CN116514974A - 抗cd28抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗CD28抗体或抗原结合片段，其用于治疗或预防肿瘤、自身免疫疾病或炎症性疾病中的应用。在一些实施方案中，所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1‑6任一项所示的序列表示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的序列表示的轻链可变区。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域。具体地，本发明涉及一种抗CD28抗体及其应用。
技术背景
CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。它与APC(抗原递呈细胞)上的B7分子结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。初始T细胞的完全活化通常需要三个信号，第一信号是抗原和抗原受体的结合，第二信号是共刺激信号，第三信号是细胞因子信号。CD28作为共刺激分子，参与了第二信号的接收。
当DC(树突状细胞)表面的特异pMHC(肽–主要组织相容性复合体)结合了初始Th细胞(辅助性T细胞)或Tc细胞(细胞毒性T细胞)表面多拷贝的某个TCR(T细胞受体)时将传递第一信号。TCR和pMHC结合，将导致与TCR紧密相邻的CD3链上ITAM被Lck激酶磷酸化。其他胞内信号转导相关酶随后被募集到此处，与CD4或CD8共受体及CD3链的胞质尾区相接触。这些酶一起介导酶级联化学反应，导致其他多个酶的活化。当这种活化级联反应出现于多个TCR时，T细胞将接收到第一信号(Mak,Saunders et al.2013,Primer to the immuneresponse,Newnes.)。
在多数情况下，TCR和pMHC的结合不足以完全活化一个初始Th细胞或Tc细胞，共刺激信号传导形式的第二信号是必需的。对于Th细胞，接收第一信号后导致Th细胞表面的重要共刺激分子CD28的表达上调。然而CD28要传递第二信号到Th细胞核内，其必须同递呈活化性pMHC的DC表面的配体B7分子相结合。T细胞活化是T细胞继续增殖和分化的基础，T细胞完全活化需要第一信号和第二信号的共同参与。T细胞通过TCR识别，此为T细胞活化的第一信号。TCR与CD3分子形成TCR-CD3复合体，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原产生的活化信号。第二信号(或共刺激信号)则由APC或靶细胞表面的共刺激分子与T细胞表面的相应共刺激分子相互作用产生，CD28则是T细胞活化中极其重要的共刺激分子。
第一款CD28超级激动性抗体Theralizumab(TGN1412，TAB08)被设计用于治疗自身免疫相关疾病(Attarwala 2010,J Young Pharm 2(3):332-336.)，并于2006年开始首次临床试验。目前Theralizumab在Phase II临床试验中用于Merkel细胞癌、类风湿关节炎、***性红斑狼疮、银屑病等的治疗。
CD28靶点更多在于拮抗剂药物的开发。如OSE Immunotherapeutics的FR-104(JNJ-3133)是PEG化的单价抗CD28 Fab抗体，用于类风湿性关节炎、器官移植排斥、术后并发症的治疗。百时美施贵宝的Lulizumab也是针对CD28结构域的拮抗剂抗体，用于治疗***性红斑狼疮、Sjogren-Larsson综合征等。CD28相关的其它药物如溶瘤病毒产品，基因治疗产品、融合蛋白产品，针对肿瘤、移植并发症、自身免疫性疾病等适应症的研究也均处于临床研究阶段。
发明内容
本发明涉及抗CD28抗体及其应用。具体地，本发明涉及以下内容：
1.抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以下HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3或其变体中的一个或多个：
(1)HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，
HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，
HCDR3的序列包含SEQ ID NO:12-17中任一个所示的序列或由其组成，
LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，
LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，
LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(2)SEQ ID NO:1所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(3)SEQ ID NO:2所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:13所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(4)SEQ ID NO:3所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(5)SEQ ID NO:4所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:15所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(6)SEQ ID NO:5所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；或
(7)SEQ ID NO:6所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成，
其中所述变体与所述对应的CDR序列分别具有3，2或1个氨基酸差异(优选保守氨基酸置换)或分别具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且所述变体保留与CD28的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以上所述的HCDR1，HCDR2，HCDR3中的一个或多个。在一些实施方案中，所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以上所述的HCDR1，HCDR2，和HCDR3。在一些实施方案中，所述抗CD28抗体或抗原结合片段还包含以上所述的LCDR1，LCDR2，和LCDR3中的一个或多个。
在一些实施方案中，如果所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以上所述的LCDR1，LCDR2，和LCDR3中的一个或多个，那么还包含以上所述的HCDR1，HCDR2，和HCDR3中的一个或多个。
在一些实施方案中，所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以下HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3或其变体：
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，
HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，
HCDR3的序列包含SEQ ID NO:12-17中任一个所示的序列或由其组成，
LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，
LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，
LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示序列或其变体的重链可变区。
在一些实施方案中，抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示序列或其变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示序列或其变体的重链可变区和SEQ ID NO:7所示序列或其变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述的变体与所述对应的序列分别具有3，2或1个氨基酸差异(优选保守氨基酸置换)或分别具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且所述变体保留与CD28的结合亲和力。
在一些实施方案中，抗CD28抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以下CDRs或其变体：
(1)SEQ ID NO:1所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(2)SEQ ID NO:2所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:13所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(3)SEQ ID NO:3所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(4)SEQ ID NO:4所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:15所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(5)SEQ ID NO:5所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；或
(6)SEQ ID NO:6所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成，
其中所述变体与所述对应的CDR序列分别具有3，2或1个氨基酸差异(优选保守氨基酸置换)或分别具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且所述变体保留与CD28的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述的CDR是按照Kabat编号***。
2.项目1所述的抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体包含SEQ IDNO:1-6任一个所示的序列或由其组成的重链可变区或其变体。
在一些实施方案中，所述抗体包含选自以下各项组成的重链可变区和轻链可变区，或其变体：
(1)包含SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(2)包含SEQ ID NO:2所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(3)包含SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(4)包含SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(5)包含SEQ ID NO:5所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；或
(6)包含SEQ ID NO:6所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述变体与所述对应的可变区分别具有3，2或1个氨基酸差异(优选保守氨基酸置换)或分别具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且所述变体保留与CD28的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述的抗CD28抗体或抗原结合片段还包含轻链恒定区和/或重链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区为κ或λ链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中所述抗体或抗原结合片段为IgG1抗体。
在一些实施方案中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:8所示的序列或由其组成，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为人源化抗体。
3.项目1或2所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)2、Fd、Fv、Fab/c、scFv、scFv多聚体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、双链抗体(Diabody)、二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、结构域抗体(dAb)或二价结构域抗体。
4.多肽，其选自以下各项组成的组：
(1)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(2)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列；
(3)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(4)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示的序列；
(5)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(6)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示的序列；
(7)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(8)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15所示的序列；
(9)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(10)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:16所示的序列；
(11)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的序列或其变体，其中所述多肽作为抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20所示的序列；
(12)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:17所示的序列；
(13)多肽，其包含SEQ ID NO:1所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:7所示的序列；
(14)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:1所示的序列；
(15)多肽，其包含SEQ ID NO:2所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:7所示的序列；
(16)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:2所示的序列；
(17)多肽，其包含SEQ ID NO:3所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:7所示的序列；
(18)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:3所示的序列；
(19)多肽，其包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体，其中所述多肽作为抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；
(20)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:4所示的序列；
(21)多肽，其包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:7所示的序列；
(22)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:5所示的序列；
(23)多肽，其包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ ID NO:7所示的序列；或
(24)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为抗CD28抗体的一部分，特异性结合CD28，所述抗体还包含SEQ IDNO:6所示的序列；
其中所述变体序列为与序列编号所示的对应序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并保留与CD28结合亲和力的序列，或与序列编号所示的对应序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，***或缺失)并保留与CD28结合亲和力的序列。
在一些实施方案中，作为抗CD28抗体的一部分的多肽，其选自以下各项组成的组：
(1)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列或其变体；
(2)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示的序列或其变体；
(3)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示的序列或其变体；
(4)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15所示的序列或其变体；
(5)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16所示的序列或其变体；
(6)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，所述抗CD28抗体还包含SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ IDNO:20所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分的多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD28的抗CD28抗体还包含SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和一个选自SEQ ID NO:12-17所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，作为抗CD28抗体的一部分的多肽，选自以下各项组成的组：
(1)多肽，其包含SEQ ID NO:1所示的序列或其变体；
(2)多肽，其包含SEQ ID NO:2所示的序列或其变体；
(3)多肽，其包含SEQ ID NO:3所示的序列或其变体；
(4)多肽，其包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体；
(5)多肽，其包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体；或
(6)多肽，其包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体。
在一些实施方案，所述抗CD28抗体还包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分的多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，所述抗CD28抗体还包含选自SEQ ID NO:1-6所示的序列或其变体。
在一些实施方案中，所述变体序列为与序列编号所示的对应序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并保留与CD28结合亲和力的序列，或与序列编号所示的对应序列相比具有一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，***或缺失)并保留与CD28结合亲和力的序列。
在一些实施方案中，所述抗CD28抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段或多肽。
5.生物材料，为
(1)核酸分子，其编码项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段，或项目4所述的多肽；
(2)载体，其包含编码项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段，或项目4所述的多肽的核酸分子；或
(3)宿主细胞，其包含编码项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段，或项目4所述的多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，所述的宿主细胞选自CHO细胞、HEK细胞(如HEK293F细胞)、BHK细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。
本发明还提供制备本发明的抗CD28抗体或抗原结合片段的方法，包括：培养上述的宿主细胞使抗体或抗原结合片段表达，及分离所述抗体或其抗原结合片段。
6.偶联物，其包含项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、可检测的标记、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合。
在一些实施方案中，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质、化疗剂、生物毒素、聚乙二醇或酶。
7.试剂盒，其包括项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段、项目6所述的偶联物。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗CD28抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测CD28在样品中的存在或其水平。
8.药物组合物，其包含项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段、项目6所述的偶联物。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物为适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
9.项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段、项目6所述的偶联物用于治疗和/或预防疾病或在制备治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
10.试剂盒，其包含(1)项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段、项目6所述的偶联物，和(2)针对其它抗原的抗体或其抗原结合片段，和/或细胞毒性剂，和任选地，使用说明书。
11.治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的项目1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段、项目6所述的偶联物。
在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤、自身免疫疾病或炎症疾病，如选自以下各项组成的组的疾病：Merkel细胞癌、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、银屑病、器官移植排斥、术后并发症，Sjogren-Larsson综合征。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
在本发明中涉及的术语具备本领域技术人员理解的常规含义。在本技术领域内使用和/或可接受的情况下，一个术语有两个或两个以上定义时，本文使用的术语的定义用于包括所有的含义。
“抗体”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体包括但不局限的实施例包括重链、轻链、其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分或结合蛋白的至少一部分。CDR区包括轻链的CDR区(LCDR1-3)和重链的CDR区(HCDR1-3)。
本领域普通技术人员可以理解，抗体的CDR区负责抗体对抗原的结合特异性。在已知抗体重链和轻链可变区序列的情况下，目前有几种确定抗体CDR区的方法，包括Kabat，IMGT，Chothia和AbM编号***。然而，每种关于抗体或其变体的CDR的定义的应用都将在本文定义和使用的术语的范围内。如果给定该抗体的可变区氨基酸序列，则本领域技术人员通常可确定哪些残基包含在特定CDR中，而不依赖于该序列自身之外的任何实验数据。
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同源性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一删除、***、替换或添加――与第一氨基酸序列相比――都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如NCBI Multiple Alignment(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi？LINK_LOC＝BlastHom eLink)。例如，在WO 04/037999,EP 0 967 284,EP 1 085 089,WO 00/55318,WO 00/78972,WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，专业技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸替换，其通常可以描述为这样的氨基酸替换，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基替换，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸替换是本领域内公知的，例如，从WO04/037999,GB-A-3357768,WO 98/49185,WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种替换的(优选)类型和/或结合。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一些实施方案中，一串氨基酸可被结构上类似的氨基酸串替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。
在下表中提供了保守性氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示在这两个氨基酸之间有保守替换。
| C | G | P | S | A | T | D | E | N | Q | H | K | R | V | M | I | L | F | Y | W | |
| W | -8 | -7 | -6 | -2 | -6 | -5 | -7 | -7 | -4 | -5 | -3 | -3 | 2 | -6 | -4 | -5 | -2 | 0 | 0 | 17 |
| Y | 0 | -5 | -5 | -3 | -3 | -3 | -4 | -4 | -2 | -4 | 0 | -4 | -5 | -2 | -2 | -1 | -1 | 7 | 10 | |
| F | -4 | -5 | -5 | -3 | -4 | -3 | -6 | -5 | -4 | -5 | -2 | -5 | -4 | -1 | 0 | 1 | 2 | 9 | ||
| L | -6 | -4 | -3 | -3 | -2 | -2 | -4 | -3 | -3 | -2 | -2 | -3 | -3 | 2 | 4 | 2 | 6 | |||
| I | -2 | -3 | -2 | -1 | -1 | 0 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | 4 | 2 | 5 | ||||
| M | -5 | -3 | -2 | -2 | -1 | -1 | -3 | -2 | 0 | -1 | -2 | 0 | 0 | 2 | 6 | |||||
| V | -2 | -1 | -1 | -1 | 0 | 0 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | 4 | ||||||
| R | -4 | -3 | 0 | 0 | -2 | -1 | -1 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||
| K | -5 | -2 | -1 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 5 | ||||||||
| H | -3 | -2 | 0 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||||
| Q | -5 | -1 | 0 | -1 | 0 | -1 | 2 | 2 | 1 | 4 | ||||||||||
| N | -4 | 0 | -1 | 1 | 0 | 0 | 2 | 1 | 2 | |||||||||||
| E | -5 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 4 | ||||||||||||
| D | -5 | 1 | -1 | 0 | 0 | 0 | 4 | |||||||||||||
| T | -2 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3 | ||||||||||||||
| A | -2 | 1 | 1 | 1 | 2 | |||||||||||||||
| S | 0 | 1 | 1 | 1 | ||||||||||||||||
| P | -3 | -1 | 6 | |||||||||||||||||
| G | -3 | 5 | ||||||||||||||||||
| C | 12 |
在一些实施方案中，所述保守替换优选地是这样的替换，即，其中下列组(a)–(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基替换：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala,Ser,Thr,Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp,Asn,Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基:His,Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基:Met,Leu,Ile,Val和Cys；以及(e)芳族残基:Phe,Tyr和Trp。
特别优选的保守替换如下：Ala替换成Gly或替换成Ser；Arg替换成Lys；Asn替换成Gln或替换成His；Asp替换成Glu；Cys替换成Ser；Gln替换成Asn；Glu替换成Asp；Gly替换成Ala或替换成Pro；His替换成Asn或替换成Gln；Ile替换成Leu或替换成Val；Leu替换成Ile或替换成Val；Lys替换成Arg,替换成Gln或替换成Glu；Met替换成Leu,替换成Tyr或替换成Ile；Phe替换成Met,替换成Leu或替换成Tyr；Ser替换成Thr；Thr替换成Ser；Trp替换成Tyr；Tyr替换成Trp；和/或Phe替换成Val,替换成Ile或替换成Leu。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”包括但不限于，F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、Fd、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链Fvs(scFv)、二硫键稳定性Fv(Disulfide-stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、双链抗体(Diabody)、二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)、scFv多聚体(如scFv二聚体、scFv三聚体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、纳米抗体、单域抗体(sdAb)、结构域抗体(dAb)、二价结构域抗体，或任何其他与抗原结合但不包含完整的抗体结构的抗体片段。不管结构如何，抗原结合片段包括任何能够与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原结合的多肽或多肽复合体。Mao C S等“Disulfide stabilized FvFragments(dsFv):a New Type of Engineering Antibody Fragments”.Progress inBiochemistry and Biophysics,1998,25(6):525-526介绍了dsFv的结构。Holt等″Domainantibodies：proteins for therapy″Trends in Biotechnology(2003)：Vol.21，No.11：484-490综述了称为“结构域抗体”或dAbs的抗原结合片段，它仅含有抗体的VH或VL结构域，因此比例如Fab和scFv更小。dAbs是抗体最小的已知的抗原结合片段，从11kDa到15kDa。Fab/c片段含有Fc和Fab决定簇，其中“Fc”区域含有两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。术语“抗体片段”包括适配体、适配体对映体(spiegelmers)和双体(diabodies)。术语“抗体片段”也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它们与抗体一样可结合至特定的抗原以形成复合体。通常，抗体片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明公开的抗体、抗原结合片段包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体或抗原结合片段的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体或抗原结合片段与表位结合。抗体或抗原结合片段可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
在本发明中，CD28抗原可以来自哺乳动物，例如人，大鼠，小鼠，猴。
本文所述的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。“分离的”也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体、抗原结合片段或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
对于治疗特定患者的有效剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体、抗原结合片段或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、***频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。在一些实施方案中，本发明抗体施用于患者的剂量为每次0.01mg/kg至100mg/kg患者体重。在一些实施方案中，每星期、或每月给药一次。
“药学上可接受的”是指药典中列出的用于动物、特别是用于人类药物的物料。此外，“药学上可接受的载体和/或赋形剂”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体和/或赋形剂，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
本发明的抗体或抗原结合片段包括中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括但不限于与衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及与衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。本文所述抗体可以为中性，即基本没有净电荷，如含抗体组合物pH为抗体等电点时抗体为电中性。本文所述抗体可以以正离子形式存在，如当pH在等电点以下，抗体分子整体上显示正电荷。本文所述抗体可以以负离子形式存在，如当pH在等电点以上，抗体分子整体上显示负电荷。
“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。
“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect)是指能引起50％最大效应的浓度。
附图说明:
图1.不同抗CD28抗体与人CD28结合曲线。
图2.不同抗CD28抗体与大鼠CD28结合曲线。
图3.不同抗CD28抗体与小鼠CD28结合曲线。
图4.溶液状态下抗CD28抗体功能测试。
图5.在抗CD3抗体参与下抗CD28抗体激活T细胞能力测试，其中图中αCD3为小鼠抗人CD3抗体。
抗体的制备
本领域已知多种制备抗体的方法，如杂交瘤技术、重组DNA技术、转基因小鼠技术及噬菌体展示文库等方法制备抗体。
抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of ProteinTherapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in ReferenceModule in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及***序列两侧RNA剪接的供体和受***点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物宿主细胞包括HEK293细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞、鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，***基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、新霉素抗性、潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。所得抗体可通过常规技术手段分离或纯化，如蛋白A-琼脂糖凝胶、离子交换层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等。
具体实施方式
以下通过实施例具体描述本发明。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：抗CD28抗体的制备、亲和力测定
1.抗CD28抗体的表达
将编码表1所述抗体的可变区的核酸转入含有编码人Ig kappa轻链恒定区框架(SEQ ID NO：8)和IgG1重链恒定区框架(SEQ ID NO：9)的表达载体中，并通过HEK293F宿主细胞瞬时转染表达抗体。
表1.抗CD28抗体重链可变区序列与轻链可变区序列列表(其中CDR序列以下划线标出)
人Ig kappa轻链恒定区序列(SEQ ID NO：8)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC
人IgG1重链恒定区序列(SEQ ID NO：9)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD
VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2.抗CD28抗体与人CD28的亲和力测定
在2-8℃条件下，过夜包被终浓度为2μg/mL的人CD28蛋白(义翘神州，货号：11524-HCCH)，每孔100μl加入ELISA板中。第二天弃掉包被液用5％脱脂牛奶封闭ELISA板，每孔250μl，在37℃恒温箱中孵育2小时。用PBST缓冲液(由PBS磷酸缓冲盐溶液+吐温20配置)清洗2次ELISA板后，分别加入100μl不同抗CD28抗体。对照抗体为小鼠抗人CD28抗体(BDBiosciences，CAT#555725)。抗CD28抗体起始浓度为10μg/mL，3倍稀释，二抗为HRP偶联的羊抗人IgG(Jackson，货号：109-035-098)，ELISA试验表明这6个抗体与人CD28有不同程度的结合(见图1和表2)。
表2.不同抗CD28单克隆抗体与人CD28的结合试验
将人CD28蛋白用生物素偶联，使用SA传感器在Fortebio仪器上检测不同浓度的抗CD28单克隆抗体与人CD28抗原的亲和力，这6个抗体的亲和力数值见表3所示。
表3.不同抗CD28单克隆抗体与人CD28亲和力检测
实施例2：CD28单抗与不同物种的CD28蛋白结合活性研究
用PBS作为稀释液分别稀释CD28单抗终浓度为1μg/mL，每孔100μl加入到ELISA板中，2-8℃条件下过夜包被。第二天弃掉包被液用5％脱脂牛奶封闭ELISA板子，每孔250μl，在37℃恒温箱孵育2小时。用PBST缓冲液清洗2次ELISA板子后，加入用PBS稀释的大鼠CD28蛋白(义翘神州，货号：80302-R08H)或小鼠CD28蛋白(义翘神州，货号：50103-M08H)，起始浓度为3μg/mL，3倍稀释，每孔100μl，然后37℃孵育1个小时。用PBST缓冲液洗涤3次后加入HRP标记的抗his二抗(1：5000稀释，Genscript，货号：A00612)，然后37℃孵育1个小时。用PBST缓冲液洗涤5次后加入TMB显色约15-20分钟后，加入0.1M H2SO4终止显色，在酶标仪上读取450nm处的吸光值。用四参数方程拟合结果如图2和图3所示。
由于人CD28蛋白胞外区序列和食蟹猴CD28蛋白胞外区序列100％一致，因此由实施例1中图1可知除了P64-2D6与人或食蟹猴CD28较强结合外，其它5种CD28抗体与人或食蟹猴CD28结合能力相对较弱。图2表明P64-2D6和P64-2D8与大鼠CD28蛋白具有较强亲和力外，其它4种抗体与大鼠CD28亲和力相对较弱。由图3可知，P64-2D6和P64-2D8与小鼠CD28蛋白具有较强亲和力外，其它4种抗体与小鼠CD28亲和力相对较弱。
实施例3：抗CD28抗体的功能检测
采用基因工程化的Jurkat T细胞***来检测CD28单克隆抗体激活T细胞的能力。该细胞***由表达NFAT响应元件(NFAT-RE)或NF-κb响应元件或IL-2启动子驱动的荧光素酶报告基因组成。Jurkat细胞本身含有TCR/CD3受体，当含有NFAT-RE响应元件或NF-κb响应元件驱动的荧光素酶报告基因细胞与合适的TCR/CD3配体或抗TCR/CD3抗体结合时，TCR会转导细胞内信号，导致NFAT-RE或NF-κb介导的发光。类似地，当TCR/CD3效应细胞(IL-2)与抗TCR/CD3和抗CD28刺激物共同参与时，受体介导的信号会导致IL-2启动子介导的发光。
用含10％ FBS(胎牛血清，购于Gibco公司)的RPMI 1640培养基(购于Gibco公司)重悬细胞和稀释抗体。在96孔板中对应孔中加入IL-2-Jurkat细胞20万个/孔，每孔50μL。CD28单克隆抗体终浓度1μg/mL，阳性对照小鼠抗人CD28抗体(BD Biosciences，CAT#555725)与阴性对照人IgG1同型对照终浓度也为1μg/mL。抗人IgG Fc specific(Sigma，CAT#I2136-BULK)终浓度2.5μg/mL。对应孔中稀释抗体的加入量为50μL，最终每孔终体积为均100μL。加完样品之后在37℃CO2细胞培养箱孵育6个小时后，加入50μL荧光素酶底物反应液，然后在酶标仪中震荡10s后检测相对光单元(RLU)。单独加溶液状态下CD28单克隆抗体均不会引起T细胞的激活，但在加入抗人IgG Fc specific进行交联之后，抗体P64-1B11、P64-1H3、P64-2D6、P64-1G12、P64-2D5、P64-2D8可以引起T细胞的激活(见图4)。众所周知，在人体内本身存在一定量的免疫球蛋白(IgG)，如果这些免疫球蛋白与CD28抗体存在交联情况，有可能促使CD28抗体激活T细胞，导致细胞因子的大量释放，从而造成一些不良反应。由图4可以看出，同样条件下P64-2D6相对于其它单克隆抗体，在加入抗人IgG Fc specific进行交联之后，激活T细胞的能力较低，说明更加安全。
在另一个试验中，过夜包被小鼠抗人CD3抗体(BD Biosciences，CAT#555336)，第二天弃掉包被液，加入IL-2-Jurkat细胞和CD28单克隆抗体，细胞加入量和抗体的浓度及加入量与图4一致。本实施例中所用的抗人CD3抗体的Fab段可以特异性识别TCR-CD3复合物的中CD3ε链，激活T细胞，使T细胞初步活化。但是仅有第一信号的参与下即单独的CD3抗体不足以激活T细胞，但是和P64-1B11或P64-2D6联和则可以强烈的激活T细胞，即在第二信号的共同参与下可以使T细胞进一步活化(见图5)。
Claims (10)
1.抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体或抗原结合片段包含以下HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3或其变体中的一个或多个：(1)SEQ ID NO:1所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(2)SEQ ID NO:2所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:13所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(3)SEQ ID NO:3所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(4)SEQ ID NO:4所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:15所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；
(5)SEQ ID NO:5所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成；或
(6)SEQ ID NO:6所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，SEQ ID NO:7所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
优选按照Kabat编号***，HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，HCDR3的序列包含SEQ ID NO:17所示的序列或由其组成，LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成，
(7)HCDR1的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，
HCDR2的序列包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，
HCDR3的序列包含SEQ ID NO:12-17中任一个所示的序列或由其组成，
LCDR1的序列包含SEQ ID NO:18所示的序列或由其组成，
LCDR2的序列包含SEQ ID NO:19所示的序列或由其组成，
LCDR3的序列包含SEQ ID NO:20所示的序列或由其组成，
其中所述变体与所述对应的CDR序列分别具有3，2或1个氨基酸差异(优选保守氨基酸置换)或分别具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且所述变体保留与CD28的结合亲和力。
2.权利要求1所述的抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD28抗体包含选自以下各项组成的组的重链可变区和轻链可变区，或其变体：
(1)包含SEQ ID NO:1所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(2)包含SEQ ID NO:2所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(3)包含SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(4)包含SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；
(5)包含SEQ ID NO:5所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区；或
(6)包含SEQ ID NO:6所示的序列或由其组成的重链可变区，包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成的轻链可变区，
其中所述变体与所述对应的可变区分别具有3，2或1个氨基酸差异(优选保守氨基酸置换)或分别具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，并且所述变体保留与CD28的结合亲和力，
优选地，所述抗CD28抗体包含SEQ ID NO:8所示的轻链恒定区和SEQ ID NO:9所示的重链恒定区。
3.权利要求1或2所述的抗CD28抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)2、Fd、Fv、Fab/c、互补决定区片段、scFv、scFv多聚体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、双链抗体(Diabody)、二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
4.特异性结合CD28的多肽，其选自以下各项组成的组：
(1)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(2)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列；
(3)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(4)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示的序列；
(5)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(6)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示的序列；
(7)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(8)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15所示的序列；
(9)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(10)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16所示的序列；
(11)多肽，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列；
(12)多肽，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还应包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的序列；
(13)多肽，其包含SEQ ID NO:1所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；
(14)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:1所示的序列；
(15)多肽，其包含SEQ ID NO:2所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；
(16)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:2所示的序列；
(17)多肽，其包含SEQ ID NO:3所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；
(18)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:3所示的序列；
(19)多肽，其包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；
(20)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:4所示的序列；
(21)多肽，其包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；
(22)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:5所示的序列；
(23)多肽，其包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:7所示的序列；或
(24)多肽，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，其中所述多肽作为特异性结合CD28的抗CD28抗体的一部分，所述抗体还包含SEQ IDNO:6所示的序列；
其中所述变体序列为与序列编号所示的对应序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并保留与CD28结合亲和力的序列，或与序列编号所示的对应序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，***或缺失)并保留与CD28结合亲和力的序列。
5.生物材料，为
(1)核酸分子，其编码权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段，或权利要求4所述的多肽；
(2)载体，其包含编码权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段，或权利要求4所述的多肽的核酸分子；或
(3)宿主细胞，其包含编码权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段，或权利要求4所述的多肽的核酸分子。
6.偶联物，其包含权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、可检测的标记、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合；或，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质、化疗剂、生物毒素、聚乙二醇或酶。
7.试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段、权利要求6所述的偶联物；任选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗CD28抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶；任选地，所述试剂盒用于检测CD28在样品中的存在或其水平；任选地，所述试剂盒还包括针对其它抗原的抗体或其抗原结合片段，和/或细胞毒性剂，和任选地，使用说明书。
8.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段、权利要求6所述的偶联物；可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂；或者，所述药物组合物为适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
9.权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或抗原结合片段、权利要求6所述的偶联物用于治疗和/或预防疾病或在制备治疗和/或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病为肿瘤、自身免疫疾病或炎症性疾病，如选自以下各项组成的组的疾病：Merkel细胞癌、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、银屑病、器官移植排斥、术后并发症，Sjogren-Larsson综合征。
10.治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-3任一项所述的抗CD28抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的偶联物，其中所述疾病为肿瘤、自身免疫疾病或炎症疾病，如选自以下各项组成的组的疾病：Merkel细胞癌、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、银屑病、器官移植排斥、术后并发症，Sjogren-Larsson综合征。
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