ES2967411T3 - Péptido COMP y anticuerpos dirigidos contra el mismo para el diagnóstico de la osteoartritis - Google Patents

Péptido COMP y anticuerpos dirigidos contra el mismo para el diagnóstico de la osteoartritis Download PDF

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Abstract

Se proporciona un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal-SGPTH y un anticuerpo contra este péptido. El péptido puede usarse para el diagnóstico en humanos y animales, en particular caballos. En particular, el anticuerpo se puede utilizar para el diagnóstico de una enfermedad inflamatoria crónica sistémica de bajo grado tal como osteoartritis o aterosclerosis, o una enfermedad neurodegenerativa o enfermedad neuroinflamatoria. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido COMP y anticuerpos dirigidos contra el mismo para el diagnóstico de la osteoartritis
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un péptido y a anticuerpos dirigidos contra dicho péptido, y a su uso en el diagnóstico, en particular, el diagnóstico de enfermedades inflamatorias sistémicas, en particular, osteoartritis y enfermedades cardiovasculares.
Antecedentes
La aterosclerosis está asociada a una inflamación crónica sistémica de bajo grado y a la posterior formación de placas inflamatorias en los vasos sanguíneos, siendo una de las principales causas de muerte en el mundo occidental. La aterosclerosis progresa lentamente desde una fase asintomática de bajo riesgo hasta el desarrollo de placas, que luego pueden causar trombosis, obstruir los capilares y provocar infartos o accidentes cerebrovasculares.
En las fases avanzadas, la aterosclerosis a menudo deriva en estenosis de la arteria carótida, que es un estrechamiento de la superficie interna de la arteria carótida causado por las placas. En esta fase, el riesgo de formación de trombosis y de liberación de émbolos causantes de accidentes cerebrovasculares es muy elevado. En la actualidad, no es posible controlar cómo progresa la aterosclerosis hasta la fase peligrosa.
La estenosis carotídea normalmente se diagnostica mediante ultrasonidos, con una sensibilidad y especificidad moderadas. Por lo tanto, se necesitan métodos para controlar la progresión de la aterosclerosis a la estenosis carotídea.
La osteoartritis (OA) es una inflamación sistémica crónica de bajo grado que resulta de la degradación del cartílago articular y del hueso subyacente. La enfermedad progresa desde una fase inicial, que a menudo se caracteriza por la aparición de inflamación y desorganización de las proteínas de la matriz en las articulaciones afectadas, hasta una fase más grave con daños en el hueso subyacente. Su principal síntoma es el dolor articular. La osteoartritis es un problema clínico importante ya que afecta alrededor del 3,8 % de la población. Se estima que el 50 % de las prescripciones de analgésicos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) están relacionadas con la OA.
Aunque el dolor articular suele hacer sospechar al médico de la existencia de OA, especialmente si el paciente es de edad avanzada, en la actualidad es difícil diagnosticar las primeras etapas de OA. Hoy en día, el diagnóstico se basa a menudo en la identificación, mediante radiología, de daños estructurales irreversibles típicos de las últimas etapas de la OA. Sin embargo, los rayos X y la resonancia magnética no pueden utilizarse para diagnosticar la OA en fase inicial, ya que los daños estructurales aún no son visibles. Además, los exámenes de rayos X y resonancia magnética requieren equipos costosos y citas con radiólogos.
La osteoartritis en los caballos es un gran problema para sus propietarios. La razón principal para tener un caballo es poder utilizarlo y competir con él de forma regular. La OA es la razón más frecuente por la que no pueden utilizarse los caballos y representa la mayor pérdida económica en la industria equina.
La OA en fase inicial en los caballos suele manifestarse en forma de cojera, es decir, marcha o postura anormales. La cojera a menudo puede ser sutil, pero sería útil disponer de un método mejorado para controlarla. Esto permitiría a los propietarios de caballos saber cuándo deben suspender el entrenamiento o la competición de sus caballos debido a la cojera.
La OA en caballos y humanos está causada por mecanismos similares. Tanto en los seres humanos como en los caballos, la OA progresa desde una fase inicial caracterizada por inflamación durante meses y años hasta una fase posterior con daño tisular extenso (Goldring, M.B. y Otero M. Current Opinion in Rheumatology (2011) 23(5):471). La patogénesis de la enfermedad de OA en humanos y caballos es también muy similar a nivel molecular (Stenberg J, Rüetschi U, Skioldebrand E, Karrholm J, Lindahl A. Proteome Sci. (2013) 4 de octubre;11(1):43) (Svala E, Lofgren M, Sihlbom C, Rüetschi U, Lindahl A, Ekman S, Skioldebrand E. Connect Tissue Res. (2015);56(4):312-25.
Anónimo, 2015 divulga un antisuero policlonal que se une a la proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP). El documento WO 2016//172722) divulga péptidos mer de 7 a 11 aminoácidos utilizados para la producción de agentes de inmunoterapia contra el cáncer, tales como anticuerpos, y su uso diagnóstico. Uno de los neoepítopos es un péptido con secuencia SGPTHASGN. El documento US 2004/214272) divulga una proteína vegetal de 179 aminoácidos de longitud con una secuencia extremo-N-SGPTH (véase SEQ ID NO:309.498).
El documento "COMP/THBS5 Antibody, Rabbit PAb, Antigen Affinity Purified Catalog Number: 10173-RP03", Sino Biological Inc, 6 de marzo de 2015, divulga un anticuerpo contra la proteína COMP, sin especificar el epítopo.
Skioldebrandet al."Cartilage oligomeric matrix protein neoepitope in the synovial fluid of horses with acute lameness:" EQUINE VETERINARY JOURNAL, vol. 49, núm. 5, 28 de febrero de 2017, se publica después de la fecha de prioridad.
Dickinsonet al.:"Cleavage of cartilage oligomeric matrix protein (thrombospondin-5) by matrix metalloproteinases and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs", Matrix Biology, 1 de enero de 2003 (2003-01 01), páginas 267-278, analiza la relevancia de COMP en la osteoartritis.
Zhenet al.:"Characterization of metalloprotease cleavage products of human articular cartilage", ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 58, núm. 8, 1 de agosto de 2008, páginas 2420-2431, divulga diversos fragmentos de escisión de proteínas.
El documento WO 2016172722, presentado antes de la fecha de prioridad, pero publicado después de la misma, divulga varios péptidos.
El documento US2004/214272 divulga diversas secuencias de proteínas.
La falta de marcadores tempranos para la OA dificulta el desarrollo de fármacos que pueden utilizarse para controlar la enfermedad antes de que se manifieste como un daño tisular irreversible. Sería útil disponer de métodos más convenientes para diagnosticar y estadificar la OA.
La presente invención resuelve estos y otros problemas.
Sumario de la invención
En un primer aspecto de la invención se proporciona un método de diagnóstico que comprende, en una muestra previamente aislada de un sujeto, analizar la muestra para determinar la presencia o la cantidad de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH, donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido.
El método puede utilizarse para el diagnóstico de la osteoartritis o la aterosclerosis, en particular la osteoartritis en fase inicial.
En un segundo aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH, donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido, donde el anticuerpo se une a la secuencia extremo-N-SGTPH, para uso en diagnósticoin vivo.El diagnóstico puede ser un diagnóstico de osteoartritis o aterosclerosis en un sujeto. La aterosclerosis puede ser estenosis de la arteria carótida. El anticuerpo puede utilizarse para detectar la cantidad de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH, donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 La especificidad del anticuerpo anti-NH<2>-SGPTH se analizó utilizando una dilución en serie del péptido de control (SEQ ID NO 4) o del péptido SGPTHEGVC (SEQ ID NO 3).
La Fig. 2 es un gráfico que muestra la concentración del péptido que comprende la secuencia extremo-NH<2>-SGPTH en muestras de líquido sinovial de caballos (*=p<0,050, ****=p<0,0001).
La Fig. 3 es un gráfico que muestra la concentración del péptido que comprende la secuencia extremo-NH<2>-SGPTH en suero de humanos (***=p<0,001).
Las Figs. 4 y 5 son imágenes de muestras de cartílago articular de caballos, teñidas con el anticuerpo contra el péptido NH<2>-SGPTH. Las secciones teñidas con inmunohistoquímica son de cartílago articular de un caballo sano (cartílago sano, Figura 4) y de un caballo con fibrilación superficial del cartílago articular (OA en fase inicial, Figura 5). El anticuerpo contra el péptido se tiñe negativamente en el cartílago sano. Sin embargo, en la OA en fase inicial, el anticuerpo se tiñe positivamente (indicado por flechas) en el área fibrilada.
La Fig. 6 muestra una sección histológica de una muestra de placa aterosclerótica de un paciente humano, teñida con el anticuerpo contra el péptido NH<2>-SGPTH.
Descripción detallada
En el presente documento se divulga un péptido que comprende la secuencia extremo-N-SGPTH (SEQ ID NO 1) donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido, un anticuerpo dirigido contra este péptido y el uso de dicho anticuerpo en el diagnóstico.
El péptido puede tener una longitud de 5 a 100, preferiblemente de 5 a 30, más preferiblemente de 5 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 5 a 9 aminoácidos, siempre que el extremo N tenga la secuencia SGPTH. El residuo de serina de esta secuencia del péptido tiene, por tanto, el grupo NH<2>del péptido.
En una divulgación, el péptido tiene una longitud tal que puede utilizarse para inmunización. La longitud del péptido es entonces preferiblemente de al menos nueve residuos.
El péptido puede ser un péptido aislado. El péptido puede aislarse, por ejemplo, de líquido sinovial, sangre, plasma o suero. El péptido también puede sintetizarse utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154 y Schnolzer, M. A., P.; Jones, A.; Alewood, D.; Kent, S.B.H. (2007). "In Situ Neutralization in Boc-chemistry Solid Phase Peptide Synthesis". Int. J. Peptide Res. Therap. 13 (1-2): 31-44. El péptido puede ser un péptido aislado. El péptido puede utilizarse para la producción y el aislamiento de un anticuerpo. El anticuerpo se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido, en particular un péptido que consta de al menos nueve residuos de aminoácidos. El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y monocatenarios. Los métodos para producir anticuerpos contra un péptido son bien conocidos. El péptido puede utilizarse para el cribado de anticuerpos que se unen al péptido y también para purificar el anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo tiene una alta afinidad por el péptido. La afinidad puede expresarse utilizando la constante de disociación o Kd. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación (Kd) inferior a 10'6 M, más preferiblemente 5 x 10'7 M, más preferiblemente 10'7 M, más preferiblemente 5 x 10'8 M, 10'8 M, más preferiblemente 5 x 10'9 M, más preferiblemente 10'9 M, más preferiblemente 5 x 10'1° M, más preferiblemente 10'10 M, más preferiblemente 5 x 10'11 M, más preferiblemente 10'11 M, más preferiblemente 5 x 10-12 M, más preferiblemente 10'12 M, incluso más preferiblemente 5 x 10'13 M , o, y más preferiblemente, 10'13 M. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo aislado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado.
Preferiblemente, el anticuerpo se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia extremo-N-SGPTH (SEQ ID NO 1) donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido. Para generar el anticuerpo puede ser adecuado inmunizar con un péptido más largo que SGPTH, por ejemplo, el péptido de inmunización SGPTHGGGC (SEQ ID NO 2). Sin embargo, una etapa de cribado posterior puede identificar anticuerpos que se unen específicamente al epítopo extremo-N-SGPTH donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido, y donde los demás residuos del péptido utilizado para la inmunización no intervienen en la unión del anticuerpo. En el péptido de inmunización SGPt Hg GGC (SEQ ID NO 2), la cisteína extremo C-terminal puede utilizarse para conjugar el péptido, por ejemplo, con una matriz que se utilizará para la purificación del anticuerpo.
El anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo derivado de un mamífero tal como ratón, rata, hámster, conejo, cabra, caballo y similares, entre los cuales se prefiere el ratón o el pollo. El isotipo de los anticuerpos puede ser cualquiera de IgG, IgM, IgE, IgA, IgY y similares.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, producido mediante inmunización de un animal, por ejemplo, un conejo, tal como se conoce en la técnica. Sin embargo, preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal de ratón o conejo. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el péptido pueden generarse utilizando la conocida tecnología de hibridoma (Kohler y Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Puede aislarse un clon único mediante el análisis de dilución limitante, el ensayo de agar blando, un método que utilice un clasificador celular activado por fluorescencia, y similares. En el análisis de dilución limitante, por ejemplo, las colonias del hibridoma se diluyen en serie hasta aproximadamente 1 célula/pocillo en un medio antes del cultivo para aislar el hibridoma que produce el anticuerpo deseado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
También pueden generarse clones de anticuerpos utilizando otros métodos, tales como, por ejemplo, la presentación en fagos.
Cuando el anticuerpo es IgG murino, el anticuerpo puede purificarse con cromatografía de afinidad utilizando un vehículo conjugado con proteína A o un vehículo conjugado con inmunoglobulina anti-ratón.
Existen métodos bien conocidos para producir, purificar y aislar anticuerpos y determinar su capacidad de unión. Para más detalles, véanse los Protocolos actuales en inmunología y los Protocolos actuales en biología molecular. El anticuerpo puede utilizarse para el diagnóstico de diferentes maneras. El anticuerpo puede utilizarse para medir la presencia, la cantidad o la concentración del péptido en una muestra de un sujeto, que puede ser un ser humano o un animal. La muestra puede ser cualquier tipo de muestra biológica, por ejemplo, líquido sinovial, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo (licor) u orina, ascitis o un corte histológico. Preferiblemente la muestra es una muestra líquida. En una realización preferida, la muestra es una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de plasma o una muestra de líquido sinovial. En una realización aún más preferida la muestra es una muestra de líquido sinovial.
Una manera conveniente de medir la concentración de un péptido en una muestra con un anticuerpo es ELISA. El diseño y uso de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) es bien conocido en la técnica del diagnóstico. El anticuerpo también puede utilizarse, por ejemplo, en inmunohistoquímica. Por ejemplo, pueden teñirse secciones finas de tejido, por ejemplo, tejido congelado, tratado con parafina o fijado, utilizando el anticuerpo como se conoce en la técnica de la patología. El anticuerpo también puede utilizarse en Western Blot.
El anticuerpo puede detectarse de diversas maneras. Un método utilizado con frecuencia es utilizar un anticuerpo secundario que se conjuga con una sustancia que puede detectarse (un marcador o etiqueta), por ejemplo, una enzima (como HRP), un fluoróforo o un radiomarcador. Por ejemplo, si el anticuerpo primario es un anticuerpo de ratón, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo anti-ratón de cabra. La presencia del marcador puede detectarse con métodos conocidos en la técnica: una enzima puede detectarse con reactivos que producen un color o luz, un radiomarcador puede detectarse con un centelleador o una película fotográfica, y un fluoróforo puede detectarse con un detector de fluorescencia o visualizarse en un microscopio de fluorescencia.
De manera alternativa, el anticuerpo primario (anticuerpo anti-SGPTH) puede conjugarse directamente con un marcador/etiqueta.
Una concentración de trabajo adecuada del anticuerpo cuando se utiliza en diversos procedimientos tales como ELISA o inmunohistoquímica depende de la afinidad del anticuerpo y puede determinarse probando diferentes concentraciones del anticuerpo para encontrar una concentración que proporcione una buena relación señal-ruido. Como ejemplo, una solución madre de anticuerpo con una concentración de 1 mg/ml puede diluirse a 1/100, 1/200, 1/1000 y 1/5000 para probar una concentración de trabajo adecuada. Las concentraciones de trabajo del anticuerpo en estos procedimientos normalmente están en el intervalo de pg/ml, por ejemplo 1-10 pg/ml. El anticuerpo se diluye adecuadamente en PBS, posiblemente con el uso de una proteína adicional tal como BSA y un conservante, tal como azida sódica.
El anticuerpo puede utilizarse para el diagnóstico de una enfermedad en un sujeto, en particular en un ser humano o en un caballo. Por ejemplo, la concentración del péptido en una muestra puede determinarse utilizando métodos estándar, por ejemplo, ELISA. La concentración así determinada puede compararse con un valor estándar. Una desviación del valor estándar puede ser indicativa de una enfermedad particular o de una etapa de la enfermedad. El diagnóstico puede ser el diagnóstico de una enfermedad asociada a una inflamación sistémica, en particular una inflamación crónica sistémica de bajo grado. Por lo tanto, el diagnóstico puede ser el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Alzheimer, la demencia vascular, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), o una enfermedad neuroinflamatoria, tal como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, el síndrome de Guillain-Barré, la miastenia gravis, la neuromielitis óptica, la encefalitis autoinmune o la narcolepsia.
En una realización preferida, la enfermedad que se diagnostica puede ser una seleccionada del grupo que consiste en aterosclerosis y estenosis de la arteria carótida, en particular en un ser humano. En particular, la enfermedad puede ser la estenosis de la arteria carótida. La muestra es entonces preferiblemente una muestra de sangre, una muestra de plasma o una muestra de suero.
El anticuerpo puede utilizarse para monitorizar el avance de la aterosclerosis en humanos, en particular desde la enfermedad de placas hasta la estenosis de la arteria carótida. El anticuerpo puede utilizarse para distinguir pacientes con placas únicamente de pacientes con estenosis de la arteria carótida. Una concentración de péptido, basada en el calibrador actual con los antisueros policlonales de conejo, superior a 100 ng/ml, más preferiblemente superior a 600 ng/ml, más preferiblemente superior a 800 ng/ml, más preferiblemente 1000 ng/ml, más preferiblemente 1200 ng/ml. y más preferiblemente superior a 2000 ng/ml en suero puede ser indicativa de estenosis de la arteria carótida en un ser humano. El límite apropiado puede establecerse mediante experimentos estándar y controles apropiados.
El anticuerpo puede utilizarse para el diagnóstico de OA en humanos o en caballos. En una realización preferida, una concentración elevada del péptido en el líquido sinovial puede indicar una OA en fase inicial. Una concentración baja del péptido puede indicar que no hay OA o que la OA está en una fase tardía. El anticuerpo puede utilizarse para monitorizar el paso de cojera aguda/OA en fase inicial a cojera crónica/OA crónica, en particular en caballos. En caballos, el anticuerpo puede utilizarse para diagnosticar una afección seleccionada del grupo que consiste en cojera aguda/OA en fase inicial y cojera crónica/OA crónica.
En el caballo, una concentración de péptido en la concentración de líquido sinovial, basada en el calibrador actual con los antisueros policlonales de conejo, superior a 1 pg/ml, más preferiblemente superior a 20 pg/ml, más preferiblemente 30 pg/ml, más preferiblemente superior a 40 pg/ml, más preferiblemente superior a 200 pg/ml, puede ser indicativa de cojera incipiente y, por tanto, de OA en fase inicial. Los niveles de corte para caballos pueden establecerse mediante experimentos estándar y controles apropiados.
El anticuerpo y los reactivos necesarios pueden incluirse en un kit para detectar el péptido en una muestra. El kit puede estar basado en ELISA, por ejemplo, ELISA competitivo. El kit puede incluir una fase estacionaria (como una placa con pocillos), anticuerpos secundarios, tampones y reactivos para detectar el marcador.
EJEMPLO 1
Anticuerpo policlonal
Se generó un anticuerpo policlonal de conejo contra el péptido de inmunización extremo-N SGPTHGGGC-extremo-C, SEQ ID NO 2) donde el residuo de serina tenía el grupo NH<2>de dicho péptido. El péptido extremo-n SGPTH se identificó como un fragmento de escisión de la proteína COMP (trombospondina 5) en el líquido sinovial de caballos. La proteína humana tiene la misma secuencia. El péptido inmunogénico se utilizó para la purificación del anticuerpo a partir de suero de conejo. El anticuerpo policlonal se utilizó en los Ejemplos 2-6.
EJEMPLO 2
ELISA de inhibición, detección del péptido en caballos y humanos
Se desarrolló un ELISA de inhibición para un péptido con la secuencia SGPTHEGVC (SEQ ID NO 3) utilizando el anticuerpo del Ejemplo 1. El ELISA se llevó a cabo como en el Ejemplo 3 (caballo) y el Ejemplo 4 (humano). La unión del anticuerpo a este péptido confirma que el anticuerpo policlonal es específico para N-SGPTH. Además, el anticuerpo no se unió al péptido de control no escindido con la secuencia PPGYSGPTHEGVGMC (SEQ ID NO 4), lo que demuestra que el extremo N forma parte del epítopo de este anticuerpo, ya que este péptido (SEQ ID NO 4) comprende SGPTH, pero no el extremo N de N-SGPTH (Figura 1). Como se esperaba, en el ELISA de inhibición el péptido SGPTHEGVC (SEQ ID NO 3) proporciona una señal de absorbancia decreciente con el aumento de la concentración del péptido. El ELISA fue validado en suero y líquido sinovial (LS) tanto de humanos como de caballos. Así se estableció que el anticuerpo detecta el péptido presente en la sangre y el líquido sinovial de humanos y caballos.
Un coeficiente de variación (CV) (%) de validación intraensayo de 10,9 y un CV (%) de validación interensayo de 10,7 (el límite más bajo de cuantificación fue de 0,156 pg/ml) para el ensayo en caballos. El CV de las muestras de suero humano fue similar al de los datos de caballos. Las muestras de suero y sinoviales también fueron sometidas a ensayo en relación con la estabilidad después de la congelación (-80 °C), la descongelación y la adición de inhibidores de proteasa y EDTA.
EJEMPLO 3
Detección del péptido en líquido sinovial de caballos con osteoartritis
Se recogieron muestras de líquido sinovial (LS) de biobancos. El material utilizado comprende líquido sinovial de las articulaciones del carpo medio y del menudillo de los caballos.
Los criterios de inclusión para las presentes muestras fueron A) más de 100 pl de líquido disponible y una de las siguientes condiciones: B) antecedentes de OA en fase inicial/cojera aguda (<4 semanas de duración), C) antecedentes de OA crónica/cojera crónica (>4 semanas de duración), D) antecedentes de ausencia de cojera y una articulación con morfología normal (control sano), o E) una articulación con presencia OA en fase tardía.
El Biobanco I incluyó 28 jóvenes trotones de Standardbred (STB) (13 potras y 15 potros) entrenados por el mismo entrenador en el mismo campus. Estos caballos iniciaron su entrenamiento a una edad media de 19,5 meses y finalizaron a una edad media de 40 meses. Todos los caballos estaban clínicamente sanos y fueron examinados en seis ocasiones (visitas 1, 2, 3, 4, 5 y 6). En el muestreo de LS, se realizó un examen clínico de cojera con una prueba de flexión que incluía radiografías y gammagrafía de las articulaciones del carpo.
El Biobanco II consistía en articulaciones del carpo izquierdo de STB y caballos de monta de sangre caliente suecos (SWH) que fueron sacrificados en un matadero. Se tomaron muestras del LS de la articulación intercarpiana izquierda inmediatamente post mortem. El cartílago articular se caracterizó como normal o con lesiones estructurales de OA de la superficie articular proximal en el tercer hueso del carpo.
El Biobanco III consistía en LS de caballos clínicamente cojos. Los caballos fueron examinados durante un examen rutinario de cojera que incluía pruebas de flexión y anestesia intraarticular. Este examen también incluía la prueba del localizador de cojera para evaluar la cojera antes y después de la anestesia. El LS se recogió de diferentes articulaciones dependiendo de la evaluación clínica de la cojera. Este banco consiste en LS de articulaciones con cojera definida en una articulación específica mediante anestesia intraarticular y localizador de cojera.
El material utilizado en la Figura 2 es LS de las articulaciones del carpo medio y del menudillo de caballos con cartílago articular macroscópicamente normal, controles sanos (n=8, Biobanco II), cambios estructurales de OA del cartílago articular de leves a moderados, OA en fase tardía (n=8, Biobanco II), OA en fase inicial/cojera aguda <4 semanas (n=9, Biobanco III) y OA crónica/cojera crónica >4 meses (n= 9, Biobanco III) de caballos de carreras jóvenes y sanos en entrenamiento, controles sanos (n=7, Biobanco I).
Se desarrolló un ELISA de inhibición para cuantificar la concentración del péptido en LS. Se recubrieron placas NUNC con 4,0 pg/ml de péptido (secuencia SGPTHEGVC, SEQ ID NO 3) diluido en tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6 y se incubaron a 4 °C durante la noche. Se utilizó una dilución en serie de 5,0 pg/ml de péptido (secuencia SGPTHEGVGMA (SEQ ID NO 5) en PBS 10 mM con BSA al 0,6 % y SDS al 0,8 % como curva de calibración (rango = 5-0,078 pg/ml). Las muestras de LS se diluyeron 1:20 en PBS con 0,84 % de SDS. Se incubaron duplicados del estándar y LS en placas Sterilin de 96 pocillos a 25 °C durante la noche. El segundo día, se añadió el anticuerpo anti-SGPTH primario (diluido 1:2000 en PBS con 1 % de BSA y 4 % de Triton-X-100) a las placas Sterilin y las placas se incubaron durante 1 h y 20 min a 25 °C. Las placas NUNC se lavaron y bloquearon con PBS con 1 % de BSA y 0,1 % de Tween durante 1 h a 25 °C. Se transfirió un total de 100 pl de las placas Sterilin a las placas NUNC y se incubaron durante 1 h a 25 °C. Tras la incubación, se lavaron las placas NUNC y se añadió el anticuerpo secundario (IgG H&L [HRP] cabra anti-conejo), diluido 1:20.000 en PBS con 1 % de BSA y 0,1 % de Tween. Las placas se incubaron durante 1 h a 25 °C y luego se lavaron seis veces y se incubaron con sustrato (Substrate Reagent Pack DY999, R&D System, Reino Unido) durante aproximadamente 8 min a 25 °C. Se añadió solución de parada (1 M H<2>SO<4>) y se midió la absorbancia a 450 nm (SpectraMaxPlus 384, MDS Analytical Technologies Ltd, Reino Unido).
Se observó un aumento estadístico de la concentración de péptido en el líquido sinovial de caballos con osteoartritis en fase inicial/cojera aguda en comparación con las articulaciones de control sanas y las articulaciones de caballos con osteoartritis crónica/cojera crónica y/o con osteoartritis en fase tardía (Figura 2).
Los datos se presentan como media ± DE y las diferencias entre medias se evaluaron mediante ANOVA unidireccional utilizando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE. UU.). Para las comparaciones entre los grupos se realizó una prueba de comparaciones múltiples de Turkey. El nivel de significación se fijó en p<0,05.
EJEMPLO 4
Detección del péptido en suero de pacientes con aterosclerosis. El material del paciente eraxz el mismo que el de Stromberg S, Nordanstig A, Bentzel T, Osterberg K, Bergstrom GM, Risk of early recurrent Stroke in syntomatic carotid stenosis, Eur J Vasc Endovasc Surg (2015); 49: 137-44.
Se desarrolló un ELISA de inhibición para cuantificar la concentración del péptido en suero. Se recubrieron placas NUNC con 4,0 pg/ml de péptido (secuencia SGPTHEGVC (SEQ ID NO 3) diluido en tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6 y se incubaron a 4 °C durante la noche. Se utilizó como curva de calibración una dilución en serie de 1000 ng/ml a 15,6 ng/ml de péptido (secuencia SGPTHQGVGLA (SEQ ID NO 6) en 10 mM de PBS con 0,6 % de BSA y 0,8 % de SDS. Las muestras de suero se diluyeron 1:4 en PBS con 0,84 % de SDS. Se incubaron duplicados del estándar y el suero en placas Sterilin de 96 pocillos a 25 °C durante la noche. El segundo día, el anticuerpo anti-SGPTH primario (diluido 1:6000 en PBS con 1 % de BSA y 4 % de Triton-X-100) se añadió a las placas Sterilin y las placas se incubaron durante 1 h y 20 min a 25 °C. Las placas NUNC se lavaron y bloquearon con PBS con 1 % de BSA y 0,1 % de Tween durante 1 h, a 25 °C. Se transfirió un total de 100 pl de las placas Sterilin a las placas NUNC y se incubaron durante 1 hora a 25 ° C. Tras la incubación, se lavaron las placas NUNC y se añadió el anticuerpo secundario (IgG H&L-HRP cabra anti-conejo) diluido 1:20.000 en PBS con 1 % de B<s>A y 0,1 % de Tween. Las placas se incubaron durante 1 h a 25 °C y luego se lavaron seis veces y se incubaron con sustrato (Substrate Reagent Pack DY999, R&D System, Reino Unido) durante aproximadamente 21 min a 25 °C. Se añadió solución de parada (1 M H<2>SO<4>) y se midió la absorbancia a 450 nm (SpectraMaxPlus 384, MDS Analytical Technologies Ltd, Reino Unido)
Se observó un aumento estadístico de la concentración de péptido en suero de pacientes con placas carotídeas en comparación con pacientes con estenosis carotídea (Figura 3).
Las estadísticas fueron como en el Ejemplo 3.
EJEMPLO 5
Inmunohistoquímica del cartílago articular de caballos
Se inmunotiñeron bloques de cartílago articular sano y en fase inicial de OA fijados con formol para el péptido (anticuerpo policlonal de conejo). Los anticuerpos policlonales se utilizaron a una dilución de 1:800 y 1:1000 respectivamente. En resumen, las muestras se seccionaron y se montaron en portaobjetos, se desparafinaron, se rehidrataron y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; 0,01 M, pH 7,4). La actividad de la peroxidasa endógena se extinguió con peróxido de hidrógeno al 3%en PBS. La unión no específica se bloqueó incubando las secciones en suero de cabra normal al 2 % (DAKO, X0907, anticuerpo de conejo), luego se secaron y se incubaron con el anticuerpo durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA). Después de enjuagar en PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Dako Real EnVision™ Detection systen, k5007, kit listo para usar) durante 30 minutos a TA. La visualización se realizó utilizando el revelador de color 3, 3-diaminobencidina (DAB+ Cromogen Dako EnVision) y la contratinción con hematoxilina. Como controles negativos, el anticuerpo primario se sustituyó por suero de conejo no inmune (Fracción de inmunoglobulina de conejo X0936, DAKO) en la misma dilución que el anticuerpo primario.
Las secciones se evaluaron subjetivamente utilizando un microscopio Nikon Eclipse E600 y el software NIS Elements Basic Research versión 3.22.11 (Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EE. UU.).
Los portaobjetos de inmunohistoquímica de cartílago articular de caballos sanos (cartílago sano, Figura 4) y de caballos con fibrilación superficial (un daño en la superficie del cartílago) del cartílago articular (OA en fase inicial) muestran patrones de tinción distintos (Figura 5). El anticuerpo dirigido contra el péptido se tiñe solo débilmente o se tiñe negativamente en el cartílago sano. Sin embargo, en la OA en fase inicial, el anticuerpo se tiñe positivamente en el área fibrilada.
EJEMPLO 6
Inmunohistoquímica de placas ateroscleróticas de seres humanos a partir de un material descrito en Fagerberg B, Ryndel M, Kjelldahl J,et al.J Vase Res (2010); 47: 221-30.
Se examinó una muestra de un paciente con estenosis carotídea sintomática mediante angiografía por resonancia magnética para localizar la estenosis máximain vivo,antes de la endarterectomía. Se utilizaron secciones transversales de tejido de la estenosis máxima para la inmunohistoquímica, que se llevó a cabo como en el Ejemplo 5. Se observó un aumento de la tinción (indicado por la flecha) en la pared de la íntima, lo que indica la presencia de un péptido que comprende la secuencia N-SGPTH (Figura 6).
Este Ejemplo 6 y el Ejemplo 4 muestran que el anticuerpo puede utilizarse para el diagnóstico de la aterosclerosis. Además, el Ejemplo 3 y el Ejemplo 5 muestran que el anticuerpo puede utilizarse para el diagnóstico de la osteoartritis. El denominador común de la osteoartritis y la aterosclerosis es la inflamación sistémica. Se concluye que el anticuerpo puede utilizarse para el diagnóstico de enfermedades en las que está presente la inflamación sistémica, como, por ejemplo, la osteoartritis, la aterosclerosis, los trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular y las enfermedades neuroinflamatorias como la esclerosis múltiple. LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Skioldebrand Eva
Lindahl Anders
Ekman Stina
<120> Péptido y anticuerpos para uso en diagnóstico
<160>6
<170>BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211>5
<212> PRT
<213>Equus caballus
<400> 1
Ser Gly Pro Thr His
1 5
<210>2
<211>9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido utilizado para la inmunización
<400>2
Ser Gly Pro Thr His Gly Gly Gly Cys
1 5
<210>3
<211>9
<212> PRT
<213>Equus caballus
<400>3
Ser Gly Pro Thr His Glu Gly Val Cys
1 5
<210>4
<211> 15
<212> PRT
<213>Equus caballus
<400>4
Pro Pro Gly Tyr Ser Gly Pro Thr His Glu Gly Val Gly Met Cys
1 5 10 15
<210>5
<211> 11
<212> PRT
<213>Equus caballus
<400>5
Ser Gly Pro Thr His Glu Gly Val Gly Met Ala
1 5 10
<210>6
<211> 11
<212> PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Ser Gly Pro Thr His Gln Gly Val Gly Leu Ala
1 5 10

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Método de diagnóstico que comprende: analizar una muestra previamente aislada de un sujeto para determinar la presencia o la cantidad de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido.
2. Método según la reivindicación 1, donde el método se utiliza en el diagnóstico de la osteoartritis o la aterosclerosis.
3. Método según la reivindicación 2, donde la osteoartritis es una osteoartritis en fase inicial.
4. Anticuerpo que se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido, donde el anticuerpo se une a la secuencia extremo-N-SGTPH, para su uso en diagnósticoin vivo.
5. Anticuerpo para uso según la reivindicación 4, donde el diagnóstico es el diagnóstico de osteoartritis o aterosclerosis en un sujeto.
6. Anticuerpo para uso según la reivindicación 5, donde el diagnóstico es diagnóstico de aterosclerosis.
7. Anticuerpo para uso según la reivindicación 6, donde la aterosclerosis es estenosis de la arteria carótida.
8. Anticuerpo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde el anticuerpo se utiliza para detectar la cantidad de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos extremo-N-SGPTH donde el residuo de serina tiene el grupo NH<2>de dicho péptido.
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