JP6798697B2

JP6798697B2 - Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法

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Publication number: JP6798697B2
Application number: JP2017024397A
Authority: JP
Inventors: 松田　文彦; 文彦松田; 修治川口; 正和清水; 幸一郎日笠
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2017-02-13
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2020-12-09
Anticipated expiration: 2037-02-13
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Description

本発明は、Classical HLA遺伝子のPCRプライマーセット、及びそれを用いた高効率かつ高均一なシークエンス法に関する。

ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）であるヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；HLA）は、免疫応答に携わる重要なタンパク質であり、免疫が関係する疾患と深く関わっている。HLAをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置しており、HLAの重要な遺伝子として、ほとんどすべての細胞で発現しているクラスＩ分子に属するHLA-A、HLA-B、HLA-Cと、主として免疫系の細胞で発現しているクラスII分子に属するHLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1が挙げられる。また、これらのHLA遺伝子は臓器移植の際の組織適合性に深く関わるため、正確にHLAアレルを決定（タイピング）することは臨床学的にも極めて重要である。しかしながら、上記6種類のHLA遺伝子は、対立遺伝子（アレル）の種類が１万を超える程、とりわけヒトゲノムの中でも群を抜いて多型に富む領域であり、未だに確立したタイピング方法がない。

Hosomichiらは、上記６種類のHLA遺伝子に対して、それぞれの遺伝子の上流領域及び下流領域に特異的にアニールするプライマーを作成し、これを用いたロングPCR法と次世代シークエンサー（NGS）によって、HLA遺伝子の塩基配列を決定する方法について報告している（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、本発明者らが行った被験対象を日本人とする予備実験により、上記プライマーを用いたロングPCRでは、HLA-Cに対して増幅効率が高い一方で、HLA-DRB1では増幅効率が極端に低く、均一な増幅が得られない問題が存在した。特にHLA-DRB1では一部の種類のアレルがほとんど増幅されない上、DRB3等の対象外の遺伝子が増幅されていた。また、被験対象が日本人の場合だけでなく、アジア人、白人、黒人の場合においても、同様の問題が報告されている（非特許文献２）。

Ehrenbergらは、上記方法の問題点を解決するため、上記プライマーに１種類のプライマー（HLA-A及びHLA-Cの場合）、又は３種類のプライマー（HLA-DRB1の場合）を追加してPCRを行ったことを報告している（非特許文献２）。しかしながら、前記PCRは、遺伝子毎にプライマーの数が異なるため、均一な増幅に影響が生じる。さらには、HLA-DRB1に関しては、目的外の遺伝子にもプライマーの配列が完全一致することにより、目的外の遺伝子が増幅される虞がある。

また、その他のHLA遺伝子タイピングのアプローチとして、上記６種類のHLA遺伝子に対して、データベースを基にHLAアレルの様々な配列に対応した120塩基のプローブを設計し、cDNAとプローブをハイブリダイゼーションさせて得たゲノム断片をNGSで読む方法が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、本方法では、データベースに登録されているHLAアレルの配列を可能な限り網羅するため、１万種に及ぶプローブを設計しており、増幅の均一性や収集効率が悪化するという問題がある。また、網羅されたHLAアレル以外のアレルの検出が困難であり、さらにはプローブと同配列を持つ、目的外の遺伝子のゲノム断片が混入する可能性が高い。

特開2016-10318号公報

Hosomichi, K. et al., BMC Genomics, 14:355, 2013. Ehrenberg, P.K. et al., BMC Genomics, 15:864, 2014. Wittig, M. et al., Nucleic Acids Res., 43(11): e70, 2015

本発明は、HLA遺伝子の均一な増幅を可能とし、一度に実施できる検体数を増やすことが可能なプライマーセットを提供することを課題とする。また、本発明は、該プライマーセットを用いた高効率かつ高均一なシークエンス法を提供することを課題とする。

HLA遺伝子の増幅を目的としたPCRプライマーの設計には、相反する以下の２つの課題が存在する。
Ａ．出来るだけ多種類のHLAアレルを包括できるようなプライマーの配列を選択する。
Ｂ．均一な増幅のため各増幅対象領域に対し、単一のプライマーを用意する。領域が重なる場合もオーバーラップ部は極力短くする。また目的外の遺伝子を増幅してはならない。
従って、上記２課題を解決する（即ち、上記Ａ,Ｂの条件を充足する）プライマーセットの開発が望まれていた。Ａの条件を上げるにはプライマーの数を増やすか、相同性の高い配列を選択する必要があるが、この場合にはＢの条件達成が困難となる。本発明者らは、以下の１〜４のステップを行うことで、条件Ａと条件Ｂの２条件を充足するプライマーセットを開発できるのではないかとの着想を得た。
１.768人の日本人検体における6遺伝子の次世代シークエンスによる配列解析データを、他の遺伝子由来のリードを排除しつつ、アセンブリする。
２.アセンブリした結果を遺伝子毎の全検体においてアライメントする。
３.２の結果において全検体で共通した配列を持つ領域を検出し、プライマー候補とする。
４.３の候補のなかで配列が他のHLA遺伝子と共通せずかつプライマーに適した配列を選定する。
本発明者らは、上記着想に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の通りである。
［１］配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-A遺伝子増幅用プライマーセット。
［２］配列番号３に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-B遺伝子増幅用プライマーセット。
［３］配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-C遺伝子増幅用プライマーセット。
［４］配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット。
［５］配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-DQB1遺伝子増幅用プライマーセット。
［６］配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-DPB1遺伝子増幅用プライマーセット。
［７］［１］に記載のプライマーセット、［２］に記載のプライマーセット、［３］に記載のプライマーセット、［４］に記載のプライマーセット、［５］に記載のプライマーセット及び［６］に記載のプライマーセットからなる群から２つ以上選択される、HLA遺伝子増幅用プライマーセット。
［８］［１］〜［６］に記載の全てのプライマーセットを含む、HLA遺伝子増幅用プライマーセット。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載のプライマーセットを用いて行う、HLA遺伝子のシークエンス方法。
［１０］［９］に記載の方法により得られた塩基配列情報を用いて行う、HLA遺伝子のタイピング方法。
［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載のプライマーセットを含む、HLA遺伝子の増幅用キット。

本発明のプライマーセットは、大規模シークエンスの結果をアセンブリ及びアラインメントし、共通する配列に基づいて設計しているため、本発明のプライマーセットを用いることで、従来法では増幅困難であったHLAのアレルの多くを漏らさず増幅することができる。また、本発明のプライマーセットは、計算学的アプローチにより膨大な配列候補から、他の遺伝子と相同性のないプライマーを選定しているため、本発明のプライマーセットを用いることで、非特異な増幅を防ぐことが可能である。従って、目的外遺伝子の混入によるアレルの誤判定を減らすことができ、精度の高いアレル判定に寄与する。さらには、目的の遺伝子領域に対し単一なプライマーを用いているため、均一なPCR増幅が可能となり、一度に実地できる検体数を増やすことができ、HLAタイピングコストの低減に繋がる。

図１は、本発明のHLA-A遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの位置を示す概略図及びプライマーの概要を示す。図２は、本発明のHLA-B遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの位置を示す概略図及びプライマーの概要を示す。図３は、本発明のHLA-C遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの位置を示す概略図及びプライマーの概要を示す。図４は、本発明のHLA-DRB1遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの位置を示す概略図及びプライマーの概要を示す。図５は、本発明のHLA-DQB1遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの位置を示す概略図及びプライマーの概要を示す。図６は、本発明のHLA-DPB1遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの位置を示す概略図及びプライマーの概要を示す。図７は、本発明のプライマーセットと、既報のプライマーセットを用いたMiSeqによるシークエンス結果におけるカバレッジ平均の結果を解析した図を示す。

本発明は、HLA遺伝子のHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、HLA-DQB１又はHLA-DPB１の遺伝子領域（翻訳領域とイントロン領域および５’側と３’側の非翻訳領域を一部含む）をPCRにより均一に増幅することが出来るプライマーセット（以下「本発明のプライマーセット」と略記する。）を提供する。また、本発明のプライマーセットを用いたHLA遺伝子のタイピング方法も提供する。

本発明において「プライマーセット」とは、各HLA遺伝子の所定の領域を増幅することができる２つ以上のPCRプライマーの組み合わせを意味し、各領域に対応するフォワードプライマーとリバースプライマーの２つのプライマーからなるプライマーセットを、プライマーペアと呼ぶことがある。

具体的には、本発明は下記表１に列挙したプライマーセットの中から選択される、少なくとも１組のプライマーペアを提供する。

本発明のHLA-A遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの遺伝子上の位置を示す概略図及びプライマーの概要を図１に示す。表１において、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-A遺伝子を特異的に増幅することが可能なプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-A遺伝子増幅用プライマーセット」と略記する。）。HLA-A遺伝子増幅用プライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-A遺伝子のエクソン１の上流側からエクソン８の下流側までの領域を増幅するように設計されている。

本発明のHLA-B遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの遺伝子上の位置を示す概略図及びプライマーの概要を図２に示す。表１において、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-B遺伝子を特異的に増幅することが可能なプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-B遺伝子増幅用プライマーセット」と略記する。）。HLA-B遺伝子増幅用プライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-B遺伝子のエクソン１の上流側からエクソン７の下流側までの領域を増幅するように設計されている。

本発明のHLA-C遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの遺伝子上の位置を示す概略図及びプライマーの概要を図３に示す。表１において、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-C遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-C遺伝子増幅用プライマーセット」と略記する。）。HLA-C遺伝子増幅用プライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-C遺伝子のエクソン１の上流側からエクソン８の下流側までの領域を増幅するように設計されている。

本発明のHLA-DRB1遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの遺伝子上の位置を示す概略図及びプライマーの概要を図４に示す。表１において、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-DRB１遺伝子の一部分を特異的に増幅するプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-DRB１遺伝子増幅用プライマーセット１」と略記する。）。HLA-DRB１遺伝子増幅用プライマーセット１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-DRB１遺伝子のエクソン１の上流側からエクソン２の下流側までの領域を増幅するように設計されている。また、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-DRB１遺伝子の一部分を特異的に増幅するプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-DRB１遺伝子増幅用プライマーセット２」と略記する。）。HLA-DRB１遺伝子増幅用プライマーセット２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-DRB１遺伝子のエクソン１とエクソン２の間のイントロン領域からエクソン６の下流側までの領域を増幅するように設計されている。HLA-DRB１遺伝子は長大な遺伝子長を有することから、DNAの分解に対して頑健性を持たせるため、前記２種類のプライマーセットを用いてPCRを行うことが好ましい。

本発明のHLA-DQB1遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの遺伝子上の位置を示す概略図及びプライマーの概要を図５に示す。表１において、配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-DQB１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-DQB１遺伝子増幅用プライマーセット」と略記する。）。HLA-DQB１遺伝子増幅用プライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-DQB１遺伝子のエクソン１の上流側からエクソン６の下流側までの領域を増幅するように設計されている。

本発明のHLA-DPB1遺伝子における大規模シークエンスのアセンブリ結果および増幅用プライマーの遺伝子上の位置を示す概略図及びプライマーの概要を図６に示す。表１において、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-DPB１遺伝子の一部分を特異的に増幅するプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット１」と略記する。）。HLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-DPB１遺伝子のエクソン１の上流側からエクソン２の下流側までの領域を増幅するように設計されている。また、配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットは、HLA-DPB１遺伝子の一部分を特異的に増幅するプライマーセットである（このプライマーセットを「HLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット２」と略記する。）。HLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：hg19）において、HLA-DPB１遺伝子のエクソン２の上流側からエクソン５の下流側までの領域を増幅するように設計されている。HLA-DPB１遺伝子は長大な遺伝子長を有することから、DNAの分解に対して頑健性を持たせるため、前記２種類のプライマーセットを用いてPCRを行うことが好ましい。

本発明のプライマーセットを構成するプライマー（以下「本発明のプライマー」と略記する。）としては、前記の各配列番号に示される塩基配列からなる核酸以外にも、各配列番号で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体もまた含まれる。

「各配列番号で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、上記した各配列番号で示される塩基配列にそれぞれ相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。例えば、「配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってHLA-A遺伝子の一部分をPCR増幅させることのできる機能を有する。同様に「配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってHLA-A遺伝子の一部分をPCR増幅させることのできる機能を有する。
かかる変異体は、プライマーとしての機能が維持される範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドから１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている。
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。

本発明のプライマーは核酸からなるが、該核酸は一本鎖核酸であることが好ましい。本発明において、核酸とはヌクレオチド及び該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子のことを意味する。例えば、DNA、RNA及びRNAとDNAが混合した重合体が挙げられるが、RNAを含む場合には、その塩基配列はDNA配列における「T（チミン）」を「U（ウラシル）」に読み替えるものとする。本発明のプライマーは、当業者に周知の任意の化学合成法により作製することができ、例えばヌクレアーゼ等の酵素を用いて作製することもできるし、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて作製することもできる。これらのプライマーは、構成する核酸にさらに任意の修飾が施されたものでもよい。例えば本発明のプライマーは、その5'末端又は3'末端に当該プライマーの検出や増幅を容易にするための標識物質（例えば、蛍光分子、色素分子、放射性同位元素、ジゴキシゲニンやビオチン等の有機化合物など）及び／又は付加配列（LAMP法で用いるループプライマー部分等）を含んでいてもよい。本発明のプライマーは、5'末端でリン酸化又はアミン化されていてもよい。また、本発明のプライマーは、天然塩基のみを含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。修飾塩基としては、デオキシイノシン、デオキシウラシル、S化塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のプライマーは、ホスホロチオエート結合やホスホロアミデート結合などを含む任意の誘導体オリゴヌクレオチドを含むものであってもよいし、ペプチド核酸結合を含むペプチド-核酸（PNA）を含んでいてもよい。

本発明のプライマーは、単離又は精製されていることが好ましい。「単離又は精製」とは、天然あるいは合成された状態から目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製されたプライマーの純度（全核酸中に含まれる目的とするプライマーの割合）は、（ｗ／ｗ）％の場合には、通常50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば100％）である。プライマーの純度は、溶媒及び固体・液体の状態によって適宜変更することができる。また、純度の単位は、（ｗ／ｖ）％、（ｖ／ｖ）％であってもよく、上記（ｗ／ｗ）％の場合の純度の規定を参酌し、適宜望ましい純度を算定することができる。

これらのプライマーは、乾燥した状態又はアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水又は適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。

本発明のプライマーセットを複数組み合わせることにより、HLAの複数の遺伝子をまとめて増幅することが可能となる。従って、本発明は、表１に列挙した本発明のプライマーセットの中から選択される２組以上のプライマーセットを含むプライマーセットを提供する。さらに、表１に列挙した全てのプライマーを用いることにより、上記重要なHLAの６種類の遺伝子（即ち、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB１、HLA-DQB１及びHLA-DPB１）の複数を一度に増幅できるマルチプレックスPCRを行うことができ、高効率、高均一かつコストの低いHLA遺伝子のタイピングが実現できる。ただし、HLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット１とHLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット２は重複領域があるため、別個にマルチプレックスPCRを行うことが好ましい。同様にHLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット１と15、16のHLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット２も別個にマルチプレックスPCRを行うことが好ましい。従って、好適な実施態様において、本発明は、表１に列挙した本発明のプライマーを全て含むプライマーセットを提供する。

本発明のプライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、目的とするHLA遺伝子を増幅する複数のプライマーセットを同じチューブ（容器）に入れてPCRを行う。ただし、HLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット１とHLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット２は重複領域があるため別個の容器に入れることが好ましい。同様にHLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット１とHLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット２も別個の容器に入れることが好ましい。好適な実施態様において、本発明は、１つの容器にHLA-A遺伝子増幅用プライマーセット、HLA-C遺伝子増幅用プライマーセット、HLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット１、及びHLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット１を混合し、別の容器にHLA-B遺伝子増幅用プライマーセット、HLA-DRB１遺伝子増幅用プライマーセット２、HLA-DQB１遺伝子増幅用プライマーセット、及びHLA-DPB１遺伝子増幅用プライマーセット２を混合し、２つの容器をまとめてPCRを行う方法を提供する。

本発明において、PCRの鋳型とするDNAは、被験試料から調製することができる。被験試料としては、特に限定されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などを挙げることができる。

DNAの調製は、プロテイナーゼK／フェノール抽出法、フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のDNA/RNA抽出用キットを用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度のDNAを調製することができる。

本発明のプライマーセットを用いた、HLAに対するPCRの反応条件として、例えば以下の条件が挙げられる。
熱変性ステップ（例：９２〜９８℃）
アニーリングステップ（例：５５〜７２℃）
伸長ステップ（例：６５〜８０℃）

上記PCRは、アニーリングステップと伸長ステップを１つのステップとして行ってもよく（シャトル法）、又はアニーリング温度を高めに設定し、サイクルごとに徐々に温度を下げていく方法（タッチダウン法）により行ってもよい。あるいは、それらを組み合わせて行ってもよい。シャトル法を行う場合には、アニーリングステップと伸長ステップの温度は、典型的には６５〜７２℃である。

次いで、得られた増幅産物は、通常の方法により塩基配列を決定することができるが、次世代シークエンサー（NGS）を用いて塩基配列を決定することが好ましい。次世代シークエンスに関しては、例えば、実験医学別冊「次世代シークエンス解析スタンダード」、2014年（羊土社）等を参照することができる。このような目的に用いられるNGSとしては、イルミナ（illumina）社製の装置（例：MiSeq、HiSeq2500）、ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社製の装置（例：Ion Proton、Ion PGM）、ロッシュダイアグノスティックス（Roche Diagnostic）社製の装置（例：GS FLX+、GS Junior）などを挙げることができるが、これらの装置に限定されない。

NGSを用いた塩基配列決定の方法は、NGSの種類によって異なり、例えば、各社のマニュアル(例：Nextera^R XT DNA Library Prep Reference Guide)に準じて実施することができる。また、得られたサンプルのシークエンシングには、好ましくはペアエンド解析が用いられる。以下では、イルミナ社のMiSeqを用いた配列決定の手順の概要について記載するが、他の装置（ライフテクノロジーズ社製のIon Proton、ロッシュダイアグノスティックス社のGS FLX+など）を用いた場合でも、装置に適した方法により同様に塩基配列を決定することができる。

１．各サンプルの増幅産物を、キット（例：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(Illumina社)）によりタグ付断片化（Tagmentation）を行う。
２．得られた断片配列に対し、キット（例：Nextera XT v2 Index Kit Set A、B、C、D(Illumina社)）を用いて、サンプルそれぞれに異なるIndex配列を両側に付加し、PCRを行う。
３．増幅産物を精製する。
４．各サンプルからの増幅産物を用いて、ライブラリサイズを確認する。
５．サンプル間の濃度調整を行う。
６．サンプルの増幅産物をプールし、プールした増幅産物に対し、定量PCRを行う。
７．MiSeqを用いて、プールした増幅産物のシークエンスを行う。

このようにNGSで得られた増幅産物の塩基配列情報（以下、リード）を基に、データベースを使用してHLA遺伝子の遺伝子型を判定すること（タイピング）ができる。このデータベースとしては、10,000種類を超えるアレルが登録されているIPD-IMGT/HLAデータベースや、本発明者らが新たに作成したHLA辞書などが挙げられる。HLA辞書とは、IPD-IMGT/HLAデータベースから、登録されている全HLAアレルのエクソンおよびイントロンの全塩基配列を抽出し、塩基配列パターンごとにグループ化し、これらのパターンとその属するアレル情報を記録したものである。NGSで得られた増幅産物の塩基配列情報を基にしたタイピング方法としては、例えば、リードを複数のHLA遺伝子のアレルへのマッピングし、その結果を線形計画問題に当てはめ、最も当てはまりの良いアレルペアを検出する方法(OptiType)（Szolek, A. et al., (2014) OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data. Bioinformatics, 30, 3310-3316.）や、リードのマッピング結果をDe novoアセンブリし、その結果からアレルを判定する方法(HLAreporter)（Huang, Y. et al., (2015) HLAreporter: a tool for HLA typing from next generation sequencing data. Genome Med, 7, 25.）などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。

あるいは、NGSを用いずにHLAのタイピングをしてもよい。このような方法としては、例えば、アレイベースのPCR-SSOP法、Sanger法ベースのPCR-SBT法、PCR-PHFA法、及びPCR-SSCP法などの、ロングPCRによる増幅産物を用いた解析方法が挙げられるが、これらの方法に限定されない。

本発明はまた、本発明のプライマーセットを用いたPCRにおいて使用され得るキットを提供する。本発明のキットは、上記本発明のプライマーセットに加えて、PCRに必要な他の試薬を含んでいてもよい。前記試薬が、本発明のプライマーセットと共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない試薬である場合には、プライマーセットと混合してキットに含めることができる。あるいは、前記試薬と本発明のプライマーセットとは混合せずに別個で提供されてもよい。前記試薬としては、DNA抽出用試薬、DNAポリメラーゼ酵素、dNTP、反応緩衝液、PCRの陽性コントロールとなる標的配列を含むDNA分子、説明書などが挙げられる。前記DNAポリメラーゼ酵素は、市販品であってもよく、このようなDNAポリメラーゼ酵素としては、例えばTaKaRa社製のPrimeSTAR GXL DNA Polumerase、Tks Gflex DNA Polymerase、TaKaRa LA Taq、Thermo SCIENTIFIC社製のLong PCR Enzyme Mixが挙げられるが、これらに限定されない。

実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ Classical HLA遺伝子のマルチプレックスPCRプライマーセットのデザイン
6種のClassical HLA遺伝子（HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1, -DPB1）に対し、マルチプレックスPCRを行うためのプライマー設計手順について記述する。なお、次世代シークエンサーから得られたリードのマッピングには、全てbowtie2 (ver. 4.1.2)を用いた。

I．HLA遺伝子のシークエンス結果からの遺伝子全長のアセンブリ
１．従来法によるHLA遺伝子のシークエンス
既存のプライマーセット[Hosomichi, K. et al. (2013) Phase-defined complete sequencing of the HLA genes by next-generation sequencing. BMC Genomics, 14:355.]を用いて各3遺伝子の2セットでのマルチプレックスPCRを768検体（未公開検体）に対して行った(表２参照)。ただしDRB1に関しては、配列を修正したプライマーを追加した。実験条件に関しては表３を参照のこと。得られた増幅産物をMiSeqによりシークエンスした。

２．HLA辞書へのマッピング
IPD-IMGT/HLAデータベースから得られる全てのHLAアレルのエクソン・イントロンの配列情報に対し、MiSeqのシークエンス結果をbowtie2でマッピングした。マップ結果を基に、リードの各遺伝子における重みを計算した。重みの計算方法について以下簡潔に説明する。
マッピング結果を読み込み、各エクソンに一致したリードの対応関係を調べる。リードの50%以上がHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致するもしくはHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致するかを調べる。マッチしたリードに対して各エクソン・イントロンでマッチした配列に対応するアレル数に応じて遺伝子毎に重み付けをする。各遺伝子に対する該リードの重みは以下の式

に従い、これをペアエンドリード別個で計算した後以下の式

でまとめる。

以降の手順は各HLA遺伝子(遺伝子Gとおく)で個別に行った。カバレッジのカウントには上記で計算した重みを加重した。

３．遺伝子へのマッピング及び相異箇所の検出
遺伝子Gにおいて正(>0)の重みが得られたリード群を、IPD-IMGT/HLAにおいてイントロンを含めた完全長配列が登録されている遺伝子Gの全てのアレル（以下完全アレル）にマップした。各完全アレルに対し、5塩基のミスマッチ以内でマップされたリードを集め、マップされた各位置で各塩基のカバレッジを計算した。計算したカバレッジが各位置で最大となる塩基を選ぶことで得られる配列（以下「コンセンサス配列」と略記する。）を作成した。次に、ある位置でコンセンサス配列とは異なる塩基のカバレッジがコンセンサス配列に対応する塩基のカバレッジの10%以上ある場合、その位置を相異位置とし、その塩基配列を相異配列とした。ただし、10%以上のカバレッジをもつ塩基が複数存在する場合は、その中で最大のカバレッジを持つものを選択した。コンセンサスおよび相異をIDとする二つのクラスを用意し、相異位置を含む箇所にマップされたリードがコンセンサス配列・相異配列のどちらを多く含むか比較し、多い側のクラスにリードを所属させた。ただし同数若しくは相異位置を一つも含んでいないリードは両クラスに属するとした。

４．相異配列の反転・除去
コンセンサスのクラスに属するリードの集合だけでカバレッジを再計算し、相異位置のコンセンサス配列のカバレッジが相異配列のカバレッジを下回る場合は相異位置でのコンセンサス配列・相異配列に対応する塩基を入れ替えた。この後、相異側のクラスに属するリードの集合だけでカバレッジを計算し、相異位置のコンセンサス配列のカバレッジが相異配列のカバレッジを上回る場合は、この相異位置を除去した。反転および除去された情報をもとに、再び全リードに対してステップ３のリードのクラス分けを行い、相異位置でのコンセンサス配列・相異配列の反転および相異位置の除去を行った。この作業を反転および相異位置の除去が発生しなくなるまで繰り返した。

５.最適アレルペアの選択
全ての完全アレルにおいてステップ３、４を行い、クラス分けされたリードの集合を得た。任意の二つの完全アレルをそれぞれA、BとしC(A)、C(B)をそれぞれA、Bのコンセンサスのクラスに属するリードの集合、D(A)、D(B)をそれぞれA、Bの相異のクラスに属するリードの集合とした。C(A)∪C(B)、C(A)∪D(B)、D(A)∪C(B)、D(A)∪D(B)のそれぞれの和集合において、式２（数２）の重みをかけた上でのリード数合計をそれぞれ計算した。完全アレルペアの全ての組み合わせにおける全ての和集合でリード数を比較して、最もリード数が多くなるアレルペアとその和集合の種類を選択した。ペアの探査にはAとBが同じ完全アレルとする組み合わせを含めた。

６.相異位置の修正
ステップ５で選ばれたペアが異なる完全アレルであった場合、二つの完全アレルが持つ相異位置の互いの対応関係が不明なため、マップされたリードの関係を用いて相異位置を対応させた。まず完全アレルの各相異位置において、この位置を含んでマップされたリードの集合を検出した。このリードの集合には、コンセンサス・相異の両クラスに属するものを含む。二つの完全アレル間の相異位置のリードの集合同士における全ての組み合わせで共通リード数を計算し、共通リード数が多い集合の組みの順番に、集合に対応する相異位置同士を完全アレル間における同じ相異位置として対応させた。片方の完全アレル側に対応する相異位置が存在しなかった場合は、その相異位置を除去した。

７.再クラス分け及びコンセンサス配列の決定
ステップ５で決定したアレルペアと対応するクラスおよびそれらの間で対応させた相異位置関係に対して、各リードをステップ３の方法によってどちらの完全アレル側に属するか判定した。判定結果で得られた各完全アレルのリードの集合からコンセンサス配列をそれぞれ作成した。

８．コンセンサス配列の逐次的更新
1)ステップ７で得られた二つのコンセンサス配列に対し、全リードを再マップした。2)各リードを二つのマップ結果のミスマッチ数を比較して少ない方に所属させた。同ミスマッチ数の場合は両方に属するとした。それぞれの所属したリードの集合を用いて再びコンセンサス配列を作成した。このときコンセンサスのカバレッジが5リード数に達しない位置は“N”とした。3)得られた二つの配列に対し、再びステップ1)、2)を行った。これを両配列にどちらにおいても更新がなくなるまで繰り返した。

９．ホモ・ヘテロ判定
ステップ８で最終的に得られた二つのコンセンサス配列におけるリードの集合を比較した。この時、片側のアレルにのみ属するリードの数が相手側にのみ属するリードの数に対し10倍以上あった場合、少ない側のアレルを消去し、残った側のコンセンサス配列によるホモアレルとして出力した。そうでない場合は、両アレルのコンセンサス配列を出力した。出力した配列をアセンブリ配列とする。

II.アセンブリ配列を用いた新規プライマーの設計
事前に京都大学医学研究科付属ゲノム医学センター（以下「ゲノム医学センター」と略記する。）で保管する768検体のDNAサンプルそれぞれにおいて、Iの方法を用いて6種類のHLA遺伝子のアセンブリ配列を作成した。

１．短いアセンブリ結果の除去
得られたアセンブリ配列から塩基配列数が以下の長さに達しないものを除去した。この際、“N”の部分は配列数から引いた。
HLA-A: 2,800bp
HLA-B: 2,800bp
HLA-C: 2,800bp
HLA-DRB1: 10,000bp
HLA-DQB1: 6,500bp
HLA-DPB1: 9,500bp
ただし、“N”が配列全体の5%以上含まれる場合は長さの如何を問わずそのアセンブリ配列を除去した。

２．マルチプルアラインメントの実行
ステップ１で残った各遺伝子のアセンブリ配列の集合に対しMUSCLE (ver 3.8.31) [Edgar, R.C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res., 32:1792-1797.]を用いてマルチプルアラインメントを行った。

３．レアな挿入の除去
アラインメント結果から得られたコンセンサス配列のある区間が１つのアセンブリ配列によって20塩基以上の挿入が生じていた場合（=カバレッジが1である区間が20塩基以上続く）、その区間を除去しアライメント位置を詰めた。

４.相異区間、Exon区間のマスク
ステップ３で得られたコンセンサス配列のカバレッジがアセンブリ配列数の95%以下になっている位置をマスクした。またコンセンサス配列上でエクソンに該当する位置を、類似する配列を検索するソフトウェアであるBLASTにより既知のHLA遺伝子の配列データから検索し、一致したエクソン区間をマスクした。

５．プライマー候補の選別
Primer3 [Untergasser, A. et al. (2012) Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res., 40:e115.] を用いてプライマーペアの候補を決定した。プライマーは以下の基準を満たすものとした。
・ステップ４でマスクした領域を含まない。
・A,B,C,DQB1は一つのペアで全ての翻訳領域を包括する。
・DRB1, DPB1に対しては2ペア用意し、両ペアともエクソン2を含みかつ前後2ペアによって翻訳領域を包括する。
・各遺伝子のプライマーペアは、他のどのHLA遺伝子に対しても特異的である。また特異な位置はできる限り内側 (5’側のプライマーなら3’側の位置、3’側のプライマーなら5’側)に存在している。

Primer3のオプションは以下の通りである。
PRIMER_OPT_SIZE=30
PRIMER_MIN_SIZE=20
PRIMER_MAX_SIZE=35
PRIMER_MIN_TM=40
PRIMER_MAX_TM=90
PRIMER_MIN_GC=10
PRIMER_MAX_GC=90
PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=1
P3_FILE_FLAG=1
PRIMER_MAX_SELF_END=3
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END=3
PRIMER_MAX_HAIRPIN_TH=60

以上を満たす候補が複数ある場合は、配列の特異性、Primer3のスコアを考慮して最適なものを選択した。この作業は人為的に行った。得られたプライマーセットの情報を表４に示す。

実施例２マルチプレックスPCR及びNGSシークエンス
Ｉ．ロングPCR
１．計384検体の各DNAサンプルに対し、HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1, -DPB1 の6遺伝子を標的としたマルチプレックスロングPCRを行った。増幅は以下の2セットをそれぞれまとめて行った。
セット1: HLA-A,-C,-DPB1(FF,FR),-DRB1(FF,FR)
セット2: HLA-B,-DQB1,-DPB1(RF,RR),-DRB1(RF,RR)
プライマー配列と最終濃度は表3の通りである。またPCRに向けて以下のものを準備した。
・DNA 25 ng
・0.25 μL of Tks Gflex^TM DNA Polymerase
・6.25 μL 2 × Gflex^TM PCR Buffer
最終容量が12.5 μLになるように調製した後Cool Start^TM法(TaKaRa社)を適用し、表５における温度条件、サイクル数でPCR反応を行った。PCR装置にはGeneAmp^R PCR System 9700 (Thermo Fisher Scientific inc., Waltham, MA, USA) を用いた。
２．増幅産物をAgencourt^R AMPure^R XP Beads(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)で精製した。
３．各サンプル1μLをアガロースゲルで泳動し、目的バンドの有無を確認した。想定されるバンドサイズは表３に記載した通りである。
４．二つのセットを等モル混合し、サンプル毎の増幅産物の最終濃度が0.2ng/μL(2.5μL)になるように調製した。

ＩＩ．次世代シーケンサーを用いた配列決定 (MiSeq)
これより以下で特に記載のないプロトコルは、Illumina社のマニュアルに準拠した(Nextera XT DNA Library Prep Reference Guide (15031942 Rev. D))。
１．各サンプルの増幅産物の 0.5 ng を Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (Illumina)適用してTagmentationを行った(300bp×2のペアエンドリード)。
２．得られた断片配列に対し、Nextera XT v2 Index Kit Set A、B、C、Dを用いて（各行、列で2.5 μL）384検体それぞれに異なるIndex配列を両側に付加し、PCRを行った。
３．Agencourt^R AMPure^R XP Beadsで増幅産物を精製した。
４．各サンプルから増幅産物を1 μL用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer及びHigh Sensitivity DNA chip (Agilent Technology)によりライブラリサイズを確認した。
５．Kit中のLibrary Normalization Beadsによるサンプル間の濃度調整を行った。
６．384検体の増幅産物を等量プールした。
７．プールした増幅産物に対し、 KAPA Library Quantification Kit を用いて定量PCRを行った(詳細はKAPA Library Quantification Kit. Illumina^R platformsのTechnical Data Sheetを参照)。
８．MiSeq (Illumina) を用いて384検体、HLA6遺伝子のシークエンスを行った。
９．15GB前後のデータサイズ(25Mのペアエンドリード)の出力が得られているか確認した。

III.本発明のプライマーセットを用いたHLA6遺伝子シークエンス予備実験結果
ゲノム医学センターで保管されている384検体を用いて、デザインしたHLA遺伝子用のプライマーセット及び上記の実験方法を用いて予備実験を行った。比較のため、既報のプライマーセット及び実験方法を用いた96検体によるシークエンスも同時に行った[Hosomichi, K. et al. (2013) Phase-defined complete sequencing of the HLA genes by next-generation sequencing. BMC Genomics, 14:355.]。なお、比較用の検体は、予備実験とは重複していない。これらの検体のMiSeqによるシークエンス結果に対し、IMGT/HLAデータベースの完全長配列が既知のHLAアレル全てにマップした。いずれかのアレルと一致したリードを集め各遺伝子での平均カバレッジを計算した。平均カバレッジの分母となる遺伝子長はHLAアレルによって異なるため、各遺伝子のアレルセットでの平均長を用いた。

図７に6種類の遺伝子の平均カバレッジの検体毎の分布を２種類のプライマーセットで比較した結果を示す。実施した検体数が異なるため、平均カバレッジは既存セット側が高くなっている(MiSeqの出力データサイズは同じため)。既報のプライマーセットによる結果では、HLA-BとHLA-DRB1の平均カバレッジが他の遺伝子と比べて低いことが認められた。特にHLA-DRB1では中央値が0を指しており、これは半分以上の検体で増幅産物が得られなかったことを意味する。それに対し、本発明のプライマーセットは遺伝子間でのばらつきが低く、HLA-DRB1の配列も問題なく読めることが確認された。従って、本発明のプライマーセットを用いることで、一度の次世代シークエンサーの実施に対する検体の数を増やす事が可能となるため、本発明のプライマーセットは、従来のプライマーセットと比較して優れた効果を有する。

本発明のプライマーセットは、均一なPCR増幅を可能とするため、一度の次世代シークエンサーの実施に対する検体の数を増やす事が可能である。ゲノム医学センターで得られた大規模な日本人検体の共通配列を用いているので、日本人に関してはプライマーと合わない未知のアレルが発生する頻度は極めて低いと考えられる。これより、再実施率が低減されるためHLAタイピングの自動化に適している。臓器移植や、将来iPSを用いた治療における安全性の高い適合検査や多くのドナー確保に適用可能であり、またプライマー数を少なくできるため、取り回しが効き商品化しやすい。

Claims

配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-A遺伝子増幅用プライマーセット。
配列番号３に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-B遺伝子増幅用プライマーセット。
配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-C遺伝子増幅用プライマーセット。
配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-DRB1遺伝子増幅用プライマーセット。
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-DQB1遺伝子増幅用プライマーセット。
配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーを含む、HLA-DPB1遺伝子増幅用プライマーセット。
請求項１に記載のプライマーセット、請求項２に記載のプライマーセット、請求項３に記載のプライマーセット、請求項４に記載のプライマーセット、請求項５に記載のプライマーセット及び請求項６に記載のプライマーセットからなる群から２つ以上選択される、HLA遺伝子増幅用プライマーセット。
請求項１〜６に記載の全てのプライマーセットを含む、HLA遺伝子増幅用プライマーセット。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて行う、HLA遺伝子のシークエンス方法。
請求項９に記載の方法により得られた塩基配列情報を用いて行う、HLA遺伝子のタイピング方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、HLA遺伝子の増幅用キット。