CN107429237B - Cmp依赖性的唾液酸酶活性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有N‑端截短缺失或内部缺失的某些糖基转移酶变体的性能。在有作为共底物的CMP‑活化的唾液酸存在下和在有合适的受***点存在下，在这里公开的任何突变体表现出α‑2,6‑唾液酸转移酶酶活性。在本发明中记录的一个基本发现是，这样的酶不仅能够催化唾液酸基（sialidyl）部分的转移，而且它们还能够催化来自聚糖的在末端结合的唾液酸的水解裂解。具体地，发现在有胞苷‑5’‑单磷酸(CMP)存在下，糖基转移酶活性被抑制，且唾液酸酶活性被刺激。发现唾液酸酶活性依赖于氨基酸的特定段(位置90‑108)在参考(野生型)hST6Gal‑I多肽的多肽序列中的存在。发现该序列部分在N‑端截短变体中的缺失会消除唾液酸酶活性，特别是在有和没有CMP存在下。因而，公开了采用本文中记录的CMP介导的反馈调节的组合物、用途和方法。

Description

CMP依赖性的唾液酸酶活性

本发明涉及具有N-端截短缺失或内部缺失的某些糖基转移酶变体的性能。在有作为共底物的CMP-活化的唾液酸存在下和在有合适的受***点存在下，在这里公开的任何突变体表现出α-2,6-唾液酸转移酶酶活性。在本发明中记录的一个基本发现是，这样的酶不仅能够催化唾液酸基（sialidyl）部分的转移，而且它们还能够催化来自聚糖的在末端结合的唾液酸的水解裂解。具体地，发现在有胞苷-5’-单磷酸(CMP)存在下，糖基转移酶活性被抑制，且唾液酸酶活性被刺激。发现唾液酸酶活性依赖于氨基酸的特定段(位置90-108)在参考(野生型) hST6Gal-I多肽的多肽序列中的存在。发现该序列部分在N-端截短变体中的缺失会消除唾液酸酶活性，特别是在有和没有CMP存在下。因而，公开了采用本文中记录的CMP介导的反馈调节的组合物、用途和方法。

与以前的发现相反，发现α-2,6-唾液酸转移酶突变体会表现出唾液酸酶酶活性，特别是(但不限于)具有涉及各种野生型多肽的前89个N-端氨基酸的截短缺失的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (hST6Gal-I；野生型氨基酸序列参见SEQ ID NO:1)的变体(即具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的突变体)。在本发明中记录的一个基本发现是，该突变体酶不仅能够催化唾液酸基（sialidyl）部分的转移；实际上，所述α-2,6-唾液酸转移酶变体还能够催化来自聚糖的在末端结合的唾液酸的水解裂解。本发明进一步报告了反馈抑制的意外观察结果。具体地，发现在有胞苷-5’-单磷酸(CMP)存在下，糖基转移酶活性被抑制，且唾液酸酶活性被刺激。甚至更惊人的是，发现不仅涉及前89个N-端氨基酸的缺失突变体、而且人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (hST6Gal-I)的其它N-端截短变体会表现出唾液酸酶酶活性。但是，发现唾液酸酶活性依赖于氨基酸的特定段(位置90-108, 参见图1)在根据SEQ ID NO:1的参考(野生型) hST6Gal-I多肽的多肽序列中的存在。发现该序列部分在N-端截短变体中的缺失会消除唾液酸酶活性，特别是在有和没有CMP存在下。因而，公开了采用本文中记录的CMP介导的反馈调节的组合物、用途和方法，具体地涉及在N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分中的α2,6糖苷键的受控水解。此外，公开了关于CMP-不敏感的hST6Gal-I的组合物、用途和方法。

背景技术

转移酶(EC 2)催化官能团从一种物质向另一种物质的转移。糖基转移酶（酶的一个超家族）参与合成糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物部分。特定糖基转移酶通过活化的糖供体的单糖部分向受体分子的连续转移而合成寡糖。因此，“糖基转移酶”催化糖部分从它的核苷酸供体向多肽、脂质、糖蛋白或糖脂的受体部分的转移。该过程也被称作“糖基化”。碳水化合物部分（其为例如糖蛋白的结构部分）也被称作“聚糖”。聚糖构成所有已知的翻译后蛋白修饰的最流行部分。聚糖参与多个生物识别过程，多样化如粘附、免疫应答、神经细胞迁移和轴突延伸。作为糖蛋白的结构部分，聚糖还在蛋白折叠以及蛋白稳定性和生物活性的支持中起作用。

在糖基转移酶催化中，单糖单元葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)和木糖被活化为尿苷二磷酸(UDP)-α-D衍生物；***糖被活化为UDP-β-L衍生物；甘露糖(Man)和岩藻糖分别被活化为GDP-α-D和GDP-β-L衍生物；且唾液酸(= β-D-Neu5Ac; = Neu5Ac; = SA; =NANA)被活化为唾液酸的CMP衍生物。CMP-活化的唾液酸(= CMP-β-D-Neu5Ac, 参见下文)似乎是呈单磷酸核苷酸形式的唯一天然存在的核苷酸糖。

许多不同的糖基转移酶为聚糖的合成做出贡献。糖蛋白的碳水化合物部分的结构多样性是特别大的，并且由复杂的生物合成途径确定。在真核生物中，糖蛋白的聚糖部分的翻译后生物合成发生在内质网(“ER”)的腔和高尔基体中。糖蛋白的单个(支链或直链)碳水化合物链通常是N-或O-连接的聚糖。在翻译后加工过程中，碳水化合物通常经由天冬酰胺(“N-连接的糖基化”)或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)连接至多肽。聚糖（无论是否N-或O-连接的(= “N-/O-连接的”)）的合成由几种不同的膜锚定的糖基转移酶的活性实现。一种糖蛋白可能包含一个或多个聚糖连接的氨基酸(=“糖基化位点”)。一种具体的聚糖结构可以是直链的或支链的。分支是碳水化合物的一种显著特征，其不同于DNA、RNA和多肽的典型直链性质。与它们的基础结构单元单糖的大异质性组合，聚糖结构表现出高多样性。此外，在特定糖蛋白种类的成员中，与特定糖基化位点连接的聚糖的结构可以变化，从而导致各个糖蛋白种类的微观不均一性，即在共享多肽部分的相同氨基酸序列的种类中。

唾液酸转移酶(= “ST”)是催化唾液酸残基从供体化合物向以下基团的转移的糖基转移酶：(i)糖脂或神经节苷脂的末端单糖受体基团，或(ii)糖蛋白的N-/O-连接的聚糖的末端单糖受体基团。为了本发明的目的，所述供体化合物也被称作“共底物”。对于包括人ST种类的哺乳动物唾液酸转移酶，存在一种共同的供体化合物，其为胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸(= CMP-β-D-Neu5Ac = CMP-Neu5Ac = CMP-NANA; = CMP-唾液酸; = CMP-SA)。技术人员众所周知，CMP-唾液酸是唾液酸转移酶的供体化合物的一个具体实施方案；此外，存在功能等同物，包括、但不限于CMP-9-荧光素基-唾液酸。唾液酸残基(或其功能等同物)向受***点的转移和共价偶联也被称作“唾液酸化”。

在唾液酸化的糖蛋白的聚糖结构中，(一个或多个)唾液酸基部分经常存在于寡糖的末端位置。因而，取决于唾液酸化的位点的量，一个或多个唾液酸残基可以形成给定糖蛋白的聚糖部分的组成部分。由于末端，即暴露的位置，唾液酸可以参与许多不同的生物识别现象并在不同种类的生物学相互作用中起作用。在糖蛋白中，可能存在超过一个唾液酸化位点，即能够充当唾液酸转移酶的底物且是适合唾液酸残基转移的受体基团的位点。这样的超过一个位点原则上可以是锚定在糖蛋白的不同糖基化位点处的多个直链聚糖部分的末端。另外，支链聚糖可以具有多个可以发生唾液酸化的位点。

根据现有知识，可以发现末端唾液酸残基(i)α2→3 (α2,3)连接至半乳糖基-R，(ii)α2→6 (α2,6)连接至半乳糖基-R，(iii)α2→6 (α2,6)连接至N-乙酰基半乳糖氨基-R，(iv)α2→6 (α2,6)连接至N-乙酰基葡萄糖氨基-R，和(v)α2→8/9 (α2,8/9)连接至唾液酸基（sialidyl）-R，其中-R表示受体底物部分的剩余部分。因此，在唾液酸基缀合物的生物合成中有活性的唾液酸转移酶通常根据它各自的单糖受体底物和根据它催化的糖苷键的3、6或8/9位进行命名和分类。因此，在本领域已知的文献中，例如在Patel RY, 等人,Glycobiology 16 (2006) 108-116中，提及真核唾液酸转移酶，诸如(i) ST3Gal、(ii)ST6Gal、(iii) ST6GalNAc或(v) ST8Sia，取决于当形成糖苷键时向其转移Neu5Ac残基的受体糖残基的羟基位置。还可以以更一般的方式提及唾液酸转移酶，例如作为ST3、ST6、ST8；因而，“ST6”具体地包括催化α2,6唾液酸化的唾液酸转移酶。

二糖部分β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(= Galβ1,4GlcNAc)是糖蛋白的N-连接的聚糖的天线的一种常见末端残基，但是也可以存在于O-连接的聚糖和糖脂中。另外，由于半乳糖基转移酶酶活性，可以在某些靶糖蛋白中产生末端Galβ1,4GlcNAc部分。酶β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶(= “ST6Gal”)能够催化聚糖的末端Galβ1,4GlcNAc受体部分或聚糖的分支（在本领域中也被称作“天线”）的α2,6-唾液酸化。关于其一般方面，参考DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676的文件。在人和其它哺乳动物中，似乎存在ST6Gal的几个种类(同工酶)。本发明特别公开了人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (= hST6Gal-I；根据IUBMB酶命名法的EC 2.4.99.1)及其变体，但是不限于此。

唾液酸转移酶的ST6组包含两个亚组ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活性催化Neu5Ac残基向游离半乳糖基残基的C6羟基的转移，所述游离半乳糖基残基是聚糖或聚糖天线中的末端Galβ1,4GlcNAc的组成部分，由此在聚糖中形成与Galβ1,4GlcNAc部分的半乳糖基残基α2→6连接的末端唾液酸残基。所述聚糖中得到的新形成的末端部分是Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc。

在本文件提交时人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (hST6Gal-I)的野生型多肽在公众可接近的NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)中被公开为“UniProtKB/Swiss-Prot: P15907.1”。包括编码序列在内的其它信息被提供为在数据库条目“Gene ID: 6480”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6480)内编译的超链接。

哺乳动物唾液酸转移酶与其它哺乳动物高尔基体停留的糖基转移酶共享所谓的“II型体系结构”，其具有(i)短细胞质N-端尾巴，(ii)跨膜片段，随后是(iii)可变长度的茎区域，和(iv)面向高尔基体的腔的C-端催化结构域(Donadio S. 等人. Biochimie 85(2003) 311-321)。因此，具有N-端截短缺失的“可溶性的”唾液酸转移酶至少缺乏II型体系结构的元件(i)和(ii)。哺乳动物唾液酸转移酶似乎在它们的催化结构域中表现出显著的序列同源性。关于hST6Gal-I的结构和功能的最近数据公开在Kuhn B. 等人(Biol.Crystallography D69 (2013) 1826-1838)中。

在包括小鼠、大鼠和人类在内的某些哺乳动物中，ST6Gal具有广泛的组织分布。它在肝脏中是特别丰富的，所述肝脏是血清糖蛋白合成的主要部位(Weinstein J. 等人. J.Biol. Chem 257 (1982) 13835-13844)。一方面，唾液酸转移酶主要以膜结合的形式存在于高尔基体和转运高尔基体网络内，在此处它参与新合成的分泌型或细胞表面糖蛋白的翻译后修饰。另一方面，ST6Gal-I的可溶形式存在于血清中(Kim Y.S. 等人Biochim.Biophys Acta 244 (1971) 505-512; Dalziel M. 等人. Glycobiology 9 (1999) 1003-1008)，且主要通过蛋白水解事件源自肝脏(Kaplan, H.A.等人. J. Biol. Chern. 258(1983) 11505-11509; van Dijk, W.等人. Biochem. Cell. Biol. 64 (1986) 79-84;Dalziel M. 等人(出处同上))，所述蛋白水解事件从它的膜锚释放催化结构域(Kaplan等人, 出处同上; Weinstein, J. 等人. J. Biol. Chem. 262 (1987) 17735-17743)。因而，术语“可溶性变体”包括具有包含膜锚的N-端截短的最初膜锚定的糖基转移酶的任何变体。可以示例性地如下产生可溶性变体：从所述蛋白蛋白水解地除去具有膜锚的部分，或表达编码原始蛋白的N-端截短形式的变体核酸序列，其中所述截短包括膜锚(跨膜片段，II型架构的元件(ii))。

Donadio S. 等人(出处同上)在CHO细胞中重组地表达了没有膜锚的hST6Gal-I的几种N-端截短变体。作者发现，包含前35、48、60和89个氨基酸的N-端缺失产生了具有酶活性且能够将唾液酸转移至外源受体的hST6Gal-I的变体。

糖基化是蛋白的一种重要翻译后修饰，其影响蛋白折叠、稳定性和生物活性的调节。唾液酸基残基经常暴露在N-聚糖的末端位置，且因此，是对生物学识别和配体功能的主要贡献者。作为一个重要例子，发现具有以末端唾液酸残基为特征的聚糖的IgG会诱导减轻的炎症应答并表现出血清半衰期的增加。因此，糖基转移酶用于确定聚糖结构的酶促合成的用途正在变成通向治疗性蛋白和特别是治疗性单克隆抗体的直接体外N-糖基化的工程改造工具。

由于原核起源的糖基转移酶经常不会作用于复杂的糖蛋白结构上，哺乳动物起源的唾液酸转移酶对于体外糖工程改造目的而言是优选的。例如，Barb等人(2009)使用分离的人ST6Gal-I制备了免疫球蛋白G的Fc片段的高度唾液酸化形式。但是，由于在不同的宿主(甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、培养的草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda）细胞、基于大肠杆菌（E. coli）的表达***)中重组地表达的hST6Gal-I的低表达收率和/或差活性，用于这样的应用的重组hST6Gal-I的可用性仍然是有限的。

Kleineidam R.G. 等人. Glycoconjugate Journal (1997) 14: 57-66公开了来自大鼠肝脏的α-2,6-唾液酸转移酶的许多抑制剂。具体地，分别在有胞苷、2’-CMP、3’-CMP和5’-CMP存在下，观察到α-2,6-唾液酸转移酶的70%、40%、39%和71%抑制，其中在0.25 mM的浓度测试每种抑制剂。

尽管哺乳动物糖基转移酶用于将糖基化的靶分子（诸如糖蛋白或糖脂）体外唾液酸化的用途是本领域已知的，但是到目前为止相反反应(唾液酸酶活性、来自聚糖部分的末端唾液酸基残基的水解裂解)通常由神经氨酸酶提供。但是，本发明的发明人的最初发现是，哺乳动物起源的唾液酸转移酶的可溶性变体在有CMP存在下表现出唾液酸酶活性。实际上，借助于N-端截短而缺乏跨膜结构域的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的可溶性变体的具体例子可以用于：(i)靶糖蛋白的唾液酸化和(ii)来自唾液酸化的靶糖蛋白的唾液酸基残基的水解裂解。取决于CMP的存在和CMP与可溶性变体的相互作用，可以定量地控制唾液酸化。在涉及具有两个或更多个天线聚糖受***点的靶分子的具体实施方案中，本发明提供了允许唾液酸化靶分子几个受***点中的仅一个、以及唾液酸化的两个或更多个、或甚至所有受***点的方式、方法和条件。

这为许多不同的方案铺设了道路，特别是在免疫球蛋白以及其它糖基化的靶分子的体外糖工程改造领域中。

发明概述

在第一方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案中，公开了一种水性组合物，其包含

(a)可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I，其包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序；

(b)胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物；

(c)选自糖蛋白和糖脂的糖基化的靶分子，所述靶分子包含一个或多个天线，至少一个天线具有含有在半乳糖基残基的C6位置处的羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分作为末端结构；

(d)水溶液，其允许糖基转移酶酶活性；

其中所述水性组合物还包含在允许糖基转移酶酶活性的条件下能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶。

在第二方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案中，公开了能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶用于在根据所述第一方面的组合物中维持唾液酸转移酶酶活性和/或抑制唾液酸酶酶活性的用途。

在第三方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案中，公开了一种在体外生产唾液酸化的靶分子的方法，所述方法包括下述步骤

(a)提供根据权利要求1和2中的任一项所述的水性组合物；

(b)通过温育步骤(a)的水性组合物，形成一个或多个末端天线N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基，由此使胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物作为共底物反应，由此形成5’-胞苷-单磷酸；

(c)水解在步骤(b)中形成的5’-胞苷-单磷酸的磷酸酯键，由此减少5’-胞苷-单磷酸介导的抑制，由此维持可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的活性；

由此在体外生产所述唾液酸化的靶分子。

在第四方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案中，公开了唾液酸化的免疫球蛋白的制品，每个免疫球蛋白具有人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的多个受***点，其中唾液酸化的免疫球蛋白的制品中小于约25%的受***点没有被唾液酸化，且约75%或更多被唾液酸化，其中所述制品通过根据所述第三方面的方法得到。

在第五方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案中，公开了包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序的可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I用于在有5’-胞苷-单磷酸存在下体外水解N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分中的α2,6糖苷键的用途，所述部分是唾液酸化的糖蛋白或糖脂中的聚糖的末端结构。

附图说明

图1是野生型hST6Gal-I多肽及其N-端部分（它们在如本文中公开的缺失变体中被截短）的氨基酸序列的表示。在截短体中的缺失位置用“X”表示。加下划线的是在被发现为CMP诱导的唾液酸酶活性所必需的位置90-108处的氨基酸。

图2是在HEK细胞中瞬时表达并从其分泌的Δ89 hST6Gal-I变体的电泳和染色以后的SDS-PAGE凝胶。泳道1显示了大小标准，根据所述标准的以kDa计的分子量指示在左侧。泳道2：经纯化的Δ89 hST6Gal-I截短变体(将5µg蛋白加载在凝胶上)。

图3是在HEK细胞中瞬时表达并从其分泌的Δ108 hST6Gal-I变体的电泳和染色以后的SDS凝胶。泳道1显示了大小标准，根据所述标准的以kDa计的分子量指示在左侧。泳道2：Δ108 hST6Gal-I截短变体(将5µg蛋白加载在凝胶上)。

图4是使用重组Δ89 hST6Gal-I对IgG4 MAB的唾液酸化的时程。

图5是由重组Δ89 hST6Gal-I催化的G2+2SA和G2+1SA的形成的动力学，如质谱图所示，所述质谱图作为用于确定不同的唾液酸化的靶分子种类的相对含量的基础。

图6是CTP对重组Δ89 hST6Gal-I的唾液酸酶活性的抑制。为不同的时间点显示了具有含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA，“去唾液酸基的”)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。

图7是Δ89 hST6Gal-I的CMP依赖性的唾液酸酶活性：在没有CMP存在下将经纯化的IgG1 MAB G2+2SA与Δ89 hST6Gal-I一起温育。为不同的时间点显示了具有含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。

图8是Δ89 hST6Gal-I的CMP依赖性的唾液酸酶活性：在有CMP存在下将经纯化的IgG1 MAB G2+2SA与Δ89 hST6Gal-I一起温育。为不同的时间点显示了具有含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。

图9是Δ89 hST6Gal-I的CMP依赖性的唾液酸酶活性：在有CMP存在下将经纯化的IgG1 MAB G2+2SA与Δ108 hST6Gal-I一起温育。为不同的时间点显示了具有含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。

图10是Δ89 hST6Gal-I的CMP依赖性的唾液酸酶活性：在有CMP存在下将经纯化的IgG1 MAB G2+2SA与δ57ST3-Gal-I一起温育。为不同的时间点显示了具有含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。

图11是在唾液酸化反应混合物中在没有或有5´-核苷酸酶CD73存在下用Δ89hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。使用的5´-核苷酸酶的量是0 - 0.5µg。阴性对照: 0µg 5´-核苷酸酶CD73。

图12是在唾液酸化反应混合物中在没有或有5´-核苷酸酶CD73存在下用Δ89hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有0.1µg 5´-核苷酸酶CD73的唾液酸化反应混合物。

图13是在唾液酸化反应混合物中在没有或有5´-核苷酸酶CD73存在下用Δ89hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有0.25µg 5´-核苷酸酶CD73的唾液酸化反应混合物。

图14是在唾液酸化反应混合物中在没有或有5´-核苷酸酶CD73存在下用Δ89hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有0.5µg 5´-核苷酸酶CD73的唾液酸化反应混合物。

图15是在唾液酸化反应混合物中在没有或有碱性磷酸酶存在下用Δ89 hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。使用的5´-核苷酸酶的量是0- 100µg。阴性对照: 0µg碱性磷酸酶。

图16是在唾液酸化反应混合物中在没有或有碱性磷酸酶存在下用Δ89 hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有1µg碱性磷酸酶的唾液酸化反应混合物。

图17是在唾液酸化反应混合物中在没有或有碱性磷酸酶存在下用Δ89 hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有5µg碱性磷酸酶的唾液酸化反应混合物。

图18是在唾液酸化反应混合物中在没有或有碱性磷酸酶存在下用Δ89 hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有10µg碱性磷酸酶的唾液酸化反应混合物。

图19是在唾液酸化反应混合物中在没有或有碱性磷酸酶存在下用Δ89 hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化。显示了具有仅含末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和二唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的抗体的相对含量。含有100µg碱性磷酸酶的唾液酸化反应混合物。

发明详述

术语“一个”、“一种”和“所述”通常包括复数指示物，即“一个或多个”，除非上下文另外清楚地指出。本文中使用的“多个”被理解为是指超过一个。例如，多个表示至少2、3、4、5个或更多个。除非特别说明或者从上下文显而易见，否则本文中使用的术语“或”理解为是包含性的。

除非特别说明或者从上下文显而易见，否则本文中使用的术语“约”被理解为在本领域通常容忍的范围内，例如在平均值的2个标准差内。约可以被理解为在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非另外从上下文明白，否则本文中提供的所有数值可以被术语“约”修饰。

术语“氨基酸”通常表示可以掺入肽、多肽或蛋白中的任何单体单元。本文中使用的术语“氨基酸”包括以下20种天然的或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在“X”残基未被定义的情况下，这些应当定义为“任意氨基酸”。这20种天然氨基酸的结构显示在，例如，Stryer等人, Biochemistry, 第5版, Freeman and Company (2002)中。还可以遗传上编码另外的氨基酸，诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸(Stadtman (1996)“Selenocysteine,”Annu Rev Biochem. 65:83-100和Ibba等人(2002)“Genetic code: introducingpyrrolysine,”Curr Biol. 12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”也包括非天然的氨基酸、经修饰的氨基酸(例如，具有经修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物。参见，例如，Zhang等人(2004)“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins inmammalian cells,”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson等人(2004)“An expanded genetic code with a functional quadruplet codon”Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda等人(2003)“Synthesis of anovel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein invivo,”Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin等人(2003)“An ExpandedEukaryotic Genetic Code,”Science 301(5635):964-967, James等人(2001)“Kineticcharacterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizablephenylazophenylalanine residues,”Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991,Kohrer等人(2001)“Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammaliancells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analoguesinto proteins,”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher等人(2001)“Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable ofGrowth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,”J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku等人(2000)“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASynthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficientlythan Tyrosine,”J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, 和Budisa等人(2001)“Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophoresand pharmaceutically active amino acids,”Protein Sci. 10(7):1281-1292。为了进一步举例说明，氨基酸通常是包括被取代的或未被取代的氨基、被取代的或未被取代的羧基、和一个或多个侧链或基团、或这些基团中的任一个的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如，巯基、硒代、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基（alkynl）、醚、硼酸酯、硼酸酯、磷、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、或这些基团的任意组合。其它代表性的氨基酸包括、但不限于：包含可光活化的交联剂的氨基酸、结合金属的氨基酸、旋转标记的氨基酸、荧光氨基酸、含金属的氨基酸、具有新官能团的氨基酸、与其它分子共价地或非共价地相互作用的氨基酸、光捕获的（photocaged）和/或可光致同分异构化的氨基酸、放射性的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学切割的和/或可光裂解的氨基酸、碳-连接的含糖氨基酸、氧化还原活性的氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个有毒部分的氨基酸。

术语“蛋白”表示作为核糖体翻译过程的产物的多肽链(氨基酸序列)，其中所述多肽链已经经历产生三维蛋白结构的翻译后折叠过程。术语“蛋白”也包括具有一个或多个翻译后修饰诸如(但不限于)糖基化、磷酸化、乙酰化和泛素化的多肽。

如本文中公开的任何蛋白，特别是如本文中公开的重组地生产的蛋白，在一个具体实施方案中可以包含“蛋白标签”，其为遗传上移植到重组蛋白上的肽序列。蛋白标签可以包含具有特定蛋白酶切割位点的接头序列以便利通过蛋白酶解除去所述标签。作为一个具体实施方案，将“亲和标签”附加至靶蛋白，使得所述靶标可以使用亲和技术从它的原始生物学来源纯化出来。例如，所述来源可以是经转化的表达靶蛋白的宿主生物或经转化的宿主生物向其中分泌靶蛋白的培养物上清液。亲和标签的具体实施方案包括甲壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。聚(His)标签是一种广泛使用的蛋白标签，其促进与某些金属螯合基质的结合。

术语“嵌合蛋白”、“融合蛋白”或“融合多肽”中的每一种同样表示这样的蛋白：其氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物。融合蛋白通常不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是相反，从编码所述嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达。

术语“重组体”表示已经通过重组方法有意地修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“重组核酸”在本文中是指呈在自然界中通常未发现的形式的核酸，其最初在体外形成，一般而言，通过用内切核酸酶操作核酸。因此，呈线性形式的分离的突变体DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。应当理解，一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；但是，这样的核酸一旦重组地产生，尽管随后非重组地复制，仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白”或“重组地生产的蛋白”是使用重组技术制备的蛋白，即，通过如上所述表达重组核酸。

术语“宿主细胞”表示单细胞原核生物和真核生物有机体(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母和放线菌)和来自高等植物或动物的单个细胞（当在细胞培养物中培养时）。

术语“糖基化”表示将糖基残基共价地偶联至受体基团的化学反应。一种具体的受体基团是羟基，例如另一个糖的羟基。“唾液酸化”是糖基化的一种具体形式，其中使受体基团与唾液酸(= N-乙酰基神经氨酸)残基反应。这样的反应通常使用胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸作为供体化合物或共底物由唾液酸转移酶催化。

“唾液酸化”是在允许的条件下，糖基转移酶酶活性(在特定情况下，唾液酸转移酶酶活性)的结果的一个具体实施方案。

通常，技术人员会理解，可以在其中发生糖基转移酶酶活性的水性组合物(= 在“允许糖基转移酶酶活性”的条件下)需要使用缓冲盐诸如Tris、MES、磷酸盐、乙酸盐或另一种缓冲盐进行缓冲，所述另一种缓冲盐具体地能够在pH 6至pH 8的pH范围内缓冲，更具体地在pH 6至pH 7的pH范围内缓冲，甚至更具体地能够缓冲约pH 6.5的溶液。所述缓冲液还可以含有中性盐诸如但不限于NaCl。此外，在特定实施方案中，技术人员可以考虑向所述水性缓冲液中加入包含二价阳离子（诸如Mg²⁺或Mn²⁺）的盐，例如，但不限于，MgCl₂和MnCl₂。在另外的具体实施方案中，允许糖基转移酶酶活性的水性组合物可以包含抗氧化剂和/或表面活性剂。本领域中已知的允许糖基转移酶酶活性的条件包括环境(室)温度，但是更一般地在0℃至40℃范围内的温度，特别是10℃至30℃，特别是约20℃。尽管上述条件会提供允许这样的酶活性的一般条件，但是糖基转移酶活性另外还需要活化的糖供体(诸如具体地CMP-Neu5Ac)作为共底物存在。但是，术语“允许糖基转移酶酶活性”被理解为不一定包括共底物的存在。因而，术语“允许糖基转移酶酶活性”在本文中也包括允许本发明的哺乳动物糖基转移酶受试者的水解(唾液酸酶)活性的条件，特别是在有5’-胞苷-单磷酸(CMP)存在下的水解活性。

术语“聚糖”表示多糖或寡糖，即表示在酸水解后产生多个单糖的多聚体化合物。糖蛋白包含一个或多个聚糖部分，所述聚糖部分共价地偶联至多肽链的侧基，通常经由天冬酰胺或精氨酸(“N-连接的糖基化”)或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)。

糖基转移酶用于酶促合成复杂聚糖结构的用途是一个有吸引力的得到复杂生物活性糖蛋白的方案。例如Barb等人. Biochemistry 48 (2009) 9705-9707使用分离的人ST6Gal-I制备了免疫球蛋白G的Fc片段的非常有效的唾液酸化形式。但是，在糖蛋白的治疗用途中越来越多的兴趣导致越来越多的对糖基转移酶（包括唾液酸转移酶）的需求。BorkK. 等人. J. Pharm. Sci. 98 (2009) 3499-3508描述了增加或改变糖蛋白的唾液酸化的不同策略。一个有吸引力的策略是重组地生产的蛋白(诸如但不限于免疫球蛋白和生长因子)、特别是治疗性蛋白的体外唾液酸化。为此目的，几个研究组描述了唾液酸转移酶在经转化的生物体中的表达和重组地生产的唾液酸转移酶的纯化。由于原核起源的糖基转移酶经常不会作用于复杂糖蛋白(例如抗体)，所以优先研究了来自哺乳动物起源的唾液酸转移酶。

本文件的公开内容和所有方面以及本文中的方面和实施方案涉及的特定糖蛋白包括但不限于细胞表面糖蛋白和以可溶形式存在于血清中的糖蛋白(“血清糖蛋白”)，所述糖蛋白具体地具有哺乳动物起源。“细胞表面糖蛋白”被理解为这样的糖蛋白：其一部分通过表面糖蛋白的多肽链的膜锚部分位于膜表面上并结合至膜表面，其中所述膜是生物细胞的组成部分。术语细胞表面糖蛋白也包括细胞表面糖蛋白的分离形式以及与所述膜锚部分分离的它们的可溶性片段，例如通过蛋白水解性裂解或通过这样的可溶性片段的重组生产。“血清糖蛋白”被理解为存在于血清中的糖蛋白，即在沉降细胞血液组分以后存在于全血的非细胞部分中（例如在上清液中）的血液蛋白。非限制性地，一种特别注意的和体现的血清糖蛋白是免疫球蛋白。在这里提及的特定免疫球蛋白属于IgG组(以γ重链为特征)，特别是四个IgG亚组中的任一个。关于本文中的公开内容、方面和实施方案，术语“血清糖蛋白”也包括单克隆抗体；人工单克隆抗体是本领域众所周知的，且可以例如由杂交瘤细胞产生或使用经转化的宿主细胞重组地产生。另一种血清特异性的糖蛋白是载体蛋白诸如血清白蛋白、胎球蛋白或富含组氨酸的糖蛋白的超家族（胎球蛋白为其成员）的另一个糖蛋白成员。此外，非限制性地，关于本文中所有公开内容、方面和实施方案的一种特别注意的和体现的血清糖蛋白是糖基化的蛋白信号传递分子。该组的特定分子是***(EPO)。

关于糖蛋白的体外工程改造，可以使用糖基转移酶作为有效的工具(Weijers2008)。哺乳动物起源的糖基转移酶与作为底物的糖蛋白相容，而细菌糖基转移酶经常改变更简单的底物如寡糖。由于该原因，使用哺乳动物糖基转移酶作为候选工具，有利地做出糖蛋白的聚糖部分中的合成变化。但是，对于糖基转移酶在糖工程改造中的大规模应用，需要大(即工业)量合适酶的可用性。本文公开内容特别提供了具有(i) hST6Gal-I唾液酸转移酶活性和(ii)唾液酸酶活性的蛋白，其可以用于定量地在体外控制具有一个或多个可接近的半乳糖基底物部分的靶糖蛋白的唾液酸化。

重要的是，在SEQ ID NO:1中的从位置90至位置108的在人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I中的氨基酸基序是所述酶能够表现出唾液酸酶活性所必需的。与此同时，该氨基酸基序是所述酶与5’-CMP相互作用所必需的。非常显著的是，一种截短缺失突变体，即缺少从位置1至位置108的氨基酸的连续N-端段的可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I变体，不会表现出唾液酸酶活性，即使在有CMP存在下也不会。因而，结论是，在SEQ IDNO:1中的从位置90至位置108的在人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I中的氨基酸基序是这些性能的存在所必需的。

一方面，要用唾液酸酶活性治疗的合适靶标包括无唾液酸糖蛋白，即通过唾液酸酶的作用已经从其除去唾液酸残基的糖蛋白。另一方面，二唾液酸化的糖蛋白可以充当唾液酸酶活性的底物。非常有利的是，去唾液酸基的、单唾液酸化的和二唾液酸化的免疫球蛋白是特异的底物，特别是IgG类的免疫球蛋白。

当在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母中表达野生型hST6Gal-I并且已经将表达的多肽靶向宿主生物的分泌途径时，观察了重组地生产的hST6Gal-I的不同截短变体。通常，将hST6Gal-I衍生的蛋白色谱纯化并分析，特别是借助于质谱法和通过从N-端确定氨基酸序列(Edman降解)。通过这些方式，详细地表征了截短，特别是hST6Gal-I的N-端截短。

在经转化的毕赤酵母菌株的上清液中鉴别出了几种惊人的截短变体。所述变体可能源自从酵母细胞分泌过程中位点特异性的蛋白水解性裂解，或源自存在于培养的毕赤酵母菌株的上清液中的一种或多种细胞外蛋白酶的内切蛋白水解性裂解。

给每种鉴别的截短变体赋予“δ”(= “Δ”)命名，其指示根据SEQ ID NO:1从野生型hST6Gal-I多肽的N-端计数的各个截短缺失的最后氨基酸位置的编号。将hST6Gal-I的特定N-端截短变体Δ89和Δ108重组地表达并更详细地研究。

为hST6Gal-I野生型蛋白以及Δ89和Δ108截短变体在不同宿主生物中的表达构建了表达载体，所述宿主生物包括原核生物诸如大肠杆菌和芽孢杆菌属种、酵母诸如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母、和哺乳动物细胞诸如CHO细胞和HEK细胞。分子地组装含有hST6Gal-I的Δ89和Δ108截短变体的表达构建体的载体，由此提供在几种经转化的宿主生物中重组地生产人ST6Gal-I的Δ89变体的方式。为了便利重组地表达的酶的纯化，在具体实施方案中，由所述构建体编码的截短多肽任选地包括N-端His-标签。

一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是一种变体哺乳动物糖基转移酶，其能够催化糖蛋白中的聚糖的N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的α2,6糖苷键的水解。具体地，所述变体哺乳动物糖基转移酶能够催化糖蛋白聚糖中的N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的α2,6糖苷键的形成，由此产生游离的N-乙酰基神经氨酸。在如本文中公开的所有方面的一个具体实施方案中，所述变体哺乳动物糖基转移酶是包含SEQ ID NO:1（其公开了人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I）中从位置90至位置108的氨基酸基序的可溶性酶。这里公开的教导包括这样的同源唾液酸转移酶：其包含与SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的基序对应的氨基酸基序。

在如本文中公开的所有方面的一个具体实施方案中，能够催化α2,6糖苷键的水解的变体哺乳动物糖基转移酶是通过氨基酸缺失从根据SEQ ID NO:1的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I衍生出的哺乳动物糖基转移酶，所述序列从N-端截短了缺失。在如本文中公开的所有方面的另一个具体实施方案中，所述从N-端的截短缺失是SEQ ID NO:1的位置1至位置89的连续序列。

另一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是一种融合多肽，其包含根据如本文中公开的任意实施方案的变体哺乳动物糖基转移酶的多肽。融合蛋白或融合多肽是包含两个或更多个多肽的氨基酸序列的嵌合多肽。所述两个或更多个多肽可以具有互补的功能，所述多肽之一可以提供补充性的功能性质，或所述多肽之一可以具有与所述融合多肽中的其它多肽无关的功能。一个或多个包含细胞器靶向或保留序列的多肽可以与期望的多肽融合以将期望的多肽靶向特定细胞的细胞器，或将期望的多肽保留在细胞内。一个或多个包含辅助所述融合多肽的表达、纯化和/或检测的载体序列的多肽可以与期望的多肽融合(例如，FLAG、myc标签、6x His标签、GST融合体等)。特定融合配偶体包括能够将所述融合多肽的变体哺乳动物糖基转移酶部分引导至在其中表达所述融合多肽的宿主生物的分泌途径的N-端前导肽。由此促进在细胞外空间和周围培养基中的分泌。然而，另一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是一种核苷酸序列，其编码根据如本文中公开的任意实施方案的变体哺乳动物糖基转移酶或包含根据如本文中公开的任意实施方案的变体哺乳动物糖基转移酶作为一部分的融合多肽。重要的是，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的序列或其同源等同物（在与人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I同源的唾液酸转移酶的情况下）。

然而，另一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是一种表达载体，其包含靶基因和促进所述靶基因在用所述表达载体转化的宿主生物中的表达的序列，其中所述靶基因包含如本文中公开的核苷酸序列。

然而，另一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是一种经转化的宿主生物，其中所述宿主生物用如本文中公开的表达载体转化。由于特别的优点，人胚胎肾293 (HEK)细胞可以用于实践这里公开的教导。这些细胞的特别的优点是，它们是靶基因的转染和随后的后续培养和瞬时表达的非常适合的靶标。因而，HEK细胞可以有效地用于通过重组表达来生产靶蛋白。由于巨大的优点，将表达构建体设计成将翻译产物引导至分泌途径，从而导致如本文中公开的变体哺乳动物糖基转移酶或融合多肽的分泌。尽管如此，Jurkat、NIH3T3、HeLa、COS和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是众所周知的替代细胞，并且在本文中包括进来作为如本文中公开的转化和所有方面的具体实施方案的替代宿主生物。

然而，另一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是一种重组地生产变体哺乳动物糖基转移酶的方法，所述方法包括下述步骤：在用表达载体转化的宿主生物中表达编码如本文中公开的变体哺乳动物糖基转移酶的核苷酸序列，其中形成多肽，由此产生变体哺乳动物糖基转移酶。

根据更早的知识，由于它们缺乏跨膜结构域，有利地在体外使用糖基转移酶的N-端截短变体。因而，这样的变体可用于催化和执行在溶液中的糖基转移酶反应。令人惊讶地发现且如本文中公开的，具体地N-端截短变体Δ89 hST6Gal-I表现出不同的体外活性，例如当与糖基化的抗体一起和在有5’-CMP存在下温育时。因而，本发明的一个具体实施方案和本文中的所有方面和实施方案是一种变体哺乳动物糖基转移酶，其能够催化二唾液酸化的糖蛋白（即在所述糖蛋白的一个或多个聚糖部分中包含两个单独末端N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的糖蛋白）的N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的α2,6糖苷键的水解。在一个具体实施方案中，仅一个α2,6糖苷键被水解。在另一个具体实施方案中，所述二唾液酸化的糖蛋白是二唾液酸化的IgG免疫球蛋白。

作为一种示例性情况，IgG-Fc聚糖G2具有在天线分支的末端处的两个半乳糖部分，它们可以被唾液酸化。在合适的反应条件下，N-端截短变体Δ89 hST6Gal-I催化在免疫球蛋白Fc部分处具有二唾液酸化的G2聚糖(G2 + 2SA)的IgG的合成。但是，在5’-CMP的积累以后，所述酶变体充当催化唾液酸部分从二唾液酸化的(G2 + 2SA)抗体水解除去从而产生单唾液酸化的(G2 + 1SA)抗体的唾液酸酶。该性质被意外地发现且似乎代表一种固有的唾液酸酶(神经氨酸酶)活性。

在关于人ST6Gal-I的基础出版物中，阐明了所述酶不含有任何唾液酸酶活性，参见Sticher等人. Glycoconjugate Journal 8 (1991) 45-54。考虑到本发明的惊人发现，使用相同的酶和通过控制唾液酸化反应混合物中的CMP来控制所述酶的反应动力学，可能优先合成具有单-、二-或甚至更高唾液酸化的聚糖的糖蛋白。另一个优点是，在同一个反应容器中由同一种酶提供两种活性：唾液酸化活性和唾液酸酶活性。

但是，在本发明中记录的一般发现是，存在一种变体哺乳动物糖基转移酶，特别是根据本发明的糖基转移酶，其能够催化糖蛋白中的聚糖的N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的α2,6糖苷键的水解。除了已经已知的唾液酸转移酶(唾液酸化)活性以外，惊人发现是，至少如关于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-端截短人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I特别证实的，不仅存在常规唾液酸转移酶，而且存在由该酶介导的唾液酸酶酶活性。令人感兴趣的是，在示例性情况下，没有同时观察到这两种活性，这可能部分地解释所述意外发现。因而，在没有CMP存在下，唾液酸转移酶活性在开始占优势，且唾液酸酶活性仅在温育的晚期阶段在已经积累足够量的CMP以后才变得明显。尽管如此，同一酶的两种不同活性的明显识别允许控制靶分子的唾液酸化的程度，例如通过改变温育时间。

但是，以非常巧妙的方式，通过向唾液酸化反应混合物中加入能够在允许唾液酸转移酶酶活性的条件下水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶，可以使唾液酸化最大化。因而，副产物CMP被除去，且不会抵消由唾液酸转移酶实现的唾液酸化催化。

然而，另一个方面和如本文中公开的所有其它方面的一个具体实施方案是在允许唾液酸转移酶酶活性的条件下能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶用于维持糖基转移酶活性和/或抑制如本文中公开的变体哺乳动物糖基转移酶（特别是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的N-端截短人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I）的唾液酸酶活性的用途。

这样控制的唾液酸化被提供为在体外合成具有期望的唾液酸化程度的单-、二-、和更高级唾液酸化的糖蛋白的新方式。因而，尽管通过用IgG分子表现出期望的技术效果来举例说明，但是根据本发明的用途在这里也允许以类似的方式处理其它糖蛋白，前提条件是，关于糖基转移酶活性，所述糖蛋白包含两个或更多个末端天线β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分。相同的推理以类似的方式应用于糖脂。

在一个特定实施例中，在唾液酸化实验中使用被表征为G2+0SA (= 存在两个受***点，在任何受***点处没有唾液酸化)的重组人源化IgG1和IgG4单克隆抗体(mab)、以及EPO (= ***)作为靶标(30 μg酶/300 μg靶蛋白)。在标准反应条件下使用Δ89hST6Gal-I，并通过质谱法分析G2+0SA、G2+1SA (= 单唾液酸化，两个受***点之一被唾液酸化)和G2+2SA (= 二唾液酸化，两个可能的受***点被唾液酸化)状态。

由于高表达率和有效纯化程序，可以以大量和以高纯度得到示例性的Δ89hST6Gal-I以及在功能上等同的酶。变体Δ89 hST6Gal-I酶对高分子量底物（其中单克隆抗体仅仅是一个例子）是有活性的。取决于温育时间，与CMP-水解酶组合的Δ89 hST6Gal-I在使用具有双天线聚糖的单克隆抗体作为底物的唾液酸化实验中显示出良好性能。使用本发明的实施方案，优选地在较短温育时段（诸如8小时）以后以巨大优点得到二唾液酸化的聚糖。还接受四-天线聚糖作为底物(数据未显示)。结果证实了治疗性抗体的体外糖工程改造的技术优点。

以下项目进一步提供了本发明的具体方面和用于实践本文提供的教导的具体实施方案。

1. 包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序的可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I用于在有5’-胞苷-单磷酸存在下体外水解N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分中的α2,6糖苷键的用途，所述部分是唾液酸化的糖蛋白或糖脂中的聚糖的末端结构。

2. 根据项目1所述的用途，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置406的氨基酸。

3. 根据项目1和2中的任一项所述的用途，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

4. 根据项目1-3中的任一项所述的用途，其中所述糖蛋白选自细胞表面糖蛋白和血清糖蛋白。

5. 根据项目4所述的用途，其中所述血清糖蛋白选自糖基化的蛋白信号传递分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒起源的蛋白。

6. 根据项目1-5中的任一项所述的用途，其中重组地生产所述糖蛋白。

7. 根据项目6所述的用途，其中在经转化的哺乳动物起源的宿主细胞中重组地生产所述糖蛋白。

8. 根据项目1-7中的任一项所述的用途，其中所述糖蛋白是人起源的免疫球蛋白或人源化的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

9. 根据项目1-7中的任一项所述的用途，其中所述糖蛋白选自EPO和去唾液酸基的胎球蛋白。

10. 一种水性组合物，其包含

(a)可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I，其包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序；

(b)胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物；

(c)选自糖蛋白和糖脂的糖基化的靶分子，所述靶分子包含一个或多个天线，至少一个天线具有含有在半乳糖基残基的C6位置处的羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分作为末端结构；

(d)水溶液，其允许糖基转移酶酶活性；

其中所述水性组合物还包含在允许糖基转移酶酶活性的条件下能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶。

11. 根据项目10所述的水性组合物，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置406的氨基酸。

12. 根据项目10和11中的任一项所述的水性组合物，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

13. 根据项目10-12中的任一项所述的水性组合物，其中所述糖基化的靶分子是选自细胞表面糖蛋白和血清糖蛋白的糖蛋白。

14. 根据项目10-13中的任一项所述的水性组合物，其中所述血清糖蛋白选自糖基化的蛋白信号传递分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒起源的蛋白。

15. 根据项目10-14中的任一项所述的水性组合物，其中重组地生产所述糖蛋白。

16. 根据项目15所述的水性组合物，其中在经转化的哺乳动物起源的宿主细胞中重组地生产所述糖蛋白。

17. 根据项目10-16中的任一项所述的水性组合物，其中所述糖蛋白是人起源的免疫球蛋白或人源化的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

18. 根据项目10-16中的任一项所述的水性组合物，其中所述糖蛋白选自EPO和去唾液酸基的胎球蛋白。

19. 根据项目10-18中的任一项所述的水性组合物，其中所述水溶液包含水、能够在pH 6至pH 8的pH范围中缓冲的缓冲盐和任选的化合物，所述化合物选自中性盐、具有二价阳离子的盐、抗氧化剂、表面活性剂及其混合物。

20. 根据项目10-19中的任一项所述的水性组合物，所述组合物具有0℃至40℃的温度。

21. 根据项目10-20中的任一项所述的水性组合物，其中所述能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和5’核苷酸酶。

22. 根据项目21所述的水性组合物，其中所述碱性磷酸酶选自细菌起源的碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、人胎盘碱性磷酸酶、及其混合物。

23. 根据项目22所述的水性组合物，其中所述水性组合物还包含Zn²⁺ 离子。

24. 根据项目21所述的水性组合物，其中所述5’核苷酸酶是哺乳动物起源、特别是人起源的5’核苷酸酶CD73。

25. 根据项目10-24中的任一项所述的水性组合物用于减轻5’-胞苷-单磷酸介导的抑制和由此维持包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序的可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的唾液酸化活性的用途。

26. 根据项目25所述的用途，其中所述唾液酸化活性催化唾液酸残基或其功能等同物从共底物向含有在半乳糖基残基的C6位置处的羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的转移和共价偶联，所述部分是选自糖蛋白和糖脂的糖基化的靶分子的聚糖的末端结构。

27. 一种在体外生产唾液酸化的靶分子的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供根据项目10-24中的任一项所述的水性组合物；

(b)通过温育步骤(a)的水性组合物，形成一个或多个末端天线N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基，由此使胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物作为共底物反应，由此形成5’-胞苷-单磷酸；

(c)水解在步骤(b)中形成的5’-胞苷-单磷酸的磷酸酯键，由此减少5’-胞苷-单磷酸介导的抑制，由此维持所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的活性；

由此在体外生产所述唾液酸化的靶分子。

28. 根据项目27所述的方法，其中在0℃至40℃的温度进行所述方法。

29. 根据项目27和28中的任一项所述的方法，其中在相同容器中进行步骤(b)和(c)。

30. 根据项目27-29中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自2 h至96 h、2 h至23 h、2 h至6 h和约2 h的时间段。

31. 根据项目27-29中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自6 h至96 h、6 h至23 h和约6 h的时间段。

32. 根据项目27-29中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自23 h至96 h和约23 h的时间段。

33. 根据项目27-29中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行约96 h的时间段。

34. 缺少SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序的可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I用于在有5’-胞苷-单磷酸存在下在体外将5-N-乙酰基神经氨酸残基从供体化合物胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或从其功能等同物转移至受体的用途，所述受体是糖蛋白或糖脂的聚糖部分中的末端β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺。

35. 根据项目34所述的用途，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置109至位置406的氨基酸。

36. 根据项目34和35中的任一项所述的用途，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

37. 根据项目34-36中的任一项所述的用途，其中所述糖蛋白选自细胞表面糖蛋白和血清糖蛋白。

38. 根据项目37所述的用途，其中所述血清糖蛋白选自糖基化的蛋白信号传递分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒起源的蛋白。

39. 根据项目34-38中的任一项所述的用途，其中重组地生产所述糖蛋白。

40. 根据项目39所述的用途，其中在经转化的哺乳动物起源的宿主细胞中重组地生产所述糖蛋白。

41. 根据项目34-40中的任一项所述的用途，其中所述糖蛋白是人起源的免疫球蛋白或人源化的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

42. 根据项目34-40中的任一项所述的用途，其中所述糖蛋白选自EPO和去唾液酸基的胎球蛋白。

43. 一种水性组合物，其包含

(a)可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I，其缺少SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序；

(b)胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物；

(c)选自糖蛋白和糖脂的糖基化的靶分子，所述靶分子包含一个或多个天线，至少一个天线具有含有在半乳糖基残基的C6位置处的羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分作为末端结构；

(d)水溶液，其允许糖基转移酶酶活性；

其中所述水性组合物还包含5’-胞苷-单磷酸。

44. 根据项目43所述的水性组合物，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置109至位置406的氨基酸。

45. 根据项目43和44中的任一项所述的水性组合物，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

46. 根据项目43-45中的任一项所述的水性组合物，其中所述糖基化的靶分子是选自细胞表面糖蛋白和血清糖蛋白的糖蛋白。

47. 根据项目43-46中的任一项所述的水性组合物，其中所述血清糖蛋白选自糖基化的蛋白信号传递分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒起源的蛋白。

48. 根据项目43-47中的任一项所述的水性组合物，其中重组地生产所述糖蛋白。

49. 根据项目48所述的水性组合物，其中在经转化的哺乳动物起源的宿主细胞中重组地生产所述糖蛋白。

50. 根据项目43-49中的任一项所述的水性组合物，其中所述糖蛋白是人起源的免疫球蛋白或人源化的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

51. 根据项目43-49中的任一项所述的水性组合物，其中所述糖蛋白选自EPO和去唾液酸基的胎球蛋白。

52. 根据项目43-51中的任一项所述的水性组合物，其中所述水溶液包含水、能够在pH 6至pH 8的pH范围中缓冲的缓冲盐和任选的化合物，所述化合物选自中性盐、具有二价阳离子的盐、抗氧化剂、表面活性剂及其混合物。

53. 根据项目43-52中的任一项所述的水性组合物，所述组合物具有0℃至40℃的温度。

54. 一种在体外生产唾液酸化的靶分子的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供根据项目43-53中的任一项所述的水性组合物；

(b)通过温育步骤(a)的水性组合物，形成一个或多个末端天线N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基，由此使胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物作为共底物反应，由此形成5’-胞苷-单磷酸；

(c)积累在步骤(b)中形成的5’-胞苷-单磷酸；

由此在体外生产所述唾液酸化的靶分子。

55. 根据项目54所述的方法，其中在0℃至40℃的温度进行所述方法。

56. 根据项目54和55中的任一项所述的方法，其中在相同容器中进行步骤(b)和(c)。

57. 根据项目54-56中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自2 h至72 h的时间段。

58. 能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶用于在根据项目10-24中的任一项所述的组合物中维持唾液酸转移酶酶活性的用途。

59. 能够水解5’-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶用于在根据项目10-24中的任一项所述的组合物中抑制唾液酸酶酶活性的用途。

60. 一种唾液酸化的免疫球蛋白的制品，每个免疫球蛋白具有人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的多个受***点，其中所述唾液酸化的免疫球蛋白的制品中小于25%的受***点没有被唾液酸化，且75%或更多被唾液酸化，其中所述制品根据项目27-33中的任一项所述的方法得到。

61. 根据项目60所述的制品，其中所述唾液酸化的免疫球蛋白的制品中小于20%的受***点没有被唾液酸化，且80%或更多被唾液酸化。

62. 根据项目60所述的制品，其中所述唾液酸化的免疫球蛋白的制品中小于10%的受***点没有被唾液酸化，且90%或更多被唾液酸化。

以下实施例是本发明的具体实施方案及其多种用途的示例。它们仅仅为了解释性的目的而阐述，不应当用于限制公开内容。

实施例1

关于唾液酸转移酶酶活性的测试

将去唾液酸基的胎球蛋白(去唾液酸化的胎球蛋白, Roche Applied Science)用作受体，并将CMP-9-氟-NANA (CMP-9-荧光素基-NeuAc)用作供体底物(Brossmer, R. 和Gross H. J. (1994) Meth. Enzymol. 247, 177-193)。通过测量唾液酸从供体化合物向去唾液酸基的胎球蛋白的转移，确定唾液酸转移酶的酶活性。反应混合物(35 mM MES, pH6.0, 0.035%Triton X-100, 0.07%BSA)含有在51µL的总体积中的2.5µg酶样品、5µL去唾液酸基的胎球蛋白(20 mg/mL)和2µL CMP-9-氟-NANA (1.0 mg/mL)。将反应混合物在37℃温育30 min。通过加入10µL抑制剂CTP (10 mM)停止反应。将反应混合物加载到用0.1 MTris/HCl（pH 8.5）平衡的PD10脱盐柱上。使用平衡缓冲液从所述柱洗脱胎球蛋白。级分大小是1 mL。使用荧光分光光度计确定形成的胎球蛋白的浓度。激发波长为490 nm，在520 nm测量发射。将酶活性表达为RFU (相对荧光单位)。10,000 RFU/µg等同于0.0839 nmol/µg xmin的比活性。

实施例2

SDS凝胶电泳

使用NuPAGE凝胶(4-12%, Invitrogen)进行分析型SDS凝胶电泳。将样品(36µL)用12µL NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)稀释，并在85℃温育2 min。将等分试样（通常含有5µg蛋白）加载到凝胶上。使用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)将凝胶染色。

实施例3

通过Edman降解进行N-端测序

使用得自Life Technologies的试剂和装置，通过Edman降解分析表达的人ST6Gal-I的变体的N-端序列。如在Life Technologies ProSorb Sample Preparation筒(目录号401950)和Life Technologies ProBlott Mini PK/10膜(目录号01194)的指导手册中所述，进行样品的制备。关于测序，使用Procise蛋白测序平台（Procise ProteinSequencing Platform）。

实施例4

糖基化的人ST6Gal-I酶的质谱法

分析了在HEK细胞中表达的人ST6Gal-I变体的分子质量。制备人ST6Gal-I的糖基化形式，并将制备的材料使用Micromass Q-Tof Ultima和Synapt G2 HDMS装置(WatersUK)和MassLynx V 4.1软件进行分析。

关于质谱法测量，将样品在电喷射介质(20%乙腈+ 1%甲酸)中缓冲。用illustra™MicroSpin™G-25柱(GE-Healthcare)执行缓冲液更换。将20µg唾液酸转移酶变体（具有1mg/mL的浓度）应用于预平衡的柱，并通过离心洗脱。通过电喷射电离质谱法分析得到的洗脱液。

实施例5

去糖基化的人ST6Gal-I酶的质谱法

分析了在HEK细胞中表达的人ST6Gal-I变体的分子质量。使用Micromass Q-TofUltima和Synapt G2 HDMS装置(Waters UK)和MassLynx V 4.1软件分析了人ST6Gal-I的去糖基化形式。

关于去糖基化，将唾液酸转移酶的样品变性和还原。向100µg唾液酸转移酶中加入45µL变性缓冲液(6 M盐酸胍)和13µL TCEP (= 三(2-羧基乙基)膦; 0.1 mM，在变性缓冲液中稀释)。此外，加入适当体积的超纯水，使得盐酸胍的总浓度为约4 M。将样品在37℃温育1h以后，使用Bio-SpinR 6 Tris柱(Bio Rad)更换缓冲液，所述柱经过用超纯水预平衡。将整个样品应用于柱上并通过离心洗脱。向得到的洗脱液中加入5.5µL的0.1 U/µL的PNGase-F溶液，并在37℃温育过夜。此后，将样品调至30%ACN (= 乙腈)和1%FA (= 甲酰胺)，并通过电喷射电离质谱法进行分析。

实施例6

用于在哺乳动物宿主细胞中瞬时表达人ST6Gal-I的截短变体Δ89的pM1MT表达构建体的克隆

为了使用***信号肽序列(Epo)和2个氨基酸的肽间隔物(“AP”)进行瞬时表达，克隆了人ST6Gal-I的截短变体Δ89。对于Epo-AP-Δ89 hST6Gal-I构建体，合成了经密码子优化的cDNA，参见SEQ ID NO:3。作为天然前导序列和N-端蛋白序列的替代，hST6Gal-I编码区携带***信号序列和AP接头序列以便确保宿主细胞系的分泌机制对表达的多肽的正确加工。另外，所述表达盒特征在于SalI和BamHI限制位点，其用于克隆进预消化的pM1MT载体片段(Roche Applied Science)的多克隆位点。因此，ST6Gal-I编码序列的表达是在人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子区域控制下，后面是用于调节表达的“内含子A”和BGH多腺苷酸化信号。

如在实施例8中所述，执行Epo-AP-Δ89 hST6Gal-I构建体在HEK细胞中的表达和Δ89 hST6Gal-I蛋白向细胞上清液中的分泌。

实施例7

用于在哺乳动物宿主细胞中瞬时表达人ST6Gal-I的截短变体Δ108的pM1MT表达构建体的克隆

为了使用***信号肽序列(Epo)和4个氨基酸的肽间隔物(“APPR”)进行瞬时表达，克隆了人ST6Gal-I的截短变体Δ108。对于Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I构建体，合成了经密码子优化的cDNA，参见SEQ ID NO:6。将天然的hST6Gal-I-衍生的mRNA前导序列和N-端蛋白序列与***信号序列和“APPR”接头序列交换以确保HEK宿主细胞系的分泌机制对多肽的正确加工。另外，所述表达盒特征在于SalI和BamHI位点，其用于克隆进预消化的pM1MT载体片段(Roche Applied Science)的多克隆位点。由此将hST6Gal-I编码序列的表达置于人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子区域控制下；所述表达载体进一步特征在于用于调节表达的“内含子A”和BGH多腺苷酸化信号。

如在实施例8中所述执行Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I构建体(SEQ ID NO:6)在HEK细胞中的表达和Δ108 hST6Gal-I蛋白向细胞上清液中的分泌。

实施例8

转化HEK细胞和瞬时表达和分泌

通过质粒DNA的转染实现的瞬时基因表达(TGE)是一种在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的快速策略。为了重组人蛋白的高水平表达，使用基于适应悬浮的人胚胎肾(HEK)293细胞系的TGE平台。将细胞在无血清培养基条件下在摇瓶中在37℃培养。根据生产商的指南，用与293-Free™(Merck)转染试剂复合的pM1MT表达质粒(0.5-1 mg/L细胞培养物)以大约2x 10⁶ vc/mL转染细胞。转染后3小时，加入丙戊酸，一种HDAC抑制剂(最终浓度4 mM)，以便促进表达(Backliwal等人(2008), Nucleic Acids Research 36, e96)。每天，给培养物补充6%(v/v)的基于大豆蛋白胨水解物的补料。在转染后第7天通过离心收集培养物上清液。

实施例9

从转化的HEK细胞的上清液纯化人ST6Gal-I的N-端截短变体

如在实施例8中所述转化HEK细胞。如在实施例6和7中所述制备表达构建体。

从HEK细胞发酵物的上清液中，使用经简化的纯化方案纯化两种酶变体Epo-AP-Δ89 hST6Gal-I和Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I。在第一步中，将0.1 L体积的培养物上清液过滤(0.2µm)，并将溶液在缓冲液A (20 mM磷酸钾, pH 6.5)中透析。将透析液加载到用缓冲液A平衡的S-Sepharose™ff (Fast Flow)柱(1.6 cm x 2 cm)上。用100 mL缓冲液A洗涤以后，将酶用10 mL缓冲液A和10 mL含有200 mM NaCl的缓冲液A的线性梯度洗脱，随后是使用48 mL含有200 mM NaCl的缓冲液A的洗涤步骤。通过分析型SDS凝胶电泳分析级分(4 mL)。

将含有Δ89 hST6Gal-I酶的级分合并，并在缓冲液B (50 mM MES, pH 6.0)中透析。将经透析的合并物加载到用缓冲液B平衡的肝素Sepharose ff柱(0.5 cm x 5 cm)上，并使用含有200 mM NaCl的缓冲液B洗脱。将含有所述酶的级分(1 mL)合并，并在缓冲液B中透析。在280 nm (E280nm [1 mg/mL] = 1.931)确定蛋白浓度。质谱法分析表明，分泌没有N-端氨基酸AP的重组地表达的Epo-AP-Δ89 hST6Gal-I酶。该发现是意外的，并指示当除去Epo部分时信号肽酶对表达的蛋白的罕见裂解。关于重组人Δ89 hST6Gal-I酶，确定3.75nmol/µg x min的比活性。图2显示了从HEK细胞纯化的重组Δ89 hST6Gal-I变体的SDS-PAGE的结果。

将含有Δ108 hST6Gal-I酶的级分合并，并在贮存缓冲液(20 mM磷酸钾, 100 mM氯化钠, pH 6.5)中透析。使用1.871的摩尔消光系数在280 nm的波长确定蛋白浓度。从用Epo-APPR-Δ108-hST6Gal-I表达构建体转化的HEK细胞分泌的重组蛋白的质量光谱测定分析证实了N-端序列“APPR”，因而指示信号肽酶对EPO信号序列的预期裂解。关于来自HEK细胞的重组人Δ108 hST6Gal-I变体，确定了>600 RFU/µg的比活性。图3显示了从HEK细胞纯化的重组Δ108 hST6Gal-I变体的SDS-PAGE的结果。

实施例10

使用Δ89 hST6Gal-I对人源化的单克隆抗体IgG4 MAB的唾液酸化

在唾液酸化实验中使用了高度半乳糖基化的人源化的单克隆抗体IgG4 MAB。反应混合物含有IgG4 MAB (300µg在55µL的35 mM醋酸钠/Tris缓冲液pH 7.0中)、供体底物CMP-NANA (150µg在50µL水中)和唾液酸转移酶(30µgΔ89 hST6Gal-I在20 mM磷酸钾、0.1 MNaCl、pH 6.5中)。将样品在37℃温育确定的时间。为了停止反应，将样品在-20℃冷冻。关于质量分析，将100µL变性缓冲液(6 M盐酸胍)和30µL TCEP (= 三(2-羧基乙基)膦; 0.1 mM，在变性缓冲液中稀释)加入样品中，并将样品在37℃温育1 h。使用预平衡的illustra™Nap5-Columns (GE-Healthcare)，将样品在电喷射介质[20%ACN (= 乙腈), 1%FA (= 甲酰胺)]中缓冲。通过电喷射电离质谱法分析样品，并确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA N-聚糖的含量。使用Micromass Q-Tof Ultima和Synapt G2 HDMS装置(Waters UK)，使用的软件是MassLynx V 4.1。为了确定唾液酸化的动力学，将反应物温育多达72 h。图4显示了在温育时段中在不同的时间点以后得到的不同地唾液酸化的靶蛋白的相对量。

通过质谱法确定了G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA的含量。对于已经温育2 h以后的变体Δ89 hST6Gal-I，得到了二唾液酸化形式G2+2SA的高含量(88%)，参见图4。所述数据也表明，由于Δ89 hST6Gal-I的固有的CMP依赖性的唾液酸酶(神经氨酸酶)活性，G2+0SA和G2+1SA的含量再次随时间增加。温育48 h以后，得到71%的G2+1SA含量。

图5显示了通过IgG4 MAB的不同样品的质量光谱测定分析得到的波谱。在时间点t=0 (下图)、时间点t=8 h (中图)和时间点t=48 h (上图)取样。描绘了具有G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA聚糖的IgG分子的质谱图中单电荷状态的质荷比(m/z)信号。从这些信号衍生出不同的唾液酸化的种类的相对强度。对应于图4，在t=0 h，G2+0SA是主要聚糖种类。在t=8 h，G2+2SA的信号是优势形式，而在t=48 h，G2+1SA是最丰富的种类。关于确定的数值，参见图4。

实施例11

CTP对Δ89 hST6Gal-I的唾液酸酶活性的抑制

化合物胞苷-5’-三磷酸(CTP)是唾液酸转移酶的一种已知的有效抑制剂(ScudderPR & Chantler EN BBA 660 (1981) 136-141)。为了证实唾液酸酶活性是Δ89 hST6Gal-I的内在活性，进行了抑制实验。在实验的第一阶段中，进行Δ89 hST6Gal-I对IgG4 MAB的唾液酸化以达到G2+2SA的高含量(参见实施例10)。温育7 h以后，G2+2SA含量为94%。随后，加入CTP以抑制Δ89 hST6Gal-I的唾液酸酶活性(CTP的终浓度: 0.67 mM)。在不同的时间取样，并通过质谱法确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA的含量。结果显示在图6中。与图4所示的不含抑制剂的条件相比，由唾液酸酶活性造成的G2+2SA的降解显著下降。温育72 h以后，仍然存在73%的G2+2SA。唾液酸转移酶活性的已知抑制剂对唾液酸酶活性的抑制强烈地指示，两种活性都位于Δ89 hST6Gal-I的相同活性中心中。

实施例12

Δ89 hST6Gal-I对IgG1 MAB的唾液酸化

将15 mg量的高度半乳糖基化的人源化的单克隆抗体IgG1 MAB用于唾液酸化处理。反应混合物含有确定量的IgG1 MAB (15 mg在1,854µL含有20 mM醋酸钠、50 mM Tris缓冲液的水性缓冲液中，pH 8.0)、供体底物CMP-NANA (7,500µg在2,500µL水中)和唾液酸转移酶(1,500µg重组地生产并纯化的Δ89 hST6Gal-I在202µL 20 mM磷酸钾、0.1 M NaCl中，pH 6.5)。将所述组分混合，并将得到的反应混合物在37℃温育不同的时间，包括2 h、4 h、8h、24 h和48 h。如在实施例13中所述执行唾液酸化的抗体的纯化。

为了分析唾液酸化的程度，将124µL变性缓冲液(6 M盐酸胍水溶液)和30µL TCEP(= 三(2-羧基乙基)膦; 0.1 mM，在变性缓冲液中稀释)加入76µL (对应于250µg IgG1MAB)中，并将样品在37℃温育1 h。此后，将所述样品使用预平衡的illustraTM Nap5-Columns (GE-Healthcare)在电喷射介质[20%ACN (= 乙腈), 1%FA (= 甲酰胺)]中缓冲。随后，通过电喷射电离质谱法分析样品，并确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA N-聚糖的含量。使用Synapt G2 HDMS装置(Waters UK)，使用的软件是MassLynx V 4.1。

实施例13

唾液酸化的IgG1 MAB的纯化

为了从实施例12的经温育的唾液酸化反应混合物中除去唾液酸转移酶和CMP-NANA，使用蛋白A纯化经温育的IgG1 MAB。将反应混合物应用于用25 mM Tris、25 mM NaCl、5 mM EDTA (= 乙二胺四乙酸)（pH 7）平衡过的蛋白A柱。将所述柱用25 mM Tris、25 mMNaCl、500 mM TMAC (= 四甲基氯化铵)、5 mM EDTA（pH 5.0）洗涤，并然后用25 mM Tris、25mM NaCl、5 mM EDTA（pH 7.1）洗涤。将IgG1 MAB用25 mM柠檬酸钠洗脱。为了避免在低pH的自发去唾液酸化，使用1 M Tris pH 9.0将pH调至pH 7.0。使用该程序，以纯形式得到唾液酸化的IgG1 MAB，具有12 mg的典型产量。

实施例14

在有和没有CMP存在下Δ89 hST6Gal-I对IgG1 MAB的唾液酸酶活性

胞苷单磷酸(5’-CMP, = CMP)是由唾液酸转移酶催化的反应的产物，其在糖基转移酶反应过程中从共底物CMP-NANA产生。随着唾液酸化反应的温育时间，CMP在反应混合物中积累。为了证实固有的唾液酸酶活性是CMP依赖性的，如在实施例12中所述通过在有CMP-NANA存在下与Δ89 hST6Gal-I一起温育来制备高度唾液酸化的IgG1单克隆抗体IgG1 MABG2+2SA，并如在实施例13中所述进行纯化。

向1,250µg量(在194µL中)的根据实施例12的高度唾液酸化的IgG1 MAB（具有8 h的唾液酸化温育时段）中，加入125µg唾液酸转移酶变体(30µg/300µg IgG1 MAB)。

针对CMP依赖性的唾液酸酶活性测试了不同的N-端截短hST6Gal-I酶变体：

· Δ89 hST6Gal-I (实施例9)

· Δ108 hST6Gal-I (实施例9)

· Δ57 hST3Gal-I (得自R&D Systems)

使用Δ89 hST6Gal-I (16.8µL含有125µg)、Δ108 hST6Gal-I (17.3µL含有125µg)、Δ57 hST3Gal-I (20.1µL含有125µg)和阴性对照(无酶，20.1µL超纯水)进行了四个不同实验。在没有和有CMP (10倍过量，基于摩尔浓度)存在下，针对唾液酸酶活性测试了所述酶。浓度如下所示：

Δ89 hST6Gal-I (16.8µL含有125µg):11,8µg CMP (c=0.5 mg/mL 23,6µL)

Δ108 hST6Gal-I (17.3µL含有125µg):12,3µg CMP (c=0.5 mg/mL 24,5µL)

Δ57 hST3Gal-I (20.1µL含有125µg):12,3µg CMP (c=0.5 mg/mL 24,5µL)

阴性对照(无酶):12,3µg CMP (c=0.5 mg/mL 24,5µL)

将样品在20 mM柠檬酸钠、35 mM Tris（pH 6.5）中在37℃温育。在不同的温育时间以后取等分试样作为样品，并分析。

为了分析样品中IgG1 MAB的唾液酸化程度，将124µL变性缓冲液(6 M盐酸胍水溶液)和30µL TCEP (= 三(2-羧基乙基)膦; 0.1 mM，在变性缓冲液中稀释)加入76µL (对应于250µg IgG1 MAB)中，并将样品在37℃温育1 h。此后，将所述样品使用经预平衡的illustraTM Nap5-Columns (GE-Healthcare)在电喷射介质(20%ACN (= 乙腈)、1%FA (=甲酰胺))中缓冲。随后，通过电喷射电离质谱法分析样品，并确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SAN-聚糖的含量。使用Synapt G2 HDMS装置(Waters UK)，使用的软件是MassLynx V 4.1。

结果显示在图7-10中。在不含CMP的反应混合物中，即使在温育46 h以后也没有观察到G2+2SA的降解(图7)。而在有CMP存在下，测得G2+2SA的降解，伴有G2+1SA的含量的增加(图8)。在上述的条件下，Δ89 hST6Gal-I表现出CMP依赖性的唾液酸酶活性，而Δ108hST6Gal-I (图9)和Δ57 ST3Gal-I (图10)在有CMP存在下没有表现出任何唾液酸酶活性。在后一种情况下，这解释为所述酶是对2-3糖苷键特异性的。

实施例15

在有磷酸酶酶活性存在下使用Δ89 hST6Gal-I将IgG4 MAB唾液酸化

通过将反应过程中形成的CMP的连续除去，研究了Δ89 hST6Gal-I的CMP依赖性的唾液酸酶活性的抑制。

在所述实验中，使用了酶：(i)对5'-核苷酸具有广泛特异性的5´-核苷酸酶(EC3.1.3.5)，和(ii)碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1) (二者由商业供应商提供)。这里使用的特定5'-核苷酸酶也被称作外切-5'-核苷酸酶或CD73 (分化簇73)，在人类中由NT5E基因编码。两种酶会将CMP去磷酸化，即催化CMP中的磷酸酯键的水解。在本实施例的实验中，使用所述酶降解通过唾液酸转移酶反应从共底物CMP-NANA产生的CMP。在没有CMP存在下，没有观察到Δ89 hST6Gal-I的固有唾液酸酶活性。

向1,000µg IgG4 MAB (182µL)中，加入500µg CMP-NANA (3 mg/mL, 166.7µL)、100µgΔ89 hST6Gal-I (13.4µL, 30µg/300µg IgG4 MAB)和不同量的核苷酸酶(Nu)和碱性磷酸酶(AP)。由于Zn²⁺ 离子是AP的活性所必需的，将这些加入至0.1 mM的终浓度)。使用的缓冲液是20 mM醋酸钠/Tris, pH 6.5。

将不同量的所述酶加入反应混合物中以研究所述去磷酸化酶的作用：

1)以0.1µg/µL的浓度使用5´-核苷酸酶CD73。向反应物中加入0.10µg、0.25µg和0.50µg。

2)以1µg/µL和10µg/µL的浓度使用碱性磷酸酶(AP)。向反应物中加入1µg、5µg、10µg和100µg。

加入各种量的酶以后，将样品在37℃温育。在几个时间点取样以控制唾液酸化的程度。因此，将110µL变性缓冲液(6 M盐酸胍)和30µL TCEP (0.1 mM，在变性缓冲液中稀释)加入90µL样品(约250µg IgG4 MAB)中，并将样品在37℃温育1 h。此后，将样品使用经预平衡的illustra^TM Nap5-Columns (GE-Healthcare)在电喷射介质[20%ACN (= 乙腈)、1%FA(= 甲酰胺)]中缓冲。然后，通过电喷射电离质谱法分析样品，并确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA N-聚糖的含量。使用Synapt G2 HDMS装置(Waters UK)，使用的软件是MassLynx V4.1。

在没有或有5´-核苷酸酶CD73存在下Δ89 hST6Gal-I对IgG4 MAB的唾液酸化结果描绘在图11-14中；在没有或有碱性磷酸酶存在下Δ89 hST6Gal-I对IgG4 MAB的唾液酸化结果描绘在图15-19中。如证实的，引入能够水解5’-CMP中的磷酸酯键的磷酸酶活性会有效地降低CMP介导的唾液酸酶活性并促进唾液酸转移酶活性。

Claims (20)

1.一种水性组合物，其包含

(a) 可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I，其为缺少位置1至位置89的连续序列的SEQ ID NO:1的截短缺失突变体；

(b) 胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物；

(c) 选自糖蛋白和糖脂的糖基化的靶分子，所述靶分子包含一个或多个天线，至少一个天线具有含有在半乳糖基残基的C6位置处的羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分作为末端结构；和

(d) 水溶液，其允许糖基转移酶酶活性；

其中所述水性组合物还包含在允许糖基转移酶酶活性的条件下能够水解5'-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶。

2.根据权利要求1所述的水性组合物，其中所述能够水解5'-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶选自碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和5'核苷酸酶。

3.根据权利要求1所述的水性组合物，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I缺少SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序。

4.根据权利要求3所述的水性组合物，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置109至位置406的氨基酸。

5.根据权利要求3或4所述的水性组合物，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

6.能够水解5'-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶用于在根据权利要求1-5中的任一项所述的组合物中维持唾液酸转移酶酶活性的用途。

7.能够水解5'-胞苷-单磷酸中的磷酸酯键的酶用于在根据权利要求1-5中的任一项所述的组合物中抑制唾液酸酶酶活性的用途。

8.一种在体外生产唾液酸化的靶分子的方法，所述方法包括下述步骤：

(a) 提供根据权利要求1-5中的任一项所述的水性组合物；

(b) 通过温育步骤(a)的水性组合物，形成一个或多个末端天线N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基，由此使胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸或其功能等同物作为共底物反应，由此形成5'-胞苷-单磷酸；

(c) 水解在步骤(b)中形成的5'-胞苷-单磷酸的磷酸酯键，由此减少5'-胞苷-单磷酸介导的抑制，由此维持可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的活性；

由此在体外生产所述唾液酸化的靶分子。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在0℃至40℃的温度进行所述方法。

10.根据权利要求8和9中的任一项所述的方法，其中在相同容器中进行步骤(b)和(c)。

11.根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自2 h至96h、2 h至23 h、2 h至6 h和约2 h的时间段。

12.根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自6 h至96h、6 h至23 h和约6 h的时间段。

13.根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行选自23 h至96 h和约23 h的时间段。

14.根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中将步骤(b)和(c)进行约96 h的时间段。

15.可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I用于在有5'-胞苷-单磷酸存在下体外水解N-乙酰基神经氨基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分中的α2,6糖苷键的用途，所述部分是唾液酸化的糖蛋白或糖脂中的聚糖的末端结构，所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I为缺少位置1至位置89的连续序列的SEQ ID NO:1的截短缺失突变体。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置90至位置406的氨基酸。

17.根据权利要求15和16中的任一项所述的用途，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I缺少SEQ ID NO:1中从位置90至位置108的氨基酸基序。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述可溶性的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I包含SEQ ID NO:1中从位置109至位置406的氨基酸。

20.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述可溶性的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

Images