JP2019514871A - 骨髄性白血病の治療方法で使用するための、ｃｄ３３とｃｄ３に結合する二重特異性構築物の投与の方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、骨髄性白血病の治療方法で使用するための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性構築物を提供し、その際、当該構築物は１４日の最長期間投与され、その後に当該構築物を投与しない少なくとも１４日の期間が続く。さらに、本発明は、治療上有効な量のそのような二重特異性構築物の投与を含む骨髄性白血病の治療方法、及び骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製についてのそのような二重特異性構築物の使用を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、骨髄性白血病の治療方法で使用するための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性構築物に関するものであり、構築物は１４日の最長期間投与され、その後構築物を投与しない少なくとも１４日の期間が続く。さらに、本発明は、治療上有効な量のそのような二重特異性構築物の投与を含む骨髄性白血病の治療方法、及び骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製についてのそのような二重特異性構築物の使用に関する。

発明の背景
ＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性のＴ細胞エンゲージャー）抗体構築物のような二重特異性分子は２つの柔軟に結合された抗体に由来する結合ドメインから作られる組換えタンパク質である。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の一方の結合ドメインは標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり；第２の結合ドメインはＴ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。その特定の設計によって、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物はＴ細胞を標的細胞に一時的に接続するのに独特に適しており、同時に標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能を強力に活性化する。第１世代のＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物（ＷＯ９９／５４４４０（特許文献１）及びＷＯ２００５／０４０２２０（特許文献２）を参照のこと）は、ＡＭＧ１０３（ブリナツモマブ）及びＡＭＧ１１０（ソリトマブ）として臨床に進んだ。これらのＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物は連続静脈内点滴を介して投与される。たとえば、ブリナツモマブは、第１週における低い初回用量、及び第１サイクルの残りの治療及び開始からの他のすべてのサイクルでの高い用量を伴う、４週間の点滴としてＢ細胞急性リンパ芽球性白血病に投与される。第２サイクルを開始する前に２週間の無治療期間がある。類似の投与スキームがソリトマブに使用されており、それは、漸増用量での少なくとも２８日間にわたる連続静脈内点滴として投与され、２つのサイクル間では２週間の無治療期間があった。

ＢｉＴＥ（登録商標）抗体構築物の第１世代の重要なさらなる開発は、ヒト及び、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３ε鎖のＮ末端での、背景に無関係のエピトープに結合する二重特異性構築物の提供だった（ＷＯ２００８／１１９５６７（特許文献３））。本出願ではまた、ＣＤ３３にさらに結合する二重特異性抗体も開示される。ＣＤ３３は、とりわけ、ほとんどの患者におけるＡＭＬ芽球、及びたぶん一部では白血病幹細胞で見いだされる骨髄分化抗原として知られる、シアル酸依存性の細胞接着分子である。従って、ＣＤ３３は骨髄性白血病の有望なマーカー及びそのような疾患の治療における標的分子として特定されている。

白血病性骨髄芽球に存在するＣＤ３３抗原に対して向けられた組換えモノクローナル抗体に連結される細胞傷害性抗生剤であるＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブ、オゾガマイシン）は、迅速認可を介してＡＭＬ患者のために米国内で認可されている。しかしながら、薬剤が確認試験にて臨床的利益を実証できなかったこと、及び市場流通後の状況で認められた静脈閉塞性疾患の漸増リスクを受けて、薬剤は製造元によって米国の市場から自主的に撤退させられた。ゲムツズマブ、オゾガマイシンで観察され、頻繁に報告された毒性には好中球減少症及び血小板減少症が含まれ、さほど頻繁ではなく報告された毒性には、点滴関連の急性反応（アナフィラキシー）、肝毒性及び静脈閉塞性疾患に関連する事象が含まれた。

ＷＯ９９／５４４４０ ＷＯ２００５／０４０２２０ ＷＯ２００８／１１９５６７

定義
本明細書で使用されるとき、単数形態「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈が明瞭に指示しない限り、複数の参照が含まれることが留意されなければならない。従って、たとえば、「一つの試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」への言及には１つ以上のそのような様々な試薬が含まれ、「その方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及には本明細書に記載されている方法について改変されてもよい、または置き換えられてもよい当業者に既知の同等の工程及び方法への言及が含まれる。

指示されない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は一連のあらゆる要素を指すと理解されるべきである。当業者は、通常程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多数の同等物を認識するであろう、または付き止めることができるであろう。そのような同等物は本発明によって包含されるように意図される。

用語「及び／または」は、本明細書のどこで使用されようとも、「及び」、「または」及び「前記用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。

用語「約」または「およそ」は本明細書で使用されるとき、所与の値または範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、さらに好ましくは±１０％以内、最も好ましくは±５％以内を意味する。

本明細書及び後に続くクレームの全体を通して文脈が要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、述べられた整数または工程または整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、他の整数または工程または整数もしくは工程の群の排除を暗示しないと理解されるであろう。本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または時には本明細書で使用されるとき用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と置き換えることができる。

本明細書で使用されるとき、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」はクレームの要素で特定されていない任意の要素、工程または成分を排除する。本明細書で使用されるとき、「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、クレームの基本的な及び新規の特徴に物質的に影響を与えない物質または工程を排除しない。

本明細書の各例では、用語「構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと交換されてもよい。

発明の詳細な説明
ブリナツモマブは、４週間の連続静脈内点滴（最初の１週間は５μｇ／ｍ^２／日及びその後１５μｇ／ｍ^２／日）、その後の２週間の無治療（１サイクル）を５サイクルまで、による急性リンパ芽球性白血病の治療で与えられる。そのようにして、この治療は、Ｂ細胞系列に限定される区画であるＣＤ１９^＋細胞の区画を取り除く。

ＣＤ３３に特異的なＢｉＴＥ（登録商標）を調べる動物試験では、そのような分子について提案された作用様式に一致して、循環している好中球、血小板及び赤血球量の低下を含む一時的な骨髄抑制が観察された。白血球の減少は、活性化された動物の試験で予想される増加と共に、提案された作用様式に一致して、循環している好中球、血小板及び赤血球量の低下を含む一時的な骨髄抑制を生じた。白血球の減少は、活性化Ｔリンパ球細胞における予想される増加及びサイトカインレベルの上昇と共にすべての用量群で観察された。発熱性好中球減少症及び好中球減少症は血液悪性腫瘍で併用化学療法前の患者で見られる一般的な事象である。

出血はＡＭＬの治療の一般的で潜在的に深刻な合併症であり、血小板減少症に続発することが最も多い。出血の合併症の中で特に重要なのは、凝固因子及び血小板の消費を伴った血液凝固の重度の血管内活性化による播種性血管内凝固（ＤＩＣ）症候群であり、重篤な出血をもたらす。成人のＡＭＬ患者では、すべて白血球増加症または急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の存在下で入院日に１％の致死的な出血が観察されている。ＡＭＬ患者における最近のデータは９．９％の出血性の死亡率を示している。加えて、このＡＭＬ患者の集団では、汎血球減少症患者における消散しない感染と末期的な出血の間に強い相関があってもよい。

免疫不全の患者が一般的な市中感染及び日和見感染の双方に感受性であることも十分に受け入れられている。感染症は癌患者の病的状態及び死亡率の主要な原因であり、特定の癌は免疫不全に本質的に関連するが、感染のリスクは細胞傷害性療法及び免疫抑制療法の強度及び持続時間に主に関係する。

上記を考慮して、本発明の根底にある課題は、急性骨髄性白血病においては状況が急性リンパ芽球性白血病に比べて異なることである。骨髄の区画には、生存に必要である広いスペクトルの細胞系列が含まれる。従って、ＡＭＬに特異的な二重特異性抗体構築物を用いたＡＭＬの治療にＡＬＬでのブリナツモマブの投与スキームを単純に移すことは可能ではない。ＣＤ３３^＋細胞を取り除く治療法のアプローチを用いたＡＭＬの効率的な治療については、治療は、生存に必須である骨髄区画におけるそれらの細胞型に対して有効であるのに十分に長いこと、且つ毒性を出来るだけ抑えるのに十分に短いことが必要である。加えて、用量は同様に有効であるのに十分である必要がある。治療の持続期間及びさらに高い用量が、生体外試験における有効性を改善できることが示されている。

この課題は、たとえば、骨髄性白血病の治療方法で使用するための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性構築物（ＣＤ３３／ＣＤ３）を提供することによって解決し、その際、構築物は１４日の最長期間で投与され、その後構築物を投与しない少なくとも１４日の期間が続く。

本発明に従って投与スケジュールを使用して、好ましくは漸増用量レベルでの段階投薬を適用して、１４日までのＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性構築物の投与期間の間に骨髄性白血病細胞を効率的に取り除くことが可能である一方で、少なくとも１４日の構築物を投与しない期間でさらに患者が骨髄区画を回復できるようにする。同時に、段階投薬は好ましくは、たとえば、サイトカイン放出症候群のような重篤な免疫的副作用のリスクを取り除く。図１から明らかなように、骨髄球系共通前駆細胞、骨髄芽球、単球を含む骨髄性細胞の表面上におけるＣＤ３３の発現はフローサイトメトリーによって文献で実証されている。さらに、マクロファージの表面上のＣＤ３３の発現は免疫組織化学を介して実証されている。骨髄区画におけるこれらのＣＤ３３^＋細胞の集団は、本明細書に記載されている二重特異性構築物による患者の治療のもとで取り除かれる。これらの細胞集団の一部がそれ自体、骨髄区画における他の細胞集団の前駆細胞であるという事実のせいで、骨髄球系共通前駆細胞の下流の細胞型すべての造血が影響を受け、汎血球減少症を生じる。

骨髄性白血病の治療の成功のために、Ｔ細胞の活性化／増殖及びそれらＴ細胞の細胞傷害性活性を誘導するには、本明細書に記載されている二重特異性構築物による患者の十分な曝露（すなわち、特定の長さの曝露）が必要とされる。しかしながら、上述の観察に基づいて、二重特異性構築物の投与期間が長く続けば続くほど、長い汎血球減少が予想される。これを念頭に置いて、本発明の根底にある課題に対する解決は、曝露の長さと、患者の骨髄区画を回復させる無治療期間を伴った白血病細胞の効果的な除去を可能にする二重特異性構築物の投薬とのバランスを取ることである。これは上述の投与スキームに反映される。

投与の期間の終了は、活性化合物、たとえば、二重特異性化合物の血清レベルが定義された閾値未満に下がるとき到達されると理解される。そのような閾値の例は、ＥＣ_９０値未満、好ましくはＥＣ_５０値未満、さらに好ましくはＥＣ_１０値未満の血清レベルである。そのようなＥＣ値はアッセイに従ってＣＤ３３^＋標的細胞とエフェクター細胞としてのヒトＰＢＬとを用いた細胞傷害性アッセイにて定義することができる。

たとえば、短い血清半減期（添付の実施例２で示すＰＫパラメータに基づいて、マウスにおけるＡＭＧ３３０の半減期は６．５〜８．７時間である一方で、ＡＭＧ３３０のヒトにおける予測半減期は約２時間である）を有することが知られているＡＭＧ３３０（配列番号１０４を参照のこと）のような二重特異性単鎖抗体構築物の場合、血清レベルは、連続ｉｖ投与を停止した後短時間以内で、すなわち、投与段階の終了のほとんど直後に上記で議論した閾値未満に下がることになる。半減期の長い二重特異性単鎖抗体構築物の場合、本発明の治療スキームに従って閾値未満に徐々に減るのを保証するために投与段階の終了が計画されなければならない。

本発明に好適な二重特異性構築物の特定のＥＣ_ｘ値を決定するためのアッセイは本明細書の以下で実施例に記載されている。

用語「二重特異性構築物」は２つの個々の標的構造への特異的な結合に好適な構造を有する分子を指す。本発明の文脈では、そのような二重特異性構築物は、標的細胞の細胞表面上のＣＤ３３及びＴ細胞の細胞表面上のＣＤ３に特異的に結合する。二重特異性構築物の好ましい実施形態では、二重特異性構築物の少なくとも一方、さらに好ましくは双方の結合ドメインは、抗体の構造及び／または機能に基づく。そのような構築物は本発明に従って「二重特異性抗体構築物」と名付けられてもよい。

用語「抗体構築物」は構造及び／または機能が、抗体、たとえば、完全長の免疫グロブリン分子または免疫グロブリン全体の構造及び／または機能に基づく分子を指す。従って抗体構築物はその特異的な標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明に係る抗体構築物は、標的結合を可能にする抗体の最小限の構造要件を含む。この最小限の要件は、たとえば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）ならびに／または少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在によって定義されてもよい。本発明に係る構築物が基づく抗体には、たとえば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体が挙げられる。

本発明に係る「抗体構築物」の定義の範囲内には、ラクダ抗体及びバイオテクノロジーまたはタンパク質工学の方法または工程によって生成される他の免疫グロブリン抗体も含む、完全長抗体または全抗体がある。これらの完全長抗体は、たとえば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体であってもよい。「抗体構築物」の定義の範囲内にはまた、完全長抗体の断片、たとえば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または「ｒＩｇＧ」（「半抗体」）もある。本発明に係る抗体構築物は、抗体変異体とも呼ばれる抗体の修飾された断片、たとえば、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ_３、ジアボディ、単鎖ジアボディ、直列ジアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、直列ジ−ｓｃＦｖ、直列トリ−ｓｃＦｖ、以下：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ_３）_２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ_３）_２、（（ｓｃＦｖ）_２−ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）_２−ＣＨ３）または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）_２のような構造によって例示される「ミニボディ」、たとえば、トリアボディまたはテトラボディのようなマルチボディ、及びたとえば、ナノボディのような単一ドメイン抗体、または他のＶ領域もしくはＶドメインとは無関係に抗原もしくはエピトープを特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨもしくはＶＬであってもよい単に１つの可変ドメイン含む単一可変ドメイン抗体であってもよい。

結合ドメインは通常、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むが、それは双方を含む必要はない。たとえば、Ｆｄ断片は２つのＶＨ領域を有し、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持することが多い。抗体断片、抗体変異体または結合ドメインの形式の追加の例には、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１のドメインを有する一価の断片であるＦａｂ断片、（２）ヒンジ領域にてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価の断片であるＦ（ａｂ’）_２断片、（３）２つのＶＨとＣＨ１のドメインを有するＦｄ断片、（４）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨのドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６）、（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（たとえば、ｓｃＦＶライブラリに由来する）。本発明に係る抗体構築物の実施形態の例は、たとえば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２に記載されている。

さらに、用語「抗体構築物」の定義には、一価、二価及び多価／多重価の構築物、従ってただ１つの抗原構造に特異的に結合する単一特異的な構築物、ならびに、異なる結合ドメインを介して１つを超える、たとえば、２つ、３つ以上の抗原構造を特異的に結合する二重特異性及び多特異性／多重特異性の構築物が含まれる。さらに、用語「抗体構築物」の定義には、ただ１つのポリペプチド鎖から成る分子、ならびに、鎖が同一であることができる（ホモ二量体、ホモ三量体、またはホモオリゴマー）または異なることができる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロオリゴマー）１つを超えるポリペプチド鎖から成る分子が含まれる。上記で特定された抗体及びその変異体または誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８８） ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０ならびにＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００９に記載されている。

本発明の抗体構築物は好ましくは「試験管内で生成される抗体構築物」である。この用語は、可変領域のすべてまたは一部（たとえば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、たとえば、試験管内のファージディスプレイ、タンパク質チップ、または抗原に結合する能力について候補配列を調べることができる他の方法で生成される上記の定義に係る抗体構築物を指す。従って、この用語は好ましくは動物における免疫細胞でのゲノム再構成によってだけで生成される配列を排除する。「組換え抗体」は組換えＤＮＡ技術または遺伝子操作の使用を介して作られる抗体である。

本発明の二重特異性抗体構築物の実施形態は「単鎖抗体構築物」である。それらの単鎖抗体構築物には、単一のペプチド鎖から成る抗体構築物の上述の実施形態のみが含まれる。

用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、軽微な量で存在してもよい考えられる天然に存在する突然変異及び／または翻訳後修飾（たとえば、異性化、アミド化）を除いて集団を構成する個々の抗体が同一である集団から得られる抗体を指す。通常、様々な決定基（またはエピトープ）に対して向けられた様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は高度に特異性であり、抗原における単一の抗原部位または抗原決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマの培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンが混入しないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示すのであって、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。

モノクローナル抗体の調製については、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技法を使用することができる。たとえば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、または組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。ヒトのモノクローナル抗体を作製するさらなる技法の例には、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４（１９８３），７２）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。

次いで、常法、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラスモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））解析を用いてハイブリドーマを評価し、特定された抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを特定することができる。関連抗原の任意の形態、たとえば、組換え抗原、天然に存在する形態、その変異体または断片、ならびに、その抗原ペプチドを免疫原として使用してもよい。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されるような表面プラスモン共鳴を使用して標的抗原、たとえば、標的細胞表面抗原ＣＤ３３またはＣＤ３イプシロンのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８３（１９９５），７−１３）。

モノクローナル抗体を作製する別の例となる方法には、タンパク質発現ライブラリ、たとえば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイのライブラリをスクリーニングすることが挙げられる。ファージディスプレイは、たとえば、Ｌａｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−１３１７，Ｃｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている。

ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して非ヒト動物、たとえば、齧歯類（たとえば、マウス、ハムスター、ウサギ、またはラット）を免疫することができる。一実施形態では、非ヒト動物はヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。たとえば、マウス抗体産生欠損のマウス系統をヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きな断片で操作することが可能である。ハイブリドーマ法を用いて、所望の特異性を持つ遺伝子に由来する抗原特異的なモノクローナル抗体を作製し、選択してもよい。たとえば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標），Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−２１，ＵＳ２００３−００７０１８５，ＷＯ９６／３４０９６，及びＷＯ９６／３３７３５を参照のこと。

非ヒト動物からモノクローナル抗体を得て、次いで当該技術で既知の組換えＤＮＡ法を用いて修飾する、たとえば、ヒト化する、脱免疫する、キメラにすること等ができる。修飾された抗体構築物の例には、非ヒト抗体のヒト化変異体、「親和性成熟させた」抗体（たとえば、Ｈａｗｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照のこと）及び変化したエフェクター機能（複数可）を持つ抗体変異体（たとえば、米国特許第５，６４８，２６０号，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２０１０），ｌｏｃ．ｃｉｔ．ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ（２００９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照のこと）が挙げられる。

免疫学では、親和性成熟は、Ｂ細胞が免疫応答の経過の間で抗原に対する高い親和性で抗体を産生する過程である。同一抗原への繰り返される曝露によって、宿主は相次いで、より良い親和性の抗体を産生するであろう。天然の原型のように、試験管内の親和性成熟は成熟と選択の原理に基づく。試験管内の親和性成熟を上手く用いて抗体、抗体構築物及び抗体断片を最適化している。放射線、化学的変異原、または変異性ＰＣＲを用いてＣＤＲ内の無作為の突然変異が導入される。加えて、鎖シャッフリングによって遺伝的多様性を増やすことができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ法を用いた２または３回の突然変異と選択は普通、低いナノモル範囲での親和性を持つ抗体断片を生じる。

抗体構築物の好ましい種類のアミノ酸の置換変異には親抗体（たとえば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域の残基を置換することが関与する。一般に、さらなる開発のために選択される得られる変異体（複数可）は、それらが生成される親抗体に比べて改善された生物特性を有するであろう。そのような置換変異体を生成するための好都合な方法には、ファージディスプレイを用いた親和性成熟が関与する。手短には、幾つかの超可変領域の部位（たとえば、６〜７部位）を変異させて各部位で考えられるアミノ酸置換のすべてを生成する。こうして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされるＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として線状ファージ粒子からの一価の形状で表示される。次いで、本明細書で開示されているようにファージディスプレイされた変異体をその生物活性（たとえば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補の超可変領域部位を特定するために、アラニン走査変異誘発を行って抗原結合に有意に寄与する超可変領域の残基を特定することができる。代わりにまたはさらに、抗原・抗体複合体の結晶構造を解析して結合ドメインと、たとえば、ヒト標的細胞表面抗原ＣＤ３３との間での接触点を特定することが有益であってもよい。そのような接触残基及び近隣の残基が本明細書で詳細に述べられる技法に係る置換の候補である。そのような変異体がいったん生成されると、変異体のパネルを本明細書に記載されているようなスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイにて優れた特性を持つ抗体がさらなる開発のために選択されてもよい。

本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物は具体的に、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である一方で、鎖（複数可）の残りは別の種に由来するまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１： ６８５１−６８５５ （１９８４））。本明細書の対象とするキメラ抗体は非ヒト霊長類（たとえば、旧世界のサル、類人猿）に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体を含む。キメラ抗体を作るための種々のアプローチが記載されている。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．ＳｃＬ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２，１９８５，Ｃａｂｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；及びＧＢ２１７７０９６を参照のこと。

抗体、抗体構築物または抗体断片は、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７にて開示された方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫」と呼ばれる方法）によっても修飾されてもよい。手短には、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて解析することができ；これらのペプチドが潜在的なＴ細胞エピトープを表す（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７で定義されたように）。潜在的なＴ細胞エピトープの検出については、「ペプチドスレディング」と呼ばれるコンピュータモデル化アプローチを適用することができ、加えて、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７にて記載されたようにＶＨ及びＶＬの配列に存在するモチーフについてヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは１８の主要ＭＨＣクラスＩＩＤＲアロタイプのいずれかに結合するので潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは可変ドメインにおける少数のアミノ酸残基を置換することによって、好ましくは単一アミノ酸置換によって取り除くことができる。通常、保存的な置換が行われる。多くは、しかし専らではなく、ヒト生殖系列の抗体配列における位置に共通するアミノ酸が使用されてもよい。ヒト生殖系列の配列は、たとえば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５），ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８にて開示されている。Ｖ ＢＡＳＥ指導書はヒト免疫グロブリン可変領域の配列の包括的な指導書を提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって示された）。これらの配列をヒト配列、たとえば、フレームワーク領域及びＣＤＲの供給源として使用することができる。たとえば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されたようなコンセンサスヒトフレームワーク領域も使用することができる。

「ヒト化された」抗体、その抗体構築物または断片（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合配列）は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列（複数可）を含有するほとんどヒト配列の抗体または免疫グロブリンである。ほとんどの部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（同様にＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、たとえば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギのような非ヒト（たとえば、齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、「ヒト化抗体」は本明細書で使用されるとき、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見いだされない残基も含んでもよい。これらの修飾を行って抗体の能力をさらに洗練し、最適化する。ヒト化抗体は、通常ヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（Ｆｃ）も含んでもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。

ヒト化抗体またはその断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメインに由来する同等の配列で置き換えることによって生成することができる。ヒト化抗体またはその断片を生成する例となる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８６），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４によって；及びＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；及びＵＳ６，４０７，２１３によって提供されている。これらの方法には、重鎖または軽鎖の少なくとも一方に由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインのすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離すること、操作すること及び発現させることが含まれる。そのような核酸は、上述のような所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、ならびに、他の供給源から得られてもよい。次いでヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングすることができる。

ヒト化抗体は、ヒトの重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現するが、内在性のマウスの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することができないマウスのようなトランスジェニック動物を用いて産生されてもよい。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されているヒト化抗体を調製するのに使用されてもよい例となるＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべてを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えてもよく、またはＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置き換えてもよい。所定の抗原へのヒト化抗体の結合に必要とされるＣＤＲの数を置き換えることだけが必要である。

ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖系列の置換及び／または復帰突然変異の導入によって最適化することができる。そのような変化した免疫グロブリン分子は当該技術で既知の幾つかの技法のいずれかによって作製することができる（たとえば、Ｔｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２，及びＥＰ２３９４００）。

用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」及び「ヒト結合ドメイン」には、たとえば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって記載されたものを含む、当該技術で既知のヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に実質的に相当する可変及び定常の領域またはドメインのような抗体領域を有する抗体、抗体構築物及び結合ドメインが含まれる。本発明のヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、たとえば、ＣＤＲにて、特にＣＤＲ３にてヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、試験管内での無作為のもしくは部位特異的な変異誘発によって、または生体内での体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでもよい。ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基によって置き換えられた少なくとも１、２、３、４、５以上の位置を有することができる。ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインの定義は本明細書で使用されるとき、それらはゼノマウスのような技術またはシステムを用いて導出することができるので抗体の非人工的に及び／または遺伝的に変化させたヒト配列のみを含む完全なヒト抗体も企図する。

一部の実施形態では、本発明の抗体構築物は「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書で開示されている抗体構築物を記載するのに使用されるとき、その製造環境の成分から特定されている、分離されている及び／または回収されている抗体構築物を意味する。好ましくは、抗体構築物はその製造環境に由来する他の成分すべてとの関連を含まないまたは実質的に含まない。たとえば、組換え形質移入細胞から生じるもののようなその製造環境の混入成分は通常、ポリペプチドについての診断または治療の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性のまたは非タンパク性の溶質を含んでもよい。抗体構築物は、たとえば、所与の試料における総タンパク質の少なくとも約５重量％または少なくとも約５０重量％を構成してもよい。単離されたタンパク質は状況に応じて総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成してもよいことが理解される。ポリペプチドは誘導性プロモータまたは高発現プロモータの使用を介して有意に高い濃度で作られてもよいので、それは高い濃度レベルで作られる。定義には、当該技術で既知である多種多様な生物及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生が含まれる。好ましい実施形態では、抗体構築物は、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（２）クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた非還元または還元の条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。しかしながら普通、単離された抗体構築物は少なくとも１つの精製工程によって調製される。

用語「結合ドメイン」は本発明と関連して、それぞれ標的分子（抗原）及びＣＤ３上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に（特異的に）結合する／それと相互作用する／それを認識するドメインを特徴とする。第１の結合ドメイン（標的細胞の表面抗原ＣＤ３３を認識する）の構造及び機能、ならびに好ましくはまた第２の結合ドメイン（ＣＤ３）の構造及び／または機能は、抗体、たとえば、完全長の免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子全体の構造及び／または機能に基づく。本発明によれば、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第２の結合ドメインは好ましくは、標的の結合を可能にする抗体の最小の構造的要件も含む。さらに好ましくは、第２の結合ドメインは少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／または第２の結合ドメインは既存の（モノクローナル）抗体に由来するＣＤＲ配列を足場に移植することによってではなくファージディスプレイ法またはライブラリスクリーニング法によって製造されるまたは入手できることが想定される。

本発明によれば、結合ドメインは好ましくはポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドには、タンパク性の部分及び非タンパク性の部分（たとえば、グルタールアルデヒドのような化学リンカーまたは化学架橋剤）が含まれてもよい。タンパク質（普通３０未満のアミノ酸を有するペプチドを含むその断片、好ましくは生物活性のある断片）は共有ペプチド結合を介して互いに結合した２以上のアミノ酸（アミノ酸の鎖を生じる）を含む。用語「ポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、普通３０を超えるアミノ酸から成る分子の群を記載する。ポリペプチドはさらに、たとえば、二量体、三量体及びさらに高次のオリゴマーのような、すなわち、１を超えるポリペプチド分子から成る多量体を形成してもよい。そのような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は同一または非同一であってもよい。そのような多量体の相当する高次の構造はその結果として、ホモ二量体またはヘテロ二量体、ホモ三量体またはヘテロ三量体、等と呼ばれる。ヘテロ多量体についての例は抗体分子であり、それは、天然に存在する形態では、２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖及び２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖から成る。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、修飾が、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾によって達成される、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は本明細書で言及されるとき、ペグ化のように化学的に修飾されてもよい。そのような修飾は当該技術で周知であり、本明細書の以下に記載されている。

少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物は、非ヒト、たとえば、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）の可変及び／または定常の領域を持つ抗体または抗体構築物と関連する課題の一部を回避する。そのような齧歯類に由来するタンパク質の存在は抗体または抗体構築物の迅速なクリアランスをもたらすことができ、または患者による抗体または抗体構築物に対する免疫応答の生成をもたらすことができる。齧歯類由来の抗体または抗体構築物の使用を回避するために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能の齧歯類への導入を介してヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築物を生成することができる。

ＹＡＣにてメガ塩基の大きさのヒト遺伝子座をクローニングし、再構築し、それらをマウスの生殖系列に導入する能力は、非常に大きなまた粗くマッピングした遺伝子座の機能的な成分を解明するだけでなく、ヒト疾患の有用なモデルを生成する強力なアプローチを提供する。さらに、マウスの遺伝子座をヒトのその同等物で置換するそのような技術の使用は、発生の間でのヒト遺伝子産物の発現及び調節、他のシステムとのそのやりとり、及び疾患の誘導や進行へのその関与に独特の洞察を提供してもよい。

そのような戦略の重要な実践的な適用は、マウスの液性免疫系の「ヒト化」である。内在性のＩｇ遺伝子が不活化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現及び組織化の根底にあるメカニズムならびにＢ細胞発生におけるその役割を研究する機会を提供する。さらに、そのような戦略は、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造のための理想的な供給源を提供してもよく―ヒト疾患における抗体療法の裏付けを満たすことに向けた重要な一里塚である。完全ヒト抗体または抗体構築物は、マウスのｍＡｂまたはマウスで誘導体化したｍＡｂに固有の免疫原性の及びアレルギー性の反応を出来るだけ抑えることが予想されるので、投与される抗体／抗体構築物の有効性及び安全性を高める。完全ヒト抗体または抗体構築物の使用は、反復する化合物投与を必要とする、たとえば、炎症、自己免疫及び癌のような慢性の及び再発性のヒト疾患の治療で実質的な利点を提供すると予想することができる。

この目標に向かったアプローチの１つは、マウス抗体の非存在下でそのようなマウスがヒト抗体の大きなレパトアを産生することになるという予想においてマウス抗体産生欠損のマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片で操作することである。大きなヒトＩｇ断片は可変遺伝子の大きな多様性ならびに抗体の産生及び発現の適正な調節を保っている。抗体の多様化や選択及びヒトのタンパク質に対する免疫寛容の欠如についてマウスの機構を活用することによって、これらのマウス系統にて再生されたヒト抗体のレパトアはヒト抗原を含む対象とする任意の抗原に対して高親和性の抗体を生じるはずである。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を持つ抗原特異的なヒトｍＡｂが容易に産生され、選択されてもよい。この一般的な戦略は最初のゼノマウスのマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−２１（１９９４）を参照のこと）。ゼノマウスの系統は、コアの可変領域及び定常領域の配列を含有する、それぞれヒトの重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂ及び１９０ｋｂのサイズの生殖系列の構成断片を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）で操作された。ヒトＩｇを含有するＹＡＣは抗体の再構成及び発現の双方についてマウスの系と互換性があることが判明し、不活化されたマウスＩｇ遺伝子の代わりになることができた。このことは、Ｂ細胞発生を誘導する、完全ヒト抗体の成人様のレパトアを産生する、及び抗原特異的なヒトｍＡｂを生成する能力によって実証された。これらの結果はまた、多数のＶ遺伝子を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大きな部分、追加の調節要素及びヒトＩｇ定常領域の導入が、感染及び免疫に対するヒトの液性反応の特徴である実質的に完全なレパトアを反復し得ることも示唆している。Ｇｒｅｅｎらの研究は最近、それぞれヒトの重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のメガ塩基の大きさの生殖系列構成のＹＡＣ断片の導入を介してヒトの抗体レパトアのおよそ８０％超の導入に拡大された。Ｍｅｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許出願番号０８／７５９，６２０を参照のこと。

ゼノマウスのマウスの作製は、米国特許出願整理番号０７／４６６，００８、整理番号０７／６１０，５１５、整理番号０７／９１９，２９７、整理番号０７／９２２，６４９、整理番号０８／０３１，８０１、整理番号０８／１１２，８４８、整理番号、０８／２３４，１４５、整理番号０８／３７６，２７９、整理番号０８／４３０，９３８、整理番号０８／４６４，５８４、整理番号０８／４６４，５８２、整理番号０８／４６３，１９１、整理番号０８／４６２，８３７、整理番号０８／４８６，８５３、整理番号０８／４８６，８５７、整理番号０８／４８６，８５９、整理番号０８／４６２，５１３、整理番号０８／７２４，７５２及び整理番号０８／７５９，６２０；及び米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、及び同第５，９３９，５９８号及び日本特許第３０６８１８０Ｂ２号、同第３０６８５０６Ｂ２号、及び同第３０６８５０７Ｂ２号にてさらに議論され、詳細に記載されている。また、Ｍｅｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）ならびにＧｒｅｅｎ及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８），ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０及びＷＯ０３／４７３３６も参照のこと。

代わりのアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃを含む他者は「ミニ遺伝子座」のアプローチを利用している。ミニ遺伝子座のアプローチでは、Ｉｇ遺伝子座に由来する小片（個々の遺伝子）の包含によって外来性のＩｇ遺伝子座が模倣される。従って、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、及び第２の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）が動物への挿入のための構築物を形成する。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉ，ｅｔ ａｌの米国特許第５，５４５，８０７号及びそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、及び同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号、及び同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓ，ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、及び同第５，７８９，２１５号、及びＣｈｏｉ及びＤｕｎｎの米国特許第５，６４３，７６３号、及びＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願整理番号０７／５７４，７４８、整理番号０７／５７５，９６２、整理番号０７／８１０，２７９、整理番号０７／８５３，４０８、整理番号０７／９０４，０６８、整理番号０７／９９０，８６０、整理番号０８／０５３，１３１、整理番号０８／０９６，７６２、整理番号０８／１５５，３０１、整理番号０８／１６１，７３９、整理番号０８／１６５，６９９、整理番号０８／２０９，７４１に記載されている。また、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４及び米国特許第５，９８１，１７５号も参照のこと。さらにＴａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｔｕａｉｌｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），及びＴｕａｉｌｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照のこと。

Ｋｉｒｉｎもミクロ細胞の融合を介して染色体の大きな一部分または染色体全体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成を実証している。欧州特許出願番号７７３２８８及び８４３９６１を参照のこと。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓはヒト抗体の潜在的生成についての技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスをヒトのリンパ系細胞、たとえば、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞で再構成する。次いでマウスは抗原で免疫され、その抗原に対する免疫応答を生成することができる。米国特許第５，４７６，９９６号；同第５，６９８，７６７号；及び同第５，９５８，７６５を参照のこと。

ヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応はキメラ抗体またはさもなければヒト化抗体を調製する産業をもたらしている。しかしながら、特に抗体の長期にわたるまたは複数回用量の利用では、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が観察されるであろうことが予想される。従って、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡの反応の懸念及び／または影響を無効にするために、標的細胞表面抗原に対する完全ヒト結合ドメイン及びＣＤ３対する完全ヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましい。

用語「に（特異的に）結合する」、「を（特異的に）認識する」、「に（特異的に）向けられる」及び「と（特異的に）反応する」は本発明に従って、結合ドメインが標的タンパク質または抗原（標的細胞の表面抗原ＣＤ３３／ＣＤ３）上に位置するエピトープの、１個以上、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは少なくとも３個、及び最も好ましくは少なくとも４個のアミノ酸と相互作用するまたは特異的に相互作用することを意味する。

用語「エピトープ」は、たとえば、抗体または免疫グロブリンまたは抗体または免疫グロブリンの誘導体または断片のような結合ドメインが特異的に結合する抗原の部位を指す。「エピトープ」は抗原性であるので、用語エピトープは「抗原構造」または「抗原決定基」とも呼ばれることがある。従って、結合ドメインは「抗原の相互作用部位」である。前記結合／相互作用は「特異的な認識」を定義するとも理解される。用語「エピトープ」は本出願と関連して完全な抗原構造を記載するとして理解されるのに対して、用語「エピトープの一部」は所与の結合ドメインの特定のエピトープの１つ以上の亜群を記載するのに使用されてもよい。

「エピトープ」は、隣接するアミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みにより並置される隣接しないアミノ酸の双方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸の一次構造が、認識されるエピトープを構成するエピトープである。線状エピトープには通常、独特の配列にて少なくとも３個または少なくとも４個、さらに普通には少なくとも５個または少なくとも６個または少なくとも７個、たとえば、約８個〜約１０個のアミノ酸が含まれる。

「立体構造エピトープ」は線状エピトープとは対照的に、エピトープを構成するアミノ酸の一次構造が、認識されるエピトープの単独の定義成分ではないエピトープ（たとえば、アミノ酸の一次配列が結合ドメインによって必ずしも認識されないエピトープ）である。通常、立体構造エピトープは線状エピトープに比べて多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドまたはタンパク質またはそれらの断片（本発明の文脈では、結合ドメインの１つについての抗原は標的細胞の表面抗原ＣＤ３３の範囲内に含まれる）の三次元構造を認識する。たとえば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造形成すると、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチドの主鎖は並置されるようになって抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構造を決定する方法には、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光分析、及び部位特異的スピン標識及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光分析が挙げられるが、これらに限定されない。

結合ドメインとエピトープまたはエピトープ群との間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原（ここでは、それぞれ標的細胞の表面抗原ＣＤ３３及びＣＤ３）上のエピトープまたはエピトープ群に対して相当な親和性を示し、一般に標的細胞の表面抗原ＣＤ３３及びＣＤ３以外のタンパク質または抗原との有意な反応性を示さないことを意味する。「相当な親和性」には、約１０^−６Ｍ（ＫＤ）以上に強い親和性による結合が含まれる。好ましくは、結合は、結合親和性が約１０^−１２〜１０^−８Ｍ、１０^−１２〜１０^−９Ｍ、１０^−１２〜１０^−１０Ｍ、１０^−１１〜１０^−８Ｍ、好ましくは約１０^−１１〜１０^−９Ｍである場合に特異的であると見なされる。結合ドメインが標的と特異的に反応するかまたは結合するかどうかは、とりわけ、前記結合ドメインの標的タンパク質または抗原との反応を前記結合ドメインの標的細胞の表面抗原ＣＤ３３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって容易に調べることができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原ＣＤ３３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原とは本質的にまたは実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは標的細胞の表面抗原ＣＤ３３以外のタンパク質に結合することができず、且つ第２の結合ドメインはＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。

用語「本質的に／実質的に結合しない」または「結合することができない」は、本発明の結合ドメインが標的細胞の表面抗原ＣＤ３３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原には結合しない、すなわち、標的細胞の表面抗原ＣＤ３３またはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との３０％を超える、好ましくは２０％以下の、さらに好ましくは１０％以下の、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％以下の反応性を示さず、それによってそれぞれ標的細胞の表面抗原ＣＤ３３またはＣＤ３への結合が１００％であると設定される。

特異的な結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列の特定のモチーフによって達成されると考えられている。従って、結合は、その一次、二次及び／または三次構造の結果として、ならびに、前記構造の二次的修飾の結果として達成される。抗原の相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用は前記部位の抗原への単純な結合を生じてもよい。さらに、抗原の相互作用部位とその特異的な抗原との特異的な相互作用は、代わりにまたはさらに、たとえば、抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化等のせいでシグナルの開始を生じてもよい。

用語「可変」は、その配列にて可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性を決定するのに関与する抗体または免疫グロブリンドメインの一部（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）の対合は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。

可変性は抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布するわけではない。それは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインにて集中する。これらのサブドメインは「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのさらに保存された（すなわち、超可変ではない）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれ、三次元空間で６つのＣＤＲのための足場を提供して抗原結合表面を形成する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、βシート構造を接続する、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続され、βシート構造を大部分導入する４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含む。各鎖における超可変領域はＦＲＭに非常に近接して一緒に保持され、他の鎖に由来する超可変領域は抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照のこと）。

用語「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」は、その３つが軽鎖可変領域の結合特性（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）を構成し、その３つが重鎖可変領域の結合特性（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）を構成する相補性決定領域をさす。ＣＤＲは抗体の抗原との特異的な相互作用に関与する残基のほとんどを含有するので、抗体分子の機能的活性に寄与し；それらは抗原特異性の主要な決定基である。

正確な定義のＣＤＲの境界及び長さは異なる分類及び番号付け方式の対象である。従って、ＣＤＲは、本明細書に記載されている番号付け方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、コンタクトまたは任意の他の境界定義によって言及されてもよい。様々な境界にもかかわらず、これらの方式のそれぞれは可変配列の範囲内でいわゆる「超可変領域」を構成するものにてある程度の重複を有する。従って、これらの方式に係るＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界領域で異なってもよい。たとえば、Ｋａｂａｔ（異種間配列の可変性に基づくアプローチ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原・抗体複合体の結晶研究に基づくアプローチ）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の基準はＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓＡｂＭ抗体モデル化ソフトウエアによって使用されているＡｂＭ定義である。たとえば、抗体可変ドメインのタンパク質の配列及び構造の分析。Ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照のこと。２つの残基の特定法が重複するが、同一領域ではない領域を定義する程度に、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従った番号付けが好ましい。

通常、ＣＤＲは標準構造として分類することができるループ構造を形成する。用語「標準構造」は抗原結合（ＣＤＲ）ループによって取り入れられる主要鎖の構造を指す。匹敵する構造研究から、６つの抗原結合ループのうち５つは利用できる構造の限定されたレパトアのみを有することが見いだされている。各標準構造はポリペプチド主鎖のねじれ角を特徴とすることができる。従って、抗体間の相当するループは、ループのほとんどの部分でのアミノ酸配列の高い可変性にもかかわらず、非常に類似する三次元構造を有してもよい（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、取り入れられたループ構造とそれを取り囲むアミノ酸配列との間には関係がある。特定の標準クラスの構造は、ループの長さ及びループ内、ならびに、保存されたフレームワーク内（すなわち、ループの外側）の重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。従って、特定の標準クラスへの割り当てはこれらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。

用語「標準構造」には、たとえば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって分類されたように、抗体の線状配列に関する考慮も含まれてもよい。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（方式）は、一貫した方法で抗体可変ドメインのアミノ酸残基を番号付けするために広く取り入れられた標準であり、本明細書のどこかでも言及されるように本発明で適用される好ましいスキームである。追加の構造的な考察を用いて抗体の標準構造を決定することもできる。たとえば、Ｋａｂａｔの番号付けによって完全には反映されないそれらの差異をＣｈｏｔｈｉａらの番号付け方式によって記載することができ、及び／または、他の技法、たとえば結晶学及び二次元や三次元のコンピュータによるモデル化によって示すことができる。従って、所与の抗体配列は、とりわけ、適当なシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）配列を特定するのを可能にする標準クラスに入れられてもよい（たとえば、ライブラリにて種々の標準構造を含むための願望に基づいて）。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け及びＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．によって記載されたような構造的な考察及び抗体構造の標準態様を解釈するためのそれらの意味合いは文献に記載されている。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元構造は当該技術で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと。

軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖の可変領域の範囲内での抗原結合における最も重要な決定基を構成してもよい。一部の抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間での接触の主要な領域を構成すると思われる。ＣＤＲ３のみが変化する試験管内の選択スキームを用いて抗体の結合特性を変えることができ、またはどの残基が抗原の結合に寄与するのかを決定することができる。従って、ＣＤＲ３は通常、抗体結合部位内での分子多様性の最大の供給源である。たとえば、Ｈ３は２つのアミノ酸残基ほど短くてもよいし、または２６を超えるアミノ酸であってもよい。

古典的な完全長の抗体または免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖はジスルフィド共有結合１つによって重（Ｈ）鎖に連結される一方で、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは普通ＣＨ１とされる。定常（「Ｃ」）ドメインは抗原結合に直接関与しないが、たとえば、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性及び補体の活性化のような種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は重鎖の定常ドメイン内に含まれ、たとえば、細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。

構築及び体細胞変異の後の抗体遺伝子の配列は高度に変化し、これらの変化した遺伝子は１０^１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２^ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。従って、免疫系は免疫グロブリンのレパトアを提供する。用語「レパトア」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全面的にまたは部分的に由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。配列（複数可）は重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメントならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントの生体内での再構成によって生成されてもよい。或いは、配列（複数可）は再構成が起きる反応（たとえば、試験管内での刺激）に対して細胞から生成することができる。或いは、配列（複数可）の一部または全部はＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発及び他の方法によって得られてもよい。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照のこと。レパトアは、ただ１つの配列だけを含んでもよいし、または遺伝的に多様な収集におけるものを含む複数の配列を含んでもよい。

用語「二重特異性」は本明細書で使用されるとき、「少なくとも二重特異性である」構築物を指し、すなわち、それは少なくとも第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、その際、第１の結合ドメインは１つの抗原または標的に結合し、第２の結合ドメインは別の抗原または標的（ここでは、ＣＤ３）に結合する。従って、本発明に係る二重特異性の構築物は少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の用語「二重特異性の構築物」はまた、たとえば、三重特異性の構築物のような多重特異性の構築物も包含し、これは３つの結合ドメインを含み、または構築物は３を超える（たとえば、４、５・・・）特異性を有する。本発明と関連して使用される構築物が抗体構築物である場合、これらを包含する相当する構築物はたとえば、三重特異性の抗体構築物のような多重特異性の抗体構築物であり、これは３つの結合ドメインを含み、または構築物は３を超える（たとえば、４、５・・・）特異性を有する。

本発明に係る抗体構築物が（少なくとも）二重特異性であることを考えると、それらは天然には存在せず、且つそれらは天然に存在する産物とは顕著に異なる。従って、「二重特異性の」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性で少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッドの抗体または免疫グロブリンである。二重特異性の抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む種々の方法によって作製することができる。たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ及びＬａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照のこと。

本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでもよいし、または含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は本発明に従って、本発明の抗体構築物の一方の（可変及び／または結合）ドメインと別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列が互いに連結されるアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は前記ペプチドリンカーが重合活性を含まないことである。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号及び同第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載されたものがある。ペプチドリンカーを用いて他のドメインまたはモジュールまたは領域（たとえば、半減期延長ドメイン）を本発明の抗体構築物に結合することができる。

リンカーが使用される事象では、このリンカーは好ましくは、第１のドメイン及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立してその差次的な結合特異性を保持することができるようにするのに十分な長さ及び配列である。本発明の抗体構築物における少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーについては、少数にすぎないアミノ酸残基、たとえば、１２個以下のアミノ酸残基を含むそれらのペプチドリンカーが好ましい。従って、１２、１１、１０、９、８、７、６または５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは４、３、２または１個のアミノ酸（複数可）を含み、Ｇｌｙが豊富なリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」の文脈で特に好ましい「単一」アミノ酸はＧｌｙである。従って、前記ペプチドリンカーは単一アミノ酸Ｇｌｙから成ってもよい。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわち、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒまたはそのポリマー、すなわち、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ｘは１以上の整数である。二次構造の促進を含まない前記ペプチドリンカーの特徴は当該技術で既知であり、たとえば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３），Ｃｈｅａｄｌｅ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２），２９，２１−３０）ならびにＲａａｇ及びＷｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ，（１９９５），９（１），７３−８０）に記載されている。どんな二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの互いの連結は、たとえば、実施例に記載されているような遺伝子操作によって提供することができる。融合され、操作可能に連結された二重特異性の単鎖構築物を調製し、哺乳類細胞または細菌にてそれを発現させる方法は当該技術で周知である（たとえば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。

二重特異性の単鎖分子は当該技術で既知であり、ＷＯ９９／５４４４０，Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５，Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７，Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３，Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。単鎖抗体の作製について記載された技法（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２０１０），ｌｏｃ．ｃｉｔ．ならびにＬｉｔｔｌｅ（２００９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．）を適合させて選んだ標的（複数可）を特異的に認識する単鎖抗体構築物を作製することができる。

二価（二価とも呼ぶ）または二重特異性の単鎖可変断片（式（ｓｃＦｖ）_２を有するｂｉ−ｓｃＦｖｓまたはｄｉ−ｓｃＦｖｓ）は２つのｓｃＦｖ分子を連結することによって操作することができる。これら２つのｓｃＦｖ分子が同一の結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子は好ましくは二価と呼ばれるであろう（すなわち、それは同一標的エピトープに対して２つの価数を有する）。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子は好ましくは二重特異性と呼ばれるであろう。連結は、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域とを持つ単一のペプチド鎖を作製し、直列のｓｃＦｖを得ることによって行うことができる（たとえば、Ｋｕｆｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２（５）：２３８−２４４を参照のこと）。別の可能性は、２つの可変領域が一緒に折り畳むには短すぎるリンカーペプチド（たとえば、約５のアミノ酸）を持つｓｃＦｖ分子を作り出して強制的にｓｃＦｖを二量体化することである。この型はジアボディとして知られている（たとえば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ，ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ，１９９３），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９０（１４）：６４４４−８を参照のこと）。

単一ドメイン抗体は、他のＶ領域またはドメインとは無関係に特定の抗原に選択的に結合することができる単に１つ（単量体）の抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体はラクダ科動物で見いだされた重鎖抗体から操作され、これらはＶ_ＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚類も、Ｖ_ＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有する。代替のアプローチは、たとえば、ハムスターまたは齧歯類に由来する共通の免疫グロブリンの二量体可変ドメインを単量体に分け、よって単一ドメインＡｂとしてＶＨまたはＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体のほとんどの研究が現在のところ重鎖可変ドメインに基づくが、軽鎖に由来するナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ、または単一可変ドメイン抗体と呼ばれている。

（単一ドメインｍＡｂ）_２は従って、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶ_ＮＡＲを含む群から個々に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体で構成されるモノクローナル抗体構築物である。リンカーは好ましくはペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ」は少なくとも１つの上述のような単一ドメイン抗体と１つの上述のようなｓｃＦｖ分子で構成されるモノクローナル抗体構築物である。再び、リンカーは好ましくはペプチドリンカーの形態である。

本発明の抗体構築物は、標的抗原ＣＤ３３及びＣＤ３に結合する機能に加えて、さらなる機能を有することも想定される。この形式では、抗体構築物は、標的抗原への結合を介して標的細胞を標的とし、ＣＤ３の結合を介して細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を媒介し、たとえば、標識（蛍光等）、毒素または放射性核種等のような治療剤のようなさらなる機能を提供することによる三機能性または多機能性の抗体構築物である。

抗体構築物の共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれ、常にではないが、一般に翻訳後に行われる。たとえば、抗体構築物の共有結合修飾の幾つかの型が、抗体構築物の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端の残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入される。

システイニル残基を最も一般的に、たとえば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び相当するアミン）と反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−プロピルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基は、この作用物質がヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的であるためｐＨ５．５〜７．０にてジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。臭化パラ−ブロモフェナシルも有用であり；反応は好ましくは０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムｐＨ６．０にて実施される。リシニル及びアミノ末端残基は無水コハク酸または他のカルボン酸と反応する。これらの作用物質による誘導体化はリシニル残基の荷電を反転する効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに好適な他の試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２,４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼが触媒する反応が挙げられる。

アルギニル残基は、１つまたは幾つかの従来の試薬、それらの間で、フェニルグリオキサール、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化はグアニジン官能基の高いｐＫａのゆえに反応がアルカリ条件で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬はリジンの基、ならびに、アルギニンイプシロン−アミノ基と反応してもよい。

チロシル残基の具体的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することにおいて特に興味を持って行われてもよい。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いてそれぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。^１２５Ｉまたは^１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化し、放射性免疫アッセイ、及び好適であると上記に記載されているクロラミンＴ法にて使用するための標識されたタンパク質を調製する。

カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、その際、Ｒ及びＲ’は、たとえば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような任意で異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。

二官能性の作用物質による誘導体化は、種々の方法での使用のための水不溶性の支持体マトリクスまたは表面に本発明の抗体構築物を架橋するのに有用である。一般に使用される架橋剤には、たとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタールアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性のイミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。或いは、たとえば、シアン臭化物活性化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリクス及び米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に記載されている反応性基質はタンパク質の不動化に採用される。

グルタミニル残基及びアスパラギニル残基はそれぞれ相当するグルタミル残基及びアスパルチル残基に脱アミド化されることが多い。或いは、これらの残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲の中に入る。

他の修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基もしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

本発明の範囲の中に含まれる抗体構築物の共有結合修飾の別の型はタンパク質のグリコシル化のパターンを変えることを含む。当該技術で既知のように、グリコシル化のパターンは、タンパク質の配列（たとえば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の双方に左右され得る。特定の発現系が以下で議論されている。

ポリペプチドのグリコシル化は通常Ｎ−結合型またはＯ−結合型である。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリンを除くアミノ酸である三ペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンはアスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれら三ペプチド配列のいずれかの存在は潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ−結合型のグリコシル化は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用されてもよいが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つの結合を指す。

抗体構築物へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が上述の三ペプチド配列（Ｎ−結合型グリコシル化部位用）の１つ以上を含有するように配列を変えることによって好都合に達成される。変化は、出発配列への１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加またはそれによる置換（Ｏ−結合型グリコシル化部位用）によって行われてもよい。容易にするために、抗体構築物のアミノ酸配列は好ましくは、特に所望のアミノ酸に翻訳するコドンが生成されるように選択前のベースでポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによってＤＮＡレベルでの変化を介して変えられる。

抗体構築物にて炭水化物部分の数を増やす別の手段はタンパク質への配糖体の化学結合または酵素結合によるものである。これらの手順は、それらがＮ−結合型及びＯ−結合型のグリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもののような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されてもよい。これらの方法はＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。

出発抗体構築物に存在する炭水化物部分の除去は化学的にまたは酵素的に達成されてもよい。化学的な脱グリコシル化は化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖の切断を生じる一方で、ポリペプチドはインタクトのままである。化学的な脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されたように種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されたように化合物ツニカマイシンの使用によって防がれてもよい。ツニカマイシンはタンパク質・Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。

抗体構築物の他の修飾が本明細書で企図される。たとえば、抗体構築物の共有結合修飾の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号で述べられた方法にて、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーのような種々のポリオールを含むが、これらに限定されない種々の非タンパク性ポリマーに抗体構築物を連結することを含む。加えて、当該技術で既知であるように、たとえば、ＰＥＧのようなポリマーの付加を促すために、抗体構築物の中での種々の位置でアミノ酸置換を行ってもよい。

一部の実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は１つ以上の標識の付加を含む。種々の長さのスペーサーアームを介して標識基を抗体構築物に結合して潜在的な立体障害を低減してもよい。タンパク質を標識する種々の方法は当該技術で既知であり、本発明を実施することにおいて使用することができる。用語「標識」または「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、それらが検出されるであろうアッセイに応じて種々のクラスに分類され、―以下の例：
（ａ）放射性同位元素または放射性核種（たとえば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）のような放射活性があってもよい、または重同位体であってもよい同位体標識
（ｂ）磁気標識（たとえば、磁性粒子）
（ｃ）酸化還元活性のある部分
（ｄ）光学色素（発色団、リン光体及び蛍光体を含むが、これらに限定されない）、たとえば、蛍光基（たとえば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン光体）、化学発光基及び「小分子」蛍光体またはタンパク性蛍光体であることができる蛍光体
（ｅ）酵素基（たとえば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
（ｆ）ビオチン化基
（ｇ）二次レポーター（たとえば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ
が挙げられるが、これらに限定されない。

「蛍光標識」によって、その固有の蛍光特性によって検出されてもよい任意の分子を意味する。好適な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光体を含む好適な光学色素は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。

好適なタンパク性蛍光標識には、ＧＦＰのＲｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種（Ｃｈａｌｆｉｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２−８０５）を含む緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ、８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ１Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）も挙げられるが、これらに限定されない。

ロイシンジッパードメインは、それらが見いだされるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは元々幾つかのＤＮＡ結合タンパク質にて特定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１７５９）、以来種々の異なるタンパク質で見いだされてきた。既知のロイシンジッパーの間では、二量体化するまたは三量体化する天然に存在するペプチド及びその誘導体がある。可溶性のオリゴマータンパク質を作製するのに好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺界面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーはＨｏｐｐｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３４４：１９１に記載されている。それに融合される異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。アプローチの１つでは、ロイシンジッパーに融合された標的抗原抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を好適な宿主細胞にて発現させ、生じる可溶性オリゴマーの標的抗原抗体断片または誘導体を培養上清から回収する。

本発明の抗体構築物はまた、たとえば、分子の単離に役立つ、または分子の適合させた薬物動態プロファイルに関係する、追加のドメインを含んでもよい。抗体構築物の単離に役立つドメインは、単離方法、たとえば、単離カラムで捕捉することができるペプチドモチーフまたは二次的に導入される部分から選択されてもよい。そのような追加のドメインの非限定の実施形態は、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡＴ−タグ、ＨＡ−タグ、ＴＡＰ−タグ、ＧＳＴ−タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ−タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−タグ）、Ｆｌａｇ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ及びその誘導体（たとえば、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ）及びＨｉｓ−タグとして知られるペプチドモチーフを含む。特定されたＣＤＲを特徴とする本明細書で開示されている抗体構築物はすべてＨｉｓ−タグドメインを含むことが好ましく、それは一般に、分子のアミノ酸配列にて連続するＨｉｓ残基の繰り返し、好ましくは６つのＨｉｓ残基の繰り返しとして知られる。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞介在性の免疫において中心的な役割を担うリンパ球（それ自体白血球の１種）の１種である。それぞれ異なる機能を持つＴ細胞の幾つかのサブセットがある。Ｔ細胞は、細胞表面上でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によってＢ細胞及びＮＫ細胞のような他のリンパ球から区別することができる。ＴＣＲは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することに関与し、２つの異なるタンパク質鎖で構成される。Ｔ細胞の９５％では、ＴＣＲはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖とから成る。ＴＣＲが抗原性ペプチドとＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）に結合すると、Ｔリンパ球は、関連する酵素、共受容体、特殊化されたアダプター分子及び活性化されたまたは放出された転写因子が媒介する一連の生化学的事象を介して活性化される。

ＣＤ３受容体複合体はタンパク質複合体であり、４つの鎖で構成される。哺乳類では、複合体はＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球にて活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能力に必須である免疫受容体チロシン活性化モチーフまたは略してＩＴＡＭとして知られる単一の保存されたモチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトでは第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。好ましいヒトＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインの配列を配列番号１に示し、ヒトＣＤ３イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７に相当する最も好ましいＣＤ３結合エピトープを配列番号２で表す。

多重特異性の、少なくとも二重特異性の抗体構築物によるＴ細胞の動員を介した標的細胞の再指示された溶解には細胞溶解性シナプス形成及びパーフォリンやグランザイムの送達が関与する。結合したＴ細胞は連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原の処理及び提示、またはクローン性Ｔ細胞の分化を妨害する免疫回避メカニズムによって影響されない。たとえば、ＷＯ２００７／０４２２６１を参照のこと。

二重特異性構築物が媒介する細胞傷害性は種々の方法によって測定することができる。エフェクター細胞は、たとえば、刺激され、濃縮された（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または非刺激の（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であることができる。標的細胞がマカク起源である、マカクの標的細胞抗原を発現している、またはそれで形質移入されているのであれば、エフェクター細胞もマカクＴ細胞株、たとえば、４１１９ＬｎＰｘのようなマカク起源であるべきである。標的細胞は、標的細胞抗原、たとえば、ヒトまたはマカクの標的細胞抗原（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するべきである。標的細胞は、安定的にまたは一時的に標的細胞抗原、たとえば、ヒトまたはマカクの標的細胞抗原で形質移入されている細胞株（たとえば、ＣＨＯ）であることができる。或いは、標的細胞は、標的細胞抗原陽性の天然のエフェクター細胞株、たとえば、ヒト癌細胞株であることができる。普通、ＥＣ５０値は、細胞表面上で標的細胞抗原を高いレベルで発現している標的細胞株では低いと予想される。エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は普通、約１０：１であるが、変化することもできる。二重特異性構築物の細胞傷害活性は、^５１クロム放出アッセイ（約１８時間のインキュベート時間）またはＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベート時間）にて測定することができる。アッセイのインキュベート時間（細胞傷害性反応）の修正も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は当業者に周知であり、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰに基づくアッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン形成法、及びＥＣＩＳ技術が含まれる。

本発明の二重特異性構築物が媒介する細胞傷害活性は、好ましくは、細胞に基づく細胞傷害性アッセイにて測定される。それは、最大有効濃度の半分（ベースラインと最大の間の中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体構築物の濃度）に相当するＥＣ_５０値で表される。好ましくは、二重特異性構築物のＥＣ_５０値は、≦２０．０００ｐｇ／ｍｌ、さらに好ましくは≦５０００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦３５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。

上記で与えられたＥＣ_５０値のいずれかを、たとえば、添付の実施例に記載されている方法に従って細胞に基づく細胞傷害性アッセイの示されたシナリオのいずれか１つと組み合わせることができる。たとえば、（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞またはマカクＴ細胞株がエフェクター細胞として使用される場合、本発明の二重特異性構築物（たとえば、標的細胞抗原／ＣＤ３二重特異性の構築物）のＥＣ_５０値は、好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌ、さらに好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。このアッセイにて、標的細胞が標的抗原（たとえば、標的細胞抗原ＣＤ３３）で形質移入された（ヒトまたはマカク）の細胞、たとえば、ＣＨＯ細胞である場合、二重特異性の構築物）のＥＣ_５０値は、好ましくは≦１５０ｐｇ／ｍｌ、さらに好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦３０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。標的細胞が陽性の天然のエフェクター細胞（たとえば、標的細胞抗原の）である場合、ＥＣ_５０値は、好ましくは≦３５０ｐｇ／ｍｌ、さらに好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦２００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ以下である。（ヒト）ＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される場合、二重特異性構築物のＥＣ_５０値は、好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌ、さらに好ましくは≦７５０ｐｇ／ｍｌ、さらに好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦３５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、一層さらに好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ以下である。

好ましくは、本発明の二重特異性構築物は、たとえば、ＣＨＯ細胞のような標的細胞抗原陰性の細胞の溶解を誘導しない／それを媒介しない、または溶解を本質的に誘導しない／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」または「溶解に本質的に媒介しない」は、本発明の抗体構築物が、３０％を超える、好ましくは２０％以下の、さらに好ましくは１０％以下の、特に好ましくは９％、８％、７％、６％、または５％以下の標的細胞抗原陰性の細胞の溶解を誘導せず、または溶解を媒介せず、それによって標的細胞抗原陽性の細胞株の溶解を１００％であると設定することを意味する。これは普通、５００ｎＭまでの抗体構築物の濃度について適用される。当業者はさらなる面倒がなくどのように細胞溶解を測定すればいいかを知っている。さらに、本明細書はどのように細胞溶解を測定すればいいかの特定の指示を教示する。

好ましくは、本発明に従って使用するための二重特異性構築物は以下のステップ：
（ａ）二重特異性構築物の第１の用量の投与、その後に続く
（ｂ）第２の用量が前記第１の用量を超える二重特異性構築物の第２の用量の投与、任意でその後に続く
（ａ）任意の第３の用量が前記第２の用量を超える二重特異性構築物の前記第３の用量の投与
を含むスケジュールに従って投与される。

上記に従って、第１の用量の投与期間は７日までであることがさらに好ましい。第１の用量の投与期間の間にさらに高い用量が使用される場合に予想され得る高サイトカイン血症及び／またはサイトカイン放出症候群を回避しながら、第１の用量の投与のこの期間を二重特異性構築物の投与の当初フェーズ／第１のサイクルの間に使用して、たとえば、患者における腫瘍負荷を減らし得る（腫瘍減量）。

本発明の一実施形態では、第１の用量の投与の期間は７日目までである一方で、この第１の用量が６日、５日、４日、３日、２日または１日の期間で投与されることもこの好ましい実施形態の範囲内である。個々の患者の腫瘍負荷または全身状態が最初の限定された用量のステップにおける二重特異性構築物の限定された用量の投与を必要とする場合、この第１の用量のステップは二重特異性構築物との患者の最初の接触から生じる副作用を回避するまたは限定するはずである慣らし段階／適応段階として理解される。そのような慣らし段階／適応段階における用量についての好ましい範囲は、たとえば、５４ｋＤａの単鎖ポリペプチドであるＡＭＧ３３０のような標準のＢｉＴＥ（登録商標）について１〜５０μｇ／日の範囲内、好ましくは３〜３０μｇ／日の範囲内、さらに好ましくは４〜２０μｇ／日の範囲内、一層さらに好ましくは５〜１５μｇ／日の範囲内であってもよい。非常に好ましい実施形態では、本発明に係る二重特異性構築物は１０μｇ／日の用量で投与される。半減期を延長した抗体構築物の場合、それぞれの等モル用量を容易に決定することができる。しかしながら、個々の患者の腫瘍負荷または全身状態が最初の限定された用量のステップにおける二重特異性構築物の限定された用量のそのような投与を必要としない場合、すでに第１の用量はその範囲内にあってもよい。

二重特異性構築物の第２の用量についての好ましい範囲は、たとえば、ＡＭＧ３３０のような標準のＢｉＴＥ（登録商標）について１０μｇ／日〜１０ｍｇ／日の範囲内、さらに好ましくは２５μｇ／日〜１ｍｇ／日の範囲内、一層さらに好ましくは３０μｇ／日〜５００μｇ／日の範囲内である。非常に好ましい実施形態では、第２の用量は３０μｇ／日または６０μｇ／日である。上記に従って、二重特異性構築物の第３の用量についての好ましい範囲は第２の用量の各用量を超える。第３の用量は通常６０μｇ／日〜５００μｇ／日の範囲内であり、好ましくは本発明に係る第２の用量と同等の治療を逃れ得る残留標的細胞を根絶させる。

本発明の使用のための二重特異性構築物の一実施形態では、第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間は８〜１３日間の範囲内である。上記に従って、異なる用量のステップにおける投与の全期間は１４日間を超えない。従って、第２の用量及び任意で第３の用量での二重特異性構築物の投与の期間は好ましくは１３、１２、１１、１０、９または８日間、最も好ましくは１０日間である。

驚くべきことに、段階投薬が適用される場合、たとえば、第１の用量が４日間与えられ、第２の用量が１０日間与えられるならば、その際、第１の用量は５〜１５μｇ／日、好ましくは１０μｇ／日であり、第２の用量は３０μｇ／日〜５００μｇ／日、好ましくは３０μｇ／日または６０μｇ／日であるならば、そのとき、たとえば、望ましくないサイトカインの放出、たとえば、サイトカイン放出症候群のような免疫的な副作用が効果的に防がれ得ることが見いだされた。対照的に、本発明の第１の用量と同等の低い用量を前もって与えずに第２の用量と同等の用量を与えるならば、そのとき、たとえば、望ましくないサイトカインの放出、たとえば、サイトカイン放出症候群のような副作用が発生し得る。

第２の用量の投与の期間が４〜７日間、好ましくは４日間であり、且つ第３の用量の投与の期間が４〜７日間であることも本発明にとって好ましい。従って、第２の用量の投与の期間が７、６、５または４日間であり、且つ任意の第３の用量の投与の期間が７、６、５または４日間であることが特に好ましい。

また、本発明に従って、骨髄性白血病の治療は好ましくは、それぞれ構築物投与の１４日間の最長期間とそれに続く構築物を投与しない少なくとも１４日の期間とを含む治療の２以上のサイクルを含む。本発明に従った治療が２以上のサイクルを含む場合、一実施形態では、治療の第１のサイクルのみがステップ（ａ）に係る投与を含むのに対してその後のサイクルはステップ（ｂ）に係る用量で開始することがさらに好ましい。

また、本発明に従って、二重特異性構築物の第１の結合ドメインが配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが骨髄性白血病の治療で使用される二重特異性構築物にとって好ましい。

さらに、本発明に従って、二重特異性構築物の第２の結合ドメインがＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号９〜１４、２７〜３２、４５〜５０、６３〜６８、８１〜８６、９９〜１０４、１１７〜１２２、１３５〜１４０、１５３〜１５８及び１７１〜１７６から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが骨髄性白血病の治療で使用される二重特異性構築物にとって好ましい。

第２の結合ドメイン、ならびに、本発明の抗体構築物の第１の（または任意のさらなる）結合ドメイン（複数可）は好ましくは哺乳類霊長目のメンバーについて異種間特異的である。異種間特異的なＣＤ３結合ドメインは、たとえば、ＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている。一実施形態によれば、第１及び第２の結合ドメインは、それぞれ、ヒトＣＤ３３標的細胞抗原及びヒトＣＤ３への結合に加えて、（これらに限定されないが）新世界霊長類（たとえば、コモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザル）、旧世界霊長類（たとえば、ヒヒ及びマカク）、テナガザル及び非ヒトヒト亜科（ｈｏｍｉｎｉｎａｅ）を含む霊長類のＣＤ３３標的細胞抗原／ＣＤ３にも結合するであろう。コモンマーモセット及びワタボウシタマリンは双方ともマーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）の科に属する新世界の霊長類である一方で、コモンリスザルはオマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ）の科に属する新世界の霊長類である。

本発明の好ましい実施形態では、二重特異性構築物は二重特異性の抗体構築物である。上記本明細書で提供された定義に従って、この実施形態は抗体構築物である二重特異性構築物に関する。本発明の好ましい実施形態では、二重特異性の抗体構築物は単鎖構築物である。そのような二重特異性の単鎖抗体構築物は本発明に従って配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。

本明細書に記載されている二重特異性構築物のアミノ酸配列の修飾も企図される。たとえば、二重特異性構築物の結合親和性及び／または他の生物特性を改善することが望ましいことがある。二重特異性構築物の核酸に適当なヌクレオチドの変化を導入することまたはペプチド合成によって二重特異性構築物のアミノ酸配列の変異体が調製される。以下に記載されているアミノ酸配列の修飾のすべては、修飾されていない親分子の所望の生物活性（標的細胞抗原及びＣＤ３への結合）を依然として保持している二重特異性構築物を生じるはずである。

用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、修飾された、合成の、または稀なアミノ酸が所望に応じて使用されてもよいが、通常、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；及びバリン（ＶａＩまたはＶ）から成る群から選択されるアミノ酸のような当該技術で認識された定義を有するアミノ酸を指す。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（たとえば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＶａＩ）；負に荷電した側鎖（たとえば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正に荷電した側鎖（たとえば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（たとえば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有するとしてグループ分けすることができる。

アミノ酸の修飾には、たとえば、二重特異性構築物のアミノ酸配列内での残基からの欠失及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って、最終的な構築物が所望の特徴を持つという条件で最終的な構築物に到達する。アミノ酸の変化は二重特異性構築物の翻訳後の処理を変え得、たとえば、グリコシル化部位の数または位置を変え得る。

たとえば、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸をＣＤＲのそれぞれで挿入してもよく、または欠失させてもよい（当然、その長さに応じて）一方で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸がＦＲのそれぞれで挿入されてもよく、または欠失させてもよい。好ましくは、アミノ酸配列の挿入には、１００以上の残基を含有するポリペプチドへの長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基に及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。本発明の二重特異性構築物の挿入変異体には、酵素への二重特異性構築物のＮ末端もしくはＣ末端への融合、または二重特異性構築物の血清半減期を増やすポリペプチドへの融合が含まれる。

増えた半減期は一般に、免疫グロブリン、特に抗体、最も特に小さなサイズの抗体断片の生体内適用で有用である。抗体断片（Ｆｖｓ、ジスルフィド結合したＦｖｓ、Ｆａｂｓ、ｓｃＦｖｓ、ｄＡｂｓ）に基づいたそのような抗体構築物は生体のほとんどの部分に迅速に到達することができるが、これらの抗体構築物は生体からの迅速なクリアランスに悩まされる可能性がある。単鎖ジアボディのような抗体構築物の半減期を延長するための当該技術に記載されている戦略には、ポリエチレングリコール鎖の抱合（ペグ化）、ＩｇＧのＦｃ領域への融合、またはアルブミンもしくはアルブミン結合ドメインへの融合が含まれる。

血清アルブミンは肝臓によって生理的に産生されるタンパク質であり；それは血漿に溶解して存在し、哺乳類における最も豊富な血液タンパク質である。アルブミンは、血管と生体組織との間の体液の適正な分布に必要とされる膠質浸透圧を維持するのに必須である。それはまた幾つかの疎水性ステロイドホルモンを非特異的に結合することによる血漿担体として及びヘミンや脂肪酸のための輸送タンパク質としても作用する。用語「血清アルブミン」、それぞれそのヒト変異体（「ヒトアルブミン」）は発明されたタンパク質の文脈で、親ヒト血清アルブミンタンパク質（配列番号１０９に記載されているような配列）または好ましくは遺伝子融合タンパク質として発現される、及び少なくとも１つの治療用タンパク質との化学的架橋等によるその変異体（たとえば、配列番号１１０〜１３８に記載されているようなアルブミンタンパク質）もしくはその断片のいずれかを定義する。単一もしくは複数の変異を含むアルブミンの変異体または断片は、親または参照に比べてたとえば、ＦｃＲｎへの親和性及び延びた血漿半減期のような改善された特性を提供する。ヒトアルブミンの変異体は、たとえば、ＷＯ２０１４／０７２４８１に記載されている。本発明に従って、血清アルブミンはペプチドリンカーを介して抗体構築物に連結されてもよい。ペプチドリンカーはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１３）_ｎを有することが好まれ、その際、ｎは１〜５の範囲での整数である。さらに好ましいのは「ｎ」が１〜３の範囲での整数であることであり、最も好ましくは「ｎ」は１または２である。

置換型変異誘発について最も関心のある部位には重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが、重鎖及び／または軽鎖におけるＦＲの変化も企図される。置換は好ましくは本明細書に記載されているように保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸がＣＤＲにて置換されてもよい一方で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸がフレームワーク領域（ＦＲ）にて置換されてもよい。たとえば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含するならば、これらのアミノ酸のうち１、２または３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含するならば、これらのアミノ酸のうち１、２、３、４、５または６個が置換されることが想定される。

変異誘発について好ましい位置である二重特異性構築物の特定の残基または領域を特定するのに有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって記載されたように、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。ここで、二重特異性構築物内の標的残基の残基または基が特定され（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕのような荷電残基）、中性のまたは負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられてアミノ酸のエピトープとの相互作用に影響を与える。

次いで、置換に対して機能的な感受性を示すそれらアミノ酸の位置が、置換の部位でまたは部位についてさらなるまたは他の変異体を導入することによって改良される。従って、アミノ酸配列の変異を導入するための部位または領域が予め決定される一方で、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。たとえば、所与の部位での突然変異の能力を解析するまたは最適化するために、標的のコドンまたは領域にてアラニン走査のまたは無作為の変異誘発を行ってもよく、所望の活性の最適な組み合わせについて発現された二重特異性構築物の変異体をスクリーニングする。既知の配列を有するＤＮＡにおける所定の部位で置換突然変異を行う技法は周知であり、たとえば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発。変異体のスクリーニングは標的抗原結合活性のアッセイを用いて行われる。

一般に、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲの１つ以上またはすべてにてアミノ酸が置換されるならば、そのとき得られる「置換された」配列は「元々の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％、さらに好ましくは６５％、一層さらに好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、さらに特に好ましくは８０％同一であることが好ましい。このことは、それが「置換された」配列にどの程度一致するかはＣＤＲの長さに依存することを意味している。たとえば、５つのアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１つの置換されたアミノ酸を有するためには、好ましくは置換された配列と８０％同一である。従って、二重特異性の抗体構築物のＣＤＲは、その置換された配列に対する異なる程度の同一性を有し得、たとえば、ＣＤＲＬ１は８０％を有し得る一方で、ＣＤＲＬ３は９０％を有し得る。

好ましい置換（または置き換え）は保存的置換である。しかしながら、二重特異性構築物が第１の結合ドメインを介して標的細胞抗原に結合し、且つ第２の結合ドメインを介してＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、及び／またはそのＣＤＲがそのとき置換された配列に対して同一性（「元々の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％、さらに好ましくは６５％、一層さらに好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、さらに特に好ましくは８０％同一である）を有する限り、任意の置換（非保存的置換及び以下の表１でリストにした「例となる置換」からの１つ以上を含む）が想定される。

保存的置換は「好ましい置換」の見出しのもとに表１にて示される。そのような置換が生物活性で変化を生じるのであれば、そのときは、表Ａにて「例示的置換」と呼ばれるまたはアミノ酸のクラスを参照して以下でさらに記載されるようなさらに実質的な変化を導入してもよく、所望の特徴について産物を評価してもよい。

（表Ａ）：アミノ酸の置換

本発明の二重特異性構築物の生物特性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域、たとえば、シートもしくはらせんの立体構造におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するその影響で有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の特性に基づいて：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅの群に分けられる。

非保存的置換はこれらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することが伴うであろう。二重特異性構築物の適正な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は一般にセリンで置換されて分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防いでもよい。逆に、システイン結合（複数可）を抗体に付加してその安定性（特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）を改善してもよい。

アミノ酸配列については、配列の同一性及び／または類似性は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性配列比較アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性方法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５によって記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の標準の技法を用いて、好ましくは、初期設定を用いて、または緻密な調査によって決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータ：１のミスマッチペナルティ；１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；及び３０の連結ペナルティ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに基づいてＦａｓｔＤＢによって算出される。

有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは累進的な一対配列比較を用いて関連する配列の群から複数の配列の配列比較を作り出す。それはまた配列比較を作り出すのに使用されるクラスタリング関係を示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の累進的配列比較法の簡略化を使用し；方法はＨｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３によって記載されたものに類似する。３．００の初期設定ギャップ重み、０．１０の初期設定ギャップ長重み及び荷重末端ギャップを含む有用なＰＩＬＥＵＰパラメータ。

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７にて記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は幾つかの検索パラメータを用い、そのほとんどは初期設定値に設定される。調整できるパラメータは以下の値：重複スパン＝１、重複分画＝０．１２５、単語閾値（Ｔ）＝ＩＩで設定される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２は動的な値であり、特定の配列の組成及び対象とする配列が検索されている特定のデータベースの組成に応じたプログラム自体によって確立される；しかしながら、値を調整して感度を増してもよい。

追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたようなギャップのあるＢＬＡＳＴである。ギャップのあるＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定した閾値Ｔパラメータ；ギャップのない伸長をもたらす２ヒット法、１０＋ｋのコストであるｋのチャージギャップ長；１６に設定したＸｕ；及びデータベースの検索段階では４０に及びアルゴリズムの出力段階では６７に設定したＸｇを使用する。ギャップのあるアルゴリズムは約２２ビットに相当するスコアによって始動される。

一般に、個々の変異体ＣＤＲ間のアミノ酸の相同性、類似性または同一性は、本明細書で示される配列に対して少なくとも６０％であり、さらに通常では、好ましくは、少なくとも６５％または７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％または８０％、一層さらに好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びほぼ１００％相同性または類似性を増す。同様の方法で、「パーセント（％）核酸配列同一性」は本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関して二重特異性構築物のコーディング配列におけるヌクレオチド残基と同一である候補配列におけるヌクレオチド残基の比率として定義される。特定の方法は、初期設定パラメータに設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＩＮモジュールをそれぞれ１及び０．１２５に設定した重複スパン及び重複分画と共に利用する。

一般に、個々の変異体ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書で示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列の相同性、類似性または同一性は少なくとも６０％であり、さらに通常では、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％相同性または同一性を増す。従って、「変異体ＣＤＲ」は本発明の親ＣＤＲに対して特定された相同性、類似性または同一性を持つものであり、親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むが、これらに限定されない生物機能を共有する。

一実施形態では、本発明に従って使用するための二重特異性構築物は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシウレア、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）から成る群から選択される１種類以上のエピジェネティック因子との併用で投与され、その際、
（ａ）二重特異性構築物の投与に先立って１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；
（ｂ）二重特異性構築物の投与に続いて１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；または
（ｃ）１種類以上のエピジェネティック因子と二重特異性構築物が同時に投与される。

用語「エピジェネティック因子」は本発明未関連して、投与の際、細胞集団の遺伝子発現または細胞表現型を変えることができる化合物を定義する。そのような変化は、核酸配列における変化が関与しないゲノムに対する１つ以上の機能的に関連する修飾を指すことが理解される。そのような修飾の例は、ＤＮＡのメチル化及びヒストンの修飾であり、それらは双方とも根底にあるＤＮＡ配列を変えることなく遺伝子発現を調節するのに重要である。

上述のエピジェネティック因子の１種類以上との併用での二重特異性構築物の投与を含む、骨髄性白血病の治療についての詳細はＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６９５７５にて提供されている。

本発明の一実施形態では、二重特異性構築物の投与に先立って１種類以上のエピジェネティック因子を７日まで投与することが好ましい。

また、本発明の一実施形態では、エピジェネティック因子はヒドロキシウレアであることが好ましい。

骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞性白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、小児骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤血球性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄性肉腫、及び急性混合型白血病から成る群から選択されることが本発明にとって好ましい。さらに好ましくは、骨髄性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬの定義は、とりわけ、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性赤血球性白血病、及び急性汎骨髄性白血病を含む。

本発明に関連して記載されている二重特異性構築物は、医薬組成物の形態にてそれを必要とする対象への適当な投与のために製剤化されてもよい。

本明細書に記載されている製剤は、それを必要とする患者における本明細書に記載されているような病的な医学的状態の治療、改善及び／または予防において医薬組成物として有用である。用語「治療」は治療上の処置及び予防上または予防的な措置の双方を指す。治療には、疾患、疾患の症状または疾患になりやすい傾向を治癒させる、治す、緩和する、和らげる、変える、治療する、改良する、改善するまたは影響を与える目的で、疾患／障害を有する患者に由来する生体、単離した組織もしくは細胞、疾患／障害の症状、または疾患／障害になりやすい傾向に対する製剤の適用または投与が含まれる。

用語「疾患」は、本明細書に記載されている二重特異性構築物または医薬組成物による治療から利益が得られる任意の状態を指す。これには、哺乳類が問題になっている疾患になりやすい傾向がある病的な状態を含む慢性及び急性の障害または疾患が含まれる。

用語「必要とする対象」または「治療を必要とする」者には、すでに障害を持っている者、ならびに、障害が予防されるべきである者が含まれる。必要とする対象または「患者」には、予防上の処置または治療上の処置を受けるヒト対象及び他の哺乳類対象が含まれる。

本発明の二重特異性構築物は、とりわけ、生体利用効率及び持続性の範囲と共に、一般に投与の特定の経路及び方法について、投与の特定の投与量及び頻度について、特定の疾患の特定の治療について考案されるであろう。組成物の材料は好ましくは、投与の部位で受け入れることができる濃度で製剤化される。

従って製剤及び組成物は投与の好適な経路による送達のために本発明に従って考案されてもよい。本発明の文脈では、投与の経路には、
・局所経路（たとえば、経皮、吸入、鼻、眼、耳／耳、膣、粘膜）
・経腸経路（たとえば、経口、消化管、舌下、***下、頬、直腸）及び
・非経口経路（たとえば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、クモ膜下、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病変内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）
が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に関連して記載されている医薬組成物及び二重特異性構築物は、たとえば、ボーラス注射のような注射による、または連続点滴のような点滴による非経口投与、たとえば、皮下または静脈内の送達に特に有用である。医薬組成物は医療用機器を用いて投与されてもよい。医薬組成物を投与するための医療用機器の例は米国特許第４，４７５，１９６号；同第４，４３９，１９６号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４８７，６０３号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；及び同第５，３９９，１６３に記載されている。

特に、本発明は好適な組成物の途切れない投与を提供する。非限定例として、途切れないまたは実質的に途切れない、すなわち、連続した投与は、患者の体内への治療剤の流入を計測するための患者が装着する小型ポンプシステムによって実現されてもよい。本発明に関連して記載されている二重特異性構築物を含む医薬組成物は前記ポンプシステムを用いて投与することができる。そのようなポンプシステムは当該技術で一般に既知であり、点滴される治療剤を含有するカートリッジの周期的な交換に共通して頼る。そのようなポンプシステムにおけるカートリッジを交換する際、患者の体内への治療剤のさもなければ途切れない流れの一時的な中断が結果として起きてもよい。そのような場合、カートリッジ交換に先立つ投与の段階及びカートリッジ交換に続く投与の段階はそのまま、本発明の医薬の手段と方法が一緒にそのような治療剤の１回の「途切れない投与を構成するという意味の範囲内であると見なされる。

本発明に関連して記載されている二重特異性構築物の連続したまたは途切れない投与は、流体をリザーバの外に運びだすための流体を運ぶメカニズムと運ぶメカニズムを作動させるための作動させるメカニズムとを含む流体送達装置または小型ポンプシステムを手段として静脈内または皮下であってもよい。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、患者の体内に好適な組成物を送達するための針またはカニューレを含んでもよい。前記ポンプシステムは静脈、動脈または血管とは無関係に患者の皮膚に直接固定されてもよく、または取り付けられてもよく、それによってポンプシステムと患者の皮膚とに間の直接接触を可能にする。ポンプシステムは２４時間から数日まで患者の皮膚に取り付けることができる。ポンプシステムは少量のリザーバが付いた小型のものであってもよい。非限定例として、投与される好適な医薬組成物のためのリザーバの体積は０．１〜５０ｍｌの間であることができる。

連続した投与は、皮膚に装着され、間隔を置いて取り換えられる貼付剤を手段として経皮であってもよい。当業者はこの目的に好適な薬剤送達のための貼付剤システムを知っている。経皮投与は、最初に使い切った貼付剤の交換が、たとえば、最初に使い切った貼付剤のすぐ隣の皮膚の表面で且つ最初に使い切った貼付剤の除去の直前に、新しい２番目の貼付剤の配置と同時に有利に達成することができるので、途切れない投与に特に適していることは注目すべきである。流れの中断または動力電池の不具合の問題点は生じない。

医薬組成物が凍結乾燥されているのであれば、凍結乾燥された物質は投与に先立って適当な液体で先ず再構成される。凍結乾燥された物質は、たとえば、注射用殺菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥に先立ってタンパク質が入っていた同じ製剤にて再構成されてもよい。

本発明の組成物は、たとえば、非チンパンジー霊長類、たとえば、マカクに対して本明細書に記載されている異種間特異性を示す本発明に関連して記載されている二重特異性構築物の漸増用量の投与による用量漸増試験によって決定することができる好適な用量で対象に投与することができる。上記で述べられたように、本明細書に記載されている異種間特異性を示す本発明に関連して記載されている二重特異性構築物は、非チンパンジー霊長類における前臨床試験にて同一の形態で及びヒトにて薬剤として有利に使用することができる。投薬計画は主治医及び臨床因子によって決定されるであろう。医療技術で周知のように、どの患者の投与量も、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の回数と経路、健康全般、及び同時に投与される他の薬剤を含む多数の因子に左右される。

用語「有効な用量」または「有効な投与量」は所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。用語「治療上有効な用量」は、疾患をすでに患っている患者における疾患及びその合併症を治癒させる、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。この使用に有効な量または用量は、治療される状態（適応）、送達される二重特異性構築物、治療の背景と目的、疾患の重症度、前の治療法、患者の既往歴と治療剤に対する反応、投与の経路、患者の大きさ（体重、体表面または臓器の大きさ）及び／または状態（年齢及び健康全般）及び患者自身の免疫系の一般的な状態に左右されるであろう。適正な用量は、それが１回または一連の投与にわたって患者に投与され得るように、且つ最適な治療効果を得るために主治医の判断に従って調整され得る。

典型的な投与量は、上記で言及された因子に応じて約０．１μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ以上までに及んでもよい。具体的な実施形態では、投与量は１．０μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、任意で１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、または１００μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでに及んでもよい。

治療上有効な量の本発明に関連して記載されている二重特異性構築物は好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度もしくは持続時間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防を生じる。標的細胞抗原を発現している腫瘍を治療することについては、治療上有効な量の本発明に関連して記載されている二重特異性構築物、たとえば、抗標的細胞抗原／抗ＣＤ３抗体構築物は、未治療の患者に比べて、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力はヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルにて評価されてもよい。

医薬組成物は、単独の治療剤として、または必要に応じた抗癌治療剤のような追加の治療剤、たとえば、他のタンパク性及び非タンパク性の薬剤との併用で投与することができる。これらの薬剤は、本明細書で定義されているような本発明に関連して記載されている二重特異性構築物を含む組成物と同時に、または前記二重特異性構築物の投与の前または後で別に適時に定義された間隔と用量で投与されてもよい。

さらに、本発明者らは、たとえば、免疫的な副作用のような稀な副作用はグルココルチコイドによる（事前の）及び／または（同時の）治療法によって防ぐことができ、または緩和することができることを観察した。

従って、本発明は、たとえば、デキサメタゾンのようなグルココルチコイドが、本発明に係るＣＤ３３／ＣＤ３特異的な二重特異性構築物による治療の経過において発生し得る有害な影響を軽減するまたはさらに予防することを立証している。

グルココルチコイド（ＧＣ）は、炎症性疾病及び自己免疫疾患の治療に未だに最も広く使用されている免疫抑制剤である。グルココルチコイド（ＧＣ）は、ヒトを含むほぼすべての脊椎動物細胞に存在するグルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合するステロイドホルモンの一種である。これらの化合物は炎症の原因にかかわらず、強力な抗炎症剤である。グルココルチコイドは、とりわけ、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＦＮ−γをコードする遺伝子を阻害することによって、細胞が媒介する免疫を抑制する。

ＧＣの群に属するコルチゾンは、アジソン病から関節リウマチに至る多数の病気と闘うのに使用される重要な治療剤である。特効薬として称賛をもたらしたその抗リウマチ特性の発見以来ずっと、特定の病気とよりよく闘うために向上した特性を持つコルチゾンの誘導体が生産されている。コルチゾンはコルチコステロイドとして知られるステロイドの群に属する。これらのステロイドは、腎臓の近傍の副腎の外側部分である副腎皮質によって産生される。コルチコステロイドは２つの主要な群：脂肪、タンパク質、カルシウム及び炭水化物の代謝を制御するグルココルチコイド（ＧＣ）と、ナトリウム及びカリウムのレベルを制御するミネラロコルチコイドとに分けられる。コルチゾンは前者の群、すなわち、ＧＣに属する。コルチゾン及びその多数の誘導体は種々の疾患に使用されている。コルチゾンはまた、移植された臓器に存在する外来性タンパク質に向かう生体の防御反応を出来るだけ抑えるので移植された臓器の機能性の損傷を出来るだけ抑えるその能力のゆえに、臓器移植を実現するのに役立った。しかしながら、５０年を超える間の臨床使用にもかかわらず、免疫系の様々な細胞区画に対するＧＣの具体的な抗炎症効果は未だに明らかではない。ＧＣは免疫系のほぼすべての細胞に影響を及ぼし、細胞型特異的なメカニズムの証拠が増えている。

具体的な一実施形態では、本発明はＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性構築物が原因で生じる有害効果の改善、治療または予防における使用のためのグルココルチコイド（ＧＣ）に関する。上記で要点を述べたように、これらの望ましくない有害効果は本明細書に記載されている段階投薬によって防がれてもよい。しかしながら、単なる予防措置のために、患者における（免疫的な）有害効果の改善、治療または予防にて使用するためのグルココルチコイド（複数可）が提供されてもよく、その際、前記患者はＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性構築物による治療法に供されている。従って、さらなる態様の１つでは、本発明は、本発明に係るＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物が原因で生じる免疫的な有害効果の改善、治療または予防における方法で使用するためのグルココルチコイド（ＧＣ）に関する。

また、本発明はＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物が原因で生じる免疫的な有害効果の改善、治療または予防の方法に関するものであり、前記方法はそれを必要とする患者にグルココルチコイド（ＧＣ）を投与することを含む。ＧＣは好ましくは、ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物が原因で生じる前記免疫的な有害効果を改善する、治療するまたは予防するのに十分な量で投与される。

用語「グルココルチコイド」はグルココルチコイド受容体に好ましくは特異的に結合する化合物を意味する。前記用語には、薬学上許容できるそれらの誘導体を含めて、コルチゾン、コルチゾール（ハイドロコルチゾン）、クロプレドノール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、フルオコルトロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、コルチバゾール、パラメタゾン、及び／またはフルチカゾンから成る群から選択される化合物（複数可）が含まれる。本発明の実施形態の文脈では、言及された化合物は単独で使用されてもよいし、または併用で使用されてもよい。デキサメタゾンが好ましい。しかしながら、本発明は上記で言及された具体的なＧＣに限定されない。「グルココルチコイド」としてすでに分類されているまたは将来分類されるであろう物質はすべて同様に本発明の文脈で採用されてもよいことが想定される。そのような将来のグルココルチコイドにはグルココルチコイド受容体に特異的に結合するまたはそれを活性化する化合物が含まれる。用語「ＧＣ受容体に特異的に結合する」は、本発明に従って、一般的にタンパク質／受容体との会合（すなわち、非特異的な結合）に比較して統計的に有意な程度にＧＣ（またはＧＣのように作用すると仮定される化合物）がＧＣ受容体（ＮＲ３Ｃ１としても知られる）と会合する（たとえば、相互作用する）ことを意味する。ＧＣ受容体がグルココルチコイドに結合するとき、作用のその主要なメカニズムは遺伝子転写の調節である。ＧＣの非存在下では、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）は、熱ショックタンパク質９０（ｈｓｐ９０）、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）、及びタンパク質ＦＫＢＰ５２（ＦＫ５０６結合タンパク質５２）を含む種々のタンパク質と複合体化して細胞質ゾルに存在する。ＧＣのグルココルチコイド受容体（ＧＲ）への結合は熱ショックタンパク質の放出を生じる。従って、将来のＧＣまたはＧＣの薬学上許容できる誘導体もしくは塩は好ましくはＧＣ受容体に結合することができ、且つ上記で言及された熱ショックタンパク質を放出することができることが想定される。活性化されたＧＲ複合体は、核における抗炎症性タンパク質の発現を上方調節し、または細胞質ゾルにおける炎症誘発性タンパク質の発現を抑制する（細胞質ゾルから核への他の転写因子の移動を防ぐことによって）。

好ましい実施形態では、前記ＧＣは、デキサメタゾン、フルチカゾンプロピオン酸塩、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、またはそれらの組み合わせのような最も臨床で使用され、関連するＧＣから選択される。

一層さらに好ましい実施形態では、前記ＧＣはデキサメタゾンである。

デキサメタゾンは、最も一般的に使用されるステロイドのうちで最高のグルココルチコイドの効能を有し、最長の半減期も有する（以下の表を参照のこと）。しかし、当業者は他の既知のグルココルチコイドの１つを選択することができ、その一部は本明細書で開示されており、且つそれを必要とする患者の治療から生じてもよい免疫的な有害事象を改善するまたは予防するのに適当で有効な用量を選択することができる。

デキサメタゾンはまた、おそらく中枢神経系（ＣＮＳ）への特異的な浸透のせいで、悪性のＣＮＳ疾患（たとえば、ＣＮＳリンパ腫または脳転移）にて有益な効果も持つ。それはまた脳浮腫を治療するのに優先的に（他のステロイドと比較して）使用される。コルチコステロイドは腫瘍自体における毛細血管の透過性を低下させるが、動物モデルでは、デキサメタゾンは腫瘍から離れる大きな流れに対する効果によって異なって作用し、浮腫を減らし得ることが見いだされている（Ｍｏｌｎａｒ，Ｌａｐｉｎ及びＧｏｏｔｈｕｉｓ，１９９５，Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．１９９５；２５（１）：１９−２８）。

ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物の適用と関連した臨床試験については、本発明者らは、効率的であり、且つ患者のほとんどによって上手く忍容される治療計画を開発しなければならなかった。この目的で、本発明者らは本明細書で要点が述べられているようなＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体構築物の段階的な適用を適用した。それによって有害効果の数を減らし、有害効果を改善し、さらに予防することができた。適当な投与量は、患者における有害効果の最少化と共に有効性、忍容性及び安全性に基づいて臨床医によって選択され得る。

本発明の実施形態に従って使用されるべきであるＧＣの用量は限定されない、すなわち、それは個々の患者の状況に左右されるであろう。ＧＣは静脈内にまたは経口で投与することができる。しかしながら、ＧＣの好ましい投与量には、投薬の下端での１〜６ｍｇ（デキサメタゾンの等価重量）の間から４０ｍｇ（デキサメタゾンの等価重量）が含まれる。前記投与量はすべて１回で投与することができ、またはさらに小さな投与量に小分けすることができる。好ましいのは、ＧＣの一方の用量が本明細書に記載されているような段階投薬に従った第１及び／または第２の用量の点滴に先立って与えられ、ＧＣの他方の用量が本明細書に記載されているような段階投薬に従った第２または第３の用量の投与に先立って与えられる小分け用量である。従って、ＧＣは好ましくは治療サイクル当たり２回投与される。さらに一層好ましくは、ＧＣは、治療サイクルの開始前、または前記治療サイクル内での次のさらに高い用量の投与の開始前２４または８時間または４時間または１時間に１回投与される。この点で、１時間が最も好ましい。用量は各１〜４０ｍｇ、好ましくは５〜２０ｍｇ、最も好ましくは各８ｍｇである。「ｄ」は１日を示す。さらなる投薬計画は添付の実施例から導き出せる。この段落で与えられる投与量はすべてデキサメタゾンの等価重量を指す。

用語「有効で且つ非毒性の用量」は本明細書で使用されるとき、主要な毒性効果を起こすことなくまたは本質的に起こすことなく、病的細胞の枯渇、腫瘍の除去、腫瘍の退縮または疾患の安定化を引き起こすのに高度に十分である二重特異性構築物の忍容できる用量を指す。そのような有効で且つ非毒性の用量は、たとえば、当該技術で記載されている用量漸増試験によって決定され得、重度の有害副作用を誘導する用量を下回るべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。

用語「毒性」は本明細書で使用されるとき、有害事象または重度有害事象という形で現れる薬剤の毒性効果を指す。これらの付随する事象は、投与後の全身での薬剤の忍容性の欠如及び／または局所忍容の欠如を指し得る。毒性には、薬剤が原因で生じる催奇形性の効果または発癌効果も含み得る。

用語「安全性」、「生体内の安全性」または「忍容性」は本明細書で使用されるとき、投与の後（局所忍容）及び薬剤の長期の適用の間に重度の有害事象を誘導しない薬剤の投与を定義する。「安全性」、「生体内の安全性」または「忍容性」は、たとえば、治療の間、または経過観察の期間の間に定期的な間隔で評価することができる。測定には、臨床評価、たとえば、臓器の兆候及び臨床検査異常のスクリーニングが含まれる。臨床評価を行ってもよく、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ標準に従って、正常な知見に対する逸脱を記録し／コードしてもよい。臓器の兆候には、たとえば、有害事象のためのＣｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）で述べられているような、たとえば、アレルギー／免疫、血液／骨髄、心臓不整脈、凝固等が含まれてもよい。調べ得る検査パラメータには、たとえば、血液学、臨床検査値、凝固プロファイル、及び尿分析及び血清、血漿、リンパ液または脊髄液、液等のような他の体液の検査が挙げられる。従って、安全性は、たとえば、身体検査、画像法（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ））、技術的装置による他の測定（すなわち、心電図）、生命兆候によって、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することによって評価することができる。たとえば、本発明に係る使用及び方法における非チンパンジー霊長類での有害事象は組織病理及び／または組織化学の方法によって調べられてもよい。

上記用語は、たとえば、バイオテクノロジーに由来する医薬品の前臨床安全性の評価Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｊｕｌｙ １６，１９９７においてもまた言及されている。

本発明はまた、それを必要とする対象への、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む治療上有効な量の二重特異性構築物の投与を含む、骨髄性白血病の治療方法も提供し、方法は、１４日間の最長期間、前記対象に構築物を投与するステップと、その後に続く少なくとも１４日の期間の構築物を投与しないステップとを含む。

本発明の方法については、以下のステップ：
（ａ）二重特異性構築物の第１の用量の投与と、その後に続く
（ｂ）第２の用量が前記第１の用量を超える、二重特異性構築物の前記第２の用量の投与と、任意でその後に続く
（ｃ）任意の第３の用量が前記第２の用量を超える、二重特異性構築物の前記第３の用量の投与と
を含むスケジュールに従って二重特異性構築物が投与されることが好ましい。

本発明の方法の好ましい実施形態では、第１の用量の投与の期間は７日までである。

また、本発明の方法の好ましい実施形態では、第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間は８〜１３日の範囲内である。

本発明の方法の一実施形態に従って、第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間は８〜１３日の範囲内である。

本発明の方法の好ましい実施形態については、第２の用量の投与の期間は４〜７日であり、第３の用量の投与の期間は４〜７日であることが想定される。

本発明の方法は好ましくは、それぞれ、二重特異性構築物の投与の１４日の最長期間とそれに続く二重特異性構築物を投与しない少なくとも１４日の期間とを含む治療の２以上のサイクルを含んでもよい。

本発明の方法の好ましい実施形態では、治療の第１のサイクルだけがステップ（ａ）に係る投与を含むのに対して、次に続くサイクルはステップ（ｂ）に係る用量で開始する。

本発明の方法については、二重特異性構築物の第１の結合ドメインは配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが好ましい。

また、本発明の方法の好ましい実施形態に従って、二重特異性構築物の第２の結合ドメインはＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号９〜１４、２７〜３２、４５〜５０、６３〜６８、８１〜８６、９９〜１０４、１１７〜１２２、１３５〜１４０、１５３〜１５８及び１７１〜１７６から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む。

本発明の方法の好ましい実施形態では、二重特異性構築物は二重特異性の抗体構築物である。

さらに、本発明の方法については、二重特異性の抗体構築物は、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単鎖構築物であることが好ましい。

本発明の方法の一実施形態では、二重特異性構築物は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシウレア、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）から成る群から選択される１種類以上のエピジェネティック因子との併用で投与され、その際、
（ａ）二重特異性構築物の投与に先立って１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；
（ｂ）二重特異性構築物の投与に続いて１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；または
（ｃ）１種類以上のエピジェネティック因子と二重特異性構築物が同時に投与される。

本発明の方法については、１種類以上のエピジェネティック因子は二重特異性構築物の投与に先立って７日まで投与されることが好ましい。

本発明の方法については、一実施形態については、エピジェネティック因子はヒドロキシウレアであることが好ましい。

上記で本明細書に記載されているように、本発明に従って、骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞性白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、小児骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤血球性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄性肉腫、及び急性混合型白血病から成る群から選択される。骨髄性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であることが好ましい。

また、一実施形態では、本発明は骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製についての、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性構築物の使用を提供し、その際、構築物は１４日の最長期間投与されることになり、その後、構築物を投与しない少なくとも１４日日の期間が続く。

本発明の使用については、以下のステップ：
（ａ）二重特異性構築物の第１の用量の投与と、その後に続く
（ｂ）第２の用量が前記第１の用量を超える、二重特異性構築物の前記第２の用量の投与と、任意でその後に続く
（ａ）任意の第３の用量が前記第２の用量を超える、二重特異性構築物の前記第３の用量の投与と
を含むスケジュールに従って二重特異性構築物が投与されることになることが好ましい。

本発明の使用の好ましい実施形態では、第１の用量の投与の期間は７日までである。

また、本発明の使用の好ましい実施形態では、第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間は８〜１３日の範囲内である。

本発明の使用の一実施形態に従って、第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間は８〜１３日の範囲内である。

本発明の方法の好ましい実施形態については、第２の用量の投与の期間は４〜７日であり、第３の用量の投与の期間は４〜７日であることが想定される。
本発明の好ましい一実施形態では、骨髄性白血病の治療は、それぞれ、二重特異性構築物の投与の１４日の最長期間とそれに続く二重特異性構築物を投与しない少なくとも１４日の期間とを含む治療の２以上のサイクルを含む。

本発明の使用の好ましい実施形態では、治療の第１のサイクルだけがステップ（ａ）に係る投与を含むのに対して、次に続くサイクルはステップ（ｂ）に係る用量で開始する。

本発明の使用については、二重特異性構築物の第１の結合ドメインは、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが好ましい。

また、本発明の使用の好ましい実施形態に従って、二重特異性構築物の第２の結合ドメインは、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号９〜１４、２７〜３２、４５〜５０、６３〜６８、８１〜８６、９９〜１０４、１１７〜１２２、１３５〜１４０、１５３〜１５８及び１７１〜１７６から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む。

本発明の使用の好ましい実施形態では、二重特異性構築物は二重特異性の抗体構築物である。

さらに、本発明の使用については、二重特異性の抗体構築物は、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単鎖構築物であることが好ましい。

本発明の使用の一実施形態では、二重特異性構築物は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシウレア、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）から成る群から選択される１種類以上のエピジェネティック因子との併用で投与され、その際、
（ａ）二重特異性構築物の投与に先立って１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；
（ｂ）二重特異性構築物の投与に続いて１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；または
（ｃ）１種類上のエピジェネティック因子と二重特異性構築物が同時に投与される。

本発明の使用については、１種類以上のエピジェネティック因子は二重特異性構築物の投与に先立って７日まで投与されることが好ましい。

本発明の使用の一実施形態については、エピジェネティック因子はヒドロキシウレアであることが好ましい。

上記で本明細書に記載されているように、本発明に従って、骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞性白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、小児骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤血球性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄性肉腫、及び急性混合型白血病から成る群から選択される。骨髄性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であることが好ましい。

造血細胞の種類及びそれらの起源（前駆細胞の種類）を示す図である。情報源：ウィキペディア。 ヒトＣＤ３３^＋ＥＯＬ−１細胞またはＣＤ３３⁻陰性Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞を、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比でのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及びＡＭＧ３３０と共に４８時間、共培養した。ＰＩの取り込みのフローサイトメトリー測定によって細胞溶解をモニターした（Ａ）。Ｔ細胞の活性化はＣＤ６９の表面発現の測定によって分析した（Ｂ）。各データの点は３つ組測定の平均値を表す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。 ＨＥＫ２９３−ｈｕＣＤ３３、ＨＥＫ２９３−ｃｙＣＤ３３またはＨＥＫ２９３の細胞を、カニクイザルのＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ細胞比５：１）、及び漸増濃度のＡＭＧ３３０と共に４８時間、共培養した。標的細胞の溶解はＰＩの取り込みのフローサイトメトリー測定によってモニターした（Ａ）。Ｔ細胞上のＣＤ６９の表面発現は、抗原特異的な蛍光色素を結合したモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって検出した（Ｂ）。各データの点は２つ組（Ａ）または３つ組（Ｂ）のウェルでの測定の平均値を表す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。

本明細書の本発明は特定の方法論、プロトコールまたは試薬に限定されず、そのようなものとして変化することができることが理解されるべきである。本明細書で提供されている議論及び実施例は、特定の実施例のみを記載することを目的として提示されているのであって、クレームによってのみ定義される本発明の範囲を限定するように意図されるものではない。

本明細書の本文の全体にわたって引用されている出版物及び特許はすべて（すべての特許、特許出願、科学的な出版物、製造元の仕様、指示書等）、上記であれ下記であれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本発明が従来の発明のせいでそのような開示に先行する資格が与えられないという承認として解釈されるべきものは本明細書にはない。参照によって組み入れられる物質が本明細書に矛盾するまたは不一致であるという程度まで、本明細書はそのような物質に優先するであろう。

以下の実施例は本発明の特定の実施形態または特徴を説明する目的で提供される。これらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。実施例は説明の目的で含まれ、本発明はクレームによってのみ限定される。

実施例１：
ＡＭＧ３３０が媒介する、再指示された溶解及びＴ細胞活性化
ＡＭＧ３３０の活性は標的細胞とＴ細胞の双方への同時結合を必要とする。ＡＭＧ３３０の薬理学的な効果は、以前に予備刺激されたＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋Ｔリンパ球の、ＣＤ３３^＋細胞を殺傷するようにという特異的な再指示によって媒介されている（Ｌａｓｚｌｏ，ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｂｌｏｏｄ，１２３（４）：５５４−５６１；Ｋｒｕｐｋａ，ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｂｌｏｏｄ，１２３（３）：３５６−３６５；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１３（６）：１５４９−１５５７；Ａｉｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２７（５）：１１０７−１１１５）。ＡＭＧ３３０は２４〜２００ｐｇ／ｍＬ（０．４〜３．７ｐＭ）の範囲にわたって試験管内でヒトのエフェクター細胞によってＡＭＬ細胞株の最大半量の溶解を示す強力な分子である（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ，２０１４）。

試験管内及び生体外の実験は、ＡＭＧ３３０がカニクイザルのＴ細胞も動員し、活性化することができ；ＣＤ３３^＋腫瘍細胞株の再指示溶解についてのＥＣ_５０値はヒトに比べてやや高い（７９〜２５４ｐｇ／ｍＬ［１．５〜４．７ｐＭ］）ことを実証した。カニクイザルのエフェクター細胞に比べて最大３倍高い能力がヒトについて観察された。結合及び生物活性のデータは毒性評価について関連する種としてカニクイザルを確認している。

ＡＭＧ３３０は用量依存性にヒトならびにカニクイザルのＴ細胞の活性化を誘導し、ＣＤ３３^＋細胞の再指示溶解を媒介した。

ＡＭＧ３３０活性の特異性は、ＣＤ３３^＋ヒトＥＯＬ−１細胞またはＣＤ３３⁻陰性のヒトＫａｔｏ ＩＩＩ細胞を用いて検証した。ＡＭＧ３３０は、ヒトＴ細胞によるＥＯＬ−１細胞の再指示溶解を選択的に媒介した一方で、高濃度のＡＭＧ３３０にさらしてもＫａｔｏ ＩＩＩの生存率は不変のままだった（図２Ａ）。加えて、ＡＭＧ３３０はＣＤ３３^＋細胞の存在下でのみＴ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の表面発現を高めた一方で、ＣＤ３３⁻陰性のＫａｔｏ ＩＩＩ細胞との共培養ではＣＤ６９^＋Ｔ細胞の有意な増加は観察されなかった（図２Ｂ）。

ＡＭＧ３３０は、ヒトＣＤ３３（ｈｕＣＤ３３）またはカニクイザルのＣＤ３３（ｃｙＣＤ３３）を安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞のカニクイザルエフェクター細胞による再指示溶解を選択的に媒介する一方で、標的陰性の細胞の生存率は影響を受けなかった（図３Ａ）。ＡＭＧ３３０によるカニクイザルＴ細胞の活性化（ＣＤ６９）は高度に特異的であり、ＣＤ３３発現細胞の非存在下では観察されなかった（図３Ｂ）。

ヒトＣＤ３３を発現しているＣＤ３３^＋ヒトＡＭＬ腫瘍細胞株のパネルを用いてＡＭＧ３３０の活性を調べた。健常ヒトドナーのＰＢＭＣまたは単離したＣＤ３^＋Ｔ細胞を、漸増濃度のＡＭＧ３３０の存在下で、ＣＤ３３を発現している標的細胞と共に共培養し、フローサイトメトリー解析によって特異的な細胞溶解を測定した。ＡＭＧ３３０が媒介した、試験管内でのヒトエフェクター細胞によるＡＭＬ細胞株の最大半量溶解（ＥＣ_５０）は、２４から２００ｐｇ／ｍＬまで（０．４〜３．７ｐＭ）に及んだ（表１）。

（表１）ヒトＴ細胞によるＡＭＧ３３０が媒介する再指示溶解のＥＣ_ｘの値

細胞株間の差異はＣＤ３３の細胞表面での発現の量における変動による可能性が最も高い。ＡＭＧ３３０の細胞傷害性について、標的の発現とＥＣ５０値の間には定量的な相関が認められ、高レベルのＣＤ３３の発現は低いＥＣ５０値を生じた（Ｌａｓｚｌｏ，ｅｔ ａｌ，２０１４，ｌｏｃ ｃｉｔ．）。

実施例２：ＡＭＧ３３０の薬物動態
ＢＡＬＢ／ｃマウスへの３００μｇ／ｋｇまたは９００μｇ／ｋｇの単回ＩＶボーラス注射、９００μｇ／ｋｇの単回ＳＣボーラス注射及び９００μｇ／ｋｇの単回ＩＰボーラス注射の後でＡＭＧ３００のＰＫを特徴付けた。単回用量のＩＶ、ＳＣ及びＩＰの投与の後のＡＭＧ３３０のノンコンパートメントＰＫパラメータを表２に示す。ＡＭＧ３３０の血清濃度はＩＶ投与後２４時間まで定量可能だった。半減期、クリアランス及び分布の体積が双方の群で類似していたということは、ＡＭＧ３３０の線形の薬物動態を示している。時間０から無限（ＡＵＣ_ｉｎｆ）までの濃度・時間曲線下面積及びＣ_ｍａｘは、３００μｇ／ｋｇから９００μｇ／ｋｇまで用量線形性に増加した。ＳＣ投与の後、投与後２時間で２１０．３ｎｇ／ｍＬのＣ_ｍａｘに達し、ＡＭＧ３３０は３６時間まで血清で定量可能だった。９００μｇ／ｋｇのＩＶボーラスのＰＫに由来するＡＵＣ_ｉｎｆに比べて、絶対的ＳＣ生体利用効率は２２％だった。ＩＰ投与の後２時間で２２０１ｎｇ／ｍＬのＣ_ｍａｘを達成し、ＡＭＧ３３０は３６時間まで定量可能だった。９００μｇ／ｋｇのＩＶボーラス後のＡＵＣ_ｉｎｆとの比較に基づいて、絶対的ＩＰ生体利用効率は９９％だった。見かけの***半減期は投与の経路すべてで類似しており、６．５〜８．７時間の間の範囲だった（表２）。

（表２）ＢＡＬＢ／ｃマウスへの単回用量のＩＶ、ＳＣまたはＩＰ投与の後の平均薬物動態パラメータ

ｔ_ｍａｘ＝最高濃度の時間；Ｃ_ｍａｘ＝最高濃度；ｔ_１／２＝最終半減期；ＡＵＣ_ｉｎｆ＝時間０から無限までの濃度・時間曲線下面積；Ｖｄ＝分布の体積；Ｃｌ＝クリアランス；Ｆ＝生体利用効率；ｎａ＝該当なし

実施例３：ヒトにおける予測されるＡＭＧ３３０の濃度
開発中の他のＢｉＴＥ（登録商標）分子による以前の経験に基づいてＡＭＧ３３０のヒトＰＫを予測した。ブリナツモマブ、ＡＭＧ２１１及びＡＭＧ１１０の臨床ＰＫは、臨床上の濃度・時間のデータのノンコンパートメント解析に基づいた２．１〜４．４時間の範囲の半減期を伴って類似していた（表３）。これらの化合物の構造及び分子量は類似しており、それらは類似の作用メカニズムを有するので、ＡＭＧ３３０のＰＫはそれらのデータに一致すると予想される；これらＢｉＴＥ（登録商標）分子はすべてＣＤ３^＋Ｔ細胞を標的とする一方のアームを有し、他方のアームはブリナツモマブ、ＡＭＧ２１１及びＡＭＧ１１０についてそれぞれＣＤ１９、ＣＥＡ及びＥｐＣＡＭを標的とする。ＡＭＧ３３０は液性腫瘍の適応である急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者を治療するためにｃＩＶ点滴を介して投与されるように意図され、ブリナツモマブは同じく液性腫瘍の適応であるＡＬＬを治療するためにｃＩＶ点滴を介して投与されるので、ＡＭＧ３３０のヒトＰＫパラメータはブリナツモマブから導き出した。ＡＭＧ３３０のＣＬ及びＶｄはそれぞれ２９２０ｍＬ／時間及び４５００ｍＬであると推測され、ＰＫパラメータの推定値は、ブリナツモマブのｃＩＶ点滴を受けた非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ＮＲＤ^＋ＡＬＬ及び再発／難治性（Ｒ／Ｒ）のＡＬＬの患者における４つの試験に由来するＰＫデータのノンコンパートメント解析から得た。ブリナツモマブ及びＡＭＧ３３０は異なる細胞受容体（Ｂ細胞上のＣＤ１９に対して造血細胞上のＣＤ３３）を標的とするが、他のＢｉＴＥ（登録商標）分子による以前の臨床経験は、調べた投薬範囲ではどんな標的介在性薬物動態（ＴＭＤＤ）も示唆していない。従って、ＡＭＧ３３０についての線形ＰＫの推測は臨床上調べられている他のＢｉＴＥ（登録商標）分子の観察された線形ＰＫに一致する。

これらのＰＫパラメータに基づくと、半減期はＳＣ投与後の方が長く、４〜７時間に及んだが、ＡＭＧ３３０の予測半減期は１時間であり；ｃＩＶ投与の後のカニクイザルにおける半減期は同様に短く、１．６〜２．７時間の範囲である。さらに、ブリナツモマブのＰＫパラメータを用いて、転移固形腫瘍の治療で臨床的に検討されているＡＭＧ１１０のＰＫも予測した。ＡＭＧ１１０の予測された半減期は観察された半減期のほぼ２倍以内だった。ＡＭＧ１１０のクリアランスはブリナツモマブのＰＫに基づいて予想されるものよりおよそ４倍低かったが、依然としてＰＫパラメータが導き出された４つの臨床試験にわたってブリナツモマブについて観察されたクリアランスの範囲内であった；平均のクリアランス値は１．８１〜３．３６Ｌ／時間の幅があり、変動性は３２％〜１０３％の幅があった（変動係数によって測定したとき）。

（表３）ノンコンパートメント解析に基づくブリナツモマブ、ＡＭＧ１１０及びＡＭＧ２１１の平均臨床ＰＫパラメータ

提案されたＦＩＨ用量でのＡＭＧ３３０のｃＩＶ点滴後の予測されたヒトの曝露（Ｃｓｓによって測定されたとき）及び曝露限界を表４に提示する。曝露限界は、１０μｇ／ｋｇ／日のｃＩＶでのＨＮＳＴＤで、８．３６ｎｇ／ｍＬのオス及びメスのカニクイザルの平均Ｃｓｓに基づき、ヒトとサルのエフェクター細胞間の効能の差異について調整される；ＡＭＧ３３０はサルのエフェクター細胞よりもヒトにて３倍さらに強力だった。

（表４）ＡＭＧ３３０のｃＩＶ点滴後のＨＮＳＴＤに比べた定常状態での予測されたヒトの曝露及び曝露限界

^ａ予測されたヒトＣ_ｓｓで割ったＨＮＳＴＤでのオス及びメスのサルにおける平均Ｃ_ｓｓ
^ｂ平均Ｃ_ｓｓは１０μｇ／ｋｇ／日で８．３６ｎｇ／ｍＬだった
^ｃサルのエフェクター細胞に対比させたヒトにおける３倍大きな効能について補正した

Claims (45)

1. 骨髄性白血病の治療方法で使用するための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性構築物であって、前記構築物が１４日の最長期間投与され、その後、前記構築物を投与しない少なくとも１４日の期間が続く、前記二重特異性構築物。
2. 前記構築物が、以下のステップ：
   （ａ）前記二重特異性構築物の第１の用量の投与と、その後に続く
   （ｂ）第２の用量が前記第１の用量を超える、前記二重特異性構築物の前記第２の用量の投与と、任意でその後に続く
   （ａ）任意の第３の用量が前記第２の用量を超える、前記二重特異性構築物の前記第３の用量の投与と
   を含むスケジュールに従って投与される、請求項１に記載の使用のための二重特異性構築物。
3. 前記第１の用量の投与の期間が７日までである、請求項２に記載の使用のための二重特異性構築物。
4. 前記第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間が８〜１３日の範囲内である、請求項２または３に記載の使用のための二重特異性構築物。
5. 前記第２の用量の投与の期間が４〜７日であり、且つ前記第３の用量の投与の期間が４〜７日である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
6. 前記骨髄性白血病の前記治療が、それぞれ、構築物投与の１４日の前記最長期間とその後に続く前記構築物を投与しない少なくとも１４日の前記期間とを含む治療の２以上のサイクルを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
7. 前記治療の前記第１のサイクルだけがステップ（ａ）に係る前記投与を含むのに対して、次に続くサイクルはステップ（ｂ）に係る用量で開始する、請求項６に記載の使用のための二重特異性構築物。
8. 前記二重特異性構築物の前記第１の結合ドメインが、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
9. 前記二重特異性構築物の前記第２の結合ドメインが、配列番号１４８〜１５３、１５４〜１５９、１６０〜１６５、１６６〜１７１、１７２〜１７７、１７８〜１８３、１８４〜１８９、１９０〜１９５、１９６〜２０１及び２０２〜２０７から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
10. 前記二重特異性構築物が二重特異性の抗体構築物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
11. 前記二重特異性の抗体構築物が、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単鎖構築物である、請求項１０に記載の使用のための二重特異性構築物。
12. 前記二重特異性構築物が、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシウレア、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）から成る群から選択される１種類以上のエピジェネティック因子との併用で投与され、その際、
    （ａ）前記二重特異性構築物の前記投与に先立って前記１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；
    （ｂ）前記二重特異性構築物の前記投与に続いて前記１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；または
    （ｃ）前記１種類以上のエピジェネティック因子と前記二重特異性構築物が同時に投与される、
    先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
13. 前記１種類以上のエピジェネティック因子が、前記二重特異性構築物の前記投与に先立って７日まで投与される、請求項１２に記載の使用のための二重特異性構築物。
14. 前記エピジェネティック因子がヒドロキシウレアである、請求項１３に記載の使用のための二重特異性構築物。
15. 前記骨髄性白血病が、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞性白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、小児骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤血球性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄性肉腫、及び急性混合型白血病から成る群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性構築物。
16. それを必要とする対象に、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む治療上有効な量の二重特異性構築物を投与することを含む、骨髄性白血病の治療のための方法であって、
    １４日の最長期間、前記対象に前記構築物を投与するステップと、その後に続く少なくとも１４日の期間の前記構築物を投与しないステップとを含む、前記方法。
17. 前記構築物が、以下のステップ：
    （ａ）前記二重特異性構築物の第１の用量の投与と、その後に続く
    （ｂ）第２の用量が前記第１の用量を超える、前記二重特異性構築物の前記第２の用量の投与と、任意でその後に続く
    （ｃ）任意の第３の用量が前記第２の用量を超える、前記二重特異性構築物の前記第３の用量の投与と
    を含むスケジュールに従って投与される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１の用量の投与の期間が７日までである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間が８〜１３日の範囲内である、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 前記第２の用量の投与の期間が４〜７日であり、且つ前記第３の用量の投与の期間が４〜７日である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. それぞれ、二重特異性構築物投与の１４日の前記最長期間とその後に続く前記二重特異性構築物を投与しない少なくとも１４日の前記期間とを含む治療の２以上のサイクルを含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記治療の前記第１のサイクルだけがステップ（ａ）に係る前記投与を含むのに対して、次に続くサイクルはステップ（ｂ）に係る用量で開始する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記二重特異性構築物の前記第１の結合ドメインが、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記二重特異性構築物の前記第２の結合ドメインが、配列番号１４８〜１５３、１５４〜１５９、１６０〜１６５、１６６〜１７１、１７２〜１７７、１７８〜１８３、１８４〜１８９、１９０〜１９５、１９６〜２０１及び２０２〜２０７から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記二重特異性構築物が二重特異性の抗体構築物である、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記二重特異性の抗体構築物が、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単鎖構築物である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記二重特異性構築物が、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシウレア、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）から成る群から選択される１種類以上のエピジェネティック因子との併用で投与され、その際、
    （ａ）前記二重特異性構築物の前記投与に先立って前記１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；
    （ｂ）前記二重特異性構築物の前記投与に続いて前記１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；または
    （ｃ）前記１種類以上のエピジェネティック因子と前記二重特異性構築物が同時に投与される、
    請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記１種類以上のエピジェネティック因子が、前記二重特異性構築物の前記投与に先立って７日まで投与される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記エピジェネティック因子がヒドロキシウレアである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記骨髄性白血病が、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞性白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、小児骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤血球性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄性肉腫、及び急性混合型白血病から成る群から選択される、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製についての、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメインとＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性構築物の使用であって、前記構築物は１４日の最長期間投与されることになり、その後に前記構築物を投与しない少なくとも１４日の期間が続く、前記使用。
32. 前記二重特異性構築物が、以下のステップ：
    （ａ）前記二重特異性構築物の第１の用量の投与と、その後に続く
    （ｂ）第２の用量が前記第１の用量を超える、前記二重特異性構築物の前記第２の用量の投与と、任意でその後に続く
    （ａ）任意の第３の用量が前記第２の用量を超える、前記二重特異性構築物の前記第３の用量の投与と
    を含むスケジュールに従って投与されることになる、請求項３１に記載の使用。
33. 前記第１の用量の投与の期間が７日までである、請求項３２に記載の使用。
34. 前記第１の用量に続く用量を投与するステップの全期間が８〜１３日の範囲内である、請求項３２または３３に記載の使用。
35. 前記第２の用量の投与の期間が４〜７日であり、且つ前記第３の用量の投与の期間が４〜７日である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。
36. 前記骨髄性白血病の前記治療が、それぞれ、二重特異性構築物投与の１４日の前記最長期間とその後に続く前記二重特異性構築物を投与しない少なくとも１４日の期間とを含む治療の２以上のサイクルを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の使用。
37. 前記治療の前記第１のサイクルだけがステップ（ａ）に係る前記投与を含むのに対して、次に続くサイクルはステップ（ｂ）に係る用量で開始する、請求項３６に記載の使用。
38. 前記二重特異性構築物の前記第１の結合ドメインが、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の使用。
39. 前記二重特異性構築物の前記第２の結合ドメインが、配列番号１４８〜１５３、１５４〜１５９、１６０〜１６５、１６６〜１７１、１７２〜１７７、１７８〜１８３、１８４〜１８９、１９０〜１９５、１９６〜２０１及び２０２〜２０７から成る群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の使用。
40. 前記二重特異性構築物が二重特異性の抗体構築物である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の使用。
41. 前記二重特異性の抗体構築物が、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単鎖構築物である、請求項４０に記載の使用。
42. 前記二重特異性構築物が、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシウレア、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）から成る群から選択される１種類以上のエピジェネティック因子との併用で投与され、その際、
    （ａ）前記二重特異性構築物の前記投与に先立って前記１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；
    （ｂ）前記二重特異性構築物の前記投与に続いて前記１種類以上のエピジェネティック因子が投与される；または
    （ｃ）前記１種類以上のエピジェネティック因子と前記二重特異性構築物が同時に投与される、
    請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の使用。
43. 前記１種類以上のエピジェネティック因子が、前記二重特異性構築物の前記投与に先立って７日まで投与される、請求項４２に記載の使用。
44. 前記エピジェネティック因子がヒドロキシウレアである、請求項４３に記載の使用。
45. 前記骨髄性白血病が、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞性白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、小児骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤血球性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄性肉腫、及び急性混合型白血病から成る群から選択される、請求項３１〜４４のいずれか１項に記載の使用。

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