JP2020010698A - Hla遺伝子のdnaタイピング方法及びキット - Google Patents
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Abstract
【課題】フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のDNAタイピング方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ;(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び(4)任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、HLAのDNAタイピング方法を提供する。【選択図】図6
Description
本発明は、大量並列シークエンサーを用いたHLA遺伝子のDNAタイピングのための方法及びキットに関する。
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex;MHC)であるヒト白血球抗原(Human Leukocyte Antigen;HLA)は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをT細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして6種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスI分子(HLA−A、HLA−B、HLA−C)と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスII分子(HLA−DR、HLA−DQ、HLA−DP)である。
HLAクラスI抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ2−ミクログロブリンからなり、HLAクラスII抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスI分子のα鎖はHLA−A、HLA−B、HLA−Cの各遺伝子にコードされ、クラスII抗原のβ鎖はHLA−DRB1、HLA−DQB1、HLA−DPB1、α鎖はHLA−DRA1、HLA−DQA1、HLA−DPA1遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、HLAクラスI抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン2とエクソン3が高度な多型性を示し、HLAクラスII抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン2が高度な多型性を示す。
HLAをコードしている遺伝子領域はヒト第6染色体短腕部6p21.3に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスI領域(HLA−A、HLA−C、HLA−B等)、クラスIII領域、クラスII領域(HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DQA1、HLA−DQB1、HLA−DPA1、HLA−DPB1等)の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスIII領域にはHLA遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis Factor;TNF)等の遺伝子が存在している。
HLA−DR抗原のβ鎖をコードするHLA−DRB遺伝子領域には5種類の構造多型が確認されている。DR1型やDR10型では、同一染色体上にHLA−DRB1の他にHLA−DRB6やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。DR2型では、同一染色体上にHLA−DRB1の他にHLA−DRB5(DR51)遺伝子やHLA−DRB6やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。DR3、DR5およびDR6型では、HLA−DRB1の他に同一染色体上にHLA−DRB3(DR52)遺伝子やHLA-DRB2やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。DR4、DR7およびDR9型では、HLA−DRB1の他に同一染色体上にHLA−DRB4(DR53)遺伝子やHLA-DRB7、HLA-DRB8やHLA−DRB9などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、DR8型では、同一染色体上にHLA−DRB1以外のHLA−DRB遺伝子は位置しない。
各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列(アミノ酸配列)が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各HLAアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。HLAクラスI抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン2あるいはエクソン3が、複数のアリルに共通であることもある。
HLAには高度な多型が存在するため対立遺伝子(アリル)の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的HLA型を判別する第1区域(2桁レベル)、同一の血清学的HLA型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第2区域(4桁レベル)、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第3区域(6桁レベル)、及びHLA分子をコードする遺伝子領域外(イントロン)での塩基置換を伴うアリルを判別する第4区域(8桁レベル)である。
骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのHLAタイプが4桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のGVHD頻度が低下すると言われている。逆に、HLA型が4桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、HLAタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
HLA遺伝子におけるDNAタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;PCR)に基づくSBT(Sequence Based Typing)法やSSO(Sequence Specific Oligonucleotide)−Luminex法が主流となっている。
これら従来のDNAタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスI遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ(phase ambiguity)が生じ、高精度なHLAタイピングが難しい場合があった。
また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするPCRを用いたDNAタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現HLA遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル(null)アリルの検出を見逃す可能性があった。
これら従来のDNAタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスI遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ(phase ambiguity)が生じ、高精度なHLAタイピングが難しい場合があった。
また、従来の方法は、各遺伝子のエクソン領域を中心とするPCRを用いたDNAタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現HLA遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル(null)アリルの検出を見逃す可能性があった。
Lind C.等、Human Immunology、第71巻、1033−1042頁(2010年)
本発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のDNAタイピング方法及びキットを提供することを課題とする。
本発明者らは、クラスIのHLA分子であるHLA−A、HLA−B及びHLA−CならびにクラスIIのHLA分子であるHLA−DRB1、HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1について、それらのHLA遺伝子を特異的に増幅しうるPCRプライマーを新たに設計し、好適なPCR条件を設定して、大量並列シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、以下のステップを含むHLAのDNAタイピング方法を提供する。
(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(4)データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(4)データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
本発明の方法は1分子からのHLA遺伝子のDNAタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のDNAタイピング法である。これにより、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なHLAの一致が実現される。
HLA遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているnullアリルや新規アリルの検出が可能となる。
HLA遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、全く発現していない、あるいは発現が抑制されているnullアリルや新規アリルの検出が可能となる。
以下、本発明のDNAタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
(1)プライマーセット準備ステップ
本発明のDNAタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備する。
HLA遺伝子が存在する領域を含むヒト第6染色体(6p21.3)のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物(HLA分子)の構造との関連も知られている(図1と図2参照)。
(1)プライマーセット準備ステップ
本発明のDNAタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備する。
HLA遺伝子が存在する領域を含むヒト第6染色体(6p21.3)のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物(HLA分子)の構造との関連も知られている(図1と図2参照)。
即ち、古典的HLAクラスI分子と言われるHLA−A、HLA−B及びHLA−Cの遺伝子は7個又は8個のエクソンを含んでおり(図1(a))、エクソン1の外側には2種類のエンハンサーやプロモーター領域があって発現が調節されている(図1(b))。
さらに、エクソン2、3及び4において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のDNAタイピング方法では、特にエクソン2及び3に基づいて作成されたプライマーを用いたPCRが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
また、古典的HLAクラスII分子と言われるHLA−DR、HLA−DQ及びHLA−DPはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は5個又は6個のエクソンを含んでおり(図2(a))、エクソン1の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている(図2(b))。
さらに、エクソン2及び3において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のDNAタイピング方法では、特にエクソン2に基づいて作成されたプライマーを用いたPCRが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
さらに、エクソン2、3及び4において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のDNAタイピング方法では、特にエクソン2及び3に基づいて作成されたプライマーを用いたPCRが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
また、古典的HLAクラスII分子と言われるHLA−DR、HLA−DQ及びHLA−DPはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は5個又は6個のエクソンを含んでおり(図2(a))、エクソン1の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている(図2(b))。
さらに、エクソン2及び3において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のDNAタイピング方法では、特にエクソン2に基づいて作成されたプライマーを用いたPCRが行なわれ、それに伴って前述したようにフェーズ・アンビギュイティの問題が生じていた。
本発明では、古典的クラスI分子(HLA−A,HLA−B,HLA−C)ならびに古典的クラスII分子のHLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の遺伝子領域の全て(エクソンのみならず、イントロン、5’側と3’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む)、HLA−DRB1のエクソン2から3’側の非翻訳領域を含む遺伝子領域をPCR増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてPCR増幅したPCR産物を後述する次世代シークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、nullアリルの有無も正確に検知することができる。
具体的には、下記表1〜表4に掲げるPCRプライマーセットを調製する。
表1における配列番号1〜3は、MHCクラスIα鎖であるHLA−A遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−A遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
表1における配列番号1〜3は、MHCクラスIα鎖であるHLA−A遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−A遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号1は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第29,909,487番目から第29,909,514番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号2は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第29,909,487番目から第29,909,514番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号3は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第29,914,925番目から第29,914,952番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,500塩基(bp)である。
配列番号2は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第29,909,487番目から第29,909,514番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号3は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第29,914,925番目から第29,914,952番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,500塩基(bp)である。
表1における配列番号4〜5は、MHCクラスIα鎖であるHLA−B遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−B遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号4は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,325,796番目から第31,325,820番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号5は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,321,212番目から第31,321,235番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約4,600塩基(bp)である。
配列番号5は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,321,212番目から第31,321,235番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約4,600塩基(bp)である。
表1における配列番号6〜8は、MHCクラスIα鎖であるHLA−C遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−C遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号6は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,240,868番目から第31,240,892番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号7は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,240,868番目から第31,240,892番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号8は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,236,991番目から第31,236,114番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約4,800塩基(bp)である。
配列番号7は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,240,868番目から第31,240,892番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号8は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31,236,991番目から第31,236,114番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約4,800塩基(bp)である。
表2における配列番号9〜11は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR1サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号9は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,131番目から第32,552,156番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号10は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,131番目から第32,552,156番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号11は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,200塩基(bp)である。
配列番号10は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,131番目から第32,552,156番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号11は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,200塩基(bp)である。
表2における配列番号31、32は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR1、HLA−DR4、HLA−DR6(DR13)、HLA−DR10サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号31は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,558,110番目から第32,558,133番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号32は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さはHLA−DR1サブタイプで約6,100塩基(bp)、HLA−DR4サブタイプで約9,100塩基(bp)、HLA−DR6(DR13)サブタイプで約8,900塩基(bp)、HLA−DR10サブタイプで約8,900塩基(bp)である。
配列番号32は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さはHLA−DR1サブタイプで約6,100塩基(bp)、HLA−DR4サブタイプで約9,100塩基(bp)、HLA−DR6(DR13)サブタイプで約8,900塩基(bp)、HLA−DR10サブタイプで約8,900塩基(bp)である。
表2における配列番号11と12は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR2サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号11は上記の通りである。
配列番号12は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,130番目から第32,552,151番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,500塩基(bp)である。
配列番号12は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,130番目から第32,552,151番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,500塩基(bp)である。
表3における配列番号31と33は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR2(DR15)サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号31は上記の通りである。
配列番号33は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約6,100塩基(bp)である。
配列番号33は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約6,100塩基(bp)である。
表2における配列番号13と14は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR3、HLA−DR5、HLA−DR6、HLA−DR8サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号13は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,137番目から第32,552,160番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号14は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,100塩基(bp)である。
配列番号14は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,100塩基(bp)である。
表2における配列番号34と32は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR3サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号34は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,558,110番目から第32,558,133番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号32は上記の通りである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
配列番号32は上記の通りである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
表2における配列番号15と16は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR4サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号15は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,131番目から第32,552,157番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号16は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約6,200塩基(bp)である。
配列番号16は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約6,200塩基(bp)である。
表2における配列番号31と35は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR5(DR11)サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号31は上記の通りである。
配列番号35は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
配列番号35は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
表2における配列番号31と36は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR5(DR12)サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号31は上記の通りである。
配列番号36は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
配列番号36は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
表3における配列番号31と37は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR6(DR14)サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号31は上記の通りである。
配列番号37は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
配列番号37は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
表3における配列番号17と18は、はMHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR7サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号17は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,137番目から第32,552,160番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号18は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,606番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,100塩基(bp)である。
配列番号18は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,606番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,100塩基(bp)である。
表3における配列番号38と36は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR7、HLA−DR9サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号38は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,558,110番目から第32,558,133番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
配列番号36は上記の通りである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約11,400塩基(bp)である。
配列番号36は上記の通りである。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約11,400塩基(bp)である。
表3における配列番号31と39は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR8サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号31は上記の通りである。
配列番号39は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
配列番号39は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,551,974番目から第32,551,999番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約8,900塩基(bp)である。
表3における配列番号19と20は、はMHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR9サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号19は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,137番目から第32,552,160番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号20は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,100塩基(bp)である。
配列番号20は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,609番目から第32,546,629番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,100塩基(bp)である。
表3における配列番号21と22は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DRB1遺伝子のHLA−DR10サブタイプ遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号21は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,552,137番目から第32,552,159番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号22は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,403番目から第32,546,435番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,400塩基(bp)である。
配列番号22は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,546,403番目から第32,546,435番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,400塩基(bp)である。
表4における配列番号23と24は、はMHCクラスIIα鎖であるHLA−DPA1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPA1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号23は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,041,478番目から第33,041,502番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号24は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,031,888番目から第33,031,911番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,600塩基(bp)である。
配列番号24は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,031,888番目から第33,031,911番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,600塩基(bp)である。
表4における配列番号40と41は、MHCクラスIIα鎖であるHLA−DPA1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPA1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号40は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,041,573番目から第33,041,596番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号41は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,031,888番目から第33,031,912番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,600塩基(bp)である。
配列番号41は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,031,888番目から第33,031,912番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,600塩基(bp)である。
表4における配列番号25と26は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DPB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPB1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号25は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,043,056番目から第33,043,079番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号26は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,055,476番目から第33,055,499番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約12,400塩基(bp)である。
配列番号26は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,055,476番目から第33,055,499番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約12,400塩基(bp)である。
表4における配列番号42と43は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DPB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPB1遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン2を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号42は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,043,168番目から第33,043,191番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号43は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,049,084番目から第33,049,107番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,900塩基(bp)である。
配列番号43は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,049,084番目から第33,049,107番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約5,900塩基(bp)である。
表4における配列番号44と45は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DPB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号44は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,048,182番目から第33,048,207番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号45は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,055,428番目から第33,055,453番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,200塩基(bp)である。
配列番号45は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33,055,428番目から第33,055,453番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,200塩基(bp)である。
表4における配列番号27と28は、MHCクラスIIα鎖であるHLA−DQA1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DQA1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号27は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,604,318番目から第32,604,338番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号28は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,611,681番目から第32,611,701番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,400塩基(bp)である。
配列番号28は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,611,681番目から第32,611,701番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,400塩基(bp)である。
表4における配列番号46と47は、MHCクラスIIα鎖であるHLA−DQA1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DQA1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号46は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,604,469番目から第32,604,488番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号47は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,611,936番目から第32,611,956番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,400塩基(bp)である。
配列番号47は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,611,936番目から第32,611,956番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約7,400塩基(bp)である。
表4における配列番号29と30は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DQB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DQB1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号29は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,626,545番目から第32,626,568番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号30は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,635,612番目から第32,635,637番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,100塩基(bp)である。
配列番号30は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,635,612番目から第32,635,637番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,100塩基(bp)である。
表4における配列番号29、30、48〜50は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DQB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DQB1遺伝子の全領域(プロモーター、エクソン及びイントロンを含む)を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
配列番号29と48は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,626,545番目から第32,626,568番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号30、49、50は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,635,612番目から第32,635,637番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,100塩基(bp)である。
配列番号30、49、50は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32,635,612番目から第32,635,637番目に相当する相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるPCR産物の予測される長さは約9,100塩基(bp)である。
これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表1及び表2に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、HLAの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニール可能なフォワード(Forward)プライマーとリバース(Reverse)プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。
(2)PCR増幅ステップ
本発明の方法では、前記ステップ(1)で準備したプライマーセットを用い、被検試料(DNA)をPCR増幅する。
PCR増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
1.被検試料の形態に応じて、当該試料からDNAを抽出する。
2.抽出したDNAを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
3.反応条件を設定してPCR反応を実施する。
例:熱変性ステップ(通常は92〜97℃)
アニーリングステップ(通常は55〜72℃)
伸長ステップ(通常は65〜80℃)
本発明の方法では、HLA−DRB1を除くHLA遺伝子の場合、前記アニーリングステップの温度を約60℃とするのが好ましい。約60℃でアニーリングさせることにより、対立遺伝子を等比率で(均一に)生成させることができる。また、HLA−DRB1では前記アニーリングステップの温度を約70℃とするのが好ましい。約70℃でアニーリングさせることにより、目的のDRサブタイプのみを特異的に生成させることができる。
4.得られたPCR産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
本発明の方法では、前記ステップ(1)で準備したプライマーセットを用い、被検試料(DNA)をPCR増幅する。
PCR増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
1.被検試料の形態に応じて、当該試料からDNAを抽出する。
2.抽出したDNAを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
3.反応条件を設定してPCR反応を実施する。
例:熱変性ステップ(通常は92〜97℃)
アニーリングステップ(通常は55〜72℃)
伸長ステップ(通常は65〜80℃)
本発明の方法では、HLA−DRB1を除くHLA遺伝子の場合、前記アニーリングステップの温度を約60℃とするのが好ましい。約60℃でアニーリングさせることにより、対立遺伝子を等比率で(均一に)生成させることができる。また、HLA−DRB1では前記アニーリングステップの温度を約70℃とするのが好ましい。約70℃でアニーリングさせることにより、目的のDRサブタイプのみを特異的に生成させることができる。
4.得られたPCR産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
(3)塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ(2)で生成されたPCR産物(増幅DNA)の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス(あるいは超高速シークエンス)と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第27巻、第1号、2009年(羊土社)等を参照されたい。
次に、前記ステップ(2)で生成されたPCR産物(増幅DNA)の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆる次世代シークエンス(あるいは超高速シークエンス)と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第27巻、第1号、2009年(羊土社)等を参照されたい。
本明細書では、ロシュ(Roche)のゲノムシークエンサーFLXシステムで採用されているパイロシークエンスに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。
1.前記ステップ(2)で得られたPCR産物をネブライザーにより約500塩基ほどに断片化する。
2.その断片化されたDNA断片の末端にDNAアダプターを付加する。
3.DNAアダプターを付加したDNA断片を一本鎖DNA断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む(1ビーズに1つのDNA断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される)。
1.前記ステップ(2)で得られたPCR産物をネブライザーにより約500塩基ほどに断片化する。
2.その断片化されたDNA断片の末端にDNAアダプターを付加する。
3.DNAアダプターを付加したDNA断片を一本鎖DNA断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む(1ビーズに1つのDNA断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される)。
4.エマルジョンPCR反応を実施し、各ビーズ上に各DNA断片のコピーを形成させる(各DNA断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる)。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたDNA断片を有するビーズを回収する。
5.ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする(1ウェルに1個のビーズが入るサイズである)。
6.各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからDNAの塩基配列を決定する。4種類の核酸(A、C、G、T)を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
5.ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする(1ウェルに1個のビーズが入るサイズである)。
6.各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからDNAの塩基配列を決定する。4種類の核酸(A、C、G、T)を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
(4)DNAタイピングステップ
次いで、前記ステップ(3)で得られた塩基配列を、既知のHLA対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたDNAのアリル型(8桁まで)が決定される。
次いで、前記ステップ(3)で得られた塩基配列を、既知のHLA対立遺伝子の塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたDNAのアリル型(8桁まで)が決定される。
本発明の方法は、前記表1に記載したプライマーセットを代表例とする。HLAクラスIやHLA−DRB1を除くHLAクラスIIの各遺伝子全領域、ならびにHLA−DRB1のエクソン2から3’非翻訳領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したDNAの配列決定をすることに特徴を有し、それによってフェーズ・アンビギュイティ(不確実さ)を排除し、nullアリルに関する情報を得ることもできる。
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
されるものではない。
(実施例1)
[実験方法]
1.既に抽出されているゲノムDNAを鋳型として、各HLAクラスI遺伝子特異的プライマーセット(表1参照:配列番号1〜8)を用いてPCR反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)PCR増幅はPrime STAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。すなわち、50 ngのゲノムDNA溶液に、4 μLの5xPrimeSTAR GXL緩衝液、1.6 μLのdNTP溶液、4μL(1pmol/μL)ずつのPCRプライマー、0.8μLのPrime STAR GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20μLに調整した。
(2)これを94度で2分間の保温後、続いて98度で10秒間、60度で20秒間、68度で5分間の3ステップを1工程として、これを30回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図4に示した。
[実験方法]
1.既に抽出されているゲノムDNAを鋳型として、各HLAクラスI遺伝子特異的プライマーセット(表1参照:配列番号1〜8)を用いてPCR反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)PCR増幅はPrime STAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。すなわち、50 ngのゲノムDNA溶液に、4 μLの5xPrimeSTAR GXL緩衝液、1.6 μLのdNTP溶液、4μL(1pmol/μL)ずつのPCRプライマー、0.8μLのPrime STAR GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20μLに調整した。
(2)これを94度で2分間の保温後、続いて98度で10秒間、60度で20秒間、68度で5分間の3ステップを1工程として、これを30回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図4に示した。
2.PCR産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
(1)PCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)の標準プロトコールにしたがって精製した。
(2)PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Invitrogen)の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
(3)精製したPCR産物を500ng/100μLの濃度に調整し、Genome Sequencer(GS)Junior(Roche)の標準プロトコールにしたがって、rapidライブラリーの作製、エマルジョンPCR、シークエンシングをおこない、1サンプルあたり1万リードの塩基配列を得た。
(4)それら配列をGS de novo Assembler(Roche)にて結合・編集させ、その後DNAデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、HLA遺伝子のアリルを同定した。
(1)PCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)の標準プロトコールにしたがって精製した。
(2)PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Invitrogen)の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
(3)精製したPCR産物を500ng/100μLの濃度に調整し、Genome Sequencer(GS)Junior(Roche)の標準プロトコールにしたがって、rapidライブラリーの作製、エマルジョンPCR、シークエンシングをおこない、1サンプルあたり1万リードの塩基配列を得た。
(4)それら配列をGS de novo Assembler(Roche)にて結合・編集させ、その後DNAデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、HLA遺伝子のアリルを同定した。
[考察]
HLA−A、HLA−BおよびHLA−Cにおいて、それぞれ5.5kb、4.6kbおよび4.8kbを特異的に増幅するPCRプライマーを設計した。PCR条件の検討ならびにそれらPCR産物のアガロースゲル電気泳動から、各HLAクラスI遺伝子におけるPCR産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた(図4)。またPCR産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないHLAアリルが得られたことから、本PCR系はHLAタイピングに使用しうることが確認された。
HLA−A、HLA−BおよびHLA−Cにおいて、それぞれ5.5kb、4.6kbおよび4.8kbを特異的に増幅するPCRプライマーを設計した。PCR条件の検討ならびにそれらPCR産物のアガロースゲル電気泳動から、各HLAクラスI遺伝子におけるPCR産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた(図4)。またPCR産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないHLAアリルが得られたことから、本PCR系はHLAタイピングに使用しうることが確認された。
HLA−B*40:02ホモ接合3検体ならびに従来のDNAタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせ(B*40とB*55)を含むHLA−B*40:02ヘテロ接合17検体を用いてHLA−B遺伝子由来のPCR産物をGS JuniorによりHLAタイピングをおこなった結果、全ての検体からHLA−B*40:02:01:01を検出し、ヘテロ接合17検体では15種類の既知アリルに加え、2種類の新規アリルを検出した。特に、フェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせ(B*40とB*55)の1検体については、HLA−B*40:02:01:01とHLA−B*55:02:01:01にタイピングすることができた。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない8桁レベルのHLAタイピングを可能とするとともに、nullアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールである。
(実施例2)
[実験方法]
1.既に抽出されているゲノムDNAを鋳型として、HLAクラスI及びHLAクラスIIの各遺伝子特異的プライマーセット(表1〜4参照:配列番号1〜8、9〜22、31〜50)を用いてPCR反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)PCR増幅はPrime STAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。すなわち、50 ngのゲノムDNA溶液に、4 μLの5xPrimeSTAR GXL緩衝液、1.6 μLのdNTP溶液、1から7 μL(4 pmol/μL)のPCRプライマー、0.8 μLのPrime STAR GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20 μLに調整した。
(2)これを94度で2分間の保温後、続いて98度で10秒間、70度で5分間の2ステップを1工程として、これを30回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図6に示した。
[実験方法]
1.既に抽出されているゲノムDNAを鋳型として、HLAクラスI及びHLAクラスIIの各遺伝子特異的プライマーセット(表1〜4参照:配列番号1〜8、9〜22、31〜50)を用いてPCR反応を行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)PCR増幅はPrime STAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa)を用いた。すなわち、50 ngのゲノムDNA溶液に、4 μLの5xPrimeSTAR GXL緩衝液、1.6 μLのdNTP溶液、1から7 μL(4 pmol/μL)のPCRプライマー、0.8 μLのPrime STAR GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20 μLに調整した。
(2)これを94度で2分間の保温後、続いて98度で10秒間、70度で5分間の2ステップを1工程として、これを30回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図6に示した。
2.PCR産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
(1)PCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)の標準プロトコールにしたがって精製した。
(2)PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Invitrogen)の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
(3)精製したPCR産物を100 ngの濃度に調整し、Ion Personal Genome Machine(Ion PGM)(LifeTechnologies)の標準プロトコールにしたがって、フラグメントライブラリーの作製、エマルジョンPCR、シークエンシングをおこない、1サンプルあたり30万リードの塩基配列を得た。
(4)それら配列をGS De Novo Assembler(Roche)にて結合・編集させ、その後DNAデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、HLA遺伝子のアリルを同定した。
(1)PCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)の標準プロトコールにしたがって精製した。
(2)PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Invitrogen)の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
(3)精製したPCR産物を100 ngの濃度に調整し、Ion Personal Genome Machine(Ion PGM)(LifeTechnologies)の標準プロトコールにしたがって、フラグメントライブラリーの作製、エマルジョンPCR、シークエンシングをおこない、1サンプルあたり30万リードの塩基配列を得た。
(4)それら配列をGS De Novo Assembler(Roche)にて結合・編集させ、その後DNAデータベース上の既知塩基配列とのホモロジー検索により、HLA遺伝子のアリルを同定した。
[結果及び考察]
1.HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1の5’非翻訳領域からエクソン2、HLA−DRB1のエクソン2から3’非翻訳領域、HLA−DQB1、HLA−DPB1の5’非翻訳領域からエクソン2及びHLA−DPB1のエクソン2から3’非翻訳領域において、それぞれ4kbから12kbを特異的に増幅するPCRプライマーを設計した。PCR条件の検討ならびにそれらPCR産物のアガロースゲル電気泳動から、HLAクラスI及びHLAクラスIIの各遺伝子におけるPCR産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた(図6)。またPCR産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないHLAアリルが得られたことから、本PCR系はHLAタイピングに使用しうることが改めて確認された。
1.HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1の5’非翻訳領域からエクソン2、HLA−DRB1のエクソン2から3’非翻訳領域、HLA−DQB1、HLA−DPB1の5’非翻訳領域からエクソン2及びHLA−DPB1のエクソン2から3’非翻訳領域において、それぞれ4kbから12kbを特異的に増幅するPCRプライマーを設計した。PCR条件の検討ならびにそれらPCR産物のアガロースゲル電気泳動から、HLAクラスI及びHLAクラスIIの各遺伝子におけるPCR産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた(図6)。またPCR産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないHLAアリルが得られたことから、本PCR系はHLAタイピングに使用しうることが改めて確認された。
2.従来のDNAタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む4検体を用いてHLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1の5’非翻訳領域からエクソン2、HLA−DRB1のエクソン2から3’非翻訳領域、HLA−DQB1、HLA−DPB1の5’非翻訳領域からエクソン2及びHLA−DPB1のエクソン2から3’非翻訳領域の各遺伝子由来のPCR産物をIon PGMによりHLAタイピングをおこなった。その結果、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DQB1については、遺伝子領域全体のタイピングが可能であった。HLA−DPB1については、エクソン部分のみのタイピングが可能であった。さらに、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DQB1の各遺伝子では、新規アリルを検出した。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない8桁レベルのHLAタイピングを可能とするとともに、nullアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールである。
(実施例3)
[実験方法]
1.Buccal Cell DNA Extraction Kit,BuccalQuick(TRIMGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した。
2.Buccal Cell DNA Extraction Kit,BuccalQuick(TRIMGEN)を用いて抽出したゲノムDNAをさらにイソプロパノールならびにエタノールにて精製した。
3.QIAamp DNA Blood Mini Kit(キアゲン)を用いてゲノムDNAを抽出した。
4.項目1〜3にて抽出したゲノムDNAそれぞれ3検体を用いて、実施例1及び実施例2と同様の実験方法によりHLA−A,HLA−B,HLA−C,HLA−DQB1特異的プライマーセット(表1及び表4参照:配列番号1〜8、29、30、48〜50)を用いてPCR反応を行った。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図7に示した。
[実験方法]
1.Buccal Cell DNA Extraction Kit,BuccalQuick(TRIMGEN)を用いてゲノムDNAを抽出した。
2.Buccal Cell DNA Extraction Kit,BuccalQuick(TRIMGEN)を用いて抽出したゲノムDNAをさらにイソプロパノールならびにエタノールにて精製した。
3.QIAamp DNA Blood Mini Kit(キアゲン)を用いてゲノムDNAを抽出した。
4.項目1〜3にて抽出したゲノムDNAそれぞれ3検体を用いて、実施例1及び実施例2と同様の実験方法によりHLA−A,HLA−B,HLA−C,HLA−DQB1特異的プライマーセット(表1及び表4参照:配列番号1〜8、29、30、48〜50)を用いてPCR反応を行った。PCR後に、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図7に示した。
[実験結果と考察]
図7のレーン1〜3は実験方法1にて抽出した場合、レーン4〜6は実験方法2にて抽出した場合、レーン7〜9は実験方法3にて抽出した場合のPCR産物の増幅状況を示す。実験方法1にて抽出したゲノムDNAを鋳型として用いたPCR増幅はいずれの遺伝子とも実験方法3にて抽出したものと遜色なく目的のPCR産物が得られた。実験方法3では採血を伴うが、実験方法1では口腔粘膜から細胞を採取できることから、本発明の方法を用いれば、採血が不可能な場合でもHLAタイピングが十分に可能であることが証明された。
図7のレーン1〜3は実験方法1にて抽出した場合、レーン4〜6は実験方法2にて抽出した場合、レーン7〜9は実験方法3にて抽出した場合のPCR産物の増幅状況を示す。実験方法1にて抽出したゲノムDNAを鋳型として用いたPCR増幅はいずれの遺伝子とも実験方法3にて抽出したものと遜色なく目的のPCR産物が得られた。実験方法3では採血を伴うが、実験方法1では口腔粘膜から細胞を採取できることから、本発明の方法を用いれば、採血が不可能な場合でもHLAタイピングが十分に可能であることが証明された。
本発明は、以下の態様を包含する。
(第1項)
(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;
(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(4)任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、HLAのDNAタイピング方法。
(第2項)
前記遺伝子がHLA−A遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:1、2及び3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第3項)
前記遺伝子がHLA−B遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:4及び5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、第1項に記載の方法。
(第4項)
前記遺伝子がHLA−C遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:6、7及び8の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第5項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR1型であり、前記プライマーセットが配列番号:9、10、11、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第6項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR2型であり、前記プライマーセットが配列番号:11、12、31及び33の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第7項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR3型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、32及び34の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第8項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR4型であり、前記プライマーセットが配列番号:15、16、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第9項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR5型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、31、35及び36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第10項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR6型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、31、32及び37の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第11項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR7型であり、前記プライマーセットが配列番号:17、18、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第12項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR8型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、31及び39の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第13項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR9型であり、前記プライマーセットが配列番号:19、20、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第14項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR10型であり、前記プライマーセットが配列番号:21、22、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第15項)
前記遺伝子がHLA−DPA1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:23、24、40及び41の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第16項)
前記遺伝子がHLA−DPB1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:25、26、42、43、44及び45の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第17項)
前記遺伝子がHLA−DQA1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:27、28、46及び47の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第18項)
前記遺伝子がHLA−DQB1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:29、30、48、49及び50の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第19項)
配列番号:1、2及び3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−A遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第20項)
配列番号:4及び5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−B遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第21項)
配列番号:6、7及び8の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−C遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第22項)
配列番号:9、10、11、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR1型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第23項)
配列番号:11、12、31及び33の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR2型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第24項)
配列番号:13、14、32及び34の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR3型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第25項)
配列番号:15、16、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR4型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第26項)
配列番号:13、14、31、35及び36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR5型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第27項)
配列番号:13、14、31、32及び37の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR6型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第28項)
配列番号:17、18、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR7型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第29項)
配列番号:13、14、31及び39の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR8型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第30項)
配列番号:19、20、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR9型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第31項)
配列番号:21、22、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR10型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第32項)
配列番号:23、24、40及び41の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DPA1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第33項)
配列番号:25、26、42、43、44及び45の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DPB1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第34項)
配列番号:27、28、46及び47の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DQA1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第35項)
配列番号:29、30、48、49及び50の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DQB1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第1項)
(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B,HLA−C,HLA−DQA1,HLA−DQB1,HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにHLA−DRB1のエクソン2及び3’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;
(3)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(4)任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、HLAのDNAタイピング方法。
(第2項)
前記遺伝子がHLA−A遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:1、2及び3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第3項)
前記遺伝子がHLA−B遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:4及び5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、第1項に記載の方法。
(第4項)
前記遺伝子がHLA−C遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:6、7及び8の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第5項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR1型であり、前記プライマーセットが配列番号:9、10、11、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第6項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR2型であり、前記プライマーセットが配列番号:11、12、31及び33の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第7項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR3型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、32及び34の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第8項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR4型であり、前記プライマーセットが配列番号:15、16、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第9項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR5型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、31、35及び36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第10項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR6型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、31、32及び37の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第11項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR7型であり、前記プライマーセットが配列番号:17、18、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第12項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR8型であり、前記プライマーセットが配列番号:13、14、31及び39の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第13項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR9型であり、前記プライマーセットが配列番号:19、20、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第14項)
前記遺伝子がHLA−DRB1遺伝子のDR10型であり、前記プライマーセットが配列番号:21、22、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第15項)
前記遺伝子がHLA−DPA1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:23、24、40及び41の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第16項)
前記遺伝子がHLA−DPB1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:25、26、42、43、44及び45の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第17項)
前記遺伝子がHLA−DQA1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:27、28、46及び47の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第18項)
前記遺伝子がHLA−DQB1遺伝子であり、前記プライマーセットが配列番号:29、30、48、49及び50の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、第1項に記載の方法。
(第19項)
配列番号:1、2及び3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−A遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第20項)
配列番号:4及び5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−B遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第21項)
配列番号:6、7及び8の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−C遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第22項)
配列番号:9、10、11、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR1型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第23項)
配列番号:11、12、31及び33の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR2型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第24項)
配列番号:13、14、32及び34の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR3型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第25項)
配列番号:15、16、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR4型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第26項)
配列番号:13、14、31、35及び36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR5型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第27項)
配列番号:13、14、31、32及び37の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR6型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第28項)
配列番号:17、18、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR7型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第29項)
配列番号:13、14、31及び39の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR8型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第30項)
配列番号:19、20、36及び38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR9型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第31項)
配列番号:21、22、31及び32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR10型のDNAタイピング用プライマーセット。
(第32項)
配列番号:23、24、40及び41の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DPA1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第33項)
配列番号:25、26、42、43、44及び45の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DPB1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第34項)
配列番号:27、28、46及び47の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DQA1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
(第35項)
配列番号:29、30、48、49及び50の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、HLA−DQB1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
Claims (9)
- ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DQA1、HLA−DQB1、HLA−DPA1及びHLA−DPB1の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセット、ならびにHLA−DRB1遺伝子のためのプライマーセットを含むプライマーセットであって、
前記HLA−DRB1遺伝子のためのプライマーセットが、
(a)配列番号:9、10又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号11又は32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR1型のためのプライマーセット;
(b)配列番号:12又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号11又は33の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR2型のためのプライマーセット;
(c)配列番号:13又は34の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号14又は32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR3型のためのプライマーセット;
(d)配列番号:15又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号16又は32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR4型のためのプライマーセット;
(e)配列番号:13又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号14、35又は36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR5型のためのプライマーセット;
(f)配列番号:13又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号14、32又は37の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR6型のためのプライマーセット;
(g)配列番号:17又は38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号18又は36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR7型のためのプライマーセット;
(h)配列番号:13又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号14又は39の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR8型のためのプライマーセット;
(i)配列番号:19又は38の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号20又は36の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR9型のためのプライマーセット;及び、
(j)配列番号:21又は31の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号22又は32の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、HLA−DRB1遺伝子のDR10型のためのプライマーセット、を含むことを特徴とするプライマーセット。 - HLA−A遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号:1又は2の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号:3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- HLA−B遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号:4の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号:5の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- HLA−C遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号:6又は7の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号:8の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- HLA−DPA1遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号:23又は40の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号24又は41の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- HLA−DPB1遺伝子のための前記プライマーセットが、配列番号:25、42又は44の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号26、43又は45の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- HLA−DQA1遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号:27又は46の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号28又は47の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- HLA−DQB1遺伝子のためのプライマーセットが、配列番号:29又は48の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号30、49又は50の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- (1)請求項1から8のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR増幅するステップ;
(2)PCR増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;及び
(3)任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、HLAのDNAタイピング方法。
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INTERNATIONAL JOURNAL OF IMMUNOGENETICS, vol. 38, JPN6012039484, 17 May 2011 (2011-05-17), pages 281 - 284, ISSN: 0004346793 * |
JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 49, JPN6012039483, 2004, pages 73 - 79, ISSN: 0004346792 * |
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