JP2020034492A - 生体試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1. 生体試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法であって、前記測定対象物質と前記測定対象物質に結合する抗体とを反応させて免疫複合体を形成させる際に、前記反応をりん酸塩の存在下で行う、測定方法。
2. 前記測定対象物質は、リガンドで修飾された第1の抗体と結合体を形成させたものである、1に記載の測定方法。
3. 前記測定対象物質に結合する抗体は、酵素で標識された第2の抗体である、1または2に記載の測定方法。
4. 前記りん酸塩の添加量は、1mM以上500mM以下である、1〜3のいずれかに記載の測定方法。
5. 以下の工程を順に行う、1〜4のいずれかに記載の測定方法。
(1)測定対象物質を含む生体試料溶液に、リガンドで修飾された第1の抗体を含む溶液を混合して、前記測定対象物質と前記第1の抗体との結合体を形成する工程
(2)前記結合体を含む溶液を、前記リガンドの捕捉剤が固相化された担体に接触させて、前記リガンドを介して前記結合体を前記担体に結合させる工程
(3)前記結合体が結合された前記担体に、酵素で標識された第2の抗体およびりん酸塩を含む溶液を滴下して、前記結合体に結合している前記測定対象物質に前記第2の抗体を結合させる工程
(4)前記担体に、前記酵素の基質を含む溶液を滴下して、前記酵素による基質の変化量を測定する工程
6. 前記りん酸塩の添加量は、1mM以上500mM以下である、5に記載の測定方法。
(1)測定対象物質を含む生体試料溶液に、リガンドで修飾された第1の抗体を含む溶液を混合して、前記測定対象物質と前記第1の抗体との結合体を形成する工程
(2)前記結合体を含む溶液を、前記リガンドの捕捉剤が固相化された担体に接触させて、前記リガンドを介して前記結合体を前記担体に結合させる工程
(3)前記結合体が結合された前記担体に、酵素で標識された第2の抗体およびりん酸塩を含む溶液を滴下して、前記結合体に結合している前記測定対象物質に前記第2の抗体を結合させる工程
(4)前記担体に、前記酵素の基質を含む溶液を滴下して、前記酵素による基質の変化量を測定する工程
1.生体試料溶液(検体)の調製
市販のヒト血漿(コージンバイオ(株)社製)にRecombinant Human APP770(BioLegend社製)をそれぞれ無添加(ブランク)、200ng/ml、600ng/mlとなるように添加して3種類の測定用検体を調製した。
2.APP770の測定
(1)第1の抗体(5ng/μLビオチン標識抗APP770抗体)を含む溶液10μLと各検体50μLを混合し、40℃で5分間インキュベートし、抗原−抗体の結合体を形成させた。
(2)POCube(登録商標)専用反応容器(第1の抗体に結合したビオチンを特異的に認識する捕捉剤が結合された多孔性フィルタ(抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルタ担体)を含む容器)に、ブロッキング物質として1重量%カゼインを含む溶液(ブロッキング剤)を50μL添加した後、前記(1)で調製した溶液から50μLを担体を含む反応容器に滴下して40℃で5分間インキュベートし、リガンド(ビオチン)を介して結合体を担体(捕捉剤)に結合させた。
(3)インキュベート後、反応容器に洗浄液を60μLずつ2回分注してB/F分離を行ない、第2の抗体を含む溶液(30pg/μLアルカリフォスファターゼ標識抗APP770抗体液)20μLを反応容器に滴下した。40℃で5分間インキュベートし、反応容器内の担体(捕捉剤)に結合している結合体とアルカリフォスファターゼ標識抗APP770抗体との免疫複合体を形成させた。
(4)インキュベート後、反応容器に洗浄液を60μLずつ2回分注してB/F分離を行ない、次いで発光基質試薬(Lumigen社製APS−5)30μLを添加し、化学発光量(発光強度)を測定した。
結果を表1に示す。
(バッファーの影響の確認)
(1)第1の抗体を含む溶液(5ng/μLビオチン標識抗APP770抗体液)10μLと第2の抗体を含む溶液(100pg/μLアルカリフォスファターゼ標識抗APP770抗体液)20μL、そして表2に示す各バッファー(緩衝液)50μLを混合し、40℃で5分間インキュベートした。
(2)POCube(登録商標)専用反応容器に、1重量%カゼインを含むブロッキング剤を50μL添加した後、(1)でインキュベート後の溶液から70μLを反応容器に滴下し、40℃で5分インキュベートした。
(3)インキュベート後、反応容器に洗浄液を80μLずつ2回分注して、B/F分離を行ない、次いで発光基質試薬(Lumigen社製APS−5)30μLを添加し、化学発光量(発光強度)を測定した。
結果を表2に示す。
(りん酸塩濃度の影響の確認)
第2の抗体を含む溶液(酵素標識抗体液)のバッファー成分を、表3に記載の各バッファー(pH7.0)(Na2HPO4/KH2PO4)に変更し、実施例1の方法に従い、測定を行った。なお、生体試料溶液としてAPP770無添加のヒト血漿を用いた。
結果を表3に示す。
(1)APP770の測定
第2の抗体を含む溶液(30pg/μLアルカリフォスファターゼ標識抗APP770抗体液)20μLを反応容器に滴下する際に、前記第2の抗体を含む溶液の調製を100mMりん酸バッファー(pH7.0)(Na2HPO4/KH2PO4)を用いて行った以外は、比較例1と同様にして実験を行った。
結果を表4、図1に示す。
2 第1の抗体
3 リガンド
4 測定対象物質
5 非測定対象物質(夾雑物質)
6 担体(固相)
7 リガンド捕捉剤
8 第2の抗体
9 酵素
Claims (6)
- 生体試料中の測定対象物質を免疫学的に測定する方法であって、前記測定対象物質と前記測定対象物質に結合する抗体とを反応させて免疫複合体を形成させる際に、前記反応をりん酸塩の存在下で行う、測定方法。
- 前記測定対象物質は、リガンドで修飾された第1の抗体と結合体を形成させたものである、請求項1に記載の測定方法。
- 前記測定対象物質に結合する抗体は、酵素で標識された第2の抗体である、請求項1または2に記載の測定方法。
- 前記りん酸塩の添加量は、1mM以上500mM以下である、請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
- 以下の工程を順に行う、請求項1〜4のいずれかに記載の測定方法。
(1)測定対象物質を含む生体試料溶液に、リガンドで修飾された第1の抗体を含む溶液を混合して、前記測定対象物質と前記第1の抗体との結合体を形成させる工程
(2)前記結合体を含む溶液を、前記リガンドの捕捉剤が固相化された担体に接触させて、前記リガンドを介して前記結合体を前記担体に結合させる工程
(3)前記結合体が結合された前記担体に、酵素で標識された第2の抗体およびりん酸塩を含む溶液を滴下して、前記結合体に結合している前記測定対象物質に前記第2の抗体を結合させる工程
(4)前記担体に、前記酵素の基質を含む溶液を滴下して、前記酵素による基質の変化量を測定する工程 - 前記りん酸塩の添加量は、1mM以上500mM以下である、請求項5に記載の測定方法。
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2018
- 2018-08-31 JP JP2018163029A patent/JP7268306B2/ja active Active
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