JP2020183411A - 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】脂質ナノ粒子ホスト内に封入される核酸を含む、被封入核酸ナノ粒子組成物の提供。【解決手段】薬学的に許容される担体、ならびに脂質ナノ粒子ホストおよび核酸を含む被封入核酸ナノ粒子であって、前記核酸が、前記脂質ナノ粒子ホスト中に封入されている、被封入核酸ナノ粒子を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均粒径、および動的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する、被封入核酸ナノ粒子組成物。【選択図】なし
Description
本発明は概して、被封入核酸ナノ粒子組成物、ならびに一様に小さな粒径の被封入核酸
ナノ粒子を生産するプロセスおよび系に関する。
ナノ粒子を生産するプロセスおよび系に関する。
対象への生物学的活性剤（治療上関係している化合物）の送達は多くの場合、化合物が
標的細胞または組織に到達するのが困難であることにより妨げられている。特に、生細胞
への多くの生物学的活性剤の輸送は、細胞の複雑な膜系により非常に制限される。これら
の制限は、結果を達成するのに望ましい濃度よりもはるかに高い濃度の生物学的活性剤を
使用する必要性をもたらす可能性があり、これは、毒性効果および副作用の危険性を増大
させる。この問題に対する解決法の１つは、細胞への選択的進入を可能にさせる特異的な
担体分子および担体組成物を利用することである。脂質担体、生分解性ポリマーおよび各
種共役系を使用して、細胞への生物学的活性剤の送達を改善することができる。
標的細胞または組織に到達するのが困難であることにより妨げられている。特に、生細胞
への多くの生物学的活性剤の輸送は、細胞の複雑な膜系により非常に制限される。これら
の制限は、結果を達成するのに望ましい濃度よりもはるかに高い濃度の生物学的活性剤を
使用する必要性をもたらす可能性があり、これは、毒性効果および副作用の危険性を増大
させる。この問題に対する解決法の１つは、細胞への選択的進入を可能にさせる特異的な
担体分子および担体組成物を利用することである。脂質担体、生分解性ポリマーおよび各
種共役系を使用して、細胞への生物学的活性剤の送達を改善することができる。
細胞へ到達するのが特に困難である生物学的活性剤の種類の１つは、バイオ治療薬（bi
o therapeutic）（ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉ剤などのヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド、核酸および誘導体を含む）である。概して、核酸は、細胞または原形質（
plasma）において、ほんの限られた持続期間、安定である。とりわけ、ＲＮＡ干渉、ＲＮ
Ａｉ療法、ｍＲＮＡ療法、ＲＮＡ薬、アンチセンス療法および遺伝子療法の開発は、活性
核酸剤を細胞へ導入する有効な手段の必要性を増大させてきた。これらの理由で、核酸ベ
ースの作用物質を安定化および送達することができる組成物は、特に興味が持たれている
。
o therapeutic）（ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉ剤などのヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド、核酸および誘導体を含む）である。概して、核酸は、細胞または原形質（
plasma）において、ほんの限られた持続期間、安定である。とりわけ、ＲＮＡ干渉、ＲＮ
Ａｉ療法、ｍＲＮＡ療法、ＲＮＡ薬、アンチセンス療法および遺伝子療法の開発は、活性
核酸剤を細胞へ導入する有効な手段の必要性を増大させてきた。これらの理由で、核酸ベ
ースの作用物質を安定化および送達することができる組成物は、特に興味が持たれている
。
外来核酸の細胞への運搬を改善するための最もよく研究されたアプローチは、陽イオン
性脂質を伴うウイルスベクターまたは配合物の使用を含む。ウイルスベクターを使用して
、遺伝子を幾つかの細胞型へ効率的に移行させることができるが、それらは一般的に、化
学的に合成された分子を細胞へ導入するのに使用することはできない。
性脂質を伴うウイルスベクターまたは配合物の使用を含む。ウイルスベクターを使用して
、遺伝子を幾つかの細胞型へ効率的に移行させることができるが、それらは一般的に、化
学的に合成された分子を細胞へ導入するのに使用することはできない。
代替的なアプローチは、ある部分で生物学的活性剤と接触して、かつ別の部分で膜系と
相互作用する陽イオン性脂質を組み込んだ送達化合物を使用することである。かかる組成
物は、組成および調製方法に依存して、リポソーム、ミセル、リポプレックス、または脂
質ナノ粒子を提供すると報告される（概説に関して、Felgner, 1990, Advanced Drug Del
ivery Reviews, 5, 162-187、Felgner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16、Gallas, 201
3, Chem. Soc. Rev., 42, 7983-7997、Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.10
21/jm400791q、およびその中の参照文献を参照）。
相互作用する陽イオン性脂質を組み込んだ送達化合物を使用することである。かかる組成
物は、組成および調製方法に依存して、リポソーム、ミセル、リポプレックス、または脂
質ナノ粒子を提供すると報告される（概説に関して、Felgner, 1990, Advanced Drug Del
ivery Reviews, 5, 162-187、Felgner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16、Gallas, 201
3, Chem. Soc. Rev., 42, 7983-7997、Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.10
21/jm400791q、およびその中の参照文献を参照）。
Ｂａｎｇｈａｍ（J. Mol. Biol. 13, 238-252）による１９６５年でのリポソームの第
１の記述以来、生物学的活性剤の送達のための脂質ベースの担体系を開発することは、持
続的な関心および努力の対象となっている（Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Revi
ews, 65, 36-48）。まず、正に帯電したリポソームを使用することにより、機能的核酸を
培養細胞へ導入するプロセスが、Philip Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
84, 7413-7417 (1987)により記載された。そのプロセスは後に、K. L. Brigham et al.,
Am. J. Med. Sci., 298, 278-281 (1989)によりｉｎ ｖｉｖｏで実証された。より最近
では、脂質ナノ粒子配合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで実証された有効
性を伴って開発されている（Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm4007
91q、Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007、Zimmerman, 2006, Nature, 441
, 111-114.、Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51, 8529-8533.）。
１の記述以来、生物学的活性剤の送達のための脂質ベースの担体系を開発することは、持
続的な関心および努力の対象となっている（Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Revi
ews, 65, 36-48）。まず、正に帯電したリポソームを使用することにより、機能的核酸を
培養細胞へ導入するプロセスが、Philip Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
84, 7413-7417 (1987)により記載された。そのプロセスは後に、K. L. Brigham et al.,
Am. J. Med. Sci., 298, 278-281 (1989)によりｉｎ ｖｉｖｏで実証された。より最近
では、脂質ナノ粒子配合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで実証された有効
性を伴って開発されている（Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm4007
91q、Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007、Zimmerman, 2006, Nature, 441
, 111-114.、Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51, 8529-8533.）。
脂質配合物は、それらが、それらの細胞取込みを改善しながら生物学的分子を分解から
防御することができるため、魅力的な担体である。様々な種類の脂質配合物の中から、陽
イオン性脂質を含有する配合物が、ポリアニオン（例えば、核酸）を送達するのに一般的
に使用される。かかる配合物は、陽イオン性脂質単独を使用して、任意に他の脂質および
ホスファチジルエタノールアミンなどの両親媒性物質を含むように形成され得る。脂質配
合物の組成ならびにその調製方法の両方が、得られる凝集体の構造およびサイズに影響を
及ぼすことは、当該技術分野で周知である（Leung, 2012, J. Phys Chem. C, 116, 18440
-18450）。
防御することができるため、魅力的な担体である。様々な種類の脂質配合物の中から、陽
イオン性脂質を含有する配合物が、ポリアニオン（例えば、核酸）を送達するのに一般的
に使用される。かかる配合物は、陽イオン性脂質単独を使用して、任意に他の脂質および
ホスファチジルエタノールアミンなどの両親媒性物質を含むように形成され得る。脂質配
合物の組成ならびにその調製方法の両方が、得られる凝集体の構造およびサイズに影響を
及ぼすことは、当該技術分野で周知である（Leung, 2012, J. Phys Chem. C, 116, 18440
-18450）。
界面活性剤透析、押出、高速混合および段階的な希釈を含む幾つかの技法が、脂質ナノ
粒子中に核酸を封入すると報告されている。しかしながら、核酸封入に対する既存のアプ
ローチには、低い封入率または非スケーラビリティーの問題があり、高度の一様性を欠如
するナノ粒子を生産し、および／または８０ｎｍ未満の平均粒径を達成しない。したがっ
て、高度の封入をもたらし、スケーラブルであり、８０ｎｍ未満の平均粒子直径を有する
一様なサイズのナノ粒子を生産する脂質ナノ粒子中に核酸を封入する新たな方法が必要と
される。
粒子中に核酸を封入すると報告されている。しかしながら、核酸封入に対する既存のアプ
ローチには、低い封入率または非スケーラビリティーの問題があり、高度の一様性を欠如
するナノ粒子を生産し、および／または８０ｎｍ未満の平均粒径を達成しない。したがっ
て、高度の封入をもたらし、スケーラブルであり、８０ｎｍ未満の平均粒子直径を有する
一様なサイズのナノ粒子を生産する脂質ナノ粒子中に核酸を封入する新たな方法が必要と
される。
本発明は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する改善された方法に関する。上記方法
は、スケーラブルであり、小さな平均粒径（例えば、８０ｎｍ未満）、粒径の改善された
一様性、および高度の核酸封入（例えば、９０％を超える）を有する被封入核酸ナノ粒子
の形成を提供する。本発明のプロセスにより生産されるナノ粒子は、長期安定性を有する
。
は、スケーラブルであり、小さな平均粒径（例えば、８０ｎｍ未満）、粒径の改善された
一様性、および高度の核酸封入（例えば、９０％を超える）を有する被封入核酸ナノ粒子
の形成を提供する。本発明のプロセスにより生産されるナノ粒子は、長期安定性を有する
。
本発明の第１の態様は、１つまたは複数の脂質流を１つまたは複数の核酸流と合流させ
るステップと、合流した流れを流動させて、被封入核酸ナノ粒子の第１の出口溶液を供給
するステップにより、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。各脂質流
は、有機溶媒（例えば、エタノール）中に１つまたは複数の脂質の混合物を含む。各核酸
流は、水溶液中に１つまたは複数の核酸の混合物を含む。脂質および核酸流の交差ポイン
トで、各流れは、線速度を特徴とする。１つまたは複数の脂質ナノ粒子流は、約１．５メ
ートル／秒よりも大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する。同様に、１つまた
は複数の核酸流は、約１．５メートル／秒よりも大きいか、またはそれに等しい複合線速
度を有する。脂質および核酸流の合流および混合後の有機溶媒の最終濃度は、凝集を最低
限に抑える量（例えば、３３％未満）である。ある特定の実施形態では、第１の出口溶液
中の有機溶媒の最終濃度は、約２０％〜約２５％である。第１の態様によるある特定の実
施形態では、合流した脂質および核酸流は、希釈溶媒で希釈されて、第１の出口溶液を供
給する。第１の態様による他の実施形態では、複合核酸流（複数可）の複合線速度は、約
３〜約１４メートル／秒であり、脂質流（複数可）の複合線速度は、約１．５〜約７メー
トル／秒である。
るステップと、合流した流れを流動させて、被封入核酸ナノ粒子の第１の出口溶液を供給
するステップにより、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。各脂質流
は、有機溶媒（例えば、エタノール）中に１つまたは複数の脂質の混合物を含む。各核酸
流は、水溶液中に１つまたは複数の核酸の混合物を含む。脂質および核酸流の交差ポイン
トで、各流れは、線速度を特徴とする。１つまたは複数の脂質ナノ粒子流は、約１．５メ
ートル／秒よりも大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する。同様に、１つまた
は複数の核酸流は、約１．５メートル／秒よりも大きいか、またはそれに等しい複合線速
度を有する。脂質および核酸流の合流および混合後の有機溶媒の最終濃度は、凝集を最低
限に抑える量（例えば、３３％未満）である。ある特定の実施形態では、第１の出口溶液
中の有機溶媒の最終濃度は、約２０％〜約２５％である。第１の態様によるある特定の実
施形態では、合流した脂質および核酸流は、希釈溶媒で希釈されて、第１の出口溶液を供
給する。第１の態様による他の実施形態では、複合核酸流（複数可）の複合線速度は、約
３〜約１４メートル／秒であり、脂質流（複数可）の複合線速度は、約１．５〜約７メー
トル／秒である。
本発明の第２の態様では、第１の出口溶液は、希釈、インキュベーション、濃縮、およ
び透析によりさらに加工処理される。第２の態様によるある特定の実施形態では、透析さ
れた溶液はまた、滅菌ろ過されてもよい。第２の態様のプロセスにより生産される被封入
核酸ナノ粒子は、長期安定性を有する。
び透析によりさらに加工処理される。第２の態様によるある特定の実施形態では、透析さ
れた溶液はまた、滅菌ろ過されてもよい。第２の態様のプロセスにより生産される被封入
核酸ナノ粒子は、長期安定性を有する。
本発明の第３の態様では、本発明のプロセスにより生産される封入性脂質ナノ粒子は、
約８０ｎｍ未満の平均直径を有する。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、約３０〜約
８０ｎＭの平均直径を有する。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、約７０ｎｍ未満（例
えば、約４０〜７０ｎｍ）の平均直径を有する。
約８０ｎｍ未満の平均直径を有する。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、約３０〜約
８０ｎＭの平均直径を有する。好ましい実施形態では、ナノ粒子は、約７０ｎｍ未満（例
えば、約４０〜７０ｎｍ）の平均直径を有する。
本発明の第４の態様は、薬学的に許容される担体、脂質ナノ粒子ホスト、および核酸を
含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均直径を有する、
組成物を提供する。
含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均直径を有する、
組成物を提供する。
１．０ 概要
本発明は、一様に小さな粒径を有する被封入核酸ナノ粒子を生産するプロセスを提供す
る。本発明の１つの実施形態のステップを一般的に説明する代表的な流れ図が、図１に示
される。ステップ１００では、１つまたは複数の脂質流は、第１の交差ポイントで１つま
たは複数の核酸流と合流して、第１の合流した流れを供給する。次に、第１の合流した流
れは、合流した流れの個々の流れの会合を可能にするように流動され（ステップ１１０）
、すぐに脂質ナノ粒子構築および核酸封入のプロセスが起きる。初期核酸流（複数可）に
関して選択される特定パラメーターに依存して、合流した流れは任意選択で、水性媒質で
さらに希釈して（ステップ１２０）、第１の出口溶液を得てもよい（ステップ１３０）。
あるいは、任意選択の希釈ステップ１２０を省略してもよく、第１の出口流は、ステップ
１００において適切に希釈された核酸流（複数可）の使用により、流動している合流した
流れから直接得てもよい。ステップ１３０で得られる第１の出口溶液は、被封入核酸ナノ
粒子を含有する。
本発明は、一様に小さな粒径を有する被封入核酸ナノ粒子を生産するプロセスを提供す
る。本発明の１つの実施形態のステップを一般的に説明する代表的な流れ図が、図１に示
される。ステップ１００では、１つまたは複数の脂質流は、第１の交差ポイントで１つま
たは複数の核酸流と合流して、第１の合流した流れを供給する。次に、第１の合流した流
れは、合流した流れの個々の流れの会合を可能にするように流動され（ステップ１１０）
、すぐに脂質ナノ粒子構築および核酸封入のプロセスが起きる。初期核酸流（複数可）に
関して選択される特定パラメーターに依存して、合流した流れは任意選択で、水性媒質で
さらに希釈して（ステップ１２０）、第１の出口溶液を得てもよい（ステップ１３０）。
あるいは、任意選択の希釈ステップ１２０を省略してもよく、第１の出口流は、ステップ
１００において適切に希釈された核酸流（複数可）の使用により、流動している合流した
流れから直接得てもよい。ステップ１３０で得られる第１の出口溶液は、被封入核酸ナノ
粒子を含有する。
第１の出口溶液にさらなる加工処理を実施して、有機溶媒を除去し、それにより、長期
安定性を有する配合物として被封入核酸ナノ粒子を提供し得る。最初に、第１の出口溶液
を、室温である期間（例えば、６０分）インキュベートして（ステップ１４０）、続いて
、水性媒質（例えば、水、クエン酸緩衝液）で希釈して（ステップ１５０）、濃縮および
透析して（ステップ１６０）、最終的に滅菌ろ過する（ステップ１７０）。希釈ステップ
１５０は、有機溶媒濃度を２倍に希釈し得る。濃縮は、タンジェンシャルフローフィルト
レーションによるものであり得る。
安定性を有する配合物として被封入核酸ナノ粒子を提供し得る。最初に、第１の出口溶液
を、室温である期間（例えば、６０分）インキュベートして（ステップ１４０）、続いて
、水性媒質（例えば、水、クエン酸緩衝液）で希釈して（ステップ１５０）、濃縮および
透析して（ステップ１６０）、最終的に滅菌ろ過する（ステップ１７０）。希釈ステップ
１５０は、有機溶媒濃度を２倍に希釈し得る。濃縮は、タンジェンシャルフローフィルト
レーションによるものであり得る。
驚くべきことに、小さくて、かつ一様な粒子が、１つまたは複数の脂質流を１つまたは
複数の核酸流と合流／交差させることにより得られることが見出され、ここで、複合脂質
流および複合核酸流はそれぞれ、１．５メートル／秒よりも大きい線速度を維持し、流れ
を合流／混合する際の有機溶媒の最終濃度は、３３容量％未満である。３３％未満の有機
溶媒を保持することにより、ナノ粒子の凝集が阻害される一方で、本発明の高い流速が、
粒径を小さく、かつ一様に保つ。上記プロセスは、核酸の効率的な封入を提供する。
複数の核酸流と合流／交差させることにより得られることが見出され、ここで、複合脂質
流および複合核酸流はそれぞれ、１．５メートル／秒よりも大きい線速度を維持し、流れ
を合流／混合する際の有機溶媒の最終濃度は、３３容量％未満である。３３％未満の有機
溶媒を保持することにより、ナノ粒子の凝集が阻害される一方で、本発明の高い流速が、
粒径を小さく、かつ一様に保つ。上記プロセスは、核酸の効率的な封入を提供する。
幾つかの実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１．５〜約１４メ
ートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約７メートル／
秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３〜約１４メ
ートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メート
ル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約８〜約１
４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メ
ートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３〜
約８メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５
メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約９
〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メー
トル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１１〜
約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メート
ル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約９〜約１
１メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／
秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約６〜約８メー
トル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／秒であ
る。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１０．２メー
トル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である
。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約６．８メートル／秒で
あり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。さらに他
の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１３．６メートル／秒であ
り、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。さらに他の
実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３．４メートル／秒であり、
１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．７メートル／秒である。他の実施形態で
は、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３メートル／秒であり、１つまたは複数
の脂質流の複合線速度は、約１．５メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは
複数の核酸流の複合線速度は、約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複
合線速度は、約７メートル／秒である。
ートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約７メートル／
秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３〜約１４メ
ートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メート
ル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約８〜約１
４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５メ
ートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３〜
約８メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．５〜約４．５
メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約９
〜約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メー
トル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１１〜
約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メート
ル／秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約９〜約１
１メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／
秒である。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約６〜約８メー
トル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３〜約４メートル／秒であ
る。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１０．２メー
トル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である
。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約６．８メートル／秒で
あり、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。さらに他
の実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約１３．６メートル／秒であ
り、１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約３．４メートル／秒である。さらに他の
実施形態では、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３．４メートル／秒であり、
１つまたは複数の脂質流の複合線速度は、約１．７メートル／秒である。他の実施形態で
は、１つまたは複数の核酸流の複合線速度は、約３メートル／秒であり、１つまたは複数
の脂質流の複合線速度は、約１．５メートル／秒である。他の実施形態では、１つまたは
複数の核酸流の複合線速度は、約１４メートル／秒であり、１つまたは複数の脂質流の複
合線速度は、約７メートル／秒である。
２．０ 核酸
本発明で使用するのに適した核酸として、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キ
メラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそれら
の類似体、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、および小核酸分子、ＲＮＡｉ剤
、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピン
ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（
ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮ
Ａ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉
ＲＮＡ）、および細胞培養物、対象または生物中などの関連細胞および／または組織に対
してセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ、２つまたはそれ以上のミスマッチを有する
ｓｉＲＮＡが挙げられる。かかる化合物は、精製されてもよく、または部分的に精製され
てもよく、また天然に存在してもよく、または合成であってもよく、また化学的に修飾さ
れてもよい。一実施形態では、生物学的活性剤は、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ
）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉ
ＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。一実施形態では、生物
学的核酸剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するのに有用なＲＮＡｉ剤である。
本発明で使用するのに適した核酸として、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キ
メラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそれら
の類似体、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、および小核酸分子、ＲＮＡｉ剤
、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピン
ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（
ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮ
Ａ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉
ＲＮＡ）、および細胞培養物、対象または生物中などの関連細胞および／または組織に対
してセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ、２つまたはそれ以上のミスマッチを有する
ｓｉＲＮＡが挙げられる。かかる化合物は、精製されてもよく、または部分的に精製され
てもよく、また天然に存在してもよく、または合成であってもよく、また化学的に修飾さ
れてもよい。一実施形態では、生物学的活性剤は、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ
）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉ
ＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。一実施形態では、生物
学的核酸剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するのに有用なＲＮＡｉ剤である。
「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ホスホジエステル結合により連結されるヌクレオチドのポ
リマーであり、ここで、ヌクレオチドはそれぞれ、糖構成成分としてリボースまたはその
修飾を含有する。ヌクレオチドはそれぞれ、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）
、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）またはその修飾を含有する。ｍＲＮＡ分子における遺
伝情報は、３つのヌクレオチド塩基それぞれで構成されるコドンへ配置されるｍＲＮＡ分
子のヌクレオチド塩基の配列でコードされる。コドンはそれぞれ、翻訳（タンパク質合成
）を終結させる停止コドンを除いて、ポリヌクレオチドの特異的なアミノ酸をコードする
。生細胞内で、ｍＲＮＡは、タンパク質合成の部位であるリボソームへ輸送されて、そこ
で、ｍＲＮＡは、タンパク質合成（翻訳）に関する遺伝情報を提供する。より完全な説明
に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition
, Garland Scienceを参照されたい。
リマーであり、ここで、ヌクレオチドはそれぞれ、糖構成成分としてリボースまたはその
修飾を含有する。ヌクレオチドはそれぞれ、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）
、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）またはその修飾を含有する。ｍＲＮＡ分子における遺
伝情報は、３つのヌクレオチド塩基それぞれで構成されるコドンへ配置されるｍＲＮＡ分
子のヌクレオチド塩基の配列でコードされる。コドンはそれぞれ、翻訳（タンパク質合成
）を終結させる停止コドンを除いて、ポリヌクレオチドの特異的なアミノ酸をコードする
。生細胞内で、ｍＲＮＡは、タンパク質合成の部位であるリボソームへ輸送されて、そこ
で、ｍＲＮＡは、タンパク質合成（翻訳）に関する遺伝情報を提供する。より完全な説明
に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition
, Garland Scienceを参照されたい。
真核生物では、ｍＲＮＡは、細胞酵素ＲＮＡポリメラーゼにより染色体でｉｎ ｖｉｖ
ｏで翻訳される。ｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳中または後に、５’キャップ（ＲＮＡキャップ
、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される
）が、ｍＲＮＡの５’末端へｉｎ ｖｉｖｏで付加される。５’キャップは、５’−５’
−三リン酸結合によって第１の転写ヌクレオチドへ連結される末端７−メチルグアノシン
残基である。さらに、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の３’末端にポ
リアデニリル部分（「ポリ（Ａ）テール」）を有する。ｉｎ ｖｉｖｏで、真核細胞は、
多くの場合約２５０アデノシン残基長で、転写後にポリ（Ａ）テールを付加する。したが
って、典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡキャップを伴う５’末端に始まる構造
を、続いてヌクレオチドの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、次にヌクレオチド塩基のＡＵ
Ｇトリプレットである開始コドンに始まり、タンパク質に関するコード配列であり、ヌク
レオチド塩基のＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡトリプレットであり得る停止コドンに終わる
オープンリーディングフレーム、続いてヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を
有し、ポリアデノシンテールで終わる。典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡの特色は、ｉｎ
ｖｉｖｏで真核細胞において自然に作られているのに対して、同じであるか、または構造
的かつ機能的に等価な特色は、分子生物学の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作るこ
とができる。したがって、典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡに類似した構造を有する任意の
ＲＮＡは、ｍＲＮＡとして機能することができ、「メッセンジャーリボ核酸」という用語
の範囲内である。
ｏで翻訳される。ｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳中または後に、５’キャップ（ＲＮＡキャップ
、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される
）が、ｍＲＮＡの５’末端へｉｎ ｖｉｖｏで付加される。５’キャップは、５’−５’
−三リン酸結合によって第１の転写ヌクレオチドへ連結される末端７−メチルグアノシン
残基である。さらに、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の３’末端にポ
リアデニリル部分（「ポリ（Ａ）テール」）を有する。ｉｎ ｖｉｖｏで、真核細胞は、
多くの場合約２５０アデノシン残基長で、転写後にポリ（Ａ）テールを付加する。したが
って、典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡキャップを伴う５’末端に始まる構造
を、続いてヌクレオチドの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、次にヌクレオチド塩基のＡＵ
Ｇトリプレットである開始コドンに始まり、タンパク質に関するコード配列であり、ヌク
レオチド塩基のＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡトリプレットであり得る停止コドンに終わる
オープンリーディングフレーム、続いてヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を
有し、ポリアデノシンテールで終わる。典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡの特色は、ｉｎ
ｖｉｖｏで真核細胞において自然に作られているのに対して、同じであるか、または構造
的かつ機能的に等価な特色は、分子生物学の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作るこ
とができる。したがって、典型的な成熟真核生物ｍＲＮＡに類似した構造を有する任意の
ＲＮＡは、ｍＲＮＡとして機能することができ、「メッセンジャーリボ核酸」という用語
の範囲内である。
ｍＲＮＡ分子は一般的に、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイ
ズを有する。ｍＲＮＡ分子のサイズは、特定タンパク質をコードするｍＲＮＡ種の独自性
に応じて、事実上多様である一方で、ｍＲＮＡ分子に関する平均サイズは、５００〜１０
，０００塩基である。
ズを有する。ｍＲＮＡ分子のサイズは、特定タンパク質をコードするｍＲＮＡ種の独自性
に応じて、事実上多様である一方で、ｍＲＮＡ分子に関する平均サイズは、５００〜１０
，０００塩基である。
「デオキシリボ酢酸」（ＤＮＡ）という用語は、本明細書中で使用する場合、生体およ
び多くのウイルスの細胞において遺伝情報を有するポリマー核酸を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ
で、ＤＮＡは、ＲＮＡの自己複製および合成が可能である。ＤＮＡは、二重らせんへとね
じれ、かつ相補的塩基アデノシン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニ
ン（Ｇ）との間で水素結合により結合されたヌクレオチドの２つの長鎖で構成される。ヌ
クレオチドの配列が、個々の遺伝的特徴を決定する。The American Heritage（登録商標
） Dictionary of the English Language, Fourth Edition（２００９年に改訂）. Hough
ton Mifflin Company.を参照されたい。
び多くのウイルスの細胞において遺伝情報を有するポリマー核酸を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ
で、ＤＮＡは、ＲＮＡの自己複製および合成が可能である。ＤＮＡは、二重らせんへとね
じれ、かつ相補的塩基アデノシン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニ
ン（Ｇ）との間で水素結合により結合されたヌクレオチドの２つの長鎖で構成される。ヌ
クレオチドの配列が、個々の遺伝的特徴を決定する。The American Heritage（登録商標
） Dictionary of the English Language, Fourth Edition（２００９年に改訂）. Hough
ton Mifflin Company.を参照されたい。
ＤＮＡポリマーのヌクレオチドそれぞれが、５’から３’方向でホスホジエステルによ
り連結される。ヌクレオチドはそれぞれ、糖構成成分としてデオキシリボースまたはその
修飾を含有する。ヌクレオチドはそれぞれ、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）
、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはその修飾を含有する。
り連結される。ヌクレオチドはそれぞれ、糖構成成分としてデオキシリボースまたはその
修飾を含有する。ヌクレオチドはそれぞれ、塩基としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）
、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはその修飾を含有する。
ｉｎ ｖｉｖｏで存在するほとんどのＤＮＡ分子は、逆平行形成で２つの長鎖ポリマー
で構成される二重鎖らせんであり、一方の骨格は、３’（三ダッシュ）であり、他方が、
５’（五ダッシュ）である。この二重鎖形成では、塩基は、水素結合により対形成され、
アデニンは、チミンへ結合し、グアニンは、シトシンへ結合し、それが、二重らせん構造
をもたらす。他のＤＮＡ分子は単鎖であるが、単鎖ＤＮＡ分子は、それらが相補的ヌクレ
オチド配列を伴う別の単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子と適合する場合には二重鎖結合になる
潜在力を有する。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biol
ogy of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
で構成される二重鎖らせんであり、一方の骨格は、３’（三ダッシュ）であり、他方が、
５’（五ダッシュ）である。この二重鎖形成では、塩基は、水素結合により対形成され、
アデニンは、チミンへ結合し、グアニンは、シトシンへ結合し、それが、二重らせん構造
をもたらす。他のＤＮＡ分子は単鎖であるが、単鎖ＤＮＡ分子は、それらが相補的ヌクレ
オチド配列を伴う別の単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子と適合する場合には二重鎖結合になる
潜在力を有する。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biol
ogy of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
デオキシリボース骨格に沿ったヌクレオチド塩基の配列が、遺伝情報をコードする。タ
ンパク質の合成に関して、遺伝情報は、ｍＲＮＡ分子が創出される場合、転写と呼ばれる
プロセスでｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列へコピーされる。
ンパク質の合成に関して、遺伝情報は、ｍＲＮＡ分子が創出される場合、転写と呼ばれる
プロセスでｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列へコピーされる。
ＤＮＡは、異なるサイズを有する少なくとも２つの形態で存在することができる。ＤＮ
Ａの第１の形態は、染色体と呼ばれる非常に大きなサイズのポリマーである。染色は、細
胞中にタンパク質の多くまたはほとんどに関する遺伝情報を含有し、また細胞がＤＮＡ分
子の複製を制御することができる情報も含有する。細菌細胞は、１つまたは複数の染色体
を含有し得る。真核細胞は通常、それぞれが染色体である１つよりも多い細胞染色体を含
有する。
Ａの第１の形態は、染色体と呼ばれる非常に大きなサイズのポリマーである。染色は、細
胞中にタンパク質の多くまたはほとんどに関する遺伝情報を含有し、また細胞がＤＮＡ分
子の複製を制御することができる情報も含有する。細菌細胞は、１つまたは複数の染色体
を含有し得る。真核細胞は通常、それぞれが染色体である１つよりも多い細胞染色体を含
有する。
ＤＮＡの第２の形態は、より短いサイズの形態である。第２の形態の多くのＤＮＡ分子
は、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有する。ＤＮＡのこ
れらのより短い形態の幾つかは、タンパク質を有用にコードするようなサイズを有し得る
。ＤＮＡのこれらの第２のより短い有用な形態の例として、プラスミドおよび他のベクタ
ーが挙げられる。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biol
ogy of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
は、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有する。ＤＮＡのこ
れらのより短い形態の幾つかは、タンパク質を有用にコードするようなサイズを有し得る
。ＤＮＡのこれらの第２のより短い有用な形態の例として、プラスミドおよび他のベクタ
ーが挙げられる。より完全な説明に関しては、Alberts B et al. (2007) Molecular Biol
ogy of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。
プラスミドは、細胞内で染色体ＤＮＡと物理的に離れており、染色体ＤＮＡとは無関係
に複製することができる。プラスミドは一般的に、小さな環状の二重鎖ＤＮＡ分子として
ｉｎ ｖｉｖｏで存在する。事実上、プラスミドは、生物の生存に有益であり得るタンパ
ク質（例えば、抗生物質耐性）へ転写および翻訳することができる遺伝子を有する。事実
上、プラスミドは頻繁に、水平遺伝子伝播によりある生物から別の生物へ伝達され得る。
人工または組換えプラスミドは、分子生物学で広く使用されており、組換えＤＮＡ配列の
複製、および宿主生物内の有用なタンパク質の発現を可能にするのに役立つ。プラスミド
サイズは、１〜２５キロ塩基対を上回って様々であり得る。組換えプラスミドは、それを
本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有するように、組換え的に作製
することができる。
に複製することができる。プラスミドは一般的に、小さな環状の二重鎖ＤＮＡ分子として
ｉｎ ｖｉｖｏで存在する。事実上、プラスミドは、生物の生存に有益であり得るタンパ
ク質（例えば、抗生物質耐性）へ転写および翻訳することができる遺伝子を有する。事実
上、プラスミドは頻繁に、水平遺伝子伝播によりある生物から別の生物へ伝達され得る。
人工または組換えプラスミドは、分子生物学で広く使用されており、組換えＤＮＡ配列の
複製、および宿主生物内の有用なタンパク質の発現を可能にするのに役立つ。プラスミド
サイズは、１〜２５キロ塩基対を上回って様々であり得る。組換えプラスミドは、それを
本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有するように、組換え的に作製
することができる。
分子生物学では、ベクターは、遺伝物質を、ある細胞から、または生化学反応から、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで別の細胞へ人工的に運搬するための媒体として使用されるＤＮＡ分子で
あり、そこで、ＤＮＡは、複製および／または発現させることができる。外来ＤＮＡを含
有するベクターは、組換え体と称される。プラスミドおよびウイルスベクターは、中でも
有用なベクターのタイプである。標的細胞へのベクターの挿入は通常、細菌細胞に関して
は形質転換、真核細胞に関してはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクター
の挿入は多くの場合、形質導入と呼ばれる。
ｎ ｖｉｔｒｏで別の細胞へ人工的に運搬するための媒体として使用されるＤＮＡ分子で
あり、そこで、ＤＮＡは、複製および／または発現させることができる。外来ＤＮＡを含
有するベクターは、組換え体と称される。プラスミドおよびウイルスベクターは、中でも
有用なベクターのタイプである。標的細胞へのベクターの挿入は通常、細菌細胞に関して
は形質転換、真核細胞に関してはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクター
の挿入は多くの場合、形質導入と呼ばれる。
ウイルスベクターは概して、非感染性にしたが、ウイルスプロモーター、また導入遺伝
子を依然として含有し、したがってウイルスプロモーターによって導入遺伝子の翻訳を可
能にする修飾ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを有する組換えウイルスである。ウイルスベク
ターは多くの場合、挿入物の宿主ゲノムへの永続的な組込みのために設計され、したがっ
て導入遺伝子が組み込まれた後に、宿主ゲノムにおいて明確な遺伝子マーカーが残る。ウ
イルスベクターは、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有す
るように、組換え的に作製することができる。
子を依然として含有し、したがってウイルスプロモーターによって導入遺伝子の翻訳を可
能にする修飾ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを有する組換えウイルスである。ウイルスベク
ターは多くの場合、挿入物の宿主ゲノムへの永続的な組込みのために設計され、したがっ
て導入遺伝子が組み込まれた後に、宿主ゲノムにおいて明確な遺伝子マーカーが残る。ウ
イルスベクターは、それを本発明の脂質ナノ粒子中に封入することができるサイズを有す
るように、組換え的に作製することができる。
「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能な組成物または分子である。「Ｒ
ＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）という用語は、ＲＮＡｉ剤を使用して、ＲＮＡｉ剤と同じである
か、またはＲＮＡｉ剤に非常に類似している配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を分解する翻訳後標的遺伝子サイレシング技法である。Zamore and Haley 2005 Sc
ience 309: 1519-1524、Zamore et al. 2000 Cell 101: 25-33、Elbashir et al. 2001 N
ature 411: 494-498、およびKreutzer et al., ＰＣＴ国際公開第００／４４８９５号パ
ンフレット、Fire, ＰＣＴ国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、Mello and Fire
, ＰＣＴ国際公開第０１／２９０５８パンフレット等を参照されたい。
ＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）という用語は、ＲＮＡｉ剤を使用して、ＲＮＡｉ剤と同じである
か、またはＲＮＡｉ剤に非常に類似している配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を分解する翻訳後標的遺伝子サイレシング技法である。Zamore and Haley 2005 Sc
ience 309: 1519-1524、Zamore et al. 2000 Cell 101: 25-33、Elbashir et al. 2001 N
ature 411: 494-498、およびKreutzer et al., ＰＣＴ国際公開第００／４４８９５号パ
ンフレット、Fire, ＰＣＴ国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、Mello and Fire
, ＰＣＴ国際公開第０１／２９０５８パンフレット等を参照されたい。
本明細書中で使用する場合、ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転
写阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的なＲＮＡ干渉について記載するのに
使用される他の用語と等価である。例えば、本発明の脂質を含有する配合物は、ｓｉＮＡ
分子と併用して、転写後レベルおよび／または転写前レベルの両方で、エピジェネティッ
クに遺伝子を発現停止させることができる。非限定的な例では、ｓｉＮＡ分子による遺伝
子発現の調節は、当該技術分野で公知であるように、ＲＩＳＣ、あるいは翻訳阻害を介し
たＲＮＡ（コードまたは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断に起因し得る
。別の実施形態では、ｓｉＮＡによる遺伝子発現の調節は、例えばJanowski et al. 2005
Nature Chemical Biology 1: 216-222で報告されるような転写阻害に起因し得る。
写阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的なＲＮＡ干渉について記載するのに
使用される他の用語と等価である。例えば、本発明の脂質を含有する配合物は、ｓｉＮＡ
分子と併用して、転写後レベルおよび／または転写前レベルの両方で、エピジェネティッ
クに遺伝子を発現停止させることができる。非限定的な例では、ｓｉＮＡ分子による遺伝
子発現の調節は、当該技術分野で公知であるように、ＲＩＳＣ、あるいは翻訳阻害を介し
たＲＮＡ（コードまたは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断に起因し得る
。別の実施形態では、ｓｉＮＡによる遺伝子発現の調節は、例えばJanowski et al. 2005
Nature Chemical Biology 1: 216-222で報告されるような転写阻害に起因し得る。
ＲＮＡｉ剤として、とりわけ、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ
）、ｓｈＲＮＡ、短鎖干渉オリゴヌクレオチドおよび化学的に修飾された短鎖干渉核酸分
子が挙げられる。「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）または「短鎖干渉核酸」（ｓｉＮＡ
）等の用語は、本明細書中で使用する場合、配列特異的な様式で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ
）または遺伝子サイレンシングを媒介することにより、遺伝子発現もしくはウイルス複製
を阻害または下方制御することが可能な任意の分子を指す。ｓｉＲＮＡは、発現停止され
る遺伝子標的に相同的または特異的である、より長い二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から、
リボヌクレアーゼＩＩＩ切断により生成され得る。それらはまた、当該技術分野で公知の
各種方法により人工的に作製することができる。
）、ｓｈＲＮＡ、短鎖干渉オリゴヌクレオチドおよび化学的に修飾された短鎖干渉核酸分
子が挙げられる。「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）または「短鎖干渉核酸」（ｓｉＮＡ
）等の用語は、本明細書中で使用する場合、配列特異的な様式で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ
）または遺伝子サイレンシングを媒介することにより、遺伝子発現もしくはウイルス複製
を阻害または下方制御することが可能な任意の分子を指す。ｓｉＲＮＡは、発現停止され
る遺伝子標的に相同的または特異的である、より長い二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から、
リボヌクレアーゼＩＩＩ切断により生成され得る。それらはまた、当該技術分野で公知の
各種方法により人工的に作製することができる。
本開示のＲＮＡｉ剤は、任意の標的遺伝子を標的とすることができ、任意の配列を含み
、幾つかの形式、構成成分、置換および／修飾のいずれかを有することができる。
、幾つかの形式、構成成分、置換および／修飾のいずれかを有することができる。
ＲＮＡｉ剤は概して、２つの鎖であるアンチセンス（またはガイド）鎖およびセンス（
またはパッセンジャー）鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ干渉サイレンシ
ング複合体）へ取り込まれて、標的ｍＲＮＡの対応する配列を標的とする。アンチセンス
鎖の配列（またはその一部）は、標的ｍＲＮＡの配列（またはその一部）と適合する。数
個のミスマッチ（一般的には１５ｎｔ配列につき、１〜３つ程度）は、標的特異的なＲＮ
Ａｉ活性を防止することなく存在し得る。アンチセンスおよびセンス鎖は、別々の分子で
あってもよく、またはリンカーもしくはループにより結合されていて（例えば、ｓｈＲＮ
Ａを形成する）もよい。アンチセンス鎖は概して、４９量体またはそれよりも短く、多く
の場合、１９量体〜２５量体である。センス鎖は、アンチセンス鎖と同じ長さであっても
よく、またはそれよりも短くてもよく、もしくは長くてもよい。本明細書中に示されるよ
うに、アンチセンス鎖は、１８量体程度と短くてもよく、センス鎖は、１４量体程度と短
くてもよい。
またはパッセンジャー）鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ干渉サイレンシ
ング複合体）へ取り込まれて、標的ｍＲＮＡの対応する配列を標的とする。アンチセンス
鎖の配列（またはその一部）は、標的ｍＲＮＡの配列（またはその一部）と適合する。数
個のミスマッチ（一般的には１５ｎｔ配列につき、１〜３つ程度）は、標的特異的なＲＮ
Ａｉ活性を防止することなく存在し得る。アンチセンスおよびセンス鎖は、別々の分子で
あってもよく、またはリンカーもしくはループにより結合されていて（例えば、ｓｈＲＮ
Ａを形成する）もよい。アンチセンス鎖は概して、４９量体またはそれよりも短く、多く
の場合、１９量体〜２５量体である。センス鎖は、アンチセンス鎖と同じ長さであっても
よく、またはそれよりも短くてもよく、もしくは長くてもよい。本明細書中に示されるよ
うに、アンチセンス鎖は、１８量体程度と短くてもよく、センス鎖は、１４量体程度と短
くてもよい。
古典的なｓｉＲＮＡは、１９ｂｐ（塩基対）二重鎖領域および２つの２ｎｔ（ヌクレオ
チド）オーバーハングを有する、それぞれが２１量体であるＲＮＡの２つの鎖である。El
bashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-68
88。オーバーハングは、ｄＴｄＴ、ＴＴ、ＵＵ、Ｕ（２’−ＯＭｅ）ｄＴ、Ｕ（２’−Ｏ
Ｍｅ）Ｕ（２’−ＯＭｅ）、Ｔ（２’−ＯＭｅ）Ｔ（２’−ＯＭｅ）、Ｔ（２’−ＯＭｅ
）ｄＴ等などのジヌクレオチドにより置き換えることができる。オーバーハングは、ヌク
レアーゼによる切断から、ＲＮＡｉ剤を防御するよう作用する一方で、ＲＮＡｉ活性に干
渉せず、また標的認識に寄与もしない。Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、El
bashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-6888、およびKraynack et al. 2006 RNA 12:163-
176。さらなる３’−末端ヌクレオチドオーバーハングとして、ｄＴ（デオキシチミジン
）、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレンチミジン（ｅＴ）、および２−ヒドロキシエチルリン
酸（ｈｐ）が挙げられる。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換もまた行うこ
とができる。Parrish et al. 2000 Molecular Cell 6: 1077-1087。ヌクレオチドオーバ
ーハングは、非ヌクレオチド３’末端キャップが、末端を切断から防御することが可能で
あり、分子のＲＮＡｉ活性が許容される場合には、かかるキャップにより置き換えること
ができる。例えば、米国特許第８，０９７，７１６号明細書、同第８，０８４，６００号
明細書、同第８，４０４，８３１号明細書、同第８，４０４，８３２号明細書、および同
第８，３４４，１２８号明細書、および米国特許出願公開第６１／８８６，７３９号明細
書（これは、全体が参照により援用される）を参照されたい。
チド）オーバーハングを有する、それぞれが２１量体であるＲＮＡの２つの鎖である。El
bashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-68
88。オーバーハングは、ｄＴｄＴ、ＴＴ、ＵＵ、Ｕ（２’−ＯＭｅ）ｄＴ、Ｕ（２’−Ｏ
Ｍｅ）Ｕ（２’−ＯＭｅ）、Ｔ（２’−ＯＭｅ）Ｔ（２’−ＯＭｅ）、Ｔ（２’−ＯＭｅ
）ｄＴ等などのジヌクレオチドにより置き換えることができる。オーバーハングは、ヌク
レアーゼによる切断から、ＲＮＡｉ剤を防御するよう作用する一方で、ＲＮＡｉ活性に干
渉せず、また標的認識に寄与もしない。Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498、El
bashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-6888、およびKraynack et al. 2006 RNA 12:163-
176。さらなる３’−末端ヌクレオチドオーバーハングとして、ｄＴ（デオキシチミジン
）、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレンチミジン（ｅＴ）、および２−ヒドロキシエチルリン
酸（ｈｐ）が挙げられる。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシル置換もまた行うこ
とができる。Parrish et al. 2000 Molecular Cell 6: 1077-1087。ヌクレオチドオーバ
ーハングは、非ヌクレオチド３’末端キャップが、末端を切断から防御することが可能で
あり、分子のＲＮＡｉ活性が許容される場合には、かかるキャップにより置き換えること
ができる。例えば、米国特許第８，０９７，７１６号明細書、同第８，０８４，６００号
明細書、同第８，４０４，８３１号明細書、同第８，４０４，８３２号明細書、および同
第８，３４４，１２８号明細書、および米国特許出願公開第６１／８８６，７３９号明細
書（これは、全体が参照により援用される）を参照されたい。
一方の鎖において、１つまたは複数の位置を、スペーサーにより置き換えることができ
る。これらとして、糖、アルキル、シクロアルキル、リビトールまたは他のタイプの脱塩
基ヌクレオチド、２’−デオキシリビトール、ジリビトール、２’−メトキシエトキシリ
ビトール（２’−ＭＯＥを伴うリビトール）、Ｃ３〜６アルキル、または４−メトキシブ
タン−１，３−ジオール（５３００）が挙げられるが、限定されない。幾つかの分子では
、ギャップをセンス鎖に導入することができ、２つのより短いセンス鎖を生じる。これは
、ｓｉｓｉＲＮＡと呼ばれる。ＷｅｎｇｅｌｓおよびＫｊｅｍｓに対する国際公開第２０
０７／１０７１６２号パンフレット。センス鎖とアンチセンス鎖との間の１つまたは複数
のミスマッチおよびバルジもまた導入することができる。Ｋｈｖｏｒｏｖａに対する米国
特許出願公開第２００９／０２０９６２６号明細書。
る。これらとして、糖、アルキル、シクロアルキル、リビトールまたは他のタイプの脱塩
基ヌクレオチド、２’−デオキシリビトール、ジリビトール、２’−メトキシエトキシリ
ビトール（２’−ＭＯＥを伴うリビトール）、Ｃ３〜６アルキル、または４−メトキシブ
タン−１，３−ジオール（５３００）が挙げられるが、限定されない。幾つかの分子では
、ギャップをセンス鎖に導入することができ、２つのより短いセンス鎖を生じる。これは
、ｓｉｓｉＲＮＡと呼ばれる。ＷｅｎｇｅｌｓおよびＫｊｅｍｓに対する国際公開第２０
０７／１０７１６２号パンフレット。センス鎖とアンチセンス鎖との間の１つまたは複数
のミスマッチおよびバルジもまた導入することができる。Ｋｈｖｏｒｏｖａに対する米国
特許出願公開第２００９／０２０９６２６号明細書。
ＲＮＡｉ剤は、古典的なｓｉＲＮＡで見られるように、ＲＮＡから構築され得る。しか
しながら、ＲＮＡヌクレオチドは、様々なＲＮＡｉ剤で置換または修飾され得る。１つま
たは複数の位置で、ＲＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド
核酸（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸
（ＧＮＡ）、アラビノース核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロアラビノース核酸（ＦＡＮＡ
）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、または
アンロックド核酸（ＵＮＡ）により置き換えることができる。特に、シード領域（アンチ
センス鎖のおよそ位置２〜７およびセンス鎖の対応する位置）で、一方または両方の鎖に
おけるヌクレオチドは、ＤＮＡにより置き換えることができる。全体的なシード領域は、
ＤＮＡにより置き換えることができ、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能なＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッドを形成する。Yamato et al. 2011. Cancer Gene Ther. 18: 587-597。
しながら、ＲＮＡヌクレオチドは、様々なＲＮＡｉ剤で置換または修飾され得る。１つま
たは複数の位置で、ＲＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド
核酸（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸
（ＧＮＡ）、アラビノース核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロアラビノース核酸（ＦＡＮＡ
）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、または
アンロックド核酸（ＵＮＡ）により置き換えることができる。特に、シード領域（アンチ
センス鎖のおよそ位置２〜７およびセンス鎖の対応する位置）で、一方または両方の鎖に
おけるヌクレオチドは、ＤＮＡにより置き換えることができる。全体的なシード領域は、
ＤＮＡにより置き換えることができ、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能なＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッドを形成する。Yamato et al. 2011. Cancer Gene Ther. 18: 587-597。
ＲＮＡヌクレオチドは、他の構成成分（上述するような）で置換および／または修飾す
ることができる。修飾および／または置換は、糖、リン酸および／または塩基で行われ得
る。各種態様では、ＲＮＡｉ剤は、糖の２’−修飾、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−
アリル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メ
チル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−ア
ミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡ
ＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチ
ルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチル
アセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含み、他のＲＮＡ修飾は、当該技術分野で公知であ
る。例えば、Usman and Cedergren 1992 TIBS. 17: 34、Usman et al. 1994 Nucleic Aci
ds Symp. Ser. 31: 163、Burgin et al. 1996 Biochemistry 35: 14090を参照されたい。
幾つかの実施形態では、一方または両方の鎖の３’末端上の２つのＲＮＡヌクレオチドは
、２’−ＭＯＥで修飾されて、２’−ＭＯＥクランプを形成する。米国特許第８，０９７
，７１６号明細書、および同第８，０８４，６００号明細書。
ることができる。修飾および／または置換は、糖、リン酸および／または塩基で行われ得
る。各種態様では、ＲＮＡｉ剤は、糖の２’−修飾、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−
アリル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メ
チル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−ア
ミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡ
ＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチ
ルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチル
アセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含み、他のＲＮＡ修飾は、当該技術分野で公知であ
る。例えば、Usman and Cedergren 1992 TIBS. 17: 34、Usman et al. 1994 Nucleic Aci
ds Symp. Ser. 31: 163、Burgin et al. 1996 Biochemistry 35: 14090を参照されたい。
幾つかの実施形態では、一方または両方の鎖の３’末端上の２つのＲＮＡヌクレオチドは
、２’−ＭＯＥで修飾されて、２’−ＭＯＥクランプを形成する。米国特許第８，０９７
，７１６号明細書、および同第８，０８４，６００号明細書。
糖−リン酸骨格の１つまたは複数のリン酸を、例えば、修飾ヌクレオシド間リンカーに
より置き換えることができる。これとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホルアミデート、ボラノホスホノエート、アミドリンカー、および式（Ｉａ）：
より置き換えることができる。これとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホルアミデート、ボラノホスホノエート、アミドリンカー、および式（Ｉａ）：
６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルコキシおよびＣ１〜６アリールオキシから選択され、こ
こで、Ｃ１〜６アルキルおよびＣ６〜１０アリールは、無置換であるか、または任意選択
で独立して、ハロ、ヒドロキシルおよびＮＨ２から独立して選択される１つ〜３つの基で
置換され、Ｒ４は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＣＨ２から選択される）
を有する化合物が挙げられ得るが、限定されない。
塩基もまた、例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシ
ル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（
カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ
ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ
−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグ
アニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メ
チルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチル
グアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラ
シル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル
、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−
５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオ
シトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−
メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸
（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプ
ロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンで修飾または置換さ
れ得る。ある特定の態様では、ＲＮＡｉ剤は、非天然核酸塩基を含むことができ、ここで
非天然核酸塩基は、ジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリル、またはニト
ロイミダゾリルである。多くの他の修飾が、当該技術分野で公知である。例えば、Usman
et al. 1992 TIBS 17:34、Usman et al. 1994 Nucl. Acids Symp. Ser. 31: 163、Burgin
et al. 1996 Biochem. 35: 14090を参照されたい。
ル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（
カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ
ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ
−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグ
アニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メ
チルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチル
グアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラ
シル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル
、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−
５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオ
シトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−
メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸
（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプ
ロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンで修飾または置換さ
れ得る。ある特定の態様では、ＲＮＡｉ剤は、非天然核酸塩基を含むことができ、ここで
非天然核酸塩基は、ジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリル、またはニト
ロイミダゾリルである。多くの他の修飾が、当該技術分野で公知である。例えば、Usman
et al. 1992 TIBS 17:34、Usman et al. 1994 Nucl. Acids Symp. Ser. 31: 163、Burgin
et al. 1996 Biochem. 35: 14090を参照されたい。
例えば、１つまたは複数の位置が、２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−リン酸、２’−
Ｏ−メチルウリジン−５’−リン酸で表すことができる。簡潔に述べると、任意の１つま
たは複数の位置が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含
むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末
端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−
フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレ
オシド、モルホリノヌクレオシド、アンロックドリボヌクレオチド（例えば、非環状ヌク
レオチド単量体、国際公開第２００８／１４７８２４号パンフレットに記載されるような
）、ホスホルアミデートまたは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはそれらの任意の組
合せを含むが限定されない、当該技術分野で公知の任意の修飾または置換で表すことがで
きる。
Ｏ−メチルウリジン−５’−リン酸で表すことができる。簡潔に述べると、任意の１つま
たは複数の位置が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含
むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末
端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−
フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ修飾ヌクレオシド、２’−アルキル修飾ヌクレ
オシド、モルホリノヌクレオシド、アンロックドリボヌクレオチド（例えば、非環状ヌク
レオチド単量体、国際公開第２００８／１４７８２４号パンフレットに記載されるような
）、ホスホルアミデートまたは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはそれらの任意の組
合せを含むが限定されない、当該技術分野で公知の任意の修飾または置換で表すことがで
きる。
これらの様々な方式、構成成分、置換および／または修飾のいずれも、種々の方法で、
混合して、適合させるか、または組み合わせて、任意の標的に対し、かつ任意の配列を含
むＲＮＡｉ剤を形成することができる。例えば、本開示は、２つの鎖を含むＲＮＡｉ剤に
関し、ここで一方または両方の鎖が、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて
３’末端で終結する１８量体であり、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸
または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含む。別の実施形
態では、本開示は、センスおよびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤に関し、ここでアンチ
センス鎖は、５’から３’の順序で、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて
３’末端で終結する１８量体を含み、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸
または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含み、ここでセン
ス鎖は、５’から３’の順序で、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて３’
末端で終結する１４量体（またはそれよりも長い）を含み、５’から３’の順序で、スペ
ーサー、第２のリン酸または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさ
らに含む。
混合して、適合させるか、または組み合わせて、任意の標的に対し、かつ任意の配列を含
むＲＮＡｉ剤を形成することができる。例えば、本開示は、２つの鎖を含むＲＮＡｉ剤に
関し、ここで一方または両方の鎖が、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて
３’末端で終結する１８量体であり、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸
または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含む。別の実施形
態では、本開示は、センスおよびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤に関し、ここでアンチ
センス鎖は、５’から３’の順序で、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて
３’末端で終結する１８量体を含み、５’から３’の順序で、スペーサー、第２のリン酸
または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさらに含み、ここでセン
ス鎖は、５’から３’の順序で、リン酸または修飾ヌクレオシド間リンカーにおいて３’
末端で終結する１４量体（またはそれよりも長い）を含み、５’から３’の順序で、スペ
ーサー、第２のリン酸または修飾ヌクレオシド間リンカー、および３’末端キャップをさ
らに含む。
本開示の各種実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、任意の標的遺伝子を標的とし、任意の配列
を有することができ、本明細書中に記載するか、または当該技術分野で公知であるような
任意の方式、構成成分、置換および／または修飾を有することができる。
を有することができ、本明細書中に記載するか、または当該技術分野で公知であるような
任意の方式、構成成分、置換および／または修飾を有することができる。
「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、細胞または患者においてＲＮＡ干渉機能または活性
を下方調節する（例えば、低減させるか、または阻害する）ことができる任意の分子であ
る。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣなどのタンパク質構成成分、またはｍｉＲＮＡもしくは
ｓｉＲＮＡなどの核酸構成成分を含むＲＮＡｉ経路の任意の構成成分との相互作用、ある
いはそれらの機能を妨げることにより、ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮ
Ａｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を、下方制御するか、低減させ
るか、または阻害することができる。ＲＮＡｉ阻害剤は、細胞または患者において、ＲＮ
Ａｉ経路のＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡまたは任意の他の構成成分と相互
作用するか、あるいはそれらの機能を妨げる、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタ
マー、または小分子であり得る。ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒
介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を阻害することによって、ＲＮＡｉ阻
害剤を使用して、標的遺伝その発現を調節する（例えば、上方制御するか、または下方制
御する）ことができる。一実施形態では、ＲＮＡ阻害剤を使用して、翻訳阻害、転写サイ
レンシング、またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＩＳＣ媒介性切断による
遺伝子発現の内因性下方制御または阻害を妨げる（例えば、低減させるか、または防止す
る）ことにより、遺伝子発現を上方制御する。したがって、遺伝子発現の内因性抑制、サ
イレンシング、または阻害のメカニズムを妨げることによって、本発明のＲＮｉ阻害剤を
使用して、機能の損失に起因する疾患または状態の治療のために遺伝子発現を上方制御す
ることができる。「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、本明細書中の各種実施形態において
「ｓｉＮＡ」という用語と交換可能に使用される。
を下方調節する（例えば、低減させるか、または阻害する）ことができる任意の分子であ
る。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣなどのタンパク質構成成分、またはｍｉＲＮＡもしくは
ｓｉＲＮＡなどの核酸構成成分を含むＲＮＡｉ経路の任意の構成成分との相互作用、ある
いはそれらの機能を妨げることにより、ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮ
Ａｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を、下方制御するか、低減させ
るか、または阻害することができる。ＲＮＡｉ阻害剤は、細胞または患者において、ＲＮ
Ａｉ経路のＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡまたは任意の他の構成成分と相互
作用するか、あるいはそれらの機能を妨げる、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタ
マー、または小分子であり得る。ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒
介性切断、翻訳阻害、または転写サイレンシング）を阻害することによって、ＲＮＡｉ阻
害剤を使用して、標的遺伝その発現を調節する（例えば、上方制御するか、または下方制
御する）ことができる。一実施形態では、ＲＮＡ阻害剤を使用して、翻訳阻害、転写サイ
レンシング、またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＩＳＣ媒介性切断による
遺伝子発現の内因性下方制御または阻害を妨げる（例えば、低減させるか、または防止す
る）ことにより、遺伝子発現を上方制御する。したがって、遺伝子発現の内因性抑制、サ
イレンシング、または阻害のメカニズムを妨げることによって、本発明のＲＮｉ阻害剤を
使用して、機能の損失に起因する疾患または状態の治療のために遺伝子発現を上方制御す
ることができる。「ＲＮＡｉ阻害剤」という用語は、本明細書中の各種実施形態において
「ｓｉＮＡ」という用語と交換可能に使用される。
「酵素核酸」という用語は、本明細書中で使用する場合、基質結合領域において、指定
した遺伝子標的に対して相補性を有し、また標的ＲＮＡを特異的に切断するように作用す
る酵素活性も有し、それにより標的ＲＮＡ分子を失活させる核酸分子を指す。相補領域は
、酵素核酸分子の、標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、したがっ
て切断を可能にする。１００％の相補性が好ましいが、５０〜７５％程度の低い相補性も
また、本発明で有用であり得る（例えば、Werner and Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids
Research, 23, 2092-2096、Hammann et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug D
ev., 9, 25-31を参照）。核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基で修飾され得る。
酵素核酸という用語は、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタマー
またはアプタマー結合リボザイム、調節可能リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌク
レオザイム（nucleozyme）、ＤＮＡザイム（DNAzyme）、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレ
アーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム（minizyme）、リードザイム（leadzyme）、オ
リゴザイム（oligozyme）またはＤＮＡ酵素などの語句と交換可能に使用される。これら
の専門用語は全て、酵素活性を有する核酸分子について記載している。酵素核酸分子の重
要な特色は、それが、標的核酸領域の１つまたは複数に対して相補的である特異的な基質
結合部位を有すること、およびそれが、分子に核酸切断および／またはライゲーション活
性を付与する当該基質結合部位内のまたは周囲のヌクレオチド配列を有することである（
例えば、Cech et al., 米国特許第４，９８７，０７１号明細書、Cech et al., 1988, 26
0 JAMA 3030を参照）。本発明のリボザイムおよび酵素核酸分子は、例えば当該技術分野
で、および本明細書中の他の箇所で記載されるように、化学的に修飾することができる。
した遺伝子標的に対して相補性を有し、また標的ＲＮＡを特異的に切断するように作用す
る酵素活性も有し、それにより標的ＲＮＡ分子を失活させる核酸分子を指す。相補領域は
、酵素核酸分子の、標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、したがっ
て切断を可能にする。１００％の相補性が好ましいが、５０〜７５％程度の低い相補性も
また、本発明で有用であり得る（例えば、Werner and Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids
Research, 23, 2092-2096、Hammann et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug D
ev., 9, 25-31を参照）。核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基で修飾され得る。
酵素核酸という用語は、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタマー
またはアプタマー結合リボザイム、調節可能リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌク
レオザイム（nucleozyme）、ＤＮＡザイム（DNAzyme）、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレ
アーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム（minizyme）、リードザイム（leadzyme）、オ
リゴザイム（oligozyme）またはＤＮＡ酵素などの語句と交換可能に使用される。これら
の専門用語は全て、酵素活性を有する核酸分子について記載している。酵素核酸分子の重
要な特色は、それが、標的核酸領域の１つまたは複数に対して相補的である特異的な基質
結合部位を有すること、およびそれが、分子に核酸切断および／またはライゲーション活
性を付与する当該基質結合部位内のまたは周囲のヌクレオチド配列を有することである（
例えば、Cech et al., 米国特許第４，９８７，０７１号明細書、Cech et al., 1988, 26
0 JAMA 3030を参照）。本発明のリボザイムおよび酵素核酸分子は、例えば当該技術分野
で、および本明細書中の他の箇所で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「アンチセンス核酸」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＲＮＡ−ＲＮＡまた
はＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸、Egholm et al., 1993 Nature
365, 566）相互作用を用いて、標的ＲＮＡへ結合して、標的ＲＮＡの活性を変更させる
非酵素核酸分子を指す（概説に関しては、Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004、
およびWoolf et al., 米国特許第５，８４９，９０２号明細書を参照）。アンチセンスＤ
ＮＡは、化学的に合成することができるか、または単鎖ＤＮＡ発現ベクターもしくはそれ
らの等価体の使用によって発現させることができる。本発明のアンチセンス分子は、例え
ば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
はＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸、Egholm et al., 1993 Nature
365, 566）相互作用を用いて、標的ＲＮＡへ結合して、標的ＲＮＡの活性を変更させる
非酵素核酸分子を指す（概説に関しては、Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004、
およびWoolf et al., 米国特許第５，８４９，９０２号明細書を参照）。アンチセンスＤ
ＮＡは、化学的に合成することができるか、または単鎖ＤＮＡ発現ベクターもしくはそれ
らの等価体の使用によって発現させることができる。本発明のアンチセンス分子は、例え
ば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「ＲＮアーゼＨ活性化領域」という用語は、本明細書中で使用する場合、標的ＲＮＡへ
結合して、細胞ＲＮアーゼＨ酵素により認識される非共有結合的複合体を形成することが
可能な核酸分子の領域（一般的に、４〜２５ヌクレオチド長、好ましくは５〜１１ヌクレ
オチド長よりも長いか、またはそれらに等しい）を指す（例えば、Arrow et al., 米国特
許第５，８４９，９０２号明細書、Arrow et al., 米国特許第５，９８９，９１２号明細
書を参照）。ＲＮアーゼＨ酵素は、核酸分子−標的ＲＮＡ複合体へ結合して、標的ＲＮＡ
配列を切断する。
結合して、細胞ＲＮアーゼＨ酵素により認識される非共有結合的複合体を形成することが
可能な核酸分子の領域（一般的に、４〜２５ヌクレオチド長、好ましくは５〜１１ヌクレ
オチド長よりも長いか、またはそれらに等しい）を指す（例えば、Arrow et al., 米国特
許第５，８４９，９０２号明細書、Arrow et al., 米国特許第５，９８９，９１２号明細
書を参照）。ＲＮアーゼＨ酵素は、核酸分子−標的ＲＮＡ複合体へ結合して、標的ＲＮＡ
配列を切断する。
「２−５Ａアンチセンスキメラ」という用語は、本明細書中で使用する場合、５’−リ
ン酸化２’−５’−連結アデニル酸残基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指
す。これらのキメラは、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡへ結合して、細胞２−５Ａ依存
性リボヌクレアーゼを活性化して、続いて標的ＲＮＡを切断する（Torrence et al., 199
3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1300、Silverman et al., 2000, Methods Enzymol.,
313, 522-533、Player and Torrence, 1998, Pharmacol. Ther., 78, 55-113）。２−５
Ａアンチセンスキメラ分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾す
ることができる。
ン酸化２’−５’−連結アデニル酸残基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指
す。これらのキメラは、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡへ結合して、細胞２−５Ａ依存
性リボヌクレアーゼを活性化して、続いて標的ＲＮＡを切断する（Torrence et al., 199
3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1300、Silverman et al., 2000, Methods Enzymol.,
313, 522-533、Player and Torrence, 1998, Pharmacol. Ther., 78, 55-113）。２−５
Ａアンチセンスキメラ分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾す
ることができる。
「三重鎖形成オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列特
異的な様式で二重鎖ＤＮＡへ結合して、三重鎖らせんを形成することができるオリゴヌク
レオチドを指す。かかる三重鎖らせん構造の形成は、標的遺伝子の転写を阻害することが
知られている（Duval-Valentin et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504、Fo
x, 2000, Curr. Med. Chem., 7, 17-37、Praseuth et. al., 2000, Biochim. Biophys. A
cta, 1489, 181-206）。本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子は、例えば当該技術
分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
異的な様式で二重鎖ＤＮＡへ結合して、三重鎖らせんを形成することができるオリゴヌク
レオチドを指す。かかる三重鎖らせん構造の形成は、標的遺伝子の転写を阻害することが
知られている（Duval-Valentin et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504、Fo
x, 2000, Curr. Med. Chem., 7, 17-37、Praseuth et. al., 2000, Biochim. Biophys. A
cta, 1489, 181-206）。本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子は、例えば当該技術
分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「デコイＲＮＡ」という用語は、本明細書中で使用する場合、所定のリガンドへ優先的
に結合するように設計されるＲＮＡ分子またはアプタマーを指す。かかる結合は、標的分
子の阻害または活性化をもたらし得る。デコイＲＮＡまたはアプタマーは、特異的なリガ
ンドの結合に関して、天然に存在する結合標的と競合し得る。同様に、デコイＲＮＡは、
受容体へ結合して、エフェクター分子の結合を阻止するよう設計され得るか、または目的
の受容体へ結合して、受容体との相互作用を防止するよう設計され得る。本発明のデコイ
分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
に結合するように設計されるＲＮＡ分子またはアプタマーを指す。かかる結合は、標的分
子の阻害または活性化をもたらし得る。デコイＲＮＡまたはアプタマーは、特異的なリガ
ンドの結合に関して、天然に存在する結合標的と競合し得る。同様に、デコイＲＮＡは、
受容体へ結合して、エフェクター分子の結合を阻止するよう設計され得るか、または目的
の受容体へ結合して、受容体との相互作用を防止するよう設計され得る。本発明のデコイ
分子は、例えば当該技術分野で記載されるように、化学的に修飾することができる。
「単鎖ＤＮＡ」（ｓｓＤＮＡ）という用語は、本明細書中で使用する場合、直鎖状単鎖
を含む天然に存在するか、または合成のデオキシリボ核酸分子を指し、例えば、ｓｓＤＮ
Ａは、センスもしくはアンチセンス遺伝子配列またはＥＳＴ（発現配列タグ）であり得る
。
を含む天然に存在するか、または合成のデオキシリボ核酸分子を指し、例えば、ｓｓＤＮ
Ａは、センスもしくはアンチセンス遺伝子配列またはＥＳＴ（発現配列タグ）であり得る
。
「アロザイム」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば米国特許第５，８３
４，１８６号明細書、同第５，７４１，６７９号明細書、同第５，５８９，３３２号明細
書、同第５，８７１，９１４号明細書、およびＰＣＴ国際公開第００／２４９３１号パン
フレット、同第００／２６２２６号パンフレット、同第９８／２７１０４号パンフレット
、同第９９／２９８４２号パンフレットを含む、アロステリック酵素核酸分子を指す。
４，１８６号明細書、同第５，７４１，６７９号明細書、同第５，５８９，３３２号明細
書、同第５，８７１，９１４号明細書、およびＰＣＴ国際公開第００／２４９３１号パン
フレット、同第００／２６２２６号パンフレット、同第９８／２７１０４号パンフレット
、同第９９／２９８４２号パンフレットを含む、アロステリック酵素核酸分子を指す。
「アプタマー」という用語は、本明細書中で使用する場合、標的分子へ特異的に結合す
るポリヌクレオチド組成物を意味し、ここでポリヌクレオチドは、細胞において標的分子
により一般的に認識される配列と異なる配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分
子が天然では核酸へ結合しない標的分子へ結合する核酸分子であり得る。標的分子は、任
意の目的の分子であり得る。本発明のアプタマー分子は、例えば当該技術分野で記載され
るように、化学的に修飾することができる。
るポリヌクレオチド組成物を意味し、ここでポリヌクレオチドは、細胞において標的分子
により一般的に認識される配列と異なる配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分
子が天然では核酸へ結合しない標的分子へ結合する核酸分子であり得る。標的分子は、任
意の目的の分子であり得る。本発明のアプタマー分子は、例えば当該技術分野で記載され
るように、化学的に修飾することができる。
３．０ 脂質
３．１ 陽イオン性脂質
脂質組成物における使用に適した陽イオン性脂質として、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プ
ロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）クロリド、Ｎ−（１−（２
，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（
ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤ
ＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＣＤＡＰ）
、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、トリ
フルオロ酢酸ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２−スペルミンカルボキシアミド（2-spennine
carboxamido））エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオ
クタデシルアミドグリシルスペルミン（spennine）（ＤＯＧＳ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、１，
２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミ
ド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３ベータ−オキシ
ブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プ
ロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−オキシ）−３’−
オキサペントキシ］−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１２’−オクタデカ
ジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイル
オキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−
ジメチアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）および／またはそれらの混合物が挙げられ
るが、それらに限定されない。
３．１ 陽イオン性脂質
脂質組成物における使用に適した陽イオン性脂質として、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プ
ロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）クロリド、Ｎ−（１−（２
，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（
ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤ
ＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＣＤＡＰ）
、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、トリ
フルオロ酢酸ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２−スペルミンカルボキシアミド（2-spennine
carboxamido））エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオ
クタデシルアミドグリシルスペルミン（spennine）（ＤＯＧＳ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、１，
２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミ
ド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３ベータ−オキシ
ブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プ
ロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−オキシ）−３’−
オキサペントキシ］−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１２’−オクタデカ
ジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイル
オキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−
ジメチアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）および／またはそれらの混合物が挙げられ
るが、それらに限定されない。
他の適した陽イオン性脂質は、米国仮出願公開第６１／９１８，９２７号明細書（これ
は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。適切な脂質は、式
（Ｉ）：
は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。適切な脂質は、式
（Ｉ）：
ヘテロシクリル−Ｃ１〜８−アルキルまたはヘテロシクリル−Ｃ１〜８−アルコキシルで
あり、それらはそれぞれ、Ｃ１〜８−アルキル、Ｃ３〜７−シクロアルキル、Ｃ３〜７−
シクロアルキル−Ｃ１〜８−アルキル、ヘテロシクリル、−［（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン
］ｖ−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”、−Ｏ−［（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン］ｖ−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”または
−Ｎ（Ｈ）−［（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン］ｖ−Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）から独立して選択さ
れる１つ、２つまたは３つの基で任意選択で置換されてもよく、ここで上記（Ｃ１〜Ｃ４
）アルキレンは、１つまたは複数のＲ基で任意選択で置換され、ｖは、０、１、２、３ま
たは４であり、Ｒは、水素または−Ｃ１〜８−アルキルであるか、またはｖが０である場
合、Ｒは存在せず、Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立して、水素、−Ｃ１〜８−アルキルで
あるか、またはＲ’およびＲ”は、それらが結合する窒素と合わせて、Ｎ、ＯおよびＳか
ら選択される別のヘテロ原子を任意選択で含み、−Ｃ１〜８−アルキル、ヒドロキシもし
くはシクロアルキル−Ｃ１〜８−で任意選択で置換される５〜８員環の複素環またはヘテ
ロアリールを形成し、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜２２アルキル、Ｃ１
２〜２２アルケニル、
を有する化合物、またはその塩である。
他の陽イオン性脂質として、式（ＩＩ）：
他の適した陽イオン性脂質として、式（Ｉ）および式（ＩＩ）（式中、Ｒ４は、水素で
あるか、またはＲ４は、
あるか、またはＲ４は、
他の適した陽イオン性脂質として、上述の脂質（式中、Ｒ１は、
他の適した陽イオン性脂質として、上述の脂質（式中、Ｒ２は、
他の適した陽イオン性脂質として、上述の脂質（式中、Ｒ３は、
上述の脂質に従う他の適した脂質として、Ｒ２およびＲ３が同一であるものが挙げられ
る。
る。
特定の陽イオン性脂質として、下記：
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−
カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−
ジエノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（４−メチルピペラジン−１−
イル）プロパノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９
，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ピロリジン−１−イル）ブタ
ノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエ
ノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ピペリジン−１−イル）ブタ
ノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエ
ノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイ
ル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエ
ート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（ジメチルアミノ）アセトキシ）
メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロパノイ
ル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエ
ート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，４−ジメチルピペリジン−４−
カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−
ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１−（シクロプロピルメチル）ピペ
リジン−４−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ
−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−モルホリノプロパノイル）オキ
シ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル
）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエー
ト）；
２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン
−１，３−ジイルビス（８−（オクタノイルオキシ）オクタノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−
２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピ
ルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−
２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピ
ルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−
２−（（（（（１−エチルピペリジン−３−イル）メトキシ）カルボニル）オキシ）メチ
ル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
２−（（（（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロパ
ン−１，３−ジイルビス（２−ヘプチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ
）−２−（（（２−ヘプチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９
，１２−ジエノエート；
２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロ
パン−１，３−ジイルビス（２−ヘプチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（２−ヘプチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−
９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ
）−２−（（（３−オクチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９
，１２−ジエノエート；
２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロ
パン−１，３−ジイルビス（３−オクチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（３−オクチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−
９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（９−ペンチルテトラデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ
−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（５−ヘプチルドデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９
，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセトキシ）−２−（（（
（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ
−９，１２−ジエノエート；および
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（６，６−ビス（オクチルオキシ）ヘキサノイル）オキシ）
−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロ
ピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート
から成る群から選択される化合物が挙げられる。
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−
カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−
ジエノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（４−メチルピペラジン−１−
イル）プロパノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９
，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ピロリジン−１−イル）ブタ
ノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエ
ノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ピペリジン−１−イル）ブタ
ノイル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエ
ノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイ
ル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエ
ート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（ジメチルアミノ）アセトキシ）
メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロパノイ
ル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエ
ート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１，４−ジメチルピペリジン−４−
カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−
ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（１−（シクロプロピルメチル）ピペ
リジン−４−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ
−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（３−モルホリノプロパノイル）オキ
シ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル
）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエー
ト）；
２−（（（１，３−ジメチルピロリジン−３−カルボニル）オキシ）メチル）プロパン
−１，３−ジイルビス（８−（オクタノイルオキシ）オクタノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−
２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピ
ルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−
２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピ
ルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−
２−（（（（（１−エチルピペリジン−３−イル）メトキシ）カルボニル）オキシ）メチ
ル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
２−（（（（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロパ
ン−１，３−ジイルビス（２−ヘプチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ
）−２−（（（２−ヘプチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９
，１２−ジエノエート；
２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロ
パン−１，３−ジイルビス（２−ヘプチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（２−ヘプチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−
９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ
）−２−（（（３−オクチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９
，１２−ジエノエート；
２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロ
パン−１，３−ジイルビス（３−オクチルウンデカノエート）；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（３−オクチルウンデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−
９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（９−ペンチルテトラデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ
−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−２−（（（５−ヘプチルドデカノイル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９
，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセトキシ）−２−（（（
（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ
−９，１２−ジエノエート；および
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（６，６−ビス（オクチルオキシ）ヘキサノイル）オキシ）
−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロ
ピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート
から成る群から選択される化合物が挙げられる。
他の適した陽イオン性脂質は、米国仮出願公開第６１／９１８，９４１号明細書（これ
は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。適切な脂質は、式
（ＩＩＩ）：
は、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。適切な脂質は、式
（ＩＩＩ）：
または８であり、Ｌ１は、−Ｏ−または結合であり、Ｌ２は、−ＯＣ（Ｏ）−または−Ｃ
（Ｏ）Ｏ−であり、Ｒ１は、下記：
、Ｃｙｌは、１つまたは２つのアルキル基で任意選択で置換される５〜７員環窒素含有複
素環であり、ＲおよびＲ’はそれぞれ独立して、水素またはＣ１〜８アルキルであり、Ｒ
２は、ヒドロキシルで任意選択で置換されるＣ６〜２０アルキル、Ｃ１５〜１９アルケニ
ル、Ｃ１〜１２アルキル−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ１〜１２アルキル−Ｃ（
Ｏ）Ｏ−Ｃ５〜２０アルキル、および
を有する化合物、またはその塩である。
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＶ）、またはその塩を有するものが挙げられ
る：
る：
他の適した陽イオン性脂質として、式（Ｖ）を有するものが挙げられる：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）（式中、Ｒ２は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）（式中、Ｒ２は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）を有するものが挙げられ、こ
こで上記化合物は、式（ＶＩ）：
こで上記化合物は、式（ＶＩ）：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）（式中、Ｒ３は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）（式中、Ｒ３は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）（式中、Ｒ３は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）を有するものが挙げられ、
ここで上記化合物は、式（ＶＩＩ）：
ここで上記化合物は、式（ＶＩＩ）：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩＩ）を有するものが挙げられ
、ここで上記化合物は、式（ＶＩＩＩ）：
、ここで上記化合物は、式（ＶＩＩＩ）：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＶＩＩＩ）を有するものが挙げら
れ、ここで上記化合物は、式（ＩＸ）：
れ、ここで上記化合物は、式（ＩＸ）：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＩＸ）（式中、Ｒ１は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＩＸ）（式中、Ｒ１は、下記：
他の適した陽イオン性脂質として、式（ＩＩＩ）〜（ＩＸ）（式中、Ｒ１は、下記：
他の適した陽イオン性脂質は、下記：
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザヘプタデカン−１７−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザペンタデカン−１５−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザヘキサデカン−１６−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−
２−アザヘプタデカン−１７−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザノナデカン−１９−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−
２−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザイコサン−２０−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザノナデカン−１９−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタ
デシル４，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６
，６−ビス（オクチルオキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６
，６−ビス（ヘキシルオキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６
，６−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ビス（ヘキシルオキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ジブトキシオクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタ
デシル８，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル３
−オクチルウンデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル３
−オクチルウンデカ−２−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル７
−ヘキシルトリデカ−６−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル９
−ペンチルテトラデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル９
−ペンチルテトラデカ−８−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル５
−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）トリデシル５−
ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ウンデシル５−
ヘプチルドデカノエート；
１，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロパン−２−イル（３−（（（２−（ジメチル
アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）スクシネート；
１，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロパン−２−イル（３−（（（３−（ジメチル
アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）スクシネート；
１−（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデ
シル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデ
シル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）
ペンタデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデ
シル）１０−（２−エチルヘキシル）デカンジオエート；
１−（３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）
ペンタデシル）１０−（２−エチルヘキシル）デカンジオエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１
０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−２−ア
ザノナデカン−１９−イルデカノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１
０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタ
デシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニ
ル）オキシ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ
）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
１−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）ペンタデカン−
３−イル１，４−ジメチルピペリジン−４−カルボキシレート；
２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデシル４
，４−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ブタノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイ
ル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イルオクタデカ−９，１２−ジエノ
エート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル３−オクチルウンデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル５−ヘプチルドデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル７−ヘキシルトリデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル９−ペンチルテトラデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−
１−イルオキシ）カルボニル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−３−イル３−
（ジメチルアミノ）プロパノエート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキ
シ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イル２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセテート
；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オ
キシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イル２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセテー
ト；
２，２−ビス（ヘプチルオキシ）エチル３−（（３−エチル−１０−（（９Ｚ，１２Ｚ
）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−８，１５−ジオキソ−７，９，１４−
トリオキサ−３−アザヘプタデカン−１７−イル）ジスルファニル）プロパノエート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オ
キシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルヘプタデカン−９−イルスクシネート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−２−（（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロパノイル）オキシ）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）オキシ）エチルオクタデ
カ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−ヒドロ
キシトリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル７−ヘキシルトリデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−ヒドロ
キシトリデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
１−（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−
（オクタノイルオキシ）トリデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−５−オクチルトリデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−５−オクチル
トリデシルデカノエート；
５−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−７−オクチル
ペンタデシルオクタノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−５−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−７−オクチルペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−オクチ
ルノナデシルオクタノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−オクチ
ルノナデシルデカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）ノナデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシルヘキ
サノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシル３−
オクチルウンデカノエート；
９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデシルヘキサノエート；
９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデシル３−オクチルウンデ
カノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１５Ｚ，１５’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（
ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパ
ン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート）；
（Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオレエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（デカノエート）；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（デカノエート）；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボ
ニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジ
オクタノエート；
２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボ
ニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジ
オクタノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス
（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス
（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
４，４−ビス（オクチルオキシ）ブチル４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ
）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノエート；
４，４−ビス（オクチルオキシ）ブチル２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ
）カルボニル）オキシ）ドデカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−１０−ドデシル−３−エチル−１４−（２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−
オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）エチル）−８，１３−ジオキソ−７，９−ジ
オキサ−３，１４−ジアザヘキサデカン−１６−イルオクタデカ−９，１２−ジエノエー
ト；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１
−（オクタノイルオキシ）ウンデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタ
ノエート；および
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１２−
ジオキソ−６，８，１３−トリオキサ−２−アザテトラデカン−１４−イル）プロパン−
１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）
から選択される。
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザヘプタデカン−１７−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザペンタデカン−１５−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザヘキサデカン−１６−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−
２−アザヘプタデカン−１７−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザノナデカン−１９−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−
２−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（１０−ドデシル−３−エチル−８，１４−ジオキソ−７，９，１３−トリオキサ
−３−アザイコサン−２０−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１３−ジオキソ−６，８，１２−トリオキサ−
２−アザノナデカン−１９−イル）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタ
デシル４，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル４
，４−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）ブタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６
，６−ビス（オクチルオキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６
，６−ビス（ヘキシルオキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル６
，６−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ヘキサノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ビス（ヘキシルオキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ジブトキシオクタノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタ
デシル８，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル８
，８−ビス（（２−プロピルペンチル）オキシ）オクタノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル３
−オクチルウンデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル３
−オクチルウンデカ−２−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル７
−ヘキシルトリデカ−６−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル９
−ペンチルテトラデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル９
−ペンチルテトラデカ−８−エノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル５
−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）トリデシル５−
ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ウンデシル５−
ヘプチルドデカノエート；
１，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロパン−２−イル（３−（（（２−（ジメチル
アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）スクシネート；
１，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロパン−２−イル（３−（（（３−（ジメチル
アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル）スクシネート；
１−（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデ
シル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデ
シル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）
ペンタデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
１−（３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデ
シル）１０−（２−エチルヘキシル）デカンジオエート；
１−（３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）
ペンタデシル）１０−（２−エチルヘキシル）デカンジオエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１
０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
８−ドデシル−２−メチル−６，１２−ジオキソ−５，７，１１−トリオキサ−２−ア
ザノナデカン−１９−イルデカノエート；
３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタデシル１
０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ペンタ
デシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニ
ル）オキシ）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ
）ペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
１−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）ペンタデカン−
３−イル１，４−ジメチルピペリジン−４−カルボキシレート；
２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデシル４
，４−ビス（（２−エチルヘキシル）オキシ）ブタノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイ
ル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−イルオクタデカ−９，１２−ジエノ
エート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル３−オクチルウンデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル５−ヘプチルドデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル７−ヘキシルトリデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘンイコ
サ−１２，１５−ジエン−１−イル９−ペンチルテトラデカノエート；
（１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−
１−イルオキシ）カルボニル）オキシ）ヘンイコサ−１２，１５−ジエン−３−イル３−
（ジメチルアミノ）プロパノエート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）オキ
シ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イル２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセテート
；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オ
キシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イル２，２−ビス（ヘプチルオキシ）アセテー
ト；
２，２−ビス（ヘプチルオキシ）エチル３−（（３−エチル−１０−（（９Ｚ，１２Ｚ
）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−８，１５−ジオキソ−７，９，１４−
トリオキサ−３−アザヘプタデカン−１７−イル）ジスルファニル）プロパノエート；
（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オ
キシ）ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルヘプタデカン−９−イルスクシネート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−２−（（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロパノイル）オキシ）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）オキシ）エチルオクタデ
カ−９，１２−ジエノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−ヒドロ
キシトリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル５−ヘプチルドデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル７−ヘキシルトリデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−ヒドロ
キシトリデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル９−ペンチルテトラデカノエート；
１−（３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−
（オクタノイルオキシ）トリデシル）１０−オクチルデカンジオエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オク
タノイルオキシ）トリデシル１０−（オクタノイルオキシ）デカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−５−オクチルトリデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−５−オクチル
トリデシルデカノエート；
５−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−７−オクチル
ペンタデシルオクタノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−５−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）−７−オクチルペンタデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−オクチ
ルノナデシルオクタノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１−オクチ
ルノナデシルデカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキ
シ）ノナデシルオクタデカ−９，１２−ジエノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシルヘキ
サノエート；
９−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ノナデシル３−
オクチルウンデカノエート；
９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデシルヘキサノエート；
９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデシル３−オクチルウンデ
カノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１５Ｚ，１５’Ｚ）−２−（（４−（（（３−（
ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパ
ン−１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２，１５−トリエノエート）；
（Ｚ）−２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオレエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジテトラデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジドデカノエート；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（デカノエート）；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス（デカノエート）；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（４−（（（３−（エチル（メチル）アミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ
）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボ
ニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジ
オクタノエート；
２−（（（１３Ｚ，１６Ｚ）−４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボ
ニル）オキシ）ドコサ−１３，１６−ジエノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジ
オクタノエート；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス
（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジメチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル
ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プ
ロポキシ）カルボニル）オキシ）ドデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルビス
（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；
２−（（２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）テトラ
デカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタノエート；
４，４−ビス（オクチルオキシ）ブチル４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ
）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノエート；
４，４−ビス（オクチルオキシ）ブチル２−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ
）カルボニル）オキシ）ドデカノエート；
（９Ｚ，１２Ｚ）−１０−ドデシル−３−エチル−１４−（２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−
オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ）エチル）−８，１３−ジオキソ−７，９−ジ
オキサ−３，１４−ジアザヘキサデカン−１６−イルオクタデカ−９，１２−ジエノエー
ト；
２−（（４−（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１１
−（オクタノイルオキシ）ウンデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイルジオクタ
ノエート；および
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−２−（９−ドデシル−２−メチル−７，１２−
ジオキソ−６，８，１３−トリオキサ−２−アザテトラデカン−１４−イル）プロパン−
１，３−ジイルビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）
から選択される。
本明細書中で使用する場合、「アルキル」という用語は、指数数の炭素原子を有する完
全に飽和した分岐状または未分岐状炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜８アルキルは、１
〜８個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ４〜２２アルキルは、４〜２２
個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ６〜１０アルキルは、６〜１０個の
炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ１２〜２２アルキルは、１２〜２２個の
炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキルの代表的な例として、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブ
チル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル
、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル
、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル、ｎ−トリデカニル、９
−メチルヘプタデカニル、１−ヘプチルデシル、２−オクチルデシル、６−ヘキシルドデ
シル、４−ヘプチルウンデシル等が挙げられるが、それらに限定されない。
全に飽和した分岐状または未分岐状炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜８アルキルは、１
〜８個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ４〜２２アルキルは、４〜２２
個の炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ６〜１０アルキルは、６〜１０個の
炭素原子を有するアルキル基を指す。例えば、Ｃ１２〜２２アルキルは、１２〜２２個の
炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキルの代表的な例として、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブ
チル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル
、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル
、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル、ｎ−トリデカニル、９
−メチルヘプタデカニル、１−ヘプチルデシル、２−オクチルデシル、６−ヘキシルドデ
シル、４−ヘプチルウンデシル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルキレン」という用語は、本明細書中で上記で規定す
るような二価アルキル基を指す。アルキレンの代表的な例として、メチレン、エチレン、
ｎ−プロピレン、イソ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、イソ−ブチレン
、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ネオペンチレン、ｎ−へキシ
レン、３−メチルへキシレン、２，２−ジメチルペンチレン、２，３−ジメチルペンチレ
ン、ｎ−ヘプチレン、ｎ−オクチレン、ｎ−ノニレン、ｎ−デシレン等が挙げられるが、
それらに限定されない。
るような二価アルキル基を指す。アルキレンの代表的な例として、メチレン、エチレン、
ｎ−プロピレン、イソ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、イソ−ブチレン
、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ネオペンチレン、ｎ−へキシ
レン、３−メチルへキシレン、２，２−ジメチルペンチレン、２，３−ジメチルペンチレ
ン、ｎ−ヘプチレン、ｎ−オクチレン、ｎ−ノニレン、ｎ−デシレン等が挙げられるが、
それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルケニル」という用語は、鎖内に指定数の炭素原子お
よび１つまたは複数の炭素間二重結合を有する不飽和の分岐状または未分岐状炭化水素鎖
を指す。例えば、Ｃ１２〜２２アルケニルは、鎖内に１つまたは複数の炭素間二重結合を
有する１２〜２２個の炭素原子を有するアルケニル基を指す。ある特定の実施形態では、
アルケニル基は、鎖内に１つの炭素間二重結合を有する。他の実施形態では、アルケニル
基は、鎖内に１つよりも多い炭素間二重結合を有する。アルケニル基は、式（Ｉ）または
（ＩＩＩ）で規定するように、１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されてもよい。
アルケニルの代表的な例として、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキ
セニル等が挙げられるが、それらに限定されない。アルケニルの他の例として、Ｚ−オク
タデカ−９−エニル、Ｚ−ウンデカ−７−エニル、Ｚ−ヘプタデカ−８−エニル、（９Ｚ
，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル、（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１
１−ジエニル、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル、
リノレニル、２−オクチルデカ−１−エニル、リノレイルおよびオレリルが挙げられるが
、それらに限定されない。
よび１つまたは複数の炭素間二重結合を有する不飽和の分岐状または未分岐状炭化水素鎖
を指す。例えば、Ｃ１２〜２２アルケニルは、鎖内に１つまたは複数の炭素間二重結合を
有する１２〜２２個の炭素原子を有するアルケニル基を指す。ある特定の実施形態では、
アルケニル基は、鎖内に１つの炭素間二重結合を有する。他の実施形態では、アルケニル
基は、鎖内に１つよりも多い炭素間二重結合を有する。アルケニル基は、式（Ｉ）または
（ＩＩＩ）で規定するように、１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されてもよい。
アルケニルの代表的な例として、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキ
セニル等が挙げられるが、それらに限定されない。アルケニルの他の例として、Ｚ−オク
タデカ−９−エニル、Ｚ−ウンデカ−７−エニル、Ｚ−ヘプタデカ−８−エニル、（９Ｚ
，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル、（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１
１−ジエニル、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル、
リノレニル、２−オクチルデカ−１−エニル、リノレイルおよびオレリルが挙げられるが
、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「アルケニレン」という用語は、本明細書中で上記で規定
するような二価アルケニル基を指す。アルケニレンの代表的な例として、エテニレン、プ
ロペニレン、ブテニレン、ペンテニレン、ヘキセニレン等が挙げられるが、それらに限定
されない。
するような二価アルケニル基を指す。アルケニレンの代表的な例として、エテニレン、プ
ロペニレン、ブテニレン、ペンテニレン、ヘキセニレン等が挙げられるが、それらに限定
されない。
本明細書中で使用する場合、「アルコキシ」という用語は、酸素架橋によって結合した
任意のアルキル部分（即ち、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル基、ここでＣ１〜３アルキルは、本
明細書中で規定する通りである）を指す。かかる基の例として、メトキシ、エトキシおよ
びプロポキシが挙げられるが、それらに限定されない。
任意のアルキル部分（即ち、−Ｏ−Ｃ１−３アルキル基、ここでＣ１〜３アルキルは、本
明細書中で規定する通りである）を指す。かかる基の例として、メトキシ、エトキシおよ
びプロポキシが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有
する飽和した単環式、二環式または三環式炭化水素を指す。例えば、Ｃ３〜７シクロアル
キルは、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル環を指す。シクロアルキル基は、式
（Ｉ）で規定するように、１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されてもよい。シク
ロアルキルの代表的な例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク
ロヘキシル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、アダ
マンチル等が挙げられるが、それらに限定されない。
する飽和した単環式、二環式または三環式炭化水素を指す。例えば、Ｃ３〜７シクロアル
キルは、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル環を指す。シクロアルキル基は、式
（Ｉ）で規定するように、１つまたは複数の置換基で任意選択で置換されてもよい。シク
ロアルキルの代表的な例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク
ロヘキシル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、アダ
マンチル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およ
びヨードを指す。
びヨードを指す。
本明細書中で使用する場合、「複素環式」という用語は、１〜４個のヘテロ原子を含有
する、４〜１２員環の飽和もしくは不飽和の単環式または二環式環を指す。複素環系は、
芳香族ではない。１つよりも多いヘテロ原子を含有する複素環式基は、異なるヘテロ原子
を含有してもよい。複素環式基は、単環式、スピロ、または融合もしくは架橋二環式環系
である。単環式複素環式基の例として、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、１，
４−ジオキサニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、アゼチジニル、ピペラジニル、
ピペリジニル、１，３−ジオキソラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピロリニ
ル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、１，２，３，６−テトラ
ヒドロピリジニル、オキサチオラニル、ジチオラニル、１，３−ジオキサニル、１，３−
ジチアニル、オキサチアニル、チオモルホリニル、１，４，７−トリオキサ−１０−アザ
シクロドデカニル、アザパニル等が挙げられる。スピロ複素環の例として、１，５−ジオ
キサ−９−アザスピロ［５．５］ウデンカニル、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４
．５］デカニル、２−オキサ−７−アザスピロ［３．５］ノナニル等が挙げられるが、そ
れらに限定されない。融合複素環系は、８〜１１個の環原子を有し、複素環がフェニル環
に融合される基を含む。融合複素環の例として、デカヒドロクニリニル（qunilinyl）、
（４ａＳ，８ａＲ）−デカヒドロイソキノリニル、（４ａＳ，８ａＳ）−デカヒドロイソ
キノリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、イソイノリニル、（３ａＲ，７
ａＳ）−ヘキサヒドロ−［１，３］ジオキソロ［４．５−ｃ］ピリジニル、オクタヒドロ
−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジニル、テトラヒドロイソキノリニル等が挙げられる
が、それらに限定されない。
する、４〜１２員環の飽和もしくは不飽和の単環式または二環式環を指す。複素環系は、
芳香族ではない。１つよりも多いヘテロ原子を含有する複素環式基は、異なるヘテロ原子
を含有してもよい。複素環式基は、単環式、スピロ、または融合もしくは架橋二環式環系
である。単環式複素環式基の例として、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、１，
４−ジオキサニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、アゼチジニル、ピペラジニル、
ピペリジニル、１，３−ジオキソラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピロリニ
ル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、１，２，３，６−テトラ
ヒドロピリジニル、オキサチオラニル、ジチオラニル、１，３−ジオキサニル、１，３−
ジチアニル、オキサチアニル、チオモルホリニル、１，４，７−トリオキサ−１０−アザ
シクロドデカニル、アザパニル等が挙げられる。スピロ複素環の例として、１，５−ジオ
キサ−９−アザスピロ［５．５］ウデンカニル、１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４
．５］デカニル、２−オキサ−７−アザスピロ［３．５］ノナニル等が挙げられるが、そ
れらに限定されない。融合複素環系は、８〜１１個の環原子を有し、複素環がフェニル環
に融合される基を含む。融合複素環の例として、デカヒドロクニリニル（qunilinyl）、
（４ａＳ，８ａＲ）−デカヒドロイソキノリニル、（４ａＳ，８ａＳ）−デカヒドロイソ
キノリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、イソイノリニル、（３ａＲ，７
ａＳ）−ヘキサヒドロ−［１，３］ジオキソロ［４．５−ｃ］ピリジニル、オクタヒドロ
−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジニル、テトラヒドロイソキノリニル等が挙げられる
が、それらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロシクリルＣ１〜８アルキル」という用語は、単結
合により、または上記で規定するようなＣ１〜８アルキル基により、分子の残部に結合さ
れた、上記で規定するような複素環を指す。
合により、または上記で規定するようなＣ１〜８アルキル基により、分子の残部に結合さ
れた、上記で規定するような複素環を指す。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素および硫黄
から個々に選択される１、２、３または４つのヘテロ原子を含む５または６員環の芳香族
単環式環基を指す。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して結合され得
る。ヘテロアリールの例として、フリル、ピロリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリ
ル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テト
ラゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジルまたはピリジルが挙げられるが、それ
らに限定されない。
から個々に選択される１、２、３または４つのヘテロ原子を含む５または６員環の芳香族
単環式環基を指す。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して結合され得
る。ヘテロアリールの例として、フリル、ピロリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリ
ル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テト
ラゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジルまたはピリジルが挙げられるが、それ
らに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ヘテロアリールＣ１〜８アルキル」は、単結合により、
または上記で規定するようなＣ１〜８アルキル基により、分子の残部に結合された、上記
で規定するようなヘテロアリール環を指す。
または上記で規定するようなＣ１〜８アルキル基により、分子の残部に結合された、上記
で規定するようなヘテロアリール環を指す。
３．２ 中性脂質
本発明の脂質組成物における使用に適した中性脂質として、例えば、様々な中性、非荷
電または両性イオン性脂質が挙げられる。本発明における使用に適した中性リン脂質の例
として、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミト
イルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰ
Ｃ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、
ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジル
コリン（ＥＰＣ）、ジラウリルオイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイ
ルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチ
ジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（
ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、
１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステア
ロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファ
チジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パル
ミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジル
エタノールアミンおよびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一実施
形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジ
ミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）から成る群から選択される。
本発明の脂質組成物における使用に適した中性脂質として、例えば、様々な中性、非荷
電または両性イオン性脂質が挙げられる。本発明における使用に適した中性リン脂質の例
として、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミト
イルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰ
Ｃ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、
ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジル
コリン（ＥＰＣ）、ジラウリルオイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイ
ルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチ
ジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（
ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、
１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステア
ロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファ
チジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パル
ミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジル
エタノールアミンおよびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一実施
形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジ
ミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）から成る群から選択される。
３．３ 陰イオン性脂質
本発明における使用に適した陰イオン性脂質として、ホスファチジルグリセロール、カ
ルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカ
ノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミ
ン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンコハク酸水素コレステロール（ＣＨ
ＥＭＳ）、およびリジルホスファチジルグリセロールが挙げられるが、それらに限定され
ない。
本発明における使用に適した陰イオン性脂質として、ホスファチジルグリセロール、カ
ルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカ
ノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミ
ン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンコハク酸水素コレステロール（ＣＨ
ＥＭＳ）、およびリジルホスファチジルグリセロールが挙げられるが、それらに限定され
ない。
３．４ ヘルパー脂質
ヘルパー脂質は、トランスフェクション（例えば、生物学的活性剤を含むナノ粒子のト
ランスフェクション）をある程度高める脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクショ
ンを高めるメカニズムは、例えば、粒子安定性を高めること、および／または膜融合性を
高めることを含み得る。ヘルパー脂質として、ステロイドおよびアルキルレゾルシノール
が挙げられる。本発明における使用に適したヘルパー脂質として、コレステロール、５−
ヘプタデシルレゾルシノール、およびコハク酸水素コレステロールが挙げられるが、それ
らに限定されない。
ヘルパー脂質は、トランスフェクション（例えば、生物学的活性剤を含むナノ粒子のト
ランスフェクション）をある程度高める脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクショ
ンを高めるメカニズムは、例えば、粒子安定性を高めること、および／または膜融合性を
高めることを含み得る。ヘルパー脂質として、ステロイドおよびアルキルレゾルシノール
が挙げられる。本発明における使用に適したヘルパー脂質として、コレステロール、５−
ヘプタデシルレゾルシノール、およびコハク酸水素コレステロールが挙げられるが、それ
らに限定されない。
３．４ ステルス脂質
ステルス脂質は、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、血中で）存在することができ
る間、増加する脂質である。本発明の脂質組成物における使用に適したステルス脂質とし
て、脂質部分に連結される親水性ヘッド基を有するステルス脂質が挙げられるが、それら
に限定されない。かかるステルス脂質の例として、国際公開第２０１１／０７６８０７号
パンフレットに記載されるような、式（ＸＩ）
ステルス脂質は、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、血中で）存在することができ
る間、増加する脂質である。本発明の脂質組成物における使用に適したステルス脂質とし
て、脂質部分に連結される親水性ヘッド基を有するステルス脂質が挙げられるが、それら
に限定されない。かかるステルス脂質の例として、国際公開第２０１１／０７６８０７号
パンフレットに記載されるような、式（ＸＩ）
（式中、
Ｚは、ＰＥＧならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニ
ルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（
２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、多糖およびポリ（アミノ酸）ベースのポ
リマーから選択され、ここでポリマーは、直鎖状であってもよく、または分岐状であって
もよく、ポリマーは、任意選択で置換されてもよく、
Ｚは、ｎ個のサブユニットにより重合され、
ｎは、１０〜２００ユニットのＺ間の数平均重合度であり、ｎは、種々のポリマータイ
プに関して最適化され、
Ｌ１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシ
ネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、カルバメート（例え
ば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ケトン（
例えば、−Ｃ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ−）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）−）、尿素（例えば
、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（
Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−
）、キサントエート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、
−ＯＰ（Ｏ２）Ｏ−）のうちの０、１つ、２つまたはそれ以上を含む、任意選択で置換さ
れるＣ１〜１０アルキレンまたはＣ１〜１０ヘテロアルキレンリンカーであり、それらの
いずれも、０、１つまたは複数のＺ基により置換されてもよく、
Ｒ’は、−Ｈ、−ＮＨ、−ＮＨ２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェートまたは任意選択で置
換されるＣ１〜１０アルキレンから独立して選択され、
Ｘ１およびＸ２は、炭素または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選
択されるヘテロ原子から独立して選択され、
Ａ１およびＡ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、およびＣ６〜３０ア
ルキニルから独立して選択され、ここでＡ１およびＡ２は、同じであってもよく、または
異なってもよく、あるいは、
Ａ１およびＡ２は、それらが結合する炭素と一緒に、任意選択で置換されるステロイド
を形成する）が挙げられる。
特定のステルス脂質として、表１に列挙するものが挙げられるが、それらに限定されな
い。
い。
本発明の脂質組成物における使用に適した他のステルス脂質およびかかる脂質の生化学
に関する情報は、Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, p
.55-71、およびHoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52に
見出すことができる。
に関する情報は、Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, p
.55-71、およびHoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52に
見出すことができる。
一実施形態では、適したステルス脂質は、ＰＥＧ（場合によっては、ポリ（エチレンオ
キシド）と称される）ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ
（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリ［Ｎ−（２
−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］ベースのポリマーから選択される基を含む。
さらなる適したＰＥＧ脂質は、例えば国際公開第２００６／００７７１２号パンフレット
に開示されている。
キシド）と称される）ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ
（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリ［Ｎ−（２
−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］ベースのポリマーから選択される基を含む。
さらなる適したＰＥＧ脂質は、例えば国際公開第２００６／００７７１２号パンフレット
に開示されている。
特定の適したステルス脂質として、約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独
立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基
を含むものを含む、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールまたはポリエチレン
グリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）が挙げられる。ジアルキルグリセロ
ールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換アルキル基を含む。本明細
書中に記載する実施形態のいずれかにおいて、ＰＥＧ複合体は、ＰＥＧ−ジラウリルグリ
セロール、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（NOF, Tokyo, Japan
からのカタログ＃ＧＭ−０２０）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジス
テリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド
、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−
コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ］カルボキ
シアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ
（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オ
メガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール
）−２０００］（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USAからのカタログ＃８８
０１５０Ｐ）から選択することができる。
立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基
を含むものを含む、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールまたはポリエチレン
グリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）が挙げられる。ジアルキルグリセロ
ールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換アルキル基を含む。本明細
書中に記載する実施形態のいずれかにおいて、ＰＥＧ複合体は、ＰＥＧ−ジラウリルグリ
セロール、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（NOF, Tokyo, Japan
からのカタログ＃ＧＭ−０２０）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジス
テリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド
、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−
コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ］カルボキ
シアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ
（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オ
メガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール
）−２０００］（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USAからのカタログ＃８８
０１５０Ｐ）から選択することができる。
一実施形態では、ステルス脂質は、Ｓ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、または
Ｓ０３３である。
Ｓ０３３である。
別の実施形態では、ステルス脂質はＳ０２４である。
別記しない限り、「ＰＥＧ」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意のポリエ
チレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態で
は、ＰＥＧは、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換される直鎖
状または分岐状ポリマーである。一実施形態では、ＰＥＧは無置換である。一実施形態で
は、ＰＥＧは、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシま
たはアリール基により置換される。一実施形態では、上記用語は、ＰＥＧ−ポリウレタン
またはＰＥＧ−ポリプロピレンなどのＰＥＧ共重合体を含み（例えば、J. Milton Harris
, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (199
2)を参照）、別の実施形態では、上記用語は、ＰＥＧ共重合体を含まない。一実施形態で
は、ＰＥＧは、約１３０〜約５０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約３０，０００
、亜実施形態では、約１５０〜約２０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約１５，０
００、亜実施形態では、約１５０〜約１０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約６０
００、亜実施形態では、約１５０〜約５０００、亜実施形態では、約１５０〜約４０００
、亜実施形態では、約１５０〜約３０００、亜実施形態では、約３００〜約３０００、亜
実施形態では、約１０００〜約３０００、および亜実施形態では、約１５００〜約２５０
０の分子量を有する。
チレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態で
は、ＰＥＧは、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換される直鎖
状または分岐状ポリマーである。一実施形態では、ＰＥＧは無置換である。一実施形態で
は、ＰＥＧは、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシま
たはアリール基により置換される。一実施形態では、上記用語は、ＰＥＧ−ポリウレタン
またはＰＥＧ−ポリプロピレンなどのＰＥＧ共重合体を含み（例えば、J. Milton Harris
, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (199
2)を参照）、別の実施形態では、上記用語は、ＰＥＧ共重合体を含まない。一実施形態で
は、ＰＥＧは、約１３０〜約５０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約３０，０００
、亜実施形態では、約１５０〜約２０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約１５，０
００、亜実施形態では、約１５０〜約１０，０００、亜実施形態では、約１５０〜約６０
００、亜実施形態では、約１５０〜約５０００、亜実施形態では、約１５０〜約４０００
、亜実施形態では、約１５０〜約３０００、亜実施形態では、約３００〜約３０００、亜
実施形態では、約１０００〜約３０００、および亜実施形態では、約１５００〜約２５０
０の分子量を有する。
ある特定の実施形態では、ＰＥＧは、「ＰＥＧ ２０００」とも称される「ＰＥＧ−２
Ｋ」であり、それは、約２０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ−２Ｋは、本明
細書中では、下記式（ＸＩＩａ）により表され、ここではｎは４５であり、数平均重合度
が約４５個のサブユニットを含むことを意味する。しかしながら、例えば、数平均重合度
が、約２３個のサブユニット（ｎ＝２３）および／または６８個のサブユニット（ｎ＝６
８）を含むものを含む、当該技術分野で公知の他のＰＥＧ実施形態が使用されてもよい。
Ｋ」であり、それは、約２０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ−２Ｋは、本明
細書中では、下記式（ＸＩＩａ）により表され、ここではｎは４５であり、数平均重合度
が約４５個のサブユニットを含むことを意味する。しかしながら、例えば、数平均重合度
が、約２３個のサブユニット（ｎ＝２３）および／または６８個のサブユニット（ｎ＝６
８）を含むものを含む、当該技術分野で公知の他のＰＥＧ実施形態が使用されてもよい。
本発明のプロセスにおける使用のための式（Ｉ）〜式（ＩＸ）の好ましい化合物は、以
下の実施例１〜３６である。
下の実施例１〜３６である。
４．０ 被封入核酸ナノ粒子
「脂質ナノ粒子」とは、分子間力によって互いに物理的に結合された複数の（即ち、１
つよりも多い）脂質分子を含む粒子を意味する。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェ
ア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミ
セルまたは懸濁液中の内部相であり得る。
「脂質ナノ粒子」とは、分子間力によって互いに物理的に結合された複数の（即ち、１
つよりも多い）脂質分子を含む粒子を意味する。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェ
ア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミ
セルまたは懸濁液中の内部相であり得る。
「脂質ナノ粒子ホスト」という用語は、ｓｉＲＮＡなどの１つまたは複数の核酸分子を
封入するための分子間力／静電相互作用によって互いに物理的に結合された複数の脂質分
子を指す。
封入するための分子間力／静電相互作用によって互いに物理的に結合された複数の脂質分
子を指す。
ある特定の実施形態は、薬学的に許容される担体および被封入核酸ナノ粒子を含む被封
入核酸ナノ粒子組成物を提供する。被封入核酸ナノ粒子は、脂質ナノ粒子ホストおよび脂
質ナノ粒子ホスト中に封入される核酸を含む。「薬学的に許容される担体」という用語は
、本明細書中で使用する場合、無毒性の不活性希釈剤を意味する。薬学的に許容される担
体として作用し得る材料として、発熱物質除去水（pyrogen-free water）、脱イオン水、
等張生理食塩水、リンゲル溶液、およびリン酸緩衝溶液が挙げられるが、それらに限定さ
れない。好ましい実施形態では、被封入核酸ナノ粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均サイ
ズ、および例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、動
的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する。脂質ナノ粒子ホス
トは、本明細書中の他の箇所で記載されるように、分解性陽イオン性脂質、脂質付加され
た（lipidated）ポリエチレングリコール、コレステロール、および１，２−ジステアロ
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン構成成分を含む。
入核酸ナノ粒子組成物を提供する。被封入核酸ナノ粒子は、脂質ナノ粒子ホストおよび脂
質ナノ粒子ホスト中に封入される核酸を含む。「薬学的に許容される担体」という用語は
、本明細書中で使用する場合、無毒性の不活性希釈剤を意味する。薬学的に許容される担
体として作用し得る材料として、発熱物質除去水（pyrogen-free water）、脱イオン水、
等張生理食塩水、リンゲル溶液、およびリン酸緩衝溶液が挙げられるが、それらに限定さ
れない。好ましい実施形態では、被封入核酸ナノ粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均サイ
ズ、および例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、動
的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する。脂質ナノ粒子ホス
トは、本明細書中の他の箇所で記載されるように、分解性陽イオン性脂質、脂質付加され
た（lipidated）ポリエチレングリコール、コレステロール、および１，２−ジステアロ
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン構成成分を含む。
本発明の実施形態は、陽イオン性脂質および別の脂質構成成分を含む被封入核酸ナノ粒
子組成物を調製する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質およびヘルパー脂
質、例えばコレステロールを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質
、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方
法を提供する。本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレス
テロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４
、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。本発明の別の実施形
態は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供し、ここでナノ粒子は、陽イオ
ン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ステルス
脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を含み、核酸は
、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパ
ー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例え
ばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供し、
ここで核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡである。
子組成物を調製する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質およびヘルパー脂
質、例えばコレステロールを使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質
、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方
法を提供する。本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレス
テロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４
、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。本発明の別の実施形
態は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供し、ここでナノ粒子は、陽イオ
ン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ステルス
脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を含み、核酸は
、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質、ヘルパ
ー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例え
ばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供し、
ここで核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡである。
本発明の幾つかの実施形態では、脂質溶液／流（複数可）は、陽イオン性脂質化合物、
ヘルパー脂質（コレステロール）、任意選択の中性脂質（ＤＳＰＣ）およびステルス脂質
（例えば、Ｓ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、またはＳ０３１）を含有する。配合物が４つ
の脂質構成成分を含有する場合、脂質のモル比は、４０〜６０の標的を有する陽イオン性
脂質に関して２０〜７０モルパーセントの範囲であってもよく、ヘルパー脂質のモルパー
セントは、３０〜５０の標的で２０〜７０の範囲であり、中性脂質のモルパーセントは、
０〜３０の範囲であり、ＰＥＧ脂質のモルパーセントは、２〜５の標的で１〜６の範囲を
有する。
ヘルパー脂質（コレステロール）、任意選択の中性脂質（ＤＳＰＣ）およびステルス脂質
（例えば、Ｓ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、またはＳ０３１）を含有する。配合物が４つ
の脂質構成成分を含有する場合、脂質のモル比は、４０〜６０の標的を有する陽イオン性
脂質に関して２０〜７０モルパーセントの範囲であってもよく、ヘルパー脂質のモルパー
セントは、３０〜５０の標的で２０〜７０の範囲であり、中性脂質のモルパーセントは、
０〜３０の範囲であり、ＰＥＧ脂質のモルパーセントは、２〜５の標的で１〜６の範囲を
有する。
幾つかの実施形態では、脂質溶液／流（複数可）は、式（ＩＩＩ）を有する化合物３０
〜６０％、コレステロール３０〜６０％／ＤＳＰＣ５〜１０％、およびＰＥＧ−ＤＭＧ、
Ｓ０１０、Ｓ０１１またはＳ０２４ １〜５％を含有する。
〜６０％、コレステロール３０〜６０％／ＤＳＰＣ５〜１０％、およびＰＥＧ−ＤＭＧ、
Ｓ０１０、Ｓ０１１またはＳ０２４ １〜５％を含有する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５の
脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂
質約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、陽イ
オン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを
使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５５／ヘルパー脂質
約４０〜５５／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜１０の脂質モル比で、陽イオン
性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステ
ルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する
方法を提供する。
脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂
質約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、陽イ
オン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを
使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５５／ヘルパー脂質
約４０〜５５／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜１０の脂質モル比で、陽イオン
性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステ
ルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する
方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０の
脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂
質約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、陽イ
オン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを
使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５０／ヘルパー脂質
約４０〜５０／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜５の脂質モル比で、陽イオン性
脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステル
ス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方
法を提供する。
脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂
質約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、陽イ
オン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを
使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４０〜５０／ヘルパー脂質
約４０〜５０／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜５の脂質モル比で、陽イオン性
脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステル
ス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方
法を提供する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７の
脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂
質約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２の脂質モル比で、陽イ
オン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを
使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４３〜４７／ヘルパー脂質
約４３〜４７／中性脂質約７〜１２／ステルス脂質約１〜４の脂質モル比で、陽イオン性
脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステル
ス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方
法を提供する。
脂質モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂
質約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２の脂質モル比で、陽イ
オン性脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを
使用する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４３〜４７／ヘルパー脂質
約４３〜４７／中性脂質約７〜１２／ステルス脂質約１〜４の脂質モル比で、陽イオン性
脂質、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステル
ス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方
法を提供する。
本発明の別の実施形態は、陽イオン性脂質約４５％およびヘルパー脂質約４４％の脂質
モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質
ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約
４５％、ヘルパー脂質約４４％、および中性脂質約９％の脂質モル比で、陽イオン性脂質
、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方
法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４５％、ヘルパー脂質約４４％、中性
脂質約９％、およびステルス脂質約２％の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質
、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０
１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
モル比で、陽イオン性脂質およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質
ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約
４５％、ヘルパー脂質約４４％、および中性脂質約９％の脂質モル比で、陽イオン性脂質
、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方
法を提供する。別の実施形態は、陽イオン性脂質約４５％、ヘルパー脂質約４４％、中性
脂質約９％、およびステルス脂質約２％の脂質モル比で、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質
、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０
１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の一実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物および別の脂質構成成分を含む被封入
核酸ナノ粒子組成物を調製する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合
物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用する方法を提供する。別の実施形態
は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、
例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する
化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステ
ルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する
方法を提供する。本発明の別の実施形態は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
を提供し、ここでナノ粒子は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステ
ロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２
７、Ｓ０３１、またはＳ０３０３を含み、核酸は、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである。本
発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール
、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２
７、Ｓ０３１、またはＳ０３０３を使用する方法を提供し、ここで核酸は、例えばｍＲＮ
Ａ、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡである。
核酸ナノ粒子組成物を調製する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合
物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用する方法を提供する。別の実施形態
は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質、
例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する
化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステ
ルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する
方法を提供する。本発明の別の実施形態は、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
を提供し、ここでナノ粒子は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステ
ロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２
７、Ｓ０３１、またはＳ０３０３を含み、核酸は、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである。本
発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール
、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２
７、Ｓ０３１、またはＳ０３０３を使用する方法を提供し、ここで核酸は、例えばｍＲＮ
Ａ、ｓｉＲＮＡまたはＤＮＡである。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０
〜５５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物およびヘルパー
脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を
提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５
５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（Ｉ
Ｘ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質
、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物
約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜１
０の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例
えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０
、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
〜５５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物およびヘルパー
脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法を
提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５
５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（Ｉ
Ｘ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、および中性脂質
、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）を有する化合物
約４０〜５５／ヘルパー脂質約４０〜５５／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜１
０の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例
えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０
、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５
０／ヘルパー脂質約４０〜５０の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有す
る化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中
に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを
有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５の脂質モル
比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステ
ロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、
式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５
０／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）
のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤ
ＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、または
Ｓ０３３を使用する方法を提供する。
０／ヘルパー脂質約４０〜５０の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有す
る化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中
に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを
有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５０／中性脂質約５〜１５の脂質モル
比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステ
ロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、
式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４０〜５０／ヘルパー脂質約４０〜５
０／中性脂質約５〜１５／ステルス脂質約１〜５の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）
のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤ
ＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、または
Ｓ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４３〜４
７／ヘルパー脂質約４３〜４７の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有す
る化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中
に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを
有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２の脂質モル
比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステ
ロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、
式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４
７／中性脂質約７〜１２／ステルス脂質約１〜４の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）
のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤ
ＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、または
Ｓ０３３を使用する方法を提供する。
７／ヘルパー脂質約４３〜４７の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有す
る化合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中
に核酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを
有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４７／中性脂質約７〜１２の脂質モル
比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステ
ロール、および中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、
式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４３〜４７／ヘルパー脂質約４３〜４
７／中性脂質約７〜１２／ステルス脂質約１〜４の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）
のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤ
ＳＰＣ、およびステルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、または
Ｓ０３３を使用する方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４５％お
よびヘルパー脂質約４４％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化
合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核
酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有す
る化合物約４５％、ヘルパー脂質約４４％、および中性脂質約９％の脂質モル比で、式（
Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、お
よび中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜
式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４５％、ヘルパー脂質約４４％、中性脂質約９％
、およびステルス脂質約２％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する
化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステ
ルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する
方法を提供する。
よびヘルパー脂質約４４％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化
合物およびヘルパー脂質、例えばコレステロールを使用して、脂質ナノ粒子ホスト中に核
酸を封入する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有す
る化合物約４５％、ヘルパー脂質約４４％、および中性脂質約９％の脂質モル比で、式（
Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、お
よび中性脂質、例えばＤＳＰＣを使用する方法を提供する。別の実施形態は、式（Ｉ）〜
式（ＩＸ）のいずれかを有する化合物約４５％、ヘルパー脂質約４４％、中性脂質約９％
、およびステルス脂質約２％の脂質モル比で、式（Ｉ）〜式（ＩＸ）のいずれかを有する
化合物、ヘルパー脂質、例えばコレステロール、中性脂質、例えばＤＳＰＣ、およびステ
ルス脂質、例えばＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３を使用する
方法を提供する。
本発明のプロセスにおける脂質：核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の比は、およそ１５〜２
０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。ある特定の実施形態では、脂質：核酸の比は、約１７
〜１９：１である。他の実施形態では、脂質：核酸の比は、約１８．５：１である。
０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。ある特定の実施形態では、脂質：核酸の比は、約１７
〜１９：１である。他の実施形態では、脂質：核酸の比は、約１８．５：１である。
本発明のプロセスにより生産されるナノ粒子は、平均／平均値直径、およびおよそ平均
値のサイズの分布を有する。より狭い範囲の粒径は、粒径のより一様な分布に対応する。
粒径は、インキュベーション後、またはナノ粒子配合物を完全に加工処理（例えば、希釈
、ろ過、透析等）した後に、ナノ粒子の収集時に決定され得る。例えば、粒径決定は通常
、６０分のインキュベーション期間後、および／または完全な試料の加工処理後に実施さ
れる。平均粒径は、Ｚ−平均値または数平均値のいずれかとして報告される。Ｚ−平均値
は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで動的光散乱により測定される。ナノ粒子試料
は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈されて、その結果、カウントレート（coun
t rate）は、およそ２００〜４００ｋｃｔである。データは、強度測定の加重平均値とし
て表される。動的光散乱はまた、粒径分布の幅を定量化する多分散指数（ＰＤＩ）を提供
する。より大きなＰＤＩは、より大きな粒径分布と相関し、また逆の場合も同様である。
他方で、数平均値は、顕微鏡下での測定により決定することができる。
値のサイズの分布を有する。より狭い範囲の粒径は、粒径のより一様な分布に対応する。
粒径は、インキュベーション後、またはナノ粒子配合物を完全に加工処理（例えば、希釈
、ろ過、透析等）した後に、ナノ粒子の収集時に決定され得る。例えば、粒径決定は通常
、６０分のインキュベーション期間後、および／または完全な試料の加工処理後に実施さ
れる。平均粒径は、Ｚ−平均値または数平均値のいずれかとして報告される。Ｚ−平均値
は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで動的光散乱により測定される。ナノ粒子試料
は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈されて、その結果、カウントレート（coun
t rate）は、およそ２００〜４００ｋｃｔである。データは、強度測定の加重平均値とし
て表される。動的光散乱はまた、粒径分布の幅を定量化する多分散指数（ＰＤＩ）を提供
する。より大きなＰＤＩは、より大きな粒径分布と相関し、また逆の場合も同様である。
他方で、数平均値は、顕微鏡下での測定により決定することができる。
幾つかの実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入核酸ナノ粒子は、約
３０〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約３０〜約４０ｎ
ｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均直径を有
する。他の実施形態では、粒子は、約６５〜約８０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形
態では、粒子は、約５０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜約８０ｎｍの数
平均値を有する。さらなる他の実施形態では、粒子は、約５０〜約７０ｎｍのＺ平均値お
よび／または約４０〜６５ｎｍの数平均値を有する。さらに他の実施形態では、粒子は、
約７０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約６０〜８０ｎｍの数平均値を有する。得
られる粒子の特定サイズは、核酸および脂質流の線速度、任意選択の希釈ステップの使用
、および使用する特定核酸または脂質に依存し得る。より大きな線速度、および第１の出
口溶液中の有機溶媒濃度を３３％未満に維持することが、より小さな粒径を生じる傾向に
ある。
３０〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約３０〜約４０ｎ
ｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均直径を有
する。他の実施形態では、粒子は、約６５〜約８０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形
態では、粒子は、約５０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜約８０ｎｍの数
平均値を有する。さらなる他の実施形態では、粒子は、約５０〜約７０ｎｍのＺ平均値お
よび／または約４０〜６５ｎｍの数平均値を有する。さらに他の実施形態では、粒子は、
約７０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約６０〜８０ｎｍの数平均値を有する。得
られる粒子の特定サイズは、核酸および脂質流の線速度、任意選択の希釈ステップの使用
、および使用する特定核酸または脂質に依存し得る。より大きな線速度、および第１の出
口溶液中の有機溶媒濃度を３３％未満に維持することが、より小さな粒径を生じる傾向に
ある。
幾つかの実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入ｓｉＲＮＡナノ粒子
は、約３０〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約３０〜約
４０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均直
径を有する。他の実施形態では、粒子は、約６５〜約８０ｎｍの平均直径を有する。他の
実施形態では、粒子は、約５０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜約８０ｎ
ｍの数平均値を有する。さらなる他の実施形態では、粒子は、約５０〜約７０ｎｍのＺ平
均値および／または約４０〜６５ｎｍの数平均値を有する。さらに他の実施形態では、粒
子は、約７０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約６０〜８０ｎｍの数平均値を有す
る。さらなる他の実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入ｓｉＲＮＡナ
ノ粒子は、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０
、約７５、または約８０ｎｍの平均直径を有し得る。
は、約３０〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約３０〜約
４０ｎｍの平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約４０〜約７０ｎｍの平均直
径を有する。他の実施形態では、粒子は、約６５〜約８０ｎｍの平均直径を有する。他の
実施形態では、粒子は、約５０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約４０〜約８０ｎ
ｍの数平均値を有する。さらなる他の実施形態では、粒子は、約５０〜約７０ｎｍのＺ平
均値および／または約４０〜６５ｎｍの数平均値を有する。さらに他の実施形態では、粒
子は、約７０〜約８０ｎｍのＺ平均値および／または約６０〜８０ｎｍの数平均値を有す
る。さらなる他の実施形態では、本発明のプロセスにより生産される被封入ｓｉＲＮＡナ
ノ粒子は、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０
、約７５、または約８０ｎｍの平均直径を有し得る。
動的光散乱（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ）を使用し
て、多分散指数（ＰＤＩ）は、０〜１．０の範囲であり得る。特定の好ましい実施形態で
は、ＰＤＩは、約０．２未満である。他の好ましい実施形態では、ＰＤＩは、約０．１未
満である。
て、多分散指数（ＰＤＩ）は、０〜１．０の範囲であり得る。特定の好ましい実施形態で
は、ＰＤＩは、約０．２未満である。他の好ましい実施形態では、ＰＤＩは、約０．１未
満である。
本発明のプロセスは、陽イオン性脂質を、所望のｐＫａ範囲、ステルス脂質、ヘルパー
脂質、および中性脂質と組み合わせることにより、特定の細胞および組織へのｉｎ ｖｉ
ｖｏでの送達のために、例えばリポソーム配合物、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）配合物等を含
む配合物へとさらに最適化されてもよい。一実施形態では、さらなる最適化は、これら各
種タイプの脂質間の脂質モル比を調節することにより得られる。一実施形態では、さらな
る最適化は、所望の粒径、Ｎ／Ｐ比、および／またはプロセスパラメーターの１つまたは
複数を調節することにより得られる。上記で列挙する実施形態に関する当業者に公知の各
種最適化技法は、本発明の一部とみなされる。
脂質、および中性脂質と組み合わせることにより、特定の細胞および組織へのｉｎ ｖｉ
ｖｏでの送達のために、例えばリポソーム配合物、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）配合物等を含
む配合物へとさらに最適化されてもよい。一実施形態では、さらなる最適化は、これら各
種タイプの脂質間の脂質モル比を調節することにより得られる。一実施形態では、さらな
る最適化は、所望の粒径、Ｎ／Ｐ比、および／またはプロセスパラメーターの１つまたは
複数を調節することにより得られる。上記で列挙する実施形態に関する当業者に公知の各
種最適化技法は、本発明の一部とみなされる。
５．０ 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入するプロセス
下記方法を使用して、本発明の脂質ナノ粒子を作製することができる。粒子におけるサ
イズ低減を達成するために、および／またはサイズの均質性を増加させるために、当業者
は、以下に提示する方法ステップを使用して、種々の組合せを実験してもよい。さらに、
当業者は、リポソーム配合物で使用される超音波処理、ろ過または他のサイジング技法を
用いることができる。
下記方法を使用して、本発明の脂質ナノ粒子を作製することができる。粒子におけるサ
イズ低減を達成するために、および／またはサイズの均質性を増加させるために、当業者
は、以下に提示する方法ステップを使用して、種々の組合せを実験してもよい。さらに、
当業者は、リポソーム配合物で使用される超音波処理、ろ過または他のサイジング技法を
用いることができる。
本発明の組成物を作製するプロセスは通常、第１のリザーバ中に核酸を含む、クエン酸
緩衝液などの水溶液を供給するステップ、脂質（複数可）の有機アルコール、例えばエタ
ノールなどの有機溶液を含む第２のリザーバを供給するステップ、続いて水溶液を有機脂
質溶液と混合するステップを含む。第１のリザーバは、任意選択で、第２のリザーバと液
洛している。混合ステップに続いて、任意選択で、インキュベーションステップ、ろ過ま
たは透析ステップ、ならびに希釈および／または濃縮ステップが行われる。インキュベー
ションステップは、混合ステップからの溶液を、およそ室温で約０〜約２４時間（好まし
くは、約１時間）容器中で、および任意選択で光から防御して静置させるステップを含む
。一実施形態では、希釈ステップに続いて、インキュベーションステップが行われる。希
釈ステップは、例えばポンピング装置（例えば、ぜん道ポンプ）を使用した、水性緩衝液
（例えば、クエン酸緩衝液または純水）を用いた希釈を包含し得る。ろ過ステップは、限
外ろ過または透析であってもよい。限外ろ過は、適切な限外ろ過膜（例えば、ＧＥ中空繊
維カートリッジまたはそれらの等価体）と併用して適切なポンピングシステム（例えば、
ぜん動ポンプまたはそれらの等価体などのポンピング装置）を使用した、希釈した溶液の
濃縮、続くダイアフィルトレーションを含む。透析は、適切な膜（例えば、１０，０００
ｍｗｃ スネークスキン膜）に通した溶媒（緩衝液）交換を含む。
緩衝液などの水溶液を供給するステップ、脂質（複数可）の有機アルコール、例えばエタ
ノールなどの有機溶液を含む第２のリザーバを供給するステップ、続いて水溶液を有機脂
質溶液と混合するステップを含む。第１のリザーバは、任意選択で、第２のリザーバと液
洛している。混合ステップに続いて、任意選択で、インキュベーションステップ、ろ過ま
たは透析ステップ、ならびに希釈および／または濃縮ステップが行われる。インキュベー
ションステップは、混合ステップからの溶液を、およそ室温で約０〜約２４時間（好まし
くは、約１時間）容器中で、および任意選択で光から防御して静置させるステップを含む
。一実施形態では、希釈ステップに続いて、インキュベーションステップが行われる。希
釈ステップは、例えばポンピング装置（例えば、ぜん道ポンプ）を使用した、水性緩衝液
（例えば、クエン酸緩衝液または純水）を用いた希釈を包含し得る。ろ過ステップは、限
外ろ過または透析であってもよい。限外ろ過は、適切な限外ろ過膜（例えば、ＧＥ中空繊
維カートリッジまたはそれらの等価体）と併用して適切なポンピングシステム（例えば、
ぜん動ポンプまたはそれらの等価体などのポンピング装置）を使用した、希釈した溶液の
濃縮、続くダイアフィルトレーションを含む。透析は、適切な膜（例えば、１０，０００
ｍｗｃ スネークスキン膜）に通した溶媒（緩衝液）交換を含む。
一実施形態では、混合ステップは、透明な単一相を供給する。
一実施形態では、混合ステップ後、有機溶媒を除去して、粒子の懸濁液を供給し、ここ
で核酸は、脂質（複数可）により封入される。
で核酸は、脂質（複数可）により封入される。
有機溶媒の選択は通常、溶媒極性および粒子形成の後期段階で、溶媒を除去することが
できる容易さの考慮を含む。可溶化剤としても使用される有機溶媒は好ましくは、核酸お
よび脂質の透明な単一相混合物を供給するのに十分な量で存在する。適切な有機溶媒とし
て、注射用製剤用の共溶媒としての使用に関して、Strickley, Pharmaceutical Res. (20
04), 21, 201-230により記載されるものが挙げられる。例えば、有機溶媒は、エタノール
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４０
０、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル-２−ピロリドン（ＮＭ
Ｐ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つまたは複数（例えば、２つ
）から選択され得る。好ましくは、有機溶媒は、エタノールである。
できる容易さの考慮を含む。可溶化剤としても使用される有機溶媒は好ましくは、核酸お
よび脂質の透明な単一相混合物を供給するのに十分な量で存在する。適切な有機溶媒とし
て、注射用製剤用の共溶媒としての使用に関して、Strickley, Pharmaceutical Res. (20
04), 21, 201-230により記載されるものが挙げられる。例えば、有機溶媒は、エタノール
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４０
０、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル-２−ピロリドン（ＮＭ
Ｐ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つまたは複数（例えば、２つ
）から選択され得る。好ましくは、有機溶媒は、エタノールである。
本発明の組成物を作製するための装置が、本明細書中に開示される。装置は通常、核酸
を含む水溶液を保持するための少なくとも１つのリザーバ、および有機脂質溶液を保持す
るための別の１つまたは複数のリザーバを含む。装置はまた、水溶液および有機脂質溶液
を、混合領域または混合チャンバーへポンピングするよう設定されたポンプメカニズムを
通常含む。幾つかの実施形態では、混合領域または混合チャンバーは、クロスカップリン
グ、または等価体を含み、それにより、水性および有機流体流を、十字コネクターへの入
力として組み合わせることが可能であり、得られた複合水性および有機溶液を、十字コネ
クターから、収集リザーバまたはその等価体へ出すことが可能である。他の実施形態では
、混合領域または混合チャンバーは、Ｔカップリングまたはその等価体を含み、それによ
り、水性および有機流体流を、Ｔコネクターへの入力として組み合わせることが可能であ
り、得られた複合水性および有機溶液を、Ｔコネクターから、収集リザーバまたはその等
価体へ出すことが可能である。
を含む水溶液を保持するための少なくとも１つのリザーバ、および有機脂質溶液を保持す
るための別の１つまたは複数のリザーバを含む。装置はまた、水溶液および有機脂質溶液
を、混合領域または混合チャンバーへポンピングするよう設定されたポンプメカニズムを
通常含む。幾つかの実施形態では、混合領域または混合チャンバーは、クロスカップリン
グ、または等価体を含み、それにより、水性および有機流体流を、十字コネクターへの入
力として組み合わせることが可能であり、得られた複合水性および有機溶液を、十字コネ
クターから、収集リザーバまたはその等価体へ出すことが可能である。他の実施形態では
、混合領域または混合チャンバーは、Ｔカップリングまたはその等価体を含み、それによ
り、水性および有機流体流を、Ｔコネクターへの入力として組み合わせることが可能であ
り、得られた複合水性および有機溶液を、Ｔコネクターから、収集リザーバまたはその等
価体へ出すことが可能である。
本発明によるプロセスは、被封入核酸ナノ粒子を形成する例示的な方法における使用の
ためのシステムを示す図２を参照することにより、より良好に理解され得る。装置１は、
それぞれ第１の核酸流１０、第２の核酸流２０、および脂質流３０を受けるための通路１
２、通路２２および通路３２を有する十字１６を含有する。流れ１０、流れ２０、および
流れ３０は、核酸溶液を含有する１つまたは複数のリザーバ、および脂質の溶液を含有す
る１つまたは複数のリザーバに通じる適切なチューブを通って各々の流れをポンピングす
ることにより、通路１２、通路２２および通路３２へ送達され得る（チューブおよびリザ
ーバは示していない）。図２における通路１２、通路２２、および通路３２は、ほぼ等し
い内径を有する。流１０、流２０、および流３０は、交差ポイント１４で集まって、複合
流４０を形成する。十字１６の幾何学のため、脂質流３０は、核酸流１０および核酸流２
０に対して直角の方向で流動し、核酸流１０および核酸流２０は、交差ポイント１４に向
かって互いに対して約１８０°で反対方向で流動する。複合流４０は、通路４２を通って
、プロセスチャンバー７０へと流動し、プロセスチャンバーの本体（７２）は、通路４２
よりも大きな直径を有し得る。プロセスチャンバー７０はまた、様々な長さを有してもよ
い。例えば、プロセスチャンバー７０は、通路１２、通路２２、および通路３２の直径の
約１００〜２０００倍の長さ、および通路１２、通路２２、および通路３２の直径の約４
倍の直径を有し得る。
ためのシステムを示す図２を参照することにより、より良好に理解され得る。装置１は、
それぞれ第１の核酸流１０、第２の核酸流２０、および脂質流３０を受けるための通路１
２、通路２２および通路３２を有する十字１６を含有する。流れ１０、流れ２０、および
流れ３０は、核酸溶液を含有する１つまたは複数のリザーバ、および脂質の溶液を含有す
る１つまたは複数のリザーバに通じる適切なチューブを通って各々の流れをポンピングす
ることにより、通路１２、通路２２および通路３２へ送達され得る（チューブおよびリザ
ーバは示していない）。図２における通路１２、通路２２、および通路３２は、ほぼ等し
い内径を有する。流１０、流２０、および流３０は、交差ポイント１４で集まって、複合
流４０を形成する。十字１６の幾何学のため、脂質流３０は、核酸流１０および核酸流２
０に対して直角の方向で流動し、核酸流１０および核酸流２０は、交差ポイント１４に向
かって互いに対して約１８０°で反対方向で流動する。複合流４０は、通路４２を通って
、プロセスチャンバー７０へと流動し、プロセスチャンバーの本体（７２）は、通路４２
よりも大きな直径を有し得る。プロセスチャンバー７０はまた、様々な長さを有してもよ
い。例えば、プロセスチャンバー７０は、通路１２、通路２２、および通路３２の直径の
約１００〜２０００倍の長さ、および通路１２、通路２２、および通路３２の直径の約４
倍の直径を有し得る。
図２の実施形態では、合流した流れ４０は、通路５２を通って入ってくる希釈流５０と
交差する。希釈流５０は、希釈溶液を含有する希釈リザーバからチューブを通って送達さ
れ得る。図２では、通路５２は、通路１２、通路２２、および通路３２よりも約２倍大き
な直径を有する。合流した流れ４０および希釈流５０は、Ｔチャンバー５４で交差する。
合流した流れ４０および希釈流５０の交差により生じる流れは、被封入核酸ナノ粒子を含
有する第１の出口溶液６０である。
交差する。希釈流５０は、希釈溶液を含有する希釈リザーバからチューブを通って送達さ
れ得る。図２では、通路５２は、通路１２、通路２２、および通路３２よりも約２倍大き
な直径を有する。合流した流れ４０および希釈流５０は、Ｔチャンバー５４で交差する。
合流した流れ４０および希釈流５０の交差により生じる流れは、被封入核酸ナノ粒子を含
有する第１の出口溶液６０である。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．１〜約１
．５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１０〜約２５ｍｇ
／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２
〜約０．９ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１５〜約２
０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約
０．２２５、０．３、０．３３、または０．４５〜約０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つ
または複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６〜約１８ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態
では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、０
．４５、または０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は
、約１６．７ｍｇ／ｍＬである。
．５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１０〜約２５ｍｇ
／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２
〜約０．９ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１５〜約２
０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約
０．２２５、０．３、０．３３、または０．４５〜約０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つ
または複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６〜約１８ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態
では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、０
．４５、または０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は
、約１６．７ｍｇ／ｍＬである。
脂質流は、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含む。１つまたは複数の脂質
は、陽イオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の混合物であっても
よく、それらはそれぞれ、最終的な被封入核酸ナノ粒子に関して、本明細書中で上記の他
の箇所で記載されるように、ほぼ同じ相対量で存在し得る。脂質流に使用される有機溶媒
は、脂質を可溶化させることが可能なものであり、即ち水性媒質と混和性である。適切な
有機溶媒として、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、
ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メ
チル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられ
る。好ましくは、有機溶媒は、約８０％またはそれ以上のエタノールを含む。好ましくは
、有機溶媒は、約９０％またはそれ以上のエタノールを含む。より好ましくは、有機溶媒
はエタノールである。ある特定の実施形態では、脂質流は、クエン酸ナトリウムの緩衝溶
液（例えば、２５ｍＭ）などの任意選択の緩衝溶液を含む。
は、陽イオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の混合物であっても
よく、それらはそれぞれ、最終的な被封入核酸ナノ粒子に関して、本明細書中で上記の他
の箇所で記載されるように、ほぼ同じ相対量で存在し得る。脂質流に使用される有機溶媒
は、脂質を可溶化させることが可能なものであり、即ち水性媒質と混和性である。適切な
有機溶媒として、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、
ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メ
チル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられ
る。好ましくは、有機溶媒は、約８０％またはそれ以上のエタノールを含む。好ましくは
、有機溶媒は、約９０％またはそれ以上のエタノールを含む。より好ましくは、有機溶媒
はエタノールである。ある特定の実施形態では、脂質流は、クエン酸ナトリウムの緩衝溶
液（例えば、２５ｍＭ）などの任意選択の緩衝溶液を含む。
核酸流は、第１の水溶液中に適切な核酸の混合物を含む。第１の水溶液は、塩を含まな
くてもよく、または少なくとも１つの塩を含んでもよい。例えば、第１の水溶液は、添加
塩を伴わずに、脱イオンまたは蒸留水中に適切な核酸を含んでもよい。ある特定の実施形
態では、第１の水溶液は、例えば塩化ナトリウムおよび／またはクエン酸ナトリウムなど
の少なくとも１つの塩を含む第１の緩衝溶液である。第１の水溶液において、塩化ナトリ
ウムは、約０〜約３００ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。ある特定の実施形態では、塩化
ナトリウムの濃度は、約５０、６６、７５、１００、または１５０ｍＭである。第１の水
溶液は、約０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度でクエン酸ナトリウムを含み得る。第１の緩衝溶
液は好ましくは、ｐＨ約４〜約６．５、より好ましくは約４．５〜５．５を有する。幾つ
かの実施形態では、第１の緩衝溶液のｐＨは、約５であり、クエン酸ナトリウム濃度は、
約２５ｍＭである。他の実施形態では、第１の緩衝溶液のｐＨは、約６であり、クエン酸
ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭである。好ましくは、第１の緩衝溶液は、陽イオン性
脂質のｐＫａ未満であるｐＨを有する。水溶液中に塩を含まない本発明の実施形態に関し
て、脂質流は、任意選択の緩衝溶液を含む。核酸流または脂質流のいずれかにおける塩（
例えば、クエン酸ナトリウム）の非存在下では、封入は起きない。
くてもよく、または少なくとも１つの塩を含んでもよい。例えば、第１の水溶液は、添加
塩を伴わずに、脱イオンまたは蒸留水中に適切な核酸を含んでもよい。ある特定の実施形
態では、第１の水溶液は、例えば塩化ナトリウムおよび／またはクエン酸ナトリウムなど
の少なくとも１つの塩を含む第１の緩衝溶液である。第１の水溶液において、塩化ナトリ
ウムは、約０〜約３００ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。ある特定の実施形態では、塩化
ナトリウムの濃度は、約５０、６６、７５、１００、または１５０ｍＭである。第１の水
溶液は、約０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度でクエン酸ナトリウムを含み得る。第１の緩衝溶
液は好ましくは、ｐＨ約４〜約６．５、より好ましくは約４．５〜５．５を有する。幾つ
かの実施形態では、第１の緩衝溶液のｐＨは、約５であり、クエン酸ナトリウム濃度は、
約２５ｍＭである。他の実施形態では、第１の緩衝溶液のｐＨは、約６であり、クエン酸
ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭである。好ましくは、第１の緩衝溶液は、陽イオン性
脂質のｐＫａ未満であるｐＨを有する。水溶液中に塩を含まない本発明の実施形態に関し
て、脂質流は、任意選択の緩衝溶液を含む。核酸流または脂質流のいずれかにおける塩（
例えば、クエン酸ナトリウム）の非存在下では、封入は起きない。
他の考え得る緩衝液として、酢酸ナトリウム／酢酸、Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸、フタ
ル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム／オルトリン酸二水素
ナトリウム、フタル酸水素二カリウム／オルトリン酸二水素カリウム、オルトリン酸二水
素カリウム／水酸化ナトリウムが挙げられるが、それらに限定されない。
ル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム／オルトリン酸二水素
ナトリウム、フタル酸水素二カリウム／オルトリン酸二水素カリウム、オルトリン酸二水
素カリウム／水酸化ナトリウムが挙げられるが、それらに限定されない。
ある特定の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、約２０〜
２５％エタノール、約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３〜４．５ｍｇ／
ｍＬの脂質を含む。他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は
、約２０％エタノール、約０．１５〜０．２ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３〜３．５ｍｇ
／ｍＬの脂質を含む。さらに他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出
口溶液は、約２０％エタノール、約０．１８ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３．３ｍｇ／ｍ
Ｌの脂質を含む。他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、
約２５％エタノール、約０．２〜０．２５ｍｇ／ｍＬの核酸、および約４〜４．５ｍｇ／
ｍＬの脂質を含む。さらなる他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出
口溶液は、約２５％エタノール、約０．２３ｍｇ／ｍＬの核酸、および約４．２ｍｇ／ｍ
Ｌの脂質を含む。
２５％エタノール、約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３〜４．５ｍｇ／
ｍＬの脂質を含む。他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は
、約２０％エタノール、約０．１５〜０．２ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３〜３．５ｍｇ
／ｍＬの脂質を含む。さらに他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出
口溶液は、約２０％エタノール、約０．１８ｍｇ／ｍＬの核酸、および約３．３ｍｇ／ｍ
Ｌの脂質を含む。他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出口溶液は、
約２５％エタノール、約０．２〜０．２５ｍｇ／ｍＬの核酸、および約４〜４．５ｍｇ／
ｍＬの脂質を含む。さらなる他の実施形態では、有機溶媒はエタノールを含み、第１の出
口溶液は、約２５％エタノール、約０．２３ｍｇ／ｍＬの核酸、および約４．２ｍｇ／ｍ
Ｌの脂質を含む。
図２によるある特定の実施形態では、核酸流１０および核酸流２０は、約３〜約８メー
トル／秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約１．５〜約４．５メートルの
線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中
の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、
約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、
約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：
１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。上記範囲からの核酸流
および脂質流に関する線速度の選択は、本明細書中に規定するように、脂質対核酸の比を
維持するための要件により制限されることが理解されよう。したがって、他のパラメータ
ー（例えば、核酸濃度（ｍｇ／ｍＬ）、流速（ｍＬ／分））の調節は、標的脂質対核酸比
を達成するのに必要であり得る。
トル／秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約１．５〜約４．５メートルの
線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中
の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、
約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、
約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：
１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。上記範囲からの核酸流
および脂質流に関する線速度の選択は、本明細書中に規定するように、脂質対核酸の比を
維持するための要件により制限されることが理解されよう。したがって、他のパラメータ
ー（例えば、核酸濃度（ｍｇ／ｍＬ）、流速（ｍＬ／分））の調節は、標的脂質対核酸比
を達成するのに必要であり得る。
図２による他の実施形態では、核酸流１０および核酸流２０は、約６〜約８メートル／
秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線速度を有し、
脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃
度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：
１または約１７〜１９：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％
である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口
溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
秒の複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線速度を有し、
脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃
度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５〜２０：
１または約１７〜１９：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２５％
である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、出口
溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
図２による一実施形態では、核酸流１０および核酸流２０は、約６．８メートル／秒の
複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を有し、各流れ
１０／２０／３０／５０は、ほぼ同じ流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量による
比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
ほぼ等しい容量の２つの核酸流、１つの脂質流および１つの希釈流を供給することにより
、第１の出口溶液中の脂質流（１００％有機溶媒中の脂質）に由来する有機溶媒の総濃度
は、約２５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１で
ある。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、１８．５：１である。
複合線速度を有し、脂質流３０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を有し、各流れ
１０／２０／３０／５０は、ほぼ同じ流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量による
比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液６０中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
ほぼ等しい容量の２つの核酸流、１つの脂質流および１つの希釈流を供給することにより
、第１の出口溶液中の脂質流（１００％有機溶媒中の脂質）に由来する有機溶媒の総濃度
は、約２５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１で
ある。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、１８．５：１である。
本発明の典型的な実施形態では、各核酸流１０／２０は、約０．４５ｍｇ／ｍＬの核酸
濃度、および３．４メートル／秒の線速度を有してもよく、脂質流３０は、約１６．７ｍ
ｇ／ｍＬの総脂質濃度、および約３．４メートル／秒の線速度を有してもよく、個々の流
れの流速はほぼ等しい。例えば、通路１２、通路２２、および通路３２は、内径０．５ｍ
ｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約４０ｍＬ／分の流速、
および約３．４メートル／秒の対応する線速度を有する。あるいは、通路１２、通路２２
、および通路３２は、内径１．０ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０は
それぞれ、約１６０ｍＬ／分の流速を有するのに対して、対応する線速度は、約３．４メ
ートル／秒のままである。さらなる代替物では、通路１２、通路２２、および通路３２は
、内径約２．０ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約６４
０ｍＬ／分の流速を有するのに対して、線速度は、約３．４メートル／秒のままである。
上述の例から明らかであるように、通路および流れの直径の倍増は、一定の線速度を維持
するために流速の４倍増加を要する。これらの例では、希釈流５０は、流１０、流２０、
および流３０と同じ流速を有するが、通路５２の２倍よりも大きい直径が、各プロセスス
ケールで、希釈流に関して５０％よりも低い線速度をもたらす。驚くべきことに、同じ高
度の核酸封入および小さくて、かつ一様な粒径を維持しながら、本発明のプロセスは、上
述するように縮尺され得ることが見出されている。
濃度、および３．４メートル／秒の線速度を有してもよく、脂質流３０は、約１６．７ｍ
ｇ／ｍＬの総脂質濃度、および約３．４メートル／秒の線速度を有してもよく、個々の流
れの流速はほぼ等しい。例えば、通路１２、通路２２、および通路３２は、内径０．５ｍ
ｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約４０ｍＬ／分の流速、
および約３．４メートル／秒の対応する線速度を有する。あるいは、通路１２、通路２２
、および通路３２は、内径１．０ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０は
それぞれ、約１６０ｍＬ／分の流速を有するのに対して、対応する線速度は、約３．４メ
ートル／秒のままである。さらなる代替物では、通路１２、通路２２、および通路３２は
、内径約２．０ｍｍを有してもよく、流１０、流２０、および流３０はそれぞれ、約６４
０ｍＬ／分の流速を有するのに対して、線速度は、約３．４メートル／秒のままである。
上述の例から明らかであるように、通路および流れの直径の倍増は、一定の線速度を維持
するために流速の４倍増加を要する。これらの例では、希釈流５０は、流１０、流２０、
および流３０と同じ流速を有するが、通路５２の２倍よりも大きい直径が、各プロセスス
ケールで、希釈流に関して５０％よりも低い線速度をもたらす。驚くべきことに、同じ高
度の核酸封入および小さくて、かつ一様な粒径を維持しながら、本発明のプロセスは、上
述するように縮尺され得ることが見出されている。
脂質流３０に対する複合核酸流１０／２０の線速度は、各々の流れ中の核酸および脂質
濃度、ならびに希釈流５０を含む、個々の流れの流速（ｍＬ／分）に関する。しかしなが
ら、核酸および脂質の濃度は、上記で付与される特定の値に限定されず、流速が相応して
調節されるのであれば、必要に応じて、一般的に脂質：核酸の比を約１５〜２０：１に維
持するように上下に調節してもよい。例えば、０．４５ｍｇ／ｍＬから０．４０５ｍｇ／
ｍＬへの核酸濃度の１０％減少は、一定の核酸の全体的な送達を保持するために流速（ｍ
Ｌ／分）の約１．１１倍増加により遂行される。一定の核酸流の直径を保持して、ｍＬ／
分の流速の１．１１倍増加は、メートル／秒の線速度の１．１１倍増加をもたらす。同様
に、一定の希釈流の流速を保持して、出口溶液６０中の脂質流からの有機溶媒の全体的な
濃度は、約２３．５％へ減少する。当然のことながら、希釈流５０の流速は同様に、その
ように望まれる場合には、有機溶媒濃度を約２５％に保持するように低減させることがで
きる。最終的に、核酸濃度の十分な低減および核酸流の流速の対応する増加が、有機溶媒
濃度を第１の出口溶液６０中で約２５％に維持するための希釈流５０の必要性を不要にし
得る。逆に、核酸濃度を増加させてもよい（例えば、０．９ｍｇ／ｍＬへ）。しかしなが
ら、かかる２倍増加は、有機溶媒の濃度を約２５％に、また脂質：核酸の比を約１５〜２
０：１に保持するのに、核酸流の流速（複数可）の対応する減少、および希釈流の速度の
増加を必要とする。核酸もしくは脂質濃度、流速、または流れ１０、流れ２０、流れ３０
、および流れ５０の線速度のさらなる変動は、上述の原理に従って行われてもよい。
濃度、ならびに希釈流５０を含む、個々の流れの流速（ｍＬ／分）に関する。しかしなが
ら、核酸および脂質の濃度は、上記で付与される特定の値に限定されず、流速が相応して
調節されるのであれば、必要に応じて、一般的に脂質：核酸の比を約１５〜２０：１に維
持するように上下に調節してもよい。例えば、０．４５ｍｇ／ｍＬから０．４０５ｍｇ／
ｍＬへの核酸濃度の１０％減少は、一定の核酸の全体的な送達を保持するために流速（ｍ
Ｌ／分）の約１．１１倍増加により遂行される。一定の核酸流の直径を保持して、ｍＬ／
分の流速の１．１１倍増加は、メートル／秒の線速度の１．１１倍増加をもたらす。同様
に、一定の希釈流の流速を保持して、出口溶液６０中の脂質流からの有機溶媒の全体的な
濃度は、約２３．５％へ減少する。当然のことながら、希釈流５０の流速は同様に、その
ように望まれる場合には、有機溶媒濃度を約２５％に保持するように低減させることがで
きる。最終的に、核酸濃度の十分な低減および核酸流の流速の対応する増加が、有機溶媒
濃度を第１の出口溶液６０中で約２５％に維持するための希釈流５０の必要性を不要にし
得る。逆に、核酸濃度を増加させてもよい（例えば、０．９ｍｇ／ｍＬへ）。しかしなが
ら、かかる２倍増加は、有機溶媒の濃度を約２５％に、また脂質：核酸の比を約１５〜２
０：１に保持するのに、核酸流の流速（複数可）の対応する減少、および希釈流の速度の
増加を必要とする。核酸もしくは脂質濃度、流速、または流れ１０、流れ２０、流れ３０
、および流れ５０の線速度のさらなる変動は、上述の原理に従って行われてもよい。
本発明の他の実施形態では、核酸流１０／２０および脂質流３０の流速および／または
線速度はともに、一緒に低減または上昇させてもよい。したがって、各流れに関して一定
の直径および濃度を保持して、複合核酸流の線速度は３．４メートル／秒へ、脂質流の線
速度は１．７メートル／秒へ低減されてもよい。他の実施形態では、複合核酸流の線速度
は約３メートル／秒へ、脂質流の線速度は約１．５メートル／秒へ低減されてもよい。同
様に、複合核酸流の線速度は約１４メートル／秒へ、脂質流の線速度は約７メートル／秒
へ上昇されてもよい。一般的に、速度の上限範囲は、流れをポンピングするのに使用する
設備の機械的制限によってのみ対象となる。非常に高い流速／速度は、設備故障を引き起
こす背圧を生じ得る。概して、図２による複合核酸流の速度は、約３メートル／秒〜１秒
当たり約１４メートル、脂質流に関しては、約１．５〜約４．５メートル／秒の範囲であ
り得る。好ましくは、複合核酸流の速度は、約６〜８メートル／秒、脂質流に関しては、
約３〜約４メートル／秒である。ある特定の実施形態では、複合核酸流の複合速度は、約
６．８メートル／秒、脂質流に関しては、約３．４メートル／秒である。
線速度はともに、一緒に低減または上昇させてもよい。したがって、各流れに関して一定
の直径および濃度を保持して、複合核酸流の線速度は３．４メートル／秒へ、脂質流の線
速度は１．７メートル／秒へ低減されてもよい。他の実施形態では、複合核酸流の線速度
は約３メートル／秒へ、脂質流の線速度は約１．５メートル／秒へ低減されてもよい。同
様に、複合核酸流の線速度は約１４メートル／秒へ、脂質流の線速度は約７メートル／秒
へ上昇されてもよい。一般的に、速度の上限範囲は、流れをポンピングするのに使用する
設備の機械的制限によってのみ対象となる。非常に高い流速／速度は、設備故障を引き起
こす背圧を生じ得る。概して、図２による複合核酸流の速度は、約３メートル／秒〜１秒
当たり約１４メートル、脂質流に関しては、約１．５〜約４．５メートル／秒の範囲であ
り得る。好ましくは、複合核酸流の速度は、約６〜８メートル／秒、脂質流に関しては、
約３〜約４メートル／秒である。ある特定の実施形態では、複合核酸流の複合速度は、約
６．８メートル／秒、脂質流に関しては、約３．４メートル／秒である。
本発明の幾つかの実施形態では、核酸および脂質の濃度はともに、一緒に低減または上
昇させてもよい。例えば、より効率的なプロセスのために可能な限り高い濃度を保持する
ことが一般的に望ましいが、核酸の濃度を約０．０４５ｍｇ／ｍＬへ、および脂質の濃度
を約１．６７ｍｇ／ｍＬへ低減させることが可能である。しかしながら、さらに低い濃度
では、粒子凝集が増加する傾向にある。
昇させてもよい。例えば、より効率的なプロセスのために可能な限り高い濃度を保持する
ことが一般的に望ましいが、核酸の濃度を約０．０４５ｍｇ／ｍＬへ、および脂質の濃度
を約１．６７ｍｇ／ｍＬへ低減させることが可能である。しかしながら、さらに低い濃度
では、粒子凝集が増加する傾向にある。
図２によるある特定の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０
．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１０〜
約２５ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は
、約０．２〜約０．９ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約
１５〜約２０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の
濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、または０．４５〜約０．６７５ｍｇ／ｍＬで
あり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６〜１８ｍｇ／ｍＬである。他の
実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．
３３、０．４５または０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の
濃度は、約１６．７ｍｇ／ｍＬである。概して、より高い核酸濃度は、好ましい範囲（例
えば、約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬ）で第１の出口流６０中の核酸濃度を維持するた
めに、相応して増加されるレベルの希釈流５０からの希釈を要する。
．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１０〜
約２５ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は
、約０．２〜約０．９ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約
１５〜約２０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の
濃度は、約０．２２５、０．３、０．３３、または０．４５〜約０．６７５ｍｇ／ｍＬで
あり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度は、約１６〜１８ｍｇ／ｍＬである。他の
実施形態では、１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度は、約０．２２５、０．３、０．
３３、０．４５または０．６７５ｍｇ／ｍＬであり、１つまたは複数の脂質流中の脂質の
濃度は、約１６．７ｍｇ／ｍＬである。概して、より高い核酸濃度は、好ましい範囲（例
えば、約０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬ）で第１の出口流６０中の核酸濃度を維持するた
めに、相応して増加されるレベルの希釈流５０からの希釈を要する。
他の実施形態では、図２におけるＴ接合部５４は、２つの希釈流５０ａおよび５０ｂが
、合流した流れ（例えば、流れ４０）と交差し得るように、十字５４ａで置き換えてもよ
い（図２ａ）。希釈流５０ａおよび５０ｂは、十字５４ａの通路５２ａおよび通路５２ｂ
を通って入る。単一希釈流ではなく、２つの希釈流を使用することで、合流した流れ４０
のより大きな希釈倍数が可能となる。第１の出口流６０の得られたより大きな希釈は、い
くらか小さな粒径を提供し得る。例えば、図２に関連した上述の核酸流／脂質流の流速お
よび速度を使用するが、図２ａ由来の十字５４ａを代用することで、希釈溶媒の容量を２
倍にすることができる。第１の合流した流れ４０の得られたより大きな希釈は、より低濃
度の脂質流由来の有機溶媒（例えば、エタノール）を有する第１の出口流６０を生じる。
例えば、十字５４ａを使用して、第１の出口溶液中の有機溶媒濃度は、約２０％に低減さ
れ得る。他の点で、核酸濃度、脂質濃度、流速、速度等は、図２に関連して上述するのと
同じ十字５４ａを使用して変動させてもよい。
、合流した流れ（例えば、流れ４０）と交差し得るように、十字５４ａで置き換えてもよ
い（図２ａ）。希釈流５０ａおよび５０ｂは、十字５４ａの通路５２ａおよび通路５２ｂ
を通って入る。単一希釈流ではなく、２つの希釈流を使用することで、合流した流れ４０
のより大きな希釈倍数が可能となる。第１の出口流６０の得られたより大きな希釈は、い
くらか小さな粒径を提供し得る。例えば、図２に関連した上述の核酸流／脂質流の流速お
よび速度を使用するが、図２ａ由来の十字５４ａを代用することで、希釈溶媒の容量を２
倍にすることができる。第１の合流した流れ４０の得られたより大きな希釈は、より低濃
度の脂質流由来の有機溶媒（例えば、エタノール）を有する第１の出口流６０を生じる。
例えば、十字５４ａを使用して、第１の出口溶液中の有機溶媒濃度は、約２０％に低減さ
れ得る。他の点で、核酸濃度、脂質濃度、流速、速度等は、図２に関連して上述するのと
同じ十字５４ａを使用して変動させてもよい。
あるいは、上述の実施形態のいずれか由来の合流した流れは、希釈流５０、５０ａ、ま
たは５０ｂにより供給されるものと等しい容量の希釈溶媒を含有する希釈プール中で単に
希釈されてもよい。
たは５０ｂにより供給されるものと等しい容量の希釈溶媒を含有する希釈プール中で単に
希釈されてもよい。
代替的な実施形態では、図２における十字１６は、図３ａに示すように、Ｔ形状のチャ
ンバー８６で置き換えてもよい。チャンバー８６を使用したプロセスは、１つの核酸流８
０および１つの脂質流９０に関して、２つの流入通路８２および９２を有する。混合チャ
ンバー８６を使用したプロセスでは、核酸流および脂質流は、互いに対して約１８０°の
反対方向の流動を有する。チャンバー８６を使用して、２つの核酸流を利用する十字１６
を使用して達成され得る脂質：核酸の同じ比を維持するために、単一の核酸流の流速およ
び速度は、脂質流の流速および速度の２倍となり得る。例えば、Ｔチャンバー８６（例え
ば、０．５ｍｍ直径の通路８２および９２）を使用した一実施形態では、約０．４５ｍｇ
／ｍＬの核酸を有する核酸流は、約８０ｍＬ／分の流速および６．８メートル／秒の線速
度を有してもよく、脂質流は、約１６．７ｍｇ／ｍＬの濃度および３．４メートル／秒の
線速度を有し得る。チャンバー８６を使用したプロセスにおいて、４０ｍＬ／分の流速で
図２に示すような希釈流５０を用いることで、約２５％の第１の出口溶液中の有機溶媒の
濃度をもたらす。驚くべきことに、小さな粒径および一様性の同じ有益な特性が、十字１
６を使用して得ることができるように、Ｔチャンバー８６を使用して得られ得る。Ｔチャ
ンバー８６を使用することは、図２における個々の核酸流の流速と比較して、核酸流の流
速を２倍にする点が異なる。全体的な核酸流の流速は、両方のプロセスに関して依然とし
て同じであり、したがって、実質的に等価な特性を有するナノ粒子を生じる。
ンバー８６で置き換えてもよい。チャンバー８６を使用したプロセスは、１つの核酸流８
０および１つの脂質流９０に関して、２つの流入通路８２および９２を有する。混合チャ
ンバー８６を使用したプロセスでは、核酸流および脂質流は、互いに対して約１８０°の
反対方向の流動を有する。チャンバー８６を使用して、２つの核酸流を利用する十字１６
を使用して達成され得る脂質：核酸の同じ比を維持するために、単一の核酸流の流速およ
び速度は、脂質流の流速および速度の２倍となり得る。例えば、Ｔチャンバー８６（例え
ば、０．５ｍｍ直径の通路８２および９２）を使用した一実施形態では、約０．４５ｍｇ
／ｍＬの核酸を有する核酸流は、約８０ｍＬ／分の流速および６．８メートル／秒の線速
度を有してもよく、脂質流は、約１６．７ｍｇ／ｍＬの濃度および３．４メートル／秒の
線速度を有し得る。チャンバー８６を使用したプロセスにおいて、４０ｍＬ／分の流速で
図２に示すような希釈流５０を用いることで、約２５％の第１の出口溶液中の有機溶媒の
濃度をもたらす。驚くべきことに、小さな粒径および一様性の同じ有益な特性が、十字１
６を使用して得ることができるように、Ｔチャンバー８６を使用して得られ得る。Ｔチャ
ンバー８６を使用することは、図２における個々の核酸流の流速と比較して、核酸流の流
速を２倍にする点が異なる。全体的な核酸流の流速は、両方のプロセスに関して依然とし
て同じであり、したがって、実質的に等価な特性を有するナノ粒子を生じる。
Ｔチャンバー８６および希釈流５０を使用したある特定の実施形態では、核酸流８０は
、約３〜約８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約１．５〜約４．
５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出
口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質
量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度
は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．
５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
、約３〜約８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約１．５〜約４．
５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出
口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質
量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度
は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．
５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
Ｔチャンバー８６および希釈流５０を使用した他の実施形態では、核酸流８０は、約６
〜約８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線
速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機
溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５
〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２
５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、
出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
〜約８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メートルの線
速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機
溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１５
〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０〜２
５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１であり、
出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
Ｔチャンバー８６および希釈流５０を使用した一実施形態では、核酸流８０は、約６．
８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を
有し、流れ８０は、流れ９０および希釈流５０の２倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：
核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２
５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他
の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
８メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線速度を
有し、流れ８０は、流れ９０および希釈流５０の２倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：
核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２
５％である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他
の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用したある特定の実施形態では、核酸流８
０は、約８〜約１４メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約１．５〜
約４．５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であ
り、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核
酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒
の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約
１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％または２５％である。
０は、約８〜約１４メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約１．５〜
約４．５メートルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であ
り、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核
酸の質量比は、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒
の濃度は、約２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約
１８．５：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％または２５％である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した他の実施形態では、核酸流８０は、
約９〜約１１メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メート
ルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中
の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、
約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２
０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１で
あり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
約９〜約１１メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メート
ルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中
の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、
約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２
０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１で
あり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した一実施形態では、核酸流８０は、約
１０．２メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線
速度を有し、流れ８０は、流れ９０の３倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量
による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である
。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実
施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
１０．２メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線
速度を有し、流れ８０は、流れ９０の３倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量
による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２５％である
。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実
施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した他の実施形態では、核酸流８０は、
約１１〜約１４メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メー
トルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液
中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は
、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約
２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１
であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％である。
約１１〜約１４メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３〜約４メー
トルの線速度を有し、脂質：核酸の質量による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液
中の有機溶媒の濃度は、３３％未満である。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は
、約１５〜２０：１または約１７〜１９：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約
２０〜２５％である。他の特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１
であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％である。
希釈流５０を有さずにＴチャンバー８６を使用した一実施形態では、核酸流８０は、約
１３．６メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線
速度を有し、流れ８０は、流れ９０の４倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量
による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％である
。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実
施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
１３．６メートル／秒の線速度を有し、脂質流９０は、１秒当たり約３．４メートルの線
速度を有し、流れ８０は、流れ９０の４倍の流速（ｍＬ／分）を有し、脂質：核酸の質量
による比は、約１５〜２０：１であり、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％である
。特定の実施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１７〜１９：１である。他の特定の実
施形態では、脂質：核酸の質量比は、約１８．５：１である。
図２に関連して上記で論述するように、核酸流８０および脂質流９０の規模、濃度、流
速、および線速度は同様に、Ｔチャンバー８６を使用して変化させてもよい。特に、図２
に関連して上述する核酸濃度、脂質濃度、およびエタノール濃度はまた、Ｔチャンバー８
６を用いた本発明の実施形態にも当てはまる。１つの例示的な実施形態では、核酸の同じ
全体的な送達（約３６ｍｇ／分）を維持するために、核酸濃度を、３分の１に（例えば、
０．４５から０．３ｍｇ／ｍＬへ）低減させてもよく、核酸流の流速を、５０％（例えば
、８０ｍＬ／分から１２０ｍＬ／分へ）増加させてもよい。線速度は同様に、約１０．２
メートル／秒へ増加される。核酸流のより大きな希釈のため、出口溶液中の約２５％の有
機溶媒の濃度は、補足的な希釈流を使用することなく得られ得る。核酸流の流速を１６０
ｍＬ／分（０．５ｍｍの流に関して速度１３．６メートル／秒）へさらに増加させること
により、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％へ低減される。この後者のプロセスで
は、粒径および一様性の著しい変化を伴わずに、核酸流の速度は、約６．８メートル／秒
へ低減されてもよく、脂質流の速度は、約１．７メートル／秒へ低減されてもよい。
速、および線速度は同様に、Ｔチャンバー８６を使用して変化させてもよい。特に、図２
に関連して上述する核酸濃度、脂質濃度、およびエタノール濃度はまた、Ｔチャンバー８
６を用いた本発明の実施形態にも当てはまる。１つの例示的な実施形態では、核酸の同じ
全体的な送達（約３６ｍｇ／分）を維持するために、核酸濃度を、３分の１に（例えば、
０．４５から０．３ｍｇ／ｍＬへ）低減させてもよく、核酸流の流速を、５０％（例えば
、８０ｍＬ／分から１２０ｍＬ／分へ）増加させてもよい。線速度は同様に、約１０．２
メートル／秒へ増加される。核酸流のより大きな希釈のため、出口溶液中の約２５％の有
機溶媒の濃度は、補足的な希釈流を使用することなく得られ得る。核酸流の流速を１６０
ｍＬ／分（０．５ｍｍの流に関して速度１３．６メートル／秒）へさらに増加させること
により、出口溶液中の有機溶媒の濃度は、約２０％へ低減される。この後者のプロセスで
は、粒径および一様性の著しい変化を伴わずに、核酸流の速度は、約６．８メートル／秒
へ低減されてもよく、脂質流の速度は、約１．７メートル／秒へ低減されてもよい。
図２および図３における、および上記で一般的に記載する様々な核酸、脂質、および希
釈流は、直角または正面のいずれかで交差するが、これらの角度は重要ではない。例えば
、図３におけるＴチャンバー８６は、Ｙ形状チャンバー８４により置き換えてもよい（図
３ｂ）。あるいは、Ｔチャンバーの方向付けは、チャンバー９４で示されるように回転さ
せてもよい（図３ｃ）。図３ｃは、脂質流９０の前方向の流動と交差する核酸流８０を示
すが、核酸および脂質流の位置は、図３ｃで入れ替えてもよい。
釈流は、直角または正面のいずれかで交差するが、これらの角度は重要ではない。例えば
、図３におけるＴチャンバー８６は、Ｙ形状チャンバー８４により置き換えてもよい（図
３ｂ）。あるいは、Ｔチャンバーの方向付けは、チャンバー９４で示されるように回転さ
せてもよい（図３ｃ）。図３ｃは、脂質流９０の前方向の流動と交差する核酸流８０を示
すが、核酸および脂質流の位置は、図３ｃで入れ替えてもよい。
さらなる他の実施形態では、濃度および流速の適した調節で、核酸および脂質流の数を
さらに変化させてもよい。例えば、適切な設備を用いて、２、３、または４つの脂質流を
、１、２、３または４つの核酸流と合流させてもよい。
さらに変化させてもよい。例えば、適切な設備を用いて、２、３、または４つの脂質流を
、１、２、３または４つの核酸流と合流させてもよい。
本明細書中に記載する本発明のプロセスは、高い割合の核酸封入を提供する。概して、
封入の割合は、７０％を上回る。本発明の幾つかの実施形態では、７５％またはそれ以上
の核酸が封入される。他の実施形態では、８０％または８５％の核酸が封入される。さら
なる他の実施形態では、９０％またはそれ以上の核酸が封入される。他の実施形態では、
約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約
１００の核酸が封入される。
封入の割合は、７０％を上回る。本発明の幾つかの実施形態では、７５％またはそれ以上
の核酸が封入される。他の実施形態では、８０％または８５％の核酸が封入される。さら
なる他の実施形態では、９０％またはそれ以上の核酸が封入される。他の実施形態では、
約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約
１００の核酸が封入される。
本明細書中に記載するような被封入核酸ナノ粒子の形成後に、第１の出口溶液を、室温
で約６０分間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、溶液を第２の希釈溶媒
と混合して、第１の出口溶液を約２倍希釈して、第２の出口溶液を供給してもよい。第２
の希釈溶媒は、第３の緩衝溶液または水であり得る。希釈ステップは、図３ａにおけるＴ
チャンバー８６のようなＴコネクター中で、インキュベートした第１の出口溶液を、第２
の希釈溶媒（水）と混合することにより実施され得る。インキュベートした第１の出口溶
液および第２の希釈溶媒は、例えば約０．５〜１メートル／秒などの任意の適切な流速ま
たは速度で、Ｔコネクターへ供給され得る。希釈ステップ後に、第２の出口溶液中の有機
溶媒の濃度は、第１の出口溶液に対して、半分低減される。したがって、幾つかの実施形
態では、第２の出口溶液中の有機溶媒（例えば、エタノール）の濃度は、１６．５％未満
である。他の実施形態では、第２の出口溶液中の有機溶媒（例えば、エタノール）の濃度
は、約１０〜１５％、約１０〜１２．５％、約１２．５％、または約１０％である。第２
の出口溶液は、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮されて、リン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた１５Ｘダイアフィルトレーションに付して、出発緩衝液
およびエタノールを除去してもよく、出発緩衝液およびエタノールは、ＰＢＳで置き換え
られる。タンジェンシャルフローフィルトレーション後、以下の実施例でより詳細に記載
するように、ＰＢＳ中の濃縮された被封入核酸ナノ粒子のプールを収集して、滅菌ろ過し
てもよい。上述のさらなるプロセスステップにより生産される配合物中に存在する被封入
核酸ナノ粒子は、４℃で６カ月間を上回って安定に保存され得る。
で約６０分間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、溶液を第２の希釈溶媒
と混合して、第１の出口溶液を約２倍希釈して、第２の出口溶液を供給してもよい。第２
の希釈溶媒は、第３の緩衝溶液または水であり得る。希釈ステップは、図３ａにおけるＴ
チャンバー８６のようなＴコネクター中で、インキュベートした第１の出口溶液を、第２
の希釈溶媒（水）と混合することにより実施され得る。インキュベートした第１の出口溶
液および第２の希釈溶媒は、例えば約０．５〜１メートル／秒などの任意の適切な流速ま
たは速度で、Ｔコネクターへ供給され得る。希釈ステップ後に、第２の出口溶液中の有機
溶媒の濃度は、第１の出口溶液に対して、半分低減される。したがって、幾つかの実施形
態では、第２の出口溶液中の有機溶媒（例えば、エタノール）の濃度は、１６．５％未満
である。他の実施形態では、第２の出口溶液中の有機溶媒（例えば、エタノール）の濃度
は、約１０〜１５％、約１０〜１２．５％、約１２．５％、または約１０％である。第２
の出口溶液は、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮されて、リン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた１５Ｘダイアフィルトレーションに付して、出発緩衝液
およびエタノールを除去してもよく、出発緩衝液およびエタノールは、ＰＢＳで置き換え
られる。タンジェンシャルフローフィルトレーション後、以下の実施例でより詳細に記載
するように、ＰＢＳ中の濃縮された被封入核酸ナノ粒子のプールを収集して、滅菌ろ過し
てもよい。上述のさらなるプロセスステップにより生産される配合物中に存在する被封入
核酸ナノ粒子は、４℃で６カ月間を上回って安定に保存され得る。
本明細書中に開示する実施形態それぞれによれば、核酸がｓｉＲＮＡであるさらなる実
施形態が存在する。例えば、本明細書中に記載する実施形態によれば、核酸流が、緩衝溶
液中に１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子の混合物を含み、かつ本明細書中に開示する線速
度を有するｓｉＲＮＡ流であるさらなる実施形態が存在する。
施形態が存在する。例えば、本明細書中に記載する実施形態によれば、核酸流が、緩衝溶
液中に１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子の混合物を含み、かつ本明細書中に開示する線速
度を有するｓｉＲＮＡ流であるさらなる実施形態が存在する。
６．０ プロセス実施例
６．１ ｓｉＲＮＡ脂質配合物
被封入ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子は、図２〜図３ｂで一般に示され、また上記で一般的に
記載されるシステムおよび装置により、エタノール中に溶解した脂質の溶液を、クエン酸
緩衝液中に溶解したｓｉＲＮＡと混合することにより形成した。内径０．５、１．０、ま
たは２．０ｍｍを有する通路を有する混合チャンバーを使用した。プロセシングチャンバ
ーは、５０ｍｍ〜１０００ｍｍの長さを有していた。希釈チャンバーは、約０．５または
１．０または２．０または４．０ｍｍの混合チャンバーの内径に等しいか、またはその少
なくとも２倍の内径を有する通路を有していた。脂質溶液は、陽イオン性脂質、ヘルパー
脂質（コレステロール）、中性脂質（ＤＳＰＣ）およびステルス脂質を含有していた。
６．１ ｓｉＲＮＡ脂質配合物
被封入ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子は、図２〜図３ｂで一般に示され、また上記で一般的に
記載されるシステムおよび装置により、エタノール中に溶解した脂質の溶液を、クエン酸
緩衝液中に溶解したｓｉＲＮＡと混合することにより形成した。内径０．５、１．０、ま
たは２．０ｍｍを有する通路を有する混合チャンバーを使用した。プロセシングチャンバ
ーは、５０ｍｍ〜１０００ｍｍの長さを有していた。希釈チャンバーは、約０．５または
１．０または２．０または４．０ｍｍの混合チャンバーの内径に等しいか、またはその少
なくとも２倍の内径を有する通路を有していた。脂質溶液は、陽イオン性脂質、ヘルパー
脂質（コレステロール）、中性脂質（ＤＳＰＣ）およびステルス脂質を含有していた。
総脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬまたは２５ｍｇ／ｍＬのいずれかであった。これ
らの実験に関する総脂質対ｓｉＲＮＡの比は、約１８．３：１であった。ｓｉＲＮＡ溶液
の濃度は、ｐＨ５を有するクエン酸ナトリウム：塩化ナトリウム緩衝液中で０．２２５、
０．３、０．３３７５、または０．４５ｍｇ／ｍＬであった。ＮａＣｌの濃度は、５０ｍ
Ｍ、６６ｍＭ、７５ｍＭ、または１００ｍＭであった。流速および線速度は、以下に記載
するように変動させた。
らの実験に関する総脂質対ｓｉＲＮＡの比は、約１８．３：１であった。ｓｉＲＮＡ溶液
の濃度は、ｐＨ５を有するクエン酸ナトリウム：塩化ナトリウム緩衝液中で０．２２５、
０．３、０．３３７５、または０．４５ｍｇ／ｍＬであった。ＮａＣｌの濃度は、５０ｍ
Ｍ、６６ｍＭ、７５ｍＭ、または１００ｍＭであった。流速および線速度は、以下に記載
するように変動させた。
ｓｉＲＮＡ封入実験に関して、使用する陽イオン性脂質およびステルス脂質（即ち、Ｐ
ＥＧ脂質）を以下の表に示す。
ＥＧ脂質）を以下の表に示す。
これらの実験に使用したｓｉＲＮＡは、以下の表に示すような配列および配列番号を有
していた。
していた。
６．２ プロセス実施例１ ｓｉＲＮＡの封入
６．２．１ エタノール中の脂質混合物の調製
下記は、陽イオン性脂質アミン対ｓｉＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比４．５：１で封入
されるｓｉＲＮＡの例である。表４に示す量の脂質（陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレス
テロールおよび脂質付加されたＰＥＧ）を、エタノール１５０ｍＬ中に溶解する。脂質の
モル比は、それぞれ４５：９：４４：２である。混合物を短期間超音波処理した後、５分
間穏やかに攪拌して、続いて使用するまで３７℃で維持する。
６．２．１ エタノール中の脂質混合物の調製
下記は、陽イオン性脂質アミン対ｓｉＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比４．５：１で封入
されるｓｉＲＮＡの例である。表４に示す量の脂質（陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレス
テロールおよび脂質付加されたＰＥＧ）を、エタノール１５０ｍＬ中に溶解する。脂質の
モル比は、それぞれ４５：９：４４：２である。混合物を短期間超音波処理した後、５分
間穏やかに攪拌して、続いて使用するまで３７℃で維持する。
６．２．２ クエン酸緩衝液中のｓｉＲＮＡ配列番号１の調製
ｓｉＲＮＡ流用の緩衝液は、ｐＨ５の１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭクエン
酸ナトリウムである。まず、クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ５．００であることを確認する
。そうでない場合は、加工処理前に、ｐＨを調製する。封入用の水中の十分なｓｉＲＮＡ
を、−８０℃の保存から解凍させる。ｓｉＲＮＡ配列番号１をクエン酸緩衝溶液へ添加し
て、溶解したｓｉＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計で２６０ｎｍにて、光学密度により測
定する。ｓｉＲＮＡの最終濃度を、滅菌ＰＥＴＧボトルにおいてクエン酸緩衝液１５０ｍ
ｌ中で０．４５ｍｇ／ｍｌへ調節して、使用するまで室温で保持する。
ｓｉＲＮＡ流用の緩衝液は、ｐＨ５の１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭクエン
酸ナトリウムである。まず、クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ５．００であることを確認する
。そうでない場合は、加工処理前に、ｐＨを調製する。封入用の水中の十分なｓｉＲＮＡ
を、−８０℃の保存から解凍させる。ｓｉＲＮＡ配列番号１をクエン酸緩衝溶液へ添加し
て、溶解したｓｉＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計で２６０ｎｍにて、光学密度により測
定する。ｓｉＲＮＡの最終濃度を、滅菌ＰＥＴＧボトルにおいてクエン酸緩衝液１５０ｍ
ｌ中で０．４５ｍｇ／ｍｌへ調節して、使用するまで室温で保持する。
６．２．３ 脂質ナノ粒子中のｓｉＲＮＡの封入
ｓｉＲＮＡ封入は、図２に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌シリン
ジに、等量（２５ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸緩衝液中の
ｓｉＲＮＡ（シリンジ（ｂ１）および（ｂ２））、および水単独（シリンジ（ｃ））を充
填する。１６．７ｍｇ／ｍＬの脂質を含有するシリンジ（ａ）上のルアーフィッティング
から通じるチューブを、内径０．５ｍｍを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。０
．４５ｍｇ／ｍｌでｓｉＲＮＡを含有するシリンジ（ｂ１）および（ｂ２）上のルアーフ
ィッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、
内径１．５５ｍｍを有するフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）チューブである。シリ
ンジ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２）を、シリンジポンプＡ上に設置する。脂質入力の反
対側の十字の中央入力からつながるチューブを、内径１ｍｍを有するＴ接合部へ取り付け
る（例えば、図２、Ｔ接合部５４を参照）。水単独を含有するシリンジ（ｃ）上のルアー
フィッティングから通じるチューブを、Ｔ接合部へ取り付けて、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子
のインライン希釈を可能にして、シリンジ（ｃ）を、シリンジポンプＢ上に設置する。Ｔ
接合部からの出力ラインを、希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の収集用の滅菌ＰＥＴＧボ
トルより上に位置させる。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認
することが重要である。シリンジポンプを、適したシリンジ製造業者（syringe manufact
urer）およびサイズおよび１分当たり４０ｍｌの流速に設定する。両方のポンプを同時に
始動させて、およそ０．５秒後に材料を収集し始める。被封入ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子お
よそ９０ｍｌを収集して、それは、２５容量％のエタノール、０．２３ｍｇ／ｍＬのｓｉ
ＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｍＬの脂質、および５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する。６０分後、混
合インキュベーション期間後に、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して、粒径
を決定する。
ｓｉＲＮＡ封入は、図２に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌シリン
ジに、等量（２５ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸緩衝液中の
ｓｉＲＮＡ（シリンジ（ｂ１）および（ｂ２））、および水単独（シリンジ（ｃ））を充
填する。１６．７ｍｇ／ｍＬの脂質を含有するシリンジ（ａ）上のルアーフィッティング
から通じるチューブを、内径０．５ｍｍを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。０
．４５ｍｇ／ｍｌでｓｉＲＮＡを含有するシリンジ（ｂ１）および（ｂ２）上のルアーフ
ィッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、
内径１．５５ｍｍを有するフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）チューブである。シリ
ンジ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２）を、シリンジポンプＡ上に設置する。脂質入力の反
対側の十字の中央入力からつながるチューブを、内径１ｍｍを有するＴ接合部へ取り付け
る（例えば、図２、Ｔ接合部５４を参照）。水単独を含有するシリンジ（ｃ）上のルアー
フィッティングから通じるチューブを、Ｔ接合部へ取り付けて、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子
のインライン希釈を可能にして、シリンジ（ｃ）を、シリンジポンプＢ上に設置する。Ｔ
接合部からの出力ラインを、希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の収集用の滅菌ＰＥＴＧボ
トルより上に位置させる。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認
することが重要である。シリンジポンプを、適したシリンジ製造業者（syringe manufact
urer）およびサイズおよび１分当たり４０ｍｌの流速に設定する。両方のポンプを同時に
始動させて、およそ０．５秒後に材料を収集し始める。被封入ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子お
よそ９０ｍｌを収集して、それは、２５容量％のエタノール、０．２３ｍｇ／ｍＬのｓｉ
ＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｍＬの脂質、および５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する。６０分後、混
合インキュベーション期間後に、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して、粒径
を決定する。
６．２．４ ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の希釈
内径１．０ｍｍのＴ接合部を、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液のさらなる希釈用に設定
する。この希釈ステップは、１つのシリンジポンプ上で２つのシリンジを用いて実行する
。１つの１４０ｍＬのシリンジは、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を含有し、第２の１４０ｍＬ
のシリンジは、水を含有する。流速は、１分当たり２５ｍｌに設定する。ｓｉＲＮＡ流お
よび水流は、互いに１８０度でＴ接合部に入る。希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液
を、滅菌ＰＥＴＧボトルへ収集する。最終容量は、およそ２８０ｍｌであり、エタノール
濃度１２．５％を有する。
内径１．０ｍｍのＴ接合部を、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液のさらなる希釈用に設定
する。この希釈ステップは、１つのシリンジポンプ上で２つのシリンジを用いて実行する
。１つの１４０ｍＬのシリンジは、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を含有し、第２の１４０ｍＬ
のシリンジは、水を含有する。流速は、１分当たり２５ｍｌに設定する。ｓｉＲＮＡ流お
よび水流は、互いに１８０度でＴ接合部に入る。希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液
を、滅菌ＰＥＴＧボトルへ収集する。最終容量は、およそ２８０ｍｌであり、エタノール
濃度１２．５％を有する。
６．２．５ タンジェンシャルフローフィルトレーションによるｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子
の透析および濃縮
封入の実行におけるあらゆる５０ｍｇのｓｉＲＮＡに関しては、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５
０カートリッジを使用する。１００ｍｇのｓｉＲＮＡ封入の実行に関しては、直列に取り
付けた２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカ
ートリッジをすすいで、製造業者からの任意の保存溶液を除去しなくてはならない。これ
は、空のＴＦＦリザーバにＤＩ水５００ｍｌを注ぐことにより行われ、流速１１５ｍｌ／
分でぜん動ポンプにより再循環させる。透過物（permeate）は制限されるべきではなく、
水５００ｍｌ全体を膜に通して流したら、すすぎプロセスは、完了である。
の透析および濃縮
封入の実行におけるあらゆる５０ｍｇのｓｉＲＮＡに関しては、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５
０カートリッジを使用する。１００ｍｇのｓｉＲＮＡ封入の実行に関しては、直列に取り
付けた２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカ
ートリッジをすすいで、製造業者からの任意の保存溶液を除去しなくてはならない。これ
は、空のＴＦＦリザーバにＤＩ水５００ｍｌを注ぐことにより行われ、流速１１５ｍｌ／
分でぜん動ポンプにより再循環させる。透過物（permeate）は制限されるべきではなく、
水５００ｍｌ全体を膜に通して流したら、すすぎプロセスは、完了である。
ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦリザーバへ充填する。全
体的な圧力２０〜２５ｐｓｉを維持しながら、混合物を濃縮する。ろ液は、濃縮ステップ
全体にわたって、１分当たりおよそ４ｍｌで溶出されるべきである。この速度は、適正な
流速が達成されるまで、ピンチ弁で透過物ラインを制限することにより達成される。リザ
ーバ中の液体レベルが、目盛り１５ｍｌになるまで濃縮する。濃縮したｓｉＲＮＡ脂質ナ
ノ粒子懸濁液を、発熱物質を含まず、ヌクレアーゼを含まない１×ＰＢＳ ２２５ｍｌに
対してダイアフィルトレーションする（Diafilter）。流速を８０ｍｌ／分に増加する。
ダイアフィルトレーション後、ＴＦＦシステムのホールドアップ容量へ、材料の濃縮を再
開する。ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液をリザーバから収集する。さらに２ｍｌの１×Ｐ
ＢＳでＴＦＦシステムをすすいで、希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこ
の洗浄液を収集することが可能であるが、この洗浄液は、濃縮したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒
子懸濁液とは別個に収集されるべきである。分析するまで材料を４℃で保存する。
体的な圧力２０〜２５ｐｓｉを維持しながら、混合物を濃縮する。ろ液は、濃縮ステップ
全体にわたって、１分当たりおよそ４ｍｌで溶出されるべきである。この速度は、適正な
流速が達成されるまで、ピンチ弁で透過物ラインを制限することにより達成される。リザ
ーバ中の液体レベルが、目盛り１５ｍｌになるまで濃縮する。濃縮したｓｉＲＮＡ脂質ナ
ノ粒子懸濁液を、発熱物質を含まず、ヌクレアーゼを含まない１×ＰＢＳ ２２５ｍｌに
対してダイアフィルトレーションする（Diafilter）。流速を８０ｍｌ／分に増加する。
ダイアフィルトレーション後、ＴＦＦシステムのホールドアップ容量へ、材料の濃縮を再
開する。ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液をリザーバから収集する。さらに２ｍｌの１×Ｐ
ＢＳでＴＦＦシステムをすすいで、希釈したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこ
の洗浄液を収集することが可能であるが、この洗浄液は、濃縮したｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒
子懸濁液とは別個に収集されるべきである。分析するまで材料を４℃で保存する。
６．２．６ 滅菌ろ過ステップ
５０℃で１０分間予熱したアルミニウム蓄熱ヒーターに配置されるガラスバイアル中の
懸濁液およそ１０ｍｌを加熱することにより、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子をろ過する。次に
、バイアルを取り出して、溶液をシリンジで取り出して、滅菌バイアルへ直接、０．２２
μｍのＰＥＳシリンジフィルターに通してろ過する。この最終的な生成物を４℃で保存す
る。
５０℃で１０分間予熱したアルミニウム蓄熱ヒーターに配置されるガラスバイアル中の
懸濁液およそ１０ｍｌを加熱することにより、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子をろ過する。次に
、バイアルを取り出して、溶液をシリンジで取り出して、滅菌バイアルへ直接、０．２２
μｍのＰＥＳシリンジフィルターに通してろ過する。この最終的な生成物を４℃で保存す
る。
６．２．７ 封入パーセントの決定（ＳＹＢＲ ＧＯＬＤ）
脂質ナノ粒子へのｓｉＲＮＡ配合の効率を決定するために、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ蛍光を
測定することにより、ｓｉＲＮＡの封入パーセントを決定することができる。ｓｉＲＮＡ
に結合されると、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは蛍光を発する。ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ蛍光の強度は
、ｓｉＲＮＡの量に比例する。
脂質ナノ粒子へのｓｉＲＮＡ配合の効率を決定するために、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ蛍光を
測定することにより、ｓｉＲＮＡの封入パーセントを決定することができる。ｓｉＲＮＡ
に結合されると、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは蛍光を発する。ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ蛍光の強度は
、ｓｉＲＮＡの量に比例する。
およそ０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡストックの標準溶液をＰＢＳ中に調製する。ｓｉ
ＲＮＡストックの濃度は、ＵＶ測定により検証される。ｓｉＲＮＡストックを、ＰＢＳで
８μｇ／ｍＬへ希釈する。段階希釈を行って、４、２、１、０．５および０．２５μｇ／
ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を調製する。等量の８μｇ／ｍＬおよび４μｇ／ｍＬの溶液を混合
することにより、６μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを調製する。
ＲＮＡストックの濃度は、ＵＶ測定により検証される。ｓｉＲＮＡストックを、ＰＢＳで
８μｇ／ｍＬへ希釈する。段階希釈を行って、４、２、１、０．５および０．２５μｇ／
ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を調製する。等量の８μｇ／ｍＬおよび４μｇ／ｍＬの溶液を混合
することにより、６μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを調製する。
試験試料を調製するために、ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液１０μＬを、ＰＢＳ ９９
０μＬで希釈する（これが、この段階で溶液Ａである）。注記：この第１の希釈ステップ
は、およそ３．６ｍｇ／ｍＬまたはそれ未満の予想ｓｉＲＮＡ濃度を有する配合物に当て
はまる。濃度がおよそ３．６ｍｇ／ｍＬよりも高い場合には、希釈はより大きくすべきで
ある。溶液Ａ ４０μＬを、ＰＢＳ １６０μＬで希釈する（これが、この段階で溶液１
である）。
０μＬで希釈する（これが、この段階で溶液Ａである）。注記：この第１の希釈ステップ
は、およそ３．６ｍｇ／ｍＬまたはそれ未満の予想ｓｉＲＮＡ濃度を有する配合物に当て
はまる。濃度がおよそ３．６ｍｇ／ｍＬよりも高い場合には、希釈はより大きくすべきで
ある。溶液Ａ ４０μＬを、ＰＢＳ １６０μＬで希釈する（これが、この段階で溶液１
である）。
配合物中の遊離のｓｉＲＮＡの測定に関して、ＰＢＳ中０．０２％ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ
の溶液を調製する（例えば、ＰＢＳ １５ｍＬ中ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ ３μＬ）（溶液２
）。９６ウェルの黒色の透明底プレートにおいて、溶液１ １０μＬを、溶液２ １９０
μＬと混合して、試料混合物１を供給する。このミックス中では、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは
、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡへのみ結合する。リポソーム中に封入さ
れたｓｉＲＮＡへ接近は見られない。
の溶液を調製する（例えば、ＰＢＳ １５ｍＬ中ｓｙｂｒ ｇｏｌｄ ３μＬ）（溶液２
）。９６ウェルの黒色の透明底プレートにおいて、溶液１ １０μＬを、溶液２ １９０
μＬと混合して、試料混合物１を供給する。このミックス中では、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは
、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡへのみ結合する。リポソーム中に封入さ
れたｓｉＲＮＡへ接近は見られない。
配合物中の総ｓｉＲＮＡの測定に関して、ＰＢＳ中０．０２％ｓｙｂｒ ｇｏｌｄおよ
び０．２％トリトン−ｘの溶液を調製する（例えば、ＰＢＳ中０．２％トリトン１５ｍＬ
中のｓｙｂｒ ｇｏｌｄ ３μＬ）。９６ウェルの黒色の透明底プレートにおいて、溶液
１ １０μＬを、溶液３ １９０μＬと混合して、試料混合物２を供給する。このミック
ス中では、トリトン−ｘは、リポソームを崩壊して、予め封入されたｓｉＲＮＡを、ｓｙ
ｂｒ ｇｏｌｄ結合へと露出させる。したがって、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは、封入されてい
ない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡ、および全ての新たに露出されたｓｉＲＮＡへ結合する
。遊離のｓｉＲＮＡ＋新たに露出されたｓｉＲＮＡ＝総ｓｉＲＮＡ。
び０．２％トリトン−ｘの溶液を調製する（例えば、ＰＢＳ中０．２％トリトン１５ｍＬ
中のｓｙｂｒ ｇｏｌｄ ３μＬ）。９６ウェルの黒色の透明底プレートにおいて、溶液
１ １０μＬを、溶液３ １９０μＬと混合して、試料混合物２を供給する。このミック
ス中では、トリトン−ｘは、リポソームを崩壊して、予め封入されたｓｉＲＮＡを、ｓｙ
ｂｒ ｇｏｌｄ結合へと露出させる。したがって、ｓｙｂｒ ｇｏｌｄは、封入されてい
ない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡ、および全ての新たに露出されたｓｉＲＮＡへ結合する
。遊離のｓｉＲＮＡ＋新たに露出されたｓｉＲＮＡ＝総ｓｉＲＮＡ。
上述の標準溶液（それぞれ１０μＬ）を、溶液２ １９０μＬと混合して、標準混合物
１を供給するか、または溶液３ １９０μＬと混合して、標準混合物２を供給する。
１を供給するか、または溶液３ １９０μＬと混合して、標準混合物２を供給する。
全てのミックスの蛍光を、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ５．２および下記パ
ラメーターを使用したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計で測定する：
λｅｘ＝４８５ｎｍ λｅｍ＝５３０ｎｍ
リードモード： 蛍光、トップリード
波長： Ｅｘ ４８５ｎｍ、Ｅｍ ５３０ｎｍ、オートカットオフ
オン ５３０ｎｍ
感度： 読取り６、ＰＭＴ：オート
オートミックス： 前：オフ
オートキャリブレート： オン
アッセイプレートタイプ： ９６ウェルｃｏｓｔａｒｂｌｋ／ｃｌｒｂｔｍ
読み取るべきウェル： プレート全体を読み取る
修正時間： オフ
カラム波長優先： カラム優先
キャリッジ速度： 標準
オートリード： オフ
ラメーターを使用したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計で測定する：
λｅｘ＝４８５ｎｍ λｅｍ＝５３０ｎｍ
リードモード： 蛍光、トップリード
波長： Ｅｘ ４８５ｎｍ、Ｅｍ ５３０ｎｍ、オートカットオフ
オン ５３０ｎｍ
感度： 読取り６、ＰＭＴ：オート
オートミックス： 前：オフ
オートキャリブレート： オン
アッセイプレートタイプ： ９６ウェルｃｏｓｔａｒｂｌｋ／ｃｌｒｂｔｍ
読み取るべきウェル： プレート全体を読み取る
修正時間： オフ
カラム波長優先： カラム優先
キャリッジ速度： 標準
オートリード： オフ
標準混合物１から得られる蛍光強度値を使用して、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線を
作成する。次に、試料１混合物の蛍光強度は、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線により提
供される方程式へ代入する。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナ
ノ粒子配合物中の遊離のｓｉＲＮＡを得る。
作成する。次に、試料１混合物の蛍光強度は、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線により提
供される方程式へ代入する。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナ
ノ粒子配合物中の遊離のｓｉＲＮＡを得る。
標準混合物２から得られる蛍光強度値を使用して、総ｓｉＲＮＡに関する検量線を作成
する。次に、試料２混合物の蛍光強度は、総ｓｉＲＮＡに関する検量線により提供される
方程式へ代入する。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配
合物中の総ｓｉＲＮＡを得る。
する。次に、試料２混合物の蛍光強度は、総ｓｉＲＮＡに関する検量線により提供される
方程式へ代入する。続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配
合物中の総ｓｉＲＮＡを得る。
被封入ｓｉＲＮＡは、式：［（総ｓｉＲＮＡ−遊離のｓｉＲＮＡ）／（総ｓｉＲＮＡ）
］×１００％により算出される。
］×１００％により算出される。
６．２．８ サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用した封入パーセントの決定
遊離のｓｉＲＮＡのサイズ（５ｎｍ）は、リポソームのサイズ（５０〜２００ｎｍ）と
異なるので、それらは、サイズ排除カラムでは異なる時間で溶出する。遊離のｓｉＲＮＡ
は、リポソーム後に溶出する。ｓｉＲＮＡに関する保持時間は、およそ１７分であるのに
対して、リポソームに関する保持時間は、およそ１０分である。溶出したｓｉＲＮＡの検
出は、２６０ｎｍで設定した吸収波長を有するＵＶ検出器によって実施する。
遊離のｓｉＲＮＡのサイズ（５ｎｍ）は、リポソームのサイズ（５０〜２００ｎｍ）と
異なるので、それらは、サイズ排除カラムでは異なる時間で溶出する。遊離のｓｉＲＮＡ
は、リポソーム後に溶出する。ｓｉＲＮＡに関する保持時間は、およそ１７分であるのに
対して、リポソームに関する保持時間は、およそ１０分である。溶出したｓｉＲＮＡの検
出は、２６０ｎｍで設定した吸収波長を有するＵＶ検出器によって実施する。
およそ０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡストックをＰＢＳ中に調製する。ストックの２０
０μＬ分取量へ、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ １０μＬを添加する。ｓｉＲＮＡストック
の濃度は、ＵＶ測定により検証される。段階希釈を行って、ｓｉＲＮＡストックの１／２
、１／４、１／８、１／１６および１／３２濃度で標準物質を調製する。ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００ １０μＬを、各標準物質２００μＬへ添加する。各標準物質の濃度は、ＵＶ
測定により検証される。
０μＬ分取量へ、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ １０μＬを添加する。ｓｉＲＮＡストック
の濃度は、ＵＶ測定により検証される。段階希釈を行って、ｓｉＲＮＡストックの１／２
、１／４、１／８、１／１６および１／３２濃度で標準物質を調製する。ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００ １０μＬを、各標準物質２００μＬへ添加する。各標準物質の濃度は、ＵＶ
測定により検証される。
ＨＰＬＣバイアル中で、脂質ナノ粒子配合物２５μＬを、１×ＰＢＳ（脱イオン水で１
０×ＰＢＳ（ＦＩＳＨＥＲ、ＢＰ３９９）を１×へ希釈）へ添加する。分散液を、均質に
なるまで穏やかにボルテックスする（分散液１）。別のＨＰＬＣバイアル中では、脂質ナ
ノ粒子配合物２５μＬを、２０％ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ １８５μＬへ添加する。分散液を、
透明かつ均質になるまで穏やかにボルテックスする（分散液２）。
０×ＰＢＳ（ＦＩＳＨＥＲ、ＢＰ３９９）を１×へ希釈）へ添加する。分散液を、均質に
なるまで穏やかにボルテックスする（分散液１）。別のＨＰＬＣバイアル中では、脂質ナ
ノ粒子配合物２５μＬを、２０％ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ １８５μＬへ添加する。分散液を、
透明かつ均質になるまで穏やかにボルテックスする（分散液２）。
サイズ排除クロマトグラフィーは、ＥＭＰＯＷＥＲ ＰＲＯソフトウェアを使用したＡ
ＧＩＬＥＮＴ １２００ ＨＰＬＣで実施する。パラメーターは、下記である：
カラム温度： ３０℃
移動相の流速 １ｍｌ／分で３０分間
ＵＶ検出器の波長： ２６０ｎｍ
注入容量： ２０μＬ
注入の数： ２
ＧＩＬＥＮＴ １２００ ＨＰＬＣで実施する。パラメーターは、下記である：
カラム温度： ３０℃
移動相の流速 １ｍｌ／分で３０分間
ＵＶ検出器の波長： ２６０ｎｍ
注入容量： ２０μＬ
注入の数： ２
標準物質および分散液２０μＬを、サイズ排除カラム上へ注入し、７．７に調製したｐ
Ｈを有する移動相１×ＰＢＳは、１ｍＬ／分で３０分間流動している。溶出した材料は、
吸収波長２６０ｎｍを有するＵＶ検出器により検出される。
Ｈを有する移動相１×ＰＢＳは、１ｍＬ／分で３０分間流動している。溶出した材料は、
吸収波長２６０ｎｍを有するＵＶ検出器により検出される。
ｓｉＲＮＡ標準物質から、およそ１７分のピークは、ｓｉＲＮＡを表す。分散液１から
、およそ１０分のピークは、被封入ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を表し、およそ１
７分のピークは、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡを表す。
、およそ１０分のピークは、被封入ｓｉＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を表し、およそ１
７分のピークは、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡを表す。
分散液２では、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘは、脂質ナノ粒子を崩壊して、予め封入されたｓｉＲ
ＮＡが、１７分ですでに遊離のｓｉＲＮＡと一緒に溶出することが可能となる。およそ１
０分のピークが消失し、クロマトグラム中に唯一のピーク、即ちおよそ１７分のピークが
残り、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡおよび新たに遊離のｓｉＲＮＡの両
方を表す。遊離のｓｉＲＮＡ＋新たに遊離のｓｉＲＮＡ＝総ｓｉＲＮＡ。
ＮＡが、１７分ですでに遊離のｓｉＲＮＡと一緒に溶出することが可能となる。およそ１
０分のピークが消失し、クロマトグラム中に唯一のピーク、即ちおよそ１７分のピークが
残り、封入されていない（即ち、遊離の）ｓｉＲＮＡおよび新たに遊離のｓｉＲＮＡの両
方を表す。遊離のｓｉＲＮＡ＋新たに遊離のｓｉＲＮＡ＝総ｓｉＲＮＡ。
ｓｉＲＮＡ標準物質から得られるピーク面積値を使用して、ｓｉＲＮＡ濃度検量線を作
成する。分散１におけるおよそ１７分のピークの積算面積を、遊離のｓｉＲＮＡに関する
検量線により提供される方程式へ代入して、分散液中の遊離のｓｉＲＮＡの濃度を得る。
続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の遊離のｓｉ
ＲＮＡを得る。
成する。分散１におけるおよそ１７分のピークの積算面積を、遊離のｓｉＲＮＡに関する
検量線により提供される方程式へ代入して、分散液中の遊離のｓｉＲＮＡの濃度を得る。
続いて、試料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の遊離のｓｉ
ＲＮＡを得る。
分散２におけるおよそ１７分のピークの積算面積を、遊離のｓｉＲＮＡに関する検量線
により提供される方程式へ代入して、分散液中の総ｓｉＲＮＡの濃度を得る。続いて、試
料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の総ｓｉＲＮＡを得る。
により提供される方程式へ代入して、分散液中の総ｓｉＲＮＡの濃度を得る。続いて、試
料の実測した濃度に、希釈規模を乗じて、脂質ナノ粒子配合物中の総ｓｉＲＮＡを得る。
被封入ｓｉＲＮＡは、式：［（総ｓｉＲＮＡ−遊離のｓｉＲＮＡ）／（総ｓｉＲＮＡ）
］×１００％により算出される。
］×１００％により算出される。
６．２．９ 粒子分析論
ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａ
ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。１ｍ
ｇ／ｍｌを上回る被封入ｓｉＲＮＡ濃度で配合したｓｉＲＮＡに関して、試料５μｌを１
×ＰＢＳ １１５μｌで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベットへ添加する。キ
ュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳへ挿入する。機械設定に関して、材料は
ポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また細胞はＺＥＮ０４０である
と設定する。待ち時間なしで、試料を２５℃で測定する。Ｚ−Ａｖｅ（直径として設定、
ナノメートル単位で）および多分散性指数（ＰＤＩ）を記録する。
ｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａ
ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。１ｍ
ｇ／ｍｌを上回る被封入ｓｉＲＮＡ濃度で配合したｓｉＲＮＡに関して、試料５μｌを１
×ＰＢＳ １１５μｌで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベットへ添加する。キ
ュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳへ挿入する。機械設定に関して、材料は
ポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また細胞はＺＥＮ０４０である
と設定する。待ち時間なしで、試料を２５℃で測定する。Ｚ−Ａｖｅ（直径として設定、
ナノメートル単位で）および多分散性指数（ＰＤＩ）を記録する。
表５では、上述の手順を使用してｓｉＲＮＡおよび脂質ナノ粒子の組合せに関して得ら
れる結果を示す。封入のパーセンテージは、ＳＥＣ法を使用して決定した。
れる結果を示す。封入のパーセンテージは、ＳＥＣ法を使用して決定した。
６．３ プロセス実施例２ 希釈の効果
図２に実質的に示すようなシステムを使用して、濃度０．４５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ
配列番号１、ｐＨ５の１００ｍＬ ＮａＣｌ、および２５ｍＭクエン酸ナトリウムを有す
る２つの水性核酸流を、反対方向から、内径０．５ｍｍを有する通路を有する十字形状の
混合チャンバーへ、それぞれ流速４０ｍＬ／分で導入した。同時に、脂質流を、十字形状
の混合チャンバーへ、２つの核酸流に直角の方向から、流速４０ｍＬ／分で導入した。脂
質流は、エタノール中４５％陽イオン性脂質Ａ１、４４％コレステロール、９％ＤＳＰＣ
、および２％ＰＥＧ−脂質Ｂ１で構成されていた。脂質の総濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬ
であった。１回の実行で、交差形状の混合チャンバーからの合流した流れを、図２におけ
るチャンバー５４に類似したＴ形状のチャンバー（内径１．０ｍｍ）を使用して、水を用
いた希釈ステップに付した。水を、Ｔ形状チャンバーへ、速度４０ｍＬ／分で導入した。
得られた溶液を収集して、被封入核酸ナノ粒子を、サイズおよび一様性に関して分析して
、結果を表６のエントリー１に示した。エントリー１から得られる溶液は、２５容量％の
エタノール、０．２３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｍＬの脂質、および５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含んでいた。同じ濃度、流速、および初期の十字形状の混合チャンバーを
用いた別個の実験では、混合チャンバーからの合流した流れを、エントリー１で使用する
希釈容量に等しい容量の水で希釈した。これらの結果を表６のエントリー２に示す。収集
した溶液の濃度は、エントリー１と同じであった。比較のために、同じプロセス条件下で
あるが、いかなる希釈ステップも伴わない別の実験を行った。これらの結果を表６のエン
トリー３に示す。いかなる希釈ステップも伴わない場合、エントリー３の収集した溶液は
、３３％エタノール、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｍＬの脂質および６
６ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。エントリー１およびエントリー２に関するＺ−Ａｖｇ、
＃−Ａｖｇ、ならびにＰＤＩは、希釈ステップを欠如したエントリー３よりも小さかった
。表中のＺ−Ａｖｇ、＃−Ａｖｇ、ならびにＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
図２に実質的に示すようなシステムを使用して、濃度０．４５ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ
配列番号１、ｐＨ５の１００ｍＬ ＮａＣｌ、および２５ｍＭクエン酸ナトリウムを有す
る２つの水性核酸流を、反対方向から、内径０．５ｍｍを有する通路を有する十字形状の
混合チャンバーへ、それぞれ流速４０ｍＬ／分で導入した。同時に、脂質流を、十字形状
の混合チャンバーへ、２つの核酸流に直角の方向から、流速４０ｍＬ／分で導入した。脂
質流は、エタノール中４５％陽イオン性脂質Ａ１、４４％コレステロール、９％ＤＳＰＣ
、および２％ＰＥＧ−脂質Ｂ１で構成されていた。脂質の総濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬ
であった。１回の実行で、交差形状の混合チャンバーからの合流した流れを、図２におけ
るチャンバー５４に類似したＴ形状のチャンバー（内径１．０ｍｍ）を使用して、水を用
いた希釈ステップに付した。水を、Ｔ形状チャンバーへ、速度４０ｍＬ／分で導入した。
得られた溶液を収集して、被封入核酸ナノ粒子を、サイズおよび一様性に関して分析して
、結果を表６のエントリー１に示した。エントリー１から得られる溶液は、２５容量％の
エタノール、０．２３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｍＬの脂質、および５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含んでいた。同じ濃度、流速、および初期の十字形状の混合チャンバーを
用いた別個の実験では、混合チャンバーからの合流した流れを、エントリー１で使用する
希釈容量に等しい容量の水で希釈した。これらの結果を表６のエントリー２に示す。収集
した溶液の濃度は、エントリー１と同じであった。比較のために、同じプロセス条件下で
あるが、いかなる希釈ステップも伴わない別の実験を行った。これらの結果を表６のエン
トリー３に示す。いかなる希釈ステップも伴わない場合、エントリー３の収集した溶液は
、３３％エタノール、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｍＬの脂質および６
６ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。エントリー１およびエントリー２に関するＺ−Ａｖｇ、
＃−Ａｖｇ、ならびにＰＤＩは、希釈ステップを欠如したエントリー３よりも小さかった
。表中のＺ−Ａｖｇ、＃−Ａｖｇ、ならびにＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
表６のエントリー１に関して記載するのと同じプロセスおよび脂質混合物を使用するが
、ｓｉＲＮＡ配列番号３を用いて、図４ａに示す一様のサイズの脂質ナノ粒子を生産した
。流速４０ｍｇ／ｍＬで、ｓｉＲＮＡ配列番号３の濃度を０．９ｍｇ／ｍＬへ増加させる
と同時に、十字形状の混合チャンバーを、図３ａのＴ形状の混合チャンバー（内径０．５
ｍｍ）で置き換えることで（半分の容量中に同じ総量のｓｉＲＮＡ）、図４ｂに示すあま
り一様でないサイズの脂質ナノ粒子を生産した。Ｔ形状の混合チャンバーおよび０．９ｍ
ｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを使用した類似のプロセスをプロセス実施例４に記載する。
、ｓｉＲＮＡ配列番号３を用いて、図４ａに示す一様のサイズの脂質ナノ粒子を生産した
。流速４０ｍｇ／ｍＬで、ｓｉＲＮＡ配列番号３の濃度を０．９ｍｇ／ｍＬへ増加させる
と同時に、十字形状の混合チャンバーを、図３ａのＴ形状の混合チャンバー（内径０．５
ｍｍ）で置き換えることで（半分の容量中に同じ総量のｓｉＲＮＡ）、図４ｂに示すあま
り一様でないサイズの脂質ナノ粒子を生産した。Ｔ形状の混合チャンバーおよび０．９ｍ
ｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを使用した類似のプロセスをプロセス実施例４に記載する。
６．４ プロセス実施例３ 流速、速度、および溶液濃度の影響
図３ａに示すようなチャンバーに類似した、かつ内径０．５ｍｍを有するＴ形状の混合
チャンバーを使用した一連の実験において、単一の核酸流および単一の脂質流を、様々な
流速／速度および濃度で混合した。核酸および脂質流は、プロセス実施例２において上述
するのと同じ成分を含んでいた。これらの例では、希釈ステップを使用せず、初期ｓｉＲ
ＮＡ濃度は、表６のエントリー１と同じ最終溶液濃度を得るように調節した。これらの実
験におけるエタノール中の脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬ（１×）または２５ｍｇ／
ｍＬ（１．５×）のいずれかであった。結果を以下の表７に示し、Ｚ−Ａｖｇ、＃−Ａｖ
ｇ、およびＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
図３ａに示すようなチャンバーに類似した、かつ内径０．５ｍｍを有するＴ形状の混合
チャンバーを使用した一連の実験において、単一の核酸流および単一の脂質流を、様々な
流速／速度および濃度で混合した。核酸および脂質流は、プロセス実施例２において上述
するのと同じ成分を含んでいた。これらの例では、希釈ステップを使用せず、初期ｓｉＲ
ＮＡ濃度は、表６のエントリー１と同じ最終溶液濃度を得るように調節した。これらの実
験におけるエタノール中の脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬ（１×）または２５ｍｇ／
ｍＬ（１．５×）のいずれかであった。結果を以下の表７に示し、Ｚ−Ａｖｇ、＃−Ａｖ
ｇ、およびＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
６．５ プロセス実施例４ 流速および速度の影響
図３ａに示すようなチャンバーに類似し、かつプロセス実施例３で使用するＴ形状の混
合チャンバー（内径０．５ｍｍ）を使用した一連の実験において、単一の核酸流および単
一の脂質流を、反対方向から、様々な流速／線速度で混合して、続いて図２で一般的に示
すように、内径１ｍｍの希釈ｔｅｅ水で希釈した。ｓｉＲＮＡ配列番号４、陽イオン性脂
質Ａ１、ＰＥＧ脂質Ｂ１、コレステロール、およびＤＳＰＣは、上述するような量で、プ
ロセス実施例４で使用した。エタノール流中の脂質の総濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであ
った。核酸流中のｓｉＲＮＡの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬであった。表８の結果により、
線速度を増加させると、粒径およびＰＤＩが減少することが示される。
図３ａに示すようなチャンバーに類似し、かつプロセス実施例３で使用するＴ形状の混
合チャンバー（内径０．５ｍｍ）を使用した一連の実験において、単一の核酸流および単
一の脂質流を、反対方向から、様々な流速／線速度で混合して、続いて図２で一般的に示
すように、内径１ｍｍの希釈ｔｅｅ水で希釈した。ｓｉＲＮＡ配列番号４、陽イオン性脂
質Ａ１、ＰＥＧ脂質Ｂ１、コレステロール、およびＤＳＰＣは、上述するような量で、プ
ロセス実施例４で使用した。エタノール流中の脂質の総濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであ
った。核酸流中のｓｉＲＮＡの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬであった。表８の結果により、
線速度を増加させると、粒径およびＰＤＩが減少することが示される。
６．６ プロセス実施例５ Ｔ形状の混合チャンバーの方向付けの影響
表９は、図３ｃに示すチャンバーに類似した代替的な混合チャンバー（内径０．５ｍｍ
）を使用した２つの実験からの結果を示す。エントリー１では、ｓｉＲＮＡが分岐から入
る、得られた結果を示し、エントリー２では、脂質が分岐から入る、得られた結果を示す
。両方の実験に関して、ｓｉＲＮＡおよび脂質は、プロセス実施例２で上述するのと同じ
であった。ｓｉＲＮＡ流に関する流速は、１２０ｍＬ／分であり、脂質流の流速は、４０
ｍＬ／分であった。ｓｉＲＮＡ濃度は、６６ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝溶液中で０．
３ｍｇ／ｍＬであった。脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであった。Ｚ−Ａｖｅ、＃−
Ａｖｇ、およびＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
表９は、図３ｃに示すチャンバーに類似した代替的な混合チャンバー（内径０．５ｍｍ
）を使用した２つの実験からの結果を示す。エントリー１では、ｓｉＲＮＡが分岐から入
る、得られた結果を示し、エントリー２では、脂質が分岐から入る、得られた結果を示す
。両方の実験に関して、ｓｉＲＮＡおよび脂質は、プロセス実施例２で上述するのと同じ
であった。ｓｉＲＮＡ流に関する流速は、１２０ｍＬ／分であり、脂質流の流速は、４０
ｍＬ／分であった。ｓｉＲＮＡ濃度は、６６ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝溶液中で０．
３ｍｇ／ｍＬであった。脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであった。Ｚ−Ａｖｅ、＃−
Ａｖｇ、およびＰＤＩは、混合の６０分後に決定した。
６．７ プロセス実施例６ 混合チャンバー形状の影響
３〜６の範囲の流れの総数を有する核酸および脂質流の様々な形状を有する混合チャン
バーを使用して、一連の実験を行った。それぞれの場合で、混合チャンバーは、内径１ｍ
ｍのチャンバーを有し、流速は、ｓｉＲＮＡ流に関しては２４０ｍＬ／分、および脂質流
に関しては８０ｍＬ／分の複合流量を維持するように調節した。これらの実験におけるｓ
ｉＲＮＡの濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬであり、脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであっ
た。複合ｓｉＲＮＡ流の線速度は、５．１メートル／秒であった。複合脂質流の線速度は
、１．７メートル／秒であった。流れの数が、流れの１つを上回る配置を可能にする場合
、表１０は、脂質またはｓｉＲＮＡ流間の角度を示す。例えば、３つの脂質流および３つ
のｓｉＲＮＡ流の場合、各脂質流は、６０度（即ち、３つの隣接した脂質流）または１２
０度（即ち、脂質流は、１２０度で分離されており、介在するｓｉＲＮＡ流も１２０度で
分離される）のいずれかによって、次の脂質流と分離される。表１０に概要する実験結果
に関して、４５：９：４４：２の比での陽イオン性脂質Ａ４、ＤＳＣＰ、コレステロール
およびＰＥＧ脂質Ｂ１とともに、ｓｉＲＮＡ配列番号５を使用した。表１０に示す結果に
より、総流速／速度が一定のままである様々な混合形状に関して、実質的に同じ結果が得
られることが示される。
３〜６の範囲の流れの総数を有する核酸および脂質流の様々な形状を有する混合チャン
バーを使用して、一連の実験を行った。それぞれの場合で、混合チャンバーは、内径１ｍ
ｍのチャンバーを有し、流速は、ｓｉＲＮＡ流に関しては２４０ｍＬ／分、および脂質流
に関しては８０ｍＬ／分の複合流量を維持するように調節した。これらの実験におけるｓ
ｉＲＮＡの濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬであり、脂質の濃度は、１６．７ｍｇ／ｍＬであっ
た。複合ｓｉＲＮＡ流の線速度は、５．１メートル／秒であった。複合脂質流の線速度は
、１．７メートル／秒であった。流れの数が、流れの１つを上回る配置を可能にする場合
、表１０は、脂質またはｓｉＲＮＡ流間の角度を示す。例えば、３つの脂質流および３つ
のｓｉＲＮＡ流の場合、各脂質流は、６０度（即ち、３つの隣接した脂質流）または１２
０度（即ち、脂質流は、１２０度で分離されており、介在するｓｉＲＮＡ流も１２０度で
分離される）のいずれかによって、次の脂質流と分離される。表１０に概要する実験結果
に関して、４５：９：４４：２の比での陽イオン性脂質Ａ４、ＤＳＣＰ、コレステロール
およびＰＥＧ脂質Ｂ１とともに、ｓｉＲＮＡ配列番号５を使用した。表１０に示す結果に
より、総流速／速度が一定のままである様々な混合形状に関して、実質的に同じ結果が得
られることが示される。
６．８ プロセス実施例７ ｍＲＮＡの封入
６．８．１ 材料および試薬
６．８．１ 材料および試薬
ＴＥＶ−ｈレプチン−ＧＡｏｐｔ−２ｘｈＢＧ−１２０Ａ（配列番号６）
配列の特色：
タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ：１４〜１５４
最適コザック（Kozak）配列：１５５〜１６３
タンパク質受託番号＃ＮＰ＿０００２２１のヒトレプチンコードアミノ酸１〜１６７、
ＧｅｎｅＡｒｔにより最適化された配列コドン：１６４〜６６４
２つの停止コドン：６６５〜６７０
ヒトベータ−グロブリン３’ＵＴＲの２つのコピー：６８９〜９５４
１２０個のヌクレオチドポリＡテール：９６１〜１０８０
配列の特色：
タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ：１４〜１５４
最適コザック（Kozak）配列：１５５〜１６３
タンパク質受託番号＃ＮＰ＿０００２２１のヒトレプチンコードアミノ酸１〜１６７、
ＧｅｎｅＡｒｔにより最適化された配列コドン：１６４〜６６４
２つの停止コドン：６６５〜６７０
ヒトベータ−グロブリン３’ＵＴＲの２つのコピー：６８９〜９５４
１２０個のヌクレオチドポリＡテール：９６１〜１０８０
６．８．２ エタノール中の脂質混合物の調製
下記は、陽イオン性脂質アミン対ｍＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比４：１で封入される
ｍＲＮＡの例である。脂質（陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび脂質付加
されたＰＥＧ）をエタノール中に溶解する。脂質のモル比は、それぞれ４０：１０：４８
：２である。例えば、表１２では、エタノール中の容量６３ｍｌの脂質に関する全ての構
成成分の量および最終濃度が見られる。容量６３ｍｌは、確実に標的容量が、シリンジへ
充填するのに利用可能であるのに必要とされる容量の１．０５倍を表す。混合物を秤量し
て、滅菌ポリエチレンテレフタレートグリコール修飾（ＰＥＴＧ）の１２５ｍｌのボトル
に入れて、エタノールを添加する。混合物を短期間超音波処理した後、５分間穏やかに攪
拌して、続いて使用するまで３７℃で維持する。
下記は、陽イオン性脂質アミン対ｍＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比４：１で封入される
ｍＲＮＡの例である。脂質（陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび脂質付加
されたＰＥＧ）をエタノール中に溶解する。脂質のモル比は、それぞれ４０：１０：４８
：２である。例えば、表１２では、エタノール中の容量６３ｍｌの脂質に関する全ての構
成成分の量および最終濃度が見られる。容量６３ｍｌは、確実に標的容量が、シリンジへ
充填するのに利用可能であるのに必要とされる容量の１．０５倍を表す。混合物を秤量し
て、滅菌ポリエチレンテレフタレートグリコール修飾（ＰＥＴＧ）の１２５ｍｌのボトル
に入れて、エタノールを添加する。混合物を短期間超音波処理した後、５分間穏やかに攪
拌して、続いて使用するまで３７℃で維持する。
６．８．３ クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡの調製
まず、クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ６．００であることを確認する。そうでない場合は
、加工処理前に、ｐＨを調整する。封入用の水中の十分なｍＲＮＡを、−８０℃の保存か
ら解凍させて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器を用いて、水からクエン酸緩
衝液ｐＨ６．０へ交換する。ｍＲＮＡ １０〜１２ｍｇを各濃縮器へ充填することができ
、それを４，０００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離する。容量は、クエン酸緩衝液ｐＨ
６．０の添加により増加させる。所望の緩衝液条件を達成するには、クエン酸緩衝液ｐＨ
６．０による１０倍以上の容量の交換を推奨する。ｍＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計で
２６０ｎｍにて、光学密度により測定する。ｍＲＮＡの最終濃度を、滅菌した２５０ｍｌ
のＰＥＴＧボトルにおいてクエン酸緩衝液１２６ｍｌ中で０．２５ｍｇ／ｍｌへ調節して
、使用するまで室温で保持する。容量１２６ｍｌは、確実に標的容量が、シリンジへ充填
するのに利用可能であるのに必要とされる容量の１．０５倍を表す。
まず、クエン酸緩衝液のｐＨがｐＨ６．００であることを確認する。そうでない場合は
、加工処理前に、ｐＨを調整する。封入用の水中の十分なｍＲＮＡを、−８０℃の保存か
ら解凍させて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器を用いて、水からクエン酸緩
衝液ｐＨ６．０へ交換する。ｍＲＮＡ １０〜１２ｍｇを各濃縮器へ充填することができ
、それを４，０００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離する。容量は、クエン酸緩衝液ｐＨ
６．０の添加により増加させる。所望の緩衝液条件を達成するには、クエン酸緩衝液ｐＨ
６．０による１０倍以上の容量の交換を推奨する。ｍＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計で
２６０ｎｍにて、光学密度により測定する。ｍＲＮＡの最終濃度を、滅菌した２５０ｍｌ
のＰＥＴＧボトルにおいてクエン酸緩衝液１２６ｍｌ中で０．２５ｍｇ／ｍｌへ調節して
、使用するまで室温で保持する。容量１２６ｍｌは、確実に標的容量が、シリンジへ充填
するのに利用可能であるのに必要とされる容量の１．０５倍を表す。
６．８．４ 脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの封入
ｍＲＮＡ封入は、図２に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌した６０
ｍｌシリンジに、等量（６０ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸
緩衝液中のｍＲＮＡ（シリンジ（ｂ１）および（ｂ２））、およびクエン酸緩衝液単独（
シリンジ（ｃ））を充填する。脂質を含有するシリンジ（ａ）上のルアーフィッティング
から通じるチューブを、内径０．５ｍｍを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。０
．２５ｍｇ／ｍｌでｍＲＮＡを含有するシリンジ（ｂ１）および（ｂ２）上のルアーフィ
ッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、内
径０．８ｍｍを有するＰＴＦＥチューブである。シリンジ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２
）を、シリンジポンプＡ上に設置する。脂質入力の反対側の十字の中央入力からつながる
チューブを、Ｔ接合部へ取り付ける（例えば、図２、Ｔ接合部５４を参照）。クエン酸緩
衝液単独を含有するシリンジ（ｃ）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、Ｔ
接合部へ取り付けて、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にして、シリンジ（
ｃ）を、シリンジポンプＢ上に設置する。Ｔ接合部からの出力ラインを、希釈したｍＲＮ
Ａ脂質ナノ粒子の収集用の滅菌した５００ｍｌのＰＥＴＧボトルより上に位置させる。全
てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。シリ
ンジポンプを、適したシリンジ製造業者およびサイズ（ＢＤ、Ｐｌａｓｔｉｐａｋ、６０
ｍｌ）および１分当たり最大１６ｍｌの流速に設定した。両方のポンプを同時に始動させ
て、およそ０．５秒後に材料を収集し始める。被封入ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子およそ２２０
〜２３０ｍｌを収集する。
ｍＲＮＡ封入は、図２に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌した６０
ｍｌシリンジに、等量（６０ｍｌ）のエタノール中の脂質（シリンジ（ａ））、クエン酸
緩衝液中のｍＲＮＡ（シリンジ（ｂ１）および（ｂ２））、およびクエン酸緩衝液単独（
シリンジ（ｃ））を充填する。脂質を含有するシリンジ（ａ）上のルアーフィッティング
から通じるチューブを、内径０．５ｍｍを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。０
．２５ｍｇ／ｍｌでｍＲＮＡを含有するシリンジ（ｂ１）および（ｂ２）上のルアーフィ
ッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、内
径０．８ｍｍを有するＰＴＦＥチューブである。シリンジ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２
）を、シリンジポンプＡ上に設置する。脂質入力の反対側の十字の中央入力からつながる
チューブを、Ｔ接合部へ取り付ける（例えば、図２、Ｔ接合部５４を参照）。クエン酸緩
衝液単独を含有するシリンジ（ｃ）上のルアーフィッティングから通じるチューブを、Ｔ
接合部へ取り付けて、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にして、シリンジ（
ｃ）を、シリンジポンプＢ上に設置する。Ｔ接合部からの出力ラインを、希釈したｍＲＮ
Ａ脂質ナノ粒子の収集用の滅菌した５００ｍｌのＰＥＴＧボトルより上に位置させる。全
てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。シリ
ンジポンプを、適したシリンジ製造業者およびサイズ（ＢＤ、Ｐｌａｓｔｉｐａｋ、６０
ｍｌ）および１分当たり最大１６ｍｌの流速に設定した。両方のポンプを同時に始動させ
て、およそ０．５秒後に材料を収集し始める。被封入ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子およそ２２０
〜２３０ｍｌを収集する。
６．８．５ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の希釈
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液１３５ｍｌを吸引するのに１４０ｍｌのシリンジを使用す
る。残りの８５〜９５ｍｌを第２の１４０ｍｌのシリンジへ移す。同容量のクエン酸緩衝
液を用いて、１４０ｍｌのシリンジを調製する。別のＴ接合部を、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子
懸濁液の別の希釈用に設定する。この希釈ステップは、唯一のシリンジポンプ上で両方の
シリンジを用いて実行する。容量１３５ｍｌを有する１４０ｍｌのシリンジ（一方は、脂
質ナノ粒子を含有し、他方は、クエン酸緩衝液を含有する）をまず実行して、より小さな
容量を有する１４０ｍｌのシリンジは、２番目に実行する。全てのフィッティングがシリ
ンジ上で締まっていることを確認することが重要である。最初の実行に関して、正確なサ
イズおよび製造業者（１４０ｍｌ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−Ｍｏｎｏｊｅｃｔ）に合わせて、
シリンジポンプに関する設定を変化させる。流速は、１分当たり２５ｍｌに設定する。希
釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌した５００ｍｌのＰＥＴＧボトルへ収集する
。最終容量は、およそ４４０〜４６０ｍｌである。
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液１３５ｍｌを吸引するのに１４０ｍｌのシリンジを使用す
る。残りの８５〜９５ｍｌを第２の１４０ｍｌのシリンジへ移す。同容量のクエン酸緩衝
液を用いて、１４０ｍｌのシリンジを調製する。別のＴ接合部を、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子
懸濁液の別の希釈用に設定する。この希釈ステップは、唯一のシリンジポンプ上で両方の
シリンジを用いて実行する。容量１３５ｍｌを有する１４０ｍｌのシリンジ（一方は、脂
質ナノ粒子を含有し、他方は、クエン酸緩衝液を含有する）をまず実行して、より小さな
容量を有する１４０ｍｌのシリンジは、２番目に実行する。全てのフィッティングがシリ
ンジ上で締まっていることを確認することが重要である。最初の実行に関して、正確なサ
イズおよび製造業者（１４０ｍｌ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−Ｍｏｎｏｊｅｃｔ）に合わせて、
シリンジポンプに関する設定を変化させる。流速は、１分当たり２５ｍｌに設定する。希
釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌した５００ｍｌのＰＥＴＧボトルへ収集する
。最終容量は、およそ４４０〜４６０ｍｌである。
６．８．６ タンジェンシャルフローフィルトレーションによるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の
透析および濃縮
封入の実行におけるあらゆる１５ｍｇのｍＲＮＡに関しては、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０
カートリッジを使用する。３０ｍｇのｍＲＮＡ封入の実行に関しては、直列に取り付けた
２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカートリ
ッジを、発熱物質を含まないようにしなくてはならない。この手順は、封入の前日に始め
るべきである。Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦシステムを使用して、２つのＶｉｖａｆｌｏｗ
５０カートリッジを直列で設定して、チューブを取り付ける。発熱物質を含まず、ヌク
レアーゼを含まない水５００ｍｌをリザーバへ充填して、それを圧力２０ｐｓｉでカート
リッジに通して流す。０．１ＭのＮａＯＨ／１．０ＭのＮａＣｌ １００ｍｌをリザーバ
へ充填して、５０ｍｌをカートリッジに通して流す。残りの５０ｍｌをカートリッジで一
晩静置させる。翌朝、残りの５０ｍｌを２０ｐｓｉでカートリッジに通して流す。発熱物
質をより含まず、ヌクレアーゼを含まない水をリザーバへ充填して、５０ｍｌをカートリ
ッジに通して流す。この水洗浄を２回以上繰り返す。最終的なすすぎ水の分取量を試験し
て、エンドトキシンが検出可能な量以下であることを確認する。
透析および濃縮
封入の実行におけるあらゆる１５ｍｇのｍＲＮＡに関しては、Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０
カートリッジを使用する。３０ｍｇのｍＲＮＡ封入の実行に関しては、直列に取り付けた
２つのＶｉｖａｆｌｏｗ ５０カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカートリ
ッジを、発熱物質を含まないようにしなくてはならない。この手順は、封入の前日に始め
るべきである。Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦシステムを使用して、２つのＶｉｖａｆｌｏｗ
５０カートリッジを直列で設定して、チューブを取り付ける。発熱物質を含まず、ヌク
レアーゼを含まない水５００ｍｌをリザーバへ充填して、それを圧力２０ｐｓｉでカート
リッジに通して流す。０．１ＭのＮａＯＨ／１．０ＭのＮａＣｌ １００ｍｌをリザーバ
へ充填して、５０ｍｌをカートリッジに通して流す。残りの５０ｍｌをカートリッジで一
晩静置させる。翌朝、残りの５０ｍｌを２０ｐｓｉでカートリッジに通して流す。発熱物
質をより含まず、ヌクレアーゼを含まない水をリザーバへ充填して、５０ｍｌをカートリ
ッジに通して流す。この水洗浄を２回以上繰り返す。最終的なすすぎ水の分取量を試験し
て、エンドトキシンが検出可能な量以下であることを確認する。
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦリザーバへ充填する。全体
的な圧力２０〜２５ｐｓｉを維持しながら、混合物を濃縮する。ろ液は、１分当たりおよ
そ４ｍｌで溶出させて、始動させるべきであるが、減速する。リザーバ中の液体レベルが
、目盛り４０ｍｌになるまで濃縮する。濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、発熱物
質を含まず、ヌクレアーゼを含まない１×ＰＢＳ ３００ｍｌに対してダイアフィルトレ
ーションする。圧力２０〜１５ｐｓｉを保持する。ダイアフィルトレーション後、リザー
バ上の目盛り１０ｍｌ線のすぐ下まで、材料の濃縮を再開する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸
濁液をリザーバから収集する。さらに５ｍｌの１×ＰＢＳでＴＦＦシステムをすすいで、
希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこの洗浄液を収集することが可能である
が、この洗浄液は、濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液とは別個に収集されるべきであ
る。分析するまで材料を４℃で保存する。
的な圧力２０〜２５ｐｓｉを維持しながら、混合物を濃縮する。ろ液は、１分当たりおよ
そ４ｍｌで溶出させて、始動させるべきであるが、減速する。リザーバ中の液体レベルが
、目盛り４０ｍｌになるまで濃縮する。濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を、発熱物
質を含まず、ヌクレアーゼを含まない１×ＰＢＳ ３００ｍｌに対してダイアフィルトレ
ーションする。圧力２０〜１５ｐｓｉを保持する。ダイアフィルトレーション後、リザー
バ上の目盛り１０ｍｌ線のすぐ下まで、材料の濃縮を再開する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸
濁液をリザーバから収集する。さらに５ｍｌの１×ＰＢＳでＴＦＦシステムをすすいで、
希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこの洗浄液を収集することが可能である
が、この洗浄液は、濃縮したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液とは別個に収集されるべきであ
る。分析するまで材料を４℃で保存する。
６．８．７ ３８４ウェルプレートアッセイ方式で決定した封入パーセント
脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡ配合の効率を決定するために、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓからのＱｕａｎｔ−ＩＴ ｒｉｂｏｇｒｅｅｎＲＮＡアッセイキットを使用して
、ｍＲＮＡの封入パーセントを測定する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液は、ヌクレアーゼ
を含まないＴＥ緩衝液中でアッセイして、脂質ナノ粒子の外側のｍＲＮＡの濃度を決定し
、またＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤中でもアッセイし
て、脂質ナノ粒子を分解させて、脂質ナノ粒子懸濁液全体中のｍＲＮＡの濃度を決定する
。２つの濃度の関係を使用して、封入パーセントを算出する。
脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡ配合の効率を決定するために、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓからのＱｕａｎｔ−ＩＴ ｒｉｂｏｇｒｅｅｎＲＮＡアッセイキットを使用して
、ｍＲＮＡの封入パーセントを測定する。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子懸濁液は、ヌクレアーゼ
を含まないＴＥ緩衝液中でアッセイして、脂質ナノ粒子の外側のｍＲＮＡの濃度を決定し
、またＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤中でもアッセイし
て、脂質ナノ粒子を分解させて、脂質ナノ粒子懸濁液全体中のｍＲＮＡの濃度を決定する
。２つの濃度の関係を使用して、封入パーセントを算出する。
ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両
方中で、キット中に提供される１００μｇ／ｍｌのストック標準物質ＲＮＡからＲＮＡの
１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を調製する。表１３に従って、ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０
．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方において、このストックを使用し
て、標準曲線を作成する。
方中で、キット中に提供される１００μｇ／ｍｌのストック標準物質ＲＮＡからＲＮＡの
１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を調製する。表１３に従って、ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０
．７５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方において、このストックを使用し
て、標準曲線を作成する。
４００〜２，０００倍の範囲の希釈を使用して、ＴＥ緩衝液およびＴＥ緩衝液＋０．７
５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方中に、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料を慎
重に調製する。２ステップの希釈に関して、ＴＥまたはＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎではなく、確
実にＰＢＳ中で第１のステップを実施する。各緩衝液条件において各試料に関して２組の
希釈を行い、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料１つにつき、緩衝液条件１つ当たり総計６個のウ
ェルに関して、三重反復で各組の希釈をアッセイする。標準曲線用試料を作製し、９６デ
ィープウェルプレートにおいてｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料を希釈して、それらを調製する
際に試料の完全な混合を確実にする。より大きな容量の標準曲線用試料を準備して、後の
使用のために、密封した９６ディープウェルプレート中で、４℃で最大３日間保存するこ
とができる。
５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤の両方中に、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料を慎
重に調製する。２ステップの希釈に関して、ＴＥまたはＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎではなく、確
実にＰＢＳ中で第１のステップを実施する。各緩衝液条件において各試料に関して２組の
希釈を行い、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料１つにつき、緩衝液条件１つ当たり総計６個のウ
ェルに関して、三重反復で各組の希釈をアッセイする。標準曲線用試料を作製し、９６デ
ィープウェルプレートにおいてｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料を希釈して、それらを調製する
際に試料の完全な混合を確実にする。より大きな容量の標準曲線用試料を準備して、後の
使用のために、密封した９６ディープウェルプレート中で、４℃で最大３日間保存するこ
とができる。
ウェル１つ当たり標準物質および試料４０μｌを、黒色３８４ウェルアッセイプレート
（未処理のＣｏｓｔａｒ、＃３５７３）へ添加する。２５０μｌの自動多チャネルピペッ
トを使用して、標準曲線用試料８５μｌを吸引して、４０μｌをアッセイプレートの２つ
のウェルへ分取する。各希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料１２５μｌを吸引して、４０
μｌを、アッセイプレートの３つのウェルへ分取する。
（未処理のＣｏｓｔａｒ、＃３５７３）へ添加する。２５０μｌの自動多チャネルピペッ
トを使用して、標準曲線用試料８５μｌを吸引して、４０μｌをアッセイプレートの２つ
のウェルへ分取する。各希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料１２５μｌを吸引して、４０
μｌを、アッセイプレートの３つのウェルへ分取する。
ＴＥ緩衝液中で、キット中のｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を２４０倍希釈して、アッセイプ
レートの各ウェルへ６０μｌを添加する。標準曲線用試料の各ウェル中に６０μｌを分取
して、その結果、ＴＥおよびＴＥ＋界面活性剤標準曲線試料との間でチップを交換するよ
うにしながら、１２５μｌの自動多チャネルピペットを使用して、希釈したｒｉｂｏｇｒ
ｅｅｎ試薬１２５μｌを吸引する。各希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料間でチップを交
換する。
レートの各ウェルへ６０μｌを添加する。標準曲線用試料の各ウェル中に６０μｌを分取
して、その結果、ＴＥおよびＴＥ＋界面活性剤標準曲線試料との間でチップを交換するよ
うにしながら、１２５μｌの自動多チャネルピペットを使用して、希釈したｒｉｂｏｇｒ
ｅｅｎ試薬１２５μｌを吸引する。各希釈したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試料間でチップを交
換する。
上下にピペットを動かすこと（pipetting）により、ウェル中で試料を混合する。例え
ば、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ ｒｏｂｏｔ上に黒色３８４ウェルアッセイプレートを配置させ
て、３０μｌのＸＬチップを使用することにより、これを行うことができる。混合後、４
８０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光で、蛍光マイクロプレートーリーダーを使用
して蛍光を測定する。
ば、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ ｒｏｂｏｔ上に黒色３８４ウェルアッセイプレートを配置させ
て、３０μｌのＸＬチップを使用することにより、これを行うことができる。混合後、４
８０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光で、蛍光マイクロプレートーリーダーを使用
して蛍光を測定する。
試薬ブランクの蛍光値を、各ＲＮＡ試料に関する蛍光値から差し引いて、ＴＥおよびＴ
Ｅ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００条件に関して、蛍光対ＲＮＡ濃度の標準曲線を作成する。
試薬ブランクの蛍光値を、試料それぞれの蛍光値から差し引いて、続いて適切な標準曲線
から試料それぞれのＲＮＡ濃度を決定する。ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の試料と
、ＴＥ緩衝液単独中の試料との間の濃度の差を、ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活
性剤中の試料の濃度で除算することにより、試料の封入パーセントを決定する。
Ｅ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００条件に関して、蛍光対ＲＮＡ濃度の標準曲線を作成する。
試薬ブランクの蛍光値を、試料それぞれの蛍光値から差し引いて、続いて適切な標準曲線
から試料それぞれのＲＮＡ濃度を決定する。ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の試料と
、ＴＥ緩衝液単独中の試料との間の濃度の差を、ＴＥ＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活
性剤中の試料の濃度で除算することにより、試料の封入パーセントを決定する。
６．８．８ 粒子分析論
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａｓ
ｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。１ｍｇ
／ｍｌを上回る被封入ｍＲＮＡ濃度で配合したｍＲＮＡに関して、試料５μｌを１×ＰＢ
Ｓ １１５μｌで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベット（Ｂｒａｎｄ、＃７５
９２００）へ添加する。キュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳへ挿入する。
機械設定に関して、材料はポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また
細胞はＺＥＮ０４０であると設定する。待ち時間なしで、試料を２５℃で測定する。Ｚ−
Ａｖｅ（直径として設定、ナノメートル単位で）および多分散性指数（ＰＤＩ）を記録す
る。
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａｓ
ｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。１ｍｇ
／ｍｌを上回る被封入ｍＲＮＡ濃度で配合したｍＲＮＡに関して、試料５μｌを１×ＰＢ
Ｓ １１５μｌで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベット（Ｂｒａｎｄ、＃７５
９２００）へ添加する。キュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳへ挿入する。
機械設定に関して、材料はポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また
細胞はＺＥＮ０４０であると設定する。待ち時間なしで、試料を２５℃で測定する。Ｚ−
Ａｖｅ（直径として設定、ナノメートル単位で）および多分散性指数（ＰＤＩ）を記録す
る。
本発明の実施例および実施形態の上記説明は、事実上単に例示であり、したがって、そ
れらの変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とみなされるべきではない。
れらの変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とみなされるべきではない。
１ 装置
１０ 第１の核酸流
１２ 通路
１４ 交差ポイント
１６ 十字
２０ 第２の核酸流
２２ 通路
３０ 脂質流
３２ 通路
４０ 複合流
４２ 通路
５０ 希釈流
５０ａ 希釈流
５０ｂ 希釈流
５２ 通路
５２ａ 通路
５２ｂ 通路
５４ Ｔチャンバー
５４ａ 十字
６０ 第１の出口溶液
７０ プロセスチャンバー
７２ プロセスチャンバーの本体
８０ 核酸流
８２ 流入通路
８４ Ｙ形状チャンバー
８６ チャンバー
９０ 脂質流
９２ 流入通路
９４ チャンバー
１０ 第１の核酸流
１２ 通路
１４ 交差ポイント
１６ 十字
２０ 第２の核酸流
２２ 通路
３０ 脂質流
３２ 通路
４０ 複合流
４２ 通路
５０ 希釈流
５０ａ 希釈流
５０ｂ 希釈流
５２ 通路
５２ａ 通路
５２ｂ 通路
５４ Ｔチャンバー
５４ａ 十字
６０ 第１の出口溶液
７０ プロセスチャンバー
７２ プロセスチャンバーの本体
８０ 核酸流
８２ 流入通路
８４ Ｙ形状チャンバー
８６ チャンバー
９０ 脂質流
９２ 流入通路
９４ チャンバー
本発明の実施例および実施形態の上記説明は、事実上単に例示であり、したがって、そ
れらの変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とみなされるべきではない。
本発明は下記の態様も含む。
＜１＞
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
、
１つまたは複数の核酸流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の核酸流が
、第１の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも大きいか、ま
たはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
１つまたは複数の脂質流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の脂質流が
、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも
大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
第１の交差ポイントで前記１つまたは複数の脂質流を前記１つまたは複数の核酸流と合
流させて、第１の合流した流れを供給するステップと、
第１の方向で前記第１の合流した流れを流動させ、それらの構成成分を混合して、前記
被封入核酸ナノ粒子を含む第１の出口溶液を供給するステップと
を含み、前記第１の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第１の水溶液または
前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の
濃度が、３３％未満である、方法。
＜２＞
前記第１の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第１の緩衝溶液であり、
前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記第１の合流した流れを、第２の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
て、第１の出口流を供給するステップ
をさらに含む、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
前記アルカリ金属塩が、ＮａＣｌおよびクエン酸ナトリウムの１つまたは複数から選択
され、
前記有機溶媒がエタノールを含む、＜３＞に記載の方法。
＜５＞
前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約２０〜約２５％である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞
前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約１．５〜約４．５メートル／秒であり
、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約３〜約１４メートル／秒である、
＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞
前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約９〜約１４メートル／秒である、
＜１＞または＜３＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞
前記第１の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第２の緩衝溶液および水から選択
される水性溶媒を含む、ステップと、
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第１の出口流を供給するステ
ップと
を含み、前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約６〜約８メートル／秒である、
＜２＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞
前記第１の出口溶液をインキュベートするステップをさらに含む、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞
前記インキュベートした第１の出口溶液を、第３の緩衝溶液および水から選択される第
２の希釈溶媒で希釈して、第２の出口溶液を供給するステップと、
前記第２の出口溶液を濃縮するステップおよび透析するステップ
をさらに含む、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
ステップを含む、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、＜１０＞または＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記核酸がｓｉＲＮＡである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞
前記核酸がｍＲＮＡである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１５＞
前記脂質ナノ粒子ホストが、表２から選択される脂質の１つまたは複数を含む、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞
前記被封入核酸ナノ粒子が、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均粒径直径（average partic
le size diameter）を有する、＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。
＜１７＞
前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均粒径直径、および動的光散
乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する、＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の方法。
＜１８＞
脂質：核酸の質量による比が、約１５〜２０：１である、＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載の方法。
＜１９＞
前記１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度が、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり
、前記１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度が、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬである、＜１＞〜＜１８＞のいずれかに記載の方法。
＜２０＞
前記第２の出口溶液中のエタノールの濃度が、約１０〜１５％である、＜９＞〜＜１９＞のいずれかに記載の方法。
＜２１＞
２つの核酸流および１つの脂質流を供給するステップと、
十字コネクターで前記２つの核酸流を前記１つの脂質流と合流させて、前記第１の合流
した流れを供給するステップと
を含む、＜１＞〜＜２０＞のいずれかに記載の方法。
＜２２＞
前記２つの核酸流が、互いに対して約１８０°で反対方向から前記十字コネクターに入
り、前記脂質流が、前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターに入る、＜２１＞に記載の方法。
＜２３＞
前記第１の方向での前記第１の合流した流れを流動させるステップが、前記脂質流と実
質的に同じ方向で、かつ前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターから外
へ前記第１の合流した流れを流動させるステップを含む、＜２２＞に記載の方法。
＜２４＞
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第１の合流した流
れを、前記第１の合流した流れの方向に対して約９０°から前記希釈流と交差させるステ
ップを含む、＜８＞〜＜２３＞のいずれかに記載の方法。
＜２５＞
前記核酸流由来の核酸の約９０％超が、前記第１の出口溶液中に封入される、＜１＞〜＜２４＞のいずれかに記載の方法。
＜２６＞
薬学的に許容される担体、ならびに
脂質ナノ粒子ホストおよび核酸を含む被封入核酸ナノ粒子であって、前記核酸が、前記
脂質ナノ粒子ホスト中に封入されている、被封入核酸ナノ粒子
を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約
７０ｎｍの平均粒径、および動的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指
数を有する、被封入核酸ナノ粒子組成物。
＜２７＞
前記脂質ナノ粒子ホストが、分解性陽イオン性脂質、脂質付加されたポリエチレングリコール、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む、＜２６＞に記載の組成物。
れらの変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とみなされるべきではない。
本発明は下記の態様も含む。
＜１＞
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
、
１つまたは複数の核酸流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の核酸流が
、第１の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも大きいか、ま
たはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
１つまたは複数の脂質流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の脂質流が
、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも
大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
第１の交差ポイントで前記１つまたは複数の脂質流を前記１つまたは複数の核酸流と合
流させて、第１の合流した流れを供給するステップと、
第１の方向で前記第１の合流した流れを流動させ、それらの構成成分を混合して、前記
被封入核酸ナノ粒子を含む第１の出口溶液を供給するステップと
を含み、前記第１の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第１の水溶液または
前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の
濃度が、３３％未満である、方法。
＜２＞
前記第１の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第１の緩衝溶液であり、
前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記第１の合流した流れを、第２の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
て、第１の出口流を供給するステップ
をさらに含む、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
前記アルカリ金属塩が、ＮａＣｌおよびクエン酸ナトリウムの１つまたは複数から選択
され、
前記有機溶媒がエタノールを含む、＜３＞に記載の方法。
＜５＞
前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約２０〜約２５％である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞
前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約１．５〜約４．５メートル／秒であり
、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約３〜約１４メートル／秒である、
＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞
前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約９〜約１４メートル／秒である、
＜１＞または＜３＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞
前記第１の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第２の緩衝溶液および水から選択
される水性溶媒を含む、ステップと、
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第１の出口流を供給するステ
ップと
を含み、前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約６〜約８メートル／秒である、
＜２＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞
前記第１の出口溶液をインキュベートするステップをさらに含む、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞
前記インキュベートした第１の出口溶液を、第３の緩衝溶液および水から選択される第
２の希釈溶媒で希釈して、第２の出口溶液を供給するステップと、
前記第２の出口溶液を濃縮するステップおよび透析するステップ
をさらに含む、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
ステップを含む、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、＜１０＞または＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
前記核酸がｓｉＲＮＡである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞
前記核酸がｍＲＮＡである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１５＞
前記脂質ナノ粒子ホストが、表２から選択される脂質の１つまたは複数を含む、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞
前記被封入核酸ナノ粒子が、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均粒径直径（average partic
le size diameter）を有する、＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。
＜１７＞
前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均粒径直径、および動的光散
乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する、＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の方法。
＜１８＞
脂質：核酸の質量による比が、約１５〜２０：１である、＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載の方法。
＜１９＞
前記１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度が、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり
、前記１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度が、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬである、＜１＞〜＜１８＞のいずれかに記載の方法。
＜２０＞
前記第２の出口溶液中のエタノールの濃度が、約１０〜１５％である、＜９＞〜＜１９＞のいずれかに記載の方法。
＜２１＞
２つの核酸流および１つの脂質流を供給するステップと、
十字コネクターで前記２つの核酸流を前記１つの脂質流と合流させて、前記第１の合流
した流れを供給するステップと
を含む、＜１＞〜＜２０＞のいずれかに記載の方法。
＜２２＞
前記２つの核酸流が、互いに対して約１８０°で反対方向から前記十字コネクターに入
り、前記脂質流が、前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターに入る、＜２１＞に記載の方法。
＜２３＞
前記第１の方向での前記第１の合流した流れを流動させるステップが、前記脂質流と実
質的に同じ方向で、かつ前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターから外
へ前記第１の合流した流れを流動させるステップを含む、＜２２＞に記載の方法。
＜２４＞
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第１の合流した流
れを、前記第１の合流した流れの方向に対して約９０°から前記希釈流と交差させるステ
ップを含む、＜８＞〜＜２３＞のいずれかに記載の方法。
＜２５＞
前記核酸流由来の核酸の約９０％超が、前記第１の出口溶液中に封入される、＜１＞〜＜２４＞のいずれかに記載の方法。
＜２６＞
薬学的に許容される担体、ならびに
脂質ナノ粒子ホストおよび核酸を含む被封入核酸ナノ粒子であって、前記核酸が、前記
脂質ナノ粒子ホスト中に封入されている、被封入核酸ナノ粒子
を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約
７０ｎｍの平均粒径、および動的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指
数を有する、被封入核酸ナノ粒子組成物。
＜２７＞
前記脂質ナノ粒子ホストが、分解性陽イオン性脂質、脂質付加されたポリエチレングリコール、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む、＜２６＞に記載の組成物。
Claims (27)
- 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
、
１つまたは複数の核酸流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の核酸流が
、第１の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも大きいか、ま
たはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
１つまたは複数の脂質流を供給するステップであって、前記１つまたは複数の脂質流が
、有機溶媒中に１つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約１．５メートル／秒よりも
大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
第１の交差ポイントで前記１つまたは複数の脂質流を前記１つまたは複数の核酸流と合
流させて、第１の合流した流れを供給するステップと、
第１の方向で前記第１の合流した流れを流動させ、それらの構成成分を混合して、前記
被封入核酸ナノ粒子を含む第１の出口溶液を供給するステップと
を含み、前記第１の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第１の水溶液または
前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の
濃度が、３３％未満である、方法。 - 前記第１の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第１の緩衝溶液であり、
前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、
請求項１に記載の方法。 - 前記第１の合流した流れを、第２の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
て、第１の出口流を供給するステップ
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。 - 前記アルカリ金属塩が、ＮａＣｌおよびクエン酸ナトリウムの１つまたは複数から選択
され、
前記有機溶媒がエタノールを含む、
請求項３に記載の方法。 - 前記第１の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約２０〜約２５％である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約１．５〜約４．５メートル／秒であり
、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約３〜約１４メートル／秒である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約９〜約１４メートル／秒である、
請求項１または３〜６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第１の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第２の緩衝溶液および水から選択
される水性溶媒を含む、ステップと、
前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第１の出口流を供給するステ
ップと
を含み、前記１つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約３〜約４メートル／秒であり、
前記１つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約６〜約８メートル／秒である、請求項２
〜６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第１の出口溶液をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１〜８のいず
れか一項に記載の方法。 - 前記インキュベートした第１の出口溶液を、第３の緩衝溶液および水から選択される第
２の希釈溶媒で希釈して、第２の出口溶液を供給するステップと、
前記第２の出口溶液を濃縮するステップおよび透析するステップ
をさらに含む、請求項９に記載の方法。 - 前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
ステップを含む、請求項１０に記載の方法。 - 濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、請求項１０または１１に記載
の方法。 - 前記核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質ナノ粒子ホストが、表２から選択される脂質の１つまたは複数を含む、請求項
１〜１４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記被封入核酸ナノ粒子が、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍの平均粒径直径（average partic
le size diameter）を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍの平均粒径直径、および動的光散
乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指数を有する、請求項１〜１６のいずれ
か一項に記載の方法。 - 脂質：核酸の質量による比が、約１５〜２０：１である、請求項１〜１７のいずれか一
項に記載の方法。 - 前記１つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度が、約０．１〜約１．５ｍｇ／ｍＬであり
、前記１つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度が、約１０〜約２５ｍｇ／ｍＬである、請
求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第２の出口溶液中のエタノールの濃度が、約１０〜１５％である、請求項９〜１９
のいずれか一項に記載の方法。 - ２つの核酸流および１つの脂質流を供給するステップと、
十字コネクターで前記２つの核酸流を前記１つの脂質流と合流させて、前記第１の合流
した流れを供給するステップと
を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記２つの核酸流が、互いに対して約１８０°で反対方向から前記十字コネクターに入
り、前記脂質流が、前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターに入る、請
求項２１に記載の方法。 - 前記第１の方向での前記第１の合流した流れを流動させるステップが、前記脂質流と実
質的に同じ方向で、かつ前記２つの核酸流に対して約９０°で前記十字コネクターから外
へ前記第１の合流した流れを流動させるステップを含む、請求項２２に記載の方法。 - 前記第１の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第１の合流した流
れを、前記第１の合流した流れの方向に対して約９０°から前記希釈流と交差させるステ
ップを含む、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記核酸流由来の核酸の約９０％超が、前記第１の出口溶液中に封入される、請求項１
〜２４のいずれか一項に記載の方法。 - 薬学的に許容される担体、ならびに
脂質ナノ粒子ホストおよび核酸を含む被封入核酸ナノ粒子であって、前記核酸が、前記
脂質ナノ粒子ホスト中に封入されている、被封入核酸ナノ粒子
を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、前記被封入核酸ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約
７０ｎｍの平均粒径、および動的光散乱により決定される場合の約０．１未満の多分散指
数を有する、被封入核酸ナノ粒子組成物。 - 前記脂質ナノ粒子ホストが、生分解性陽イオン性脂質、脂質付加されたポリエチレング
リコール、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリンを含む、請求項２６に記載の組成物。
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