JP6643902B2 - 超並列高速シークエンサーによる簡便なhla遺伝子のdnaタイピング方法およびキット - Google Patents
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Description
(1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1、およびHLA−DPB1からなる群から選択される少なくとも1つの対象遺伝子のエクソン2とエクソン3を含むイントロン1領域およびエクソン4領域に各々特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR法によるDNA増幅を行うステップ;
(3)PCR法により増幅された産物の塩基配列を決定するステップ;および
(4)データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
(1)プライマーセット準備ステップ
本発明のDNAタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1およびHLA−DPB1からなる群から選択される少なくとも1つの対象遺伝子のエクソン2とエクソン3を含むイントロン1およびエクソン4に各々特異的にアニールするプライマーセットであって、同一条件でのアニーリングが可能なプライマーセットを準備する。
配列番号2は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32548609番目から第32548631番目および32486419番目から32486441番目、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:6_cox_hap2)における第3999861番目から第3999883番目および第3935840番目から3935862番目、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:mann_hap4)における第3996203番目から第3996225番目および3847267番目から第3847289番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約4,000〜約4,500塩基(bp)である。
配列番号4は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32633103番目から第32633127番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号5は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第32629214番目から第32629237番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約3,900塩基(bp)である。
配列番号7は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33053563番目から第33053591番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約5,400塩基(bp)である。
配列番号10は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第29914925番目から第29914954番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約5,500塩基(bp)である。
配列番号12は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31321210番目から第31321235番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約4,600塩基(bp)である。
配列番号15は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第31236075番目から第31236114番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約4,800塩基(bp)である。
本発明の方法では、前記ステップ(1)で準備したプライマーセットを用い、被検試料(DNA)をPCR法によりDNA増幅を行う。
PCRは、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
1.被検試料の形態に応じて、当該試料からDNAを抽出する。
2.抽出したDNAを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
3.反応条件を設定してPCRを実施する。
例:熱変性ステップ(通常は92〜98℃)
アニーリングステップ(通常は55〜72℃)
伸長ステップ(通常は65〜80℃)
本発明の方法では、前記アニーリングおよび伸長ステップの温度を約65〜70℃とするのが好ましい。より好ましくは65℃〜68℃とする。約65〜70℃でアニーリングおよび伸長させることにより、HLAアリルを等比率で(均一に)生成させることができる。
4.得られたPCR産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
次に、前記ステップ(2)で生成されたPCR産物(増幅DNA)の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆるハイスループットシークエンス(あるいは超高速シークエンス、大量並列シークエンス)と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。ハイスループットシークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第27巻、第1号、2009年(羊土社)等を参照されたい。
1.前記ステップ(2)で得られたPCR産物をネブライザーにより約500塩基ほどに断片化する。
2.その断片化されたDNA断片の末端にDNAアダプターを付加する。
3.DNAアダプターを付加したDNA断片を一本鎖にした後、アダプターを介してビーズに結合させ、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む。これにより、1ビーズに1つのDNA断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される。
4.エマルジョンPCRを実施し、各DNA断片を増幅させる。エマルジョンPCRにより、各DNA断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたDNA断片が結合したビーズを回収する。
5.ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする。ピコタイタープレートは、1ウェルに1個のビーズが入るサイズである。
6.各々のビーズについて、4種類の核酸(A、C、G、T)を一定の順序で加え、添加した核酸がポリメラーゼによりDNA配列に取り込まれたときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応により検出し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
次いで、前記ステップ(3)で得られるsff fileをMIDタグ毎に分類した後、既知のHLAアリルの塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたDNAの第3区域レベルあるいは第4区域レベルのHLAアリル(6桁あるいは8桁レベル)が決定される。
[目的]
HLAクラスII各遺伝子における増幅状況を確認する。
酵素としてPrimeSTAR(登録商標)GXL DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いて、既に抽出されているゲノムDNAを鋳型として、HLAクラスIIの各遺伝子特異的プライマーセット(表1の配列番号1〜7)を用いたPCRを行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)25ngのゲノムDNA溶液に、4μLの5xPrimeSTAR(登録商標)GXL緩衝液、1.6μLのdNTP溶液、1μL(4pmol/μL)ずつのPCRプライマー、0.8μLのPrime STAR(登録商標)GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20μLに調整した。
(2)(1)の調製物を94℃で2分間の保温後、続いて98℃で10秒間、70℃で3分間の2ステップを1工程として、この工程を30回繰り返してPCRを行った。なお、このPCRにはGeneAmp(登録商標)PCR System9700(ライフテクノロジーズ社)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動法によりPCR産物の増幅状況を確認した。
PrimeSTAR(登録商標)GXL DNAポリメラーゼによってHLA遺伝子のPCRが可能であった。増幅されたPCR産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図6に示す。レーン1はHLA−DRB1、HLA−DRB4およびHLA−DRB5、レーン2はHLA−DQB1、レーン3はHLA−DPB1それぞれのエクソン2および3を含む領域に相当するPCR産物であることが示された。図6においてレーンMはDNAサイズマーカーを示す。これらプライマーを用いることにより、HLAクラスIIの各遺伝子について目的の分子量の位置に単一のPCR産物を得ることができた。
[目的]
実施例1のHLAクラスIIに加え、HLA−A、HLA−B、HLA−Cを含めたHLA6座位におけるマルチプレックスPCR法の可能性を検証する。
1.既に抽出され、HLA型が明らかにされており、従来のDNAタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む6検体(表3のSample1〜6)のゲノムDNAを鋳型として、PrimeSTAR(登録商標)GXL DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いて、HLAクラスIおよびHLAクラスIIの各遺伝子に特異的なプライマーセット(表2の配列番号8〜15および表1の配列番号1〜7)を用いたPCRを行った。具体的な手順は次の通りである。
(1)PCRは2本の0.2mlチューブに分けて行った。すなわち、HLA−A、HLA−B、HLA−Cを1本のチューブで増幅させ、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1およびHLA−DPB1を1本のチューブで増幅させた。
(2)25ngのゲノムDNA溶液に、4μLの5xPrimeSTAR(登録商標)GXL緩衝液、1.6μLのdNTP溶液、3.2〜5μL(10pmol/μL)ずつのPCRプライマー、0.8μLのPrime STAR(登録商標)GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20μLに調整した。
(3)(2)の調製物を94℃で2分間の保温後、続いて98℃で10秒間、70℃で3分間の2ステップを1工程として、この工程を30回繰り返してPCR増幅を行った。なお、このPCRにはGeneAmp(登録商標)PCR System9700(ライフテクノロジーズ社)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動法によりPCR産物の増幅状況を確認した。
(1)PCR産物をAMPure XPキット(ベックマン・コールター株式会社)の標準的なプロトコールに従って精製した。
(2)PicoGreen(登録商標)dsDNA定量キット(インビトロジェン社)の標準的なプロトコールに従って濃度を測定した。
(3)精製したクラスI遺伝子由来のPCR産物とクラスII遺伝子由来のPCR産物を等量ずつ混合した。
(4)500ng/100μLの濃度に調整し、GS Junior(ロシュ社)の標準的なプロトコールに従って、rapidライブラリーの作製、エマルジョンPCR、シークエンシングを行い、1サンプルあたり1万5千リードの塩基配列を得た。
(5)それら配列をIMGT HLAデータベースに登録されている全HLAアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補HLAアリル配列を選択した。
(6)その候補HLAアリル配列をリファレンスとして、GS Reference Mapper(ロシュ社)を用いて、リファレンスとリードとを100%一致の条件でマッピングを行い、目視によるマッピング状況を確認することにより、HLAアリルを同定した。
1.増幅されたPCR産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図7に示す。図7においてレーン1〜6は表3のSample ID1〜6を用いたPCR産物に相当する。レーンMはDNAサイズマーカーである。図7から明らかなように、いずれの試料においても、表1および表2に示すプライマーを用いることによりHLAクラスIおよびHLAクラスIIの各遺伝子についてのPCR産物と、目的の分子量の位置に単一の増幅産物を得ることができた。またPCR産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないHLAアリルが得られた。よって、表1および表2に示すプライマーを用いたPCR系によりHLA遺伝子のDNAタイピングを行うことができる。
2.従来のDNAタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む6検体を用いてHLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1およびHLA−DPB1のエクソン2とエクソン3を含む領域の各遺伝子由来のPCR産物をGS JuniorによりHLA遺伝子のDNAタイピングを行った。その結果、全ての遺伝子ともに6桁レベルにおけるDNAタイピングが可能であった(表3)。よって本法により、フェーズ・アンビギュイティのない6桁レベル以上のHLA遺伝子のDNAタイピングを行うことができるとともに、イントロン内も含め、ヌルアリルの原因となり得る塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出することができる。
[目的]
HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4およびHLA−DRB5のHLA7座、ならびにHLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1およびHLA−DPB1のHLA9座におけるマルチプレックスPCR法の可能性を検証する。
1.既に抽出され、HLA型が明らかにされており、従来のDNAタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む4検体(表4のSample1〜4)のゲノムDNAを鋳型として、PrimeSTAR(登録商標)GXL DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いて、HLAクラスIおよびHLAクラスIIの各遺伝子特異的プライマーセット(表2の配列番号8〜15および表1の配列番号1〜5)を用いたPCRを行った。
HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1については表2の配列番号8〜15および表1の配列番号1〜5を用い、HLA−DPB1については、DPB1−F2(5'- CTCAGTGCTCGCCCCTCCCTAGTGAT -3':配列番号16)およびDPB1−R2(5'- GCACAGTAGCTTTCGGGAATTGACCA -3':配列番号17)を用いた。DPB1−F2(配列番号16)とDPB1−R2(配列番号17)は、MHCクラスIIβ鎖であるHLA−DPB1遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)において、HLA−DPB1遺伝子のエクソン2から3’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。配列番号16は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33048182番目から第33048207番目に相当する塩基配列を持つ。配列番号17は、ヒトゲノム塩基配列(リファレンス配列:hg19)における第33055428番目から第33055453番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるPCR産物の長さは約7,300塩基(bp)である。
PCRの具体的な手順は次の通りである。
(1)PCRは2本の0.2mlチューブに分けて行った。すなわち、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4およびHLA−DRB5を1本のチューブで増幅させた。また、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1およびHLA−DPB1を1本のチューブで増幅させた。
(2)25ngのゲノムDNA溶液に、4μLの5xPrimeSTAR(登録商標)GXL緩衝液、1.6μLのdNTP溶液、3.2〜5μL(10pmol/μL)ずつのPCRプライマー、0.8μLのPrime STAR(登録商標)GXLポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20μLに調整した。
(3)(2)の調製物を94℃で2分間の保温後、続いて98℃で10秒間、70℃で3分間の2ステップを1工程として、この工程を30回繰り返してPCR増幅を行った。なお、このPCRにはGeneAmp(登録商標)PCR System9700(ライフテクノロジーズ社)を用いた。PCR後に、アガロースゲル電気泳動法によりPCR産物の増幅状況を確認した。
(1)PCR産物をAMPure XPキット(ベックマン・コールター株式会社)の標準的なプロトコールに従って精製した。
(2)PicoGreen(登録商標)dsDNA定量キット(インビトロジェン社)の標準的なプロトコールに従って濃度を測定した。
(3)精製したクラスI遺伝子由来のPCR産物とクラスII遺伝子由来のPCR産物を等量ずつ混合した。
(4)500ng/100μLの濃度に調整し、Ion PGM(ライフテクノロジーズ社)の標準的なプロトコールに従って、ライブラリーの作製、エマルジョンPCR、シークエンシングを行い、1サンプルあたり40万リードの塩基配列を得た。
(5)それら配列をIMGT HLAデータベースに登録されている全HLAアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補HLAアリル配列を選択した。
(6)その候補HLAアリル配列をリファレンスとして、GS Reference Mapper(ロシュ社)を用いて、リファレンスとリードとを100%一致の条件でマッピングを行い、目視によるマッピング状況を確認することにより、HLAアリルを同定した。
1.増幅されたPCR産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図8に示す。図8においてレーン1〜4は表3のSample ID1〜4を用いたPCR産物に相当する。最も左のレーンはDNAサイズマーカーである。図8から明らかなように、上記のプライマーを用いることにより、HLA7座およびHLA9座ともにいずれの試料においても各遺伝子についてのPCR産物と、目的の分子量の位置に単一の増幅産物を得ることができた。
2.従来のDNAタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む4検体を用いて各遺伝子由来のPCR産物をIon PGMによりHLAタイピングを行った。その結果、全ての遺伝子ともに6桁レベルにおけるタイピングが可能であった(表4)。よって本法により、フェーズ・アンビギュイティのない6桁レベル以上のHLAタイピングを行うことができるとともに、イントロン内も含め、ヌルアリルの原因となり得る塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出することができる。
Claims (5)
- (1)ヒトゲノム塩基配列におけるHLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、HLA−DQB1、およびHLA−DPB1からなる群から選択される少なくとも1つの対象遺伝子のプライマーセットを準備するステップであって、当該プライマーセットがイントロン1領域およびエクソン4領域に各々特異的にアニールし、エクソン2、イントロン2、エクソン3、イントロン3およびエクソン4の一部を含む領域を増幅するものであり、
前記対象遺伝子がHLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4およびHLA−DRB5からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子である場合には、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号:1および配列番号:2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記対象遺伝子がHLA−DQB1遺伝子である場合には、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号:3および4のいずれか一方または両方および配列番号:5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記対象遺伝子がHLA−DPB1遺伝子である場合には、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号:6および配列番号:7に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、ステップ;
(2)前記プライマーセットを用いて被検試料(DNA)をPCR法によりDNA増幅するステップ;
(3)増幅されたPCR産物の塩基配列を決定するステップ;および
(4)任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ
を含む、HLA遺伝子のDNAタイピング方法。 - 6桁ないしは8桁レベルで行う、請求項1に記載の方法。
- 配列番号:1および配列番号:2に示す塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含む、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4およびHLA−DRB5からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
- 配列番号:3および4のいずれか一方または両方および配列番号:5に示す塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含む、HLA−DQB1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
- 配列番号:6および配列番号:7に示す塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含む、HLA−DPB1遺伝子のDNAタイピング用プライマーセット。
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