CN111487409A - 一种s100b蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种s100b蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物技术领域，具体涉及一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法，所述S100B蛋白的检测试剂盒包括包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。本发明实施例提供的试剂盒待测品(标准品或血清样本)与辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液的反应时间为2小时；临床常见的病理性黄疸和脂血症标本对血清S100B蛋白测定未见明显干扰；批内及批间平均变异均小于5.0％，具有简便、快速、特异、敏感，适于临床常规应用的技术效果。

Description

一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
S100B蛋白是一个分子量为21KD的酸性钙结合蛋白。由于其分子量较小，并大量存在中枢神经***中，在体内发挥着多种生物学功能，因此，它与血脑屏障和脑损伤有着密切的关系。目前，国内外已对S100B蛋白，特别是对其在血清中的动态变化水平在疾病的诊断、预后方面的临床意义方面进行了大量研究。
S100B的检测实际是对S100B亚单位的检测，S100B蛋白检测主要采用免疫学方法，目前主要有放免分析法(RIA)或免疫放射测定法(IRMA)、荧光免疫测定法(FIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和电化学发光法(ECLIA)，用于检测脑脊液、血液、尿、羊水等中S100B蛋白的含量，从而进行进一步的临床诊断。
放射免疫(RIA)或免疫放射测定法(IRMA)测定的基本原理是标记抗原与未标记待测抗原竞争反应***中有限抗体上的特异结合位点，其灵敏度为0.2μg/L。但因存在放射污染和危害，核素半衰期短，试剂盒稳定期短，操作繁琐等不足而应用受限。
荧光免疫法(FIA)的基本原理是以荧光色素标记的特异性抗体，与待测抗原结合，测定荧光的强度以计算出标本中抗原的含量。Wiesmann等采用FIA方法，用抗S100B蛋白单抗包被微孔板.与待测抗原及生物素标记兔抗S100B抗体结合.形成双抗体夹心复合物。此法灵敏度较IRMA显著提高，达到0.015μg/L，重复性好，可自动化。但须专门的荧光设备，因此在临床上不易普及。
酶联免疫吸附试验(ELISA)采用原核***表达的S100B作为标准品并制备抗S100B单克隆抗体，建立的双抗体夹心法，其灵敏度高达0.0125μg/L，线性范围0-3.2μg/L，CV<6.9％。ELISA法较RIA、FIA具有灵敏度高、无污染、操作简便、报告结果快速等诸多优点，在临床上具有极大的应用价值。我国已有国产化ELISA试剂，有较好的稳定性和灵敏度。
电化学发光法(ECLIA)是利用链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的抗体与S100B抗体连接为一体，形成双抗体夹心，最后通过与抗体偶联的发光剂和电子供体TPA通过氧化还原反应在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与发光剂的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。电化学发光法的优点：⑴标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定；⑵敏感度高，可达pg/mL水平；⑶线性范围宽；⑷反应时间短，20min以内可完成测定；⑸试剂稳定性好，2～5℃可保持一年以上，是目前较为常用的检测方法。与ELISA法相比其主要优势为其反应动力学较ELISA方法更快，并且具有更大的固相结合表面。分析方法的设计与ELISA方法有很多相似处，但在实验设计上却拥有更多的灵活性。
因此，为了满足临床检测需求，更快、更准确的实现对血清中S100B蛋白的定量检测，亟需一种定量测定血清中S100B浓度水平的体外诊断试剂盒，为颅脑损伤和脑血管疾病诊断及预后判断提供帮助。
发明内容
本发明实施例提供一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，以满足临床检测需求，更快、更准确的实现对血清中S100B蛋白的定量检测。
本发明实施例提供的S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。
本发明实施例还提供一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)配制如下溶液：
用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液与检测抗体稀释液的比例为1:10000；
用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体与检测抗体稀释液的体积比为1:5000，得到酶结合物；
用标准品稀释液溶解标准品，得到多个浓度梯度变化的标准品溶液；
将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照1:20的体积比稀释得到洗涤液。
(2)绘制标准曲线：
在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入校准品溶液50μL，然后每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；
用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
每孔加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；
用空白孔调零点后，使用发光仪测定各孔光密度值；
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理，以各校准品的光密度值的对数为纵坐标，各校准品的浓度的对数为横坐标作图，得到标准曲线；
(3)待测样品检测
在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入待测样品50μL，然后加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；
用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；
用空白孔调零点后，使用发光仪测定光密度值；
将待测样本溶液的光密度值代入标准曲线，得到待测样本溶液中S100B的含量。
本发明实施例提供的试剂盒，待测品(标准品或血清样本)辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液的反应时间为2小时；临床常见的病理性黄疸和脂血症标本对血清S100B蛋白测定未见明显干扰；批内及批间平均变异均小于5.0％，具有简便、快速、特异、敏感，适于临床常规应用的技术效果。
附图说明
图1是本发明实施例提供标准曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。
在本发明实施例中，所述辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液通过如下方法制得：抗体纯化、定量后，在0.01mol/L、pH＝9.0～9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，至浓度为5mg/mL；配置5mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；向所述辣根过氧化物酶水溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4，室温避光搅拌20min，得到氧化后的酶液；将所述氧化后的酶液在1mmol/L、pH＝4.4、4℃的醋酸盐缓冲液透析过夜，换液3次；取出透析袋中的溶液，加入0.2mol/LNa2CO3缓冲溶液，调至pH为9.0-9.5，并迅速与纯化、定量后的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；加入6mg/mL NaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应2h；还原后的反应体系，于0.15mol/L、pH＝7.4的PBS中4℃透析过夜，换液3次；加入BSA使终浓度为2～3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存。
在本发明实施例中，所述标准品为S100B抗原。
在本发明实施例中，所述样本稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝6.0的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％的明胶、0.2％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、0.01％的吐温-20、5％的蔗糖、0.5/万的溴钾酚紫以及0.1％的防腐剂。
在本发明实施例中，所述浓缩洗涤液的溶剂为水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度为116g/L的Na2HPO4·12H2O、11.84g/L NaH2PO4·2H2O、180g/L NaCl、5mL/L吐温20以及1mL/L防腐剂。
在本发明实施例中，所述发光液A的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液A中的浓度为3mg/mL的鲁米诺、0.25mg/mL的对碘苯酚以及0.5mg/mL的四苯硼钠；
在本发明实施例中，所述发光液B的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液B中的浓度为0.5mg/mL的过氧化脲。
在本发明实施例中，所述标准品稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度为质量百分含量1％的酪蛋白、质量百分含量8％的海藻糖、质量百分含量3％的甘露醇、1mmol/L的EDTA，质量百分含量0.5％的甘氨酸、150mmol/L的NaCl以及质量百分含量0.1％的防腐剂。
在本发明实施例中，所述检测抗体稀释液的溶剂是20mmol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度为质量百分含量2％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.1％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、质量百分含量0.01％的吐温20、质量百分含量5/1万的氨基比啉、质量百分含量1/20万的染料以及质量百分含量0.1％的防腐剂。
如下，本发明实施例提供一种标准曲线的绘制方法，将待测样本溶液的光密度(OD，optical density)值代入标准曲线，即可得到待测样本溶液中S100B的含量。
(1)配制如下溶液：
用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液与检测抗体稀释液的比例为1:10000；
用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体与检测抗体稀释液的体积比为1:5000，得到酶结合物；
用标准品稀释液溶解标准品，得到浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL的标准品溶液；
将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照1:20的体积比稀释得到洗涤液。
(2)绘制标准曲线：
在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入校准品溶液50μL，然后每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；
用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
每孔加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；
用空白孔调零点后，使用发光仪测定各孔光密度值；
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理，以各校准品的光密度值的对数为纵坐标，各校准品的浓度的对数为横坐标作图，得到标准曲线；如图1所示，标准曲线的方程式为y＝0.8818x+3.6761，相关系数为0.9995。
如下，本发明实施例还提供一种待测样本溶液中S100B的含量检测方法。
在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入待测样品50μL，然后加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；
用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；
用空白孔调零点后，使用发光仪测定光密度值；
将待测样本溶液的光密度值代入标准曲线，得到待测样本溶液中S100B的含量。
通过如下方法，对本发明实施例提供的试剂盒进行性能测试。分别选取三个批次的试剂盒，批次一、批次二和批次三，进行性能测试。
一：最低检测限
取包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板，每孔加入50μL标准品，然后每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL；置37℃温育2小时，用洗涤液充分洗涤5次扣干；每孔加入25μL发光液A和25μL发光液B，使用发光仪进行测定各孔发光值。
其中，每个待测试剂盒，空白标准品溶液设置20个复孔，其它标准品设置为双孔，各孔的吸光值见表1，各孔的发光值见表1。
根据各校准点OD值及相应浓度使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理。计算20孔50μL S0溶液相应的发光值的平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程计算出发光值为Mean+2×SD时的浓度值为最低检测限。
三个批次的试剂盒的最低检测限均在1pg/mL以下。
表1：
Figure BDA0001960076990000071
Figure BDA0001960076990000081
二：重复性和批间差
重复性是用同一批试剂盒测定一份样本得到的变异系数(CV)，每个标准品需在一块板内随机做10孔精密性测定，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批内变异系数(CV)＝SD/Mean×100％
批间差是不同批次试剂盒间的重复性，随机抽取三批试剂盒，用这些试剂盒测定标准品3次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批间变异系数(CV)＝SD/Mean×100％。标准品为S100B。
具体检测过程如下：
取包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板，每孔加入50μL特定溶液；然后每孔加入酶结合物100μL，置37℃温育2小时，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；每孔加入25μL发光液A和25μL发光液B，使用发光仪进行测定各孔发光值。
特定溶液为特定溶液甲或特定溶液乙。
特定溶液甲为S0溶液(标准品的浓度为0pg/mL)、S1溶液(标准品的浓度为10pg/mL)、S2溶液(标准品的浓度为100pg/mL)、S3溶液(标准品的浓度为200pg/mL)、S4溶液(标准品的浓度为500pg/mL)、S5溶液(标准品的浓度为1000pg/mL)。每个待测试剂盒，每种特定溶液甲设置两个复孔。
特定溶液乙为与特定溶液甲不同浓度的标准品溶液。
标准品溶液的制备方法：将标准品溶于20mM、pH7.4的PBS缓冲液，得到100pg/L的低浓度标准品溶液(QC1)和600pg/L的高浓度标准品溶液(QC2)。每个待测试剂盒，每种特定溶液乙设置10个复孔。
采用特定溶液甲时，各孔的发光值见表2。
表2：
Figure BDA0001960076990000091
采用特定溶液乙时，各孔的发光值见表3。
表3：
QC1 QC2 QC1 QC2 QC1 QC2
复孔1 375825 1375935 374710 1371970 375340 1378860
复孔2 375620 1373630 372290 1375895 374375 1373295
复孔3 374730 1378095 374905 1372460 375390 1370585
复孔4 367990 1377205 373930 1373390 375345 1372340
复孔5 368125 1377525 373540 1376960 371805 1378965
复孔6 369625 1375510 371110 1372490 375940 1374120
复孔7 376525 1372685 372700 1376720 373930 1378440
复孔8 369915 1378400 375335 1370655 376070 1376705
复孔9 374190 1372405 373235 1373610 372190 1373470
复孔10 370595 1374980 375795 1372515 375755 1370730
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理，根据标准曲线计算特定溶液乙中的S100B浓度，结果见表4和表5。三个批次的试剂盒测定高浓度和低浓度两个质控，批内变异系数都小于5％，表明试剂盒的均一性良好，结果具有重复性。
表4：
Figure BDA0001960076990000101
Figure BDA0001960076990000111
表5：
QC1 QC2
第一批 135.42 618.40
第二批 138.81 617.96
第三批 140.30 617.99
平均值 138.18 618.12
SD 2.501 0.246
CV 1.81％ 0.04％
用三批试剂盒测定高浓度和低浓度两个标准品，批间变异系数都小于5％，表明不同批次的试剂盒之间变异很小，测量结果具有重复性。
综上所述，本发明提供的试剂盒的主要性能指标的标准如下：
最低检测限：不高于1pg/mL；
重复性：批内变异系数不高于5％；
批间差：批间变异系数不高于5％。
三、特异性
取包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板，每孔加入50μL特定溶液，然后每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL；置37℃温育30分钟，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；每孔加入25μL发光液A和25μL发光液B，使用发光仪进行测定各孔发光值。
特定溶液为S0溶液(标准品的浓度为0pg/mL)、S1溶液(标准品的浓度为10pg/mL)、S2溶液(标准品的浓度为100pg/mL)、S3溶液(标准品的浓度为200pg/mL)、S4溶液(标准品的浓度为500pg/mL)、S5溶液(标准品的浓度为1000pg/mL)、血清总胆红素TBIL为40μmol/L的标本溶液和甘油三酯TG为4mmol/L、总胆固醇TC为9mmol/L的标本溶液。每个待测试剂盒，每种特定溶液设置两个复孔。
根据各校准点发光值及相应浓度作Log-Log拟合，根据标准曲线计算各交叉反应物质的S100B测值，此浓度为本试剂与TBIL的交叉值，以及本试剂与TG和TC的交叉值。
各孔的发光值和反推浓度见表6。
表6：
Figure BDA0001960076990000121
特异性是为了检测血液中其它物质对试剂盒测量的干扰，在人血液中容易对S100B的测量造成干扰的物质有血清总胆红素TBIL和甘油三酯TG和总胆固醇TC。用高浓度的这些物质进行实验，参考表6和表7，试剂盒与这些物质的交叉反应很低，不会对S100B的测量造成干扰。
表7：
Figure BDA0001960076990000131
四：用于颅脑损伤诊断
从医院收集临床样本，共收集到健康人血清100份，伤后12小时的颅脑损伤患者血清48份，用S100B定量测定试剂盒(酶联免疫法)检测各血清样本S100B的含量，如表8所示。
表8：
Figure BDA0001960076990000132
均值加2个标准差Mean±2SD的参考值范围140～380pg/mL。
综上所述，本发明实施例提供的试剂盒，待测品(标准品或血清样本)与辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液的反应时间为2小时；临床常见的病理性黄疸和脂血症标本对血清S100B蛋白测定未见明显干扰；批内及批间平均变异均小于5.0％，具有简便、快速、特异、敏感，适于临床常规应用的技术效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。
2.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液通过如下方法制得：
抗体纯化、定量后，在0.01mol/L、pH＝9.0～9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，至浓度为5mg/mL；
配置5mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；
向所述辣根过氧化物酶水溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4，室温避光搅拌20min，得到氧化后的酶液；
将所述氧化后的酶液在1mmol/L、pH＝4.4、4℃的醋酸盐缓冲液透析过夜，换液3次；
取出透析袋中的溶液，加入0.2mol/LNa2CO3缓冲溶液，调至pH＝9.0-9.5，并迅速与纯化、定量后的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；
加入6mg/mL NaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应2h；
还原后的反应体系，于0.15mol/L、pH＝7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
加入BSA使终浓度为2～3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存。
3.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为S100B抗原。
4.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝6.0的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％的明胶、0.2％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、0.01％的吐温-20、5％的蔗糖、0.5/万的溴钾酚紫以及0.1％的防腐剂。
5.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的溶剂为水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度为116g/L的Na2HPO4·12H2O、11.84g/LNaH2PO4·2H2O、180g/L NaCl、5mL/L吐温20以及1mL/L防腐剂。
6.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述发光液A的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液A中的浓度为3mg/mL的鲁米诺、0.25mg/mL的对碘苯酚以及0.5mg/mL的四苯硼钠。
7.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述发光液B的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液B中的浓度为0.5mg/mL的过氧化脲。
8.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度为质量百分含量1％的酪蛋白、质量百分含量8％的海藻糖、质量百分含量3％的甘露醇、1mmol/L的EDTA，质量百分含量0.5％的甘氨酸、150mmol/L的NaCl以及质量百分含量0.1％的防腐剂。
9.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体稀释液的溶剂是20mmol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度为质量百分含量2％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.1％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、质量百分含量0.01％的吐温20、质量百分含量5/1万的氨基比啉、质量百分含量1/20万的染料以及质量百分含量0.1％的防腐剂。
10.一种如权利要求1-9任一权利要求所述的S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制如下溶液：
用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液与检测抗体稀释液的比例为1:10000；
用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体与检测抗体稀释液的体积比为1:5000，得到酶结合物；
用标准品稀释液溶解标准品，得到多个浓度梯度变化的标准品溶液；
将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照1:20的体积比稀释得到洗涤液。
(2)绘制标准曲线：
在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入校准品溶液50μL，然后每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；
用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
每孔加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；
用空白孔调零点后，使用发光仪测定各孔光密度值；
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理，以各校准品的光密度值的对数为纵坐标，各校准品的浓度的对数为横坐标作图，得到标准曲线；
(3)待测样品检测
在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入待测样品50μL，然后加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；
用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；
加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；
用空白孔调零点后，使用发光仪测定光密度值；
将待测样本溶液的光密度值代入标准曲线，得到待测样本溶液中S100B的含量。
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