JP2020534791A - 組換え二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、一態様では、本発明は、抗原PDL−1および抗原CTLA−4に同時に結合するタンパク質またはポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
1)第一抗原に特異的に結合する、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含む第一抗体、および
2)重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む、第二抗原に特異的に結合する抗体断片(例えば、Fv、scFv、di−scFv)
を含み、
前記抗体断片は、第一抗体の重鎖または軽鎖のN末端またはC末端に連結され、
前記第一抗原はCTLA−4であり、且つ前記第二抗原はPDL−1であり、或いは、前記第一抗原はPDL−1であり、且つ前記第二抗原はCTLA−4である。
1)第一抗原に特異的に結合する、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含む第一抗体、および
2)第二抗原に特異的に結合するscFv
を含む。
前記二重特異性抗体は、1つの前記第一抗体および2つの前記scFvを含み、また、前記第一抗体は2つのHCおよび2つのLCを含み、ここで、前記第一抗体の1つのHCのVHと前記第一抗体の1つのLCのVLとは、抗原結合部位を形成し、もう1つのHCのVHともう1つのLCのVLとは、抗原結合部位を形成する。前記各scFvは、それぞれ前記第一抗体の2つの重鎖のN末端に連結され、または、前記各scFvは、それぞれ前記第一抗体の2つの重鎖のC末端に連結される。前記第一抗原はPDL−1であり、前記第二抗原はCTLA−4である。一部の好ましい実施形態では、前記各scFvは、それぞれリンカーS1を介して前記第一抗体の各重鎖のN末端またはC末端に連結される。一部の好ましい実施形態では、前記scFvのVHおよびVLは、リンカーS2を介して連結される。一部の好ましい実施形態では、scFvの構造はNH2−VL−S2−VH−COOHであり、前記S2はリンカーである。
a)前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖(HC)および前記scFvを含み、
b)前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖(LC)を含み、
ここで、前記scFvは、リンカーS1を介して前記第一抗体のHCのN末端またはC末端に連結される。
i)前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖(LC)および前記scFvを含み、
ii)前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖(HC)を含み、
ここで、前記scFvは、リンカーS1を介して前記第一抗体のLCのN末端またはC末端に連結される。
ここで、前記第一抗体は、配列番号13に記載のHCDR1、配列番号14に記載のHCDR2、配列番号15に記載のHCDR3、配列番号16に記載のLCDR1、配列番号17に記載のLCDR2、および配列番号18に記載のLCDR3を含み、
および/または、
前記scFvは、配列番号1に記載のHCDR1、配列番号2に記載のHCDR2、配列番号3に記載のHCDR3、配列番号4に記載のLCDR1、配列番号5に記載のLCDR2、および配列番号6に記載のLCDR3を含む。
また、前記scFvは、
(1)配列番号7に記載のVHおよび配列番号9に記載のVL;または
(2)配列番号8に記載のVHおよび配列番号10に記載のVL
を含む。
前記第一抗体は、(a)配列番号1に記載のHCDR1、配列番号2に記載のHCDR2、配列番号3に記載のHCDR3、配列番号4に記載のLCDR1、配列番号5に記載のLCDR2、および配列番号6に記載のLCDR3を含み、
および/または、
前記scFvは、配列番号13に記載のHCDR1、配列番号14に記載のHCDR2、配列番号15に記載のHCDR3、配列番号16に記載のLCDR1、配列番号17に記載のLCDR2、および配列番号18に記載のLCDR3を含む。
また、前記scFvは、
(1)配列番号19に記載のVHおよび配列番号21に記載のVL、または
(2)配列番号20に記載のVHおよび配列番号22に記載のVL
を含む。
(1)配列番号28に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号11に記載の第二ポリペプチド鎖、
(2)配列番号29に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号11に記載の第二ポリペプチド鎖、
(3)配列番号28に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号23に記載の第二ポリペプチド鎖、
(4)配列番号29に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号23に記載の第二ポリペプチド鎖
を含む。
別の側面として、本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。一部の好ましい実施形態では、前記単離された核酸分子は、本発明の二重特異性抗体をコードする。
(1)第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築する。または、第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第一発現ベクター、および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第二発現ベクターを構築する。
(2)工程(1)に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入する。または、工程(1)に記載の第一発現ベクターおよび第二発現ベクターを宿主細胞に導入する。
(3)本発明の二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で、工程(2)に記載の宿主細胞を培養する。
(4)培養した宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収する。
本発明の二重特異性抗体は、生体外または被験者の体内でCTLA−4活性およびPDL−1活性を阻害すること、CTLA−4および/またはPDL−1シグナル伝達経路を遮断すること、ならびに、CTLA−4および/またはPDL−1関連疾患(例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症)を予防および/または治療することに用いられる。
本発明の二重特異性抗体は、CTLA−4および/またはPDL−1に特異的に結合することができるため、サンプルにおけるCTLA−4および/またはPDL−1の存在またはそれらのレベルを検出すること、および被験者がCTLA−4および/またはPDL−1関連疾患(例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症)に罹患するかどうかを診断することに使用することができる。
本発明において、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学的実験などの操作手順は、いずれも対応する分野でよく使用されている従来の手順である。また、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義および説明を以下に提供する。
従来技術と比較して、本発明は、少なくとも以下の有利な効果を有する。
本発明に係る一部の配列情報を表1に示す。
この実施例において、表2に示す抗CTLA−4親抗体(AB02)は、ブリストル・マイヤーズスクイブ社から購入した。まず、DNA組換え技術によって表2に示す抗PDL−1親抗体(AB01)を得た後、第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターをそれぞれ構築し、本発明の組換え抗体であるAB03およびAB04を得た。
生長良好の対数期のCHO−S細胞(Thermo Fisher社から購入、カタログ番号:A1155701)を遠心分離し、3.5×106細胞/mlで250mlのCHOgro培地(MIRUS社から購入)に播種した。実施例1で得られたトランスフェクションを行うプラスミドを、0.22μmのメンブレンフィルターで濾過することにより滅菌した。125μgの第一ポリペプチド鎖組換えプラスミドおよび125μgの対応する第二ポリペプチド鎖組換えプラスミドを、25mlのCHOgro複合体形成溶液(CHOgro Complex Formation Solution、MIRUS社から購入)に加え、1mg/mlのPEIMAX(Polysciencs社から購入)1.25mlを添加し、3回振とうして均一に混合し、10分間放置し、250mlの前記細胞培養液に加えた。培養物を37℃、5%CO2のシェーカーに入れ、24時間後、10%Sheff−CHO PF ACF(KERRY社から購入)20mlを加え、さらに7日間培養を続けて細胞培養物を回収した。
先ず、実施例2で7日間発現されたCHO−S細胞培養物を低速で遠心分離して、細胞沈殿物と上清に分離した後、さらに高速で遠心分離して清澄な試料液を得た。組換え抗体の精製は、アフィニティークローマトグラフィー法(プロテインA)とイオン交換法との二段階方法によって行った。精製に用いられた媒介物は、それぞれGE社製のMAB Select SuRe、およびMillipore社製のEshmuno CPXであった。各組換え二重特異性抗体の発現量がほぼ同等で、いずれも40〜85mg/Lの範囲内であり、また同等の条件下での抗PDL−1親抗体AB01の発現レベルと一致したことは、各組換え抗体がいずれも正常に発現され、且つ高い発現効率を有することを示した。具体的な発現レベルを表5に示す。単離、精製された組換え抗体は、限外濾過チューブにより濃縮された後、PBS溶液に溶解させた。還元条件下のSDS−PAGEを図2に示す。図2では、AB01およびAB02が還元された後に、それぞれ50kDa(重鎖)および25kDa(軽鎖)であり;二重特異性抗体AB03およびAB04の還元バンドのサイズは、それぞれ75kDa(第一ペプチド鎖)および25kDa(第二ペプチド鎖)であり、且つSEC純度は、それぞれ96.34%および96.04%であった。バンドのサイズが予想と一致たことは、各組換え二重特異性抗体がいずれも効率的に発現され、正しく組み立てられたことを示した。さらに、明らかな凝集や分解がないことは、組換え二重特異性抗体の安定性が優れたことを示した。
本実施例では、各組換え二重特異性抗体とその親抗体が同一抗原に対して結合する親和性の差、および組換え二重特異性抗体が2種類の抗原に同時に結合する相対親和性を、ELISA法でそれぞれ測定し、親抗体の能力に比べて1類種の抗原のみを遮断する能力は低くなるかどうか、2種類の抗原を同時に遮断して2つのシグナル経路を遮断することにより相乗効果を生み出すが得られるかどうかを検証する。
100ng/ウェルで組換えPDL−1−mFcタンパク質(Kelun−Biotechから入手、Uniport No.:Q9NZQ7)を96ウェルELISAプレート(Thermo社から購入)に添加し、4℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液(0.05%のTween−20を含むリン酸緩衝液)でウェルを1回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、2%BSAを含むPBS溶液を100μl/ウェルで添加し、ウェルを37℃で2時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体であるAB03とAB04および親抗体であるAB01を、1000ng/mLから11濃度勾配で3倍希釈して、100μl/ウェルでウェルに加えた。37℃でELISAプレートを2時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で3回洗浄し、100μl/ウェルでHRP結合Goat Anti−Human IgG(H+L)溶液を添加し、37℃で1時間インキュベートした。100μl/ウェルでTMB溶液を添加し、室温で反応を約5分間行った。100μl/ウェルで停止溶液を添加してELISAプレートリーダーにセットし、OD450吸光度値を読み取った。実験データについて、図3に示すように、カーブフィッティングを行い、EC50を計算した。
2つのバッチの組換えCLTA−4−Hisタンパク質(Kelun−Biotech社から入手、Uniport No.:P16410)をそれぞれPBSで希釈して、100μl/ウェルで96ウェルELISAプレートに加え、4℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液でウェルを1回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、2%BSAを含むPBS溶液を100μl/ウェルで添加し、37℃で2時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体であるAB03とAB04および抗CTLA−4親抗体であるAB02を、30nMから11濃度勾配で4倍希釈して、100μl/ウェルでウェルに加えた。37℃でELISAプレートを2時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で3回洗浄し、HRP結合Goat Anti−Human IgG(H+L)溶液を添加し、37℃で1時間インキュベートした。TMB溶液を添加し、室温で反応を約8分間行った。停止溶液を添加してELISAプレートリーダーにセットし、OD450吸光度値を読み取った。実験データについて、カーブフィッティングを行い、2つのバッチの組換えCLTA−4−His結合活性の測定結果を図4Aと図4Bに示し、EC50を計算した。
100ng/ウェルで組換えPDL−1−mFcタンパク質を96ウェルELISAプレートに添加し、4℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液(0.05%のTween−20を含むリン酸緩衝液)でウェルを1回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、2%BSAを含むPBS溶液を100μl/ウェルで添加し、37℃で2時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体を、10000ng/mLから11濃度勾配で5倍希釈して、100μl/ウェルでウェルに加えた。37℃でELISAプレートを2時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で3回洗浄し、それぞれのウェルに1.5μg/mlのCLTA−4−Hisタンパク質を100μl/ウェルで加え、37℃で2時間インキュベートし、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液でウェルを3回洗浄した。HRP結合Goat Anti−His(BioLegend社から購入)溶液を添加し、37℃で1時間インキュベートした。TMB溶液を添加し、室温で反応を約5分間行った。停止溶液を添加してELISAプレートリーダーにセットし、OD450吸光度値を読み取った。実験データについて、図5に示すように、カーブフィッティングを行い、EC50を計算した。
本実施例において、競合ELISAによって組換え二重特異性抗体がPD1とPDL−1との結合を遮断できるかどうかを検出した。
本実施例において、組換え二重特異性抗体のADCC、CDC活性を検証するために、組換え二重特異性抗体とCD16a(Val)、C1qそれぞれとの結合をELISA実験によって測定した。
100ng/ウェルで組換えCD16a(Val)タンパク(Sino Biological社から購入)を96ウェルELISAプレート(Thermo社から購入)に添加し、4℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液(0.05%のTween−20を含むリン酸緩衝液)で1回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、2%BSAを含むPBS溶液を100μl/ウェルで添加し、ウェルを25℃で2時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。50μg/mlで組換え二重特異性抗体AB03、AB04および親抗体AB01、陽性対照抗体ヒトIgG1(Kelun−Biotech社から入手)を、それぞれGoat F(ab)2 anti−Human Kappa(BIORAD社から購入)と37℃で1時間架橋反応を行った後、11濃度勾配で3倍希釈して、100μl/ウェルで混合物をウェルに加えた。25℃でELISAプレートを2時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄した。1:10000のHRP結合F(ab)2アフィニティ精製F(ab’)2断片化ヤギ抗ヒトIgG二次抗体(Jackson社から購入)を100μl/ウェルでプレートに添加し、25℃で1時間インキュベートした。ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液でウェルを5回洗浄して、100μl/ウェルでTMB溶液をウェルに添加し、室温で約30分間反応した。100μl/ウェルで停止溶液を添加してELISAプレートリーダーにセットし、OD450吸光度値を読み取った。実験データについて、図7に示すように、カーブフィッティングを行った。
組換え二重特異性抗体AB03、AB04ならびに親抗体AB01および陽性対照抗体ヒトIgG1(Kelun−Biotech社から入手)を、500μg/mlから11濃度勾配で3倍希釈して、96ウェルELISAプレートに100μl/ウェルで加え、4℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液でウェルを1回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、2%BSAを含むPBS溶液を100μl/ウェルで添加し、37℃で2時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。2%BSAを含むPBS溶液で3μg/mlに希釈したC1q(PROSPEC社から購入)を100μl/ウェルでウェルに添加した。37℃でELISAプレートを2時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で3回洗浄した。1:200に希釈したHRP抗C1q抗体(Abcam社から購入)溶液を100μl/ウェルで添加し、37℃でプレートを1時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で5回洗浄し、TMB溶液を加え、室温で約5分間反応させた。停止溶液を添加してELISAプレートリーダーにセットし、OD450吸光度値を読み取った。実験データについて、図8に示すように、カーブフィッティングを行った。
7.1 DSF(示差走査蛍光法)による組換え二重特異性抗体のTm値の測定
組換え二重特異性抗体と親抗体AB01を、PBS溶液で1mg/mLに希釈した。SYPRO(登録商標)オレンジタンパク質ゲル染色液(Orange Protein Gel Stain、Thermo社から購入、Cat#S6651)を、蒸留水で40倍希釈した。希釈サンプル12.5μL、SYPRO(登録商標)オレンジタンパク質ゲル染色液4.2μL、蒸留水8.3μLを0.2mlの遠心管に順次加えた。混合物を均一に混合した後、蛍光定量PCR装置(Thermo社から購入、モデル7500)にセットし、反応パラメーターは、25℃で3分間、1%の速度で95℃に昇温し、95℃で2分間とした。
PBS溶液で組換え二重特異性抗体を1mg/mLに希釈し、9μl/ウェルでハイスループットタンパク質安定化アナライザー(UNCHAINED LABS社、モデルUncle)に加えた。反応パラメーターは、0.3℃/minの速度で25℃〜95℃とした。
レポーター遺伝子アッセイ法によりPD−1/PDL−1抗体の生物活性を測定した。PDL−1および抗CD3−scFvを安定して発現するCHO−PDL−1−CD3L細胞株を標的細胞とし、PD−1およびルシフェラーゼ(luciferase)を安定して発現するJurkat−PD−1−NFAT細胞株をエフェクター細胞として使用した。ここで、前記ルシフェラーゼの遺伝子は、NFAT因子(転写因子)(IL−2プロモーター)によって制御される。PD−1とPDL−1との結合は、CD3下流シグナルの伝達を遮断することができるため、ルシフェラーゼの発現を阻害する。PD−1抗体またはPDL−1抗体を添加すると、この遮断効果が逆転され、ルシフェラーゼを発現させて蛍光シグナルを検出できるようになる。
ス−パ−抗原(SEB)は、APC細胞におけるMHC IIとT細胞におけるTCRとを架橋させて、T細胞を活性化し、IL−2サイトカイン発現を促進することができる。T細胞におけるPD1とAPC細胞におけるPDL−1との結合、およびT細胞におけるCTLA−4とAPC細胞におけるCD80/CD86との結合は、T細胞の活性化を阻害し、IL−2サイトカイン発現を減少させる。本発明の組換え二重特異性抗体は、PD1/PDL−1およびCTLA−4/CD80(CD86)の結合を遮断し、SEBで刺激されたPBMCの存在下でT細胞によるIL−2の分泌をさらに促進することができる。
1.実験用薬物
AB01、Tecentriq(登録商標)、およびヒトIgGは、いずれもSichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd.から提供された。ここで、Tecentriq(登録商標)は、Roche社から購入し、ヒトIgGは、Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co.,Ltdから購入した。
MC−38/H−11細胞は、マウス結腸癌MC−38(Cobioer社から購入、カタログ番号CBP60825)細胞のマウス内因性PDL−1をノックアウトし、ヒトPDL−1をトランスフェクトして発現させたモノクローナル細胞である。したがって、MC−38/H−11細胞は、高レベルのヒトPDL−1タンパクのみを発現する。
それぞれのマウスに1×105のMC−38/H−11細胞を皮下接種した。接種の翌日(D0)に、マウスをランダムにグループ分けし、1日おきに1回(Q2D)薬物を腹腔内注射(IP)した。溶媒群は、同じ体積のヒトIgG(15mg/kg)、AB01(1.5、5、15mg/kg)、Tecentriq(登録商標)(15mg/kg)を注射し、注射量は0.1mL/10g体重でした。各グループは、いずれも10匹のマウスである。
実験の指標は、腫瘍成長に対する薬物の効果を調査するために使用される。具体的な指標は、T/C%または腫瘍抑制率TGI(%)である。
実験結果を以下の表12に示す。
モデルの確立方法:非小細胞肺癌細胞HCC827(ATCCから購入、カタログ番号:CRL−2868)をNOGマウスに皮下接種して、肺癌担癌マウスモデルを確立した。腫瘍が約100mm3に達すると、薬物を投与する前に、ヒトの免疫系をシミュレートするために、活性化されたヒトPBMCをマウスに静脈内注射した。その後、薬物を投与した。
10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地で、37℃、5%CO2の条件下でMC38−1F3細胞を培養した。指数増殖期のMC38−1F3細胞を回収し、PBSに適切な濃度に再懸濁させ、メスのC57BL/6J−huCTLA−4(Gempharmatechから購入)マウスに皮下接種して、結腸癌モデルを確立した。平均腫瘍体積が約82mm3になると、腫瘍サイズに応じて、静脈内注射ヒト免疫グロブリン群(陰性対照群)、AB01対照群、AB04抗体低用量群およびAB04抗体高用量群の4つの群にマウスをランダムに群分けした。薬物を週に2回腹腔内注射し、合計3週間投与した。投与後に、マウスの腫瘍体積と体重を定期的に観察、測定した。具体的な結果を表13および図12に示す。
10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地で、37℃、5%CO2の条件下でヒト非小細胞肺癌細胞株HCC827を培養した。指数増殖期のHCC827細胞を回収し、PBSに適切な濃度に再懸濁させ、メスのNSG免疫不全マウスに皮下接種して、移植腫瘍モデルを確立した(hPBMC−NSG(Biocytogen)−HCC827ヒト免疫再建モデル)。平均腫瘍体積が約77mm3になると、腫瘍サイズに応じて、生理食塩水群(陰性対照群)、AB01対照群、AB04抗体低用量群およびAB04抗体高用量群の4つの群にマウスをランダムに群分けした。10%ウシ胎児血清、CD28/CD3およびDNaseを含むRPMI1640培地で、37℃、5%CO2の条件下でヒト末梢血単核細胞PBMCを培養した。CD3およびCD28で3日間刺激された後、活性化されたPBMCを回収し、PBSに適切な濃度に再懸濁させ、メスのNSGマウスの尾静脈に注射して免疫系を再建した。上記のように群分けした後、マウスに週2回、薬物を尾静脈注射し、合計3週間投与した。投与後に、マウスの腫瘍体積と体重を定期的に観察、測定した。具体的な結果を表14および図13に示す。
この実験では、カニクイザルの体内における組換え二重特異性抗体の毒性を調べるために、カニクイザル(オス1匹とメス1匹)に単回投与で静脈内注射を行うことで、投与群AB04とし、生理食塩水群を対照群とし、回復期間は14日間であった。実験の結果は、単回静脈内注射で500mg/kgのAB04を投与した場合、カニクイザルが薬物によく耐え、MTDが500mg/kgであることを示した。5回連続で100mg/kgの用量を週に1回繰り返し投与した場合、顕著な標的臓器への毒性および投与部位への刺激が見られず、NOAEL(無毒性量)は100mg/kgであった。FDAが発表した既存の研究データによると、抗CTLA−4抗体イピリムマブ(Ipilimumab、商品名:Yervoy)を繰り返し投与した場合、NOAELは10mg/kg(この用量では、投与後に脾臓重量の減少や多臓器リンパ球浸潤などの軽度の毒性が観察された)であり、MTDは30mg/kgであった。AB04は、CTLA−4抗体の毒性を軽減し、薬物の安全性をある程度改善した。
Claims (29)
- 1)第一抗原に特異的に結合する、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含む第一抗体、および
2)第二抗原に特異的に結合するscFv
を含む、二重特異性抗体であって、
前記scFvは、第一抗体の重鎖または軽鎖のN末端またはC末端に連結され、
前記第一抗原はCTLA−4であり、且つ前記第二抗原はPDL−1であり、或いは、前記第一抗原はPDL−1であり、且つ前記第二抗原はCTLA−4であり、
好ましくは、前記二重特異性抗体は、1つの前記第一抗体および2つの前記scFvを含み、また、前記第一抗体は2つのHCおよび2つのLCを含み、ここで、前記第一抗体の1つのHCのVHと1つのLCのVLとは、抗原結合部位を形成し、もう1つのHCのVHともう1つのLCのVLとは、抗原結合部位を形成し、
好ましくは、1つの前記scFvは、前記第一抗体の重鎖または軽鎖のN末端に連結され、もう1つの前記scFvは、前記第一抗体の重鎖または軽鎖のC末端に連結され、
好ましくは、前記各scFvは、それぞれ前記第一抗体の2つの重鎖または2つの軽鎖のN末端に連結され、又は、前記各scFvは、それぞれ前記第一抗体の2つの重鎖または2つの軽鎖のC末端に連結される
ことを特徴とする、二重特異性抗体。 - 1)第一抗原に特異的に結合する、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含む第一抗体、および
2)第二抗原に特異的に結合するscFv
を含む、二重特異性抗体であって、
前記二重特異性抗体は、1つの前記第一抗体および2つの前記scFvを含み、また、前記第一抗体は2つのHCおよび2つのLCを含み、ここで、前記第一抗体の1つのHCのVHと1つのLCのVLとは、抗原結合部位を形成し、もう1つのHCのVHともう1つのLCのVLとは、抗原結合部位を形成し、
前記各scFvは、それぞれ前記第一抗体の2つの重鎖のN末端に連結され、又は、前記各scFvは、それぞれ前記第一抗体の2つの重鎖のC末端に連結され、
前記第一抗原はPDL−1であり、且つ前記第二抗原はCTLA−4であり、
好ましくは、前記各scFvは、それぞれリンカーS1を介して前記第一抗体の各重鎖のN末端またはC末端に連結され、
より好ましくは、前記scFvのVHおよびVLは、リンカーS2を介して連結される
ことを特徴とする、請求項1に記載の二重特異性抗体。 - 前記scFvの構造は、NH2−VL−S2−VH−COOHである
ことを特徴とする、請求項2に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体の重鎖は、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH)を含み、且つ前記軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)を含み、
好ましくは、前記第一抗体は完全長抗体である
ことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体の重鎖は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4などのIgGアイソタイプであり、例えば、ヒトIgGアイソタイプであり、および/または、前記第一抗体の軽鎖はKappaアイソタイプであり、例えば、ヒトKappaアイソタイプである
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体の2つのHCは同じCDRを含み、および/または前記第一抗体の2つのLCは同じCDRを含み、
好ましくは、前記第一抗体の2つのHCは同じVHを含み、および/または前記第一抗体の2つのLCは同じVLを含み、
好ましくは、前記第一抗体の2つのHCは同じアミノ酸配列を有し、および/または前記第一抗体の2つのLCは同じアミノ酸配列を有し、
好ましくは、2つの前記scFvは同じまたは異なるアミノ酸配列を有し、
より好ましくは、2つの前記scFvは同じアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記二重特異性抗体は、2つの第一ポリペプチド鎖および2つの第二ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖のそれぞれについて:
a)前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖(HC)および前記scFvを含み、
b)前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖(LC)を含み、
ここで、前記scFvは、リンカーS1を介して前記第一抗体のHCのN末端またはC末端に連結され;
或いは、
i)前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖(LC)および前記scFvを含み、
ii)前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖(HC)を含み、
ここで、前記scFvは、リンカーS1を介して前記第一抗体のLCのN末端またはC末端に連結され、
好ましくは、前記scFvは、NH2−VH−S2−VL−COOH又はNH2−VL−S2−VH−COOHの構造を有し、ここで、前記S2はリンカーであり、
好ましくは、前記二重特異性抗体は、2つの同じ第一ポリペプチド鎖および2つの同じ第二ポリペプチド鎖を含む
ことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体の親抗体と比較して、同等または弱い第一抗原に対する結合活性を有し、
好ましくは、前記scFvの親抗体と比較して、同等または弱い第二抗原に対する結合活性を有し、
より好ましくは、前記第一抗体の親抗体と比較して同等または弱い第一抗原に対する結合活性を有し、且つ前記scFvの親抗体と比較して同等または弱い第二抗原に対する結合活性を有し、
より好ましくは、前記第一抗体の親抗体と比較して同等の第一抗原に対する結合活性を有し、且つ前記scFvの親抗体と比較して弱い第二抗原に対する結合活性を有し、
より好ましくは、PDL−1に結合する親抗体と比較して、同等の結合活性を有し、
より好ましくは、CTLA−4に結合する親抗体と比較して、弱い結合活性を有し、
より好ましくは、PDL−1に結合する親抗体と比較して同等の結合活性を有し、且つCTLA−4に結合する親抗体と比較して弱い結合活性を有する
ことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記リンカーS1および/またはS2は、例えば、(GmSn)xで示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーであり、式中、m、nは、それぞれ独立して1〜8の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8)から選択され、xは、独立して1〜20の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20)から選択され、
好ましくは、前記リンカーS1および/またはS2は、(G4S)xで示されるアミノ酸配列を有し、xは、独立して1〜6の整数から選択され、
好ましくは、前記S1および/またはリンカーS2は、配列番号25、配列番号26、および配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記リンカーS2は、配列番号25に記載のアミノ酸配列を有し、且つ前記scFvが前記第一抗体の重鎖または軽鎖のN末端に連結される場合、前記リンカーS1は、配列番号26に記載のアミノ酸配列を有し、前記scFvが前記第一抗体の重鎖または軽鎖のC末端に連結される場合、前記リンカーS1は、配列番号27に記載のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする、請求項2、3、7又は8のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記scFvのVHとVLとの間にジスルフィド結合があり、
好ましくは、前記scFvにおけるVHの44番目のアミノ酸およびVLの100番目のアミノ酸は、それぞれシステインであり、ここで、前記アミノ酸位置は、Kabat番号付けシステムに基き、また、前記scFvにおけるVHとVLは、それぞれVHの44番目とVLの100番目に位置する2つのシステイン残基の間に形成されたジスルフィド結合によって連結される
ことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体はCTLA−4に特異的に結合し、且つ前記scFvはPDL−1に特異的に結合し、
ここで、前記scFvは、配列番号1に記載のHCDR1、配列番号2に記載のHCDR2、配列番号3に記載のHCDR3、配列番号4に記載のLCDR1、配列番号5に記載のLCDR2、および配列番号6に記載のLCDR3を含む
ことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体はCTLA−4に特異的に結合し、且つ前記scFvはPDL−1に特異的に結合し、
ここで、前記第一抗体は、配列番号13に記載のHCDR1、配列番号14に記載のHCDR2、配列番号15に記載のHCDR3、配列番号16に記載のLCDR1、配列番号17に記載のLCDR2、および配列番号18に記載のLCDR3を含み、
且つ、前記scFvは、配列番号1に記載のHCDR1、配列番号2に記載のHCDR2、配列番号3に記載のHCDR3、配列番号4に記載のLCDR1、配列番号5に記載のLCDR2、および配列番号6に記載のLCDR3を含む
ことを特徴とする、請求項11に記載の二重特異性抗体。 - 前記scFvは、
(1)配列番号7に記載のVHおよび配列番号9に記載のVL;または
(2)配列番号8に記載のVHおよび配列番号10に記載のVL
を含む
ことを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体は、配列番号19に記載のVHおよび配列番号21に記載のVLを含み、且つ前記scFvは、
(1)配列番号7に記載のVHおよび配列番号9に記載のVL;または
(2)配列番号8に記載のVHおよび配列番号10に記載のVL
を含む
ことを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体はPDL−1に特異的に結合し、且つ前記scFvはCTLA−4に特異的に結合し、
ここで、前記第一抗体は、配列番号1に記載のHCDR1、配列番号2に記載のHCDR2、配列番号3に記載のHCDR3、配列番号4に記載のLCDR1、配列番号5に記載のLCDR2、および配列番号6に記載のLCDR3を含む
ことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体はPDL−1に特異的に結合し、且つ前記scFvはCTLA−4に特異的に結合し、
ここで、前記第一抗体は、配列番号1に記載のHCDR1、配列番号2に記載のHCDR2、配列番号3に記載のHCDR3、配列番号4に記載のLCDR1、配列番号5に記載のLCDR2、および配列番号6に記載のLCDR3を含み、
且つ、前記scFvは、配列番号13に記載のHCDR1、配列番号14に記載のHCDR2、配列番号15に記載のHCDR3、配列番号16に記載のLCDR1、配列番号17に記載のLCDR2、および配列番号18に記載のLCDR3を含む
ことを特徴とする、請求項1〜10、または15のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体は、配列番号7に記載のVHおよび配列番号9に記載のVLを含む
ことを特徴とする、請求項1〜10、15または16のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体は、配列番号7に記載のVHおよび配列番号9に記載のVLを含み、
且つ前記scFvは、
(1)配列番号19に記載のVHおよび配列番号21に記載のVL、または
(2)配列番号20に記載のVHおよび配列番号22に記載のVL
を含む
ことを特徴とする、請求項1〜10、15〜17のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を有し、
好ましくは、補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有し、
より好ましくは、前記第一抗体のCHは突然変異を含み、前記突然変異を含む二重特異性抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を有し、
より好ましくは、前記第一抗体のCHは突然変異を含み、前記突然変異を含む二重特異性抗体は、増強された補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有する
ことを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記第一抗体は、UniProt登録番号P01857に示されるCH、および/またはUniProt登録番号P01834に示されるCLを含み、
必要に応じて、前記CHは、UniProt登録番号P01857に示されるCHにおける117、118、120番目のアミノ酸がAに変異すること、又はUniProt登録番号P01857に示されるCHにおける97番目のアミノ酸がRに変異することを含む
ことを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 前記二重特異性抗体は、
(1)配列番号28に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号11に記載の第二ポリペプチド鎖、または
(2)配列番号29に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号11に記載の第二ポリペプチド鎖
を含むことを特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 親抗体と比較してほぼ同等の熱安定性を有する
ことを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。 - 請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、
好ましくは、請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする、単離された核酸分子。 - 請求項23に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
- 請求項23に記載の単離された核酸分子又は請求項24に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で、請求項25に記載の宿主細胞を培養すること、および、培養した宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収することを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を調製する方法。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含む医薬組成物であって、
好ましくは、例えば、抗炎症薬または免疫抑制剤などのCTLA−4および/またはPDL−1関連疾患の予防および/または治療のための薬物などの他の医薬活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記CTLA−4および/またはPDL−1関連疾患は、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍;または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、***、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍;B型肝炎、A型肝炎、およびHIVなどの感染症;などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されない
ことを特徴とする、医薬組成物。 - 被験者(例えば、ヒト)におけるCTLA−4および/またはPDL−1関連疾患(自己免疫疾患、腫瘍または感染症)の予防および/または治療、および/または生体外或いは被験者(例えば、ヒト)の生体内でのCTLA−4および/またはPDL−1の活性の阻害のための薬物の調製への、請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項27に記載の医薬組成物の使用であって、
好ましくは、前記CTLA−4および/またはPDL−1関連疾患は、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍;または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、***、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍;B型肝炎、A型肝炎、およびHIVなどの感染症;などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されなく、
好ましくは、前記被験者は、例えば、ヒトなどの哺乳動物である
ことを特徴とする、請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項27に記載の医薬組成物の使用。 - 必要とする被験者に有効量の請求項1〜22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項27に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験者(例えば、ヒト)におけるCTLA−4および/またはPDL−1関連疾患(例えば、炎症性疾患または自己免疫疾患)を予防および/または治療する方法、および/または生体外或いは被験者(例えば、ヒト)の生体内でCTLA−4および/またはPDL−1の活性を阻害する方法であって、
好ましくは、前記CTLA−4および/またはPDL−1関連疾患は、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍;または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、***、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍;B型肝炎、A型肝炎、およびHIVなどの感染症;などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されなく、
好ましくは、前記被験者は、例えば、ヒトなどの哺乳動物である
ことを特徴とする、被験者(例えば、ヒト)におけるCTLA−4および/またはPDL−1関連疾患(例えば、炎症性疾患または自己免疫疾患)を予防および/または治療する方法、および/または生体外或いは被験者(例えば、ヒト)の生体内でCTLA−4および/またはPDL−1の活性を阻害する方法。
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