JP6733079B2 - 試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、糖脂質分野、生化学分野、分析化学分野、臨床検査分野及び生命科学分野等において重要なものであるが、特に神経疾患等の診断において重要なものである。
これらの自己抗体は、先行感染した菌体に対するものとして体内に産生され、これが神経組織の糖脂質抗原と交差反応し、自己抗体として神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
急性軸策型ギラン・バレー症候群の場合、食中毒菌として知られる菌体Campylobacter jejuniが先行感染し、菌体のリポ多糖(LPS)上のGM1aと類似の糖鎖構造部分に対する抗体が体内に産生されることにより発病する(例えば、非特許文献1)。
そして、この抗体は血液中に見い出されることが判明している(例えば、非特許文献2及び非特許文献3)。
そして、この抗体も患者血清中に見い出されることが判明している(例えば、非特許文献4及び非特許文献5)。
その他、感覚失調型ポリニューロパシーで抗GD2抗体、抗GT1b抗体、抗GQ1b抗体が上昇するとの報告や感覚神経疾患で抗スルファチド抗体が高いとの報告がある。
また、糖脂質抗原と反応する抗体が癌患者由来試料より検出されるとの報告もある。
従って、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う場合、更なる測定感度の改善が望まれていた。
(1)試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が0.17mol/L以下であることを特徴とする測定試薬。
(2)糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、前記(1)記載の測定試薬。
(3)糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、前記(1)又は(2)に記載の測定試薬。
(4)試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が0.17mol/L以下であることを特徴とする測定方法。
(5)糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、前記(4)記載の測定方法。
(6)糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、前記(4)又は(5)に記載の測定方法。
本発明の測定試薬及び測定方法では、試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度を0.17mol/L以下にすることが必須である。
このことにより、試料中の抗糖脂質抗体の測定に当たり、測定感度を上昇させることができる。
本発明において、糖脂質抗原とは、その分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質(糖脂質)であり、測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することが可能な物質のことである。
このガングリオシドとしては、例えば、GM1、GM1b、GM1−Fuc、GM2、GM3、GM3(NeuGc)、GM4、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GD3(NeuAc/NeuGc)、GD3(NeuGc)2、GT1a、GT1b、GT1c、GQ1a、GQ1b、GQ1c、GP1a、GP1b、GP1c、又はLM1等を挙げることができる。
本発明において、抗糖脂質抗体は、前記した糖脂質抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。
本発明では、試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法において、イオン強度を0.17mol/L以下とすることにより、測定感度を上昇させることができる。
本発明において、イオン強度の調整のために試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法に含有又は存在させる陽イオン及び陰イオンについて、以下説明を行う。
本発明において、陽イオンは、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオン等を挙げることができる。
その他の金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
本発明において、陰イオンは、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
また、前記陽イオンと前記陰イオンの両方を含む化合物を添加することにより含有又は存在させて、測定試薬を調製してもよい。
そしてその結果として、前記陽イオン及び前記陰イオンを各々前記の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法にイオン強度が0.17mol/L以下となるように存在させられればよい。
本発明において、担体は、前記の糖脂質抗原を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
本発明において、試料とは、抗糖脂質抗体が存在する可能性があり、かつ抗糖脂質抗体の存在の有無、又は含有量(濃度)の測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織、若しくは筋肉などの抽出液、細胞若しくは菌体などの抽出液等、抗糖脂質抗体が含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
本発明の測定方法は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が0.17mol/L以下であることを特徴とするものである。
標識免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行う場合の一例を示す。
担体:測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる糖脂質抗原を固定化した担体(例えば、抗GM1抗体の測定においては、GM1をウェルに固定化したマイクロタイタープレート)
試料希釈液:イオン強度が0.17mol/L以下である溶液
これにより、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体」の結合を形成させる。(例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−GM1−抗GM1抗体」)
このクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgA抗体、抗ヒトIgM抗体、抗ヒトIgD抗体、又は抗ヒトIgE抗体等を挙げることができる。
このサブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトカッパー(κ)抗体、抗ヒトラムダ(λ)抗体、抗ヒトIgG1抗体、抗ヒトIgG2抗体、抗ヒトIgG3抗体、又は抗ヒトIgG4抗体等を挙げることができる。
本発明の測定試薬は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が0.17mol/L以下であることを特徴とするものである。
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の抗糖脂質抗体の測定に使用することもできる。
本発明における、試料中の抗糖脂質抗体の測定においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のpHについては、適宜適当なpHを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、pH3〜12の範囲内のpHを選択して用いることが一般的である。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001〜10%(W/V)が好ましく、特に0.01〜5%(W/V)が好ましい。
本発明における、試料中の抗糖脂質抗体測定の、測定感度を上昇させる方法は、試料中の抗糖脂質抗体測定において、イオン強度を0.17mol/L以下とすることによるものである。
この、試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度が0.17mol/L以下で測定を行うことにより、抗糖脂質抗体の測定感度を上昇させることができる。
また、本発明における測定感度を上昇させる方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗GM1抗体(抗糖脂質抗体)の測定を行った。
1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する10mMリン酸緩衝液〔pH7.5〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを50mM、100mM、150mM及び200mMの濃度となるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる4種類の試料希釈液の調製を行った。
ガングリオシドGM1(Carbosynth Limited社)を1ウェル当たり200ngずつポリスチレンプレート〔PolySorp〕(ヌンク社)のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドGM1を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
0.05%ツイーン20(Tween20)を含むリン酸緩衝生理食塩水(pH7.5)を調製し、洗浄液とした。
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体〔P0214〕(ダコ社)を、酵素標識抗体として用いた。
0.02%ペルオキシダーゼ基質液〔3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジン〕(同仁化学研究所)を含有する2.5mM過酸化水素を発色液として用いた。
抗GM1抗体陽性血清:
抗GM1抗体を含むことが確認されている11種類の血清を、抗GM1抗体陽性血清として用意した。
(1)試料である本実施例の2の11種類の抗GM1抗体陽性血清を本実施例の1の(1)の4種類の試料希釈液により、それぞれ100倍に希釈して混合液を調製した。
これにより、担体に固相化されているGM1抗原と試料に含まれていた抗GM1抗体を接触させ、反応させた。
そして、このウェルを、本実施例の1の(3)の洗浄液で洗浄した。
これにより、担体に固定化された標識酵素(ペルオキシダーゼ)と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
これらの測定結果(吸光度測定値)を表1及び図1に示した。なお、表1において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度(mol/L)を示す。
表1から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が200mM(すなわちイオン強度が0.226mol/L)の場合は、塩化ナトリウム濃度が150mM(すなわちイオン強度が0.176mol/L)の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値(吸光度)が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗GQ1b抗体(抗糖脂質抗体)の測定を行った。
前記実施例1の1の(1)で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
ガングリオシドGQ1b(Hytest社)を1ウェル当たり200ngずつポリスチレンプレート〔PolySorp〕(ヌンク社)のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドGQ1bを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
前記実施例1の1の(3)で調製した洗浄液をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(4)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(5)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
抗GQ1b抗体陽性血清:
抗GQ1b抗体を含むことが確認されている10種類の血清を、抗GQ1b抗体陽性血清として用意した。
(1)試料である本実施例の2の10種類の抗GQ1b抗体陽性血清を本実施例の1の(1)の4種類の試料希釈液により、それぞれ100倍に希釈して混合液を調製した。
これにより、担体に固相化されているGQ1b抗原と試料に含まれていた抗GQ1b抗体を接触させ、反応させた。
そして、このウェルを、本実施例の1の(3)の洗浄液で洗浄した。
これにより、担体に固定化された標識酵素(ペルオキシダーゼ)と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
これらの測定結果(吸光度測定値)を表2及び図2に示した。なお、表2において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度(mol/L)を示す。
表2から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が200mMの場合(すなわちイオン強度が0.226mol/L)は、塩化ナトリウム濃度が150mMの場合(すなわちイオン強度が0.176mol/L)に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値(吸光度)が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
試料希釈液中の緩衝液の濃度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗GM1抗体(抗糖脂質抗体)の測定を行った。
(1)試料希釈液の調製
5mM、10mM、50mM及び100mMのリン酸緩衝液〔pH7.5〕に、ウシ血清アルブミン(BSA)を1%(w/v)、塩化ナトリウムを100mMとなるように添加し、緩衝液濃度の異なる4種類の試料希釈液の調製を行った。
前記実施例1の1の(2)で調製したGM1抗原固相化担体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(3)で調製した洗浄液をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(4)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(5)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
(1)抗GM1抗体陽性血清
抗GM1抗体を含むことが確認されている6種類の血清を、抗GM1抗体陽性血清として用意した。
(1)試料である本実施例の2の6種類の抗GM1抗体陽性血清を本実施例の1の(1)の4種類の試料希釈液により、それぞれ100倍に希釈して混合液を調製した。
これにより、担体に固相化されているGM1抗原と試料に含まれていた抗GM1抗体を接触させ、反応させた。
そして、このウェルを、本実施例の1の(3)の洗浄液で洗浄した。
これにより、担体に固定化された標識酵素(ペルオキシダーゼ)と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
これらの測定結果(吸光度測定値)を表3及び図3に示した。なお、表3において、かっこ内の数値は、各濃度の緩衝液を含有する試薬のイオン強度(mol/L)を示す。
表3から明らかなように、緩衝液濃度が100mM(すなわちイオン強度が0.356mol/L)の場合は、緩衝液濃度が50mM(すなわちイオン強度が0.228mol/L)の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値(吸光度)が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
緩衝液の濃度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗GM1抗体(抗糖脂質抗体)の測定を行った。
5mM、10mM、50mM及び100mMのトリス緩衝液〔pH7.5〕に、ウシ血清アルブミン(BSA)を1%(w/v)、塩化ナトリウムを100mMとなるように添加し、緩衝液濃度の異なる4種類の試料希釈液の調製を行った。
前記実施例1の1の(2)で調製したGM1抗原固相化担体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(3)で調製した洗浄液をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(4)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(5)の発色液をそのまま使用した。
(1)抗GM1抗体陽性血清
前記実施例3の2の試料をそのまま使用した。
(1)試料である本実施例の2の6種類の抗GM1抗体陽性血清を本実施例の1の(1)の4種類の試料希釈液により、それぞれ100倍に希釈して混合液を調製した。
これらの測定結果(吸光度測定値)を表4及び図4に示した。なお、表4において、かっこ内の数値は、各濃度の緩衝液を含有する試薬のイオン強度(mol/L)を示す。
表4から明らかなように、緩衝液濃度が100mM(すなわちイオン強度が0.180mol/L)の場合は、緩衝液濃度が50mM(すなわちイオン強度が0.140mol/L)の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値(吸光度)が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗GD1a抗体(抗糖脂質抗体)の測定を行った。
前記実施例1の1の(1)で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
ガングリオシドGD1a(シグマ社)を1ウェル当たり200ngずつポリスチレンプレート〔PolySorp〕(ヌンク社)のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドGD1aを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
前記実施例1の1の(3)で調製した洗浄液をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(4)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(5)の発色液をそのまま使用した。
抗GD1a抗体陽性血清:
抗GD1a抗体を含むことが確認されている3種類の血清を、抗GD1a抗体陽性血清として用意した。
(1)試料である本実施例の2の3種類の抗GD1a抗体陽性血清を本実施例の1の(1)の4種類の試料希釈液により、それぞれ100倍に希釈して混合液を調製した。
これにより、担体に固相化されているGD1a抗原と試料に含まれていた抗GD1a抗体を接触させ、反応させた。
そして、このウェルを、本実施例の1の(3)の洗浄液で洗浄した。
これにより、担体に固定化された標識酵素(ペルオキシダーゼ)と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
これらの測定結果(吸光度測定値)を表5及び図5に示した。なお、表5において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度(mol/L)を示す。
表5から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が200mM(すなわちイオン強度が0.226mol/L)の場合は、塩化ナトリウム濃度が150mM(すなわちイオン強度が0.176mol/L)の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値(吸光度)が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗GD1b抗体(抗糖脂質抗体)の測定を行った。
前記実施例1の1の(1)で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
ガングリオシドGD1b(シグマ社)を1ウェル当たり200ngずつポリスチレンプレート〔PolySorp〕(ヌンク社)のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドGD1bを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
前記実施例1の1の(3)で調製した洗浄液をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(4)の酵素標識抗体をそのまま使用した。
前記実施例1の1の(5)の発色液をそのまま使用した。
抗GD1b抗体陽性血清:
抗GD1b抗体を含むことが確認されている2種類の血清を、抗GD1b抗体陽性血清として用意した。
(1)試料である本実施例の2の2種類の抗GD1b抗体陽性血清を本実施例の1の(1)の4種類の試料希釈液により、それぞれ100倍に希釈して混合液を調製した。
これにより、担体に固相化されているGD1b抗原と試料に含まれていた抗GD1b抗体を接触させ、反応させた。
そして、このウェルを、本実施例の1の(3)の洗浄液で洗浄した。
これにより、担体に固定化された標識酵素(ペルオキシダーゼ)と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
これらの測定結果(吸光度測定値)を表6及び図6に示した。なお、表6において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度(mol/L)を示す。
表6から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が200mM(すなわちイオン強度が0.226mol/L)の場合は、塩化ナトリウム濃度が150mM(すなわちイオン強度が0.176mol/L)の場合に比較して、いずれの試料も、測定により得られる測定値(吸光度)が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
Claims (6)
- 試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が0.10mol/L以下であることを特徴とする測定試薬。
- 糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、請求項1記載の測定試薬。
- 糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、請求項1又は2記載の測定試薬。
- 試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が0.10mol/L以下であることを特徴とする測定方法。
- 糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、請求項4記載の測定方法。
- 糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、請求項4又は5記載の測定方法。
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