JP6778175B2 - 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一様に小さな粒径を有する被封入核酸ナノ粒子を生産するプロセスを提供する。本発明の1つの実施形態のステップを一般的に説明する代表的な流れ図が、図1に示される。ステップ100では、1つまたは複数の脂質流は、第1の交差ポイントで1つまたは複数の核酸流と合流して、第1の合流した流れを供給する。次に、第1の合流した流れは、合流した流れの個々の流れの会合を可能にするように流動され(ステップ110)、すぐに脂質ナノ粒子構築および核酸封入のプロセスが起きる。初期核酸流(複数可)に関して選択される特定パラメーターに依存して、合流した流れは任意選択で、水性媒質でさらに希釈して(ステップ120)、第1の出口溶液を得てもよい(ステップ130)。あるいは、任意選択の希釈ステップ120を省略してもよく、第1の出口流は、ステップ100において適切に希釈された核酸流(複数可)の使用により、流動している合流した流れから直接得てもよい。ステップ130で得られる第1の出口溶液は、被封入核酸ナノ粒子を含有する。
本発明で使用するのに適した核酸として、アンチセンスDNAまたはRNA組成物、キメラDNA:RNA組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそれらの類似体、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、および小核酸分子、RNAi剤、短鎖干渉核酸(siNA)、メッセンジャーリボ核酸(メッセンジャーRNA、mRNA)、二重鎖RNA(dsRNA)、ミクロRNA(miRNA)、および短鎖ヘアピンRNA(shRNA)分子、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸リボヌクレオチド(LNA)、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、sisiRNA(低分子内部セグメント化干渉RNA)、aiRNA(非対称干渉RNA)、および細胞培養物、対象または生物中などの関連細胞および/または組織に対してセンス鎖とアンチセンス鎖との間に1つ、2つまたはそれ以上のミスマッチを有するsiRNAが挙げられる。かかる化合物は、精製されてもよく、または部分的に精製されてもよく、また天然に存在してもよく、または合成であってもよく、また化学的に修飾されてもよい。一実施形態では、生物学的活性剤は、RNAi剤、短鎖干渉核酸(siNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、二重鎖RNA(dsRNA)、ミクロRNA(miRNA)、または短鎖ヘアピンRNA(shRNA)分子である。一実施形態では、生物学的核酸剤は、RNA干渉(RNAi)を媒介するのに有用なRNAi剤である。
を有する化合物が挙げられ得るが、限定されない。
3.1 陽イオン性脂質
脂質組成物における使用に適した陽イオン性脂質として、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)N,N,N−トリメチルアンモニウム(DOTAP)クロリド、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N−ジメチル−2,3−ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)、1,2−ジオレオイルカルバミル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(DOCDAP)、1,2−ジリネオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(DLINDAP)、トリフルオロ酢酸ジオレオイルオキシ−N−(2−スペルミンカルボキシアミド(2-spenninecarboxamido))エチル−N,N−ジメチル−プロパンアミニウム(DOSPA)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(spennine)(DOGS)、DC−Chol、1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、3−ジメチルアミノ−2−(コレスタ−5−エン−3ベータ−オキシブタン−4−オキシ)−1−(cis,cis−9,12−オクタデカジエンオキシ)プロパン(CLinDMA)、2−[5’−(コレスタ−5−エン−3−オキシ)−3’−オキサペントキシ]−3−ジメチル−1−(cis,cis−9’,12’−オクタデカジエンオキシ)プロパン(CpLinDMA)、N,N−ジメチル−3,4−ジオレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、1,2−N,N’−ジオレイルカルバミル−3−ジメチアミノプロパン(DOcarbDAP)および/またはそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
を有する化合物、またはその塩である。
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((1,3−ジメチルピロリジン−3−カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロパノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((4−(ピロリジン−1−イル)ブタノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((4−(ピペリジン−1−イル)ブタノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((3−(ジメチルアミノ)プロパノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((2−(ジメチルアミノ)アセトキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((3−(ジエチルアミノ)プロパノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((1,4−ジメチルピペリジン−4−カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((1−(シクロプロピルメチル)ピペリジン−4−カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((3−モルホリノプロパノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
2−(((1,3−ジメチルピロリジン−3−カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(8−(オクタノイルオキシ)オクタノエート);
(9Z,12Z)−3−((4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)−2−((((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−((4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)−2−((((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−((4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)−2−(((((1−エチルピペリジン−3−イル)メトキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
2−((((2−(ジエチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(2−ヘプチルウンデカノエート);
(9Z,12Z)−3−(((2−(ジエチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)−2−(((2−ヘプチルウンデカノイル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
2−((((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(2−ヘプチルウンデカノエート);
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−2−(((2−ヘプチルウンデカノイル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((2−(ジメチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)−2−(((3−オクチルウンデカノイル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
2−((((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(3−オクチルウンデカノエート);
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−2−(((3−オクチルウンデカノイル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−2−(((9−ペンチルテトラデカノイル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−2−(((5−ヘプチルドデカノイル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(2,2−ビス(ヘプチルオキシ)アセトキシ)−2−((((2−(ジメチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート;および
(9Z,12Z)−3−((6,6−ビス(オクチルオキシ)ヘキサノイル)オキシ)−2−((((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート
から成る群から選択される化合物が挙げられる。
を有する化合物、またはその塩である。
2−(10−ドデシル−3−エチル−8,14−ジオキソ−7,9,13−トリオキサ−3−アザオクタデカン−18−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(9−ドデシル−2−メチル−7,13−ジオキソ−6,8,12−トリオキサ−2−アザヘプタデカン−17−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(9−ドデシル−2−メチル−7,13−ジオキソ−6,8,12−トリオキサ−2−アザペンタデカン−15−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(10−ドデシル−3−エチル−8,14−ジオキソ−7,9,13−トリオキサ−3−アザヘキサデカン−16−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(8−ドデシル−2−メチル−6,12−ジオキソ−5,7,11−トリオキサ−2−アザヘプタデカン−17−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(10−ドデシル−3−エチル−8,14−ジオキソ−7,9,13−トリオキサ−3−アザノナデカン−19−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(9−ドデシル−2−メチル−7,13−ジオキソ−6,8,12−トリオキサ−2−アザオクタデカン−18−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(8−ドデシル−2−メチル−6,12−ジオキソ−5,7,11−トリオキサ−2−アザオクタデカン−18−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(10−ドデシル−3−エチル−8,14−ジオキソ−7,9,13−トリオキサ−3−アザイコサン−20−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(9−ドデシル−2−メチル−7,13−ジオキソ−6,8,12−トリオキサ−2−アザノナデカン−19−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル4,4−ビス((2−エチルヘキシル)オキシ)ブタノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル4,4−ビス((2−プロピルペンチル)オキシ)ブタノエート;
3−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル4,4−ビス((2−プロピルペンチル)オキシ)ブタノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル4,4−ビス((2−プロピルペンチル)オキシ)ブタノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル6,6−ビス(オクチルオキシ)ヘキサノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル6,6−ビス(ヘキシルオキシ)ヘキサノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル6,6−ビス((2−エチルヘキシル)オキシ)ヘキサノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル8,8−ビス(ヘキシルオキシ)オクタノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル8,8−ジブトキシオクタノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル8,8−ビス((2−プロピルペンチル)オキシ)オクタノエート;
3−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル8,8−ビス((2−プロピルペンチル)オキシ)オクタノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル8,8−ビス((2−プロピルペンチル)オキシ)オクタノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル3−オクチルウンデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル3−オクチルウンデカ−2−エノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル7−ヘキシルトリデカ−6−エノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル9−ペンチルテトラデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル9−ペンチルテトラデカ−8−エノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル5−ヘプチルドデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)トリデシル5−ヘプチルドデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ウンデシル5−ヘプチルドデカノエート;
1,3−ビス(オクタノイルオキシ)プロパン−2−イル(3−(((2−(ジメチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)スクシネート;
1,3−ビス(オクタノイルオキシ)プロパン−2−イル(3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)スクシネート;
1−(3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)10−オクチルデカンジオエート;
1−(3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)10−オクチルデカンジオエート;
1−(3−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)10−オクチルデカンジオエート;
1−(3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)10−(2−エチルヘキシル)デカンジオエート;
1−(3−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル)10−(2−エチルヘキシル)デカンジオエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル10−(オクタノイルオキシ)デカノエート;
8−ドデシル−2−メチル−6,12−ジオキソ−5,7,11−トリオキサ−2−アザノナデカン−19−イルデカノエート;
3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル10−(オクタノイルオキシ)デカノエート;
3−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシル10−(オクタノイルオキシ)デカノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((2−(ジメチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)ペンタデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
1−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエノイルオキシ)ペンタデカン−3−イル1,4−ジメチルピペリジン−4−カルボキシレート;
2−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)テトラデシル4,4−ビス((2−エチルヘキシル)オキシ)ブタノエート;
(9Z,12Z)−(12Z,15Z)−3−((3−(ジメチルアミノ)プロパノイル)オキシ)ヘンイコサ−12,15−ジエン−1−イルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(12Z,15Z)−3−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘンイコサ−12,15−ジエン−1−イル3−オクチルウンデカノエート;
(12Z,15Z)−3−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘンイコサ−12,15−ジエン−1−イル5−ヘプチルドデカノエート;
(12Z,15Z)−3−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘンイコサ−12,15−ジエン−1−イル7−ヘキシルトリデカノエート;
(12Z,15Z)−3−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘンイコサ−12,15−ジエン−1−イル9−ペンチルテトラデカノエート;
(12Z,15Z)−1−((((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ)カルボニル)オキシ)ヘンイコサ−12,15−ジエン−3−イル3−(ジメチルアミノ)プロパノエート;
(13Z,16Z)−4−(((2−(ジメチルアミノ)エトキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエン−1−イル2,2−ビス(ヘプチルオキシ)アセテート;
(13Z,16Z)−4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエン−1−イル2,2−ビス(ヘプチルオキシ)アセテート;
2,2−ビス(ヘプチルオキシ)エチル3−((3−エチル−10−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)−8,15−ジオキソ−7,9,14−トリオキサ−3−アザヘプタデカン−17−イル)ジスルファニル)プロパノエート;
(13Z,16Z)−4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエン−1−イルヘプタデカン−9−イルスクシネート;
(9Z,12Z)−2−(((11Z,14Z)−2−((3−(ジメチルアミノ)プロパノイル)オキシ)イコサ−11,14−ジエン−1−イル)オキシ)エチルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシル3−オクチルウンデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−ヒドロキシトリデシル5−ヘプチルドデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシル5−ヘプチルドデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシル7−ヘキシルトリデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−ヒドロキシトリデシル9−ペンチルテトラデカノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシル9−ペンチルテトラデカノエート;
1−(3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシル)10−オクチルデカンジオエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−13−(オクタノイルオキシ)トリデシル10−(オクタノイルオキシ)デカノエート;
(9Z,12Z)−3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−5−オクチルトリデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
3−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−5−オクチルトリデシルデカノエート;
5−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−7−オクチルペンタデシルオクタノエート;
(9Z,12Z)−5−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−7−オクチルペンタデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
9−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−11−オクチルノナデシルオクタノエート;
9−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−11−オクチルノナデシルデカノエート;
(9Z,12Z)−9−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ノナデシルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
9−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ノナデシルヘキサノエート;
9−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ノナデシル3−オクチルウンデカノエート;
9−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ノナデシルヘキサノエート;
9−((4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ノナデシル3−オクチルウンデカノエート;
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z,15Z,15’Z)−2−((4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12,15−トリエノエート);
(Z)−2−((4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオレエート;
2−((4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジテトラデカノエート;
2−((4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジテトラデカノエート;
2−((4−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジテトラデカノエート;
2−((4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジドデカノエート;
2−((4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジドデカノエート;
2−((4−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジドデカノエート;
2−((4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(デカノエート);
2−((4−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(デカノエート);
2−((4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−((4−(((3−(エチル(メチル)アミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(((13Z,16Z)−4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
2−(((13Z,16Z)−4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((2−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)テトラデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((2−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((2−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)テトラデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−((2−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート);
2−((2−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)テトラデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;
4,4−ビス(オクチルオキシ)ブチル4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノエート;
4,4−ビス(オクチルオキシ)ブチル2−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドデカノエート;
(9Z,12Z)−10−ドデシル−3−エチル−14−(2−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエノイルオキシ)エチル)−8,13−ジオキソ−7,9−ジオキサ−3,14−ジアザヘキサデカン−16−イルオクタデカ−9,12−ジエノエート;
2−((4−(((3−(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)−11−(オクタノイルオキシ)ウンデカノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート;および
(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(9−ドデシル−2−メチル−7,12−ジオキソ−6,8,13−トリオキサ−2−アザテトラデカン−14−イル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート)
から選択される。
本発明の脂質組成物における使用に適した中性脂質として、例えば、様々な中性、非荷電または両性イオン性脂質が挙げられる。本発明における使用に適した中性リン脂質の例として、5−ヘプタデシルベンゼン−1,3−ジオール(レゾルシノール)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ホスホコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ホスファチジルコリン(PLPC)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DAPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジラウリルオイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、1−ミリストイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、1−パルミトイル−2−ミリストイルホスファチジルコリン(PMPC)、1−パルミトイル−2−ステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、1,2−ジアラキドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DBPC)、1−ステアロイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)から成る群から選択される。
本発明における使用に適した陰イオン性脂質として、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミンコハク酸水素コレステロール(CHEMS)、およびリジルホスファチジルグリセロールが挙げられるが、それらに限定されない。
ヘルパー脂質は、トランスフェクション(例えば、生物学的活性剤を含むナノ粒子のトランスフェクション)をある程度高める脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクションを高めるメカニズムは、例えば、粒子安定性を高めること、および/または膜融合性を高めることを含み得る。ヘルパー脂質として、ステロイドおよびアルキルレゾルシノールが挙げられる。本発明における使用に適したヘルパー脂質として、コレステロール、5−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコハク酸水素コレステロールが挙げられるが、それらに限定されない。
ステルス脂質は、ナノ粒子がin vivoで(例えば、血中で)存在することができる間、増加する脂質である。本発明の脂質組成物における使用に適したステルス脂質として、脂質部分に連結される親水性ヘッド基を有するステルス脂質が挙げられるが、それらに限定されない。かかるステルス脂質の例として、国際公開第2011/076807号パンフレットに記載されるような、式(XI)
(式中、
Zは、PEGならびにポリ(オキサゾリン)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(グリセロール)、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリ[N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]、多糖およびポリ(アミノ酸)ベースのポリマーから選択され、ここでポリマーは、直鎖状であってもよく、または分岐状であってもよく、ポリマーは、任意選択で置換されてもよく、
Zは、n個のサブユニットにより重合され、
nは、10〜200ユニットのZ間の数平均重合度であり、nは、種々のポリマータイプに関して最適化され、
L1は、エーテル(例えば、−O−)、エステル(例えば、−C(O)O−)、スクシネート(例えば、−O(O)C−CH2−CH2−C(O)O−)、カルバメート(例えば、−OC(O)−NR’−)、カーボネート(例えば、−OC(O)O−)、ケトン(例えば、−C−C(O)−C−)、カルボニル(例えば、−C(O)−)、尿素(例えば、−NRC(O)NR’−)、アミン(例えば、−NR’−)、アミド(例えば、−C(O)NR’−)、イミン(例えば、−C(NR’)−)、チオエーテル(例えば、−S−)、キサントエート(例えば、−OC(S)S−)、およびホスホジエステル(例えば、−OP(O2)O−)のうちの0、1つ、2つまたはそれ以上を含む、任意選択で置換されるC1〜10アルキレンまたはC1〜10ヘテロアルキレンリンカーであり、それらのいずれも、0、1つまたは複数のZ基により置換されてもよく、
R’は、−H、−NH、−NH2、−O−、−S−、ホスフェートまたは任意選択で置換されるC1〜10アルキレンから独立して選択され、
X1およびX2は、炭素または−NH−、−O−、−S−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され、
A1およびA2は、C6〜30アルキル、C6〜30アルケニル、およびC6〜30アルキニルから独立して選択され、ここでA1およびA2は、同じであってもよく、または異なってもよく、あるいは、
A1およびA2は、それらが結合する炭素と一緒に、任意選択で置換されるステロイドを形成する)が挙げられる。
「脂質ナノ粒子」とは、分子間力によって互いに物理的に結合された複数の(即ち、1つよりも多い)脂質分子を含む粒子を意味する。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェア(単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む)、エマルジョン中の分散相、ミセルまたは懸濁液中の内部相であり得る。
下記方法を使用して、本発明の脂質ナノ粒子を作製することができる。粒子におけるサイズ低減を達成するために、および/またはサイズの均質性を増加させるために、当業者は、以下に提示する方法ステップを使用して、種々の組合せを実験してもよい。さらに、当業者は、リポソーム配合物で使用される超音波処理、ろ過または他のサイジング技法を用いることができる。
6.1 siRNA脂質配合物
被封入siRNA脂質ナノ粒子は、図2〜図3bで一般に示され、また上記で一般的に記載されるシステムおよび装置により、エタノール中に溶解した脂質の溶液を、クエン酸緩衝液中に溶解したsiRNAと混合することにより形成した。内径0.5、1.0、または2.0mmを有する通路を有する混合チャンバーを使用した。プロセシングチャンバーは、50mm〜1000mmの長さを有していた。希釈チャンバーは、約0.5または1.0または2.0または4.0mmの混合チャンバーの内径に等しいか、またはその少なくとも2倍の内径を有する通路を有していた。脂質溶液は、陽イオン性脂質、ヘルパー脂質(コレステロール)、中性脂質(DSPC)およびステルス脂質を含有していた。
6.2.1 エタノール中の脂質混合物の調製
下記は、陽イオン性脂質アミン対siRNAリン酸(N:P)モル比4.5:1で封入されるsiRNAの例である。表4に示す量の脂質(陽イオン性脂質、DSPC、コレステロールおよび脂質付加されたPEG)を、エタノール150mL中に溶解する。脂質のモル比は、それぞれ45:9:44:2である。混合物を短期間超音波処理した後、5分間穏やかに攪拌して、続いて使用するまで37℃で維持する。
siRNA流用の緩衝液は、pH5の100mM塩化ナトリウムおよび25mMクエン酸ナトリウムである。まず、クエン酸緩衝液のpHがpH5.00であることを確認する。そうでない場合は、加工処理前に、pHを調製する。封入用の水中の十分なsiRNAを、−80℃の保存から解凍させる。siRNA配列番号1をクエン酸緩衝溶液へ添加して、溶解したsiRNAの濃度を、UV分光光度計で260nmにて、光学密度により測定する。siRNAの最終濃度を、滅菌PETGボトルにおいてクエン酸緩衝液150ml中で0.45mg/mlへ調節して、使用するまで室温で保持する。
siRNA封入は、図2に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌シリンジに、等量(25ml)のエタノール中の脂質(シリンジ(a))、クエン酸緩衝液中のsiRNA(シリンジ(b1)および(b2))、および水単独(シリンジ(c))を充填する。16.7mg/mLの脂質を含有するシリンジ(a)上のルアーフィッティングから通じるチューブを、内径0.5mmを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。0.45mg/mlでsiRNAを含有するシリンジ(b1)および(b2)上のルアーフィッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、内径1.55mmを有するフッ素化エチレンプロピレン(FEP)チューブである。シリンジ(a)、(b1)および(b2)を、シリンジポンプA上に設置する。脂質入力の反対側の十字の中央入力からつながるチューブを、内径1mmを有するT接合部へ取り付ける(例えば、図2、T接合部54を参照)。水単独を含有するシリンジ(c)上のルアーフィッティングから通じるチューブを、T接合部へ取り付けて、siRNA脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にして、シリンジ(c)を、シリンジポンプB上に設置する。T接合部からの出力ラインを、希釈したsiRNA脂質ナノ粒子の収集用の滅菌PETGボトルより上に位置させる。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。シリンジポンプを、適したシリンジ製造業者(syringe manufacturer)およびサイズおよび1分当たり40mlの流速に設定する。両方のポンプを同時に始動させて、およそ0.5秒後に材料を収集し始める。被封入siRNA脂質ナノ粒子およそ90mlを収集して、それは、25容量%のエタノール、0.23mg/mLのsiRNA、4.2mg/mLの脂質、および50mM NaClを含有する。60分後、混合インキュベーション期間後に、Malvern Zetasizerを使用して、粒径を決定する。
内径1.0mmのT接合部を、siRNA脂質ナノ粒子懸濁液のさらなる希釈用に設定する。この希釈ステップは、1つのシリンジポンプ上で2つのシリンジを用いて実行する。1つの140mLのシリンジは、siRNA脂質ナノ粒子を含有し、第2の140mLのシリンジは、水を含有する。流速は、1分当たり25mlに設定する。siRNA流および水流は、互いに180度でT接合部に入る。希釈したsiRNA脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌PETGボトルへ収集する。最終容量は、およそ280mlであり、エタノール濃度12.5%を有する。
封入の実行におけるあらゆる50mgのsiRNAに関しては、Vivaflow 50カートリッジを使用する。100mgのsiRNA封入の実行に関しては、直列に取り付けた2つのVivaflow 50カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカートリッジをすすいで、製造業者からの任意の保存溶液を除去しなくてはならない。これは、空のTFFリザーバにDI水500mlを注ぐことにより行われ、流速115ml/分でぜん動ポンプにより再循環させる。透過物(permeate)は制限されるべきではなく、水500ml全体を膜に通して流したら、すすぎプロセスは、完了である。
50℃で10分間予熱したアルミニウム蓄熱ヒーターに配置されるガラスバイアル中の懸濁液およそ10mlを加熱することにより、siRNA脂質ナノ粒子をろ過する。次に、バイアルを取り出して、溶液をシリンジで取り出して、滅菌バイアルへ直接、0.22μmのPESシリンジフィルターに通してろ過する。この最終的な生成物を4℃で保存する。
脂質ナノ粒子へのsiRNA配合の効率を決定するために、sybr gold蛍光を測定することにより、siRNAの封入パーセントを決定することができる。siRNAに結合されると、sybr goldは蛍光を発する。sybr gold蛍光の強度は、siRNAの量に比例する。
λex=485nm λem=530nm
リードモード: 蛍光、トップリード
波長: Ex 485nm、Em 530nm、オートカットオフオン 530nm
感度: 読取り6、PMT:オート
オートミックス: 前:オフ
オートキャリブレート: オン
アッセイプレートタイプ: 96ウェルcostarblk/clrbtm
読み取るべきウェル: プレート全体を読み取る
修正時間: オフ
カラム波長優先: カラム優先
キャリッジ速度: 標準
オートリード: オフ
遊離のsiRNAのサイズ(5nm)は、リポソームのサイズ(50〜200nm)と異なるので、それらは、サイズ排除カラムでは異なる時間で溶出する。遊離のsiRNAは、リポソーム後に溶出する。siRNAに関する保持時間は、およそ17分であるのに対して、リポソームに関する保持時間は、およそ10分である。溶出したsiRNAの検出は、260nmで設定した吸収波長を有するUV検出器によって実施する。
カラム温度: 30℃
移動相の流速 1ml/分で30分間
UV検出器の波長: 260nm
注入容量: 20μL
注入の数: 2
siRNA脂質ナノ粒子を、Malvern InstrumentsからのZetasizer Nano ZSを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。1mg/mlを上回る被封入siRNA濃度で配合したsiRNAに関して、試料5μlを1×PBS 115μlで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベットへ添加する。キュベットをZetasizer Nano ZSへ挿入する。機械設定に関して、材料はポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また細胞はZEN040であると設定する。待ち時間なしで、試料を25℃で測定する。Z−Ave(直径として設定、ナノメートル単位で)および多分散性指数(PDI)を記録する。
図2に実質的に示すようなシステムを使用して、濃度0.45mg/mLのsiRNA配列番号1、pH5の100mL NaCl、および25mMクエン酸ナトリウムを有する2つの水性核酸流を、反対方向から、内径0.5mmを有する通路を有する十字形状の混合チャンバーへ、それぞれ流速40mL/分で導入した。同時に、脂質流を、十字形状の混合チャンバーへ、2つの核酸流に直角の方向から、流速40mL/分で導入した。脂質流は、エタノール中45%陽イオン性脂質A1、44%コレステロール、9%DSPC、および2%PEG−脂質B1で構成されていた。脂質の総濃度は、16.7mg/mLであった。1回の実行で、交差形状の混合チャンバーからの合流した流れを、図2におけるチャンバー54に類似したT形状のチャンバー(内径1.0mm)を使用して、水を用いた希釈ステップに付した。水を、T形状チャンバーへ、速度40mL/分で導入した。得られた溶液を収集して、被封入核酸ナノ粒子を、サイズおよび一様性に関して分析して、結果を表6のエントリー1に示した。エントリー1から得られる溶液は、25容量%のエタノール、0.23mg/mLのsiRNA、4.2mg/mLの脂質、および50mM NaClを含んでいた。同じ濃度、流速、および初期の十字形状の混合チャンバーを用いた別個の実験では、混合チャンバーからの合流した流れを、エントリー1で使用する希釈容量に等しい容量の水で希釈した。これらの結果を表6のエントリー2に示す。収集した溶液の濃度は、エントリー1と同じであった。比較のために、同じプロセス条件下であるが、いかなる希釈ステップも伴わない別の実験を行った。これらの結果を表6のエントリー3に示す。いかなる希釈ステップも伴わない場合、エントリー3の収集した溶液は、33%エタノール、0.3mg/mLのsiRNA、5.6mg/mLの脂質および66mMのNaClを含んでいた。エントリー1およびエントリー2に関するZ−Avg、#−Avg、ならびにPDIは、希釈ステップを欠如したエントリー3よりも小さかった。表中のZ−Avg、#−Avg、ならびにPDIは、混合の60分後に決定した。
図3aに示すようなチャンバーに類似した、かつ内径0.5mmを有するT形状の混合チャンバーを使用した一連の実験において、単一の核酸流および単一の脂質流を、様々な流速/速度および濃度で混合した。核酸および脂質流は、プロセス実施例2において上述するのと同じ成分を含んでいた。これらの例では、希釈ステップを使用せず、初期siRNA濃度は、表6のエントリー1と同じ最終溶液濃度を得るように調節した。これらの実験におけるエタノール中の脂質の濃度は、16.7mg/mL(1×)または25mg/mL(1.5×)のいずれかであった。結果を以下の表7に示し、Z−Avg、#−Avg、およびPDIは、混合の60分後に決定した。
図3aに示すようなチャンバーに類似し、かつプロセス実施例3で使用するT形状の混合チャンバー(内径0.5mm)を使用した一連の実験において、単一の核酸流および単一の脂質流を、反対方向から、様々な流速/線速度で混合して、続いて図2で一般的に示すように、内径1mmの希釈tee水で希釈した。siRNA配列番号4、陽イオン性脂質A1、PEG脂質B1、コレステロール、およびDSPCは、上述するような量で、プロセス実施例4で使用した。エタノール流中の脂質の総濃度は、16.7mg/mLであった。核酸流中のsiRNAの濃度は、0.9mg/mLであった。表8の結果により、線速度を増加させると、粒径およびPDIが減少することが示される。
表9は、図3cに示すチャンバーに類似した代替的な混合チャンバー(内径0.5mm)を使用した2つの実験からの結果を示す。エントリー1では、siRNAが分岐から入る、得られた結果を示し、エントリー2では、脂質が分岐から入る、得られた結果を示す。両方の実験に関して、siRNAおよび脂質は、プロセス実施例2で上述するのと同じであった。siRNA流に関する流速は、120mL/分であり、脂質流の流速は、40mL/分であった。siRNA濃度は、66mM NaClを含有する緩衝溶液中で0.3mg/mLであった。脂質の濃度は、16.7mg/mLであった。Z−Ave、#−Avg、およびPDIは、混合の60分後に決定した。
3〜6の範囲の流れの総数を有する核酸および脂質流の様々な形状を有する混合チャンバーを使用して、一連の実験を行った。それぞれの場合で、混合チャンバーは、内径1mmのチャンバーを有し、流速は、siRNA流に関しては240mL/分、および脂質流に関しては80mL/分の複合流量を維持するように調節した。これらの実験におけるsiRNAの濃度は、0.3mg/mLであり、脂質の濃度は、16.7mg/mLであった。複合siRNA流の線速度は、5.1メートル/秒であった。複合脂質流の線速度は、1.7メートル/秒であった。流れの数が、流れの1つを上回る配置を可能にする場合、表10は、脂質またはsiRNA流間の角度を示す。例えば、3つの脂質流および3つのsiRNA流の場合、各脂質流は、60度(即ち、3つの隣接した脂質流)または120度(即ち、脂質流は、120度で分離されており、介在するsiRNA流も120度で分離される)のいずれかによって、次の脂質流と分離される。表10に概要する実験結果に関して、45:9:44:2の比での陽イオン性脂質A4、DSCP、コレステロールおよびPEG脂質B1とともに、siRNA配列番号5を使用した。表10に示す結果により、総流速/速度が一定のままである様々な混合形状に関して、実質的に同じ結果が得られることが示される。
6.8.1 材料および試薬
配列の特色:
タバコエッチウイルス(Tobacco Etch Virus)(TEV)5’UTR:14〜154
最適コザック(Kozak)配列:155〜163
タンパク質受託番号#NP_000221のヒトレプチンコードアミノ酸1〜167、GeneArtにより最適化された配列コドン:164〜664
2つの停止コドン:665〜670
ヒトベータ−グロブリン3’UTRの2つのコピー:689〜954
120個のヌクレオチドポリAテール:961〜1080
下記は、陽イオン性脂質アミン対mRNAリン酸(N:P)モル比4:1で封入されるmRNAの例である。脂質(陽イオン性脂質、DSPC、コレステロールおよび脂質付加されたPEG)をエタノール中に溶解する。脂質のモル比は、それぞれ40:10:48:2である。例えば、表12では、エタノール中の容量63mlの脂質に関する全ての構成成分の量および最終濃度が見られる。容量63mlは、確実に標的容量が、シリンジへ充填するのに利用可能であるのに必要とされる容量の1.05倍を表す。混合物を秤量して、滅菌ポリエチレンテレフタレートグリコール修飾(PETG)の125mlのボトルに入れて、エタノールを添加する。混合物を短期間超音波処理した後、5分間穏やかに攪拌して、続いて使用するまで37℃で維持する。
まず、クエン酸緩衝液のpHがpH6.00であることを確認する。そうでない場合は、加工処理前に、pHを調整する。封入用の水中の十分なmRNAを、−80℃の保存から解凍させて、Amicon Ultra−15遠心濃縮器を用いて、水からクエン酸緩衝液pH6.0へ交換する。mRNA 10〜12mgを各濃縮器へ充填することができ、それを4,000rpmで4℃にて5分間遠心分離する。容量は、クエン酸緩衝液pH6.0の添加により増加させる。所望の緩衝液条件を達成するには、クエン酸緩衝液pH6.0による10倍以上の容量の交換を推奨する。mRNAの濃度を、UV分光光度計で260nmにて、光学密度により測定する。mRNAの最終濃度を、滅菌した250mlのPETGボトルにおいてクエン酸緩衝液126ml中で0.25mg/mlへ調節して、使用するまで室温で保持する。容量126mlは、確実に標的容量が、シリンジへ充填するのに利用可能であるのに必要とされる容量の1.05倍を表す。
mRNA封入は、図2に一般的に示すようなシステムを用いて実施する。滅菌した60mlシリンジに、等量(60ml)のエタノール中の脂質(シリンジ(a))、クエン酸緩衝液中のmRNA(シリンジ(b1)および(b2))、およびクエン酸緩衝液単独(シリンジ(c))を充填する。脂質を含有するシリンジ(a)上のルアーフィッティングから通じるチューブを、内径0.5mmを有する十字接合部の中央入力へ取り付ける。0.25mg/mlでmRNAを含有するシリンジ(b1)および(b2)上のルアーフィッティングから通じるチューブを、十字接合部の側面入力へ取り付ける。チューブは、内径0.8mmを有するPTFEチューブである。シリンジ(a)、(b1)および(b2)を、シリンジポンプA上に設置する。脂質入力の反対側の十字の中央入力からつながるチューブを、T接合部へ取り付ける(例えば、図2、T接合部54を参照)。クエン酸緩衝液単独を含有するシリンジ(c)上のルアーフィッティングから通じるチューブを、T接合部へ取り付けて、mRNA脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にして、シリンジ(c)を、シリンジポンプB上に設置する。T接合部からの出力ラインを、希釈したmRNA脂質ナノ粒子の収集用の滅菌した500mlのPETGボトルより上に位置させる。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。シリンジポンプを、適したシリンジ製造業者およびサイズ(BD、Plastipak、60ml)および1分当たり最大16mlの流速に設定した。両方のポンプを同時に始動させて、およそ0.5秒後に材料を収集し始める。被封入mRNA脂質ナノ粒子およそ220〜230mlを収集する。
mRNA脂質ナノ粒子懸濁液135mlを吸引するのに140mlのシリンジを使用する。残りの85〜95mlを第2の140mlのシリンジへ移す。同容量のクエン酸緩衝液を用いて、140mlのシリンジを調製する。別のT接合部を、mRNA脂質ナノ粒子懸濁液の別の希釈用に設定する。この希釈ステップは、唯一のシリンジポンプ上で両方のシリンジを用いて実行する。容量135mlを有する140mlのシリンジ(一方は、脂質ナノ粒子を含有し、他方は、クエン酸緩衝液を含有する)をまず実行して、より小さな容量を有する140mlのシリンジは、2番目に実行する。全てのフィッティングがシリンジ上で締まっていることを確認することが重要である。最初の実行に関して、正確なサイズおよび製造業者(140ml、Sherwood−Monoject)に合わせて、シリンジポンプに関する設定を変化させる。流速は、1分当たり25mlに設定する。希釈したmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌した500mlのPETGボトルへ収集する。最終容量は、およそ440〜460mlである。
封入の実行におけるあらゆる15mgのmRNAに関しては、Vivaflow 50カートリッジを使用する。30mgのmRNA封入の実行に関しては、直列に取り付けた2つのVivaflow 50カートリッジを使用する。まず、再生セルロースカートリッジを、発熱物質を含まないようにしなくてはならない。この手順は、封入の前日に始めるべきである。Minimate TFFシステムを使用して、2つのVivaflow 50カートリッジを直列で設定して、チューブを取り付ける。発熱物質を含まず、ヌクレアーゼを含まない水500mlをリザーバへ充填して、それを圧力20psiでカートリッジに通して流す。0.1MのNaOH/1.0MのNaCl 100mlをリザーバへ充填して、50mlをカートリッジに通して流す。残りの50mlをカートリッジで一晩静置させる。翌朝、残りの50mlを20psiでカートリッジに通して流す。発熱物質をより含まず、ヌクレアーゼを含まない水をリザーバへ充填して、50mlをカートリッジに通して流す。この水洗浄を2回以上繰り返す。最終的なすすぎ水の分取量を試験して、エンドトキシンが検出可能な量以下であることを確認する。
脂質ナノ粒子へのmRNA配合の効率を決定するために、Life TechnologiesからのQuant−IT ribogreenRNAアッセイキットを使用して、mRNAの封入パーセントを測定する。mRNA脂質ナノ粒子懸濁液は、ヌクレアーゼを含まないTE緩衝液中でアッセイして、脂質ナノ粒子の外側のmRNAの濃度を決定し、またTE緩衝液+0.75%のTriton X−100界面活性剤中でもアッセイして、脂質ナノ粒子を分解させて、脂質ナノ粒子懸濁液全体中のmRNAの濃度を決定する。2つの濃度の関係を使用して、封入パーセントを算出する。
mRNA脂質ナノ粒子を、Malvern InstrumentsからのZetasizer Nano ZSを使用して、サイズおよび多分散性に関して分析する。1mg/mlを上回る被封入mRNA濃度で配合したmRNAに関して、試料5μlを1×PBS 115μlで希釈する。小容量の使い捨てマイクロキュベット(Brand、#759200)へ添加する。キュベットをZetasizer Nano ZSへ挿入する。機械設定に関して、材料はポリスチレンラテックスであると、分散剤は水であると、また細胞はZEN040であると設定する。待ち時間なしで、試料を25℃で測定する。Z−Ave(直径として設定、ナノメートル単位で)および多分散性指数(PDI)を記録する。
れらの変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱とみなされるべきではない。
本発明は下記の態様も含む。
<1>
脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
、
1つまたは複数の核酸流を供給するステップであって、前記1つまたは複数の核酸流が
、第1の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約1.5メートル/秒よりも大きいか、ま
たはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
1つまたは複数の脂質流を供給するステップであって、前記1つまたは複数の脂質流が
、有機溶媒中に1つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約1.5メートル/秒よりも
大きいか、またはそれに等しい複合線速度を有する、ステップと、
第1の交差ポイントで前記1つまたは複数の脂質流を前記1つまたは複数の核酸流と合
流させて、第1の合流した流れを供給するステップと、
第1の方向で前記第1の合流した流れを流動させ、それらの構成成分を混合して、前記
被封入核酸ナノ粒子を含む第1の出口溶液を供給するステップと
を含み、前記第1の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第1の水溶液または
前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第1の出口溶液中の前記有機溶媒の
濃度が、33%未満である、方法。
<2>
前記第1の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第1の緩衝溶液であり、
前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、<1>に記載の方法。
<3>
前記第1の合流した流れを、第2の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
て、第1の出口流を供給するステップ
をさらに含む、<1>または<2>に記載の方法。
<4>
前記アルカリ金属塩が、NaClおよびクエン酸ナトリウムの1つまたは複数から選択
され、
前記有機溶媒がエタノールを含む、<3>に記載の方法。
<5>
前記第1の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約20〜約25%である、<1>〜<4>のいずれかに記載の方法。
<6>
前記1つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約1.5〜約4.5メートル/秒であり
、
前記1つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約3〜約14メートル/秒である、
<1>〜<5>のいずれかに記載の方法。
<7>
前記1つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約3〜約4メートル/秒であり、
前記1つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約9〜約14メートル/秒である、
<1>または<3>〜<6>のいずれかに記載の方法。
<8>
前記第1の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第2の緩衝溶液および水から選択
される水性溶媒を含む、ステップと、
前記第1の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第1の出口流を供給するステ
ップと
を含み、前記1つまたは複数の脂質流の複合線速度が、約3〜約4メートル/秒であり、
前記1つまたは複数の核酸流の複合線速度が、約6〜約8メートル/秒である、
<2>〜<6>のいずれかに記載の方法。
<9>
前記第1の出口溶液をインキュベートするステップをさらに含む、<1>〜<8>のいずれかに記載の方法。
<10>
前記インキュベートした第1の出口溶液を、第3の緩衝溶液および水から選択される第
2の希釈溶媒で希釈して、第2の出口溶液を供給するステップと、
前記第2の出口溶液を濃縮するステップおよび透析するステップ
をさらに含む、<9>に記載の方法。
<11>
前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
ステップを含む、<10>に記載の方法。
<12>
濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、<10>または<11>に記載の方法。
<13>
前記核酸がsiRNAである、<1>〜<12>のいずれかに記載の方法。
<14>
前記核酸がmRNAである、<1>〜<12>のいずれかに記載の方法。
<15>
前記脂質ナノ粒子ホストが、表2から選択される脂質の1つまたは複数を含む、<1>〜<14>のいずれかに記載の方法。
<16>
前記被封入核酸ナノ粒子が、約30nm〜約80nmの平均粒径直径(average partic
le size diameter)を有する、<1>〜<15>のいずれかに記載の方法。
<17>
前記被封入核酸ナノ粒子が、約40nm〜約70nmの平均粒径直径、および動的光散
乱により決定される場合の約0.1未満の多分散指数を有する、<1>〜<16>のいずれかに記載の方法。
<18>
脂質:核酸の質量による比が、約15〜20:1である、<1>〜<17>のいずれかに記載の方法。
<19>
前記1つまたは複数の核酸流中の核酸の濃度が、約0.1〜約1.5mg/mLであり
、前記1つまたは複数の脂質流中の脂質の濃度が、約10〜約25mg/mLである、<1>〜<18>のいずれかに記載の方法。
<20>
前記第2の出口溶液中のエタノールの濃度が、約10〜15%である、<9>〜<19>のいずれかに記載の方法。
<21>
2つの核酸流および1つの脂質流を供給するステップと、
十字コネクターで前記2つの核酸流を前記1つの脂質流と合流させて、前記第1の合流
した流れを供給するステップと
を含む、<1>〜<20>のいずれかに記載の方法。
<22>
前記2つの核酸流が、互いに対して約180°で反対方向から前記十字コネクターに入
り、前記脂質流が、前記2つの核酸流に対して約90°で前記十字コネクターに入る、<21>に記載の方法。
<23>
前記第1の方向での前記第1の合流した流れを流動させるステップが、前記脂質流と実
質的に同じ方向で、かつ前記2つの核酸流に対して約90°で前記十字コネクターから外
へ前記第1の合流した流れを流動させるステップを含む、<22>に記載の方法。
<24>
前記第1の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第1の合流した流
れを、前記第1の合流した流れの方向に対して約90°から前記希釈流と交差させるステ
ップを含む、<8>〜<23>のいずれかに記載の方法。
<25>
前記核酸流由来の核酸の約90%超が、前記第1の出口溶液中に封入される、<1>〜<24>のいずれかに記載の方法。
<26>
薬学的に許容される担体、ならびに
脂質ナノ粒子ホストおよび核酸を含む被封入核酸ナノ粒子であって、前記核酸が、前記
脂質ナノ粒子ホスト中に封入されている、被封入核酸ナノ粒子
を含む被封入核酸ナノ粒子組成物であって、前記被封入核酸ナノ粒子が、約40nm〜約
70nmの平均粒径、および動的光散乱により決定される場合の約0.1未満の多分散指
数を有する、被封入核酸ナノ粒子組成物。
<27>
前記脂質ナノ粒子ホストが、分解性陽イオン性脂質、脂質付加されたポリエチレングリコール、コレステロールおよび1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリンを含む、<26>に記載の組成物。
10 第1の核酸流
12 通路
14 交差ポイント
16 十字
20 第2の核酸流
22 通路
30 脂質流
32 通路
40 複合流
42 通路
50 希釈流
50a 希釈流
50b 希釈流
52 通路
52a 通路
52b 通路
54 Tチャンバー
54a 十字
60 第1の出口溶液
70 プロセスチャンバー
72 プロセスチャンバーの本体
80 核酸流
82 流入通路
84 Y形状チャンバー
86 チャンバー
90 脂質流
92 流入通路
94 チャンバー
Claims (17)
- 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入して、被封入核酸ナノ粒子を提供する方法であって
、
2つの核酸流を供給するステップであって、前記2つの核酸流のそれぞれが、第1の水溶液中に核酸の混合物を含み、かつ約3〜約14メートル/秒の複合線速度を共に有する、ステップと、
1つの脂質流を供給するステップであって、前記脂質流が、有機溶媒中に1つまたは複数の脂質の混合物を含み、かつ約1.5〜約4.5メートル/秒の複合線速度を有する、ステップと、
十字コネクターとして構成される第1の交差ポイントで前記脂質流を前記2つの核酸流と合流させて、第1の合流した流れを供給するステップであって、前記2つの核酸流が、互いに対して約180°で反対方向から前記十字コネクターに入り、前記脂質流が、前記2つの核酸流に対して約90°で前記十字コネクターに入る、ステップと、
第1の方向で前記第1の合流した流れを流動させるステップであって、前記脂質流と実質的に同じ方向で、かつ前記2つの核酸流に対して約90°で前記十字コネクターから外へ前記第1の合流した流れを流動させる、ステップと、
それらの構成成分を混合して、前記被封入核酸ナノ粒子を含む第1の出口溶液を供給するステップと
を含み、前記第1の水溶液および前記有機溶媒が混和性であり、前記第1の水溶液または前記有機溶媒のうちの片方が、緩衝液を含有し、前記第1の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、凝集を最低限にする濃度である、方法。 - 前記第1の水溶液が、アルカリ金属塩の水溶液を含む第1の緩衝溶液であり、
前記有機溶媒が、アルコール溶媒を含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記第1の合流した流れを、第2の緩衝溶液および水から選択される希釈溶媒で希釈し
て、第1の出口流を供給するステップ
をさらに含み、
前記第2の緩衝溶液が少なくとも1つのアルカリ金属塩を含み、
前記アルカリ金属塩が、NaClおよびクエン酸ナトリウムの1つまたは複数から選択
され、
前記第1の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約33%未満である、
請求項1に記載の方法。 - 前記1つの脂質流の複合線速度が、約3〜約4メートル/秒であり、
前記2つの核酸流の複合線速度が、約9〜約14メートル/秒である、
請求項1に記載の方法。 - 前記第1の合流した流れを、希釈溶媒で希釈するステップが、
希釈流を供給するステップであって、前記希釈流が、第2の緩衝溶液および水から選択
される水性溶媒を含む、ステップと、
前記第1の合流した流れを前記希釈流と合流させて、前記第1の出口流を供給するステ
ップと
を含み、前記1つの脂質流の複合線速度が、約3〜約4メートル/秒であり
、前記2つの核酸流の複合線速度が、約6〜約8メートル/秒である、請求項3に記載の方法。 - 前記第1の出口溶液をインキュベートするステップと、
前記インキュベートした第1の出口溶液を、第3の緩衝溶液および水から選択される第
2の希釈溶媒で希釈して、第2の出口溶液を供給するステップと、
前記第2の出口溶液を濃縮および透析することにより、濃縮した透析溶液を提供するステップと
をさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記濃縮するステップが、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮する
ステップを含む、請求項6に記載の方法。 - 濃縮した透析溶液を滅菌ろ過するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記核酸がsiRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸がmRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記脂質ナノ粒子ホストが、
((5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビス(オクタン-8,1-ジ
イル)ビス(デカノエート);
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキ
サデカノイル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル ビス(オクタデカ-9,12-ジエノエート);
(9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミ
ノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル オクタデカ-9,12-ジエノエート;
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビ
ス(ブタン-4,1-ジイル) ビス(オクタデカ-9,12-ジエノエート);
PEG-ジミリスチルグリセリン;および
2,3-ビス(テトラデシルオキシ)プロピル (158-ヒドロキシ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,3
0,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,1
08,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138,141,144,147,150,153,156-ドペンタコン
タオキサオクタペンタコンタヘクチル)カルバメート
から選択される脂質の1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記被封入核酸ナノ粒子が、約30nm〜約80nmの平均粒径直径(average partic
le size diameter)を有する、請求項1に記載の方法。 - 前記被封入核酸ナノ粒子が、約40nm〜約70nmの平均粒径直径、および動的光散
乱により決定される場合の約0.1未満の多分散指数を有する、請求項1に記載の方法。 - 脂質:核酸の質量による比が、約15〜20:1であり、
前記2つの核酸流中の核酸の濃度が、約0.1〜約1.5mg/mLであり、
前記1つの脂質流中の脂質の濃度が、約10〜約25mg/mLであり、
前記第2の出口溶液中のエタノールの濃度が、約10〜15%である、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の合流した流れを前記希釈流と合流させるステップが、前記第1の合流した流
れを、前記第1の合流した流れの方向に対して約90°から前記希釈流と交差させるステ
ップを含む、請求項5に記載の方法。 - 前記核酸流由来の核酸の約90%超が、前記第1の出口溶液中に封入される、請求項1に記載の方法。
- 凝集を最低限にする量の前記第1の出口溶液中の前記有機溶媒の濃度が、約33%未満である、請求項1に記載の方法。
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EP3554478B1 (en) * | 2016-12-16 | 2022-01-26 | Delphi Scientific, LLC | Layered particles and processes thereof |
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WO2018195526A1 (en) * | 2017-04-21 | 2018-10-25 | Chung Eddie Yocon | Membrane lipid coated nanoparticles and method of use |
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KR20200074134A (ko) | 2017-09-29 | 2020-06-24 | 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. | 지질 나노파티클을 이용한 mRNA 전달의 체외 방법 |
BR112020005323A2 (pt) | 2017-09-29 | 2020-09-24 | Intellia Therapeutics, Inc. | polinucleotídeos, composições e métodos para edição de genoma |
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CA3106641A1 (en) * | 2018-07-16 | 2020-01-23 | The Scripps Research Institute | Opioid haptens, conjugates, vaccines, and methods of generating antibodies |
AU2019313348A1 (en) | 2018-07-31 | 2021-03-04 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 (HAO1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (PH1) |
CN112839639A (zh) * | 2018-08-29 | 2021-05-25 | 川斯勒佰尔公司 | 制备负载mRNA的脂质纳米颗粒的改进方法 |
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KR20220004984A (ko) | 2019-03-28 | 2022-01-12 | 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. | Ttr 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 및 코르티코스테로이드를 포함하는 attr 아밀로이드증의 치료 또는 그의 용도 |
WO2020198697A1 (en) | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods comprising a ttr guide rna and a polynucleotide encoding an rna-guided dna binding agent |
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US20210079394A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles |
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EP4054651A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy |
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US20230102342A1 (en) | 2020-03-23 | 2023-03-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
WO2021213924A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
WO2021222287A2 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Intellia Therapeutics, Inc. | Methods of in vitro cell delivery |
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WO2024107765A2 (en) | 2022-11-14 | 2024-05-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes |
WO2024107670A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers |
CN116370437A (zh) * | 2023-05-26 | 2023-07-04 | 北京因诺惟康医药科技有限公司 | 包含胆固醇琥珀酸单酯的核酸脂质纳米颗粒组合物及其用途 |
Family Cites Families (100)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE3144150A1 (de) | 1981-04-10 | 1982-12-09 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | (omega)-cyan-1,(omega)-diphenyl-azaalkan-derivate, ihre herstellung und diese enthaltende arzneimittel |
EP0188311A3 (en) | 1985-01-07 | 1988-07-20 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Pharmaceutical formulation of nicardipine and 1,2-dioxy-omega-trialkylammonium compounds |
DE3669503D1 (de) | 1985-01-07 | 1990-04-19 | Syntex Inc | Oberflaechenaktive n-(omega, omega-1-dialkoxy)- und n-(omega, omega-1-dialkenoxy)-alk-1-yl-n,n,n-trisubstituierte ammoniumverbindungen, deren herstellung und sie enthaltende pharmazeutische formulierungen. |
DE3542994A1 (de) | 1985-12-05 | 1987-06-11 | Basf Ag | Basisch substituierte phenylacetaldehyde, ihre herstellung und diese enthaltende arzneimittel |
US4987071A (en) | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
ATE217347T1 (de) | 1992-12-04 | 2002-05-15 | Univ Yale | Diagnose mittels signalverstärkung durch ein ribozym |
WO1994013791A1 (en) | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Innovir Laboratories, Inc. | Regulatable nucleic acid therapeutic and methods of use thereof |
ES2142934T3 (es) | 1993-02-19 | 2000-05-01 | Nippon Shinyaku Co Ltd | Derivado del glicerol, dispositivo y composicion farmaceutica. |
US5871914A (en) | 1993-06-03 | 1999-02-16 | Intelligene Ltd. | Method for detecting a nucleic acid involving the production of a triggering RNA and transcription amplification |
JPH09504517A (ja) | 1993-09-27 | 1997-05-06 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | カンプトテシン処方物 |
US6166197A (en) | 1995-03-06 | 2000-12-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions |
WO1997048712A1 (fr) | 1996-06-17 | 1997-12-24 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Derives asialotrisaccharide moranoline et medicaments |
US5989912A (en) | 1996-11-21 | 1999-11-23 | Oligos Etc. Inc. | Three component chimeric antisense oligonucleotides |
US5849902A (en) | 1996-09-26 | 1998-12-15 | Oligos Etc. Inc. | Three component chimeric antisense oligonucleotides |
US5837282A (en) | 1996-10-30 | 1998-11-17 | University Of British Columbia | Ionophore-mediated liposome loading |
JP2002514913A (ja) | 1996-12-19 | 2002-05-21 | エール ユニバーシティ | 生反応性アロステリックポリヌクレオチド |
JPH10251152A (ja) | 1997-03-14 | 1998-09-22 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 虚血再灌流障害治療剤 |
TW589189B (en) | 1997-08-04 | 2004-06-01 | Scras | Kit containing at least one double-stranded RNA combined with at least one anti-viral agent for therapeutic use in the treatment of a viral disease, notably of viral hepatitis |
JP4575592B2 (ja) * | 1997-11-14 | 2010-11-04 | パシラ ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド | 多小胞リポソームの製造 |
US20030036517A1 (en) | 1997-12-05 | 2003-02-20 | Bruce A. Sullenger | Nucleic acid mediated rna tagging and rna revision |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
WO1999033791A1 (fr) | 1997-12-26 | 1999-07-08 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Derives aliphatiques |
GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
IL126731A0 (en) | 1998-10-23 | 1999-08-17 | Intelligene Ltd | A method of detection |
CA2348779A1 (en) | 1998-11-03 | 2000-05-11 | Yale University | Multidomain polynucleotide molecular sensors |
US6656498B1 (en) | 1998-11-25 | 2003-12-02 | Vanderbilt University | Cationic liposomes for gene transfer |
CA2361201A1 (en) | 1999-01-28 | 2000-08-03 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
JP2000281569A (ja) | 1999-03-25 | 2000-10-10 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 脊髄障害治療剤 |
CA2386270A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | University Of Massachusetts | Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference |
GB9927444D0 (en) | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
CN1311189A (zh) | 2000-03-01 | 2001-09-05 | 沈阳药科大学 | 聚乙二醇单甲醚胆固醇琥珀酸酯衍生物的合成及其制剂 |
DE60139690D1 (de) | 2000-07-03 | 2009-10-08 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae |
EP2189473A3 (en) | 2000-10-27 | 2010-08-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Nucleic and proteins from streptococcus groups A & B |
JP2002212477A (ja) | 2001-01-19 | 2002-07-31 | Fuji Photo Film Co Ltd | インクジェット用インク |
CA2458854A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-06 | Chiron Srl | Helicobacter pylori vaccination |
US20040006061A1 (en) | 2001-10-04 | 2004-01-08 | Wolfgang Haap | Alkoxybenzylamine |
DE10163098B4 (de) | 2001-10-12 | 2005-06-02 | Alnylam Europe Ag | Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren |
US20080207542A1 (en) | 2002-03-26 | 2008-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
WO2003102150A2 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Genteric, Inc. | Multi-functional polyamines for delivery of biologically-active polynucleotides |
US20080214437A1 (en) | 2002-09-06 | 2008-09-04 | Mohapatra Shyam S | Methods and compositions for reducing activity of the atrial natriuretic peptide receptor and for treatment of diseases |
CA2526106A1 (en) | 2003-06-26 | 2005-01-13 | Chiron Corporation | Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis |
CA2532369C (en) | 2003-07-31 | 2016-07-26 | Chiron Corporation | Immunogenic compositions for streptococcus pyogenes |
KR20110007263A (ko) | 2003-08-28 | 2011-01-21 | 노파르티스 아게 | 블런트-말단 및 3'-변형체를 갖는 간섭 rna 이중나선 |
GB0410866D0 (en) | 2004-05-14 | 2004-06-16 | Chiron Srl | Haemophilius influenzae |
CA2566559C (en) | 2004-05-17 | 2014-05-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal formulations comprising dihydrosphingomyelin and methods of use thereof |
ATE536418T1 (de) | 2004-06-07 | 2011-12-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Lipidverkapselte interferenz-rna |
WO2006007712A1 (en) | 2004-07-19 | 2006-01-26 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents |
GB0418172D0 (en) | 2004-08-13 | 2004-09-15 | Ic Vec Ltd | Vector |
WO2007086883A2 (en) | 2005-02-14 | 2007-08-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them |
US7404969B2 (en) | 2005-02-14 | 2008-07-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules |
NZ580974A (en) | 2005-02-18 | 2011-05-27 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogens from uropathogenic escherichia coli |
LT2351772T (lt) | 2005-02-18 | 2016-10-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Baltymai ir nukleorūgštys iš su meningitu/sepsiu susijusių escherichia coli |
EP1871888A4 (en) | 2005-03-30 | 2013-08-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B |
KR20080024125A (ko) | 2005-05-12 | 2008-03-17 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 | 클라미디아 트라코마티스에 대한 면역원성 조성물 |
US9005654B2 (en) * | 2005-07-27 | 2015-04-14 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing liposomes |
JP4500854B2 (ja) | 2005-09-20 | 2010-07-14 | Jitsubo株式会社 | 分離用担体 |
CA2627302A1 (en) | 2005-10-25 | 2007-05-03 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Compositions comprising yersinia pestis antigens |
AU2007229161B2 (en) | 2006-03-23 | 2012-07-12 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Small internally segmented interfering RNA |
GB0608838D0 (en) | 2006-05-04 | 2006-06-14 | Novartis Ag | Organic compounds |
WO2008020330A2 (en) | 2006-08-16 | 2008-02-21 | Novartis Ag | Immunogens from uropathogenic escherichia coli |
DE102006040276A1 (de) | 2006-08-17 | 2008-02-21 | Technische Universität Dresden | Verwendung von Mono- oder Disacchariden zur Maskierung von Gerüchen sowie Verfahren und Zusammensetzung zur Maskierung von Gerüchen |
US8466255B2 (en) | 2007-02-05 | 2013-06-18 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Polyethylene glycol derivative |
CA2689042A1 (en) | 2007-02-16 | 2008-08-28 | Merck & Co., Inc. | Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules |
WO2008137758A2 (en) | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Mdrna, Inc. | Amino acid lipids and uses thereof |
PL2162538T3 (pl) | 2007-05-22 | 2016-10-31 | Oligomery do zastosowań terapeutycznych | |
GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
GB0717187D0 (en) | 2007-09-04 | 2007-10-17 | Novartis Ag | Compositions comprising yersinia pestis antigens |
CN101468203B (zh) | 2007-12-25 | 2012-06-27 | 沈阳药科大学 | 可断裂聚乙二醇脂质衍生物的制备方法以及应用 |
WO2009082817A1 (en) | 2007-12-27 | 2009-07-09 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna |
WO2009086558A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
US8188060B2 (en) | 2008-02-11 | 2012-05-29 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation |
ITMI20081249A1 (it) | 2008-07-09 | 2010-01-09 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata. |
WO2009109860A2 (en) | 2008-03-06 | 2009-09-11 | Novartis Ag | Mutant forms of chlamydia htra |
PL2279254T3 (pl) * | 2008-04-15 | 2017-11-30 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych |
WO2009129387A2 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Abbott Laboratories | Cationic lipids and uses thereof |
WO2009129395A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Abbott Laboratories | Cationic lipids and uses thereof |
WO2010009065A2 (en) | 2008-07-15 | 2010-01-21 | Novartis Ag | Amphipathic peptide compositions |
WO2010021865A1 (en) | 2008-08-18 | 2010-02-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids |
KR102264822B1 (ko) | 2008-11-10 | 2021-06-14 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물 |
BRPI1013780B8 (pt) | 2009-04-14 | 2022-10-04 | Novartis Ag | Composição imunogênica útil para imunização contra staphylococcus aureus, seu método de preparação e composição farmacêutica |
WO2011000108A1 (en) * | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein b |
WO2011005799A2 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Novartis Ag | Self replicating rna molecules and uses thereof |
ES2579936T3 (es) | 2009-08-20 | 2016-08-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Nuevos lípidos catiónicos con diversos grupos de cabeza para el suministro oligonucleotídico |
CA2816925C (en) * | 2009-11-04 | 2023-01-10 | The University Of British Columbia | Nucleic acid-containing lipid particles and related methods |
SG10201407996PA (en) | 2009-12-23 | 2015-01-29 | Novartis Ag | Lipids, lipid compositions, and methods of using them |
WO2011141704A1 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc | Novel cyclic cationic lipids and methods of use |
WO2011150347A2 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Pharmatrophix | Non-peptide bdnf neurotrophin mimetics |
US9770463B2 (en) | 2010-07-06 | 2017-09-26 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Delivery of RNA to different cell types |
AU2012330819B2 (en) * | 2011-11-04 | 2017-08-31 | Nitto Denko Corporation | Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles |
EP3988537A1 (en) | 2011-12-07 | 2022-04-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Biodegradable lipids for the delivery of active agents |
WO2014093178A2 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Boston Scientific Neuromodulation Corporation | Method for automation of therapy-based programming in a tissue stimulator user interface |
US9504747B2 (en) | 2013-03-08 | 2016-11-29 | Novartis Ag | Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents |
ES2887254T3 (es) * | 2013-03-08 | 2021-12-22 | Novartis Ag | Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos |
CA2906732C (en) * | 2013-03-15 | 2023-08-08 | The University Of British Columbia | Lipid nanoparticles for transfection and related methods |
US9988627B2 (en) | 2013-10-04 | 2018-06-05 | Novartis Ag | Formats for organic compounds for use in RNA interference |
WO2015051044A2 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Novartis Ag | Novel formats for organic compounds for use in rna interference |
WO2015154002A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-10-08 | Ohio State Innovation Foundation | Oligonucleotide lipid nanoparticle compositions, methods of making and methods of using the same |
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