JP2020533957A - Crisprリポーター非ヒト動物およびその使用 - Google Patents
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- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
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Abstract
Description
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、2017年7月31日に出願された米国特許出願第62/539,279号の利益を主張する。
ファイル516565SEQLIST.txtに記載された配列表は72.7キロバイトであり、2018年7月31日に作成され、本明細書により参照により組み込まれる。
CRISPR/Cas技術は、有望かつ新しい治療モダリティである。しかしながら、in vivoで導入されたCRISPR/Cas剤による突然変異生成または標的遺伝子改変の効率を評価するより良好な手段が必要である。in vivoでのそのような活性の評価は、一本鎖DNase感受性アッセイ、デジタルPCR、または次世代シーケンシングなどの、様々な分子アッセイに現在依拠している。導入されたCRISPR/Cas剤の活性をより効率的に評価し、in vivoで特定の組織または細胞型を標的にするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法および手段が必要である。
in vivoでCRISPR/Cas媒介性非相同末端結合活性および/またはCRISPR/Cas誘導性組換え活性を評価するための方法および組成物が提供される。一態様では、第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのCRISPRリポーターを含む非ヒト動物であって、CRISPRリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、第1のリポータータンパク質と第2のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物が提供される。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。
形態(例えば、対立遺伝子)で存在する。
I.概要
in vivoでの導入されたCRISPR/Cas剤の送達の効率およびそれによる突然変異生成または標的遺伝子改変の効率の評価は、現在、一本鎖DNase感受性アッセイ、デジタルPCR、または次世代シーケンシングなどの様々な分子アッセイに依拠している。CRISPR/Cas剤の活性をより効率的に評価し、in vivoで特定の組織または細胞型を標的にするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法および手段が必要である。
本明細書に開示される方法および組成物は、CRISPRリポーターを使用して、in vivoまたはex vivoでCRISPRリポーターを改変する、導入されたクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)系またはそのような系の構成成分の能力を評価する。
2つのCRISPR/Casヌクレアーゼ切断部位間の配列の標的化された切り出しもしくはCRISPR/Casヌクレアーゼ切断部位の近傍の配列の標的化された破壊を検出および測定するため、ならびに/または標的核酸の外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを検出および測定するためのCRISPRリポーターが、本明細書で提供される。本明細書で提供されるCRISPRリポーターは、第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれたポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーター、次いで、1つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列を含むリポーターカセットを含んでもよい。あるいは、またはさらに、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、カノニカルなポリアデニル化ヘキサマー(AATAAA、ポリA認識モチーフまたはポリA認識配列と呼ばれる)に、またはその近傍に第3のガイドRNA標的配列を含んでもよい。Pgkポリアデニル化シグナル中のカノニカルなポリアデニル化ヘキサマーの近傍のガイドRNA標的配列の例としては、配列番号48〜52が挙げられる。しかしながら、任意の所望のガイドRNA標的配列を、CRISPRリポーター中に含有させるか、または操作して、任意のガイドRNAまたはガイドRNAの組合せを試験することができる。あるいは、またはさらに、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、第1および第2のリコンビナーゼ認識部位によって挟まれていてもよい。ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、1つまたは複数のリポータータンパク質の転写および発現を防止する。しかしながら、CRISPR/Casヌクレアーゼによる第1および第2のガイドRNA標的配列の切断ならびに転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを含む介在配列の切り出しの際に、1つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列によって転写を進行させて、その発現を可能にすることができる。あるいは、ポリA認識モチーフ(カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーAATAAA)での、またはその近傍でのガイドRNA標的配列の切断ならびにNHEJに媒介される小さい挿入および欠失(インデル)によるポリA認識モチーフの破壊の際に、1つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列によって転写を進行させて、その発現を可能にすることができる。
本明細書に記載のCRISPRリポーターを含む細胞および非ヒト動物も提供される。CRISPRリポーターを、細胞もしくは非ヒト動物のゲノム(すなわち、染色体)中に安定に組み込むか、または染色体の外部に位置させることができる(例えば、染色体外で複製するDNA)。必要に応じて、CRISPRリポーターは、ゲノム中に安定に組み込まれる。安定に組み込まれるCRISPRリポーターを、非ヒト動物のゲノム中に無作為に組み込むか(すなわち、トランスジェニック)、または非ヒト動物のゲノムの所定の領域中に組み込むことができる(すなわち、ノックイン)。必要に応じて、CRISPRリポーターは、セーフハーバー遺伝子座などの、ゲノムの所定の領域中に安定に組み込まれる。CRISPRリポーターが安定に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、CRISPRリポーターについてヘテロ接合性であるか、またはCRISPRリポーターについてホモ接合性であってもよい。二倍体の生物体は、各遺伝子座に2つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に2つの同一の対立遺伝子が存在する場合にはホモ接合体と記載され、2つの対立遺伝子が異なる場合にはヘテロ接合体と記載される。
もよく、新鮮であるか、または凍結されていてもよく、自然交配またはin vitroでの受精から誘導されたものであってもよい。
本明細書に記載のCRISPRリポーターを、細胞または非ヒト動物中の標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込むことができる。遺伝子を発現することができる任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。
CRISPR/Cas系は、転写物、およびCas遺伝子の発現に関与する、またはCas遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。CRISPR/Cas系は、例えば、I型、II型、またはIII型系であり得る。あるいは、CRISPR/Cas系は、V型系(例えば、V−A亜型またはV−B亜型)であり得る。本明細書に開示される組成物および方法において使用されるCRISPR/Cas系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、それらの天然に存在する状態から変更もしくは突然変異させたか、自然には天然に付随する少なくとも1つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないか、または、天然には付随しない少なくとも1つの他の構成成分が付随する系の1つまたは複数の構成成分などの、人間の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、天然に存在しないCRISPR/Cas系では、天然には一緒に存在しないgRNAおよびCasタンパク質、天然には存在しないCasタンパク質、または天然には存在しないgRNAを含むCRISPR複合体を使用することができる。
Casタンパク質は、一般に、ガイドRNA(gRNA、下でより詳細に記載されている)と相互作用し得る少なくとも1つのRNA認識または結合ドメインを含む。Casタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン(例えば、DNaseまたはRNaseドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。一部のそのようなドメイン(例えば、DNaseドメイン)は、天然のCasタンパク質に由来するものであってもよい。他のそのようなドメインを付加して、改変Casタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Cas9タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Cpf1タンパク質(例えば、FnCpf1)は5ヌクレオチド5’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のPAM配列から18番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の23番目の塩基の後ろで起こる。Casタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断(例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断)を創出させる完全な切断活性を有してもよいか、またはそれは標的ゲノム遺伝子座において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
「ガイドRNA」または「gRNA」は、Casタンパク質(例えば、Cas9タンパク質)に結合し、Casタンパク質を標的DNA内の特定の場所にターゲティングするRNA分子である。ガイドRNAは、2つのセグメント:「DNA標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、RNA内のヌクレオチドの連続したひと続きなどの、分子の区画または領域を含む。Cas9に対するものなどの一部のgRNAは、2つの別々のRNA分子:「活性化因子−RNA」(例えば、tracrRNA)および「標的化因子−RNA」(例えば、CRISPR RNAまたはcrRNA)を含み得る。他のgRNAは、単一のRNA分子(単一のRNAポリヌクレオチド)であり、「単一分子gRNA」、「単一ガイドRNA,」または「sgRNA」とも称され得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2013/176772、WO2014/065596、WO2014/089290、WO2014/093622、WO2014/099750、WO2013/142578、およびWO2014/131833を参照されたい。Cas9に関しては、例えば、単一ガイドRNAは、tracrRNAと融合したcrRNA(例えば、リンカーを介して)を含み得る。Cpf1に関しては、例えば、標的配列への結合および/または標的配列の切断を実現するためにはcrRNAのみが必要である。「ガイドRNA」および「gRNA」という用語は、2重分子(すなわち、モジュラー)gRNAおよび単一分子gRNAの両方を含む。
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(バージョン1;配列番号39);GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(バージョン2;配列番号7); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(バージョン3;配列番号8);およびGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(バージョン4;配列番号9)
を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。任意のガイドRNA標的配列を標的とするガイドRNAとしては、例えば、ガイドRNAの3’末端上の例示的なガイドRNA足場配列のいずれかと融合したガイドRNAの5’末端上のDNA標的化セグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書(例えば、配列番号2、14、20、22、24、26、28、29、30、31、35、36または55)に開示されるDNA標的化セグメント(すなわち、ガイド配列またはガイド)のいずれかを配列番号39、7、8または9のいずれか1つの5’末端と接合して、単一のガイドRNA(キメラガイドRNA)を形成することができる。本明細書の他の箇所で開示されるガイドRNAバージョン1、2、3、および4は、それぞれ足場バージョン1、2、3、および4と接合したDNA標的化セグメント(すなわち、ガイド配列またはガイド)を指す。
「ガイドRNA認識配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在すればgRNAのDNA標的化セグメントが結合する標的DNAに存在する核酸配列を包含する。ガイドRNA認識配列という用語は、本明細書で使用される場合、標的二本鎖DNAの両方の鎖(すなわち、ガイドRNAがハイブリダイズする相補鎖上の配列、およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する非相補鎖上の対応する配列)を包含する。「ガイドRNA標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、PAMに隣接する非相補鎖上(すなわち、PAMの上流または5’側)の配列を指す。すなわち、ガイドRNA標的配列は、ガイドRNAがハイブリダイズする相補鎖上の配列に対応する非相補鎖上の配列を指す。ガイドRNA標的配列は、ガイドRNAのDNA標的化セグメントと等しいが、ウラシルの代わりにチミンである。一例として、Cas9酵素に対するガイドRNA標的配列は、5’−NGG−3’PAMに隣接する非相補鎖上の配列を指すことになる。ガイドRNA認識配列は、ガイドRNAが相補性を有するように設計された配列を含み、ガイドRNA認識配列の相補鎖とガイドRNAのDNA標的化セグメントのハイブリダイゼーションにより、CRISPR複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドRNA認識配列またはガイドRNA標的配列は、下でより詳細に記載されているCasタンパク質の切断部位も含む。ガイドRNA認識配列またはガイドRNA標的配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
生きている動物の組織および臓器へのCRISPR/Casの送達を評価するため、およびその中でのCRISPR/Cas活性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法により、本明細書の他の箇所に記載のCRISPRリポーターを含む非ヒト動物を使用することができる。
本明細書の他の箇所に記載のCRISPRリポーターを含む非ヒト動物を使用してin vivoでCRISPR/Cas誘導性NHEJ活性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、非ヒト動物に、(i)CRISPRリポーター中の第1のガイドRNA標的配列を標的にするように設計された第1のガイドRNA;(ii)CRISPRリポーター中の第2のガイドRNA標的配列を標的にするように設計された第2のガイドRNA;および(iii)Casタンパク質(例えば、Cas9タンパク質)を導入するステップ;ならびに(b)1つまたは複数の異なるリポータータンパク質の少なくとも1つの活性または発現を測定するステップを含んでもよい。必要に応じて、第1のガイドRNAと第2のガイドRNAは同一であってもよく、第1のガイドRNA標的配列と第2のガイドRNA標的配列は同一であってもよい。あるいは、第1のガイドRNAと第2のガイドRNAは異なっていてもよく、第1のガイドRNA標的配列と第2のガイドRNA標的配列は異なっていてもよい。第1のガイドRNAがCasタンパク質と複合体を形成し、Casタンパク質をCRISPRリポーターに方向付け、第2のガイドRNAがCasタンパク質と複合体を形成し、Casタンパク質をCRISPRリポーターに方向付け、第1のCas/ガイドRNA複合体が第1のガイドRNA標的配列を切断し、第2のCas/ガイドRNA複合体が第2のガイドRNA標的配列を切断し、1つまたは複数のリポータータンパク質の上流のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの切り出しをもたらす場合、リポータータンパク質の活性または発現が誘導される。あるいは、第1もしくは第2のガイドRNA標的配列または第3のガイドRNA標的配列が、ポリA認識モチーフ(カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーAATAAA)にあるか、またはその近傍にある場合、第1および第2のガイドRNAの対の代わりに単一のガイドRNAを導入することができ、単一のガイドRNAは、Casタンパク質と複合体を形成し、Casタンパク質をCRISPRリポーターに方向付け、Cas/ガイドRNA複合体は、カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーで、またはその近傍でガイドRNA標的配列を切断し、カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーの破壊、その結果として、1つまたは複数のリポータータンパク質の上流のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの破壊をもたらす。
細胞もしくは非ヒト動物へのCRISPR/Casの送達を最適化するため、またはin vivoもしくはex vivoでのCRISPR/Cas誘導性NHEJ活性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、(a)第1の非ヒト動物において1回目の本明細書の他の箇所に記載のCRISPRリポーター中のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを切り出すCRISPR/Casの能力を試験する方法を実施するステップ;(b)変数を変化させ、第2の非ヒト動物(すなわち、同じ種の)において変化した変数を用いて2回目のこの方法を実施するステップ;および(c)ステップ(a)における1つまたは複数のリポータータンパク質の少なくとも1つの活性または発現と、ステップ(b)における1つまたは複数の異なるタンパク質の少なくとも1つの活性または発現とを比較し、1つまたは複数の異なるリポータータンパク質の少なくとも1つのより高い活性または発現をもたらす方法(すなわち、より高い有効性をもたらす方法)を選択するステップを含んでもよい。
本明細書の他の箇所に記載のCRISPRリポーターを含む非ヒト動物を使用してin vivoでCRISPR/Cas誘導性組換え活性を評価するための様々な方法が提供される。CRISPRリポーターがリポータータンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルを含むCRISPRリポーターである場合、必要に応じて、ポリアデニル化シグナルは、CRISPR/Cas媒介性切り出しまたはリコンビナーゼ媒介性切り出しによって除去されている。そのような方法は、非ヒト動物に、(i)CRISPRリポーター中のガイドRNA標的配列を標的にするように設計されたガイドRNA;(ii)Casタンパク質(例えば、Cas9タンパク質);および(iii)CRISPRリポーターと組み換わり、CRISPRリポーター内のリポータータンパク質のコード配列を、異なるリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸を導入するステップ;ならびに(b)異なるリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップを含んでもよい。ガイドRNA標的配列は、例えば、改変されるリポータータンパク質のコード配列の内部にあってもよい。必要に応じて、Casタンパク質を、本明細書の他の箇所に記載の外因性ドナー核酸に係留することができる。ガイドRNAがCasタンパク質と複合体を形成し、Casタンパク質をCRISPRリポーターに方向付け、Cas/ガイドRNA複合体が、ガイドRNA標的配列を切断し、CRISPRリポーターが、外因性ドナー核酸と組み換わって、CRISPRリポーター内のリポータータンパク質のコード配列を、異なるリポータータンパク質のコード配列に変換する場合、リポータータンパク質の活性または発現が誘導されると予想される。外因性ドナー核酸は、例えば、相同組換え修復(HDR)またはNHEJ媒介性挿入によって、CRISPRリポーターと組み換わり得る。任意の型の外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書の他の箇所に提供される。
本明細書に開示される方法および組成物は、Casタンパク質を用いたCRISPRリポーターの切断後にCRISPRリポーター(すなわち、標的ゲノム遺伝子座)を改変するために外因性ドナー核酸を使用する。そのような方法では、Casタンパク質によりCRISPRリポーターが切断されて一本鎖切断(ニック)または二本鎖切断が創出され、非相同末端結合(NHEJ)媒介性ライゲーションまたは相同組換え修復事象によって外因性ドナー核酸が標的核酸と組み換えられる。必要に応じて、外因性ドナー核酸を用いた修復により、ガイドRNA標的配列またはCas切断部位が除去または破壊され、その結果、標的化された対立遺伝子がCasタンパク質によって再度標的化されることができなくなる。
一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座におけるCasタンパク質媒介性切断によって創出される1つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を5’末端および/または3’末端に有する。これらの突出部は、5’および3’相同アームとも称され得る。例えば、一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座の5’および/または3’標的配列におけるCasタンパク質媒介性切断によって創出される1つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を5’末端および/または3’末端に有する。一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を5’末端のみに有するかまたは3’末端のみに有する。例えば、一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を、標的ゲノム遺伝子座の5’標的配列において創出される突出部に相補的な5’末端のみに有するかまたは標的ゲノム遺伝子座の3’標的配列において創出される突出部に相補的な3’末端のみに有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を5’および3’末端の両方に有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を5’および3’末端の両方に有し、これらは、例えば、それぞれ標的ゲノム遺伝子座におけるCas媒介性切断によって生じる第1および第2の突出部に相補的である。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖の相補的な領域を、ドナー核酸の上鎖の5’末端およびドナー核酸の下鎖の5’末端から伸長させ、それにより、各末端に5’突出部を創出することができる。あるいは、一本鎖の相補的な領域をドナー核酸の上鎖の3’末端および鋳型の下鎖の3’末端から伸長させ、それにより、3’突出部を創出することができる。
一部の外因性ドナー核酸は、相同アームを含む。外因性ドナー核酸が核酸挿入断片も含む場合、相同アームにより核酸挿入断片が挟まれていてよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを5’および3’(すなわち、上流および下流の)相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー核酸内の核酸挿入断片に対する相同アームの相対的な位置に関する。5’および3’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「5’標的配列」および「3’標的配列」と称される標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応する。
細胞もしくは非ヒト動物へのCRISPR/Casの送達を最適化するため、またはin vivoもしくはex vivoでのCRISPR/Cas誘導性組換え活性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、(a)第1の非ヒト動物において1回目の標的ゲノム遺伝子座の本明細書の他の箇所に記載の外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを試験する方法を実施するステップ;(b)変数を変化させ、第2の非ヒト動物(すなわち、同じ種の)において変化した変数を用いて2回目のこの方法を実施するステップ;および(c)ステップ(a)におけるリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ(b)におけるリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択する(すなわち、より高い有効性をもたらす方法を選択する)ステップを含んでもよい。
本明細書に開示される方法は、細胞または非ヒト動物に、ガイドRNA、外因性ドナー
核酸、およびCasタンパク質のうちの1つもしくは複数または全部を導入することを含む。「導入」は、細胞または非ヒト動物に、核酸またはタンパク質が細胞の内部または非ヒト動物内の細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で核酸またはタンパク質を提示することを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、2つまたはそれより多い構成成分(例えば、2つの構成成分、または全部の構成成分)を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、ガイドRNAの導入前にCasタンパク質を細胞もしくは非ヒト動物に導入するか、またはガイドRNAの導入後にそれを導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸を、Casタンパク質およびガイドRNAの導入の前に導入するか、またはCasタンパク質およびガイドRNAの導入後にそれを導入することができる(例えば、外因性ドナー核酸を、Casタンパク質およびガイドRNAの導入の約1、2、3、4、8、12、24、36、48、または72時間前または後に投与することができる)。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2015/0240263およびUS2015/0110762を参照されたい。さらに、2つまたはそれより多い構成成分を、同じ送達方法または異なる送達方法によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、2つまたはそれより多い構成成分を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、非ヒト動物に導入することができる。
mRNAのgRNA核酸に対する比を含んでもよい。
本明細書に開示される方法は、CRISPRリポーターによってコードされる1つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性を検出または測定するステップをさらに含んでもよい。発現または活性を検出または測定するための方法は、リポータータンパク質に依存すると予想される。
本明細書の他の箇所に記載のCRISPRリポーターを含む非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変生物を産生するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに好適である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるChoら(2009年)Current Protocols in Cell Biology42巻:19.11:19.11.1〜19.11.22頁およびGama Sosaら(2010年)Brain Struct. Funct. 214巻(2〜3号):91〜109頁を参照されたい。そのような遺伝子改変非ヒト動物を、例えば、標的遺伝子座(例えば、Rosa26などのセーフハーバー遺伝子座)での遺伝子ノックインによって、または無作為に組み込まれる導入遺伝子の使用によって生成することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2014/093622およびWO2013/176772を参照されたい。ある構築物をRosa26遺伝子座に標的にする方法は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2012/0017290、US2011/0265198、およびUS2013/0236946に記載されている。
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端から始まり、フォワード方向に(すなわち、各線の左から右に)3’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に(すなわち、各線の左から右に)カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
CRISPRリポーターの検証
CRISPR/Cas9技術は、有望で新しい治療モダリティである。in vivoでの導入されたCRISPR/Cas9剤による突然変異生成または標的遺伝子改変の効率の評価は、現在、一本鎖DNase感受性アッセイ、デジタルPCR、または次世代シーケンシングなどの様々な分子アッセイに依拠している。
(項目1)
第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのCRISPRリポーターを含む非ヒト動物であって、前記CRISPRリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物。
(項目2)
前記CRISPRリポーターが、前記CRISPRリポーターの外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを評価するためのものでもある、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目3)
前記第1のリポータータンパク質が、第3のガイドRNA標的配列を含み、前記CRISPRリポーターの前記外因性ドナー核酸との組換えが、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列を、第3のリポータータンパク質のコード配列に変化させる、項目2に記載の非ヒト動物。
(項目4)
前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列を、単一のコドンを変化させることによって、前記第3のリポータータンパク質の前記コード配列に変化させる、項目3に記載の非ヒト動物。
(項目5)
前記第3のガイドRNA標的配列が、前記外因性ドナー核酸によって改変された前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列の一部と重複する、項目3または4に記載の非ヒト動物。
(項目6)
前記第1および第2のリポータータンパク質の1つが、蛍光リポータータンパク質を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目7)
前記蛍光リポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)または強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)を含む、項目6に記載の非ヒト動物。
(項目8)
前記第1および第2のリポータータンパク質が、前記蛍光リポータータンパク質および非蛍光リポータータンパク質を含む、項目6または7に記載の非ヒト動物。
(項目9)
前記蛍光リポータータンパク質を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができ、前記非蛍光タンパク質を、組織化学的アッセイにおいて検出することができる、項目8に記載の非ヒト動物。
(項目10)
前記第1および第2のリポータータンパク質の1つが、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目11)
前記第1のポリアデニル化シグナルも、第1のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目12)
前記第1のリコンビナーゼのための前記リコンビナーゼ認識部位が、loxP配列である、項目11に記載の非ヒト動物。
(項目13)
前記リポーターカセットが、介在内部リボソーム進入部位(IRES)または介在2Aペプチドコード配列によって隔てられた、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列と、前記第2のリポータータンパク質の前記コード配列とを含む多シストロン性核酸を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目14)
前記多シストロン性核酸が、介在P2Aペプチドコード配列によって隔てられた、ベータ−ガラクトシダーゼコード配列と、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)コード配列または強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)コード配列とを含む、項目13に記載の非ヒト動物。
(項目15)
前記CRISPRリポーターが、前記標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目16)
前記CRISPRリポーターの5’末端が、3’スプライシング配列をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目17)
前記CRISPRリポーターが、選択カセットをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目18)
前記選択カセットが、第2のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、項目17に記載の非ヒト動物。
(項目19)
前記選択カセットが、薬物耐性遺伝子を含む、項目17または18に記載の非ヒト動物。
(項目20)
前記第1のガイドRNA標的配列と、前記第2のガイドRNA標的配列との距離が、約500塩基対未満である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目21)
前記第1のガイドRNA標的配列と、前記第2のガイドRNA標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号41を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目22)
ラットまたはマウスである、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目23)
マウスである、項目22に記載の非ヒト動物。
(項目24)
前記標的ゲノム遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目25)
前記セーフハーバー遺伝子座が、Rosa26遺伝子座である、項目24に記載の非ヒト動物。
(項目26)
前記CRISPRリポーターが、前記Rosa26遺伝子座の第1のイントロンに挿入される、項目25に記載の非ヒト動物。
(項目27)
前記非ヒト動物がマウスであり、
前記標的ゲノム遺伝子座がRosa26遺伝子座であり、
前記CRISPRリポーターが内因性Rosa26プロモーターに作動可能に連結され、前記Rosa26遺伝子座の第1のイントロンに挿入され、5’から3’に向かって、
(a)3’スプライシング配列;
(b)(i)第1および第2のloxP部位;ならびに
(ii)第1のガイドRNA標的配列と、第2のガイドRNA標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号41を含む、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル;ならびに
(c)5’から3’に向かって、
(i)ベータ−ガラクトシダーゼコード配列;
(ii)P2Aコード配列;
(iii)配列番号42を含む第3のガイドRNA標的配列を含む、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)コード配列;および
(iv)前記第1のポリアデニル化シグナルと第2のポリアデニル化シグナルとが異なる、前記第2のポリアデニル化シグナルを含むリポーターカセット
を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目28)
前記CRISPRリポーターが、
(d)前記リポーターカセットの3’側の選択カセット
をさらに含み、前記選択カセットは、FRT部位によって挟まれており、5’から3’に向かって、
(i)ヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列;および
(ii)第3のポリアデニル化シグナル
を含む、項目27に記載の非ヒト動物。
(項目29)
前記標的ゲノム遺伝子座で前記CRISPRリポーターについてヘテロ接合性である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
(項目30)
前記標的ゲノム遺伝子座で前記CRISPRリポーターについてホモ接合性である、項目1から28のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目31)
in vivoでゲノム核酸を切り出すCRISPR/Casヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
(a)項目1から30のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、
(i)前記CRISPRリポーター中の前記第1のガイドRNA標的配列にハイブリダイズするように設計された第1のガイドRNA;
(ii)前記CRISPRリポーター中の前記第2のガイドRNA標的配列にハイブリダイズするように設計された第2のガイドRNA;および
(iii)Casタンパク質
を導入するステップ;ならびに
(b)前記第1および第2のリポータータンパク質の少なくとも1つの活性または発現を測定するステップ
を含む、方法。
(項目32)
前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記Casタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、項目31または32に記載の方法。
(項目34)
前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの形態で前記非ヒト動物に導入される、項目31または32に記載の方法。
(項目35)
前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするDNAの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目31または32に記載の方法。
(項目36)
前記第1のガイドRNAと、前記第2のガイドRNAが同一であり、それぞれ、配列番号2に記載の配列を含む、項目31から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
ステップ(b)において測定された前記リポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ(b)が、フローサイトメトリーアッセイを含む、項目31から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
ステップ(b)において測定された前記リポータータンパク質が、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質であり、ステップ(b)が、組織化学染色アッセイを含む、項目31から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
ステップ(a)における前記ガイドRNAがRNAの形態で導入される、項目31から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
ステップ(a)における前記ガイドRNAが、前記ガイドRNAをコードするDNAの形態で前記非ヒト動物にそれぞれ導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目31から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、項目31から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記導入するステップが、AAV媒介性送達を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記導入するステップが、AAV8媒介性送達を含み、ステップ(b)が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
in vivoでゲノム核酸を切り出すCRISPR/Casヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
(I)第1の非ヒト動物において1回目の項目31から43のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ;
(II)変数を変化させ、第2の非ヒト動物において変化した変数を用いて2回目のステップ(I)に記載の方法を実施するステップ;および
(III)ステップ(I)における前記リポータータンパク質の活性または発現と、ステップ(II)における少なくとも1つの前記リポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
(項目45)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNAおよび/または前記Casタンパク質を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目44に記載の方法。
(項目46)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNAおよび/または前記Casタンパク質を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目44に記載の方法。
(項目47)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNAおよび/または前記Casタンパク質の濃度または量である、項目44に記載の方法。
(項目48)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるCasタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドRNAの濃度または量である、項目44に記載の方法。
(項目49)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNAである、項目44に記載の方法。
(項目50)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記Casタンパク質である、項目44に記載の方法。
(項目51)
in vivoでゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを試験する方法であって、
(a)前記CRISPRリポーターが、前記CRISPRリポーターの外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを評価するためのものでもあり、前記第1のポリアデニル化シグナルが、前記CRISPRリポーターから除去されており、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列が、第3のガイドRNA標的配列を含む、項目1から30のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供し、前記非ヒト動物に、
(i)前記CRISPRリポーター中の前記第3のガイドRNA標的配列にハイブリダイズするように設計されたガイドRNA;
(ii)Casタンパク質;および
(iii)前記CRISPRリポーターと組み換わり、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列を、第3のリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸
を導入するステップ;ならびに
(b)前記第3のリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップ
を含む、方法。
(項目52)
前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記Casタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの形態で前記非ヒト動物に導入される、項目51に記載の方法。
(項目55)
前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするDNAの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目51に記載の方法。
(項目56)
ステップ(b)において測定された前記第3のリポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ(b)が、フローサイトメトリーアッセイを含む、項目51から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記第1のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)であり、前記第3のガイドRNAが、配列番号14に記載の配列を含む、項目51から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記第1のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)であり、前記第3のリポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)である、項目51から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記外因性ドナー核酸が、配列番号15または配列番号16に記載の配列を含む、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記外因性ドナー核酸が、一本鎖デオキシヌクレオチドである、項目51から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
ステップ(a)における前記ガイドRNAがRNAの形態で導入される、項目51から60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
ステップ(a)における前記ガイドRNAが、前記ガイドRNAをコードするDNAの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目51から60のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、項目51から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記導入するステップが、AAV媒介性送達を含む、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記導入するステップが、AAV8媒介性送達を含み、ステップ(b)が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
in vivoでゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するCRISPR/Casの能力を最適化する方法であって、
(I)第1の非ヒト動物において1回目の項目51から65のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ;
(II)変数を変化させ、第2の非ヒト動物において前記変化した変数を用いて2回目のステップ(I)に記載の方法を実施するステップ;および
(III)ステップ(I)における前記第3のリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ(II)における前記第3のリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記第3のリポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
(項目67)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNA、前記Casタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの1つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目66に記載の方法。
(項目68)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNA、前記Casタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの1つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目66に記載の方法。
(項目69)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNA、前記Casタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの1つまたは複数の濃度または量である、項目66に記載の方法。
(項目70)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、項目66に記載の方法。
(項目71)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるCasタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドRNAの濃度または量である、項目66に記載の方法。
(項目72)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNAである、項目66に記載の方法。
(項目73)
ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるCasタンパク質である、項目66に記載の方法。
Claims (78)
- 第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのCRISPRリポーターを含む非ヒト動物であって、前記CRISPRリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物。
- 前記CRISPRリポーターが、前記CRISPRリポーターの外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを評価するためのものでもある、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 前記第1のリポータータンパク質が、第3のガイドRNA標的配列を含み、前記CRISPRリポーターの前記外因性ドナー核酸との組換えが、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列を、第3のリポータータンパク質のコード配列に変化させる、請求項2に記載の非ヒト動物。
- 前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列を、単一のコドンを変化させることによって、前記第3のリポータータンパク質の前記コード配列に変化させる、請求項3に記載の非ヒト動物。
- 前記第3のガイドRNA標的配列が、前記外因性ドナー核酸によって改変された前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列の一部と重複する、請求項3または4に記載の非ヒト動物。
- 前記第1および第2のリポータータンパク質の1つが、蛍光リポータータンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記蛍光リポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)または強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)を含む、請求項6に記載の非ヒト動物。
- 前記第1および第2のリポータータンパク質が、前記蛍光リポータータンパク質および非蛍光リポータータンパク質を含む、請求項6または7に記載の非ヒト動物。
- 前記蛍光リポータータンパク質を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができ、前記非蛍光タンパク質を、組織化学的アッセイにおいて検出することができる、請求項8に記載の非ヒト動物。
- 前記第1および第2のリポータータンパク質の1つが、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記第1のポリアデニル化シグナルも、第1のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記第1のリコンビナーゼのための前記リコンビナーゼ認識部位が、loxP配列である、請求項11に記載の非ヒト動物。
- 前記リポーターカセットが、介在内部リボソーム進入部位(IRES)または介在2Aペプチドコード配列によって隔てられた、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列と、前記第2のリポータータンパク質の前記コード配列とを含む多シストロン性核酸を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記多シストロン性核酸が、介在P2Aペプチドコード配列によって隔てられた、ベータ−ガラクトシダーゼコード配列と、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)コード配列または強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)コード配列とを含む、請求項13に記載の非ヒト動物。
- 前記CRISPRリポーターが、前記標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記CRISPRリポーターの5’末端が、3’スプライシング配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記CRISPRリポーターが、選択カセットをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記選択カセットが、第2のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、請求項17に記載の非ヒト動物。
- 前記選択カセットが、薬物耐性遺伝子を含む、請求項17または18に記載の非ヒト動物。
- 前記第1のガイドRNA標的配列と、前記第2のガイドRNA標的配列との距離が、約500塩基対未満である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記第1のガイドRNA標的配列と、前記第2のガイドRNA標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号41を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- ラットまたはマウスである、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- マウスである、請求項22に記載の非ヒト動物。
- 前記標的ゲノム遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記セーフハーバー遺伝子座が、Rosa26遺伝子座である、請求項24に記載の非ヒト動物。
- 前記CRISPRリポーターが、前記Rosa26遺伝子座の第1のイントロンに挿入される、請求項25に記載の非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物がマウスであり、
前記標的ゲノム遺伝子座がRosa26遺伝子座であり、
前記CRISPRリポーターが内因性Rosa26プロモーターに作動可能に連結され、前記Rosa26遺伝子座の第1のイントロンに挿入され、5’から3’に向かって、
(a)3’スプライシング配列;
(b)(i)第1および第2のloxP部位;ならびに
(ii)第1のガイドRNA標的配列と、第2のガイドRNA標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号41を含む、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル;ならびに
(c)5’から3’に向かって、
(i)ベータ−ガラクトシダーゼコード配列;
(ii)P2Aコード配列;
(iii)配列番号42を含む第3のガイドRNA標的配列を含む、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)コード配列;および
(iv)前記第1のポリアデニル化シグナルと第2のポリアデニル化シグナルとが異なる、前記第2のポリアデニル化シグナルを含むリポーターカセット
を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。 - 前記CRISPRリポーターが、
(d)前記リポーターカセットの3’側の選択カセット
をさらに含み、前記選択カセットは、FRT部位によって挟まれており、5’から3’に向かって、
(i)ヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列;および
(ii)第3のポリアデニル化シグナル
を含む、請求項27に記載の非ヒト動物。 - 前記標的ゲノム遺伝子座で前記CRISPRリポーターについてヘテロ接合性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記標的ゲノム遺伝子座で前記CRISPRリポーターについてホモ接合性である、請求項1から28のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- in vivoでゲノム核酸を切り出すCRISPR/Casヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
(a)請求項1から30のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、
(i)前記CRISPRリポーター中の前記第1のガイドRNA標的配列にハイブリダイズするように設計された第1のガイドRNA;
(ii)前記CRISPRリポーター中の前記第2のガイドRNA標的配列にハイブリダイズするように設計された第2のガイドRNA;および
(iii)Casタンパク質
を導入するステップ;ならびに
(b)前記第1および第2のリポータータンパク質の少なくとも1つの活性または発現を測定するステップ
を含む、方法。 - 前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項31に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項31または32に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項31または32に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするDNAの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項31または32に記載の方法。
- 前記第1のガイドRNAと、前記第2のガイドRNAが同一であり、それぞれ、配列番号2に記載の配列を含む、請求項31から35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において測定された前記リポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ(b)が、フローサイトメトリーアッセイを含む、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において測定された前記リポータータンパク質が、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質であり、ステップ(b)が、組織化学染色アッセイを含む、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)における前記ガイドRNAがRNAの形態で導入される、請求項31から38のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)における前記ガイドRNAが、前記ガイドRNAをコードするDNAの形態で前記非ヒト動物にそれぞれ導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項31から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、請求項31から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、AAV媒介性送達を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記導入するステップが、AAV8媒介性送達を含み、ステップ(b)が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、請求項42に記載の方法。
- in vivoでゲノム核酸を切り出すCRISPR/Casヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
(I)第1の非ヒト動物において1回目の請求項31から43のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ;
(II)変数を変化させ、第2の非ヒト動物において変化した変数を用いて2回目のステップ(I)に記載の方法を実施するステップ;および
(III)ステップ(I)における前記リポータータンパク質の活性または発現と、ステップ(II)における少なくとも1つの前記リポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。 - ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNAおよび/または前記Casタンパク質を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項44に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNAおよび/または前記Casタンパク質を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項44に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNAおよび/または前記Casタンパク質の濃度または量である、請求項44に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるCasタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドRNAの濃度または量である、請求項44に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNAである、請求項44に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記Casタンパク質である、請求項44に記載の方法。
- in vivoでゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを試験する方法であって、
(a)前記CRISPRリポーターが、前記CRISPRリポーターの外因性ドナー核酸とのCRISPR/Cas誘導性組換えを評価するためのものでもあり、前記第1のポリアデニル化シグナルが、前記CRISPRリポーターから除去されており、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列が、第3のガイドRNA標的配列を含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供し、前記非ヒト動物に、
(i)前記CRISPRリポーター中の前記第3のガイドRNA標的配列にハイブリダイズするように設計されたガイドRNA;
(ii)Casタンパク質;および
(iii)前記CRISPRリポーターと組み換わり、前記第1のリポータータンパク質の前記コード配列を、第3のリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸
を導入するステップ;ならびに
(b)前記第3のリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップ
を含む、方法。 - 前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項51に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項51に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項51に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、前記Casタンパク質をコードするDNAの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項51に記載の方法。
- ステップ(b)において測定された前記第3のリポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ(b)が、フローサイトメトリーアッセイを含む、請求項51から55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)であり、前記第3のガイドRNAが、配列番号14に記載の配列を含む、請求項51から56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)であり、前記第3のリポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)である、請求項51から57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性ドナー核酸が、配列番号15または配列番号16に記載の配列を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記外因性ドナー核酸が、一本鎖デオキシヌクレオチドである、請求項51から59のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)における前記ガイドRNAがRNAの形態で導入される、請求項51から60のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)における前記ガイドRNAが、前記ガイドRNAをコードするDNAの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記DNAが、前記非ヒト動物中の1つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項51から60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、請求項51から62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入するステップが、AAV媒介性送達を含む、請求項63に記載の方法。
- 前記導入するステップが、AAV8媒介性送達を含み、ステップ(b)が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、請求項64に記載の方法。
- in vivoでゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するCRISPR/Casの能力を最適化する方法であって、
(I)第1の非ヒト動物において1回目の請求項51から65のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ;
(II)変数を変化させ、第2の非ヒト動物において前記変化した変数を用いて2回目のステップ(I)に記載の方法を実施するステップ;および
(III)ステップ(I)における前記第3のリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ(II)における前記第3のリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記第3のリポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。 - ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNA、前記Casタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの1つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項66に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記ガイドRNA、前記Casタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの1つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項66に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNA、前記Casタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの1つまたは複数の濃度または量である、請求項66に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、請求項66に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるCasタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドRNAの濃度または量である、請求項66に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドRNAである、請求項66に記載の方法。
- ステップ(II)における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるCasタンパク質である、請求項66に記載の方法。
- 第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのCRISPRリポーターを含む非ヒト動物細胞であって、前記CRISPRリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物細胞。
- 第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのCRISPRリポーターを含む非ヒト動物ゲノムであって、前記CRISPRリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物ゲノム。
- 相同アームによって挟まれたCRISPRリポーターを含む標的化ベクターであって、前記CRISPRリポーターが、第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのものであり、前記CRISPRリポーターが、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっており、前記相同アームが、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である、標的化ベクター。
- 請求項1から30のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
(a)標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたCRISPRリポーターを含むように多能性非ヒト動物細胞のゲノムを改変するステップであって、前記CRISPRリポーターが、第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのものであり、前記CRISPRリポーターが、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっている、ステップ;
(b)前記CRISPRリポーターを含む遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を同定または選択するステップ;
(c)前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ;および
(d)代理母に前記非ヒト動物宿主胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。 - 請求項1から30のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
(a)標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたCRISPRリポーターを含むように非ヒト動物の1細胞期胚のゲノムを改変するステップであって、前記CRISPRリポーターが、第1および第2のガイドRNA標的配列の間の核酸のCRISPR/Cas誘導性切り出しを評価するためのものであり、前記CRISPRリポーターが、前記第1および第2のガイドRNA標的配列によって挟まれた第1のポリアデニル化シグナル、次いで、第1のリポータータンパク質のコード配列と、第2のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第1のリポータータンパク質と前記第2のリポータータンパク質とが異なっている、ステップ;
(b)遺伝子改変された非ヒト動物の1細胞期胚を選択するステップ;および
(c)代理母に前記遺伝子改変された非ヒト動物の1細胞期胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。
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