CN111487413A - 一种elisa法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于体外诊断试剂技术领域，提供了一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒。所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，包括包被有抗H‑FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H‑FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。本发明的检测试剂盒灵敏度较高，试剂盒的最低检测限低至1pg/mL；本发明试剂盒均一性良好，稳定性高，批内变异系数小于10％，批间变异系数都小于5％。该试剂盒与血清中易干扰测试的血清总胆红素TBIL和甘油三酯TG的交叉反应很低，不会对H‑FABP的测量造成干扰。

Description

一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌缺血坏死疾病，临床上多表现为剧烈而持久的胸骨后疼痛，严重时可并发心律失常、休克或心力衰竭，其病死率高、危害性大。
AMI通常发病突然且发展迅速，早发现、早治疗对缩小梗死面积，保护心脏功能有重大意义，可以说是挽救患者生命、提高患者预后的关键所在。
心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)为一种小分子蛋白质(15.0KD)是心肌细胞内的脂肪酸载体，是目前心肌早期缺血损伤性的敏感标志物之一。在心肌中的水平比骨骼肌高10倍。肾脏、肝脏和小肠中的水平很低。具有较好的心肌特异性。心肌损伤后心肌细胞对缺血、缺氧的敏感性增加。需动员脂肪酸供能，致使心肌细胞内心型脂肪酸结合蛋白水平增加，最终导致在血液中的水平升高。
AMI发生时，H-FABP在心肌缺血缺氧而尚未坏死时即可检测到，心肌受损后2h迅速升高，并于6h达到峰值，而在12～24h内恢复正常，相比较cTnI、CK-MB等其他心肌坏死血清生化标志物具有更高的时效性。
H-FABP是一种无酶活性的蛋白质，其定性检测与定量检测都需要借助免疫学方法。从最早的放射免疫法到最近的乳胶微粒增强免疫比浊法以及胶体金免疫技术在H-FABP测定中的应用，H-FABP的临床检测经历了一个检测速度越来越快。
1.放射免疫法
放射免疫法是最早被报道用于FABP定量检测的方法，Ockner等于1974年在研究IFABP时采用了放射免疫法，他们用14C标记抗血清与待测标本反应，通过测定免疫沉淀中放射性比活度来检测相应的I-FABP浓度。随后，Ockner等于1982年又利用相同的方法完成了L-FABP的定量检测。鉴于H-FABP与I-FABP和L-FABP相似的分子大小以及不同的抗原决定簇，此法应同样适用于H-FABP的定量检测。然而，放射免疫法准备及测定过程都较为繁琐，所需的放射性同位素价格昂贵且存在放射性污染，在临床检测中缺乏实用价值。
2.酶免疫法
(1)竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)：随着H-FABP单克隆抗体的制备成功，ELISA逐渐成为检测H-FABP的主流方法，由于H-FABP相对分子质量较小，竞争性ELISA最先进入人们的考虑范围并于1989年被Know lton等研制成功，实验采取鼠抗兔H-FABP单克隆抗体作为捕获抗体，用定量的过氧化物酶(HRP)标记的标准抗原与标本中的抗原竞争性结合捕获抗体，最后通过底物显色反应达到标本中抗原定量的目的，此方法检测时间长达16h，不能满足临床检测的需求，但是竞争性ELISA定量H-FABP血浆浓度的成功证明了基于单克隆抗体的ELISA用于H-FABP定量的可行性，为以后ELISA的改进积累了经验；
(2)双抗体夹心：ELISA:Ohka ru等于1995年报道了他们研制成功的双抗体夹心ELISA定量检测H-FABP浓度的试剂盒，他们采用8E3抗人H-FABP抗体作为捕获抗体，HRP标记的8B9抗人H-FABP抗体作为标记抗体，试验通过标本抗原与捕获抗体结合、抗原-捕获抗体复合物与标记抗体结合、底物的加入与显色以及测量620nm波长的吸光度4个步骤完成，检测时间缩短至75min，最低检测浓度为1.25μg/L，血浆标本的检测线性范围达到220μg/L，组内与组间不精密度分别低于7.9％和7.0％，上述技术参数显示该试剂盒表现比较令人满意，随后Wodzing等于1997年研制成功了一种一步法双抗体夹心ELISA用于血浆H-FABP浓度的定量，这种技术基于一种高亲和力单克隆抗体的构建成功，它与上述两步法的不同之处在于：将待测抗原与酶标抗体一次性加入捕获抗体包被的固相载体表面，一步法双抗体夹心ELISA使得血浆H-FABP定量的检测时间缩短到45min，最低检测浓度可达到0.20μg/L，组内与组间不精密度分别低于6.0％和11.0％，但是此方法检测的线性范围很窄，只到6μg/L。2000年有学者等介绍了一种全自动的双抗体夹心ELISA，该技术利用全自动酶标仪以及微量进样***使得ELISA的操作得以自动化，非常适合临床大批量标本的检测，该检测方法组间不精密度为2.3％-7.0％，相比手工法有了进一步的改进，总之，双抗体夹心ELISA试剂盒的研制成功标志着实验室定量检测H-FABP技术的成熟，该方法的线性范围、不精密度等指标均比较理想，但是已经报道的ELISA检测时间最快也需要45min，对于出现于AMI早期的心肌标志物来讲，这无疑限制了这种检测方法的应用；
(3)基于原位沉淀加强椭圆滤计比浊的ELISA：Robers等于1999年介绍了一种可用于H-FABP定量的基于原位沉淀加强椭圆滤计比浊的ELISA，该ELISA与上述标准ELISA不同之处在于使用了致沉淀底物二氨基联苯氨(DAB)而非经典使用的显色底物四甲基联苯氨(TMB)作为HRP的底物，最后通过椭圆滤计比浊法测定固相载体表面的浊度增加情况，并据此计算出标本中H-FABP的浓度，由于DAB经HRP作用后的沉淀产物多集中在抗原抗体结合物原位的固相载体表面，所以浊度的增加主要体现在固相载体表面这一二维的结构中，而经典的TMB底物产生的颜色变化则分布在反应孔这个三维的结构中，相比之下浊度的增加更为敏感，所以依据这个原理建立的ELISA有着比以往ELISA更高的灵敏度与更快的反应时间，H-FABP的检测最低浓度可达到100fmol/L，相当于1.25×10-4μg/L，而检测时间也相应缩短至10～20min，但是其检测浓度的线性范围相对较窄，只有10μg/L，对于浓度较高的AMI患者标本，只能通过稀释进入检测的线性范围。
3.免疫传感器技术的应用
免疫传感器技术将免疫学方法的特异性与传感器方法的敏感性结合在一起，可用于非酶类蛋白质的检测。1996年，Siegmann-Thoss等成功设计出了第1种利用免疫传感器检测H-FABP浓度的方法。该免疫传感器采用C lark型氧电极，用固定于硝酸纤维素膜上抗H-FABP抗体为捕获抗体，葡萄糖氧化酶(GOD)标记的另一抗H-FABP抗体为标记抗体，标记好抗体的免疫膜被包被于氧电极上，加入待测抗原和底物葡萄糖后通过氧电极检测出的GOD含量换算出待测抗原的浓度。基于这种免疫传感器的检测方法检测时间需要30min，检测下限为5μg/L，线性范围可达50μg/L。但是，固定了捕获抗体的免疫膜用10次就需要更换新的，并重新包被于电极表面，这需要耗费大量的人力物力，不适用于临床标本的检测。Schreiber等于1997年研制成功一种基于可抛弃电极的免疫传感器***用于血浆H-FABP浓度的定量。这种传感器***采用Ag/AgC l参比电极，捕获抗体被事先通过吸附作用固定在电极表面，用双抗体夹心模式捕获待测抗原并通过碱性磷酸酶标记的第二抗体完成免疫反应。加入含有氨苯基磷酸的底物液后，碱性磷酸酶可以催化氨苯基磷酸生成氨基苯酚，后者在电极表面被氧化并释放电子进而被Ag/AgCl参比电极检测到，据此抗原浓度得以定量。这种方法的检测时间在20min以内，检测下限为10μg/L，而线性检测范围可达350μg/L，组内和组间不精密度分别为10.0％～15.0％和9.0％～16.0％。由于此免疫传感器用到的捕获抗体标记电极是可抛弃型的，且在低温下(4℃)比较稳定，抗体活性可保持3个月，所以在检测前可以批量生产，这在一定程度上避免了Siegmann-Thoss等方法的不足。
4.乳胶微粒增强免疫比浊法
乳胶微粒增强免疫比浊法常用于含量微小的蛋白质检测。1998年，Robers等成功将其引入到H-FABP的检测中。试验设计采用3种针对不同表位的抗H-FABP单克隆抗体标记乳胶微粒，抗体与相应抗原结合后导致乳胶微粒的凝聚，根据浊度增加的情况计算H-FABP的浓度。检测所需试剂与样本量极少，只需要75μl乳胶结合抗体、155μl反应稀释液以及25μl的血浆标本，检测时间在10min以内，检测的最低浓度可达1.1μg/L，线性范围可达150μg/L。整个分析过程可以在临床全自动免疫比浊分析仪上进行，自动化程度高，适用于临床大批量标本的处理。
5.免疫胶体金技术的应用
免疫胶体金技术是利用胶体金聚集显色的特性将其与特异的单克隆抗体标记，从而检测特异抗原的技术。Watanabe等于2001年研制成功了一种以全血标本作为检测对象的H-FABP定性试纸条。试纸条由以下3个区域构成：(1)样品接收区域，由固相血浆分离介质组成；(2)反应区域：由包含有胶体金标记的显色抗体的结合板构成；(3)检测区域：由标记有2种捕获抗体的尼龙膜以及吸水能力强的纤维素膜构成。试纸条的一大特点是设计了一个所谓的固相血浆分离介质用以分离抗凝全血标本中的血浆，这一设计使得临床上省去了样品离心的步骤，间接缩短了检测时间。试验显示这种基于免疫胶体金技术的试纸条对全血标本的定性时间在15min以内，操作也很方便，惟一不足之处在于不能定量，限制了H-FABP在估计心肌梗死面积以及动态观察进行性心肌梗死方面的应用。2003年Chan等利用一种特殊的读卡器对阳性结果检测线扫描得出胶体金聚集颜色的密度，据此计算出待测抗原的浓度，从而达到对H-FABP浓度的定量。免疫胶体金试纸条的设计与上述Watanabe等的方法类似，不同之处在于检测样品采用血浆样品。结果显示，检测时间仅需15min，检测下限为2.8μg/L，检测的线性范围达到125μg/L，组内与组间的不精密度分别为8.0％-10.0％和10.0％-15.0％。这种试纸条比较稳定，常温或4℃可存放1年而没有抗体活性的明显降低。这种检测方法在一定程度上解决了免疫胶体金技术不能定量的问题，但是定量的检测下限仍不能和传统ELISA相比。
AM1是严重危害患者生命的临床急症，快速诊断、及时决策是挽救患者生命的重要保，救护地点检测或床旁检测在此类疾病的诊断中有重要价值，本发明旨在构建一种采用双抗体夹心ELISA法定量检测人血清中心型脂肪酸结合蛋白浓度水平的体外诊断试剂盒，在发病早期简便而快速的对AMI病人进行排除性筛选。
发明内容
本发明实施例提供一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，旨在解决目前试剂盒均一性差、稳定性不高、特异性不高以及检测时间长的问题。本发明提供的检测试剂盒具有均一性好、稳定性高、特异性高、操作简单检测时间短、价格低廉的特点，具有更广泛的应用价值。
本发明实施例是这样实现的，一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，包括包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。
所述包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：
1)将包被抗H-FABP单克隆抗体溶于包被缓冲液中至包被抗体浓度为2ug/mL，得到混合液；
2)将步骤1)获得的混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1mL，加盖板膜，2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；再向每孔中加入封闭液，每孔0.12mL，在2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；置25-35℃干燥间内，湿度<40％，干燥时间20-24小时，铝箔袋封装板子，2～8℃保存，得到酶标板。
所述包被抗H-FABP单克隆抗体为抗H-FABP单克隆抗体，购自芬兰HyTest公司。
所述包被缓冲液的组成：无水碳酸钠1.59g；NaHCO3 2.98g；苋菜红0.01g；纯化水定容至1000mL；
所述封闭液的配方：Na2HPO4·12H2O 5.20g；NaH2PO4·2H2O 0.87g；蔗糖20.00g；干酪素10.00g；BSA 10.00g；纯化水定容至1000mL。
所述HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体中，所述抗H-FABP多克隆抗体，购自芬兰HyTest公司。
所述HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗H-FABP多克隆抗体在0.01M pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，终浓度为5mg/mL；
(2)取10mg HRP溶解于2mL H2O，终浓度为5mg/mL，获得HRP溶液；
(3)向步骤(2)获得的HRP溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4溶液，室温避光搅拌氧化20min；
(4)氧化后的酶液在1mM pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜，透析截留分子量12000-14000，换液3次；
(5)取出透析袋中溶液，加入0.2M Na2CO3缓冲溶液，调至pH为9.0-9.5，并迅速与步骤(1)获得的pH9.0的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；
(6)加入新配的6mg/mL NaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应还原2h；
(7)还原后的反应体系，于0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
(8)加入BSA使终浓度为2-3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存，获得HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体。
所述标准品为H-FABP抗原，购自芬兰HyTest公司；
所述标准品稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度如下：1％(质量百分含量)酪蛋白，8％(质量百分含量)海藻糖，3％(质量百分含量)甘露醇，1mM EDTA，0.5％(质量百分含量)甘氨酸，150mM NaCl，0.1％(质量百分含量)防腐剂Proclin-300。
所述样本稀释液的组成：溶剂是20mM pH6.0的PBS缓冲液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％明胶，0.2％酪蛋白，150mM NaCl，0.01％Tween-20，5％蔗糖，0.5/万溴钾酚紫，0.1％防腐剂Proclin-300。
所述浓缩洗涤液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度如下：116g/L Na2HPO4 12H2O，11.84g/L NaH2PO4 2H2O，180g/L NaCl，5mL/L吐温20，1mL/L防腐剂Proclin-300。
所述显色液A的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液A中的浓度如下：7.28g/L柠檬酸，23.75g/L磷酸氢二钠，0.5g/L过氧化氢尿。
所述显色液B的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液B中的浓度如下：100mL/L甲醇，1g/L PVA，1.5g/LNa2S2O3，1mL/L HCl，0.03％(质量百分含量)TMB，1％(质量百分含量)DMSO。
所述终止液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述终止液中的浓度如下：200mL/1.8L硫酸，1.35g/1.8L EDTA。
所述检测抗体稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度如下：2％(质量百分含量)BSA，0.1％(质量百分含量)酪蛋白，150mMNaCl，0.01％(质量百分含量)吐温20，5/1万(质量百分含量)氨基比啉，1/20万(质量百分含量)染料食品红，0.1％(质量百分含量)防腐剂Proclin-300。
本发明所达到的有益效果主要体现在一下几方面：
1.本发明的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒灵敏度较高，试剂盒的最低检测限低至1pg/mL；本发明试剂盒均一性良好，稳定性高，批内变异系数小于10％，批间变异系数都小于5％。
2.本发明试剂盒的特异性好，该试剂盒与血清中易干扰测试的血清总胆红素TBIL和甘油三酯TG的交叉反应很低，不会对H-FABP的测量造成干扰。
3.本发明试剂盒临可实现对临床血清样本中H-FABP的快速定量检测，以作为对AMI病人发病早期简便而快速的排除性筛选。
附图说明
图1是本发明实施例二中检测获得的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一试剂盒的组成：
本发明实施例提供了一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，包括包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。
试剂盒中所包含物质的组分和制备如下：
所述包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：
1)将包被抗H-FABP单克隆抗体溶于包被缓冲液中至包被抗体浓度为2ug/mL，得到混合液；
2)将步骤1)获得的混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1mL，加盖板膜，2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；再向每孔中加入封闭液，每孔0.12mL，在2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；置25-35℃干燥间内，湿度<40％，干燥时间20-24小时，铝箔袋封装板子，2～8℃保存，得到酶标板。
所述包被抗H-FABP单克隆抗体为抗H-FABP单克隆抗体，购自芬兰HyTest公司。
所述包被缓冲液的组成：无水碳酸钠1.59g；NaHCO3 2.98g；苋菜红0.01g；纯化水定容至1000mL；
所述封闭液的配方：Na2HPO4·12H2O 5.20g；NaH2PO4·2H2O 0.87g；蔗糖20.00g；干酪素10.00g；BSA 10.00g；纯化水定容至1000mL。
所述HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体中，所述抗H-FABP多克隆抗体，购自芬兰HyTest公司。
所述HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗H-FABP多克隆抗体在0.01M pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，终浓度为5mg/mL；
(2)取10mg HRP溶解于2mL H2O，终浓度为5mg/mL，获得HRP溶液；
(3)向步骤(2)获得的HRP溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4溶液，室温避光搅拌氧化20min；
(4)氧化后的酶液在1mM pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜，透析截留分子量12000-14000，换液3次；
(5)取出透析袋中溶液，加入0.2M Na2CO3缓冲溶液，调至pH为9.0-9.5，并迅速与步骤(1)获得的pH9.0的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；
(6)加入新配的6mg/mL NaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应还原2h；
(7)还原后的反应体系，于0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
(8)加入BSA使终浓度为2-3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存，获得HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体。
所述标准品为H-FABP抗原，购自芬兰HyTest公司。
所述样本稀释液的组成：溶剂是20mM pH6.0的PBS缓冲液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％明胶，0.2％酪蛋白，150mM NaCl，0.01％Tween-20，5％蔗糖，0.5/万溴钾酚紫，0.1％防腐剂Proclin-300。
所述浓缩洗涤液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度如下：116g/L Na2HPO4 12H2O，11.84g/L NaH2PO4·2H2O，180g/L NaCl，5mL/L吐温20，1mL/L防腐剂Proclin-300。
所述显色液A的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液A中的浓度如下：7.28g/L柠檬酸，23.75g/L磷酸氢二钠，0.5g/L过氧化氢尿。
所述显色液B的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液B中的浓度如下：100mL/L甲醇，1g/L PVA，1.5g/LNa2S2O3，1mL/L HCl，0.03％(质量百分含量)TMB，1％(质量百分含量)DMSO。
所述终止液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述终止液中的浓度如下：200mL/1.8L硫酸，1.35g/1.8L EDTA。
所述标准品稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度如下：1％(质量百分含量)酪蛋白，8％(质量百分含量)海藻糖，3％(质量百分含量)甘露醇，1mM EDTA，0.5％(质量百分含量)甘氨酸，150mM NaCl，0.1％(质量百分含量)防腐剂Proclin-300。
所述检测抗体稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度如下：2％(质量百分含量)BSA，0.1％(质量百分含量)酪蛋白，150mMNaCl，0.01％(质量百分含量)吐温20，5/1万(质量百分含量)氨基比啉，1/20万(质量百分含量)染料食品红，0.1％(质量百分含量)防腐剂Proclin-300。
实施例二：用试剂盒检测的步骤
(一)：标准曲线的制作
使用前配制如下溶液：
(1)用检测抗体稀释液稀释HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体，使溶质(检测用抗H-FABP多克隆抗体)与溶剂(检测抗体稀释液)的比例为1:5000；
(2)用标准品稀释液溶解标准品，使标准品的浓度依次为0pg/mL、5pg/mL、15pg/mL、40pg/mL、130pg/mL、300pg/mL。
检测步骤如下：
1.配液：将浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水1:20稀释备用(30mL洗涤液稀释至600mL，50mL洗涤液稀释至1000mL)；
2.编号：将样品对应微孔按序编号；
3.加样：分别在相应孔中加入校准品溶液50μL，轻轻振荡混匀；
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
5.洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
6.加酶：每孔加入酶结合物100μL，轻轻振荡混匀；
7.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
8.洗涤：用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
9.显色：每孔加入显色液A、B液各50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
10.测定：每孔加终止液50μL，轻拍混匀，设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，用空白孔调零点后测定各孔OD值；
11.数据处理：
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理。以各校准品的OD值(需减去S0的OD值)的对数为纵坐标(Y轴)，各校准品的浓度的对数为横坐标(X轴)作图，得到标准曲线。得到的标准曲线如图1所示。
标准曲线的方程式为y＝0.6572x-1.1613相关系数为0.9994。
(二)待测样本的检测
在(一)中的步骤3中，加入的是待测样本溶液，在步骤11中，是将待测样本溶液的OD值代入标准曲线，得到待测样本溶液中H-FABP的含量。其余步骤均与实验一中相同。
待测样本为新鲜血清或是新鲜血浆样本，静脉采血后24小时内分离。血清血浆样本在4℃储存时间不得超过1周。如果无法在采血后1周内进行测定，则将血清样本密封后，置于-20℃以下，避免反复冻融。严重溶血、脂血样本不得用于检测。
实施例三、试剂盒的性能
待测试剂盒为：制备三个批次的试剂盒(批次一、批次二和批次三)
(一)最低检测限
1、取包被有H-FABP的微孔板，每孔加入50μL标准品轻轻振荡混匀。置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入酶结合物100μL，置37℃温育30分钟。每个待测试剂盒，S0溶液设置20个复孔，其它校准品加双孔。
2、完成步骤1后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。
3、完成步骤2后，每孔加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μL，在酶标仪上用450/630nm双波长检测。各孔的吸光值见表1。
根据各校准点OD值及相应浓度使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理。计算20孔50μL S0溶液相应的吸光值的平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程计算出吸光值为Mean+2×SD时的浓度值为最低检测限。
表1：三批次检测各孔的吸光值
Figure BDA0001962450880000131
Figure BDA0001962450880000141
由表1数据，可知三个批次的试剂盒的最低检测限均在1pg/mL以下。
(二)重复性和批间差
重复性是用同一批试剂盒测定一份样本得到的变异系数(CV)，每个质控品需在一块板内随机做10孔精密性测定，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批内变异系数(CV)＝SD/Mean×100％
批间差是不同批次试剂盒间的重复性，随机抽取三批试剂盒，用这些试剂盒测定质控品3次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批间变异系数(CV)＝SD/Mean×100％。
质控品为H-FABP。
1、取包被有H-FABP的微孔板，每孔加入50μL特定溶液轻轻振荡混匀。置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入酶结合物100μL，置37℃温育30分钟。
特定溶液为特定溶液甲或特定溶液乙。
特定溶液甲为S0溶液、S1溶液、S2溶液、S3溶液、S4溶液或S5溶液。每个待测试剂盒，每种特定溶液甲设置两个复孔。
特定溶液乙为不同浓度的质控品溶液。
质控品溶液的制备方法：将质控品溶于20mM、pH7.4的PBS缓冲液，得到100pg/mL的低浓度质控品溶液(QC1)和500pg/mL的高浓度质控品溶液(QC2).每个待测试剂盒，每种特定溶液乙设置10个复孔。
2、完成步骤1后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。
3、完成步骤2后，每孔加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μL，在酶标仪上用450/630nm双波长检测。
采用特定溶液甲时，各孔的吸光值见表2。
表2采用特定溶液甲时检测各孔的吸光值
Figure BDA0001962450880000142
Figure BDA0001962450880000151
采用特定溶液乙时，各孔的吸光值见表3。
表3采用特定溶液乙时检测各孔的吸光值
QC1 QC2 QC1 QC2 QC1 QC2
1 0.718 1.818 0.774 1.900 0.773 1.805
2 0.745 1.956 0.705 1.827 0.763 1.851
3 0.785 1.843 0.775 1.875 0.751 1.901
4 0.706 1.882 0.468 1.714 0.764 1.953
5 0.762 1.940 0.466 1.720 0.708 1.840
6 0.742 1.930 0.404 1.756 0.712 1.881
7 0.755 1.840 0.740 1.707 0.718 1.837
8 0.703 1.877 0.719 1.679 0.719 1.872
9 0.716 1.920 0.747 1.611 0.747 1.860
10 0.753 1.802 0.715 1.910 0.764 1.953
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理。根据标准曲线计算特定溶液乙中的H-FABP浓度。结果见表4和表5.三个批次的试剂盒测定高浓度和低浓度两个质控。批内变异系数都小于10％，表明试剂盒的均一性良好，结果具有重复性。
表4
QC1 QC2 QC1 QC2 QC1 QC2
1 104.78 561.35 112.32 557.05 112.36 518.78
2 101.23 535.41 95.06 519.50 109.76 591.03
3 97.50 556.65 112.57 544.06 105.14 531.57
4 97.25 557.17 106.42 582.90 115.51 543.97
5 100.48 541.07 109.74 526.11 109.50 572.32
6 97.99 567.13 95.78 545.10 104.38 544.48
7 100.48 594.79 96.75 508.41 103.88 528.49
8 114.12 556.12 98.22 578.11 95.45 546.56
9 105.29 577.17 98.46 572.81 105.65 540.34
10 109.92 516.05 97.48 562.28 110.02 589.42
平均值 102.90 556.29 102.28 549.63 107.17 550.70
SD 5.62 21.98 7.14 25.56 5.57 25.12
CV 5.5％ 4.0％ 7.0％ 4.7％ 5.2％ 4.6％
表5
QC1 QC2
第一批 102.90 556.29
第二批 102.28 549.63
第三批 107.17 550.70
平均值 104.12 552.21
SD 2.17 2.92
CV 2.1％ 0.5％
用三批试剂盒测定高浓度和低浓度两个质控品，批间变异系数都小于5％，表明不同批次的试剂盒之间变异很小，测量结果具有重复性。
综上所述，本发明提供的试剂盒的主要性能指标的标准如下：
最低检测限：不高于1pg/mL；
重复性：批内变异系数不高于10％；
批间差：批间变异系数不高于5％。
(三)特异性
1、取包被有H-FABP的微孔板，每孔加入50μL特定溶液轻轻振荡混匀。置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入酶结合物100μL，置37℃温育30分钟。
特定溶液为S0溶液、S1溶液、S2溶液、S3溶液、S4溶液、S5溶液、血清总胆红素TBIL为40μmol/L的标本溶液和甘油三酯TG为4mmol/L的标本溶液。每个待测试剂盒，每种特定溶液设置两个复孔。
2、完成步骤1后，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。
3、完成步骤2后，每孔加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μL，在酶标仪上用450/630nm双波长检测。
根据各校准点OD值及相应浓度作Log-Log拟合。根据标准曲线计算各交叉反应物质的H-FABP测值，此浓度为本试剂与TBIL的交叉值，以及本试剂与TG的交叉值。
各孔的吸光值和反推浓度见表6。
表6分析特异性实验结果
Figure BDA0001962450880000171
Figure BDA0001962450880000181
特异性是为了检测血液中其它物质对试剂盒测量的干扰。在人血液中容易对H-FABP的测量造成干扰的物质有血清总胆红素TBIL和甘油三酯TG。用高浓度的这些物质进行实验，如表7所示结果表明，试剂盒与这些物质的交叉反应很低，不会对H-FABP的测量造成干扰。
表7
反应物质 浓度 交叉反应值
血清总胆红素(TBIL) 40μmol/mL <5pg/mL
甘油三酯(TG) 4mmol/L <5pg/mL
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。
2.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：
1)将包被抗H-FABP单克隆抗体溶于包被缓冲液中至包被抗体浓度为2ug/mL，得到混合液；
2)将步骤1)获得的混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1mL，加盖板膜，2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；再向每孔中加入封闭液，每孔0.12mL，在2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；置25-35℃干燥间内，湿度<40％，干燥时间20-24小时，铝箔袋封装板子，2～8℃保存，得到酶标板。
3.如权利要求2所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液的组成：无水碳酸钠1.59g；NaHCO3 2.98g；苋菜红0.01g；纯化水定容至1000mL；
所述封闭液的配方：Na2HPO4·12H2O 5.20g；NaH2PO4·2H2O 0.87g；蔗糖20.00g；干酪素10.00g；BSA 10.00g；纯化水定容至1000mL。
4.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗H-FABP多克隆抗体在0.01M pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，终浓度为5mg/mL；
(2)取10mg HRP溶解于2mL H2O，终浓度为5mg/mL，获得HRP溶液；
(3)向步骤(2)获得的HRP溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4溶液，室温避光搅拌氧化20min；
(4)氧化后的酶液在1mM pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜，透析截留分子量12000-14000，换液3次；
(5)取出透析袋中溶液，加入0.2M Na2CO3缓冲溶液，调至pH为9.0-9.5，并迅速与步骤(1)获得的pH9.0的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；
(6)加入新配的6mg/mL NaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应还原2h；
(7)还原后的反应体系，于0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
(8)加入BSA使终浓度为2-3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存，获得HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体。
5.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为H-FABP抗原，购自芬兰HyTest公司；
所述标准品稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度如下：质量百分含量1％酪蛋白，质量百分含量8％海藻糖，质量百分含量3％甘露醇，1mM EDTA，质量百分含量0.5％甘氨酸，150mMNaCl，质量百分含量0.1％防腐剂Proclin-300。
6.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的组成：溶剂是20mM pH6.0的PBS缓冲液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％明胶，0.2％酪蛋白，150mMNaCl，0.01％Tween-20，5％蔗糖，0.5/万溴钾酚紫，0.1％防腐剂Proclin-300。
7.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度如下：116g/LNa2HPO4 12H2O，11.84g/L NaH2PO4 2H2O，180g/L NaCl，5mL/L吐温20，1mL/L防腐剂Proclin-300。
8.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述显色液A的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液A中的浓度如下：7.28g/L柠檬酸，23.75g/L磷酸氢二钠，0.5g/L过氧化氢尿；
所述显色液B的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液B中的浓度如下：100mL/L甲醇，1g/L PVA，1.5g/LNa2S2O3，1mL/L HCl，质量百分含量0.03％TMB，质量百分含量1％DMSO。
9.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述终止液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述终止液中的浓度如下：200mL/1.8L硫酸，1.35g/1.8L EDTA。
10.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度如下：质量百分含量2％BSA，质量百分含量0.1％酪蛋白，150mM NaCl，质量百分含量0.01％吐温20，质量百分含量5/1万氨基比啉，质量百分含量1/20万染料食品红，质量百分含量0.1％防腐剂Proclin-300。
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