EA034364B1 - Иммуноанализ для обнаружения хромогранина а - Google Patents

Abstract

В патенте описан способ иммуноанализа для обнаружения хромогранина A или его фрагмента(ов), заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых приводят в контакт образец, который предположительно содержит хромогранин A, с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обладающим специфичностью в отношении хромогранина A, и вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обладающим специфичностью в отношении хромогранина A, в условияхобеспечивающих образование тройного комплекса между хромогранином A и двумя антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, и проводят обнаружение связывания двух антител или их антигенсвязывающих фрагментов с хромогранином A. Описаны также антитела к аминокислотным остаткам 124-144 и 280-301 хромогранина A и их применение в способе иммуноанализа.

Description

Хромогранин A (CgA) представляет собой белок, идентифицированный и выделенный в 1965 г. из хромоаффинных клеток мозгового слоя бычьих надпочечников (Banks и др., Biochem J 97, 1965, 40С41С; Taupenot и др., New Eng J Med. 348, 2010, cc. 1134-1149). Хромоаффинные клетки представляют собой нейроэндокринные клетки, которые присутствуют в основном в мозговом слое надпочечных желез у млекопитающих. Хромогранин А является широко известным опухолевым маркером различных нейроэндокринных опухолей, гетерогенной группы редко встречающихся неоплазм из нейроэндокринных клеток, включающей множественную эндокринную неоплазию типа 1 и типа 2 (MEN1/MEN2), медуллярную карциному щитовидной железы, карциноидные опухоли, опухоли островковых клеток, феохромоцитому/паранглиому, низкодифференцированный/мелкоклеточный/атипичный легочный карциноид, мелкоклеточную карциному легкого, карциному клеток Меркеля (Deftos и др., Endocr. Rev. 12, 1991, cc. 181187; Corti и др., Br J Cancer 73, 1996, cc. 924-932) и он упоминается в ряде руководств (Ramage и др., Gut 61, 2012, cc. 6-32; Vinik и др., NANETS Pancreas 39(6), 2010, cc. 713-734; Pape и др., ENETS 95, 2012, cc. 135-156).

Человеческий хромогранин А имеет состоящую из 439 аминокислотных остатков последовательность (см. SEQ ID NO: 1), он представляет собой кислый гликопротеин с молекулярной массой 49 кДа, который запасается и высвобождается из хромоаффинных гранул эндокринных клеток, нейронов и нейроэндокринных клеток наряду с соответствующими гормонами, нейротрансмиттерами и нейропептидами (Kim и др., Cell 106, 2001, cc. 499-509).

Хромогранин А является основным представителем семейства хромогранинов/секретогранинов, состоящего из группы белков, которые происходят из различных генов, но которые обладают рядом общих характеристик, а именно, присутствием большого количества кислых аминокислотных остатков и многочисленных пар основных аминокислот, представляющих собой возможные положения для посттрансляционного процессинга (Metz-Boutigue и др., Eur. J. Biochem 217, 1993, cc. 247-257) и расщепления.

CgA является предшественником нескольких биологически активных пептидных фрагментов, которые были описаны для человека и других видов, таких как: вазостатины (Drees и др., Endocrinology 129, 1991, cc. 3381-3387), хромостатин (Galindo и др., Proc Natl Acad Sci U S A 88, 1991, cc. 1426-1430), хромацины (Strub и др., J Biol Chem 272, 1997, cc. 11928-11936), панкреастатин (Tatemoto и др., Nature 324, 1986, cc. 476-478), WE-14 (Curry и др., FEBS Lett 301, 1992, cc. 319-321), катестатин (Mahata и др., J Clin Invest 100, 1997, cc. 1623-1633), парастатин (Fasciotto и др., Endocrinology 133, 1993, cc. 461-466) и GE-25 (Kirchmair и др., Biochem J 310 (часть 1), 1995, cc. 331-336). В базе данных UniProt указаны дополнительные пептиды для человеческого хромогранина А (регистрационный номер: Р 10645) на основе сайтов расщепления, позволяющие предсказать пептиды, которые будут высвобождаться: вазостатин-1, содержащий аминокислотную последовательность 1-76, вазостатин-2, содержащий аминокислотную последовательность 1-113, ЕА-92, содержащий аминокислотную последовательность 116-207, ES-43, содержащий аминокислотную последовательность 210-242, панкреастатин, содержащий аминокислотную последовательность 254-301, SS-18, содержащий аминокислотную последовательность 304-321, WE-14, содержащий аминокислотную последовательность 324-337, WA-8, содержащий аминокислотную последовательность 324-331, LF-19, содержащий аминокислотную последовательность 340-358, AL-11, содержащий аминокислотную последовательность 362-372, GV-19, содержащий аминокислотную последовательность 375-393, GR-44, содержащий аминокислотную последовательность 395-438 и ER-37, содержащий аминокислотную последовательность 402-438. Кроме того, было продемонстрировано, что в различных нейроэндокринных клетках процессинг молекулы может происходить по-разному (Portela-Gomes и др., J Histochem Cytochem 4, 2001, cc. 483-490).

Было установлено, что хромогранин А является биомаркером целого ряда заболеваний и состояний, включая рак, например, рак предстательной железы (WO 2013/070088 A1; WO 2013/070089 A1; US 6238877 B1; WO 2012/065025 А2).

В настоящее время существует четыре соответствующих европейским стандартам (СЕ) нерадиоактивных анализа для обнаружения хромогранина А, которые осуществляют на коммерческой основе: в анализе Cis-Bio ELISA (фирма Cisbio Bioassays, Кодоле, Франция) применяют два моноклональных антитела к эпитопам, соответствующим аминокислотам 145-197 и 219-234, в анализе DAKO ELISA (фирма Dako Denmark A/S, Глоструп, Дания) применяют кроличьи поликлональные антитела к С-концевому фрагменту с молекулярной массой 23 кДа, в сэндвич-анализе ELISA Euro-Diagnostica NEOLISA™ (фирма Euro Diagnostica AB, Мальмё, Швеция) применяют два моноклональных антитела к эпитопам, соответствующим аминокислотам 236-251 и 264-279 (см. также WO 2011/135035 А1 и WO 99/58980 А1).

Единственный доступный полностью автоматизированный анализ для обнаружения хромогранина А представляет собой анализ хромогранина А KRYPTOR (фирма Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Хеннингсдорф, Германия), в котором применяют два моноклональных антитела, из которых одно моноклональное антитело связывается с эпитопом, соответствующим аминокислотам 250-301 (Popovici и др., Clin Biochem 47, 2014, cc. 87-91).

Вследствие высокого уровня протеолиза молекулы измеренная с помощью указанного анализа концентрация может варьироваться в широких пределах с течением времени в зависимости от хранения соб- 1 034364 ранного образца и в зависимости от фрагмента, измеряемого с использованием антител, поэтому улучшенный анализ хромогранина А должен быть ориентирован на наиболее стабильные фрагменты молекулы и его следует оценивать с позиций стабильности образца в различных условиях хранения.

В ряде публикаций обсуждалось влияние эпитопов, распознаваемых антителами, и схемы анализа на характеристики иммуноанализов хромогранина А с точки зрения клинического применения (Corti и др., Eur J. Biochem 235, 1996, cc. 275-280, Stridsberg и др., J Endocrinol 177, 2003, cc. 337-341).

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящей заявке раскрыта новая схема анализа для обнаружения хромогранин А или его фрагментов. В этом анализе применяют одно или несколько антител, которые связываются с эпитопами, ранее охарактеризованными как антигенные сайты, обладающие слабой способностью или отсутствием способности к связыванию (Corti и др., Eur J. Biochem 235, 1996, cc. 275-280). При создании способа неожиданно было установлено, что анализ, предлагаемый в настоящей заявке, характеризуется более высокой стабильностью аналита в образце по сравнению с существующим полностью автоматизированным анализом хромогранина A KRYPTOR (фирма B.R.A.H.M.S GmbH, Хеннингсдорф, Германия). Кроме того, иммуноанализ, представленный в настоящем описании, характеризуется широким диапазоном обнаружения, т.е. можно осуществлять обнаружение белка-мишени по меньшей мере в диапазоне концентраций от примерно 9 нг/мл до примерно 3 мг/мл. Широкий диапазон обнаружения дает преимущество с экономической точки зрения, поскольку требуется разводить меньшее количество образцов. Поэтому анализ, предлагаемый в настоящей заявке, можно применять, например, в качестве исследовательского инструмента и в клинических условиях для обнаружения хромогранина А в широком диапазоне концентраций и с высокой специфичностью. В клинических условиях анализ, предлагаемый в настоящей заявке, можно применять для обнаружения хромогранина А в образцах, взятых у пациентов, для установления диагноза, прогноза, оценки риска, стратификации риска, терапевтического контроля и/или послеоперационного контроля нарушения или медицинского состояния.

В частности, в настоящей заявке предложен способ иммуноанализа для обнаружения хромогранина А или его фрагмента, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) приводят в контакт образец, предположительно содержащий хромогранин А, с (i) первым антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А, где первое антитело или антигенсязывающий фрагмент, обладающий специфичностью к эпитопу, содержащиеся в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 124 до 144 аминокислотного остатка SEQ ID NO:1, и (ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А, где второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент, обладающий специфичностью к эпитопу, содержащемуся в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 280 до 301 аминокислотного остатка SEQ ID NO:1, в условиях, обеспечивающих образование тройного комплекса между хромогранином А и двумя антителами или их антигенсвязывающими фрагментами или производными, и

б) обнаруживают связывание двух антител или их антигенсвязывающих фрагментов с хромогранином А.

Способ иммуноанализа, раскрытый в заявке, можно применять в контексте диагностических методов. Кроме того, способ относится к наборам и их применениям в контексте диагностических методов.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - стандартная кривая, построенная для различных концентраций хромогранина А с использованием способа иммуноанализа, описанного в примере 4;

на фиг. 2 - профиль точности иммуноанализа, предлагаемого в настоящей заявке, в сравнении с известным из существующего уровня техники анализом хромогранина A KRYPTOR (фирма Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Хеннингсдорф, Германия) (пример 5).

Подробное описание

В настоящей заявке также раскрыт способ иммуноанализа, предназначенный для обнаружения хромогранина А или его фрагментов. Способ иммуноанализа основан на обнаружении хромогранина с использованием одного или нескольких антител, предпочтительно моноклональных антител, обладающих специфичностью в отношении хромогранина А. Предпочтительно иммуноанализ позволяет обнаруживать эпитопы в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 124 до аминокислотного остатка 144 и/или от аминокислотного остатка 280 до аминокислотного остатка 301 последовательности хромогранина А, представленной в SEQ ID NO: 1. Таким образом, с помощью представленного в настоящем описании иммуноанализа можно обнаруживать также фрагменты хромогранина, включающие аминокислотные остатки с 124 по 144 и/или с 280 по 301 последовательности хромогранина А. Таким образом, в контексте настоящего описания понятия хромогранин А или его фрагмент или хромогранин или его фрагмент(ы) включают хромогранин А и все его фрагменты, которые содержат эпитоп(ы), обнаруживаемый(ые) с помощью иммуноанализа описан(ы) далее. Предпочтительно в анализе используют по меньшей мере одно антитело, которое обнаруживает эпитоп в последовательности, про- 2 034364 стирающейся от аминокислотного остатка 124 до аминокислотного остатка 144 последовательности хромогранина А, представленной в SEQ ID NO: 1. Хромогранин А или, как это имеет место в некоторых случаях, его фрагмент(ы) можно обнаруживать качественно и/или количественно на основе связывания одного или предпочтительно двух антител с хромогранином А или его фрагментом. В случае сэндвичиммуноанализа (т.е. с применением двух антител) считается, что обнаружено присутствие хромогранина А или его фрагмента, если оба антитела связываются с хромогранином А или его фрагментом. Иными словами, один из аспектов данного описания относится к иммуноанализу, предназначенному для обнаружения хромогранина А или его фрагмента в образце, который заключается в том, что осуществляют стадии, на которых приводят в контакт указанный образец с первым антителом к хромогранину А (или его антигенсвязывающим фрагментом или производным) и вторым антителом к хромогранину А (или его антигенсвязывающим фрагментом или производным) и производят обнаружение присутствия тройных иммунных комплексов, включающих указанные антитела и хромогранин А (или его фрагмент(ы)). Иммунные комплексы могут формироваться в условиях, которые дают возможность осуществляться иммунной реакции между указанным/указанными антителом(ами) и указанным образцом (т.е. в условиях, в которых происходить связывание антитела/антител с хромогранином А или его фрагментом(ами), т.е. может происходить образование тройного комплекса в случае сэндвич-анализа). В иммуноанализе предпочтительно следует применять комбинацию двух антител, например, в сэндвич-формате (см. ниже). Таким образом, в настоящей заявке раскрыт способ иммуноанализа, предназначенный для обнаружения хромогранина А (или его фрагмента), который заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) приводят в контакт образец, который предположительно содержит хромогранин А (или его фрагмент), с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента, и вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента, и

б) проводят обнаружение связывания двух антител или их антигенсвязывающих фрагментов или производных с хромогранином А или его фрагментом. В способе иммуноанализаописанном в данной заявке, указанное первое антитело предпочтительно обладает специфичностью в отношении эпитопа в последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), предпочтительно в последовательности, простирающейся с аминокислоты 124 до аминокислоты 144 SEQ ID NO: 1. Первое антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело.

В настоящей заявке также раскрыт способ иммуноанализа, предназначенный для обнаружения хромогранина А (или его фрагмента), который заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) приводят в контакт образец, который предположительно содержит хромогранин А (или его фрагмент), с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента, и вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента, в условиях, в которых может происходить образование тройного комплекса между хромогранином А или его фрагментом и двумя антителами или их антигенсвязывающими фрагментами или производными, и

б) проводят обнаружение связывания двух антител или их антигенсвязывающих фрагментов или производных с хромогранином А или его фрагментом. В способе иммуноанализа согласно описаниюуказанное первое антитело предпочтительно обладает специфичностью в отношении эпитопа в последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), предпочтительно в последовательности, простирающейся с аминокислоты 124 до аминокислоты 144 SEQ ID NO: 1. Первое антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело.

В заявке так же раскрыт способ иммуноанализа, предназначенный для обнаружения хромогранина А (или его фрагментов), который заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) приводят в контакт образец, который предположительно содержит хромогранин А, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента, в условиях, в которых может происходить образование иммунного комплекса между хромогранином А и антителом или его антигенсвязывающими фрагментами или производными, где указанное первое антитело обладает специфичностью в отношении эпитопа, простирающегося с аминокислоты 124 до аминокислоты 144 последовательности хромогранина А (SEQ ID NO: 1). Антитело, обладающее специфичностью в отношении эпитопа, простирающегося от аминокислоты 124 до аминокислоты 144 последовательности хромогранина А, предпочтительно представляет собой антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы 537/Н2, которая депонирована в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур института Лейбница (DSMZ), InhoffenstraBe 7В, 38124, Брауншвейг, Германия, 20 февраля 2014 г. под регистрационным номером DSM ACC3231.

Ниже в настоящем описании понятие антитело включает также его антигенсвязывающие фрагменты или производные, если не указано иное.

Понятие антитело в целом включает моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, прежде всего, Fc-фрагменты, а также так называемые одноцепочечные антитела

- 3 034364 (Bird R. Е. и др., Science 242, 1988, cc. 423-426), химерные, гуманизированные антитела, прежде всего антитела с трансплантированными CDR, и димерные или тетрамерные антитела (диа- или тетрабоди) (Holliger Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 1993, cc. 6444-6448). Понятие относится также к иммуноглобулинподобным белкам, которые отбирают с помощью методов, включающих, например, метод фагового дисплея на основе специфического связывания с представляющей интерес молекулой, содержащейся в образце. В этом контексте понятия специфический и специфически связывающийся относятся к антителам к представляющей интерес молекуле или ее фрагменту. Считается, что антитело обладает специфичностью, если его аффинность к представляющей интерес молекуле (в данном случае: хромогранин А) или к указанному выше ее фрагменту по меньшей мере в 50 раз выше, предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем к другим молекулам, присутствующим в образце, который содержит представляющую интерес молекулу. В данной области хорошо известно, каким образом можно создавать и отбирать антитела, обладающие указанной специфичностью. Как указано выше, предпочтительными являются моноклональные антитела.

Как будет более подробно обсуждено ниже в настоящем описании, (первое и/или второе) антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или производные, применяемые в представленном в настоящем описании способе иммуноанализа, могут представлять собой, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела или моноклональные антитела, созданные методами генетической инженерии.

В способе иммуноанализа, согласно описанию указанное первое антитело может обладать специфичностью в отношении эпитопа в последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), предпочтительно в последовательности, простирающейся от аминокислоты 124 до аминокислоты 144 SEQ ID NO: 1. Первое антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело.

В способе иммуноанализа, согласно описанию указанное второе антитело может обладать специфичностью в отношении эпитопа в последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), предпочтительно в последовательности, простирающейся от аминокислоты 280 до аминокислоты 301 SEQ ID NO: 1. Второе антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело.

В конкретном варианте иммуноанализа, согласно описанию первое антитело обладает специфичностью в отношении эпитопа в последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), предпочтительно в последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 124-144 SEQ ID NO: 1, и второе антитело обладает специфичностью в отношении эпитопа в последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), предпочтительно в последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 280-301 SEQ ID NO: 1. Первое и второе антитела предпочтительно представляют собой моноклональные антитела.

Первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или производное может продуцироваться, например, линией клеток гибридомы 537/Н2, которая депонирована в DSMZ (InhoffenstraBe 7B, 38124, Брауншвейг, Германия) 20 февраля 2014 г. под регистрационным номером DSM ACC3231. Антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы 537/Н2, специфически связывается с аминокислотными остатками 124-144 последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), т.е. с SEQ ID NO: 2. Оно направлено против антигенного пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 4.

Второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или производное может продуцироваться, например, линией клеток гибридомы 541/Е2, которая депонирована в DSMZ (InhoffenstraBe 7B, 38124, Брауншвейг, Германия), 20 февраля 2014 г. под регистрационным номером DSM ACC3232. Антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы 541/Е2, специфически связывается с аминокислотными остатками 280-301 последовательности хромогранина A (SEQ ID NO: 1), т.е. с SEQ ID NO: 3. Оно направлено против антигенного пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 5.

В конкретном варианте иммуноанализа, предлагаемого в заявке, первое антитело продуцируется линией клеток гибридомы 537/Н2, которая депонирована в DSMZ (InhoffenstraBe 7B, 38124, Брауншвейг, Германия) 20 февраля 2014 г. под регистрационным номером DSM ACC3231, а второе антитело продуцируется линией клеток гибридомы 541/Е2, которая депонирована в DSMZ (InhoffenstraBe 7B, 38124, Брауншвейг, Германия), 20 февраля 2014 г. под регистрационным номером DSM ACC3232.

Связывание антител с хромогранином А (или его фрагментом) имеет место в пригодных условиях (т.е. в условиях, в которых могут происходить иммунные реакции, т.е. связывание антител с хромогранином А и образование иммунных комплексов). Такие условия известны специалисту в данной области, и можно применять стандартные форматы иммуноанализа, например, описанные ниже. Такие условия предпочтительно включают физиологические температуру, значение рН и ионную силу и они могут иметь место, например, в таких средах как забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР).

Предпочтительные методы обнаружения включают иммуноанализы в различных форматах, такие, например, как радиоиммуноанализ (РИА), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммунные анализы, ферментный иммуноанализ (EIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), анализы на основе массивов (матриц) гранул Luminex, белковых микромассивов, быстрые тест-форматы, такие, например, как иммунохроматографические стрип-тесты, и мониторинг выбранных/множественных реакций (SRM/MRM).

Анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, анализы в условиях конкуренции (конкурентные) и неконкурентные анализы. В наиболее предпочтительном аспекте в каче

- 4 034364 стве анализа применяют формат сэндвич-анализа, представляющий собой неконкурентный иммуноанализ, в котором подлежащую обнаружению и/или количественной оценке молекулу связывают с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, гранулой, поверхностью лунки или иного контейнера, чипом или полоской (стрипом), а второе антитело представляет собой антитело, меченное, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или каталитически активным фрагментом, или наоборот. Затем с помощью пригодного метода измеряют количество меченого антитела, связанного с аналитом. Общие условия и процедуры, применяемые в сэндвич-анализах, хорошо зарекомендовали себя и известны специалисту в данной области (см. The Immunoassay Handbook, под ред David Wild, изд-во Elsevier LTD, Oxford; 3-е изд., май 2005 г., ISBN13: 978-0080445267; Hultschig С. и др., Curr Opin Chem Biol., 10(1), февраль 2006 г., cc. 4-10. PMID: 16376134).

В наиболее предпочтительном аспекте в анализе применяют два антитела, которые оба присутствуют в диспергированной форме в жидкой реакционной смеси, где первый служащий в качестве метки компонент присоединяют к первому антителу, при этом указанный первый служащий в качестве метки компонент представляет собой часть системы мечения на основе гашения или усиления флуоресценции или хемилюминесценции, а второй служащий в качестве метки компонент указанной системы маркировки присоединяют ко второму антителу, в результате чего после связывания обеих захватывающих молекул с аналитом генерируется измеряемый сигнал, который позволяет обнаруживать образовавшиеся сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.

В еще более предпочтительном аспекте указанная система мечения может содержать криптаты редкоземельных металлов или хелаты редкоземельных металлов в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, прежде всего, с красителем цианинового типа.

В контексте настоящего описания в анализах на основе флуоресценции можно применять красители, которые можно выбирать, например, из группы, включающей FAM (5- или 6карбокксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Су7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодилфлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6О (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, BODIPY-красители, такие как BODIPY TMR, орегоновый зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как техасовый красный, Yakima желтый, Alexa Fluor, PET, этидия бромид, акридиновые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.

В контексте настоящего описания основанные на применении хемилюминисценции анализы предусматривают применение красителей, основанных на физических принципах, которые описаны для хемилюминисцентных материалов (Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4-ое изд., исполнительный редактор J. I. Kroschwitz; под. ред. М. Howe-Grant, изд-во John Wiley & Sons, т.15, 1993, cc. 518-562, публикация, включая цитаты, приведены на cc. 551-562). Предпочтительными хемилюминисцентными красителями являются акридининовые сложные эфиры. Хромогранин А можно обнаруживать, например, с помощью полностью автоматизированных систем для сэндвич-иммуноанализа с использованием устройства B.R.A.H.M.S KRYPTOR compact PLUS (фирма Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Хеннингсдорф/Берлин, Германия). В этом анализаторе, работающем по принципу случайного доступа, используется чувствительная технология Time Resolved Amplified Cryptate Emmission (TRACE, усиленное излучение криптата с временным разрешением), основанная на нерадиоактивном переносе энергии между двумя флуорофорами.

В конкретных аспектах метят одно из антител (например, первое антитело), а другое антитело (например, второе антитело) связывают с твердой фазой или оно может избирательно связываться с твердой фазой. Однако, как указано выше, в контексте способов, предлагаемых в заявке, предпочтительно, чтобы первое и второе антитела присутствовали в диспергированной форме в жидкой реакционной смеси и чтобы первый служащий для мечения компонент, который является частью системы мечения на основе экстинкции или усиления флуоресценции или хемилюминесценции, связывался с первым антителом, а второй служащий для мечения компонент указанной системы мечения связывался со вторым антителом, так, чтобы после связывания обоих антител с хромогранином А (или его фрагментом(ами)), генерировался измеряемый сигнал, позволяющий обнаруживать образовавшиеся сэндвич-комплексы.

В контексте настоящего описания анализ или диагностический анализ может представлять собой любой тип анализа, применяемого в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании аналита, подлежащего обнаружению, с одним или несколькими обеспечивающими захват зондами с определенной аффинностью. С точки зрения взаимодействия между антителами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами константа аффинности предпочтительно превышает 10⁸М^-1.

Способ иммуноанализа, раскрытый в данной заявке, можно применять в контексте диагностических и/или прогностических методов, в которых производят обнаружение присутствия и/или отсутствия, или

- 5 034364 уровня хромогранина А (или его фрагмента(ов)) в образце, взятом из организма индивидуума, подлежащего диагностированию. Хромогранин А участвует в целом ряде заболеваний и состояний, включая карциноидные опухоли, нейроэндокринные опухоли, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, гастрит, легочное заболевание, инфаркт миокарда, гипертензию, сердечную недостаточность, легочные заболевания, тромболизис, ожирение и диабет. Таким образом, иммуноанализ, раскрытый в данной заявке, можно применять для диагностирования заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей рак (включая карциноидные опухоли, нейроэндокринные опухоли, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря), гастрит, легочное заболевание, инфаркт миокарда, гипертензию, сердечную недостаточность, тромболизис, ожирение и диабет.

Понятие чувствительность анализа относится к пропорции действительно (истинно) положительных результатов, которые правильно идентифицированы как таковые, т.е. она характеризует способность идентифицировать положительные результаты (истинно положительные результаты/количество положительных результатов). Следовательно, чем ниже концентрации аналита, которые могут быть обнаружены с помощью анализа, тем выше чувствительность анализ. Понятие специфичность анализа относится к пропорции отрицательных результатов, которые правильно идентифицированы как таковые, т.е. она характеризует способность идентифицировать отрицательные результаты (истинно отрицательные результаты/отрицательные результаты). Для антитела специфичность определяют, как способность индивидуального антигенсвязывающего сайта взаимодействовать только с одним антигенным эпитопом. Связывающую способность антитела можно характеризовать также в терминах его аффинности и авидности. Аффинность антитела представляет собой меру силы взаимодействия между одним антигенным эпитопом и одним антигенсвязывающим сайтом. Авидность антитела представляет собой меру общей силы связывания антигена с несколькими эпитопами и многовалентными антителами.

Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависит не только от аналитического качества теста, а зависит также от того, что рассматривается в качестве неправильного результата. На практике, как правило, рассчитывают кривые операционных характеристик приемника (ROC-кривые), строя график зависимости значения переменной величины от ее частоты встречаемости в нормальной (т.е. у кажущихся здоровыми индивидуумов, не имевших пренатальных осложнений или состояний) и больной популяций. Для любого конкретного маркера уровни распределения маркеров у больных и не имеющих заболевания индивидуумов, вероятно, должны перекрываться. В таких условиях тест не позволяет осуществлять абсолютное разделение нормы и болезни с 100%ной точностью, и площадь перекрывания указывает, в каких случаях тест не позволяет различать нормальное состояние и болезнь. Выбирают порог, ниже которого результат теста рассматривается как патологический и выше которого результат теста рассматривается как нормальный. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что полученные результаты измерения могут позволить правильно идентифицировать состояние. ROC-кривые можно применять даже тогда, когда результаты теста не обязательно дают точное число. Если есть возможность ранжировать результаты, то можно создавать ROC-кривую. Например, результаты теста, проведенного на полученных из больной популяции образцах, можно ранжировать (упорядочивать!!!) в соответствии со степенью (например, 1 обозначает низкую, 2 обозначает нормальную и 3 обозначает высокую степень). Можно устанавливать корреляцию этого ранжирования (упорядочивания!!!) с результатами для нормальной популяции и создавать ROCкривую. Эти методы хорошо известны в данной области (см., например, Hanley и др., Radiology 143, 1982, ее. 29-36). Предпочтительно порог выбирают так, чтобы получать площадь под ROC-кривой, превышающую примерно 0,5, более предпочтительно превышающую примерно 0,7, еще более предпочтительно превышающую примерно 0,8, еще более предпочтительно превышающую примерно 0,85, и наиболее предпочтительно превышающую примерно 0,9. Понятие примерно в этом контексте обозначает +/- 5% от конкретной величины.

По горизонтальной оси ROC-кривой откладывают величину (1-специфичность), которая увеличивается по мере увеличения уровня ложных положительных оценок. По вертикальной оси кривой откладывают величину чувствительности, которая увеличивается по мере увеличения уровня истинных положительных оценок. Таким образом, для конкретного выбранного уровня отсечки можно определять величину (1-специфичность) и можно получать соответствующую чувствительность. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что измеренный уровень маркера должен позволять правильно идентифицировать заболевание или состояние. Таким образом, площадь под ROC-кривой можно применять для определения эффективности теста.

В других аспектах в качестве меры для оценки способности теста прогнозировать риск или диагностировать заболевание или состояние (больная группа) применяют отношение правдоподобности положительного результата исследования (т.е. отношение вероятности получения истинно положительного результата к вероятности получения ложно положительного результата), отношение правдоподобности отрицательного результата исследования (т.е. отношение вероятности получения истинно отрицательного результата к вероятности получения ложно отрицательного результата), отношение шансов (вероятностей) или отношение рисков. В случае применения отношения правдоподобности положительного результата величина, равная 1, свидетельствует о том, что получение положительного результата равнове

- 6 034364 роятно у индивидуумов как в больной группе, так и в контрольной группе; величина, превышающая 1, свидетельствует о том, что получение положительного результата более вероятно в больной группе; а величина меньше 1 свидетельствует о том, что получение положительного результата более вероятно в контрольной группе. В случае применения отношения правдоподобности отрицательного результата величина, равная 1, свидетельствует о том, что получение отрицательного результата равновероятно у индивидуумов как в больной группе, так и в контрольной группе; величина, превышающая 1, свидетельствует о том, что получение отрицательного результата более вероятно в больной группе; а величина меньше 1 свидетельствует о том, что получение отрицательного результата более вероятно в контрольной группе.

В случае применения отношения вероятностей величина, равная 1, свидетельствует о том, что получение положительного результата равновероятно у индивидуумов как в больной группе, так и в контрольной группе; величина, превышающая 1, свидетельствует о том, что получение положительного результата более вероятно в больной группе; а величина меньше 1 свидетельствует о том, что получение положительного результата более вероятно в контрольной группе.

В случае применения отношения рисков величина, равная 1, свидетельствует о том, что относительная величина риска достижения конечной точки (например, смерти) одинакова как в больной группе, так и в контрольной группе; величина, превышающая 1, свидетельствует о том, что риск больше в больной группе; а величина меньше 1 свидетельствует о том, что риск больше в контрольной группе.

Специалисту в данной области должно быть очевидно, что для установления ассоциации диагностического или прогностического индикатора с диагнозом или прогностическим риском достижения в будущем клинического исхода требуется статистический анализ. Например, если уровень маркера меньше X, то это может указывать на то, что у пациента с большей вероятностью может наступить неблагоприятный исход, чем у пациентов, у которых уровень превышает или равен X, о чем свидетельствует уровень статистической значимости. Кроме того, изменение концентрации маркера по сравнению с исходным уровнем может отражать прогноз для пациента, а степень изменения уровня маркера может быть связана с серьезностью нежелательных явлений. Статистическую значимость часто определяют путем сравнения двух или большего количества популяций и определения доверительного интервала и/или рзначения (см., например, Dowdy и Wearden, Statistics for Research, изд-во John Wiley & Sons, New York, 1983). Предпочтительными доверительными интервалами являются 90, 95, 97,5, 98, 99, 99,5, 99,9 и 99,99%, тогда как предпочтительными р-значениями являются 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 и 0,0001.

В заявке также раскрыт набор для обнаружения хромогранина А, содержащий (I) первое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или производное, обладающее/обладающий специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента; и (II) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или производное, обладающее/обладающий специфичностью в отношении хромогранина А или его фрагмента.

Первое и второе антитела, входящие в набор, предпочтительно обладают специфичностью в отношении одного и того же фрагмента или одних и тех же фрагментов хромогранина А.

Например, (I) первое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или производное обладает специфичностью в отношении эпитопа, содержащегося в последовательности SEQ ID NO: 1; и/или (II) второе антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или производное обладает специфичностью в отношении эпитопа, содержащегося в последовательности SEQ ID NO: 1. Предпочтительно первое антитело, входящее в набор, представляет собой моноклональное антитело к хромогранину А, продуцируемое клеточной линией гибридомы 537/Н2, депонированной под регистрационным номером DSM АСС3231, и/или второе антитело, входящее в набор, представляет собой моноклональное антитело к хромогранину А, продуцируемое клеточной линией гибридомы 541/Е2, депонированной под регистрационным номером DSM АСС3232.

В заявке также раскрыта клеточная линия гибридомы, выбранная из клеточной линии 537/Н2, депонированной под регистрационным номером DSM АСС3231, и клеточной линии 541/Е2, депонированной под регистрационным номером DSM ACC3232.

В ней также описано применение набора в формате сэндвич-иммуноанализа для обнаружения и/или количественной оценки хромогранина А или его фрагмента в биологическом образце, взятом из общей воды организма. В одном из аспектов такой фрагмент содержит по меньшей мере последовательность, охватывающую два эпитопа, против которых направлены два антитела, например, набор можно применять для обнаружения и/или количественной оценки хромогранина А.

Понятие образец предпочтительно обозначает биологический образец. В контексте настоящего описания понятие образец может, например, относиться к образцу общей воды организма или ткани, полученному для цели установления диагноза, прогноза или оценки состояния представляющего интерес индивидуума, такого как пациент.

Для целей данного описания понятие пациент или индивидуум включает как людей, так и других животных, прежде всего млекопитающих, и другие организмы. Таким образом, способы можно при- 7 034364 менять как для диагностики человека, так и в ветеринарии. В предпочтительном аспекте пациент представляет собой млекопитающее, а в наиболее предпочтительном варианте -индивидуум представляет собой человека.

В контексте настоящего описания образец предпочтительно представляет собой образец общей воды организма или ткани индивидуума. Предпочтительным является образец общей воды организма. Предпочтительными анализируемыми образцами являются кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, мокрота и плевральные выпоты. Кроме того, специалисту в данной области должно быть известно, что некоторые анализируемые образцы более легко анализировать после процедуры фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на компоненты, представляющие собой сыворотку или плазму.

Так, в предпочтительном аспекте данной заявки образец выбирают из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракт любого из указанных выше образцов. Предпочтительно образец представляет собой образец крови, более предпочтительно образец сыворотки или образец плазмы. Образцы сыворотки являются наиболее предпочтительными образцами в контексте настоящего описания.

Плазма в контексте настоящего описания представляет собой полученный после центрифугирования практически бесклеточный супернатант крови, содержащей антикоагулянт. Примеры антикоагулянтов включают связывающие ионы кальция соединения, такие как ЭДТК или цитрат, и ингибиторы тромбина, такие как гепаринаты или гирудин. Бесклеточную плазму можно получать центрифугированием обработанной антикоагулянтами крови (например, цитрированной, обработанной ЭДТК или гепаринизированной крови) в течение по меньшей мере 15 мин при 2000-3000 g.

Сыворотка представляет собой жидкую фракцию цельной крови, которую собирают после того, как крови дали возможность свернуться. После центрифугирования коагулированной крови (свернувшаяся кровь) сыворотку получают в виде супернатанта. Она не содержит фибриногена, хотя в ней остаются некоторые факторы свертываемости.

В определенных обстоятельствах может оказаться необходимым гомогенизировать образец или экстрагировать растворителем для получения жидкого образца. При этом жидкий образец может представлять собой раствор или суспензию. Жидкие образцы можно подвергать одной или нескольким предварительным обработкам. Такими предварительными обработками могут служить (но, не ограничиваясь только ими) разведение, фильтрация, центрифугирование, концентрирование, седиментация, преципитация, диализ. Предварительные обработки могут включать также добавление к раствору химических или биохимических субстанций, таких как кислоты, основания, буферы, соли, растворители, реакционноспособные красители, детергенты, эмульгаторы, хелаторы.

Способ, раскрытый в заявке, можно применять также для определения уровня хромогранина А (или его фрагмента(ов)) в образце для установления диагноза или прогноза или оценки риска, или скрининга, или терапевтического контроля или послеоперационного контроля медицинских состояний.

Следовательно, иммуноанализили набор раскрытый в заявке можно применять для установления диагноза или прогноза или оценки риска, или скрининга, или терапевтического контроля или послеоперационного контроля медицинского состояния индивидуума.

Таким образом, в контексте настоящего описания иммуноанализ или набор можно применять для терапевтического контроля или послеоперационного контроля нарушения, где нарушение может представлять собой различные типы рака.

Как указано выше, в контексте настоящего описания нарушение или медицинское состояние индивидуума предпочтительно можно выбирать из рака (включая карциноидные опухоли, нейроэндокринные опухоли, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря), гастрит, легочное заболевание, инфаркт миокарда, гипертензию, сердечную недостаточность, легочные заболевания, тромболизис, ожирение и диабет.

В контексте настоящего описания нарушение или медицинское состояние индивидуума предпочтительно выбирают из нейроэндокринных опухолей (НЭО), включая феохромоцитомы, панкреатические НЭО, желудочно-кишечные НЭО, нейробластом, медуллярных тиреоидных карцином, мелкоклеточного рака легких, синдромов множественной эндокринной неоплазии типа 1 и множественной эндокринной неоплазии типа 2, рака предстательной железы, сердечно-сосудистых заболеваний, состояний, связанных с инфекциями и сепсисом.

Понятие биомаркер (биологический маркер) относится к поддающимся измерению и количественной оценке биологическим параметрам (например, к концентрации специфического фермента, концентрации специфического гормона, распределению определяющего специфический фенотип гена в популяции, присутствию биологических субстанций), которые служат в качестве индикаторов для оценок, связанных с состоянием здоровья и физиологией, таких как риск развития заболевания, психиатрические нарушения, факторы окружающей среды и их воздействия, для установления диагноза заболевания, оценок метаболических процессов, злоупотребления алкоголем или наркотиками, беременности, развития клеточных линий, эпидемиологических исследований и т.д. Кроме того, понятие биомаркер определяют как характеристику, которую можно объективно измерять и оценивать в качестве индикатора нор- 8 034364 мальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических ответов на применение терапевтических средств. Биомаркер можно измерять в биообразце (путем анализа крови, мочи или ткани), данные могут представлять собой результаты измерений для индивидуума (кровяное давление, ЭКГ или суточный мониторинг ЭКГ (Holter) или могут представлять собой результаты анализа путем визуализации (доплеровское ультразвуковое обследование матки и плаценты или ширина шейной прозрачности (Conde-Agudelo и др., Obstet Gynecol 104, 2004, cc. 1367-1391; Bindra и др., Ultrasound Obstet Gynecol 20, 2002, cc. 219-225)). Биомаркеры могут являться индикаторами различных характеристик состояния здоровья или болезненного состояния, включая уровень или тип воздействия факторов окружающей среды, генетическую восприимчивость, генетические ответы на воздействия, биомаркерами субклинической или клинической фазы заболевания или индикаторами ответа на терапию. Таким образом, упрощенно рассматривать биомаркеры только как индикаторы признаков заболевания (биомаркер фактора риска или риска), состояния заболевания (доклиническая или клиническая фаза) или скорости развития (прогрессирования) заболевания. Следовательно, биомаркеры можно классифицировать как продромальные биомаркеры (позволяющие идентифицировать риск развития болезни), скрининговые биомаркеры (для скрининга субклинической фазы заболевания), диагностические биомаркеры (позволяющие распознавать имеющееся заболевание), биомаркеры стадий заболевания (позволяющие классифицировать серьезность заболевания) или прогностические биомаркеры (позволяющие прогнозировать дальнейшее течение заболевания, включая рецидив и ответ на терапию, и осуществлять мониторинг эффективности терапии). Биомаркеры могут служить также в качестве суррогатных конечных точек. Суррогатная конечная точка представляет собой точку, которую можно рассматривать в качестве исходя в клинических опытах для оценки безопасности и эффективности терапий вместо оценки истинного представляющего интерес исхода. В основе этого лежит принцип, заключающийся в том, что изменения суррогатной конечной точки тесно связаны с изменениями представляющего интерес исхода. Суррогатные конечные точки имеют преимущество, заключающееся в том, что их можно достигать за более короткие промежутки времени и с меньшими затратами по сравнению с такими конечными точками как заболеваемость и смертность, которые требуют крупномасштабных клинических опытов для оценки. Дополнительная ценность суррогатных конечных точек обусловлена тем фактом, что они более близки к моменту представляющего интерес воздействия/вмешательства и для них легче выявлять причинную связь, чем для более отдаленных клинических событий. Важным недостатком суррогатных конечных точек является то, что, если на представляющий интерес клинический исход влияют многочисленные факторы (в дополнение к суррогатной конечной точке), то остальные взаимодействия могут снижать валидность суррогатной конечной точки. Было сделано предположение, что валидность суррогатной конечной точки повышается, если она позволяет объяснить по меньшей мере 50% от эффекта воздействия или вмешательства на представляющий интерес исход. Биомаркер может представлять собой, например, белок, пептид или молекулу нуклеиновой кислоты.

В контексте настоящего описания понятие хромогранин А относится к человеческому хромогранину А. Аминокислотная последовательность человеческого хромогранина А представлена в SEQ ID NO: 1. Полипептиды или производные хромогранина А могут иметь также посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, липидирование или дериватизация.

В контексте настоящего описания понятие диагноз относится к распознаванию и (раннему) обнаружению заболевания или клинического состояния у индивидуума, и оно может включать также дифференциальный диагноз. В некоторых аспектах под понятие диагноз может подпадать также оценка серьезности заболевания или клинического состояния.

Понятие прогноз относится к прогнозированию исхода или специфического риска для индивидуума, страдающего конкретным заболеванием или клиническим состоянием. Оно может включать оценку шанса выздоровления или шанса неблагоприятного исхода для указанного индивидуума.

В контексте настоящего описания понятие оценка риска или стратификация риска относится к группировке индивидуумов на различные группы риска в соответствии с их прогнозом на будущее. Стратификация риска относится также к стратификации в отношении применяемых профилактических и/или терапевтических мер.

В контексте настоящего описания понятие терапевтический контроль относится к мониторингу и/или регулированию терапевтического лечения указанного пациента.

Понятие послеоперационный контроль в контексте настоящего описания относится к мониторингу состояния указанного пациента после подвергания указанного пациента хирургической процедуре.

Понятие скрининг в контексте настоящего описания относится к процессу изучения популяции с использованием специфического маркера или специфических маркеров и определенных для целей скрининга отсекающих уровней для идентификации индивидуумов в популяции, которые имеют более высокий риск конкретного нарушения. Скрининг можно применять для популяции, диагностирование применяют на уровне индивидуального пациента.

Последовательности:

Последовательность 1 (SEQ ID NO: 1): Человеческий хромогранин A (CGA) без сигнального пептида (UniProt Accession № P10645); антигенные эпитопы подчеркнуты:

- 9 034364

1 LPVNSPMNKG	11 DTEVMKCIVE	21 VISDTLSKPS	31 PMPVSQECFE	41 TLRGDERILS
51 ILRHQNLLKE	61 LQDLALQGAK	71 ERAHQQKKHS	81 GFEDELSEVL	91 ENQSSQAELK
101 EAVEEPSSKD	111 VMEKREDSKE	121 AEKSGEATDG	131 ARPQALPEPM	141 QESKAEGNNQ
151 APGEEEEEEE	161 EATNTHPPAS	171 LPSQKYPGPQ	181 AEGDSEGLSQ	191 GLVDREKGLS
201 AEPGWQAKRE	211 ЕЕЕЕЕЕЕЕАЕ	221 AGEEAVPEEE	231 GPTVVLNPHP	241 SLGYKEIRKG
251 ESRSEALAVD	261 GAGKPGAEEA	271 QDPEGKGEQE	281 HSQQKEEEEE	291 MAVVPQGLFR
301 GGKSGELEQE	311 EERLSKEWED	321 SKRWSKMDQL	331 AKELТАЕKRL	341 EGQEEEEDNR
351 DSSMKLSFRA	361 RAYGFRGPGP	371 QLRRGWRPSS	381 REDSLEAGLP	391 LQVRGYPEEK
401 KEEEGSANRR	411 PEDQELESLS	421 AIEAELEKVA	431 HQLQALRRG

Последовательность 2 (SEQ ID NO: 2): Эпитоп 1 человеческого хромогранина A (CGA) (соответствующий остаткам 124-144 SEQ ID NO: 1):

11 21

SGEATDGARP QALPEPMQES К

Последовательность 3 (SEQ ID NO: 3): Эпитоп 2 человеческого хромогранина A (CGA) (соответствующий остаткам 280-301 SEQ ID NO: 1):

11 21

EHSQQKEEEE EMAVVPQGLF RG

Последовательность 4 (SEQ ID NO: 4): Фрагмент антигенного пептида человеческого хромогранина A (CGA) (соответствующий остаткам 124-144 SEQ ID NO: 1, плюс дополнительный остаток цистеина на N-конце):

11 21

CSGEATDGAR PQALPEPMQE SK

Последовательность 5 (SEQ ID NO: 5): Фрагмент антигенного пептида человеческого хромогранина A (CGA) (соответствующий остаткам 280-301 SEQ ID NO: 1, плюс дополнительный остаток цистеина на N-конце):

11 21

CEHSQQKEEE EEMAVVPQGL FRG

Примеры

Пример 1. Создание антител.

Конструирование моноклональных антител.

Иммуногены получали следующим образом: пептид CSGEATDGARPQALPEPMQESK (SEQ ID NO: 4), который соответствует области молекулы хромогранина А, содержащей аминокислоты 124-144, с дополнительным остатком цистеина на ее N-конце, ковалентно перекрестно сшивали с применяемым в качестве носителя бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептид CEHSQQKEEEEEMAVVPQGLFRG (SEQ ID NO: 5), который соответствует области молекулы хромогранина А, содержащей аминокислоты 280-301, дополнительным остатком цистеина на ее N-конце, перекрестно сшивали с применяемым в качестве носителя БСА.

Моноклональные антитела к пептидам хромогранина А 124-144 и 280-301 создавали согласно стандартным процедурам (Harlow E, Lane D., Antibodies - A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Lane, Journal of Immunology Methods 81, 1985, cc. 223-228).

Самок мышей линии Balb/c 8-недельного возраста иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции 100 мкг пептида 124-144 или пептида 280-301 соответственно, разведенного в полном адъюванте Фрейнда. Последующие инъекции осуществляли с использованием дозы 50 мкг в неполном адъюванте Фрейнда в течение 61 дня с различными интервалами времени.

Перед осуществлением слияния выявляли присутствие требуемого антитела в сыворотке реципиентов с помощью ELISA с использованием иммобилизованного пептида 124-144 или 280-301. Затем осуществляли скрининг в отношении клонов 537/Н2 и 541/Е2 с помощью ELISA с использованием иммобилизованного рекомбинантного (rec.) CGA (рекомбинантный хромогранин А приготавливали на фирме French National of Scientific Research, Plate-forme de Production de Proteines Recombinantes CRBM UMR 5237 CNRS, Монтпелье).

Для характеризации изотипа применяли набор для изотипирования мышиных моноклональных антител (Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit, фирма Roche).

- 10 034364

Антитела очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке Fast Flow с белком А (фирма

GE Healthcare Life Sciences) согласно инструкциям производителя.

Мечение антител.

При проведении конечного анализа антитело 537/Н2 сшивали с криптатом европия (фирма CisBio Bioassays, Маркуль, Франция), а антитело 541/Е2 сшивали с Alexa Fluor 647® (фирма Life Technologies, в настоящее время филиал фирмы Thermo Fisher Scientific). Реакции сочетания осуществляли согласно протоколам производителей.

Пример 2. Разработка анализа хромогранина А с использованием антител, мишенью которых являются области, содержащие аминокислоты 124-144/280-301.

Для обнаружения стабильного фрагмента хромогранина А был разработан гомогенный флуоресцентный сэндвич-иммуноанализ с использованием технологии усиленного излучения криптата с временным разрешением (TRACE) (Mathis, Clin Chem 39(9), 1993, cc. 1953-1959).

Перед применением маточные конъюгированное с криптатом антитело 537/Н2 и конъюгированное с Alexa Fluor® антитело 541/Е2 разводили до концентраций 0,265 мкг/мл и 2,94 мкг/мл соответственно буфером для анализа (100мМ фосфат, рН 7, 422мМ KF, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,15 мг/мл мышиного Ig и 0,07 мг/мл бычьего Ig).

Рекомбинантный хромогранин А разводили в лошадиной сыворотке с получением стандартов хромогранина А. Иммуноанализ проводили путем инкубации 14 мкл образца/стандарта, 68 мкл раствора конъюгированного с Alexa Fluor® антитела 541/Е2 и 68 мкл раствора конъюгированного с криптатом антитела 537/Н2 при 37°C в устройстве B.R.A.H.M.S KRYPTOR (фирма Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Хеннингсдорф, Берлин) согласно инструкциям производителя. Время реакции при проведении анализа составляло 29 мин. Относительный уровень флуоресценции (RFU) получали путем одновременного измерения при двух длинах волн 665 нм и 620 нм с использованием устройства B.R.A.H.M.S KRYPTOR. Было установлено, что диапазон измерений с непосредственным отсчетом показаний составлял вплоть до 3000 нг/мл, а оценка функциональной чувствительности анализа показала, что она составляла 13,1 нг/мл.

Пример 3. Стабильность после объединения образцов хромогранина А в сыворотке по данным CgA II-анализа.

Для исследования применяли три пула образцов сыворотки, замороженные при <-16°C сразу после сбора.

Один пул состоял из образцов сыворотки здоровых индивидуумов (пул 1), а два других состояли из образцов патологической сыворотки (пулы 2 и 3, патологические пулы).

Измерения проводили в следующие моменты времени: через 1, 2 и 3 дня хранения при 2-8°C; через 1, 2 и 3 дня хранения при 18-25°C; после 1, 2 и 3 циклов замораживания/оттаивания.

Измерения проводили с помощью устройства KRYPTOR с использованием описанных выше реагентов и условий.

Принятым критерием того, что стабильность образца можно рассматривать как приемлемую, является ее снижение <10% в различных условиях.

Полученные результаты (табл. 1) свидетельствуют о том, что чувствительность KRYPTOR-анализа (537/Н2-криптат; 541/Е2-А1еха Fluor®) не изменяется при осуществлению вплоть до 3 циклов замораживания/оттаивания, при выдерживании в течение одного дня при 2-8°C или при 18-25°C. Стабильность 2 патологических пулов оказалась выше, чем стабильность пула образцов, взятых у здоровых доноров, поскольку было выявлено лишь незначительное снижение концентрации по истечении 3 дней выдерживания при 2-8°C или при 18-25°C (<11%).

Таблица1. Результаты мониторинга стабильности 3 пулов образцов сыворотки по данным KRYPTOR-анализа с использованием 537/H2-Cryptate; 541/Е2-А1еха Fluor®

	Пул 1	Пул 2	Пул 3
Условия	Конц. (нг/мл)	Относительная величина	Конц. (нг/мл)	Относительная величина	Конц. (нг/мл)	Относительная величина
Эталон	85,5	-	880	-	2153	-
3 дня при 2-8°С	65,7	-23%	786	-11%	1981	-8%
2 дня при 2-8°С	62,9	-26%	797	-9%	2011	-7%
1 день при 2-8°С	79,8	-7%	825	-6%	2096	-3%
3 дня при 18-25°С	69,9	-18%	789	-10%	1976	-8%
2 дня при 18-25°С	71,2	-17%	798	-9%	2047	-5%
1 день при 18-25°С	78,5	-8%	816	-7%	2070	-4%
3 цикла замораж. /оттаивания	82,8	-3%	851	-3%	2131	-1%
2 цикла замораж. /оттаивания	90,4	6%	862	-2%	2137	-1%
1 цикл замораж. /оттаивания	85,4	0%	875	-1%	2153	0%

- 11 034364

Пример 4. Калибровочная кривая.

На фиг. 1 представлена кривая зависимости ответа от дозы для KRYPTOR-анализа (537/Н2-криптат;

541/Е2-А1еха Fluor647®) с использованием технологии усиленного излучения криптата с временным разрешением (TRACE).

На основе калибровочной кривой было установлено, что диапазон измерений с непосредственным отсчетом показаний для KRYPTOR-анализа (537/Н2-криптат; 541/Е2-А1еха Fluor647®) составлял вплоть до 3000 нг/мл.

Пример 5. Профиль точности и чувствительность.

Были проведены параллельные измерения на 91 образце (24 образца были получены от здоровых доноров, а 67 представляли собой патологические образцы) с использованием антител 537/Н2 и 541/Е2 в описанных выше условиях и с помощью известного из существующего уровня техники KRYPTORанализа хромогранина А (фирма Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.S GmbH, Хеннингсдорф, Германия). Измерения проводили с дублированием и на одном и том же графике откладывали коэффициент вариации для каждого дубликата в зависимости от концентрации хромогранина А. Профили точности оказались одинаковыми для обоих анализов. Функциональная чувствительность анализа, заявленная для KRYPTOR-анализа хромогранина А составляла 9,04 нг/мл; оценка показала, что функциональная чувствительность KRYPTOR-анализа (537/Н2-криптат; 541/Е2-А1еха Fluor647®) для 10% CV составляла 13,1 нг/мл.

Перечень последовательностей <110> СЕЗАНН С.А.С.

<120> ИММУНОАНАЛИЗ И АНТИТЕЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ХРОМОГРАНИНА А <130> Х1439 PCT BLN <150> ЕР 14 16 4809.7 <151> 15.04.2014 <160> 5 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 439 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> человеческий хромогранин А без сигнального пептида

400> 1

Leu

Pro

Vai

Asn

Ser

Pro

Met

Asn

Lys

Gly

Asp

Thr

Glu

Vai

Met

Lys

1

5

10

15

Cys

lie

Vai

Glu

Vai

lie

Ser

Asp

Thr

Leu

Ser

Lys

Pro

Ser

Pro

Met

20

25

30

Pro

Vai

Ser

Gin

Glu

Cys

Phe

Glu

Thr

Leu

Arg

Gly

Asp

Glu

Arg

He

35

40

45

Leu

Ser

lie

Leu

Arg

His

Gin

Asn

Leu

Leu

Lys

Glu

Leu

Gin

Asp

Leu

50

55

60

Ala

Leu

Gin

Gly

Ala

Lys

Glu

Arg

Ala

His

Gin

Gin

Lys

Lys

His

Ser

65

70

75

80

Gly

Phe

Glu

Asp

Glu

Leu

Ser

Glu

Vai

Leu

Glu

Asn

Gin

Ser

Ser

Gin

85

90

95

Ala

Glu

Leu

Lys

Glu

Ala

Vai

Glu

Glu

Pro

Ser

Ser

Lys

Asp

Vai

Met

100

105

110

Glu

Lys

Arg

Glu

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

Glu

Lys

Ser

Gly

Glu

Ala

Thr

115

120

125

Asp

Gly

Ala

Arg

Pro

Gin

Ala

Leu

Pro

Glu

Pro

Met

Gin

Glu

Ser

Lys

130

135

140

Ala

Glu

Gly

Asn

Asn

Gin

Ala

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

145

150

155

160

Glu

Ala

Thr

Asn

Thr

His

Pro

Pro

Ala

Ser

Leu

Pro

Ser

Gin

Lys

Tyr

165

170

175

- 12 034364

Pro

Gly

Pro

Gin 180

Ala

Glu

Gly

Asp

Ser 185

Glu

Gly

Leu

Ser

Gin 190

Gly

Leu

Vai

Asp

Arg

Glu

Lys

Gly

Leu

Ser

Ala

Glu

Pro

Gly

Trp

Gin

Ala

Lys

195

200

205

Arg

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

Gly

Glu

Glu

210

215

220

Ala

Vai

Pro

Glu

Glu

Glu

Gly

Pro

Thr

Vai

Vai

Leu

Asn

Pro

His

Pro

225

230

235

240

Ser

Leu

Gly

Tyr

Lys

Glu

lie

Arg

Lys

Gly

Glu

Ser

Arg

Ser

Glu

Ala

245

250

255

Leu

Ala

Vai

Asp

Gly

Ala

Gly

Lys

Pro

Gly

Ala

Glu

Glu

Ala

Gin

Asp

260

265

270

Pro

Glu

Gly

Lys

Gly

Glu

Gin

Glu

His

Ser

Gin

Gin

Lys

Glu

Glu

Glu

275

280

285

Glu

Glu

Met

Al a

Vai

Vai

Pro

Gin

Gly

Leu

Phe

Arg

Gly

Gly

Lys

Ser

290

295

300

Gly

Glu

Leu

Glu

Gin

Glu

Glu

Glu

Arg

Leu

Ser

Lys

Glu

Trp

Glu

Asp

305

310

315

320

Ser

Lys

Arg

Trp

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Leu

Ala

Lys

Glu

Leu

Thr

Ala

325

330

335

Glu

Lys

Arg

Leu

Glu

Gly

Gin

Glu

Glu

Glu

Glu

Asp

Asn

Arg

Asp

Ser

340

345

350

Ser

Met

Lys

Leu

Ser

Phe

Arg

Ala

Arg

Ala

Tyr

Gly

Phe

Arg

Gly

Pro

355

360

365

Gly

Pro

Gin

Leu

Arg

Arg

Gly

Trp

Arg

Pro

Ser

Ser

Arg

Glu

Asp

Ser

370

375

380

Leu

Glu

Ala

Gly

Leu

Pro

Leu

Gin

Vai

Arg

Gly

Tyr

Pro

Glu

Glu

Lys

385

390

395

400

Lys

Glu

Glu

Glu

Gly

Ser

Ala

Asn

Arg

Arg

Pro

Glu

Asp

Gin

Glu

Leu

405

410

415

Glu

Ser

Leu

Ser

Ala

lie

Glu

Ala

Glu

Leu

Glu

Lys

Vai

Ala

His

Gin

420

425

430

Leu

Gin

Ala

Leu

Arg

Arg

Gly

435 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> остатки 124-144 человеческого хромогранина А <400> 2

Ser Gly Glu Ala Thr Asp Gly Ala Arg Pro Gin Ala Leu Pro Glu Pro

10 15

Met Gin Glu Ser Lys

- 13 034364 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> остатки 280-301 человеческого хромогранина А

<400> 3
Glu His	Ser	Gin	Gin	Lys Glu Glu Glu Glu Glu Met Ala Vai	Vai Pro
1			5	10	15
Gin Gly	Leu	Phe	Arg	Gly
		20

<210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>

<223> антигенный пептидный фрагмент человеческого хромогранина А

<400>	4
Cys Se	r Gly	Glu	Ala	Thr Asp	Gly Ala Arg Pro	Gin Ala Leu Pro Glu
1			5		10	15
Pro Met Gin	Glu	Ser	Lys
		20
<210>	5
<211>	23
<212>	PRT
<213>	искусственная	последовательность

<220>

<223> антигенный пептидный фрагмент человеческого хромогранина А <400> 5

Cys	Glu	His	Ser	Gin	Gin	Lys Glu	Glu Glu Glu	Glu Met Ala Vai Vai
1				5			10	15
Pro	Gin	Gly	Leu	Phe	Arg	Gly
			20

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ иммуноанализа для обнаружения хромогранина А или его фрагмента, включающий стадии, на которых:

   а) приводят в контакт образец, который предположительно содержит хромогранин А, с (I) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А, где первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью в отношении эпитопа, содержащегося в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 124 до аминокислотного остатка 144 SEQ ID NO: 1 и (II) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обладающим специфичностью в отношении хромогранина А, где второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью в отношении эпитопа, содержащегося в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 280 до аминокислотного остатка 301 SEQ ID NO: 1, в условиях, обеспечивающих образование тройного комплекса между хромогранином А и двумя

   - 14 034364 антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, и

   б) обнаруживают связывание двух антител или их антигенсвязывающих фрагментов с хромогранином А.
2. 2. Способ иммуноанализа по п.1, в котором первое антитело получают с использованием клеточной линии гибридомы 537/Н2, депонированной под регистрационным номером DSM ACC3231.
3. 3. Способ иммуноанализа по п.1, в котором второе антитело получают с использованием клеточной линии гибридомы 541/Е2, депонированной под регистрационным номером DSM ACC3232.
4. 4. Способ иммуноанализа по одному из пп.1-3, в котором образец получают из общей воды организма или ткани индивидуума, например из общей воды организма, выбранной из крови, сыворотки, плазмы и мочи.
5. 5. Способ иммуноанализа по одному из пп.1-4, где анализ осуществляют в гомогенной фазе или в гетерогенной фазе.
6. 6. Способ иммуноанализа по одному из пп.1-5, в котором одно из антител метят, а другое антитело связывают с твердой фазой, или оно может обладать способностью избирательно связываться с твердой фазой.
7. 7. Способ иммуноанализа по одному из пп.1-5, в котором первое антитело и второе антитело присутствуют в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси и в котором первый служащий для мечения компонент, который представляет собой часть системы мечения на основе затухания или усиления флуоресценции или хемилюминесценции, связывают с первым антителом, а второй служащий для мечения компонент указанной системы мечения связывают со вторым антителом, в результате чего после связывания обоих антител с подлежащим обнаружению хромогранином А генерируется измеряемый сигнал, обеспечивающий обнаружение образовавшихся сэндвич-комплексов в растворе, в котором проводят измерения.
8. 8. Способ иммуноанализа по п.7, отличающийся тем, что система мечения содержит криптаты или хелаты редкоземельных металлов в комбинации с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, прежде всего цианинового типа.
9. 9. Набор для обнаружения хромогранина А, содержащий (I) первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий специфичностью в отношении хромогранина А, где первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью в отношении эпитопа, содержащегося в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 124 до аминокислотного остатка 144 SEQ ID NO: 1 и (II) второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий специфичностью в отношении хромогранина А, где второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает специфичностью в отношении эпитопа, содержащегося в последовательности, простирающейся от аминокислотного остатка 280 до аминокислотного остатка 301 SEQ ID NO: 1 хромогранина А.
10. 10. Набор по п.9, в котором (I) первое антитело выбрано из антител, продуцируемых клеточной линией 537/Н2, которая депонирована под регистрационным номером DSM ACC3231, (II) второе антитело выбрано из антител, продуцируемых клеточной линией 541/Е2, которая депонирована под регистрационным номером DSM ACC3232.
11. 11. Применение способа иммуноанализа по одному из пп.1-8 для установления диагноза, прогноза, оценки риска, стратификации риска, терапевтического контроля и/или послеоперационного контроля нарушения или медицинского состояния у индивидуума, где медицинское состояние выбирают из группы, включающей рак, гастрит, инфаркт миокарда, гипертензию, сердечную недостаточность, легочные заболевания, тромболизис, ожирение и диабет.
12. 12. Применение набора по пп.9 или 10 для установления диагноза, прогноза, оценки риска, стратификации риска, терапевтического контроля и/или послеоперационного контроля нарушения или медицинского состояния у индивидуума, где медицинское состояние выбирают из группы, включающей рак, гастрит, инфаркт миокарда, гипертензию, сердечную недостаточность, легочные заболевания, тромболизис, ожирение и диабет.