JP2019528239A - 変形性関節症を診断するためのコムペプチドおよびそれに対する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
人間および馬におけるOAの疾患発症機序はまた、分子レベルで非常に良く似ている(Stenberg J, Ruetschi U, Skioldebrand E, Karrholm J, Lindahl A、 Proteome Sci. (2013) Oct 4;11(1):43) (Svala E, Lofgren M, Sihlbom C, Ruetschi U, Lindahl A, Ekman S, Skioldebrand E、 Connect Tissue Res. (2015);56(4):315−25)。
こうして、本発明の第2の態様によれば、N末端−SGPTHのアミノ酸配列を備えるペプチドに特異的に結合する抗体の、診断における使用が提供される。
しかしながら、後続するスクリーニングステップは、免疫性付与に使用されたペプチドの他の残基が抗体結合に関与していない場合、N末端−SGPTHのエピトープ(抗原決定基)に特異的に結合する抗体を同定することができる。SGPTHGGGC(配列番号2)の免疫性付与ペプチドにおいて、C末端システインが、ペプチドをコンジュゲートする(conjugating)のに、例えば、抗体精製に使用される基質(matrix)に対して、使用されてよい。
ウサギポリクロナール抗血清(antisera)での現在の較正器(キャリブレータ)に基づいて、100ng/mlより上、より好適には600ng/mlより上、より好適には800ng/mlより上、より好適には1000ng/mlより上、より好適には1200ng/ml、最も好適には2000ng/mlより上の血清中のペプチド濃度は、ヒトの頚動脈狭窄を示し得る。適切なカットオフ(cut-off)は、標準実験および適切な対照群(controls)を使用することで確立することができる。
ポリクロナール抗体
ウサギポリクロナール抗体を、N末端−SGPTHGGGC−C末端(配列番号2)の免疫ペプチドに対して作製した(raised)。N末端−SGPTHのペプチドは、ウマの滑液中のCOMP(軟骨オリゴマー基質タンパク質)タンパク質(トロンボスポンジン5)の開裂(cleavage)断片(フラグメント)として同定された。ヒトのタンパク質は、同じ配列を有する。抗原性ペプチドは、ウサギ血清からの抗体精製に使用された。ポリクロナール抗体は、実施例2から実施例6で使用された。
阻害ELISA(酸素結合免疫吸着測定法)、ウマおよびヒトのペプチドの検出
実施例1からの抗体を使用して、SGPTHEGVC(配列番号3)の配列を有するペプチドのため、阻害ELISAが展開(developed)された。ELISAは、実施例3(ウマ)および実施例4(ヒト)におけるように、実行された。抗体のこのペプチドへの結合は、ポリクロナール抗体がN−SGPTHに特異的であることを確認する。
また、抗体は、PPGYSGPTHEGVGMC(配列番号4)の配列を有する非開裂(uncleaved)対照ペプチドには結合しなかった。このペプチド(配列番号4)は、SGPTHを備えるが、N末端のN−SGPTHではないため(図1)、このことは、N末端がこの抗体のためのエピトープ(抗原決定基)の一部であることを示す。予測されたように、阻害ELISAにおいて、このSGPTHEGVC(配列番号3)ペプチドは、ペプチド濃度の増加に伴い、吸収信号の減少を示す。ELISAは、ヒトおよびウマの双方からの血清および滑液(SF)において検証された。これにより、抗体が、ヒトおよびウマからの血清および滑液に存在するペプチドを検出することが実証された。
変形性関節症(osteoarthritis)のウマからの滑液中のペプチドの検出
滑液(SF)サンプルが、バイオバンクから収集された。使用された材料は、ウマからの手根中央(middle carpal)関節および蹴爪(球節)(fetlock)関節からの滑液を有する。
バイオバンクIIは、1箇所の食肉処理場で安楽死させられたスタンダードブレッド(STB)およびスウェーデンの温血乗用馬(SWHs)からの左手根関節から成るものであった。左の手根骨間の関節からのSFは、検死後、即座にサンプル取得された。関節軟骨は、正常、または第3手根骨の近位(身体基部に近い)関節面の構造的OA損傷(病変)(lesions)を伴うもの、として特徴付けられた。
培養の後、NUNCプレートは洗浄され、1%のBSAおよび0.1%のTweenを含むPBSで1:20,000に希釈された二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG H&L [HRP])が添加された。このプレートは、25℃で1時間培養され、その後6回洗浄されて、25℃で約8分間、基板(substrate)で培養された(Substrate Reagent Pack DY999、R&D System、英国)。停止液(1M H2SO4)が添加され、および450nmでの吸光度が計測された(SpectraMaxPlus 384、MDS Analytical Technologies Ltd,英国)。
変形性関節症の患者からの血清中のペプチドの検出
患者の材料は、「症候性頚動脈狭窄における早期再発性脳卒中梗塞のリスク」(Stromberg S、 Nordanstig A、 Bentzel T、 Osterberg K、 Bergstrom GM、 Risk of early recurrent stroke symptomatic carotid stenosis、 Eur J Vase Endovasc Surg (2015); 49: 137−44)等であった。
培養の後、NUNCプレートは洗浄され、1%のBSAおよび0.1%のTweenを含むPBSで1:20,000に希釈された二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG H&L−HRP)が添加された。このプレートは、25℃で1時間培養され、その後6回洗浄されて、25℃で約21分間、基板で培養された(Substrate Reagent Pack DY999、R&D System、英国)。停止液(1M H2SO4)が添加され、および450nmでの吸光度が計測された(SpectraMaxPlus 384、MDS Analytical Technologies Ltd,英国)。
統計は、実施例3にあるとおりであった。
ウマからの関節軟骨の免疫組織化学
健常のおよび早期OA関節軟骨のホルマリン固定したブロック(Formalin-fixed blocks)は、ペプチドのため免疫染色された(ウサギポリクロナール抗体)。ポリクロナール抗体は、1:800および1:1000でそれぞれ希釈されて使用された。つまり、試料(specimens)は、薄片に切り分けられ(sectioned)、載物ガラス(スライド)(slides)に搭載され、脱パラフィンされ(deparaffinized)、リン酸緩衝食塩水(PBS;0.01M、pH7.4)で再水和(rehydrated)および洗浄された。内因性ペルオキシダーゼ活性(endogenous peroxidase activity)は、PBS中で3%の過酸化水素で急冷された(quenched)。非特異性結合は、薄片を2%の正常ヤギ血清(DAKO、X0907、ウサギ抗体)中で培養することによりブロックされ、その後、乾燥され、および抗体とともに60分間室温(RT)で培養された。PBS中ですすがれた後、薄片は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)−コンジュゲート二次抗体(Dako Real EnVision Detection(登録商標) System、k5007、Ready−to−use kit)とともに30分間、室温(RT)で培養された。視覚化は、発色現像液(color developer)3,3−ジアミノベンジジン(DAB+ Cromogen Dako EnVision)、およびヘマトキシリン(haematoxylin)での対比染色を使用して実行された。ネガティブ(陰性)対照群として、一次抗体は、一次抗体と同一の希釈で、非免疫性ウサギ血清(Rabbit Immunoglobulin Fraction X0936、DAKO)で置き換えられた。
健常なウマからの関節軟骨の免疫組織化学の載物ガラス(スライド)(健常軟骨、図4)、および関節軟骨の表在性フィブリル化(fibrillation)(軟骨表面上の損傷)を有する(早期OA)ウマからの関節軟骨の免疫組織化学のスライドは、明確に異なる染色パターンを示す(図5)。ペプチドに対する抗体は、健常軟骨中でわずかのみまたはネガティブ(陰性)に染色する。しかしながら、早期OAにおいて、抗体は、フィブリル化領域においてポジティブ(陽性)に染色する。
「Fagerberg B、 Ryndel M、 Kjelldahl J等 J Vase Res (2010); 47: 221−30」に記載される材料からの、ヒトのアテローム性動脈硬化症プラークの免疫組織化学
症候性頚動脈狭窄を有する患者からのサンプルは、動脈血管内膜切除術の前に、磁気共鳴血管造影法(MRA)で検査されてインヴィヴォ(生体内)(in-vivo)で最大の狭窄の場所を見つけ出した。最大狭窄の横行組織薄片が、免疫組織化学に使用され、これは実施例5として実行された。内壁(intima wall)中に染色の増加(矢印で示される)が見られ、これはN−SGPTHの配列を備えるペプチドの存在を示すものであった(図6)。
Claims (15)
- N末端−SGPTHのアミノ酸配列を備えるペプチドに特異的に結合する抗体。
- 診断における使用のための請求項1に記載の抗体。
- 請求項2に記載の抗体であって、前記抗体が使用される前記診断は、被験者の変形性関節症(osteoarthritis)、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、または神経炎症性疾患の診断である、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項3に記載の抗体であって、前記抗体が使用される前記診断は、骨関節症(osteoarthrosis)の診断である、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項4に記載の抗体であって、前記骨関節症は、早期段階の変形性関節症である、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項3に記載の抗体であって、前記抗体が使用される前記診断は、アテローム性動脈硬化症の診断である、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項6に記載の抗体であって、前記アテローム性動脈硬化症は、頚動脈狭窄である、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項3に記載の抗体であって、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択され、または、前記神経炎症性疾患は、多発性硬化症、パーキンソン病、ギランバレー症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、自己免疫性脳炎、ナルコレプシーからなる群から選択される、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項3から8のいずれか1項に記載の抗体であって、前記抗体は、被験者からのサンプル中のN末端−SGPTHのアミノ酸配列を備えるペプチドの量を検出するため使用される、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項9に記載の抗体であって、前記サンプルは、滑液、髄液、血清、血液、または血漿のサンプルである、
ことを特徴とする抗体。 - 請求項1に記載の抗体の診断における使用。
- 診断方法であって、
被験者からサンプルを分離し、
前記サンプル中の、N末端−SGPTHのアミノ酸配列を備えるペプチドの存在または量を分析する、
ことを含むことを特徴とする診断方法。 - 請求項1に記載の抗体を備えるキット。
- N末端−SGPTHのアミノ酸配列を備えるペプチド。
- 抗体を産生するためのN末端−SGPTHのアミノ酸配列を備えるペプチドの使用。
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