IHTMHEGKEYI ILSNAGGPKRENGMVHLARVEENGELTWLKHNPIQKGEF 750

TIGR4 NanA 686 IHTMHEGKEYIILSNAGGPKRENGMVHLARVEENGELTWLKHNPIQKGEN 735

S.typhimirium 277 ----NHGVQGSTITIPSG----NKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHN 318

.* . .. * * .* .* .

R6 NanA 751 AYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSFRKFNWDFLSKDLISPTEAK 800

TIGR4 NanA 736 AYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSNRKNNWENLSKNLISPTEAN 785

S.typhimirium 319 LYSGEVKLIDDFYPKVGNAS--GAGYSCLSYRKN---VDKETLYVVYEAN 363

* * * . . * . .** ** * **

R6 NanA 801 VKRTREMGKGVIGLEFDSEVLVNKAPTLQLANGKTARFMTQYDTKTLLFT 850

TIGR4 NanA 786 NRDGQRR-----------------DGQRSYWLGVRLRSIGQQGSNPSIGK 818

S.typhimirium 364 ------------------------------------------------GS 365

R6 NanA 851 VDSEDMGQKVTGLAEGAIESMHNLPVSVAGTKLSNGMNGSEAAVHEVPEY 900

TIGR4 NanA 819 WNNSDNPNPVN---------NQDLVVCSRNGRYRTGNYWYSNRKHRKYAN 859

S.typhimirium 366 IEFQDLSRHLP-------------VIKSYN (SEQ ID NO：17) 382

* . . .

R6 NanA 901 TGPLGTSGEEPAPTVEKPEYTGPLGTSGEEPAPTVEKPEYTGPLGTAGEE 950

TIGR4 NanA 860 SSCKSSR----CQSSWRSKWNQSSGANSSR----IYR-------GSNWYR 894

S.typhimirium 383 382

R6 NanA 951 AAPTVEKPEFTGGVNGTEPAVHEIAEYKGSDSLVTLTTKEDYTYKAPLAQ 1000

TIGR4 NanA 895 ASCSNNR--RVNGINFACNSYYKKRLYLQSSSCSAGTSNNRK-------Q 935

S.typhimirium 383 382

R6 NanA 1001 QALPETGNKESDLLASLGLTAFFLGLFTLGKKREQ(SEQ ID NO：15) 1035

TIGR4 NanA 936 GENPPSFTRTN--------SNLPWSVYAREKERTI(SEQ ID NO：16) 962

S.typhimirium 383 382

任意的神经氨酸酶的抗原性变体也可用于在此教导的组合物或方法。因此，天然存在的神经氨酸酶可以根据在此教导的方法以置换、缺失或改变氨基酸残基的方式被修饰。任选地，这种修饰将被设计为去除神经氨酸酶的毒性。“去毒”意为降低或消除酶的活性，但保留抗原性或免疫原性。这可以通过在神经氨酸酶活性位点用位点专一诱变置换、缺失或改变氨基酸的方式实现。优选地，这种对氨基酸的置换、缺失或改变在Asp盒(Asp box)范围内进行(即在氨基酸残基460-480、530-560或600-620范围内)。见于Crennell et al.，PNAS 90：9852-9856，其中教导的神经氨酸酶结构的全部内容作为参考文献在此处纳入本文。这种置换、缺失或改变也可以在氨基酸残基383-387、467-473、541-546或610-616范围内的Asp盒中进行。在Asp盒内的改变可以包括例如将天冬氨酸置换为谷氨酸或苏氨酸。也可以在Asp盒内的天冬氨酸残基或其他任何残基的位置进行其他保守性或非保守性的氨基酸置换来降低毒性。可以任选神经氨酸酶的其他区域作为位点专一诱变的靶位。例如，公开了在残基570-580的相应区域进行修饰，包括例如在572位点的缬氨酸或谷氨酰胺的保守性和非保守性氨基酸置换。还公开了在残基750-760的相应区域更具体地说是在754位置的酪氨酸进行了修饰的神经氨酸酶。酪氨酸残基的保守性氨基酸置换包括例如丝氨酸或苏氨酸。还公开了在氨基酸残基340-350、600-610或360-370的相应区域进行了修饰的神经氨酸酶。更具体地说是347、605、366或367位置的精氨酸可被置换为赖氨酸或谷氨酰胺或其他任意保守性或非保守性的氨基酸。在此教导的各种修饰可组合使用。因此，一个或多个保守性或非保守性的氨基酸置换可任选地存在于同一神经氨酸酶中。

如前所述，去毒神经氨酸酶是比非去毒神经氨酸酶活性低的神经氨酸酶，该活性由本领域熟知的Lock等人的分析方法(Microb.Pathog.4：33-43，1988)测定。在Lock分析中，以2’-(4-甲基伞形酮酰)-α-D-N-乙酰神经氨酸为底物在酶反应中测定溶胞产物、血清或血液中的NanA活性(Lock et al.1988)。10微升的底物与10μL血清相结合并于37℃培养5分钟。用0.5M碳酸钠终止反应。神经氨酸酶的活性以每分钟释放的4-甲基伞形酮(MU)的量测定。MU具有 366nM的激发波长和445nM的发射波长。与非去毒神经氨酸酶相比，优选去毒神经氨酸酶保持大体相同的抗原性或免疫原性，这样它可与可药用的载体一起组合为免疫组合物。出于比较的目的，非去毒的神经氨酸酶包括但不限于如表1所示的R6NanA。在优选的实施方案中，去毒神经氨酸酶显示了非去毒神经氨酸酶活性的至少60％、70％、80％或90％。

去毒神经氨酸酶包括与非去毒神经氨酸酶相比氨基酸序列的改变(例如置换、修饰或缺失)。在优选的实施方案中，去毒神经氨酸酶包括了非去毒神经氨酸酶中大约7％、10％、15％或20％的氨基酸改变。优选的氨基酸缺失包括了非去毒神经氨酸酶N端大约5、10或15个氨基酸的缺失。其他优选的实施方案包括非去毒神经氨酸酶C端大约60、50、40、30、20、10或5个氨基酸的缺失(根据本申请的目的，表1示出了从R6NanA的氨基酸800处开始的C端序列)。在另一个优选的实施方案中，去毒神经氨酸酶包括从非去毒神经氨酸酶C端17、9、8、7、4或2个氨基酸的缺失。表1表明了一些示例性的优选的缺失(即TIGR4 NanA的氨基酸序列)。任何上述改变都可以与一个或多个其他改变相结合。优选地，这样的去毒神经氨酸酶种类具有非去毒神经氨酸酶大约60％、70％、80％或90％的活性。

只要神经氨酸酶能保持其抗原性或免疫原性，也可以使用其他的保守性和非保守性置换。这些保守性置换是指一个天然存在的氨基酸被一个具有相似性质的氨基酸替换。这样的保守性和非保守性置换任选地改变该多肽的酶学功能。例如，可以根据表2进行保守性置换。

应当理解，在需要时可以对编码本发明的多肽和/或本发明的氨基酸序列的核酸进行修饰和改变，并获得具有类似或另外需要的特性(例如抗原性或免疫原性)的多肽。这种改变可在天然分离株中发生或者可以用位点专一诱变的方式人为引入，位点专一诱变的程序例如错配聚合酶链式反应(PCR)的程序为本领域所熟知。例如，多肽中的某些氨基酸可以被另外的氨基酸置换而不会造成功能活性的明显损失。因此可以考虑在本发明的多肽的氨基酸序列(或基础的核酸序列)中实行多种改变，这些改变不会造成多肽生物效用或活性的明显改变并且可能提高其效用或活性。

运用Sung et al.，(2001)Appl Environ Microbiol 67：5190-5196 中描述的方法实行了nanA基因或nanA基因任意部分的缺失，在其中教导的方法其全部内容作为参考文献在此处纳入本文。使用可以特异性地与蛋白质中的精氨酸残基反应的试剂2，3-丁二酮(2，3butadione)来评价精氨酸残基对NanA分子折叠的重要性。使用位点定向诱变来改变特定的氨基酸。

神经氨酸酶也可以通过例如变性的化学处理而被去毒。化学处理也可以与位点专一诱变相结合而进一步降低消极的副作用并提高抗原性或免疫原性。在用去毒神经氨酸酶对受试者免疫接种之前，去毒免疫神经氨酸酶可用例如***、戊二醛、加热等试剂或其他本领域技术人员已知的试剂进行处理。

因此在此提供去毒肺炎球菌神经氨酸酶或它的抗原性或免疫原性部分。还提供了包括去毒肺炎球菌神经氨酸酶和可药用载体的组合物。任选地，该组合物还包括佐剂(包括例如粘膜佐剂)。

此外，可在神经氨酸酶中加入一部分包括例如可增加抗原性或免疫原性的部分。这些部分包括例如细胞因子、趋化因子、生长因子、血管生成因子、细胞凋亡抑制素、激素、毒素或其他本文所讨论的用于佐剂的部分。该部分可任选地被修饰或截短以用于改变的分子中。因此在此提供肺炎球菌神经氨酸酶嵌合体，该嵌合体包括神经氨酸酶或其抗原性或免疫原性片段和提高抗原性或免疫原性的部分。还提供了包括肺炎球菌神经氨酸酶衍生物和可药用载体的组合物。任选地，该组合物还包括佐剂(包括例如粘膜佐剂)。

任选地，本发明中被修饰的神经氨酸酶片段或其部分具有与天然存在的肺炎球菌神经氨酸酶或其片段至少约70％的同源性。进一步提供了编码被修饰的神经氨酸酶或其片段的核酸。应该理解，一种定义在此公开的核酸和蛋白质中任何已知的或那些可能产生的变体和衍生物的方法是通过变体和衍生物与特定的已知序列的同源性来定义。例如，表1所示的由R6肺炎球菌菌株的nanA基因编码的氨基酸序列阐明了肺炎球菌神经氨酸酶的一个具体序列以及阐明了该蛋白的一个具体的氨基酸序列。具体公开了这个在此公开的序列的一些变体，它们与所述序列有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％的同源性。那些本领域的技术人员容易理解如何测定两个蛋白质或核酸的同源性。例如，在序列比对后计算同源性以使同源性处于其最高水平。

另一种计算同源性的方法可根据已发表的算法进行。最佳的用于比较的序列比对可在以下的文献指导下或通过观察进行：局部同源性算法Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)、同源比对算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48：443(1970)、相似性搜索方法Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)、这些算法的计算机实现(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，它们在Wisconsin遗传学软件包中，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)。相同类型的核酸的同源性可从以下文献所公开的算法中获得：Zuker，M.Science 244：48-52，1989；Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710，1989；Jaeger et al.Methods Enzymol.183：281-306，1989。以上文献中至少关于核酸序列比对的内容作为参考文献在此处纳入本文。

“肺炎球菌磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质”意为存在于肺炎球菌中的磷酸胆碱、磷壁酸或脂磷壁酸质。这些化合物可如以上对神经氨酸酶的叙述进行修饰、去毒或增强。在此提供的组合物包括经修饰、去毒和增强的化合物。

“其抗原性部分”意为分子或化合物(例如神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质)可以引发针对该分子的抗体产生的任意表位。优选地该抗原性部分引发对该分子或肺炎链球菌的免疫性。优选地该抗体针对或者干扰神经氨酸酶的活性位点。抗原性片段的实例包括但不限于对应于nanA-R6氨基酸序列残基63-361部分的残基，片段中可能含有或不含有保守性氨基酸的置换或修饰。其他实例包括神经氨酸酶的Asp区(对应于NanA-R6氨基酸序列的460-480、530-560、610-620残基)和对应于NanA-R6氨基酸序列340-350、360-370、600-610、570-580和750-760的部分，片段中可能含有或不含有保守性氨基酸的置换或修饰。任选地，针对干扰神经氨酸酶活性部位的抗体可以结合或阻止其他分子结合下述位点：位于SEQ ID NO：15的残基347、367或605处的NanA的精氨酸残基；或位于SEQ ID NO：15的残基383-387、467-473、541-546和 610-616处的NanA的Asp盒。此外，该抗体还能结合或阻止其他分子结合位于SEQ ID NO：15的残基575的缬氨酸或位于SEQ ID NO：15的残基752的酪氨酸。该抗体还能结合或阻止其他分子结合以上列出的SEQ ID NO：15的残基的任意组合。

其他NanA片段的实例包括氨基酸1到340、330到630、620到800、700到1030和330到800。进一步提供的片段为两个或更多的上述片段的融合体。融合片段包括但不限于1到340区域与620-680区域的融合。融合片段以重组蛋白的形式表达。编码这些片段的片段被克隆至表达载体(pET载体；Novagen公司)中并纯化蛋白质。或者，片段可由厂商以合成多肽的形式生产。片段用于免疫动物以产生抗体并结晶以获得三维结构。进一步提供了编码片段的核酸，其中含有或不含有在此描述的保守性或非保守性氨基酸的修饰或置换。还提供了包括核酸的载体或表达***。

在此提供包括分离的抗体的组合物，该抗体特异性地结合肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、磷壁酸、脂磷壁酸质或这些中一个或两个的抗原性部分。还提供了包括这些抗体任意组合的组合物。这些抗体可用于开发对肺炎链球菌的被动免疫。抗体组合物进一步包括可药用的载体。任选地，组合物适用于粘膜表面给药，但其他给药途径包括在此描述的全身给药也被公开。

还公开了产生抗体的方法，该抗体特异性地针对肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、磷壁酸、脂磷壁酸质或肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、磷壁酸或脂磷壁酸质的任意表位。任选地，以有效量的在此公开的组合物与受试者鼻粘膜相接触，在受试者内(即体内)产生抗体。还公开了产生抗体的方法，该抗体特异性地针对肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、磷壁酸、脂磷壁酸质或肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、磷壁酸或脂磷壁酸质的任意表位的任意组合，该方法是用有效量的包括靶分子组合或针对该分子的抗体的组合物与受试者鼻粘膜相接触。

任选地，在此描述的试剂不论是天然存在的还是经过去毒或修饰的，都可以任选地以核酸的形式给药，例如以载体中的核酸的形式。核酸的表达可以导致受试者与期望表达的核酸相接触。因此，例如，如果将编码肺炎球菌神经氨酸酶的核酸以一种能在受试者体内表达的形式给药的话，那么受试者就会与神经氨酸酶接触。

在此描述的包括将外源DNA给药和摄取到受试者细胞的方法(例如基因转导或转染)中，如本领域普通技术人员所熟知的，公开的核酸可为裸露的DNA或RNA形式，或者核酸在一个能将核酸运送至细胞的载体中，由此使编码抗体的DNA片段处于启动子的转录调控之下。该载体可以为市售制剂例如腺病毒载体(Quantum Biotechnologies，Inc.(Laval，Quebec，Canada)。将核酸或载体运送至细胞内可经由多种机制。一个实例中，可由脂质体运送，可使用市售脂质体制剂如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，也可使用根据本领域标准程序开发的其他脂质体。此外，公开的核酸或载体也可以由基因枪或例如电穿孔或SONOPORATION机器(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)的方法运送至体内，其中电穿孔技术可由Genetronics公司(San Diego，CA)得到。

一个实例中，可以经由病毒***运送载体，例如可组装重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体***(见于例如：Pastan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：4486，1988；Miller et al.，Mol.Cell.Biol.6：2895，1986)。重组逆转录病毒可用于转染并由此将核酸运送至被转染的细胞中，该核酸可编码例如肺炎球菌神经氨酸酶或广泛的中和抗体(或其活性片段)。将改变的核酸转入哺乳动物细胞的正确方法当然不限于使用逆转录病毒载体。其他技术也广泛应用于这一程序，包括使用腺病毒载体(Mitani et al.，Hum.Gene Ther.5：941-948，1994)、腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体(Goodman et al.，Blood 84：1492-1500，1994)、慢病毒载体(Naidini et al.，Science272：263-267，1996)、假型逆转录病毒载体(Agrawal et al.，Exper.Hematol.24：738-747，1996)。也可以使用物理转导技术，例如脂质体运送和受体介导和其他胞吞作用机制(见于例如Schwartzenberger et al.，Blood 87：472-478，1996)。公开的组合物和方法可与任何这里提到的或其他常用的基因转移方法联合使用。

一个实例中，如果编码抗体的核酸在腺病毒载体中被运送至受试者细胞，给予人体的腺病毒的剂量范围为每次注射大约10⁷到10⁹噬菌斑形成单位(pfu)，最高可为每次注射10¹²pfu(Crystal，Hum.Gene Ther.8：985-1001，1997；Alvarez and Curiel，Hum.Gene Ther.8：597-613，1997)。受试者可接受一次注射，或者如果必须要追加注射的话，可以以六个月的时间间隔(或由有经验的医生决定的其他合适时间间隔)重复注射一段不定的时间和/或直至确定了疗效为止。

如果使用核酸或载体的非消化道给药，其通常以注射为特征。注射物可以制备为常规形式，可以是液体溶液或悬液，也可以是适于在注射前溶于液体成为溶液或悬液的固体形式，或者是乳液。非消化道给药的一个更新的修改方案包括使用缓慢释放或持续释放***，以保持稳定的剂量。见于例如美国专利No.3,610,795，该专利作为参考文献在此处纳入本文。关于治疗化合物的适当制剂和各种给药途径的更多讨论见于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton.PA 1995。

还公开了一种减少或防止受试者中肺炎球菌鼻携带的方法，包括将有效量的在此公开的组合物与受试者的鼻粘膜相接触。这样的给药对于肺炎球菌感染或鼻携带产生主动或被动免疫或保护作用是有用的。

进一步提供减少或防止受试者中肺炎球菌感染的方法，包括将有效量的在此公开的组合物与受试者的粘膜表面相接触。例如，该方法可防止肺炎球菌脑膜炎、中耳炎、肺炎或溶血性***。防止或减少可以通过减少鼻携带和或防止CNS侵害、全身性侵害、咽鼓管或下呼吸道侵害来实现。

在此提供的术语化合物的“有效量”意为无毒害作用但可产生所需效果的化合物的足够剂量。如下文将要指出的，所需的准确剂量将根据受试者的人种、年龄和综合情况；所治疗疾病的严重程度；使用的具体化合物；给药方式等等条件而变化。因此，不可能指定一个准确的“有效量”。然而，合适的有效量由一个本领域普通技术人员仅使用常规试验就能确定。

在此描述的化合物的剂量或用量大到足够在给药方法中产生所需效果。该剂量不应大到引起如交叉反应、过敏反应等有害的副作用。通常剂量要根据受试者的年龄、身体状况、性别和病情而变化并可由本领域技术人员确定。该剂量也可由个别的医生根据受试者的临床情况进行调整。单次剂量、用药日程和给药途径也可能变化。优选的包括抗原的鼻部施用的剂量为每次接种约1-1000μg或者这之间的任何剂量，包括例如10-100μg。

根据在此描述的方法的一次特定剂量的化合物或组合物的给药效果可以通过评估医疗史、体征、症状和客观的实验室测试这些评价肺炎球菌感染的受试者或肺炎球菌携带者状态的已知有用手段来确定。如本领域治疗这些病人的临床医生和执行这些实验的研究者所知，这些体征、症状和客观的实验室测试根据要治疗或预防的特定的疾病或状况而变化。例如如果在一般人群或特定个体之间，基于合适的对照组和/或疾病的正常进程的知识进行比较：1)受试者的身体健康状况表现出有所改善(例如鼻携带已减少或消失)，2)疾病、感染或鼻携带的进程表现出稳定、减慢或逆转，或3)疾病或病症的其他药物治疗的需要减少或消除，那么特定的治疗方案被认为有效。例如，减少或防止受试者中或人群中的鼻携带，避免或减少发生CNS侵害或其他继发性肺炎球菌感染，即可说明有效。上述效果可在一个受试者(如通过粘膜表面进行传统的擦拭时检出细菌数目的减少)或一个群体中(如运用流行病学研究)被确定。

在此描述的化合物和药物组合物可根据需要局部还是全身性治疗和需治疗的面积而有多种方式给药至受试者。因此，例如，在此描述的化合物和药物组合物可以如下方式给药：静脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、包裹于脂质体内或微球内给药、作为眼科滴液和/或软膏在眼表面给药、作为鼻腔喷剂、作为喷雾溶液或作为鼻腔或呼吸道的气雾剂。此外，化合物或药物组合物可以通过***、直肠、鼻内、口服、吸入、口服或插管的方式给药至受试者。任选地该组合物可以通过静脉内、皮下、肌肉或腹膜内注射的方式给药。该组合物可以制备为传统的形式，如液体溶液或悬液、适于在液体中形成溶液或悬液的固体形式或者为乳液。任选地，给药可以应用缓慢释放或持续释放***，以保持稳定的剂量。见于例如美国专利No.3,610,795，其中教导的方法作为参考文献在此处纳入本文。

在此教导的组合物包括无菌的含水或非水溶液、悬液和乳液，也可能包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。非水性溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐类和缓冲介质。运载工具包括氯化钠溶液、林格氏(Ring’s)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏注射液或不挥发性油。也可能存在防腐剂或其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合试剂和惰性气体等等。

用于局部给药的制剂可能包括软膏、洗液、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、气溶胶、喷雾溶液和粉剂。可能必需或者需要常规的药用载体，水、粉底或油底，增稠剂等等。

口服给药的组合物包括粉剂或颗粒、水或非水介质的悬液或溶液、胶囊、药袋或片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂。

在此提供减少或防止受试者鼻携带或肺炎球菌感染的方法，包括给予受试者有效量的神经氨酸酶抑制剂。优选地，该神经氨酸酶抑制剂抑制肺炎球菌神经氨酸酶活性但是不会明显减少受试者内源性的神经氨酸酶。因此，例如，当神经氨酸酶被给予至人体时，该抑制剂优选抑制肺炎球菌神经氨酸酶但是不会减少人神经氨酸酶的活性，或不会将人神经氨酸酶活性减少到在人体内产生消极副作用的程度。已知神经氨酸酶抑制剂的例子包括DANA、NANA、扎那米韦和奥塞米韦。

在此提供减少或防止受试者鼻携带或肺炎球菌感染的方法，包括给予受试者有效量的组合物，该组合物包括针对肺炎球菌神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁酸质的抗体或其片段或针对这些中任意一个的一部分的抗体。任选地，给药包括将组合物与受试者的粘膜表面相接触。还提供了包括抗体的组合物和容器。

在此使用的术语“磷酸胆碱抗体”指的是优先结合磷酸胆碱或其抗原性片段的抗体。本发明的抗体可优先结合肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸质或他们的抗原性部分，或神经氨酸酶或其片段。

在此使用的术语“抗体”是广义的，它可包括多克隆抗体和单克隆抗体。具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，和例如F(ab’)2，Fab’，Fab，scFv等的片段，包括杂合片段也可以用于在此描述的组合物和方法。因此，提供了保留着结合其特异性抗原能力的抗体片段。例如，保留着神经氨酸酶、磷酸胆碱、磷壁酸或脂磷壁酸质结合活性的抗体片段是包括于术语“抗体片段”的意义中的。这样的抗体和片段可以由本领域已知的技术制得，也可以根据实施例中提供的方法和一般生产抗体和由特异性和活性筛选抗体的方法进行特异性和活性筛选而得(见于Harlow and Lane.Antibodies，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988))。

抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的结合物可以用于本发明的组合物中。这样的结合物描述于例如美国专利No.4,704,692中，该内容作为参考文献在此处纳入本文。抗体经体外测定或类似方法检测其期望活性后，根据已知的临床试验方法，检测它在体内的治疗和/或预防活性。

本文使用的术语“单克隆抗体”指的是从一组基本上同质的抗体所得到的抗体，即除了在抗体分子的小亚型中存在可能自然出现的突变以外，该组中的抗体个体是完全相同的。公开的单克隆抗体可以用任何生产单克隆抗体的程序制得。例如，公开的单克隆抗体可以用杂交瘤方法制备，这样的方法描述于Kohler and Milstein，Nature，256：495(1975)。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠或其他合适的宿主动物，激发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，产生的抗体会特异性地结合免疫剂。或者在体外免疫淋巴细胞，例如使用在此描述的HIV Env-CD4-共同受体复合物。

单克隆抗体也可以用重组DNA的方法制备，这样的方法描述于美国专利No.4,816,567(Cabilly et al.)中。编码公开的单克隆抗体的DNA用常规程序(例如使用可以特异结合编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易的被分离和测序。用噬菌体展示技术可以产生和筛选抗体或活性抗体片段文库，例如Burton等的美国专利No.5,804,440和Barbas等的美国专利No.6,096,441中有所描述。

体外方法也适用于制备单价抗体。使用本领域已知的常规技术就可实现对抗体的消化而产生其片段，尤其是Fab片段。例如，可用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的例子描述于1994年12月22日公布的WO 94/29348和美国专利No.4,342,566中。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个片段具有一个抗原结合位点，还产生一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生有两个抗原结合位点的片段并仍然能交联抗原。

不论抗体片段是否附着于其他序列上，它都可包括在特定区域或特定的氨基酸残基处的***、缺失、置换或其他的所选修饰，只要与未修饰的抗体或抗体片段相比，这些修饰不显著改变或损害抗体或抗体片段的活性。这些修饰可提供一些额外的属性，例如移除/增加能够形成二硫键的氨基酸而增加其生物寿命、改变分泌特性等等。无论如何，抗体或抗体片段必须具有生物活性，例如与其同源抗原的特异性结合。抗体或抗体片段的功能或活性区可通过下述方法识别：对蛋白的特定区域进行诱变，然后进行表达并检测表达的多肽。上述方法对本领域技术人员来说显而易见，可包括对编码抗体或抗体片段的核酸进行位点专一诱变。(Zoller，M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3：348-354，1992)。

正如在此使用的，术语“抗体”或“抗体片段”也可以指人类的抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如从小鼠、大鼠或兔中产生的抗体)在人体内是天然的抗原，当给药至人体时会引发不需要的免疫反应。所以在方法中使用人类或人源化抗体可以减少给药至人体时引发不需要的免疫反应的可能性。因此，包括抗体的组合物任选地包括人源化或全人抗体。抗体人源化技术通常包括使用重组DNA技术操作编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。因此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段例如Fv、Fab、Fab’，或抗体的其他抗原结合部分)，它包括整合到人类(受体)抗体框架中的非人类(供体)抗体的抗原结合位点部分。

公开的人类抗体可以使用任何技术制备。人类单克隆抗体生产技术的例子包括下述文献所描述的：Cole et al.(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77，1985)、Boerner et al.(J.Immunol.，147(1)：86-95，1991)。人类抗体(和其片段)也可以使用噬菌体展示文库来产生(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227：381，1991；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581，1991)。

公开的人类抗体也可以从转基因动物中获得。例如有关文献描述了转基因突变小鼠可以在免疫反应中产生人类抗体的全部组成成分(见于例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-255(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immunol.，7：33(1993))。特别地，这些嵌合体或者种系突变的小鼠的抗体重链连接区(J(H))的纯合子缺失导致内源性抗体的产生完全被抑制，人类种系抗体基因阵列向这样的种系突变体小鼠的成功转移使得小鼠在受到抗原攻击时产生人类抗体。具有期望活性的抗体使用在此描述的Env-CD4共同受体复合物筛选。

为产生人源化抗体，受体(人类)抗体分子中一个或多个互补决定区(CDR)的残基被已知具有期望的抗原结合特性(例如对靶抗原一定水平的特异性和亲和力)的供体(非人类)抗体分子的一个或多个CDR的残基所取代。在一些实例中，人类抗体的Fv框架(FR)的残基被非人类的相应残基所取代。人源化抗体还可包括既不存在于受体抗体中也不存在于移入的CDR或框架序列中的残基。通常，一个人源化抗体中有一个或多个从非人源引入的氨基酸残基。实际上，通常人源化抗体是其中一些CDR残基和可能一些FR残基被啮齿类动物抗体的类似位点残基取代的人类抗体。人源化抗体通常包括至少一部分抗体恒定区(Fc)，通常是人类抗体的恒定区(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2：593-596(1992))。

使非人类抗体人源化的方法在本领域广为人知。例如，人源化抗体可根据Winter及其同事的方法(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988))，用啮齿类动物的CDR或CDR序列置换人类抗体的相应序列的方法生产。产生人源化抗体的方法也被描述于下列美国专利中：No.4,816,567(Cabilly et al.)、No.5,565,332(Hoogenboom et al.)、No.5,721,367(Kay et al.)、No.5,837,243(Deo et al.)、No.5,939,598(Kucherlapati et al.)、No.6,130,364(Jakobovits et al.)、和No.6,180,377(Morgan et al.)。

抗体的给药可按照在此公开的方法进行。也存在抗体给药的核酸手段。抗体和抗体片段也可以用编码该抗体或抗体片段的核酸制品(例如DNA或RNA)的方式给药至患者或受试者，以使受试者自身的细胞摄取这些核酸并产生和分泌所编码的抗体或抗体片段。核酸的给药可以用本领域已知的任何方法进行。

在此还公开了包括在此教导的试剂和组合物的容器。特别地，该容器可以是鼻腔喷雾器(nasal spayer)、雾化器(nebulizer)、吸入器(inhaler)、瓶子或其他任何包括给药至粘膜表面的形式的组合物的装置。任选地，该容器可以运送确定剂量的组合物。

实施例

以下的实施例为本领域普通技术人员提供了如何制备和评测在此描述和要求保护的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整公开和描述，其意图完全是为了示例而非意在限制发明人认为的本发明的范围。已经努力确保数字方面(例如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以℃为单位或者为环境温度，压力等于或接近大气压。为了优化从所述方法中所得产品的纯度和产量，可在反应条件上有很多变更和组合，例如组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其他反应范围和条件。只有合理和常规的方法才被用来优化上述过程条件。

实施例1

鼻部肺炎球菌通过鼻携带穿透嗅觉组织

材料和方法

肺炎球菌菌株

本研究使用了两个有荚膜的肺炎链球菌菌株：血清型为19F的EF3030菌株和血清型为4的TIGR4菌株，以及一个无致病性无荚膜的菌株：由血清型为2的亲代菌株D39得来的R36A菌株。Avery et al.，(1944)J.Exp.Med.79：137-158。之所以选择EF3030菌株是因为它可以在没有菌血症的情况下容易地在呼吸道内建群(Briles et al.，(1992)Infect.Immun.60：111-116)，而且在静脉接种后不会引起持续的菌血症。TIGR4菌株虽然致病性强一些，但是其鼻接种物建群温和并不会引起菌血症。

小鼠

从杰克逊实验室(Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME))得到了CBA/CAHN/xid(xid)小鼠。这些小鼠Bruton酪氨酸激酶基因的突变使得它们对非胸腺依赖的II型抗原没有反应(Amsbaugh et al.， (1972)J.Exp.Med.136：931-949；Berning et al.，(1980)J.Immunol.46：506-513)，但是有相对正常的T细胞依赖的免疫反应。这些小鼠对荚膜多糖没有反应而对肺炎球菌感染有可重复的易感性。xid小鼠在无病原体条件下饲养，并在7至12周龄时使用。

组织采集

从眶后网状组织中采血至肝素化的毛细管中。在采集小鼠的鼻洗出物(NW)、肾脏、脾脏和肺之前将小鼠用70％乙醇消毒。为防止NW的血液污染，在气管上切口并将一支长2.0cm，外径0.075cm的聚乙烯(Tygon)管(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)***鼻咽部，该管附带有装满林格氏液的注射器。注射器中的液体通过鼻腔排出，收集三滴。

鼻咽关联淋巴网状组织(NALT)、ON/E、OB及脑部残留物依照下列文献描述获得：van Ginkel et al.，(2000)J.Immunol.165：4778-4782；Wu et al.，(1997)Scand.J.Immunol 46：506-513。在解剖显微镜下小心地从脑部切除三叉神经节。ON/E、OB、三叉神经节、NALT和颈部***CLN各自在0.5ml林格氏液中匀浆，脑部和肾脏各自在1.0ml林格氏液中匀浆。

在组织糜/血液/外部***物中的肺炎球菌数量

将组织和体液用无菌的林格氏液制备成八份连续三倍稀释液并涂布于含4μg/ml硫酸庆大霉素的血液琼脂平皿上。涂布并在烛罐中培养24小时后进行CFU计数。结果表示为CFU/器官或每NW或每毫升血液。肺炎链球菌EF3030菌株的GLS预培养

为封闭GLS的结合位点，使用3×10⁷CFU的肺炎链球菌EF3030菌株在冰上与20μg来自人脑的无唾液酸基GM1或与来自牛脑的125μg混合GLS(18％GM1、55％GD1a、15％GD1b、10％GT1b、2％其他GLS)(Calbiochem-Novabiochem Corporation，Inc.，La Jolla，CA)培养30分钟。GLS在使用前一天溶于PBS并充分混合。两性的GLS在PBS中形成微团使肺炎球菌可与其碳水化物部分相互作用。培养后，以每鼻孔5μl向xid小鼠鼻部给药，并不再进行洗涤。四天后分析组织的CFU。

用PCR进行肺炎链球菌溶血素基因检测

为进行肺炎链球菌的PCR检测，将组织在含0.1％脱氧胆酸的1％SDS中冻融裂解，37℃培养1小时。蛋白质以溴化十六烷基三甲铵/NaCl沉淀法除去(Ausubel et al.，(1987)，Current Protocols in Molecular Biology，2nd：2.4.4，其教导的溴化十六烷基三甲铵/NaCl沉淀法作为参考文献在此纳入本文)。使用10μgDNA进行PCR扩增。将肺炎链球菌溶血素(ply)的特异性引物Ply15’-ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA-3’(SEQ ID NO：1)和Ply25’-GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC-3’(SEQ ID NO：2)加入PCR混合物中，以扩增400bp的片段。PCR反应包括94℃下5分钟的变性步骤，接着是扩增循环：94℃(1分钟)、55℃(1分钟)和72℃(1分钟)，30个循环。PCR片段的溴化乙锭染色图像由Alpha Imager TM IS-3400(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA)仪器采集。

使用PspA特异性抗体对OB的免疫荧光染色

以5×10⁵CFU的TIGR4菌株对小鼠的鼻部进行攻击。OB在10％甲醛缓冲溶液中固定。对PspA家族2抗体(1∶100)的4μm石蜡切片(van Ginkel(2000)J.Immunol.165：4778-4782)在湿室中室温培养4小时进行染色。切片用PBS洗涤，用生物素化山羊F(ab’)2抗兔IgG(1∶200)(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)染色，洗涤后用链霉亲和素-FITC(1∶100)(BD-PharMingen，San Diego，CA)染色。荧光图像由配有DEI-750CE数码彩色摄像机(Optronics，Goleta，CA)的Nikon显微镜采集，由Scion Image软件(Scion Corporation，Frederick，MD)进行处理。

统计

数据表示为平均值±一个标准误差，结果运用不成对Mann Whitney双样本秩检验或student t-检验进行统计学分析以确定CFU显著差异来进行比较。

结果

肺炎球菌荚膜在鼻建群和CNS侵害中的作用

为检验肺炎球菌通过初级感官嗅觉神经的吸收，测定了1天和4天时EF3030和无荚膜菌株R36A在鼻道建群和进入CNS的能力(图1)。在1天时在ON/E中两个菌株都可被观察到高的CFU，但在4 天时R36A在ON/E和所有其他组织中大大减少，这与早先显示持续的建群需要一些荚膜的结果相一致。Magee and Yother(2001)Infect.Immun.69：3755-3761。EF3030在1天和4天时都显示在OB和脑中的清晰存在，并且在4天时在NW和NALT中大量存在。这些发现与EF3030在鼻攻击后由轴突运输进入OB和脑相一致。

鼻建群和CNS侵害的动力学

在39天的观察中，EF3030在所有时间点在ON/E、OB、NW和NALT中持续存在(图2)。在脑和CLN中看到的CFU数目要低得多，上述CFU通常见于18和25天。值得关注的是，除了1(图1)、18、25和39天(图2)外，肺部不出现肺炎球菌。由于在用鼻部给药的EF3030菌株进行的所有实验中均没有检出小鼠血液中的CFU，所以菌血症不会有助于神经组织的分布(图2)。在鼻部施用后1、3、6、12、24小时和随后一周内每一天针对菌血症进行了血液监测。在血中没有检出细菌。

三叉神经节的肺炎链球菌感染

三叉神经元支配鼻咽，因此预料肺炎链球菌在感染鼻粘膜之后到可能在三叉神经节中出现。为测试上述可能，在新的实验中分离了接种四天后的不同组织和血液并测定其中的EF3030。在ON/E和OB及三叉神经节中检出了EF3030菌株(表3)。这个结果进一步支持了无唾液酸基GM1作为肺炎链球菌神经靶向受体的结论。其他的GLS可能也起作用。

表3显示了肺炎链球菌EF3030菌株在鼻部给药后在不同组织中的分布。在鼻部施用1×10⁷CFU的EF3030菌株4天后分离组织。血液(50μl)、ON/E、OB和脑的组织糜被稀释，然后涂布于血琼脂培养基上。三叉神经节被混合匀浆后也涂布于该培养基。示出的是代表三个独立实验的5只小鼠的肺炎球菌CFU的平均值±SE。在脑和血液中没有肺炎球菌检出。

表3

神经节苷脂抑制肺炎球菌建群

在鼻部施用之前，EF3030菌株与无唾液酸基GM1或混合的GLS微团在PBS中培养。在鼻部施用4天后测定，GLS混合物显示出最强的抑制效果并在NW中使CFU减少了10倍(P＝0.0365)。混合的GLS预培养导致的CFU最多的下降见于ON/E中(下降617倍；P＝0.0134)。在肺(P＝0.0320)(图3B)中和CNS组织(P＝0.0078)(图3A)中也有同样显著的差异，在对照组中平均存在204和166CFU，而在与GLS培养后则检测不到(检出限＝3CFU)肺炎球菌了。无唾液酸基GM1预培养比混合的GLS的效果差一些，但是也能在CNS(图3A)和肺(图3B)中分别降低建群25倍和63倍。肺部被吸入的肺炎球菌感染，GLS可明显抑制它们附着于在肺中相对丰富的无唾液酸基GM1上。这说明GLS在初始附着到上皮细胞的过程中起作用。GLS治疗不改变肺炎球菌的存活率。在这些实验中在血液中没有肺炎球菌检出。因此，GLS构成了肺炎球菌附着于鼻道神经上皮细胞和感染肺部和CNS的重要靶点。

鼻攻击后肺炎球菌在OB中累积的检测

OB中的EF3030数量通常很低以至于无法用显微镜观察到。为使鼻部施用后OB中的肺炎链球菌能被观察到，使用了毒性更大的TIGR4菌株。检测了鼻攻击后1、3、6、12或24小时和随后每一天的代表小鼠的血样。没有观察到菌血症。攻击一周后杀死小鼠并分析其组织的CFU(图4A和4B)。仅仅5×10⁵CFU剂量的TIGR4就能导致在OB中的约300CFU(图3)。OB中的肺炎球菌通过PspA特异性抗体的染色可见(图4D至F)。在受攻击小鼠OB中即在嗅球小球层(图4F)和外丛状层(图4E)中检出了肺炎球菌。在对照小鼠的OB中没有肺炎球菌(图4D)。

在鼻部给药后6天用肺炎球菌溶血素基因的PCR扩增也能检出NW、ON/E和OB中的TIGR4菌株(图4C)。在这个区间内的血样或未感染小鼠的任何样本中没有PCR能检出的肺炎球菌。

实施例2

肺炎球菌NanA在鼻咽携带和靶向神经***中的作用

NanA突变体从三个NanA的遗传背景和位置均不相同的肺炎链球菌菌株中产生。EF3030(19F型)和D39(2型)菌株均表达与细胞壁共价结合的NanA，而TIGR4(4型)菌株表达分泌到环境的截短的NanA。

还评估了NanB在建群中的作用。

菌株和生长条件

本研究中使用的菌株列于表4。

表4

^＊Tettelin et al.(2001)Science 293：498-506。

Briles et al.(2003)J Infect Dis 188：339-348。

Avery et al.(1979)J.Exp.Med 149：297-326；McDaniel et al.(1987)Microb.Pathog.3：249-260。

^§Berry et al.(2000)Infect.Immun.68：133-140。

所有的肺炎球菌菌株于-80℃的10％甘油中储存，并转移到血琼脂平板上在37℃、5％CO₂环境中培养过夜。肺炎球菌培养物在含0.5％酵母提取物的Todd-Hewitt培养基中生长至OD660达到0.5，将培养物等份于含10％无菌甘油的相同肉汤培养基中并在-80℃冻存。携带抗生素抗性***物的突变体在适当的抗生素中生长以确保突变的稳定性。

NanA突变体的构建

分别由亲代背景TIGR4、EF3030和D39通过***复制诱变技术(Yother et al.(1992)J.Bact.174：610-618，其中教导的技术全部作为参考文献在此纳入本文)产生NanA突变体菌株JW001、SAM001和JCP001(表4)。使用TIGR4和EF3030菌株作为从等基因nanA菌株D39中制备的供体染色体DNA的转化受体(Berry et al.(2000)Infect.Immun.68：133-140)。每一例的突变体回交至亲本三次。D39突变体也回交D39亲本三次以保证其与用于此研究的亲代菌株等基因。D39的突变由***复制诱变制得，以使成熟蛋白的大约650个氨基酸的N末端片段外全部缺失(Berry et al.(2000)Infect.Immun.68：133-140)。TIGR4/nanB等基因突变体用***复制诱变技术 (Balachandran et al(2002)Infect.Immun.70：2536-2534；Yother et al.(1992)J.Bact.174：610-618)构建。使用下述方法扩增nanB的一段461bp的内部片段：以nanBF和nanBR为引物(表1)，用Taq PCR Mastermix(Invitrogen)进行PCR，于95℃1分钟、45℃1分钟、72℃1分钟进行30个循环。将片段克隆至pSF152。如前述转化质粒DNA到TIGR4菌株中(Balachandran et al.(2002)Infect.Immun.70：2526-2534)。nanA/nanB-TIGR4双突变体通过将从JW001菌株中制得的染色体DNA转化到nanB/TIGR4突变体中生成。

小鼠毒性分析

6-12周龄的CBA/CaHN-XID/J(CBA/N)雌性小鼠从杰克逊实验室(The Jackson Laboratory(Bar Harbor，MA))获得。这些小鼠的Bruton酪氨酸激酶基因突变使得它们对非胸腺依赖的II型抗原没有反应，但还有相对正常的T细胞依赖免疫反应(Amsbaugh et al.1972J.Exp.Med.136：931-949；Briles et al.1986Curr.Top.Microbiol.Immunol.124：103-120；Potter et al.1999Int.Immunol.11：1059-64；Wicker and Scher 1986Curr.Top.Microbiol.Immunol.124)。这些小鼠对荚膜多糖没有反应而对肺炎球菌感染有可重复的易感性(Briles et al.1986Curr Top.Microbiol.Immunol.124：103-120；Briels et al.1981j.Exp.Med.153：694-705)。所述x连锁免疫缺陷(xid)小鼠在无病原体条件下饲养，并在7至12周龄时使用。含有已知浓度活细胞的冰冻感染株在乳酸林格氏溶液中稀释。以10μl约5×10⁵-1×10⁶个细胞鼻内(I.N.)感染小鼠(Wu et al.1997b Microb.Pathog 23：127-137)。

组织采集

在实行鼻洗出和组织采集前对所有小鼠无痛致死。从眶后网状组织中取血至肝素化的毛细管中。在采集鼻洗出物(NW)、鼻部组织(包括嗅上皮(NT)、嗅球(OB))和脑之前将小鼠用70％乙醇消毒。液体和组织的获得如上所述。为防止NW的血液污染，在气管上切口并将一支长2.0cm，外径0.075cm的聚乙烯(Tygon)管(Cole-Parmer)***鼻咽部，该管附带有装满林格氏液的注射器。注射器中的液体通过鼻腔排出，收集三滴。ON/E和OB在0.5ml林格氏液中匀浆，脑残留物在1.0ml林格氏注射液中匀浆。存活肺炎球菌计数

将组织和体液用无菌的林格氏液制备成八份连续三倍稀释液并涂布于含4μg/ml硫酸庆大霉素的血液琼脂平皿上。涂布并在烛罐中37℃培养24小时后进行菌落形成单位(CFU)计数。用于分析神经氨酸酶活性的方法在前已述(Lock et al1988Microb Pathog 4：33-43，其分析方法全部作为参考文献在此纳入本文)。结果的显著性由双样本Mann-Whitney秩检验通过比较野生型肺炎球菌和突变型肺炎球菌来评估。

体外研究

测定了TIGR4及其nanA和nanB突变体结合特异性神经节苷脂的能力。使用的神经节苷脂包括混合神经节苷脂、无唾液酸基GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)和GM3神经节苷脂(Sigma)。GM3神经节苷脂缺少能使肺炎球菌结合的末端或内部的GalNAcβ1-4Gal序列而用作阴性对照。这些混合的、含有一个、两个或三个唾液酸的神经节苷脂很容易结合到ELISA平板上。在与TIGR4菌株短期培养之后的原始数据显示肺炎球菌与无唾液酸基GM1包被的平板结合，但不与BSA-、GM-3或GM1包被的平板结合。使用神经节苷脂包被的平板比较了野生型TIGR4菌株和TIGR4菌株、nanA、nanB和nanA/nanB突变体菌株的稳定不透明和透明相变种与平板附着的能力。这些分析包括了在神经节苷脂平板上的短期培养(1小时)和延长培养(24小时)。通过在含0.5％酵母提取物的Todd Hewitt培养基中短暂培养(10-15分钟)然后反复地移液并将脱落的细菌接种到血琼脂平板上的方法将附着的肺炎球菌从神经节苷脂平板上移除。或者用41℃的含0.5％酵母提取物的Todd Hewitt肉汤琼脂倒于附着的肺炎球菌上方并于平板底部计算菌落数目。对照包括不含肺炎球菌的平板和不含神经节苷脂但含有肺炎球菌的平板。

在测定了神经节苷脂结合力之后，使用不同的细胞系来测定它们将肺炎球菌附着于其细胞表面并摄入其中的能力。该研究着重于大鼠神经嗜铬细胞瘤细胞系PC12(ATCC)和巨噬细胞系P388D1。因为这两种细胞系的特性而选择它们。P388D1细胞系表达高亲和力的PAF-R(Valone(1988)J.Immunol.140：2389-2394)，其被报道存在于小胶质细胞。PC12细胞系不表达可检出的PAF-R。Brewer et al.， (2002)J.NeuroChem 82：1502-1511。将10²-10⁵CFU的肺炎球菌加入这些细胞系中，在6孔或24孔组织培养板上37℃培养15分钟到6小时之间，然后广泛洗涤细胞并分析附着的肺炎球菌。为测定细胞的内摄作用，用青霉素和庆大霉素洗涤细胞2小时，然后接种至血琼脂平板或层铺于41℃含0.5％酵母提取物的Todd Hewitt肉汤琼脂。使用的这两种细胞系反映了通常见于CNS的PAF-R的体内表达。活化的小胶质细胞和P388D1细胞系一样均大量表达PAF-R受体，而神经细胞如PC12细胞系不表达或仅由个别的神经亚群表达低水平的该受体。Mori et al.，(1996)J.Neurosci 16：3590-3600；Bennett et al.，(1998)Cell Dath Differ.5：867-875。两种细胞系均有肺炎球菌附着说明PAF-R对于附着是非必需的，还有其它受体。还测试了TIGR4的不透明和透明的变种及nanA-、nanB-突变体和nanA/nanB双突变体相对于观察到的野生型TIGR4菌株对这些细胞系的附着力。为进一步分析PAF-R与神经节苷脂在肺炎球菌附着中的作用，将1029bp的人PAFR的开放阅读框转染到缺少PAF-R的COS-7细胞系(Gerard and Gerard(1994)J.Immunol.152：793-800；Honda et al.，(1992)J.Lipid Med.5：105-107)中，该转染使用如早先报道的pcDNA3.1/GS质粒(Brewer et al.，(2002)J.Neuro Chem 82：1502-1511，其中教导的方法全部作为参考文献在此纳入本文)和Tranfast试剂(Promega)。只使用该质粒作为对照并在存在或缺少PAF-R的条件下对影响肺炎球菌附着的参数进行了分析。此实验提供了明确的关于PAF-R对附着的重要性的数据。在缺少PAF-R的细胞系上的附着都通过神经节苷脂介导而后被与神经节苷脂的预培养所阻碍。为进一步确定肺炎球菌附着和穿透上皮细胞的能力，使用了Detroit 562人咽部上皮细胞系(ATCC)和A549人肺部上皮细胞系(ATCC)并使用transwell***。使用

培养(Millipore，Billerica，Mass.)嵌入平板使上皮细胞系生长融合。融合通过使用Millipore

电阻抗***测量经上皮电阻而测定。阻抗达到至少500Ω/cm²表明获得完全融合的单层上皮细胞。这些上皮细胞暴露于肺炎球菌以测试肺炎球菌附着、进入和穿透上皮细胞层的能力。为区分附着和摄入，洗涤该上皮细胞并用含青霉素和庆大霉素的培养基培养2小时。初始的重点在于TIGR4菌株、其nanA和nanB突变体及其双突变体。通过连续传代，直到获得体内攻击后也不逆转的稳定变种，用此方法已经获得了TIGR4菌株的透明和不透明的稳定变种。比较了这些TIGR4变种附着、进入和穿过上皮细胞的能力。以EMEM培养基以每孔10³-10⁶CFU的数量铺板。在0.5、1、2、4、8和24小时时收集上皮细胞层上方和下方的培养物并分析CFU。洗涤细胞层5-6次，然后在细胞层上铺含0.5％酵母提取物和0.5％琼脂并冷却至41℃的Todd Hewitt肉汤培养基来测定结合于单细胞层的肺炎球菌CFU。将其置于37℃、5％CO₂条件下培养过夜，然后进行CFU计数。分析细胞系PAF-R的表达。这些细胞系的总RNA用如下两个引物通过RT-PCR进行分析：PAF-1(5′-CCGATACACTCTCTTCCCGA-3′(SEQ ID NO：3)；151到170核苷酸)和PAF-2(5′-ACAGTTGGTGCTAAGGAGGC-3′(SEQ ID NO：4)；970到951核苷酸)，得到838bp的PCR产物(Stengel et al.，(1997)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17：954-962，其中教导的方法全部在此纳入本文)。如果存在PAF受体，则在培养物中加入例如奥替溴胺(octylonium bromide)(Biomol Research Laboratories，Inc.Plymouth meeting，PA)或PAF(Biomol)等PAF受体抑制剂来测定PAF-R在上皮细胞附着和穿透过程中的作用。奥替溴胺以高亲和力结合PAF-R。或者使用上述的COS7细胞来实现此目的，比较存在和不存在PAF-R时肺炎球菌的附着。

不同肺炎球菌菌株的侵害程度与Transwell***中顶端和底外侧区室的炎性细胞因子的产量相关。收集不同时间点的上层和下层区室培养上清液并用ELISA(BD PharMingen)分析测定炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的浓度。上皮单细胞层用乙醛固定，并使用PspA特异性免疫荧光染色法分析细胞内的肺炎球菌的存在，该方法与前述的使OB中的肺炎球菌可见的方法相似。荧光图像通过装有合适的滤光立方体(Chromtechnology，Battleboro，VT)的Leica/Leitz DMRB显微镜可见，其方法如前所述(Martin et al.，(1998)J.Immunol.160：3748-3758，其中教导的方法作为参考文献在此处纳入本文)。图像由C5810数码彩色相机(Mamamatsu Photonic System)采集并由Adobe photoshop和IP LAB Spectrum软件进行处理。

结果

NanA和NanB突变体的建群

通过鼻内(i.n.)感染的小鼠和被NanA突变体菌株感染的小鼠的鼻洗出物中分离的肺炎球菌细胞数量的比较来评估NanA突变体对肺炎链球菌在CBA/N小鼠鼻咽建群能力的影响。实验包括三个不同的肺炎球菌菌株以研究NanA突变对不同的荚膜血清型和遗传背景的菌株的影响。TIGR4/NanA-(JW001)、EF3030/NanA-(SAM001)和D39/NanA-(JCP001)的荚膜型分别为4、19F和2(表4)。在荚膜型为4的临床分离株即TIGR4的情况下，编码LPETG(SEQ ID NO：13)基序的序列前有一个终止密码子。如果没有该基序，NanA可预期被TIGR4分泌到环境中。检查另外4个目前可用的肺炎球菌NanA序列：G54(19F型)、R6(2型)、西班牙23F和670(6B型)(Berry et al.Gene 71：299-305；Hoskins et al.2001J.Bacteriol.183：5709-17；Tettelin et al.2001Science 293：498-506)，显示它们具有用于共价结合于细胞壁的LPXTG(SEQ ID NO：14)基序(图5)。所以，这里包括的菌株提供了NanA为分泌型和表面结合型的菌株突变的比较。

在TIGR4和EF3030的NanA突变体中都观察到了建群的显著减少(图6和7)。

肺炎链球菌还表达另一种神经氨酸酶NanB。相对于NanA来说，NanB之间具有类似程度的同源性。NanB与NanA有43％的同源性(24％相同)。两种蛋白共有的残基显示为唾液酸酶(Berry et al.1996J.Bacteriol.178：4854-4860)。发现NanB的最适pH值为4.5，而NanA的最适pH值为6.5和7之间。但即使在其最适的pH值下，NanB作为唾液酸酶的活性也只有NanA在其最适pH值下活性的1％。即便如此，为观察NanB对于建群和CNS的直接侵害的必要性，从TIGR4遗传背景中构建了NanB缺陷的突变体菌株TIGR4/NanB-(JW002)和缺乏NanA和NanB表达的菌株TIGR4/NanAB-(JW003)。用JW002感染小鼠导致与TIGR4菌株几乎相同水平的建群(图8)。而且双突变体与NanA突变体相比，其建群也没有显著的减少(图9)。

肺炎球菌进入CNS

为跟踪肺炎链球菌向鼻组织(包括嗅神经)的移动，检测了嗅球和脑残留物中肺炎链球菌的存在。不论其遗传背景如何，NanA突变体相对于野生型菌株在鼻组织和嗅球中的数量显著下降。在杀死小鼠时，所有小鼠都经过放血而且在血液中没有发现可检出的肺炎球菌(＜12CFU/毫升血液)，这表明肺炎球菌是从鼻腔直接进入CNS组织的。NanB突变体对肺炎球菌进入鼻部组织或嗅球没有影响(图8)。

NanA突变体在鼻咽和CNS中建群和存留的能力明显减弱。这可在荚膜血清型和表面NanA附着情况均不同的菌株中观察到。虽然NanA仅是影响细菌细胞表面和宿主之间结合的众多表面结构中的一个，但是它却是鼻携带和肺炎球菌靶向至CNS关键的因素。破坏NanA会显著减少建群和靶向至CNS。在TIGR4和EF3030中都观察到了所述结果。

EF3030(19F型)菌株在鼻咽中可高效地建群一个月以上。然而，尽管EF3030的存留能力很强，在NanA的突变也可显著减少鼻中肺炎球菌细胞的数量。这种衰减在TIGR4/NanA-菌株中更为明显，该菌株从鼻洗出液中分离的细胞的数量在14天后下降至接近检出限的水平。

在天然的环境中肺炎球菌与其他菌种共存。因此NanA的其它功能可能包括改变宿主蛋白质的功能和增加携带的长期稳定性。NanA还可能增强肺炎球菌与包括脑膜炎双球菌(N.meningitidis)和流感杆菌(H.influenzae)的其他口腔微生物的竞争能力或将宿主的糖蛋白作为碳源使用。

虽然这些研究的主要结果显示NanA的表达是在小鼠中最适携带的必要条件，但是这些数据也显示缺少NanA的肺炎球菌在嗅球中也有很少量的存在。从这点上很难得知活性的NanA对于肺炎链球菌在CNS组织中的存活是否重要。虽然从这些组织中收回的NanA突变体的数量比其亲本少得多，但是它们确实在神经组织中的存在证明了当肺炎球菌进入脑时NanA的额外的致病力。在OB中神经氨酸酶突变体水平的下降极有可能是由下降的携带导致。这个发现指出了这样一个原理：携带是更多侵害性疾病的前提条件，例如NanA免疫这样可以减少携带的干预可以保护，防止肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症。

在已知的nanA序列中，TIGR是唯一不含表面锚定序列的。在这个菌株中，移码突变造成了该分子在LPETG(SEQ ID NO：13)基序前被截短(Tettelin et al.2001Science 293：498-506)。对于大部分菌株而言，NanA的很重要的一部分预期可通过分选酶(sortase)共价附着于细胞壁(Mazmanian et al.1999Science 285：760-63)，这可在电子显微镜照片中检出(Camara et al.Infect.Immun.62：3688-95)。在这些研究中，TIGR4和EF3030一样表现出在嗅球中的NanA依赖性携带和存在。从NanA活性定位于上清液或是细菌沉淀的研究中显示，与TIGR4不同，EF3030的NanA活性是细胞关联的。因此，NahA不论其为表面结合型还是分泌型均可以利于建群。

实施例3

神经节苷脂在肺炎链球菌病理学中的作用

在分离ON/E之前的15、30和60分钟，将纯化的神经氨酸酶NanA(Calbiochem)以1、10和50μg的药量在10μl PBS中鼻部给药。组织以4％多聚甲醛固定并做石蜡切片。先用生物素化-CT-B其后用链霉亲和素-FITC对GM1染色并分析了染色密度。还使用了罗丹明(rodamine)偶联的无唾液酸基GM1特异性抗体对切片染色以确定在这些组织中GM1染色的减少与无唾液酸基GM1染色增加是同时发生的。用相同手段处理平行组的小鼠，并分析了1天和4天的肺炎链球菌TIGR4和EF3030菌株的建群以确认神经氨酸酶处理会导致鼻建群水平的提高。由鼻部给予小鼠高剂量的EF3030菌株(1×10⁸CFU)，在鼻部攻击后下列时间间隔分离ON/E：1、3、6和12小时、1和4天。ON/E以上述方法染色并分析GM1和无唾液酸基GM1的表达。如果在鼻组织中观察到GM1的减少和无唾液酸基GM1的增加，则还要测试NanA-和NanB-缺陷型菌株，因为它们预期不会改变GM1在鼻道中的表达。唾液酸残基的移除暴露出了近末端的二糖β-D-吡喃半乳糖基-(1-3)N-乙酰-D-半乳糖胺，其表现为PNA高亲和力的Thompson-Friedenreich抗原的免疫显性簇。因此，ON/E中PNA结合位点的变化是神经氨酸酶活性的另一种量度。这些组织制成的冷冻切片可以容易的被PNA-FITC或PNA-HRP(Medac，Hamburg，Germany)染色，就可基于显微镜测定PNA结合位点中是否有提高(Black et al.，(2000)Pediatr.Infect.Dis J.19：187-195；Klein et al.(1978)Klin.Wochenschr.56：761-765，其中教导的方法全部内容作为参考文献在此纳入本文)。

在以TIGR4或EF3030菌株鼻部给药前将GM1位点特异性地阻断。上述目的可通过以下三种方式达到，使用：1)CT-B对非神经节苷脂对照蛋白如卵清蛋白，2)GM1的抗体(Calbiochem)对正常的兔免疫球蛋白，或3)在UAB Protein Analysis and Peptide Synthesis Core Facility中合成的GM1特异性肽。使用GM1特异性肽进行抑制是最佳手段，因为CT-B以及有可能GM1的抗体预计会引起并发炎症。在这些实验中，在肺炎球菌CFU施用后1天和4天时分析ON/E和OB。一个阻断GM1的备选方案是使用由噬菌体展示十五肽文库筛选GM1结合肽而发现的GM1结合肽。该GM1结合肽VWRLLAPPFSNRLLP(SEQ ID NO：5)对GM1具有高亲和力(10¹⁰M^-1)，并且其IC₅₀为1.0μM.Matsubura et al.，(1999)FEBS Letters 456：253-256。使用与其相同长度和氨基酸构成的随机选择序列的肽作为对照。在体内使用以前用ELISA确定了两种多肽的GM1结合能力。最初，将100μg的两种多肽置于10μl林格氏液或PBS中鼻部给药，10分钟后施用3×10⁶CFU的EF3030菌株。分析施用后1天和4天的ON/E中相对于未处理的CBA/N小鼠的CFU数量。

使用PAF(Biomol Research Laboratories，Inc.Plymouth meeting，PA)和PAF-R拮抗剂奥替溴胺(Biomol)进行阻断实验。该化合物以高亲和力结合PAF-R。分别测试了每一个神经节苷脂。在攻击后1和4天测试了混合的神经节苷脂、无唾液酸基GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)和GM3(Sigma)抑制鼻部建群的能力。多种神经节苷脂能够阻断这一过程。由于GM3神经节苷脂缺少公布的C-多糖结合基序，所以它被用作阴性对照。从神经节苷脂预培养的EF3030建群的数据来看，混合的神经节苷脂对建群的阻断比无唾液酸基GM1更有效。这说明不只是无唾液酸基GM1，其他神经节苷脂也与肺炎球菌在鼻道、肺部和脑中的建群过程有关。这些神经节苷脂抑制研究着重于TIGR4菌株及其神经氨酸酶突变体。在神经节苷脂包被的ELISA平板上TIGR4菌株的体外短期培养证明TIGR4菌株与无唾液酸基GM1有附着作用。肠毒素提供了另一种有差异地阻断鼻道中肺炎球菌-神经节苷脂相互作用的手段。CT和LTh-1均为血清群I不耐热肠毒素(Pickett et al.，(1986)J.Bacteriol 165：348-352)，并且显示类似但稍有差异的神经节苷脂结合特性。Fukuta et al.，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。CT(List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，CA)结合GM1并且较少程度的结合GD1b。LTh-1优先结合GM1和GD1b并且较弱地结合GM2和无唾液酸基GMl。Fukuta et al.，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。如果GM1是与肺炎链球菌相互作用的主要的神经节苷脂，使用LTh-1不仅能阻断GM1神经节苷脂，也能阻断代表不需要神经氨酸酶活性的天然低频率结合位点的无唾液酸基GM1。来自血清群II的不耐热肠毒素显示了不同的神经节苷脂结合特异性，尤其是不耐热肠毒素LT-II b。这种毒素结合GD1a并且较少程度地结合GT1b，而且显示对GM1没有亲和力。Fukuta et al.，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。LT-II a以高亲和力结合GD1b，并以较低的亲和力结合GM1、GT1b、GQ1b、GD2、GD1a和GM2。Fukuta et al.，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。LT-II毒素由T.D.Connell博士友情提供。为研究最佳的鼻部药剂量和最佳的观察对肺炎球菌附着于ON/E的抑制的时间段，首先对在鼻部施用肺炎链球菌过程中给予的所选肠毒素进行剂量响应试验(1.0或10μg)。如果在4天时观察到了对鼻建群的抑制，则观察持续至11天，在这过程中每两天给予一次肠毒素。测定CBA/N小鼠的ON/E和OB中的CFU。

实施例4

C-多糖特异性抗体在肺炎球菌病理学中的作用

肺炎球菌C-多糖，也被称为磷壁酸，在结构上与亦被称为脂磷壁酸质的肺炎球菌F-抗原相同。Fischer et al.(1993)Eur.J.Biochem215：851-857。这是肺炎链球菌区别于其它革兰氏阳性菌的独特特征。这些分子上的免疫显性决定子是磷酸胆碱(PC)残基，PC的抗体对于腹腔内或鼻部的肺炎球菌的攻击有保护作用。Briles et al.，(1984)Eur.J.Immunol.14：1027-1030；Briles et al.，(1981)Nature 294：88-90；Yother et al.，(1982)Infect.Immun.36：184-188；Briles et al.，(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1：305-309。因此，研究了由被动转移或主动鼻部免疫而得到的PC特异性抗体的作用。对于保护性PC特异性抗体的被动转移，即使用了IgG3(59.6C5)和同种型IgM(22.1A4)的T15个体基因型单克隆抗体。Briles et al.，(1981)Nature 294：88-90。 T15个体基因型对于肺炎球菌在小鼠中的感染显示出比M603或M511个体基因型更强的保护作用(Briles et al.，(1984)Eur.J.Immunol.14：1027-1030)，推测和它与C-多糖更高效的结合相关。被动抗体转移包括与鼻部施用肺炎球菌一起直接施用T15抗体(100μg)和对比于静脉内或腹腔内给予抗体的鼻建群的减少。随时间(4、11、18天)观测建群，如果在这些实验中不同组之间没有观察到显著差异，则每两天鼻部施用单克隆抗体(20μg)一次。CBA/N小鼠不产生T15个体基因型抗PC抗体。被动转移抗PC抗体预期不会诱导鼻道内的粘膜IgA或其他同种型的PC特异性抗体。为诱导鼻内抗体使用了两种不同的手段。一种是直接在鼻部施用经蛋白酶处理的R36A菌株，已知它可以诱导针对C-多糖的抗体反应。虽然研究了抗PC抗体的保护性免疫，但没有得到关于它在例如鼻道的粘膜表面的作用的结果。CBA/N小鼠的X染色体联锁的免疫缺陷导致其不能产生T15个体基因型的抗PC抗体。为研究不能产生该抗体的重要性，将CBA/N小鼠与其相应的野生型CBA/J小鼠(Jackson Laboratories)相比较。为诱导抗PC抗体的R36A菌株的免疫包括表面蛋白的蛋白水解移除。Krause(1970)Adv.Immunol.12：1-56。另一备选的鼻部免疫手段为将PC与钥孔虫血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)相耦合，其方法已有叙述(Krause(1970)Adv.Immunol 12：1-56；Chesebro and Metzger(1972)Biochemistry 11：766-771，其中教导的方法作为参考文献在此纳入本文)。将PC-KLH与粘膜佐剂CT一起进行鼻部免疫以获得最佳的粘膜免疫反应。小鼠在末次免疫的2-3周后接受攻击以避免CT对建群的影响。一周的时间间隔内进行三次鼻部免疫。使用C-多糖和PC特异性ELISA以本领域技术人员常用的方法测定血清抗体的效价。在PC特异性ELISA中，PC与BSA按先前叙述的方法相配对(Chesebro and Metzger(1972)Biochemistry 11：766-771，其中教导的方法作为参考文献在此纳入本文)。测量了不仅是血清中，还有鼻洗出物、唾液、支气管洗出物中的抗体效价。这些分析包括IgA、IgM、IgG和IgG亚类在粘膜分泌物和血清中的分布。诱导最佳粘膜抗体效价的实验步骤被用来进行TIGR4菌株的粘膜攻击研究，对小鼠鼻部给药约5×10⁶CFU然后在4天和11天监测建群。在免疫研究中正常的、具有完全免疫能力的小鼠(CBA/J系)同CBA/N小鼠一起用于前述研究。Wallick et al.，(1983)J.Immunol.130：2871-2875。

实施例5

神经氨酸酶特异性抗体在肺炎链球菌病理学中的作用

为在鼻攻击前鼻部免疫小鼠，使用了市售的肺炎链球菌产生的神经氨酸酶(Calbiochem)。然而，为获得足量的用于计划研究的蛋白质，使用含有组氨酸标记的表达载体(Invitrogen)在大肠杆菌中克隆和表达NanA基因。在CT存在或不存在的条件下使用经3.4％甲醛处理过的神经氨酸酶和未经处理的神经氨酸酶进行鼻部免疫并进行对比，以便获得最佳的粘膜免疫反应。在CBA/N和CBA/J小鼠中都进行了上述免疫。进行三次鼻部免疫，每两次之间相隔一周，其间用ELISA监测血清和唾液的抗体效价。免疫过的小鼠用TIGR4菌株攻击并在4天和11天比较其ON/E、OB、脑、血液、脾脏和肺部的建群。为阻断宿主的相互作用，还同时诱导了神经氨酸酶和C-多糖特异性抗体。使用了神经氨酸酶鼻部免疫和T15个体基因型单克隆抗体转移的被动免疫保护的组合疗法。

实施例6

神经氨酸酶-PC结合物对肺炎链球菌鼻部攻击的保护效力

以CT作为鼻部佐剂，使用神经氨酸酶和PC-KLH免疫小鼠，在11天时评估其对比于每个抗原单独免疫时的保护作用的增加和EF3030与TIGR4菌株鼻建群的减少。另外，用前述方法分析了鼻洗出物、唾液和血清中的抗体效价以找出免疫参数和在鼻道中针对肺炎球菌的保护程度的关联。为产生最佳的免疫反应，将磷酸胆碱直接与神经氨酸酶相配对。在鼻部和全身性免疫后的CBA/N和CBA/J小鼠中，使用或不使用CT作为佐剂运送该构建体测试了其免疫原性。用ELISA测定了鼻洗出物、唾液和血浆中的抗体效价。使用10⁷CFU的EF3030菌株或10⁶CFU的TIGR4进行了攻击研究。小鼠在攻击后11天被处死并分析其血液、鼻洗出物、ON/E、OB和脑中观察到的CFU。神经氨酸酶与PC的配对免疫通过提高粘膜和全身的针对这两种致病组分的抗体的水平来增强保护作用。使用其他的粘膜佐剂会改变抗原特异性IgG的亚类分布。CT产生Th2-、LT、混合的Th2/Th1-和例如DNA寡核苷酸(ODN)1826的CpG基序Th1-型反应并有相关的IgG亚类分布的改变。不同的佐剂进一步提高神经氨酸酶-C-多糖特异性免疫针对肺炎链球菌的鼻建群的保护能力，并可能产生新的肺炎球菌疫苗的配方。

实施例7

抗磷酸胆碱特异性单克隆抗体对鼻部攻击后肺炎链球菌鼻建群的抑制

将总共1×10⁶CFU的TIGR4菌株与5μg抗磷酸胆碱单克隆抗体的IgG3亚类或IgM同种型共培养。每鼻孔共给药5μl。示出的是施用后分别在9和12小时的500ml鼻洗出物中的CFU。对两种单克隆抗体都观察到了显著的80％以上的下降。示出的是每组五只小鼠的平均值+SD。数据示于图10。

实施例8

肺炎链球菌鼻部施用后的神经损伤和炎症

分离了在鼻部施用肺炎链球菌EF3030菌株后1、3、7和14天的小鼠的ON/E、OB和脑，并用组织学方法分析了炎症反应。比较了D39或TIGR4菌株与其nanA突变体菌株产生炎症反应的能力。在处死小鼠时，在25℃用PBS灌注小鼠，然后再用10ml Zamboni固定剂(4％多聚甲醛、15％苦味酸溶于0.1M磷酸缓冲液)灌注。取出OB和ON/E并置于新制的4％多聚甲醛(PFA)中于4℃过夜。将组织转移至30％蔗糖溶液中置于4℃48小时，以使其在切片之前受到冷冻保护。将组织在OCT中冷冻，并将切片(6μm)置于预先包被好的显微载玻片上(10％BSA的盐溶液)。首先，使用苏木精和伊红(H&E)染色来检出在这一过程中OB、三叉神经节和ON/E中任何渗入的炎性细胞。对神经生长因子β1(NGF-β1)染色来评估神经损伤。在神经损伤后会产生NGF-β1，其功能是阻止细胞凋亡和刺激神经细胞的新生长。三叉神经节和OB切片用0.2μg/ml浓度的生物素化兔抗人NGF-β1抗体染色。抗体染色的切片在4℃培养过夜。用PBS洗涤载玻片并用亲和素-生物素-复合物(ABC)Vectastain试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)在25℃反应30分钟。再用PBS洗涤组织三次，如前所述与二氨基联苯(DAB)反应5-10分钟。再洗涤载玻片三次，并用C.S.苏木精复染色30秒。在用H₂O洗涤后，将载玻片用100％乙醇和二甲苯脱水。NGF-β1的增多表示了神经组织损伤的程度。涉及神经的另一个标志是小胶质细胞的活化。激活的小胶质细胞显示为变形虫样、球形，而休眠的细胞(处于G₀/G₁期)显示为树枝状分枝形。这种活化引起的改变使人能够分辨休眠的和活化的小胶质细胞。对于小胶质细胞，使用F4/80抗体或抗MAC-1(MI/70)抗体来确定肺炎链球菌攻击后的活化状态。除神经损伤和小胶质细胞活化之外，还评估了OB中细胞凋亡的诱导。为此，分析了Asp-Glu-Val-Asp特异性蛋白酶——活性半胱天冬酶3的诱导，因为该酶在细胞凋亡途径的启动中很重要。在免疫组织化学分析中可使用特异性针对活性半胱天冬酶3的抗体(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)来检测细胞凋亡。如果用免疫组织化学方法检出了神经组织中的半胱天冬酶3的活性，则使用半胱天冬酶3分析试剂盒(Molecular probes，Eugene，OR)基于底物蛋白水解后诱导的荧光信号来定量分析其活性。

实施例9

肺炎链球菌通过逆向轴突运输靶向嗅球的能力

首先，评估了鼻部和静脉内接种的小鼠的神经组织、OB和脑中肺炎球菌的积累。静脉内接种后，神经组织中的任何肺炎球菌都是通过血液进入的。收集了鼻部攻击后1、4、11和18天的组织。在这种情况下脑和OB的每克组织中的细菌数量应该在注入后所有的时间点都相近。但是与之相反，鼻内接种后通过鼻道进入的细菌在OB中的累积(以每份组织重量表示)先于并保持领先于脑中观察到的累积。

其次，进行了鼻部攻击后肺炎球菌的体内成像。用锝-99(Tc-99m)标记的TIGR4的稳定的不透明和透明变种、EF3030和缺少nanA和/或nanB的TIGR4突变体，按照最初由Waibel et al.(1999)Nature Biotechno1.17：897-901描述的腺病毒的方案，用前述的伽玛照相机成像使这些菌株在小鼠中的存在显像。通过这种手段，由于这种同位素的半衰期很短(6小时)，可以获得鼻部施用后大约前24小时的图像，还可以分析在鼻道内发生的早期事件。为获得肺炎球菌的长期成像，使用了表达荧光素酶或GFP的肺炎球菌EF3030(或TIGR4)菌株来使生物发光在体内显像。使用了Xenogen公司(Alameda，California)市售的表达荧光素酶的肺炎球菌EF3030菌株。以前就报道过这种肺炎球菌菌株的成功的体内成像。使用生物发光成像***(IVIS system，Xenogen，Inc.)对小鼠成像来检测荧光素酶的表达。总是在腹腔内注射2.5mg荧光素后10分钟，采集定位于相同位置的小鼠的图像。在成像过程中，小鼠保持在37℃并被安氟醚麻醉。从小鼠在被表达荧光素酶的肺炎球菌鼻部攻击后2天开始至18天，每只小鼠进行数次成像。成像的图像采集时间为20秒至10分钟之间。数据采集软件确保在图像采集过程中没有像素点是饱和的。用Xenogen提供的软件定量分析感兴趣的区域的光发射(相对光子/秒)。光发射的强度由生物发光图像的假色比例(pseudocolor scaling)代表。生物发光图像通常层叠于同时采集的小鼠的黑白照片上。所述的体内成像研究着重于分析肺炎球菌从鼻道进入OB的能力。该生物发光研究还扩展到转荧光素酶基因成功的nanA TIGR4突变体中。

贯穿于本申请引用了多种出版物。这些出版物的公开全文作为参考文献纳入本申请中，以便完整的描述本发明所述的化合物、组合物和方法。

可对本发明所述的化合物、组合物和方法进行各种修改和变动。通过考虑本发明在此所公开的化合物、组合物和方法的说明书和实施，本发明所述的化合物、组合物和方法的其他方面是显而易见的。本说明书和实施例的意图应仅看作示例性用途。

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Claims

1.一种组合物，包括肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸质的磷酸胆碱或其抗原性部分和可药用载体，其中该组合物适用于给药至粘膜表面。

2.权利要求1的组合物，其中该组合物为鼻腔喷剂。

3.权利要求1的组合物，其中该组合物为喷雾溶液。

4.权利要求1的组合物，其中该组合物为气雾吸入剂。

5.一种容器，包括权利要求1的组合物。

6.权利要求5的容器，其中该容器为鼻腔喷雾器。

7.权利要求5的容器，其中该容器为雾化器。

8.权利要求5的容器，其中该容器为吸入器。

9.权利要求1的组合物在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内产生特异性针对肺炎球菌神经氨酸酶的抗体。

10.权利要求1的组合物在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内减少肺炎球菌的鼻携带。

11.权利要求1的组合物在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内减少或防止肺炎球菌的感染。

12.权利要求11的用途，其中该肺炎球菌感染为脑膜炎。

13.权利要求11的用途，其中该肺炎球菌感染为中耳炎。

14.权利要求11的用途，其中该肺炎球菌感染为肺炎。

15.权利要求11的用途，其中该肺炎球菌感染为溶血性***。

16.一种组合物，包括肺炎球菌磷壁酸或肺炎球菌脂磷壁酸质的非磷酸胆碱抗原性部分和可药用载体，其中该组合物适用于给药至粘膜表面。

17.权利要求16的组合物，其中该组合物为鼻腔喷剂。

18.权利要求16的组合物，其中该组合物为喷雾溶液。

19.权利要求16的组合物，其中该组合物为气雾吸入剂。

20.一种容器，包括权利要求16的组合物。

21.权利要求20的容器，其中该容器为鼻腔喷雾器。

22.权利要求20的容器，其中该容器为雾化器。

23.权利要求20的容器，其中该容器为吸入器。

24.权利要求16的组合物在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内产生特异性针对肺炎球菌神经氨酸酶的抗体。

25.权利要求16的组合物在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内减少肺炎球菌的鼻携带。

26.权利要求16的组合物在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内防止肺炎球菌的感染。

27.权利要求26的用途，其中该肺炎球菌感染为脑膜炎。

28.权利要求26的用途，其中该肺炎球菌感染为中耳炎。

29.权利要求26的用途，其中该肺炎球菌感染为肺炎。

30.权利要求26的用途，其中该肺炎球菌感染为溶血性***。

31.一种组合物，包括磷酸胆碱抗体或其片段和可药用载体。

32.权利要求31的组合物，其中该组合物适用于给药至粘膜表面。

33.权利要求31的组合物，其中该组合物为鼻腔喷剂。

34.权利要求31的组合物，其中该组合物为喷雾溶液。

35.权利要求31的组合物，其中该组合物为气雾吸入剂。

36.一种容器，包括权利要求31的组合物。

37.权利要求36的容器，其中该容器为鼻腔喷雾器。

38.权利要求36的容器，其中该容器为雾化器。

39.权利要求36的容器，其中该容器为吸入器。

40.一种磷酸胆碱的抗体或其片段在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内减少肺炎球菌的鼻携带。

41.权利要求40的用途，其中该药剂在给药时与受试者的鼻粘膜相接触。

42.一种磷酸胆碱的抗体或其片段在药剂制备中的用途，所述药剂可在受试者体内防止肺炎球菌的感染。

43.权利要求42的用途，其中该药剂在给药时与受试者的鼻粘膜相接触。