JP2019528249A - タウｐｅｔ画像化リガンド - Google Patents

Abstract

本発明は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用してタウ凝集体を画像化および定量化するのに有用な、新規な選択的放射標識タウリガンドに関する。本発明はまた、このような化合物を含む組成物、このような化合物および組成物の調製方法、組織または対象をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで画像化するためのこのような化合物および組成物の使用、および前記化合物の前駆体も対象とする。

Description

本発明は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用してタウ凝集体を画像化および定量化するのに有用な、新規な選択的放射標識タウリガンドに関する。本発明はまた、このような化合物を含む組成物、このような化合物および組成物の調製方法、組織または対象をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで画像化するためのこのような化合物および組成物の使用、ならびに前記化合物の前駆体も対象とする。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、老化に伴う神経変性疾患である。ＡＤ患者は、認知障害および記憶喪失、ならびに不安症などの行動問題を患う。ＡＤに罹患している人の９０％超が散発型の障害を有するが、この症例の１０％未満は家族性または遺伝性である。米国では、６５歳で１０人に約１人がＡＤを有するが、８５歳では２人に１人がＡＤに罹患している。初期診断からの平均余命は７〜１０年であり、ＡＤ患者は、介護付き生活施設での、または家族による、広範な介護を必要とする。人口に占める高齢者の数が増加するにつれ、ＡＤに対する医学的関心が高まっている。現在使用可能なＡＤの治療は、単にこの疾患の症状を処置するものに過ぎず、この疾患を引き起こす根底にある病理を処置するものではない。

ＡＤ患者の脳における顕著な病理学的特徴は、過剰リン酸化したタウタンパク質の凝集体によって生じる神経原線維変化、およびβ−アミロイドペプチドの凝集によって形成されるアミロイド斑である。最も蔓延している神経変性障害はＡＤであるが、凝集タウタンパク質はまた、「タウオパチー」として知られる他の神経変性疾患の特徴でもあり、その疾患には、追加として、以下のみというわけではないが、神経原線維変化型認知症（ＴＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、および第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）が含まれる。これらの障害の異質性は、ヒトタウの広範なアイソフォームおよび翻訳後修飾と密接な関連がある。タウ凝集体は、超微細構造的に、対らせん状細線維（ＰＨＦ：ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）、直線状細線維（ＳＦ：ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）、ランダムコイル状細線維（ＲＣＦ：ｒａｎｄｏｍｌｙ ｃｏｉｌｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）、またはねじれ状細線維（ＴＦ：ｔｗｉｓｔｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）として現れる場合があり、この多様性が多型につながる。神経原線維変化と、ＡＤにおける認知障害のレベルおよび／またはＡＤを発症する確率との相関が作られている。しかしながら、診断は依然として、死後に組織診／剖検によって行われ得るのみである。病歴および統計的な記憶試験に基づく検査は、障害または認知症の明らかな証拠を必要とし、不正確であるか、または感度が低いことが多く、腰椎穿刺による脳脊髄液中のＡβペプチドおよび総タウタンパク質の測定は侵襲的であり、有害作用を受けやすい。ＡＤに固有の複雑さは別にしても、早期診断、進行度分類、および疾患進行の正確なモニタリングのための信頼のおけるツールが不足しているため、治療法の開発が阻まれてきた。したがって、診断を行う、および／または疾患進行をモニターする手段を突き止めることが依然として必要である。タウ凝集体を画像化することにより、特に抗タウ治療が台頭する際に、そのような手段が提供され得る。

ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）は、すべての核画像化技術の中で最高の空間および時間分解能を提供する非侵襲的画像化技術であり、組織中のトレーサー濃度の真の定量化を可能にし得るという付加的な利点を有する。ＰＥＴは検出のためにポジトロン放出核種を使用する。

これまでに、タウ凝集体の画像化用に、ポジトロン放出断層撮影放射性トレーサーがいくつか報告されている（総説については、例えばＡｒｉｚａ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，４３６５−４３８２を参照されたい）。Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ ２０１６；５７：１５９９−１６１０の「Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ １８Ｆ−ＭＫ−６２４０，ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ＰＥＴ Ｔｒａｃｅｒ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ｔａｎｇｌｅｓ」では、多量のＮＦＴを含有するヒトＡＤ大脳皮質ホモジネートと高い親和性で結合するが、アミロイド斑に富んだＮＦＴの少ないＡＤ脳ホモジネートとは結合が不十分な６−フルオロー３−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル）イソキノリン−５−アミンが開示されている。頭蓋への取り込みとして、^１８Ｆ−ＭＫ−６２４０により中程度の脱フッ素化が観察される。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｉｍａｇｉｎｇ ２０１０；３７（８）：１５７５−１５９３の論文「Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ」は、 活性化したミクログリアの末梢皮質ベンゾジアゼピン受容体に結合するイソキノリン化合物［^１１Ｃ］ＰＫ１１１９５について報告し、さらに、この化合物は、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００９；６６（１）：６０−６７の「Ｃａｒｂｏｎ １１−ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ １１−ｌａｂｅｌｅｄ （Ｒ）−ＰＫ１１１９５ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ」においても、患者と健常ボランティアとの間の脳内沈着の相違を示していないが、報告された。
ＰＨＦに高親和性を有するキノリン化合物^１８Ｆ−ＴＨＫ５３５１によるヒト脳のＰＥＴ画像化は、酵素モノアミンオキシダーゼＭＡＯ−Ｂへの非特異的な結合により混同して示された（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１７；９；２５ ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１３１９５−０１７−０２５３−ｙ）。

以下に限定されるものではないが、タウ凝集体に対する高親和性および高選択性、可逆的な結合、浸透性、好適な脳内薬物動態学的プロファイル、すなわち、脳全体への急速な分布、急速なクリアランス、最小限の非特異的結合、ならびに合成の容易性を含む、特性のバランスが良好な、タウ凝集体を画像化するための選択的な改良型のポジトロン放出断層撮影放射性トレーサーを提供することが依然として必要である。

したがって、本発明の目的は、タウＰＥＴ放射性トレーサーとして有用なイソキノリン−６−アミン化合物を提供することである。したがって、一態様において、本発明は式（Ｉ）

（式中、
少なくとも１つの原子は放射性であり、ならびに
Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１がＦであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３がＦであるかのいずれかであり；または
Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ、
−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。

特に、本発明は式（Ｉ’）

（式中、
Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１が^１８Ｆであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が^１８Ｆであるかのいずれかであり；または
Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−^１８Ｆ、
−ＯＣ_１〜４アルキル−^１８Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−^１８Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。

別の態様において、本発明は、上記に定義した式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を合成するための前駆体化合物に関する。したがって、本発明はまた、式（Ｐ−１）

（式中、
Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１が、Ｂｒ、−ＮＯ_２、
−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋、および４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−からなる群から選択され、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が、Ｂｒ、−ＮＯ_２、−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋、および４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−からなる群から選択されるかのいずれかであり；または
Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、
−Ｃ_１〜４アルキル−Ｂｒ、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｉ、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３、４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−Ｃ_１〜４アルキル−、
−Ｃ_１〜４アルキル−ＯＨ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｂｒ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｉ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３、
４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−Ｃ_１〜４アルキル−Ｏ−、−ＯＣ_１〜４アルキル−ＯＨ、−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｂｒ、−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｉ、
−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３、４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−Ｃ_１〜４アルキル−ＮＲ^４−、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−ＯＨ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。

式（Ｐ−１）の化合物において、Ｒ^１またはＲ^３のいずれかが−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋である場合、好適な陰イオン性対イオンとしては、トリフルオロアセタート（−［ＯＣ（Ｏ）ＣＦ_３］⁻）、有機スルホナート（例えば、Ｃ_１〜４アルキルスルホナートまたはフェニルスルホナート（式中、フェニルは、任意選択によりＣ_１〜４アルキル基、ハロ基、またはニトロ基により置換され得る））、およびタルトラートが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ_１〜４アルキルスルホナートの特定の例としては、メタンスルホナート（メシラート）、
４−メチルベンゼンスルホナート（トシラート）、４−ブロモベンゼンスルホナート、および４−ニトロベンゼンスルホナートが挙げられる。特に、陰イオン性対イオンはトリフルオロアセタート、トシラートおよびメシラートから選択される。

本発明はまた、式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の基準物質であって、対応する非放射標識化合物に相当し、本明細書では式［^１９Ｆ］−（Ｉ）の化合物

（式中、
Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１がＦであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３がＦであるかのいずれかであり；または
Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ、
−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
と称される化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物、またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物にも関する。特に、前記医薬組成物は診断用医薬組成物である。前記医薬組成物は、具体的には滅菌溶液である。したがって、本発明の実例は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を含む滅菌溶液である。

本発明はさらに、画像化剤としての式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物の使用に関する。本発明の例示は、組織もしくは対象をｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで画像化するための、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物の使用、または組織もしくは対象をｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで画像化する方法である。

特に、本発明は、タウオパチーに罹患している、または罹患している疑いのある患者のタウ凝集体を結合させ、画像化するのに使用するための式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物に関する。特定のタウオパチーは、例えば、アルツハイマー病、神経原線維変化型認知症（ＴＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、および第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）である。特に、タウオパチーはアルツハイマー病である。

本発明はさらに、対象の脳内のタウ凝集体を画像診断するための式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物、およびタウオパチーに罹患している、または罹患している疑いのある患者のタウ凝集体を結合させ、画像化することにおける式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物の使用に関する。特定のタウオパチーは、例えば、アルツハイマー病、神経原線維変化型認知症（ＴＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、および第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）である。特に、タウオパチーはアルツハイマー病である。

本発明はまた、検出可能な量の本明細書に記載の式（Ｉ）の標識化合物、特に式（Ｉ’）の標識化合物を組織または対象に接触させる、または供給もしくは投与することと、式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を検出することとを含む、組織または対象を画像化する方法に関する。

本発明のさらなる例示は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を組織または対象に接触させる、または供給することと、ポジトロン放出断層撮影画像化システムで組織または対象を画像化することとを含む、組織または対象を画像化する方法である。

加えて、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ’−ａ）または（Ｉ’−ｂ）の化合物、特に下記で（Ｉ’−ａ１）、（Ｉ’−ａ２）、（Ｉ’−ｂ１）、（Ｉ’−ｂ２）、（Ｉ’−ｂ３）と称される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の調製方法であって、
（ａ）本明細書に記載の式（Ｐ−ａ１）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物とフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を、好適な条件下で反応させる工程、または
（ｂ）本明細書に記載の式（Ｐ−ａ２）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物とフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を、好適な条件下で反応させる工程、または
（ｃ）本明細書に記載の式（Ｐ−ｂ１）の化合物またはその薬学的に許容される塩と塩化メタンスルホニルまたは塩化４−トルエンスルホニルなどの活性化試薬を、トリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの塩基の存在下で反応させ、その後、得られたメタンスルホナートまたは４−トルエンスルホナートとフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を、好適な条件下で反応させる工程、または
（ｄ）本明細書に記載の式（Ｐ−ｂ２）の化合物またはその薬学的に許容される塩と塩化メタンスルホニルまたは塩化４−トルエンスルホニルなどの活性化試薬を、トリエチルアミンまたはＤＩＰＥＡなどの塩基の存在下で反応させ、その後、得られたメタンスルホナートまたは
４−トルエンスルホナートとフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を、好適な条件下で反応させる工程、または
（ｅ）本明細書に記載の式（Ｐ−ｂ３）の化合物またはその薬学的に許容される塩と塩化メタンスルホニルまたは塩化４−トルエンスルホニルなどの活性化試薬を、トリエチルアミンまたはＤＩＰＥＡなどの塩基の存在下で反応させ、その後、得られたメタンスルホナートまたは
４−トルエンスルホナートとフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を、好適な条件下で反応させる工程
を含む方法を指す。

式（Ｐ−ｂ１）、（Ｐ−ｂ２）および（Ｐ−ｂ３）の前駆体の活性化のための典型的な条件としては、例えば、活性化剤として塩化メタンスルホニル、溶媒として乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、室温、反応を促進させて完了させる十分な時間、通常１０分が挙げられる。（Ｐ−ｂ３）においてＲ^４がＨである場合、式（Ｉ’−ｂ３）の化合物の調製は、アミン官能基を、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの好適な保護基または別の好適なアミン保護基により保護し、その後、保護基がＢｏｃである場合、通常トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してそのような保護基を切断する、追加の工程を含むことになることを当業者は理解するであろう。

好適な^１８Ｆ⁻の供給源は、例えば、４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］ヘキサコサンカリウムフルオリド−［^１８Ｆ］（１：１）（［^１８Ｆ］ＫＦ．Ｋ２２２とも称される）である。好適な条件としては、例えば、溶媒としてＤＭＳＯまたはＤＭＦ、特にＤＭＳＯを使用し、通常の加熱またはマイクロ波照射（例えば、５０Ｗ）のもとで、例えば、約９０〜１６０℃または約１２０〜１６０℃、特に約９０℃または１６０℃で、反応がマイクロ波照射下で実施される場合は、反応を完了するまで進行させることができる十分な時間、例えば、１０分間など、当該技術分野で知られる求核置換に適したものが含まれる。

ＡＤ（ブラーク病期ＶＩ）（Ａ）の患者の視覚野の切片に［^１８Ｆ］化合物番号１（７．４ｋＢｑ／５００μＬ／切片）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏオートラジオグラフィー（ＡＲＧ）を示す。隣接する切片をタウ病態（Ｂ、ＡＴ８）およびアミロイドβ病態（Ｃ、４Ｇ８）用に免疫染色した。 図１（Ａ）に示されるＡＲＧと、１μｍｏｌ／Ｌの基準化合物である化合物番号１（Ｂ）またはＴ８０８（Ｃ）存在下で［^１８Ｆ］化合物番号１（７．４ｋＢｑ／５００μＬ／切片）とインキュベートした隣接するヒトＡＤ脳切片との間の比較を示す。 図３：図３は、ヒト大脳基底核（線条体）組織の１０ｎＭ［^３Ｈ］化合物番号１とのインキュベーション（Ａ）、それに続く１０μＭの化合物番号１（Ｂ）または１０μＭのＴＨＫ５３５１（Ｃ）による処理を示す。図３Ｄは、図４に示されるＩＨＣにより確認されたタウ病態およびアミロイド病態を有するヒトＡＤ組織（頭頂−側頭皮質、ブラーク病期ＶＩ）の１０ｎＭ［^３Ｈ］化合物番号１とのインキュベーションを示す。図３Ｅは、図５に示されるＩＨＣにより確認されたタウ病態のないアミロイド病態を有するヒトＡＤ組織（外側後頭回、ブラーク病期０）の１０ｎＭ［^３Ｈ］化合物番号１とのインキュベーションを示す。図３Ｆは、ヒト大脳基底核組織の１０ｎＭ［^３Ｈ］ＴＨＫ５３５１とのインキュベーションを示し、それに続く１０μＭの化合物番号１（Ｇ）または１０μＭのＴＨＫ５３５１（Ｈ）による処理を示す。図３Ｉは、図４に示されるように確認されたタウ病態およびアミロイド病態を有するヒトＡＤ組織（頭頂−側頭皮質、ブラーク病期ＶＩ）の［^３Ｈ］ＴＨＫ−５３５１とのインキュベーションを示す。図３Ｊは、図５に示されるように確認されたタウ病態のないアミロイド病態を有するヒトＡＤ組織（外側後頭回、ブラーク病期０）の１０ｎＭ［^３Ｈ］ＴＨＫ５３５１とのインキュベーションを示す。図３Ｋは、ヒト大脳基底核（Ｋ）、アミロイドβ病態およびタウ病態の両方を含有する上記ヒトＡＤ組織（Ｌ）、およびタウ病態のないアミロイドβを含有するヒト上記ＡＤ組織（Ｍ）の３ｎＭ［^３Ｈ］−ＡＶ−４５とのインキュベーションを示す。 （上記の通り。） 図３の画像のために使用された切片と同じ患者の頭頂−側頭皮質領域由来のＡＤ脳切片におけるアミロイド病態およびタウ病態の４Ｇ８およびＡＴ８のＩＨＣを示す。 図３Ｅおよび図３Ｊに使用されたものに隣接するヒトＡＤ脳切片（外側後頭回、女性）を示す。β−アミロイド斑の存在（Ａ、Ｂ）およびタウ濃縮体の不存在（Ｃ、Ｄ）を、それぞれ４Ｇ８抗体およびＡＴ８抗体を使用した免疫組織化学検査により確認した。 図３に示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ結合のために使用されたヒト大脳基底核組織におけるＭＡＯ−Ｂ（左）およびＭＡＯ−Ａ（右）の発現のＩＨＣによる確認を示す。 ヒトＡＤ組織切片（頭頂−側頭皮質、ブラーク病期ＶＩ）の０．２ｍＣｉ／ｍＬ［^１８Ｆ］化合物番号１とのインキュベーション（Ａ）、および１０μＭクロルギリン（Ｂ）、１０μＭデプレニール（Ｃ）、および１０μＭ化合物番号１（Ｄ）による処理を示す。 図７において参照されたものに隣接するＡＤ脳切片（頭頂−側頭皮質、ブラーク病期ＶＩ）におけるタウ病態およびアミロイド病態の各々のＡＴ８および４Ｇ８のＩＨＣを示す。 ［^１８Ｆ］化合物番号１に対する標準取込値（ＳＵＶ）として表されるμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。 ３匹の雌ウィスターラットの全脳における［^１８Ｆ］Ｔ８０７（Ｃ）に対するμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。３つの別個の分析が示される：ベースラインスキャン（トレーサーのみ）、前処置の試験（非放射性の化合物番号１またはＴ８０７、１０ｍｇ／ｋｇが放射性トレーサー注射の６０分前に皮下に注射される）、および追跡試験（非放射性の化合物番号１またはＴ８０７、１ｍｇ／ｋｇが放射性トレーサー注射の３０分後に静脈内に注射される）。 ウィスターラットの全脳における［^１８Ｆ］化合物番号１および［^１８Ｆ］Ｔ８０７の小動物ＰＥＴ時間放射能曲線の％ＳＵＶ_最大値曲線を示す。 アカゲザルの全脳、脳梁、小脳、嗅内皮質および頭蓋における、［^１８Ｆ］化合物番号１のμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。 アカゲザルの全脳、脳梁、小脳、嗅内皮質および頭蓋における、［^１８Ｆ］Ｔ８０７のμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。 アカゲザルの全脳における［^１８Ｆ］化合物番号１および［^１８Ｆ］Ｔ８０７の小動物μＰＥＴ時間放射能曲線の％ＳＵＶ_最大値曲線を示す。

一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、具体的には式（Ｉ−ａ）

（式中、
少なくとも１つの原子は放射性であり、ならびにＲ^１がＦであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３がＦである）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

より具体的には、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ’−ａ）

（式中、
Ｒ^１が^１８Ｆであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が^１８Ｆである）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、具体的には式（Ｉ−ｂ）

（式中、
少なくとも１つの原子は放射性であり、ならびにＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆからなる群から選択され、Ｒ^４はＨまたはメチルである）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

より具体的には、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ’−ｂ）

（式中、
Ｒ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−^１８−Ｆ、−ＯＣ_１〜４アルキル−^１８Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−^１８Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

一実施形態では、式（Ｉ）、具体的には式（Ｉ’）の化合物は、

またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

別の特定の実施形態では、先に定義した式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の合成のための前駆体化合物は、具体的には式（Ｐ−１）

（式中、
Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１が、Ｂｒ、−ＮＯ_２、
−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋、および４−Ｍｅ−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−からなる群から選択され、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が、Ｂｒ、−ＮＯ_２、−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋、および４−Ｍｅ−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−からなる群から選択されるかのいずれかであり；または
Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、
−Ｃ_１〜４アルキル−ＯＨ、−ＯＣ_１〜４アルキル−ＯＨ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−ＯＨ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

本発明はまた、非放射標識化合物１に対応する基準物質であって、［^１９Ｆ］−化合物

に対応する化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。

別の特定の実施形態では、式［^１９Ｆ］−（Ｉ）の化合物は、具体的には式［^１９Ｆ］−（Ｉ−ａ）

（式中、
Ｒ^１がＦであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３がＦである）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

別の特定の実施形態では、式［^１９Ｆ］−（Ｉ）の化合物は、具体的には式（Ｉ−ｂ）

（式中、
Ｒ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｆおよび−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。

［^１９Ｆ］−化合物番号１は、化合物Ｔ−８０８（Ｔ−８０８は、Ｓｉｅｍｅｎｓにより開発されている。例えば、Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．２０１４，３８，１７１−１８４を参照されたい）の内部で作られたトリチウム類似体を使用した放射標識置換アッセイにおいて、抽出されたヒトタウ凝集体に強力な結合（ｐＩＣ_５０ ８．２４）を示した。この類似体は本明細書で［^３Ｈ］−Ｔ８０８と称する。さらに、化合物番号１は、フロルベタピル（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．製のＡｍｙｖｉｄ（登録商標）またはＡＶ−４５としても知られる。例えば、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１０，５１，９１３−９２０を参照されたい）の内部で作られたトリチウム類似体を使用した放射標識置換アッセイにおいて、抽出されたヒトアミロイドβ凝集体に弱い結合（ｐＩＣ_５０ ５．１８）を示す。この類似体は本明細書で
［^３Ｈ］−ＡＶ−４５と称する。プロトコルの説明は後段に記載する。

［^３Ｈ］−Ｔ８０８は、ブロモ前駆体（１当量）のメタノール溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（５当量）の存在下で、室温にて、パラジウム担持炭素（５％）で触媒によるトリチウム化を行うことによって得られた。ブロモ前駆体は、Ｔ８０８をアセトニトリル中Ｎ−ブロモスクシンイミド（１当量）で臭素化することによって得られた。

［^３Ｈ］−ＡＶ−４５は、ジクロロメタンに溶解したＡＶ−４５の、イリジウムに触媒された（クラブトリー触媒）トリチウム交換により得られた。

既に述べたように、式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物、および式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を含む組成物は、組織または対象を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで画像化するために使用することができる。特に、本発明は、組織または対象中のタウ凝集体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで画像化または定量化する方法に関する。

特に、タウ凝集体を画像化する方法は、対象、特に患者に、検出可能な量の式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を供給することを含む。

さらに、本発明は、対象に検出可能な量の式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を供給する工程、式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物がタウ凝集体沈着物と相互作用するのに十分な時間を与える工程、およびタウ凝集体沈着物と相互作用した化合物を検出する工程を含む、タウ凝集体沈着物を画像化する方法に関する。

本方法がｉｎ ｖｉｖｏで行われる場合、式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物は、静脈内に、例えば、シリンジでの注射によって、または短カテーテルなどの末梢静脈ラインを用いて投与することができる。式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物、または式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を含む滅菌溶液は、特に、腕の静脈内投与によって、特に手背の特定可能な任意の静脈中に、または肘の肘正中皮静脈中に投与してもよい。

したがって、特定の実施形態では、本発明は、本明細書に定義する式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物、または式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を含む組成物、特に滅菌製剤を、対象に静脈内投与することと、ポジトロン放出断層撮影画像化システムで対象を画像化することとを含む、対象を画像化する方法に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物、または式（Ｉ）の化合物、特に式（Ｉ’）の化合物を含む組成物を、対象に静脈内投与することと、ポジトロン放出断層撮影画像化システムで画像化することとを含む、対象におけるタウ凝集沈着物を定量化する方法に関する。

本化合物は検出可能な量で対象に提供され、化合物がタウ凝集沈着物と相互作用するのに十分な時間が経過した後に、標識化合物は非侵襲的に検出される。

定義
本明細書で使用する場合、「組成物」という用語は、特定成分を特定量で含む生成物、および特定成分の特定量での組合せから直接的または間接的に得られる任意の生成物を包含するものとする。用語「Ｃ_１〜４アルキル」は、炭素数１、２、３または４の直鎖または分岐鎖の飽和アルキル基、例えば各々が、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、ブチルなどを意味するものとする。

本発明による化合物の付加塩もまた、本発明の範囲内に包含されることを意図した。

本発明の化合物の許容される塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。しかし、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製に使用される場合がある。薬学的に許容されるか否かにかかわらず、すべての塩が本発明の範囲に含まれる。薬学的に許容される塩は、本発明による化合物が形成することが可能な治療活性のある無毒性の酸付加塩形態を含むものと定義される。前記塩は、適切な酸、例えば無機酸、例えばハロゲン化水素酸、特に塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸およびリン酸；有機酸、例えば酢酸、ヒドロキシ酢酸、プロパン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸およびパモ酸で、本発明による化合物の塩基形態を処理することによって得ることができる。

逆に、前記塩形態は、適切な塩基で処理することにより遊離塩基形態に変換することができる。

さらに、本発明の化合物のうち一部は、水（すなわち水和物）または一般的な有機溶媒とともに溶媒和物を形成することができ、このような溶媒和物もまた、本発明の範囲内に包含されるものとする。

本明細書で使用する「対象」という用語は、処置、観察または実験の対象である、または対象となってきたヒトを指す。特に断りのない限り、「対象」には無症候性のヒト、前駆症候性のヒトおよびヒト患者が含まれる。

調製
本発明の化合物は、一般に、それぞれが当業者に知られている一連の工程により調製することができる。具体的には、本化合物は、以下の合成方法に従って調製することができる。

本明細書に開示している式［^１９Ｆ］−（Ｉ−ａ）または［^１９Ｆ］−（Ｉ−ｂ）の化合物は、６−ブロモ−イソキノリンの、式（ＩＩ−ａ）の適切な２−アミノ−ピリジン化合物（式中、すべての変数は、［^１９Ｆ］−（Ｉ）について本明細書に記載している通りである）との、

バックワルド・ハートウィッグアミノ化反応条件下での反応（式中、すべての変数は、［^１９Ｆ］−（Ｉ）について本明細書に記載している通りである）により、あるいは、式（ＩＩ−ａ’）の化合物（式中、Ｒ^１が−ＮＯ_２であり、かつＲ^３がＨであるか、またはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が−ＮＯ_２である）の、ＫＦなどのフッ化物源との、熱的条件下、ＤＭＳＯなどの反応不活性溶媒中での反応により、

あるいは、イソキノリン−６−アミンの、式（ＩＩ−ｂ）の適切な２−クロロ−ピリジン化合物（式中、すべての変数は、［^１９Ｆ］−（Ｉ）について本明細書に記載している通りである）との、

バックワルド・ハートウィッグアミノ化反応条件下での反応により調製することができる。

式（ＩＩ−ａ’）の化合物は、例えば、イソキノリン−６−アミンと、６−ブロモ−３−メチル−２−ニトロピリジンまたは２−ブロモ−５−メチル−４−ニトロピリジンのバックワルド・ハートウィッグアミノ化反応条件下での反応により調製することができる。

用途
本発明による化合物には、組織または対象をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で画像化するための様々な用途がある。したがって、例えば、本発明による化合物は、年齢および性別の異なる対象におけるタウ凝集体沈着物の特異的分布をマッピングするために使用することができる。さらに、アルツハイマー病を含むが、タウ凝集体沈着物に起因する他の疾患、すなわち他のタウオパチーも含む様々な疾患または障害に罹患している対象におけるタウ凝集体沈着物の特異的分布を調査することが可能になる。

したがって、過剰分布は、診断、症例発見、対象集団の層別化において、および個々の対象の疾患進行のモニタリングにおいて、特に抗タウ治療、例えば抗体が利用可能になった場合に役に立つ場合がある。放射性リガンドは、ＰＥＴ画像化用には微量、すなわち検出可能な量で投与されるため、本発明の放射性リガンドの投与による治療効果はあり得ない。

実験的な要素
化学的性質
本明細書で使用する場合、用語「ＡＣＮまたはＭｅＣＮ」はアセトニトリルを意味し、「ａｑ．」は水性を意味し、「ｔＢｕＯＨ」はｔｅｒｔ−ブタノールを意味し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを意味し、「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテルを意味し、「ＤＩＰＥＡ」はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを意味し、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味し、「Ｅｔ_２Ｏ」はジエチルエーテルを意味し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＬＣＭＳ」は液体クロマトグラフィー／質量分析を意味し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｍ．ｐ．」は融点を意味し、「ｏｒｇ」は有機を意味し、「Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３」はトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）を意味し、「ｐｒｅｐ」は分取を意味し、「ｒｍ／ＲＭ」は反応混合物を意味し、「ｒｔ／ＲＴ」は室温を意味し、「Ｒ_ｔ」は保持時間（分単位）を意味し、「ｓａｔ．」は飽和を意味し、「ｓｏｌ．」は溶液を意味し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を意味し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し、「ＸａｎｔＰｈｏｓ」は４，５−ビス（ジフェニル−ホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテンを意味する。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、試薬用溶媒を用いてシリカゲル６０ Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行った。オープンカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル、メッシュ２３０〜４００粒度および６０Å孔径（Ｍｅｒｃｋ）にて、標準技法で行った。自動フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｇｒａｃｅ（ＧｒａｃｅＲｅｓｏｌｖ（商標）カートリッジ）またはＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ（ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）カートリッジ）から購入した、そのまま接続できる使い捨てカートリッジを使用し、粒径３５〜７０μｍの不定形シリカゲルで、ＩＳＣＯ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈまたはＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）Ｓｐｅｋｔｒａ装置にて行った。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）：いくつかの化合物については、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ ＡＶ３００、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ ３６０ＭＨｚ ＮＭＲまたはＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計のいずれかにおいて、それぞれ３００ＭＨｚ、３６０ＭＨｚおよび４００ＭＨｚで動作する標準的なパルスシーケンスを用いて記録した。試料をＤＭＳＯ−ｄ_６またはＣＤＣｌ_３に溶解し、５ｍｍ ＮＭＲ管に移して測定した。化学シフト（δ）を、内部標準として使用したテトラメチルシラン（ＴＭＳ）より低磁場側の百万分率（ｐｐｍ）で報告する。

ＨＰＬＣによる精製を、合成プロトコルにおいて示されるように、室温での流速４０ｍＬ／分により、２０分の勾配溶出を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ １００Ａカラム（長さ１００ｍｍ×内径３０ｍｍ；５μｍ粒子）を装着したＴｒｉｌｕｔｉｏｎソフトウェアにより動作させられるＧＩＬＳＯＮセミ分取システム上で実施した。注入量は８０００μＬであった。取得周波数を、２波長ＵＶ検出器用に２８４ｎｍに設定した。

本発明の化合物を調製するためのいくつかの方法を以下の実施例に例示するが、これらの実施例は、本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではない。別段の断りがない限り、出発物質はすべて、市販業者から入手し、さらに精製することなく使用した。

Ａ．中間体の合成
中間体１の調製

テトラメチル錫（０．７３６ｍＬ、５．３０９ｍｍｏｌ）を、５−ブロモ−４−フルオロピリジン−２−アミン（０．３３８ｇ、１．７７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ９４４４０１−６９−８）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（０．０６２ｇ、０．０８８５ｍｍｏｌ）およびＬｉＣｌ（０．３００ｇ、７．０７８ｍｍｏｌ）の１０ｍＬのＤＭＦ中混合物に添加した。この混合物を、窒素による脱気後にチューブ内に密閉した。次に、混合物を１２０℃で１８時間撹拌し、その後水で希釈した。次に、ＫＦの飽和水溶液を添加し、水層をＥｔＯＡｃにより抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、真空中で溶媒を蒸発させた。粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００／０〜９５／５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１を得た（０．１９０ｇ、７９％）。

中間体２の調製

方法１：６−アミノイソキノリン（１８．３ｇ、１２７．１ｍｍｏｌ）をトルエン（４００ｍＬ）中で撹拌した溶液に、２−ブロモ−５−メチル−４−ニトロピリジン（２３．０ｇ、１０５．９ｍｍｏｌ）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（２．４５ｇ、４．２４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（１．９４ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）、ｔＢｕＯＫ（１６．６ｇ、１４８．３ｍｍｏｌ）を窒素下にて添加した。この混合物に窒素を５分間バブリングし、続いてバイアルを密封し、１００℃で２時間加熱した。混合物を濾過し、濾塊をすべての生成物が抽出されるまでＥｔＯＡｃにより洗浄した。濾液に水を添加し、有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣を水に溶解させ、１時間トリチュレートし、濾過し、真空中５５℃で乾燥させた。得られた茶色固体（ｐＨ４でＭｅＯＨ中に溶解されている）を、分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ−１０μｍ、５０×１５０ｍｍ、移動相：０．５％ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液＋１０％ＣＨ_３ＣＮ、ＭｅＯＨ）により精製した。純粋な画分を合わせ、溶出液の有機成分を蒸発させた。赤色沈殿物が生じ、これを濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。得られた沈殿物を、すべて溶解するまでＤＣＭ／ＭｅＯＨ／１Ｎ ＮａＯＨ（２Ｌ／０．２Ｌ／１Ｌ）中で撹拌し、有機層を分離した。水層をもう一度ＤＣＭにより抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発させた。残渣をエーテルと水の二相混合物中でトリチュレートし、濾過し、真空中５０℃で２日間、室温にて凍結乾燥器中で４時間乾燥させて、橙色結晶として中間体２を得た（６．１１ｇ、１８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ２．４０（ｓ，３Ｈ）７．５０（ｓ，１Ｈ）７．６２−７．７１（ｍ，２Ｈ）８．０１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）８．３６（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）８．４５（ｓ，２Ｈ）９．０９（ｓ，１Ｈ）９．９７（ｓ，１Ｈ）

方法２：６−アミノイソキノリン（７．６２ｇ、５２．８５ｍｍｏｌ）を２００ｍＬのトルエン中で撹拌した溶液に、２−ブロモ−５−メチル−４−ニトロピリジン（１１．４７ｇ、５２．８５ｍｍｏｌ）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（０．６１１ｇ、１．０５７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．４８４ｇ、０．５２９ｍｍｏｌ）およびｔＢｕＯＫ（８．３０ｇ、７４．００ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に窒素を５分間バブリングし、続いてバイアルを密封し、１００℃で２時間加熱し、再度１１０℃で３時間加熱した。混合物にＥｔＯＡｃを添加し、その後３０分間撹拌した。次に、混合物をジカライトで濾過し、濾塊をすべての生成物が抽出されるまでＥｔＯＡｃにより洗浄した。濾液に水を添加し、有機層を分離した。水層を、残留した生成物がなくなるまでＥｔＯＡｃにより抽出した（ＬＣＭＳ対照）。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣を水／ＤＩＰＥ中に溶解させ、一晩トリチュレートし、濾過し、真空中５５℃で乾燥させて、中間体２を得て（１０．５ｇ、７１％、純度５７％）、これを次の反応工程のためにそのまま使用した。

中間体３の調製

トリメチルボロキシン（０．２５６ｍＬ、１．８３ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（５．３ｍＬ）中で５−ブロモ−６−フルオロピリジン−２−アミン（０．２９１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ９４４４０１−６５−４）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．１７６ｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）およびＣｓ_２ＣＯ_３（０．９９３ｇ、３．０４７ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に窒素をバブリングしながら添加した。窒素下にて１０５℃で１６時間撹拌して反応させた。水およびＥｔＯＡｃを添加した。相を分離し、有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜５０／５０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、黄色固体として中間体３を得た（０．１５１ｇ、７９％）。

中間体４の調製

Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（トルエン中５０％、１．６７ｍＬ、３．８０７ｍｍｏｌ）を、２−クロロ−５−（２−フルオロエチル）ピリジン（０．４００ｇ、２．５３８ｍｍｏｌ、ＣＡＳ １１７５２８−２８−６）の乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）溶液に０℃で滴加した。１分後、冷浴を取り外し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ_３飽和溶液で希釈し、ＤＣＭにより抽出した。有機層を水で洗浄し、（ＭｇＳＯ_４）で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、０／１００〜７０／３０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体４を得た（０．１９３ｇ、４５％）。

中間体５の調製

ＮａＯＨ（０．０６４ｇ、１．５９９ｍｍｏｌ）を、［（６−クロロピリジン−３−イル）オキシ］酢酸（０．３００ｇ、１．５９９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ２３４１０９−２８−５）の、ＣＨ_３ＣＮ（４ｍＬ）と水（４ｍＬ）の混合物中の混合物に添加した。混合物を８５℃で１時間加熱した。溶媒を真空中で濃縮して、白色固体として中間体５を得て（３３５ｍｇ、９５％）、これを次の反応工程にてそのまま使用した。

中間体６の調製

Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（登録商標）（１．１１６ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を、あらかじめ脱気した水（７．５ｍＬ）とＣＨ_３ＣＮ（７．５ｍＬ）の混合物中の中間体５（０．３１４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。トリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）六水和物（０．０５６ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応から３０ｃｍの位置で、５００Ｗ可視光線の造船所用照明により反応を１時間照射した。光線を消した後、水とジエチルエーテルを反応媒体に注いだ。２つの相を分離し、水相をＥｔ_２Ｏにより抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物を溶出液としてのＥｔ_２Ｏによりシリカゲルで濾過し、真空中で濃縮して、ベージュ色の油状固体として中間体６を得た（０．１６７ｇ、５４％）。

中間体７の調製

５−アミノ−２−クロロピリジン（１．００ｇ、７．７７８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２７ｍＬ）中で撹拌した溶液を０℃まで冷却し、続いて２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（１．７２ｇ、７．７７８ｍｍｏｌ）とピリジン（０．９４２ｍＬ、１１．６６８ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。得られた混合物を室温まで温め、３時間撹拌した。２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（０．５２ｇ、２．３３４ｍｍｏｌ）とピリジン（０．３１４ｍＬ、３．８８９ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。次に、水を混合物に加え、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。抽出物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液および塩水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、０／１００〜１０／９０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体７を得た（２．２２ｇ、９１％）。

中間体８の調製

中間体７（１．１ｇ、３．５０６ｍｍｏｌ）と２−フルオロエチル４−メチルベンゼンスルホナート（０．９１８ｇ、４．２０８ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ３８３−５０−６）をＤＭＦ（１０．６ｍＬ）中に溶解させた。Ｃｓ_２ＣＯ_３（１．９４２ｇ、５．９６１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で添加した。混合物を８５℃まで一晩加熱した。周囲温度まで冷却した後、暗褐色懸濁液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜２０／８０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体８を得た（０．６８７ｇ、５４％）。

中間体９の調製

中間体７（０．７００ｇ、２．２３１ｍｍｏｌ）と３−フルオロプロピル４−メチルベンゼンスルホナート（０．６７４ｇ、２．９０１ｍｍｏｌ、ＣＡＳ３１２−６８−５）をＤＭＦ（６．７ｍＬ）中に溶解させた。Ｃｓ_２ＣＯ_３（１．４５ｇ、４．４６３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を窒素雰囲気下で８５℃まで一晩加熱した。３−フルオロプロピル４−メチルベンゼンスルホナート（０．３６３ｇ、１．５６２ｍｍｏｌ）とＣｓ_２ＣＯ_３（０．７２７ｇ、２．２３１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８５℃で一晩加熱した。周囲温度まで冷却した後、暗褐色懸濁液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜１５／８５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体９を得た（０．３９５ｇ、４２％）。

中間体１０の調製

中間体８（０．６８７ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）を１１．６ｍＬのＤＭＦ中で撹拌した溶液に、ＬｉＯＨ．Ｈ_２Ｏ（０．４９１ｇ、１１．４６ｍｍｏｌ）と２−メルカプトエタノール（０．１６４ｍＬ、２．３３ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。水を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。減圧下で濃縮して油状残渣を得た。粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、０／１００〜３０／７０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、黄色油として中間体１０を得た（０．２７６ｇ、８３％）。

中間体１１の調製

中間体１０（０．２００ｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ（６０％鉱油分散系、０．０６９ｇ、１．７１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９．２ｍＬ）中で懸濁した溶液に、窒素雰囲気下、０℃で添加した。この温度で３０分間撹拌した後、ＣＨ_３Ｉ（０．１３４ｍＬ、１．８３３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌を続けた。ＮａＨ（６０％鉱油分散系、０．０３２ｇ、０．８０２ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を３０分間撹拌した。ＣＨ_３Ｉ（０．０３２ｍＬ、０．５７３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜１５／８５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１１を得た（０．１３７ｇ、６３％）。

中間体１２の調製

ＮａＨ（６０％鉱油分散系、０．１７８ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を、（６−クロロピリジン−３−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．３６ｇ、純度７５％、４．４６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ １７１１７８−４５−３）を乾燥ＤＭＦ（７ｍＬ）中で撹拌した溶液にＮ_２下０℃で添加した。混合物を０℃で１５分間攪拌した。次に、１−ブロモ−３−フルオロプロパン（０．４９１ｍＬ、５．３５３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を室温まで温め、一晩撹拌した。さらなる１−ブロモ−３−フルオロプロパン（０．３２７ｍＬ、３．５６８ｍｍｏｌ）とＮａＨ（６０％鉱油分散系、０．１７８ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で４時間撹拌した。追加の１−ブロモ−３−フルオロプロパン（０．８１８ｍＬ、８．９２１ｍｍｏｌ）とＮａＨ（６０％鉱油分散系、０．１７８ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで溶解し、ＮＨ_４Ｃｌの飽和溶液で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、４０％〜１００％）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を真空中で蒸発させて、無色油として中間体１２を得た（１．７１ｇ、純度７５％、定量的収率）。

中間体１３の調製

方法１：ＴＦＡ（４ｍＬ、５３．３ｍｍｏｌ）を、中間体１２（１．７１ｇ、５．３３ｍｍｏｌ、純度７５％）の２０ｍＬのＤＣＭ中混合物に０℃で添加し、続いてその混合物を室温で１５０分間撹拌した。次に、混合物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液で洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、真空中で濃縮して、中間体１３（１．９１ｇ、純度５３％、定量的）を得て、これをそのまま使用した。

方法２：中間体７（０．３９５ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．６ｍＬ）中で撹拌した溶液に、ＬｉＯＨ．Ｈ_２Ｏ（０．２３９ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）と２−メルカプトエタノール（０．７９８ｍＬ、１．１３４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過した。減圧下で濃縮して油状残渣を得て、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、０／１００〜３０／７０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、黄色油として中間体１３を得た（０．１６８ｇ、９６％）。

中間体１４の調製

方法１：ホルムアルデヒド（３７％水溶液、２．１８５ｍＬ、２９．１６２ｍｍｏｌ）を、酢酸（０．８３５ｍＬ）とＭｅＯＨ（２０ｍＬ）の混合物中の中間体１３（方法１により取得、１．９１ｇ、９．７２１ｍｍｏｌ、純度５３％）溶液に添加した。続いて、ＮａＢＨ_３ＣＮ（１．８３ｇ、２９．１６２ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加した。混合物を室温で一晩（１５時間）撹拌した。ＮａＨＣＯ_３の飽和溶液を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜８０／２０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、無色油として中間体１４を得た（０．６８７ｇ、６３％）。

方法２：中間体１３（方法２により取得、０．１７２ｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ（６０％鉱油分散系、０．０５５ｇ、１．３６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７．３ｍＬ）中で撹拌した溶液に、窒素雰囲気下０℃で添加した。この温度で３０分間撹拌した後、ＣＨ_３Ｉ（０．１０７ｍＬ、１．４５９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を濾過し、乾燥させ、真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜１０／９０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１４を得た（０．１４３ｇ、７７％）。

中間体１５の調製

２−クロロ−５−ヒドロキシピリジン（０．３００ｇ、２．３１６ｍｍｏｌ）と２−フルオロエチル−４−メチルベンゼンスルホナート（０．５０５ｇ、２．３１６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ３８３−５０−６）をＤＭＦ（７ｍＬ）中に溶解させた。Ｃｓ_２ＣＯ_３（１．１３２ｇ、３．４７４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で添加した。混合物を８５℃で５時間加熱した。周囲温度まで冷却した後、暗褐色懸濁液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜３５／６５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１５を得た（０．３７４ｇ、９２％）。

中間体１６の調製

２−クロロ−５−ヒドロキシピリジン（０．３００ｇ、２．３１６ｍｍｏｌ）と３−フルオロプロピル４−メチルベンゼンスルホナート（０．５３８ｇ、２．３１６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ３１２−６８−５）をＤＭＦ（７ｍＬ）中に溶解させた。Ｃｓ_２ＣＯ_３（１．１３２ｇ、３．４７４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で添加した。混合物を８５℃で５時間加熱した。周囲温度まで冷却した後、暗褐色懸濁液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜３０／７０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１６を得た（０．４０８ｇ、９３％）。

中間体１７の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（１．７０ｇ、７．９９ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．１５２ｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．１６１ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）を、２，５−ジブロモピリジン（０．７３８ｇ、３．０５２ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ６２４−２８−２）の乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、混合物を窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、６−アミノイソキノリン（０．４００ｇ、２．７７４ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ２３６８７−２６−５）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜７５／２５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１７を得た（０．６８０ｇ、純度８０％、収率６５％）。

中間体１８の調製

１，４−ジオキサン（１０．２ｍＬ）中の中間体１７（０．６８０ｇ、１．８１２ｍｍｏｌ）を１０分間脱気した。２−［２−エトキシビニル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（０．５３８ｇ、２．７１９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ １２０１９０５−６１−４、国際公開第２０１２０１０５３８号パンフレットに記載の手順に従った調製、Ｅ体とＺ体の２：１混合物）、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２（０．０２０ｇ、０．０９０６ｍｍｏｌ）、Ｘ−Ｐｈｏｓ（０．０９５ｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）およびＣｓ_２ＣＯ_３（０．８８６ｇ、２．７１９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて脱気した水（１．１ｍＬ）を添加した。混合物をさらに１０分間脱気し、８０℃で６時間撹拌した。続いて、混合物を周囲温度まで冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機相を水と塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜１００／０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体１８を得た（０．５１０ｇ、９１％、Ｅ体とＺ体の混合物）。

中間体１９の調製

中間体１８（０．５１０ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５．３ｍＬ）中混合物にＨＣｌ（２Ｍ水溶液、３．９３９ｍＬ、７．８７７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を６０℃で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ_３をｐＨ７になるまで添加した。この混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させて中間体１９を得た。生成物をそのまま次の工程に使用した（０．３７８ｇ、８２％）。

中間体２０の調製

ＮａＢＨ_４（０．０５４ｇ、１．４３６ｍｍｏｌ）を中間体１９のＭｅＯＨ（４．５ｍＬ）溶液に０℃で添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。水を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ０／１００〜１０／９０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、中間体２０を得た（０．１３５ｇ、３５％）。

Ｂ．式［^１９Ｆ］（Ｉ）の化合物の調製
化合物１の調製

方法１：Ｋ_３ＰＯ_４（０．８７２ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０７８ｇ、０．０８５６ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０８３ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を、６−ブロモイソキノリン（０．３７２ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液に、混合物を窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、中間体１（０．１８０ｇ、１．４２７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００／０〜９５／５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をさらに、７０％Ｈ_２Ｏ（２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）−３０％ ＭｅＣＮ−ＭｅＯＨから２７％Ｈ_２Ｏ（２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）−７３％ＭｅＣＮ−ＭｅＯＨの逆相により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をＤＩＰＥでトリチュレートして、白色固体として化合物１を得た（０．１５０ｇ、４１％）。

方法２：ＫＦ（１０．２ｇ、１７５．７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２３６ｍＬ）中の中間体２（方法２により取得、９．８５ｇ、３５．１４ｍｍｏｌ）に添加した。得られた混合物を１６０℃で１６時間撹拌し、その後、ＬＣＭＳは完全な転化を示した。水およびＤＣＭを添加し、二相混合物を震盪させ、続いてｄｉｃａｌｉｔｅ（登録商標）で濾過した。有機層を分離し、水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発乾固させた。赤褐色残渣を、勾配（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、１：０〜０：１）を用いた１２０ｇシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物画分を蒸発乾固させて、茶色固体を得た。分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ−１０μｍ、５０×１５０ｍｍ、移動相：０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＭｅＯＨ）により精製を行い、溶出液を蒸発させ、水中で懸濁し、濾過し、ヘプタンで洗浄し、真空中で乾燥させて、白色結晶として化合物１を得た（１．３８ｇ、１５．５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ２．１７（ｓ，３Ｈ）６．７５（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ）７．６２（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）７．６６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ）７．９７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）８．２０（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ）８．３３（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）８．４２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ）９．０６（ｓ，１Ｈ）９．６１（ｓ，１Ｈ）

化合物２の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．４６２ｇ、２．１７５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４１ｇ、０．０４５３ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４４ｇ、０．０７５５ｍｍｏｌ）を、中間体３（０．１００ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ溶液に、混合物を窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、６−ブロモイソキノリン（０．１５７ｇ、０．７５５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １００／０〜９５／５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（（０．１％ＨＣＯＯＨ）／２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）；７０／３０〜２７／７３）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、化合物２を得た（０．０２３８ｇ、１２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δｐｐｍ２．２４（ｓ，３Ｈ）６．７２〜６．８６（ｍ，２Ｈ）７．４０〜７．６０（ｍ，３Ｈ）７．８９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）７．９３（ｂｒｓ，１Ｈ）８．４４（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）９．１０（ｂｒｓ，１Ｈ）

化合物３の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．３００ｇ、１．４１５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０２７ｇ、０．０２９５ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０２８ｇ、０．０４９１ｍｍｏｌ）を、中間体４（０．０８０ｇ、０．４９１ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、混合物を窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．０７４ｇ、０．５１６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ２３６８７−２６−５）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を９０℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、０／１００〜３／９７）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をさらに分取ＨＰＬＣ（（０．１％ＨＣＯＯＨ）／ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１）；９５／５〜６３／３７）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮して、化合物３を得た（０．０５１ｇ、３８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δｐｐｍ２．９８（ｄｔ，Ｊ＝２４．７，６．２Ｈｚ，２Ｈ）４．６４（ｄｔ，Ｊ＝４７．０，６．３Ｈｚ，２Ｈ）６．８２（ｂｒｓ，１Ｈ）６．９８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）７．４３〜７．５６（ｍ，３Ｈ）７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）７．９８（ｓ，１Ｈ）８．２２（ｓ，１Ｈ）８．４３（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）９．１０（ｓ，１Ｈ）．

化合物３はまた、代替的に中間体２０から、例えば、対応するメタンスルホナートすなわち４−トルエンスルホナートを形成し、続いてフッ化物の供給源により置換することにより作製することができる。

化合物４の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．４８１ｇ、２．２６４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４３ｇ、０．０４７２ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４５ｇ、０．０７８６ｍｍｏｌ）を、中間体６（０．１２７ｇ、０．７８６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍＬ）溶液に、窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．１２５ｇ、０．８６５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ ２３６８７−２６−５）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を９０℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン、５／９５〜１００／０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物を分取ＨＰＬＣ（（５９％Ｈ_２Ｏ（２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）−４１％ＭｅＣＮ−ＭｅＯＨから１７％Ｈ_２Ｏ（２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）−８３％ＭｅＣＮ−ＭｅＯＨ）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をｎ−ペンタンでトリチュレートして、ベージュ色固体として化合物４を得た（０．０７５ｇ、３４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δｐｐｍ５．６９（ｄ，Ｊ＝５４．６Ｈｚ，２Ｈ）６．８０（ｂｒｓ，１Ｈ）７．００（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）７．３９〜７．４７（ｍ，１Ｈ）７．５４（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）７．９７（ｓ，１Ｈ）８．２２（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）８．４３（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）９．０９（ｓ，１Ｈ）

化合物５の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．２９４ｇ、１．３８６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０２６ｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０２８ｇ、０．０４８１ｍｍｏｌ）を、中間体１０（０．０８４ｇ、０．４８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に、窒素をバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．０６９ｇ、０．４８１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０２６ｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０２８ｇ、０．０４８１ｍｍｏｌ）を、窒素をバブリングしながら添加し、混合物をさらに１００℃で一晩加熱した。Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０２６ｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０２８ｇ、０．０４８１ｍｍｏｌ）を、窒素をバブリングしながら添加し、混合物をさらに１００℃で一晩加熱した。混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、０／１００〜５０／５０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をさらに分取ＨＰＬＣ（７５％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−２５％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］から３８％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−６２％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させた。生成物をＥｔ_２Ｏでトリチュレートし、濾過して、化合物５を得た（０．０４２ｇ、３１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ３．３４〜３．４８（ｍ，２Ｈ）４．５８（ｄｔ，Ｊ＝４７．６，４．８Ｈｚ，２Ｈ）５．６３（ｂｒｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）６．８６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）７．１１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ）７．４７〜７．５７（ｍ，２Ｈ）７．７８（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）７．８７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）８．２１〜８．３１（ｍ，２Ｈ）８．９６（ｓ，１Ｈ）９．１２（ｓ，１Ｈ）

化合物６の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．４４４ｇ、２．０９２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４０ｇ、０．０４３６ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４２ｇ、０．０７２６ｍｍｏｌ）を、中間体１１（０．１３７ｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍＬ）溶液に、窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．１０５ｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。さらなるＰｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０２６ｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０２８ｇ、０．０４８１ｍｍｏｌ）を、混合物に窒素をバブリングしながら添加し、その後、混合物をさらに１００℃で一晩加熱した。混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、０／１００〜６５／３５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をさらに分取ＨＰＬＣ（７０％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−３０％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］から２７％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−７３％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させた。生成物をＥｔ_２Ｏでトリチュレートし、濾過して、化合物６を得た（０．０９２ｇ、４３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ２．９３（ｓ，３Ｈ）３．６２（ｄｔ，Ｊ＝２６．７，４．６Ｈｚ，２Ｈ）４．６０（ｄｔ，Ｊ＝４７．７，４．７Ｈｚ，２Ｈ）６．９３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）７．２８（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ）７．４６〜７．６０（ｍ，２Ｈ）７．８２〜７．９４（ｍ，２Ｈ）８．２７（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）８．３４（ｓ，１Ｈ）８．９７（ｓ，１Ｈ）９．２１（ｓ，１Ｈ）

化合物７の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．５４４ｇ、２．５６５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４９ｇ、０．０５３４ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０５２ｇ、０．０８９１ｍｍｏｌ）を、中間体１３（０．１６８ｇ、０．８９１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍＬ）溶液に、窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．１２８ｇ、０．８９１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。さらなるＰｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４９ｇ、０．０５３４ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０５２ｇ、０．０８９１ｍｍｏｌ）を、窒素流下で添加し、混合物をさらに１００℃で一晩加熱した。Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４９ｇ、０．０５３４ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０５２ｇ、０．０８９１ｍｍｏｌ）を窒素流下で添加し、混合物を１００℃で６時間加熱した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、０／１００〜４５／５５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物を分取ＨＰＬＣ（７５％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−２５％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］から０％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−１００％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させた。残渣をＤＣＭ中に溶解させ、ＨＣｌ（２−プロパノール中で５Ｍ）を添加し、得られた混合物を真空中で濃縮した。残渣をＥｔ_２Ｏでトリチュレートし、濾過して、橙色固体として化合物７を得た（０．０６６ｇ、収率２２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ１．８３〜２．０５（ｍ，２Ｈ）３．１７（ｂｒｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）４．５８（ｄｔ，Ｊ＝４７．４，５．８Ｈｚ，２Ｈ）５．８３（ｂｒｓ，１Ｈ）７．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）７．１２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．７Ｈｚ，１Ｈ）７．７７（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．２Ｈｚ，１Ｈ）７．８１（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）７．９９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）８．２０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．２８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）８．４２（ｓ，１Ｈ）９．３０（ｓ，１Ｈ）１０．０８（ｓ，１Ｈ）

化合物８の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．４３１ｇ、２．０３２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０３９ｇ、０．０４２３ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４１ｇ、０．０７０６ｍｍｏｌ）を、中間体１４（０．１４３ｇ、０．７０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５．９ｍＬ）溶液に、混合物を窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．１０２ｇ、０．７０６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。追加のＰｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０３９ｇ、０．０４２３ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４１ｇ、０．０７０６ｍｍｏｌ）を、混合物に窒素をバブリングしながら添加し、その後、混合物を１００℃で一晩加熱した。追加のＰｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０３９ｇ、０．０４２３ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４１ｇ、０．０７０６ｍｍｏｌ）を、窒素をバブリングしながら添加し、混合物を１００℃で６時間加熱した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、０／１００〜２０／８０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をさらに分取ＨＰＬＣ（７５％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−２５％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］から０％［２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３］−１００％［ＡＣＮ：ＭｅＯＨ １：１］）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させた。粗製物をＤＣＭ中に溶解させ、ＨＣｌ（２−プロパノール中で５Ｎ）を添加し、混合物を真空中で濃縮した。残渣をＥｔ_２Ｏでトリチュレートし、濾過して、橙色固体として化合物８を得た（０．０５８ｇ、２３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ１．７８〜２．０２（ｍ，２Ｈ）２．９２（ｓ，３Ｈ）３．４５（ｂｒｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）４．５２（ｄｔ，Ｊ＝４７．４，５．７Ｈｚ，２Ｈ）７．０９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）７．２９（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．０Ｈｚ，１Ｈ）７．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ）７．９１（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ）７．９８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）８．２１（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．２９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）８．５１（ｓ，１Ｈ）９．３２（ｓ，１Ｈ）１０．２０（ｓ，１Ｈ）

化合物９の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．４４９ｇ、２．１１７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４０ｇ、０．０４４１ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４３ｇ、０．０７３５ｍｍｏｌ）を、中間体１５（０．１４２ｇ、０．８０９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に、混合物に窒素をバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．１０６ｇ、０．７３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。室温まで冷却した後、混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜４０／６０）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。生成物をジ−イソプロピルエーテルでトリチュレートし、濾過して、ベージュ色固体として化合物９を得た（０．１１６ｇ、５５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ４．２８（ｂｒｄｔ，Ｊ＝３０．２，３．３Ｈｚ，２Ｈ）４．７５（ｂｒｄｔ，Ｊ＝４７．９，３．３Ｈｚ，２Ｈ）６．９９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）７．４３（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，１Ｈ）７．５２〜７．６８（ｍ，２Ｈ）７．９３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）８．０７（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）８．３０（ｂｒｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）８．４２（ｓ，１Ｈ）９．０２（ｓ，１Ｈ）９．４４（ｓ，１Ｈ）

化合物１０の調製

Ｋ_３ＰＯ_４（０．４４９ｇ、２．１１７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．０４０ｇ、０．０４４１ｍｍｏｌ）およびＸａｎｔｐｈｏｓ（０．０４３ｇ、０．０７３５ｍｍｏｌ）を、中間体１６（０．１５３ｇ、０．８０９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に、混合物を窒素でバブリングしながら添加した。１０分後、イソキノリン−６−アミン（０．１０６ｇ、０．７３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、混合物を１００℃で１６時間加熱した。混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー；（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ヘプタン ０／１００〜３５／６５）により精製した。所望の画分を回収し、真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ中に溶解させ、ＨＣｌ（２−プロパノール中で５Ｎ）を添加し、混合物を真空中で濃縮した。残渣をＤＩＰＥでトリチュレートし、濾過して、黄色固体として化合物１０を得た（０．１４７ｇ、４７％）。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ２．００〜２．２３（ｍ，２Ｈ）４．１６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）４．６３（ｄｔ，Ｊ＝４７．３，５．８Ｈｚ，２Ｈ）７．１８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）７．５１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．０Ｈｚ，１Ｈ）７．９１（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．４Ｈｚ，１Ｈ）８．０７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）８．１３（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ）８．２８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．３４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）８．６３（ｓ，１Ｈ）９．４１（ｓ，１Ｈ）１０．４４（ｓ，１Ｈ）

Ｃ．放射性標識合成
材料および方法
概要
Ｔ８０８に対する非放射性の基準物質は、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ＮＶ部門、Ｂｅｅｒｓｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）により文献報告（Ｄｅｃｌｅｒｃｑ Ｌ．，Ｃｅｌｅｎ Ｓ．，Ｌｅｃｉｎａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ２０１６，１５，１−１５１）に従って合成された。化学薬品および試薬はすべて民間の販売元から購入し、さらに精製することなく使用した。ＨＰＬＣ分析を、２５４ｎｍに設定されたＵＶ検出器に接続したＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において行った。放射標識化合物の分析については、ＨＰＬＣ溶出液を、ＵＶ検出器を通過させた後に、単一チャネル分析器に接続した３インチＮａＩ（Ｔｌ）シンチレーション検出器（ＧＡＢＩボックス；Ｒａｙｔｅｓｔ、Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ヘと導いた。ＧＩＮＡ Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ）データ取得システムを使用して、データを取得し、分析した。

化合物番号１のトリチウム化

化合物番号１（１．７４ｍｇ、６．８７μｍｏｌ）およびクラブトリー触媒とも称される（１，２，５，６−η）−１，５−シクロオクタジエン］（ピリジン）（トリシクロヘキシルホスフィン）イリジウム（Ｉ）ヘキサフルオロホスファート（７．７２ｍｇ、９．５９μｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（０．６ｍＬ）中に溶解させた。明橙色溶液をＲＣ Ｔｒｉｔｅｃのトリチウム化用マニホールドで３回脱気し、続いてトリチウムガス（８．９Ｃｉ）雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。反応中に達した最大圧力は８８２ｍｂａｒであった。反応後、真空下で溶媒を除去した。メタノール（０．８ｍＬ）の添加、溶液の撹拌、および再度真空下で溶媒を除去することにより、不安定なトリチウムを交換した。このプロセスを３回繰り返して、乾燥した固体の粗生成物を得た。

粗生成物をＨＰＬＣ法：Ｍａｃｈｅｒｅｙ＋Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｇｒａｖｉｔｙ Ｃ１８、５μｍ、８×１５０ｍｍカラム；移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを有する水、Ｂ：０．１％ＴＦＡを有するアセトニトリル；２７％Ｂの均一濃度；流速３．１ｍＬ／分、２３０ｎｍおよび２５４ｎｍ、２０℃により精製した。ＨＰＬＣの後、回収した生成物画分のｐＨをＮａＨＣＯ_３水溶液（１０％）により中性にした。混合物の量を回転蒸発器により減少させた。続いて、生成物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（３ｍＬ、１００ｍｇ）で抽出し、これをエタノール（５ｍＬ）で溶出させた。収容した生成物を塩基性条件下のＨＰＬＣ：Ｍａｃｈｅｒｅｙ＋Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｓｐｈｉｎｘ ＲＰ、５μｍ、８×１５０ｍｍ；移動相Ａ：０．０５％ＮＨ_４ＯＨを有する１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ：アセトニトリル；４６．５％Ｂの均一濃度；流速３．１ｍＬ／分、２３０ｎｍおよび２５４ｎｍ、２０℃により精製した。回収した生成物画分の量を回転蒸発器により減少させた。続いて、生成物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（３ｍＬ、１００ｍｇ）で抽出し、これをエタノール（５ｍＬ）で溶出させた。

［^３Ｈ］化合物番号１の放射化学的純度は、以下のＨＰＬＣ法：カラム：Ｍａｃｈｅｒｅｙ＋Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｓｐｈｉｎｘ ＲＰ（５μｍ）、４．６×１５０ｍｍ、カラム温度：３０℃、移動相Ａ：水中に０．０５％ ｖ／ｖ ＮＨ_４ＯＨを有する１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、移動相Ｂ：アセトニトリル、流速：１．０ｍＬ／分、注入量：５μＬ、検出波長：２５４ｎｍのＵＶ、溶出勾配：０〜２０分で５％Ｂから９５％Ｂへの勾配；２０〜２５分で９５％Ｂの均一濃度；２５〜２５．５分で９５％Ｂから５％Ｂへの勾配、により９９％より高いと決定された。

比放射能は、質量分析により５７．７ｍＣｉ／ｍｍｏｌであると決定された。ＬＣＭＳ条件：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８（１．８μｍ）２．１×５０ｍｍカラム；移動相Ａ：水０．１％ギ酸、Ｂ：ＭｅＣＮ０．１％ギ酸；０分５％Ｂ；０．２分５％Ｂ；５分８０％Ｂ；流速０．６ｍＬ／分；注入１．０μＬ（１．０６μＣｉ、３９．２ＫＢｑ）、ＵＶ検出２２５ｎｍ；温度６０℃。

放射性フッ素化化合物番号１（Ｎ＝６）

フルオリド−１８（［^１８Ｆ］Ｆ⁻）を、Ｃｙｃｌｏｎｅ１８／９サイクロトロン（Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｕｖａｉｎ−ｌａ−Ｎｅｕｖｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で、２ｍＬの９７％濃縮^１８Ｏ−Ｈ_２Ｏ（Ｒｏｔｅｍ ＨＹＯＸ１８，Ｒｏｔｅｍ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｅｒ Ｓｈｅｖａ、Ｉｓｒａｅｌ）を１８−ＭｅＶプロトンで照射することによる^１８Ｏ（ｐ，ｎ）^１８Ｆ核反応によって生成した。照射後、［^１８Ｆ］Ｆ⁻を、ＳｅｐＰａｋ Ｌｉｇｈｔ Ａｃｃｅｌｌ ｐｌｕｓ ＱＭＡ陰イオン交換カートリッジ（ＣＯ_３ ^２−型、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に捕捉し、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ ２．２．２（Ｋ−２２２、２７．８６ｍｇ）とＫ_２ＣＯ_３（２．４６ｍｇ）のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．７５ｍＬ；９５：５ ｖ／ｖ）中に溶解した混合物により溶出した。８０℃のヘリウム流および３５Ｗ（マイクロ波キャビティ）で溶媒を蒸発させた後、無水ＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）を添加し、［^１８Ｆ］Ｆ⁻を同じ条件下でさらに乾燥させた。０．５０ｍｇのニトロ前駆体の０．２５ｍＬ ＤＭＳＯ溶液を、乾燥［^１８Ｆ］Ｆ⁻／Ｋ_２ＣＯ_３／Ｋ−２２２残渣に添加し、混合物をマイクロ波キャビティ中において１６０℃および５０Ｗで１０分間加熱した。粗製放射標識混合物を、０．６ｍＬの調製用緩衝液（０．０１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．４およびＥｔＯＨ（６０：４０ ｖ／ｖ））で希釈し、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．４とＥｔＯＨとの混合物（６０：４０ ｖ／ｖ）により流速０．８ｍＬ／分で溶出され、２５４ｎｍのＵＶ検出を用いるＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ_１８カラム（５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製した。［^１８Ｆ］化合物番号１は２７分で溶出した。精製された放射性トレーサー溶液を生理食塩水で希釈して、静脈内注射に好適な、１０％未満のエタノール濃度を得た。続いて、溶液を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に通過させて滅菌生成物を得た。品質管理を、０．０１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｐＨ７．４とＣＨ_３Ｎとの混合物（６８：３２ ｖ／ｖ）により流速０．８ｍＬ／分で溶出されるＸＢｒｉｄｇｅカラム（Ｃ_１８、３．５μｍ、３．０ｍｍ×１００ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上のＲＰ−ＨＰＬＣを使用して行った。ＵＶ検出を２５４ｎｍで行った。［^１８Ｆ］化合物番号１は８分で溶出した。［^１８Ｆ］化合物番号１を、平均、減衰補正それぞれについて放射化学的収率１２％（分取クロマトグラムにおける［^１８Ｆ］Ｆ⁻の放射能に対して、ｎ＝６）で得た。放射化学的純度はＨＰＬＣを使用して分析用Ｃ_１８カラムで試験し、９９％を超えていた。［^１８Ｆ］化合物番号１は全合成時間６０分以内で得られ、合成の最後に（ＥＯＳ、ｎ＝６）平均比放射能８５ＧＢｑ／μｍｏｌで回収した。

Ｄ．分析的な要素
融点
値はピーク値または融解範囲のいずれかであり、この分析方法に通常付随する実験上の不確実性を伴って得られる。

いくつかの化合物について、ＤＳＣ８２３ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）（ＤＳＣとして示される）により融点を決定した。融点を、１０℃／分の温度勾配で測定した。最高温度は３００℃であった。

いくつかの化合物について、融点を、開放毛細管中でＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＭＰ５０により決定した。融点を、１０℃／分の温度勾配で測定した。最高温度は３００℃であった。融点データをデジタル表示装置から読み取り、ビデオ録画システムで確認した。

ＬＣ／ＭＳ法
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定は、各方法に明記したＬＣポンプ、ダイオードアレイ（ＤＡＤ）検出器またはＵＶ検出器およびカラムを使用して行った。必要ならば、追加の検出器を含めた（下の方法の表を参照されたい）。

カラムからの流れを、大気圧イオン源を装備した質量分析計（ＭＳ）に導入した。化合物の公称モノアイソトピック分子量（ＭＷ）の特定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えば、走査範囲、データ取込時間など）を設定することは当業者の知識の範囲内である。データ取得は、適切なソフトウェアを用いて行った。化合物は、それらの実測保持時間（Ｒ_ｔ）およびイオンで表される。データの表で別に指定しない場合、報告した分子イオンは、［Ｍ＋Ｈ］^＋（プロトン化分子）および／または［Ｍ−Ｈ］⁻（脱プロトン化分子）に対応する。化合物を直接イオン化できなかった場合、付加物の種類を記載する（すなわち、［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋、［Ｍ＋ＨＣＯＯ］⁻など）。複数の同位体パターンを持った分子（Ｂｒ、Ｃｌなど）については、報告される値は、最も低い同位体質量について得られた値である。すべての結果は、用いられた方法に通常付随する実験的不確実性を伴って得られた。

以下、「ＳＱＤ」はシングル四重極検出器を意味し、「ＭＳＤ」は質量選択検出器を意味し、「ＲＴ」は室温を意味し、「ＢＥＨ」は架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッドを意味し、「ＤＡＤ」はダイオードアレイ検出器を意味し、「ＨＳＳ」は高強度シリカを意味する。

ＣＨＮの定量および水の定量
いくつかの化合物について、炭素、水素および窒素（ＣＨＮ）の量（％ｗ／ｗ）を、Ｆｉｓｏｎｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＥＡ １１０８ ＣＨＮ分析器による動的フラッシュ燃焼により決定した。

いくつかの化合物について、水（％ｗ／ｗ）を、ＣＡ−０２水分計（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）のカール・フィッシャー滴定に適用される電量測定の原理により決定した。

Ｅ．生物学的な要素
材料および方法
概要
生体内分布および放射性代謝物の試験の、試料中の放射能の定量化を、試料交換器中に据えた、多チャネル分析器に連結した３インチＮａＩ（Ｔｌ）ウェル型結晶を備えた自動γ計数管（Ｗａｌｌａｃ ２４８０ Ｗｉｚａｒｄ ３ｑ、Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して行った。値はバックグラウンド放射、物理的減衰および計数管不感時間について補正される。齧歯動物を、温度調節され（約２２℃）、湿度制御された施設の中の個別に換気されたケージに収容し、１２時間−１２時間明暗周期下で、餌および水を自由に摂れるようにした。動物実験はすべて、大学動物倫理委員会の許可を得てから、ベルギーの、動物のケアおよび使用についての実施規定に従って行った。

ヒトＡＤ脳からの凝集タウおよびアミロイド斑の単離
濃縮した凝集タウ画分を、ＧｒｅｅｎｂｅｒｇおよびＤａｖｉｅｓが記述したプロトコル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ｇ．，Ｄａｖｉｅｓ Ｐ．Ａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ Τ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９０；８７：５８２７−５８３１）を若干変更したバージョンに従い、ヒトＡＤ脳組織（タウ原線維の量が多い後頭皮質）を使用して調製した。手短に言えば、凍結したヒトＡＤ脳試料（約１０ｇ）を、１０体積の冷却した均質化緩衝液（１０ｍＭトリス、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％スクロース、ｐＨ７．４、ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼおよびｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有）を使用して、氷上で均質化した。２７０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離した後、上清を回収し、１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを添加した。Ｎ−ラウロイルサルコシン／２−メルカプトエタノールの上清を、オービタルシェーカーで振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。続いて、１０８０００×ｇにて室温で１．５時間超遠心分離して、凝集タウを濃縮してペレットにした。上清を除去し、ペレットを少量のＴＢＳ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で慎重に２回すすいだ。最後に、凝集タウのペレットをＴＢＳ中に回収し、再懸濁させて試料の均質性を確保した。少量に等分して−８０℃で保管した。

濃縮した凝集β−アミロイド標本を、凍結したヒトＡＤ脳試料（１０ｇ−アミロイド斑の量が多い後頭皮質）から調製し、これを７倍体積の冷却した均質化緩衝液（２５０ｍＭスクロース、２０ｍＭトリス塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡならびにＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼおよびｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤）を使用して氷上で均質化した。２７０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離した後、細胞片を除去した。アミロイド斑を含有する上清を等分し、−８０℃で保管した。

ＩＮ ＶＩＴＲＯ競合放射性リガンド結合アッセイ
競合放射性リガンド結合アッセイにより、用量反応濃度範囲の試験化合物の存在下で、放射標識した参照リガンドの結合を測定する。

手短に言えば、凝集タウ標本を、５％エタノールを含むＰＢＳ緩衝液に、１００μｇタンパク質／ｍｌまで希釈した。９６ウェル形式で、２０μｇタンパク質の凝集タウ標本の存在下にて、^３Ｈ−Ｔ８０８（比放射能；３２．９７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度１０ｎＭで、漸増量の試験化合物に添加した。非特異的結合を、５０μＭチオフラビンＴ（一般的なβシート結合剤）の存在下で残存するカウント数として定義した。室温で２時間インキュベートしてから、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ９６ハーベスター装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｚａｖｅｎｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、ＧＦ／Ｂガラスフィルターで結合混合物を濾過することにより、結合していないリガンドを除去する。２０％エタノールを含有するＰＢＳ緩衝液で、フィルターを３回洗浄した。フィルタープレートを一晩乾燥させてから、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ Ｏ液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、原線維に結合した放射標識リガンドの量を、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、ＵＳＡ）にて、液体シンチレーション計数により測定する。

半数阻害濃度（ＩＣ_５０）の値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、少なくとも２つの独立した実験の置換曲線から決定した。

凝集β−アミロイドに結合する化合物を判定するために、同様のアッセイを採用したが、いくつかの軽微な変更を加えた。手短に言えば、アミロイド標本を、０．１％ＢＳＡおよび５％エタノールを含む５０ｍＭトリスに、１５０μｇタンパク質／ｍｌまで希釈した。３０μｇタンパク質のアミロイド斑標本の存在下で、^３Ｈ−ＡＶ−４５（フロルベタピル−比放射能；４５．９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度１０ｎＭで、漸増量の試験化合物に添加した。非特異的結合を、５００μＭのチオフラビンＴの存在下で測定した。室温で１５０分インキュベートしてから、ＧＦ／Ｂガラスフィルターで結合混合物を濾過した。２０％エタノールを含有するＰＢＳ緩衝液で、フィルターを３回洗浄した。その後の工程は凝集タウ標本について説明したものと同一とした。

［^１９Ｆ］化合物番号１は、この放射標識置換アッセイにおいて、［^３Ｈ］−Ｔ８０８を用いて抽出されたヒトタウに対して強力な結合（ｐＩＣ_５０ ８．２４、２．４ｎＭのＫ_ｉに相当する）を示し、［^３Ｈ］−ＡＶ−４５を用いて抽出されたヒトアミロイド−β凝集体に対して弱い結合（ｐＩＣ_５０ ５．１８、３．２μＭのＫ_ｉに相当する）を示した。

免疫組織化学検査（ＩＨＣ）：Ｍ＆Ｍヒト脳
ヒトＡＤ脳の塊（ブラーク病期Ｖ−ＶＩ）を瞬間凍結し、クライオスタットでスライスし（２０μｍ厚）、免疫組織化学検査に使用するまで−８０℃で保管した。切片を乾燥させ、ホルマリン中に固定し、過酸化水素（ＤＡＫＯ、Ｓ２０２３）で５分間、およびブロッキング試薬（ＰＢＳ１ｘ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で１時間インキュベートした。抗アミロイド抗体または抗タウ抗体［（４Ｇ８、Ｃｏｖａｎｃｅ、ＳＩＧ−３８２２０）、バックグラウンド低減成分（ＤＡＫＯ、Ｓ３０２２）を含む１／５００希釈の抗体希釈液、または（ＡＴ８（Ｂｉｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２，１１（４）：１５９３−７）、内製、１ｍｇ／ｍｌ原液濃度）、バックグラウンド低減成分（ＤＡＫＯ、Ｓ３０２２）を含む０．２μｇ／ｍＬの抗体希釈液］を切片に１時間適用した。線条体組織を抗ＭＡＯ−Ｂ抗体および抗ＭＡＯ−Ａ抗体（１：１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により免疫標識して、ＭＡＯ発現を確認した。

広範な洗浄の後に、スライドをＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＤＡＫＯ、Ｋ４０００）とともにインキュベートし、続いて発色性のＤＡＢ標識（ＤＡＫＯ、Ｋ３４６８）を行った。ヘマトキシリンで対比染色してから、切片を脱水し、有機封入剤（Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ、Ｈ−５０００）で封入した。図１ｃは、４Ｇ８のＩＨＣで検出したＡＤ脳におけるβ−アミロイド病態を示し、図１ｂは、ＡＴ８のＩＨＣで検出したＡＤ脳におけるタウ病態を示す。

オートラジオグラフィー試験
ａ）ＡＤ患者（ブラーク病期Ｖ−ＶＩの６８歳女性）の風乾凍結した１０μｍ厚の視覚野切片を［^１８Ｆ］化合物番号１（切片当たり７．４ｋＢｑ／５００μＬ）とともに６０分間インキュベートし、続いて、他で記載されているように、ＰＢＳとエタノールとの混合物で洗浄した（Ｘｉａ Ｃ．Ｆ．，Ａｒｔｅａｇａ Ｊ．，Ｃｈｅｎ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ．２０１３，１−１１）。結合の特異性を評価するために、１μＭの標準Ｔ８０８または化合物番号１の存在下で、切片をトレーサーとともにインキュベートした。切片を乾燥させてから蛍光貯蔵スクリーン（超解像度スクリーン、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に曝露した。スクリーンをＣｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で読み出し、Ｏｐｔｉｑｕａｎｔソフトウェアを使用して分析した。結果を平方ｍｍ当たりのデジタル光単位（ＤＬＵ／ｍｍ^２）として表す。隣接するＡＤ切片を抗タウ抗体（ＡＴ８）および抗Ａβ抗体（４Ｇ８）で免疫染色して、［^１８Ｆ］化合物番号１の結合と関連付けた。

ヒトＡＤ切片に対する［^１８Ｆ］化合物番号１によるデジタルオートラジオグラフィーは、皮質のタウリッチ領域への高くかつ選択的な結合性を示した（図１Ａ）。隣接する切片で実施されたタウ抗体およびＡβ抗体による免疫組織化学検査により、多数のＮＦＴおよび老人斑沈着物が同定され、ＮＦＴに結合するトレーサーの共局在が確認された（図１、それぞれＢおよびＣ）。これらのＮＦＴへのトレーサー結合の特異性を評価するために、基準化合物である化合物番号１および構造的な関連のない基準化合物Ｔ８０８による阻害試験を行った（図２）。非放射性の化合物番号１による自己阻害は、９９％の阻害を引き起こしたが、これは［^１８Ｆ］化合物番号１の結合が特異的であることを実証している。１μＭのＴ８０８存在下では、［^１８Ｆ］化合物番号１の結合が９９％減少し、タウ特異的結合を示しているが、それは、Ｔ８０８が、凝集タウに対して高親和性（Ｋ_Ｄ＝２２ｎＭ）であり、かつＡβ凝集体よりもタウに対して高い選択性を有する（２７倍）ことが報告されたためである（Ｚｈａｎｇ Ｗ．，Ａｒｔｅａｇａ Ｊ．，Ｃａｓｈｉｏｎ Ｄ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．２０１２，３１（３），６０１−６１２）。

ｂ）［^３Ｈ］化合物番号１は、タウ病態およびＡβ病態を含有するＡＤ脳の凍結切片に結合するが、Ａβ斑のみを含有するタウ病態陰性ＡＤ組織には結合しない（図３Ｄ、Ｅ）。トレーサーを１０ｎＭで試験し、この試験ではより高い濃度を検討しなかった。重要なこととして、［^３Ｈ］化合物番号１はまた、ＭＡＯに富むヒト組織（線条体）への結合を示さない（図３Ａ）。これらのデータは、本発明者らの化合物がＡβ病態およびＭＡＯよりもタウ病態に選択的であることを支持している。

比較して、ＴＨＫ−５３５１はＭＡＯにも結合すると知られているため、タウトレーサー［^３Ｈ］−ＴＨＫ−５３５１およびＡβトレーサー［^３Ｈ］−ＡＶ−４５を使用した。これらの実験は、１０ｎＭの［^３Ｈ］−ＴＨＫ−５３５１がＭＡＯに富むヒト組織に結合し、この結合は１０μＭのＴＨＫ−５３５１（非放射性）により自己阻害され得るが、１０μＭの化合物番号１（非放射性）によっても自己阻害され得ることを示している（図３Ｆ〜Ｈ）。これは、より高い濃度の化合物番号１がＭＡＯに結合できることを示す。

［^３Ｈ］−ＴＨＫ５３５１はまた、Ａβ斑（タウ陰性）のみを含有するＡＤ組織にも結合し、それによりＴＨＫ−５３５１の低い選択性が確認される（図３Ｉ、Ｊ）。

［^３Ｈ］−ＡＶ−４５（Ａβ斑に対して選択的）は、予想されるように、タウ病態およびＡβ病態（Ａβ＋／タウ＋、組織＃２８３９１）のヒト組織、ならびにＡβ病態のみ（Ａβ＋／タウ−、組織＃９２／０５０）のヒト組織の両方に結合する（図３Ｌ〜Ｍ）。この試験に使用されるヒトＡＤ組織（組織＃２８３９１：図４、組織＃９２／０５０：図５）および線条体組織（図６）に対する対照として、免疫組織化学検査を行った。ヒトＡＤ組織（＃２８３９１；＃９２／０５０）を４Ｇ８（抗アミロイド抗体）およびＡＴ８（抗タウ抗体）により免疫標識し、これらのヒトＡＤ組織は、＃２８３９１由来の切片がＡβ＋／タウ＋であるのに対して、＃９２／０５０由来の切片がＡβ＋／タウ−であることを明白に実証している（図４および５）。さらに、ヒト線条体組織（＃Ｓ９６／０３７）におけるＭＡＯ−ＢおよびＭＡＯ−Ａの発現を、免疫組織化学検査を用いて確認した（図６）。これらのデータは、図３で観察されるｉｎ ｖｉｔｒｏ結合による結論を支持している。

ｃ）［^１８Ｆ］化合物番号１のヒトＡＤ組織への結合を、報告されたＭＡＯ結合剤の存在下で評価した。図７において見ることができるように、０．２ｍＣｉ／ｍＬの［^１８Ｆ］化合物番号１は、これらのヒトＡＤ切片におけるタウ病態に対して強い結合を示した（図７Ａ）。この結合パターンは、試料を、Ａ−サブタイプに対して中程度の選択性を有する強力な不可逆的ＭＡＯ結合剤である１０μＭのクロルギリン（図７Ｂ）、または強力な不可逆的ＭＡＯ−Ｂ結合剤である１０μＭのセレギリン（デプレニール）（図７Ｃ）とともにインキュベートした場合に維持された。［^１８Ｆ］化合物番号１の結合は、１０μＭの標準の化合物番号１により全体的に阻害することができた（図７Ｄ）。隣接するＡＤ切片を抗タウ（ＡＴ８）抗体および抗Ａβ（４Ｇ８）抗体で免疫染色して、［^１８Ｆ］化合物番号１の結合と関連付けた（図８）。

マイクロＰＥＴ画像化試験
ウィスターラット
［^１８Ｆ］化合物番号１または［^１８Ｆ］Ｔ８０７による動的な１２０分のμＰＥＴスキャンを、３匹の雌ウィスターラットに対してＦｏｃｕｓ ２２０ μＰＥＴスキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）により同時に取得した。すべての手順の間、ラットをガス麻酔下に維持した（流速１Ｌ／分のＯ_２中の２．５％イソフルラン）。スキャンをリストモードで取得し、取得データを２４の時間枠（４×１５秒、４×６０秒、５×１８０秒、８×３００秒、３×６００秒）でフーリエリビニングした。データを３次元最大事後確率法（３Ｄ−ＭＡＰ）により再構成し、アフィン変換を使用して、Ｐａｘｉｎｏｓの座標におけるラット脳^１８Ｆ−ＦＤＧテンプレートに手作業で位置合わせをして、事前定義した関心体積（ＶＯＩ）分析を可能にした（Ｃａｓｔｅｅｌｓ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００６，４７，１８５８−１８６６）。全脳の時間放射能曲線（ＴＡＣ）を、ＶＯＩを使用して、ＰＭＯＤソフトウェア（ｖ３．２、ＰＭＯＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｚｕｅｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で生成した。脳内の放射能濃度を、トレーサー注射後の時間の関数としての標準取込値（ＳＵＶ、（脳内放射能Ｂｑ／ｍＬ）／（全注入量（Ｂｑ）／体重ｇ）で計算）として表した。約５０ＭＢｑの放射性トレーサーのＩＶ注射の直後にスキャンを開始した（ｎ＝３／トレーサー）。前処置および置換試験のために、非放射性の基準化合物である化合物番号１またはＴ８０７を、５％ＤＭＳＯ、５％Ｔｗｅｅｎ ８０および４０％（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの混合物中に溶解させ、注射の前に０．２２μｍメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過した。前処置（ｎ＝１）を、放射性トレーサー注射の６０分前に、１０ｍｇ／ｋｇの化合物番号１またはＴ８０７を皮下（ＳＣ）注射することにより行った。置換（ｎ＝１）を、放射性トレーサー注射の３０分後に、１ｍｇ／ｋｇの化合物番号１またはＴ８０７をＩＶ注射することにより行った。μＰＥＴ画像を非処置のラットで取得したベースラインスキャン（ｎ＝１）と比較した。

［^１８Ｆ］化合物番号１およびベンチマークの化合物［^１８Ｆ］Ｔ８０７の１２０分のベースライン、前処置および追跡試験の結果を、図９〜１１に示す（時間放射能曲線、ＴＡＣおよび％ＳＵＶ_最大値）。［^１８Ｆ］化合物番号１のベースラインスキャンのＴＡＣ（図９）は、脳への初期取り込みが高く、［^１８Ｆ］Ｔ８０７の約１．８（図１０）と比較して、約２．０という高強度の脳内ＳＵＶ値であったことを示した。骨への取り込みは、両化合物についてより後の時点で観察された。［^１８Ｆ］化合物番号１は、％ＳＵＶ_最大値曲線に示されるように（図１１）、［^１８Ｆ］Ｔ８０７（注射後６０分で０．４のＳＵＶ値）と比較して、より速い脳からの洗い出し率（注射後６０分で０．２のＳＵＶ値）を有した。自己阻害作用も自己追跡作用も［^１８Ｆ］化合物番号１には観察されなかったが、これは、脳内に、特異的な非タウ関連の結合は存在しないことを示すものである（図９）。前処置試験と比較して、［^１８Ｆ］Ｔ８０７のベースラインスキャンの間、より少ない脳への取り込みが記録されたが、これは、おそらく代謝酵素および／または血漿タンパク質の飽和に起因していた（図１０）。同様の作用が追跡試験において注射後４０分で観察された。

マイクロＰＥＴ画像化試験
アカゲザル
［^１８Ｆ］化合物番号１または［^１８Ｆ］Ｔ８０７を使用した動的な１２０分のμＰＥＴスキャンを、Ｆｏｃｕｓ ２２０ μＰＥＴスキャナーを用いて、筋肉内（ＩＭ）注射によりケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標））およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））で鎮静状態にしたアカゲザル（６歳の雄アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、７．６ｋｇ）に行った。スキャン中、サルに、追加用量のケタミン／キシラジンをＩＶ注射により反復投与した。血液中Ｏ_２飽和、呼吸頻度および心拍頻度を、全実験中モニターした。動物の頭部をμＰＥＴスキャナーの撮像視野の中央に置いた。スキャンをリストモードで取得し、２４の時間枠（４×１５秒、４×６０秒、５×１８０秒、８×３００秒、３×６００秒）でフーリエリビニングした。データを、３次元最大事後確率（３Ｄ−ＭＡＰ）反復再構成法を使用して再構成した。全脳のＴＡＣを、ＶＯＩを使用して、ＰＭＯＤソフトウェアで生成した。脳内の放射能濃度を、トレーサー注射後の時間の関数としてのＳＵＶとして表す。スキャンを、１８５ＭＢｑの［^１８Ｆ］化合物番号１または［^１８Ｆ］Ｔ８０７を右肢の伏在静脈にＩＶ注射した直後に開始した。前処置試験のために、非放射性の基準化合物である化合物番号１を、１０％ＤＭＳＯおよび４０％（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンの混合物中に溶解させ、注射の前に０．２２μｍメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過した。前処置（ｎ＝１）を、１ｍｇ／ｋｇの非放射性の化合物番号１および放射性トレーサー溶液を同時ＩＶ注射することにより行った。μＰＥＴ画像を非処置のサルで取得したベースラインスキャン（ｎ＝１）と比較した。

［^１８Ｆ］化合物番号１および［^１８Ｆ］Ｔ８０７の１２０分ベースラインスキャンの結果を図１２〜１４（ＴＡＣおよび％ＳＵＶ_最大値）に示す。脳内の［^１８Ｆ］化合物番号１のベースラインスキャンのＴＡＣは、脳への初期取り込みが高く（全脳において約５．４のＳＵＶ値）、洗い出しが速いことを示す（図１２）。脳内の［^１８Ｆ］Ｔ８０７のベースラインスキャンのＴＡＣは、脳への初期取り込みがより遅く（約１．３のＳＵＶ値）かつ洗い出しもより遅いことを示す（図１３）。［^１８Ｆ］化合物番号１の均一な分布は、観察したすべての脳領域において記録され、脳梁中の取り込みは増加しなかった。頭蓋側面のＴＡＣは、ＳＵＶシグナルが時間の関数として増加していないため、注射後１２０分に観察される遊離の^１８Ｆ−フルオリドの骨への取り込みはないことを示す。

Claims (13)

1. 式（Ｉ）
   
   （式中、
   少なくとも１つの原子は放射性であり、ならびに
   Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１がＦであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３がＦであるかのいずれかであり；または
   Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ、
   −ＯＣ_１〜４アルキル−Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
   の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
2. 請求項１に記載の化合物であって、式（Ｉ’）
   
   （式中、
   Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１が^１８Ｆであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が^１８Ｆであるかのいずれかであり；または
   Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−^１８Ｆ、−ＯＣ_１〜４アルキル−^１８Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−^１８Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
   を有する化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
3. 請求項１または２に記載の化合物であって、前記化合物が、
   
   またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
5. 前記組成物が滅菌溶液である、請求項４に記載の医薬組成物。
6. タウ凝集体を結合させ、画像化するのに使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物。
7. 対象の脳内のタウ凝集体の画像診断に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物。
8. タウオパチーに罹患している、または罹患している疑いのある患者のタウ凝集体を結合させ、画像化するのに使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物。
9. タウ凝集体を結合させ、画像化するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物の使用。
10. 請求項１または２に記載の化合物の調製方法であって、請求項１または２に記載の（ａ）式（Ｐ−ａ１）の化合物もしくは（ｂ）式（Ｐ−ａ２）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物とフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を好適な条件下で反応させる工程、あるいは請求項１または２に記載の（ｃ）式（Ｐ−ｂ１）の化合物もしくは（ｄ）式（Ｐ−ｂ２）の化合物もしくは（ｅ）式（Ｐ−ｂ３）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、塩化メタンスルホニルもしくは塩化４−トルエンスルホニルなどの活性化試薬を塩基の存在下で反応させ、その後、得られたメタンスルホナートまたは４−トルエンスルホナートとフッ化物^１８Ｆ⁻の供給源を好適な条件下で反応させる工程
    
    （式中、Ｒ^１、Ｒ^３およびＲ^４は請求項１または２に記載の通りである）
    を含む、方法。
11. 式（Ｐ−１）
    
    （式中、
    Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１が、Ｂｒ、−ＮＯ_２、−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋、および４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−からなる群から選択され、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３が、Ｂｒ、−ＮＯ_２、−［Ｎ（ＣＨ_３）_３］^＋、および４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−からなる群から選択されるかのいずれかであり；またはＲ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、
    −Ｃ_１〜４アルキル−Ｂｒ、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｉ、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３、４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−Ｃ_１〜４アルキル−、−Ｃ_１〜４アルキル−ＯＨ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｂｒ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｉ、−ＯＣ_１〜４アルキル−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３、４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−Ｃ_１〜４アルキル−Ｏ−、−ＯＣ_１〜４アルキル−ＯＨ、−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｂｒ、−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｉ、−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３、４−ＣＨ_３−Ｐｈ−ＳＯ_２−Ｏ−Ｃ_１〜４アルキル−ＮＲ^４−および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−ＯＨ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
    の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
12. 請求項１１に記載の化合物であって、前記化合物が、
    
    またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である、化合物。
13. 式［^１９Ｆ］−（Ｉ）
    
    （式中、
    Ｒ^２はメチルであり、かつＲ^１がＦであり、かつＲ^３がＨであるか、あるいはＲ^１がＨであり、かつＲ^３がＦであるかのいずれかであり；または
    Ｒ^１およびＲ^３は両方ともＨであり、かつＲ^２は、−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ、
    −ＯＣ_１〜４アルキル−Ｆ、および−ＮＲ^４−Ｃ_１〜４アルキル−Ｆ（式中、Ｒ^４はＨまたはメチルである）からなる群から選択される）
    を有する化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。